CN118006528A - 一种生产四氢嘧啶的基因工程菌、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程及发酵工程技术领域,具体公开了一种生产四氢嘧啶的基因工程菌、制备方法及应用，通过对E.coli、Bacillus subtilis和Halomonas venusta的糖酵解、天冬氨酸等代谢相关途径进行分析，以野生型E.coli.W3110为底盘微生物，并通过基因组整合过表达异源四氢嘧啶生物合成途径关键酶基因和异源丙酮酸羧化酶基因，弱化分解途径等相关分子改造获得E.coli‑ect09，具有遗传背景清晰、可持续改造等优点，该菌株发酵生产四氢嘧啶操作简单、能以廉价碳源直接合成四氢嘧啶，采用分批补料发酵法在发酵罐中48h发酵四氢嘧啶产量可达到76.5g/L，具有很好的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及发酵工程技术领域，尤其涉及一种生产四氢嘧啶的基因工程菌、制备方法及应用。
背景技术
四氢嘧啶，又称依克多因，是一种氨基酸衍生物，属于极端酶组分。最新研究发现，在极端条件下，如高盐、高温和高紫外线辐射下，四氢嘧啶能有效保护嗜盐菌免受伤害。同时，研究证明四氢嘧啶对皮肤具有良好的修复保护作用，因此在保健、生命科学和化妆品行业得到广泛应用。在有机合成中，四氢嘧啶促进酯化、缩合、烷基化等反应。在聚合物工业中，作为聚氨酯、聚丙烯酰胺等高分子材料的溶剂和反应介质。在药物制备中，作为溶剂有助于药物反应和结晶。四氢嘧啶还被广泛应用为通用有机溶剂，用于溶解和处理各种有机化合物，以及在实验室技术中的使用。
生产上，四氢嘧啶的制备大都通过化学合成的方式实现，制备方法始于丙烯，经过氧化、缩合、脱水和脱氧等步骤生成最终产品。然而，传统制备方法存在一些弊端，包括反应条件苛刻、催化剂复杂以及中间产物毒性。同时，传统制备方法依赖非可再生的石油化工原料，不符合可持续发展要求，因此迫切需要环保、高效的新技术路径。
微生物发酵法已经被作为大多数天然小分子产物大规模生产的主流方式，因此，构建一株遗传背景清晰、产量较为可观的四氢嘧啶生产菌株是目前亟待解决的问题。
发明内容
为了解决上述背景所提出的技术问题，本发明提供一种生产四氢嘧啶的基因工程菌、制备方法及应用，通过对E.coli、Bacillus subtilis和Halomonasvenusta的糖酵解、天冬氨酸等代谢相关途径进行分析，以野生型E.coli.W3110为底盘微生物，并通过基因组整合过表达异源四氢嘧啶生物合成途径关键酶基因和异源丙酮酸羧化酶基因，弱化分解途径等相关分子改造获得E.coli-ect09。
为达到上述的设计目的，本发明采取的技术方案如下：
本发明的一个目的是提供了一种生产四氢嘧啶的基因工程菌，该菌种为E.coli-ect09，以野生型E.coli.W3110为底盘微生物，并通过基因组整合过表达异源四氢嘧啶生物合成途径关键酶基因和异源丙酮酸羧化酶基因，弱化分解途径等相关分子改造获得。
进一步地，野生型E.coli.W3110的保藏号为ATCC 273250。
本发明的另一个目的是提供一种生产四氢嘧啶的基因工程菌的制备方法，该系统包括：
(1)通过在E.coliW3110的基因组ycgH、yghX、yciQ点引入经人工密码子优化的异源二氨基丁酸乙酰转移酶基因ectA、丁酸二氨基-2-氧代戊二酸转氨酶基因ectB、四氢嘧啶合酶基因JDS37_RS09010，均由Ptrc启动子启动。
(2)通过在基因组mbhA位点引入经人工密码子优化的异源丙酮酸羧化酶基因pycAPtrc启动子启动。
(3)通过在基因组ycdN、yeeL、yeeP位点分别过表达内源天冬氨酸转氨酶基因aspC、天冬氨酸激酶基因lysC、天冬氨酸-半醛脱氢酶基因asd，均由Ptrc强启动子启动。
(4)将双功能天冬氨酸激酶基因thrA的天然启动子换为PJ23114启动子；将二氢吡啶甲酸合酶基因dapA的天然启动子换为PJ23114启动子。
进一步地，上述生产四氢嘧啶的基因工程菌，所述经人工密码子优化整合的异源二氨基丁酸乙酰转移酶基因ectA、丁酸二氨基-2-氧代戊二酸转氨酶基因ectB、四氢嘧啶合酶基因JDS37_RS09010均来自于美丽盐单胞菌Halomonas venusta(ATCC 27125),其中,所述二氨基丁酸乙酰转移酶基因ectA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(ectA；NCBI-GeneID:77015291)；所述丁酸二氨基-2-氧代戊二酸转氨酶基因ectB核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(ectB；NCBI-GeneID:77015290)；所述四氢嘧啶合酶基因JDS37_RS09010核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示(JDS37_RS09010；NCBI-GeneID:77015289)。
更进一步地，上述生产四氢嘧啶的基因工程菌，所述经人工密码子优化的丙酮酸羧化酶基因pycA来自于枯草芽孢杆菌B.subtilis 168(ATCC 23857)，其中所述丙酮酸羧化酶基因pycA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示(pycA；NCBI-GeneID:935920)。
更进一步地，上述生产四氢嘧啶的基因工程菌，所述天冬氨酸转氨酶基因aspC的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示(aspC；NCBI-GeneID:945553)；所述天冬氨酸激酶基因lysC的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示(lysC；NCBI-GeneID:948531)；所述天冬氨酸-半醛脱氢酶基因asd的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示(lysC；NCBI-GeneID:948531)；所述双功能天冬氨酸激酶基因thrA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示(thrA；NCBI-GeneID:948531)；所述二氢吡啶甲酸合酶基因dapA的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示(dapA；NCBI-GeneID:946952)。
更进一步地，上述生产四氢嘧啶的基因工程菌，所述Ptrc启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；PJ23114启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的又一目的是提供基因工程菌E.coli-ect09在发酵生产四氢嘧啶中的应用。
利用基因工程菌E.coli-ect09发酵生产四氢嘧啶的方法，发酵方法包括以下步骤：
(1)菌种活化：将菌种从甘油管接至斜面培养基活化培养11-13h；将菌种从斜面培养基中接至茄形瓶培养基中继续活化扩大培养10-12h，培养温度：36℃；
(2)种子培养：培养过程pH维持在6.7±0.1，温度维持在36±0.2℃，溶氧维持在35％-50％，培养至OD为20时转接发酵罐中进行发酵培养；
(3)发酵培养：按20％的接种量将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵pH维持在6.7±0.1，温度维持在36±0.2℃，溶氧维持在30％-50％；培养过程中通过流加80％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵过程菌体所需的碳源，期间通过添加25％的氨水来调节pH。
进一步地，采用的种子培养基为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉6g/L，蛋白胨4g/L，柠檬酸1g/L，(NH4)2SO43g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，KH2PO41.5g/L，FeSO4·7H2O10mg/L，MnSO45mg/L，Vb1、Vb3、Vb5、Vb 12各2mg/L，VH 1mg/L，其余为水。
进一步地，采用的发酵培养基为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉6g/L，蛋白胨2g/L，柠檬酸2g/L，氨基酸混合粉2g/L，(NH4)2SO43g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，KH2PO44g/L，FeSO4·7H2O20mg/L，MnSO410mg/L，Vb1、Vb3、Vb5、Vb 12各2mg/L，VH 1mg/L。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明制备的基因工程菌E.coli-ect09具有遗传背景清晰、可持续改造等优点，该菌株发酵生产四氢嘧啶操作简单、能以廉价碳源直接合成四氢嘧啶，采用分批补料发酵法在发酵罐中48h发酵四氢嘧啶产量可达到76.5g/L，具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1为四氢嘧啶工程菌株E.coli-ect09的构建方法图解。
图2为四氢嘧啶工程菌株E.coli-ect095L发酵罐48H发酵过程曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。
实施例中所用的出发菌株为野生型E.coliW3110，保藏号ATCC 273250，相应启动子和基因等见序列表。
实施例1
采用的基因编辑方法参照文献(Li Y，Lin Z，Huang C，et al.Metabolicengineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 meditated genomeediting.Metabolic Engineering，2015，31：13-21.)。该方法涉及的工程质粒pGRB是以pUC18为骨架，包括启动子J23100、gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列以及氨节青霉素抗性(工作浓度：100mg/L)。下列实施例中涉及到的专业名词均可在该文章中解释。菌株构建过程中用到的引物见表1。其菌种构建过程如图1所示。
表1菌株构建过程中所涉及的引物
1.基因ectA的整合
以pGRB-ycgH-s、pGRB-ycgH-a为引物，构建出pGRB-ycgH质粒。然后以ycgH-up-s、ycgH-up-a、ectA-s、ectA-a、ycgH-dn-s、ycgH-dn-a为引物，分别以E.coli W3110的基因组和经过人工合成密码子优化的PUC-ectA质粒为模板，获得上游同源臂ycgH-up，下游同源臂ycgH-dn，目的基因ectA；然后再获得融合片段ycgH::ectA。最后将pGRB-ycgH质粒与重叠片段ycgH::ectA电转至野生型E.coliW3110的电转感受态细胞中；再以ycgH-up-s、ycgH-dn-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株E.coli-ect01。
2.基因ectB的整合
以pGRB-yghX-s、pGRB-yghX-a为引物，构建出pGRB-yghX质粒。然后以yghX-up-s、yghX-up-a、ectB-s、ectB-a、yghX-dn-s、yghX-dn-a为引物，分别以E.coli W3110的基因组和经过人工合成密码子优化的PUC-ectB质粒为模板，获得上游同源臂yghX-up，下游同源臂yghX-dn，目的基因ectB；然后再获得融合片段yghX::ectB。最后将pGRB-yghX质粒与重叠片段yghX::ectB电转至E.coli-ect01的电转感受态细胞中；再以yghX-up-s、yghX-dn-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株E.coli-ect02。
3.基因JDS37_RS09010的整合
以pGRB-yciQ-s、pGRB-yciQ-a为引物，构建出pGRB-yciQ质粒。然后以yciQ-up-s、yciQ-up-a、JDS37_RS09010-s、JDS37_RS09010-a、yciQ-dn-s、yciQ-dn-a为引物，分别以E.coli W3110的基因组和经过人工合成密码子优化的PUC-JDS37_RS09010质粒为模板，获得上游同源臂yciQ-up，下游同源臂yciQ-dn，目的基因JDS37_RS09010；然后再获得融合片段yciQ::JDS37_RS09010。最后将pGRB-yciQ质粒与重叠片段yciQ::JDS37_RS09010电转至E.coli-ect02的电转感受态细胞中；再以yciQ-up-s、yciQ-dn-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株E.coli-ect03。
4.基因pyrA的整合
以pGRB-mbhA-s、pGRB-mbhA-a为引物，构建出pGRB-mbhA质粒。然后以mbhA-up-s、mbhA-up-a、pyrA-s、pyrA-a、mbhA-dn-s、mbhA-dn-a为引物，分别以E.coli W3110的基因组和B.subtilis 168基因组为模板，获得上游同源臂mbhA-up，下游同源臂mbhA-dn，目的基因pyrA；然后再获得融合片段mbhA::pyrA。最后将pGRB-mbhA质粒与重叠片段mbhA::pyrA电转至E.coli-ect03的电转感受态细胞中；再以mbhA-up-s、mbhA-dn-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株E.coli-ect04。
5.基因aspC的整合
以pGRB-ycdN-s、pGRB-ycdN-a为引物，构建出pGRB-ycdN质粒。然后以ycdN-up-s、ycdN-up-a、aspC-s、aspC-a、ycdN-dn-s、ycdN-dn-a为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂ycdN-up，下游同源臂ycdN-dn，目的基因aspC；然后再获得融合片段ycdN::aspC。最后将pGRB-ycdN质粒与重叠片段ycdN::aspC电转至E.coli-ect04的电转感受态细胞中；再以ycdN-up-s、ycdN-dn-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株E.coli-ect05。
6.基因lysC的整合
以pGRB-yeeL-s、pGRB-yeeL-a为引物，构建出pGRB-yeeL质粒。然后以yeeL-up-s、yeeL-up-a、lysC-s、lysC-a、yeeL-dn-s、yeeL-dn-a为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂yeeL-up，下游同源臂yeeL-dn，目的基因lysC；然后再获得融合片段yeeL::lysC。最后将pGRB-yeeL质粒与重叠片段yeeL::lysC电转至E.coli-ect05的电转感受态细胞中；再以yeeL-up-s、yeeL-dn-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株E.coli-ect06。
7.基因asd的整合
以pGRB-yeeP-s、pGRB-yeeP-a为引物，构建出pGRB-yeeP质粒。然后以yeeP-up-s、yeeP-up-a、asd-s、asd-a、yeeP-dn-s、yeeP-dn-a为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂yeeP-up，下游同源臂yeeP-dn，目的基因asd；然后再获得融合片段yeeP::asd。最后将pGRB-yeeP质粒与重叠片段yeeP::asd电转至E.coli-ect06的电转感受态细胞中；再以yeeP-up-s、yeeP-dn-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株E.coli-ect07。
8.基因thrA的弱化
以pGRB-thrA-s、pGRB-thrA-a为引物，构建出pGRB-thrA质粒。然后以thrA-up-s、thrA-up-a、thrA-dn-s、thrA-dn-a为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂thrA-up，下游同源臂thrA-dn；然后再获得融合片段PJ23114-thrA。最后将pGRB-thrA质粒与重叠片段PJ23114-thrA电转至E.coli-ect07的电转感受态细胞中；再以thrA-up-s、thrA-dn-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株E.coli-ect08。
9.基因dapA的弱化
以pGRB-dapA-s、pGRB-dapA-a为引物，构建出pGRB-dapA质粒。然后以dapA-up-s、dapA-up-a、dapA-dn-s、dapA-dn-a为引物，以E.coli W3110的基因组为模板，获得上游同源臂dapA-up，下游同源臂dapA-dn；然后再获得融合片段PJ23114-dapA。最后将pGRB-dapA质粒与重叠片段PJ23114-dapA电转至E.coli-ect08的电转感受态细胞中；再以dapA-up-s、dapA-dn-a为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株E.coli-ect09。
实施例2
采用实施例1中所获得的菌株E.coli-ect09在5L发酵罐中发酵生产四氢嘧啶，具体步骤如下：
(1)菌种活化：将菌种从甘油管接至斜面培养基活化培养11-13h；将菌种从斜面培养基中接至茄形瓶培养基中继续活化扩大培养10-12h；培养温度：36℃。
(2)种子培养：采用的种子培养基为葡萄糖30g/L，酵母浸粉6g/L，蛋白胨4g/L，柠檬酸1g/L，(NH4)2SO43g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，KH2PO41.5g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MnSO45mg/L，Vb1、Vb 3、Vb 5、Vb 12各2mg/L，VH 1mg/L，其余为水；培养过程pH维持在6.7±0.2，温度维持在36℃±0.2，溶氧维持在35％-50％之间，培养至OD600nm为20时转接发酵罐中进行发酵培养。
(3)发酵培养：按20％的接种量将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，采用的发酵培养基为葡萄糖30g/L，酵母浸粉6g/L，蛋白胨2g/L，柠檬酸2g/L，氨基酸混合粉2g/L,(NH4)2SO43g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，KH2PO44g/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，MnSO410mg/L，Vb1、Vb 3、Vb 5、Vb 12各2mg/L，VH 1mg/L，其余为水；发酵pH维持在6.7±0.2，温度维持在36±0.2℃，溶氧维持在30％-50％之间；培养过程中通过流加80％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵过程菌体所需的碳源，期间通过添加25％的氨水来调节pH。
5L发酵罐发酵48h时，四氢嘧啶的产量可达到76.5g/L(发酵曲线图见图2)。
可见，本发明所述生产四氢嘧啶的基因工程菌可以廉价葡萄糖为底物，从头合成价值更高的四氢嘧啶，具有遗传性能稳定、遗传背景清晰、无缺陷型无质粒、生产效率高等优点，具有非常好的工业化前景。
以上内容是结合具体的优选实施方案对本发明所做的进一步详细说明，便于该技术领域的技术人员能理解和应用本发明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下还做出若干简单推演或替换，而不必经过创造性的劳动。因此，本领域技术人员根据本发明的揭示,对本发明做出的简单改进都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种生产四氢嘧啶的基因工程菌，其特征在于，该菌种为E.coli-ect09，以野生型E.coli.W3110为底盘微生物，并通过基因组整合过表达异源四氢嘧啶生物合成途径关键酶基因和异源丙酮酸羧化酶基因，弱化分解途径等相关分子改造获得。
2.根据权利要求1所述的一种生产四氢嘧啶的基因工程菌，其特征在于，野生型E.coli.W3110的保藏号为ATCC 273250。
3.根据权利要求1或2所述的的一种生产四氢嘧啶的基因工程菌的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：
步骤101：通过在E.coliW3110的基因组ycgH位点引入经密码子优化的美丽盐单胞菌二氨基丁酸乙酰转移酶基因ectA，由Ptrc启动子启动，得到菌株E.coli-ect01；
步骤102：在E.coliW3110的基因组yghX位点引入经密码子优化的美丽盐单胞菌丁酸二氨基-2-氧代戊二酸转氨酶基因ectB，由Ptrc启动子启动，得到菌株E.coli-ect02；
步骤103：在E.coliW3110的基因组yciQ位点引入经密码子优化的美丽盐单胞菌四氢嘧啶合酶基因JDS37_RS09010，由Ptrc启动子启动，得到菌株E.coli-ect03；
步骤104：通过在E.coliW3110的基因组mbhA位点引入经密码子优化的枯草芽孢杆菌丙酮酸羧化酶基因pycA，由Ptrc启动子启动，得到菌株E.coli-ect04；
步骤105：通过在E.coliW3110的基因组ycdN位点引入内源天冬氨酸转氨酶基因aspC，由Ptrc启动子启动，得到菌株E.coli-ect05；
步骤106：通过在E.coliW3110的基因组yeeL位点引入内源天冬氨酸激酶基因lysC,由Ptrc启动子启动，得到菌株E.coli-ect06；
步骤107：通过在E.coliW3110的基因组yeeP位点引入内源天冬氨酸-半醛脱氢酶基因asd，由Ptrc启动子启动，得到菌株E.coli-ect07；
步骤108：将双功能天冬氨酸激酶基因thrA的天然启动子换为PJ23114启动子，得到菌株E.coli-ect08；
步骤109：将二氢吡啶甲酸合酶基因dapA的天然启动子换为PJ23114启动子，菌株E.coli-ect09，即菌株E.coli-ect09为改造成功后的目的菌。
4.根据权利要求3所述的的一种生产四氢嘧啶的基因工程菌的制备方法，其特征在于，
二氨基丁酸乙酰转移酶基因ectA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
丁酸二氨基-2-氧代戊二酸转氨酶基因ectB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
四氢嘧啶合酶基因JDS37_RS09010的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
丙酮酸羧化酶基因pycA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
天冬氨酸转氨酶基因aspC的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
天冬氨酸激酶基因lysC的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
天冬氨酸-半醛脱氢酶基因asd的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
双功能天冬氨酸激酶基因thrA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
二氢吡啶甲酸合酶基因dapA的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
5.根据权利要求3所述的的一种生产四氢嘧啶的基因工程菌的制备方法，其特征在于，
Ptrc启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
PJ23114启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
6.利用权利要求3制备的基因工程菌E.coli-ect09在发酵生产四氢嘧啶中的应用。
7.利用权利要求3制备的基因工程菌E.coli-ect09发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，发酵方法包括以下步骤：
步骤201：菌种活化
将基因工程菌E.coli-ect09从甘油管接至斜面培养基活化培养11-13h；将基因工程菌E.coli-ect09从斜面培养基中接至茄形瓶培养基中继续活化扩大培养10-12h，培养温度：36℃；
步骤202：种子培养
培养过程pH维持在6.7±0.1，温度维持在36±0.2℃，溶氧维持在35％-50％，培养至OD为20时转接发酵罐中进行发酵培养；
步骤203：发酵培养
按20％的接种量将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵pH维持在6.7±0.1，温度维持在36±0.2℃，溶氧维持在30％-50％。
8.根据权利要求7所述的发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，步骤202中采用的种子培养基为：采用的种子培养基为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉6g/L，蛋白胨4g/L，柠檬酸1g/L，(NH4)2SO43g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，KH2PO41.5g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MnSO45mg/L，Vb1、Vb3、Vb5、Vb 12各2mg/L，VH 1mg/L，其余为水。
9.根据权利要求7所述的发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，步骤203中采用的发酵培养基为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉6g/L，蛋白胨2g/L，柠檬酸2g/L，氨基酸混合粉2g/L,(NH4)2SO43g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，KH2PO44g/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，MnSO410mg/L，Vb1、Vb3、Vb5、Vb 12各2mg/L，VH 1mg/L。
10.根据权利要求7所述的发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，步骤203的培养过程中通过流加80％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵过程菌体所需的碳源，期间通过添加25％的氨水来调节pH。
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |