CN112912506A - 腺相关病毒载体生产细胞系 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及腺相关病毒(AAV)载体生产细胞，其包含编码以下的核酸序列：AAV rep和cap基因，辅助病毒基因，和所述AAV载体的DNA基因组；所述AAV rep基因包含内含子，所述内含子包含转录终止序列，所述转录终止序列具有位于所述转录终止序列上游的第一重组位点和位于所述转录终止序列下游的第二重组位点；且所述核酸序列全部一起整合在所述AAV载体生产细胞基因组内的单一基因座处。本发明还涉及用于产生AAV载体生产细胞系的方法。
Description
发明领域
本发明涉及AAV载体生产细胞系、用于产生其的方法以及用于所述方法中的核酸载体。
发明背景
腺相关病毒(AAV)在1965年被发现，作为腺病毒制备物的污染物。AAV具有近似4.7千碱基(kb)的线性单链DNA(ssDNA)基因组，其在末端具有两个145核苷酸长的反向末端重复(ITR)。ITR侧接两个开放阅读框(rep和cap基因)，其编码一系列Rep(复制)和Cap(衣壳)多肽。Rep多肽(Rep78、Rep68、Rep62和Rep40)是非结构蛋白，其参与AAV基因组的复制、拯救和整合。Cap蛋白(VP1、VP2和VP3)是结构蛋白，其形成病毒粒子衣壳。AAV已经被归类为依赖细小病毒属(细小病毒科的属)，因为其需要与辅助病毒(诸如腺病毒、单纯疱疹病毒(HSV)或牛痘病毒)共同感染用于在细胞培养中的生产性感染。例如，所述腺病毒提供了需要表达用于AAV复制和病毒粒子生产的基因：E1A、E1B、E2A、E4和VA (Atchison等人(1965)Science 149:754; Buller等人(1981) J. Virol. 40:241)。
AAV载体已经证明转导和长期基因表达，并且具有感染分裂中细胞和静止细胞两者的能力。此外，目前不知道AAV引起疾病，且因此在体内几乎不引起毒性和炎症。这些特性已导致AAV成为基因疗法应用的期望载体。
通常使用几种在细胞系中生产AAV载体的方法，并且所述方法可以分为两种不同的策略。第一种策略基于无野生型辅助病毒的瞬时共转染所有元件(表达AAV载体DNA(由AAV ITR侧接的转基因)的质粒，表达rep和cap基因的质粒，表达辅助病毒基因的质粒，其通常分离自腺病毒)，这是在宿主细胞(诸如HEK293细胞)中产生AAV载体所需的(Xia等人(1996) J. Virol. 70:8098)。尽管瞬时共转染方法生成高滴度的无腺病毒的AAV载体，但该过程非常费力，昂贵且难以按比例放大用于大规模生产。
第二种策略涉及细胞系的野生型辅助病毒(例如野生型腺病毒)感染，所述细胞系稳定地携带rep和cap基因，以及由AAV ITR侧接的转基因。尽管所述野生型腺病毒诱导方法可以在培养物中按比例放大并且以高滴度产生AAV载体，但从AAV产物完全除去腺病毒是非常有挑战性的。鉴于载体安全性和特异性，非常不期望野生型腺病毒的污染。
当前的AAV载体生产方法的缺点可以通过提供稳定的生产细胞系用于大规模临床级生产重组AAV载体用于临床用途来克服。然而，由于Rep蛋白对宿主细胞的细胞毒性和抗增殖作用可以严重限制其作为AAV载体生产细胞系的有用性，因此产生组成型表达rep和cap基因的细胞系是困难的。例如，已经显示Rep78诱导不依赖于p53的凋亡，这部分归因于Rep78的DNA结合和ATPase-解旋酶活性。此外，已知Rep78抑制细胞周期进程，特别是包括S期内的完全停滞。Rep78与Rep68一起还在细胞染色质中产生切口，诱导DNA损伤应答，导致G1和G2阻滞。另外，已经显示Rep78影响cAMP信号转导途径，其在调节细胞生长和发育中发挥中心作用(Schmidt等人(2000) J. Virol. 74:9441; Berthet等人(2005) PNAS 102:13634; Schmidt等人(2002) J. Virol. 76:1033)。
因此，组成型表达Rep蛋白的稳定细胞系不能存活以达到在大规模生物反应器中产生AAV载体所需的细胞密度。因此，期望具有一种稳定的生产细胞系以克服与现有方法和细胞系相关的一个或多个缺点，所述生产细胞系在其基因组中稳定地整合可诱导产生重组AAV载体所需的所有遗传元件和控制系统。
发明概述
本发明人已经开发了新型的AAV载体生产细胞系，其中将编码重组AAV生产所必不可少的病毒基因(AAV和辅助病毒)和转基因的所有核酸序列在AAV载体生产细胞基因组内的单个基因座处整合在一起，并且其中Rep蛋白的表达可以被调节以允许有效操纵生产细胞系，例如在细胞系生成、细胞建库和细胞扩增期间。通过使用表达控制系统来控制Rep的表达，其中来自两种rep启动子P5和P19的所有rep转录物都被过早终止，直至期望Rep表达的时间点。该系统的优点是可维持rep和cap基因的所有天然启动子，以维持有效产生AAV载体所需的各种rep和cap基因转录物的正确化学计量。此外，由于表达控制系统包含在rep基因内的内含子中(其在RNA加工期间被剪接出)，因此它还具有额外的优点：rep和cap基因的mRNA完整性不受影响。
为了产生本发明的新型AAV载体生产细胞系，本发明人已开发了制备生产细胞系的新方式，其涉及使用包含非哺乳动物复制起点且能够容纳至少25千碱基(kb)DNA的核酸载体，诸如细菌人工染色体，其携带对于重组AAV载体生产必不可少的腺相关病毒(AAV)和辅助基因以及转基因。
包含非哺乳动物复制起点且能够容纳至少25kb DNA(即，大型构建体DNA)的核酸载体的使用具有几个优点。首先，可以首先在非哺乳动物细胞(例如，微生物细胞，诸如细菌细胞)而不是哺乳动物宿主细胞中操纵载体，使得它们更易于用以发挥作用(例如，可以首先在大肠杆菌中操纵细菌人工染色体)。一旦已制备核酸载体，就可以将其引入哺乳动物宿主细胞中，并且可以选择其中核酸载体已整合至内源染色体中的一个或几个中的任何细胞以分离稳定的细胞系。
将核酸载体引入哺乳动物宿主细胞也可以在单个步骤中发生，有助于减少选择压力和沉默时间范围。这允许更快速筛选潜在的生产细胞并降低材料成本，因为与涉及筛选多种质粒载体中的每一种的先前方法相比，仅使用了单一载体。具体而言，该系统的使用减少质粒制造的成本，降低转染试剂(例如聚乙烯亚胺(PEI])的需求，减少所需的BenzonaseTM处理量(在病毒收获物中DNA的量减少，因此需要较少的BenzonaseTM以在下游处理中除去过量物)并降低测试成本(不需要测试病毒产物中的残留质粒)。这些优点与必须遵守GMP要求的用于治疗应用的重组AAV载体的大规模工业生产特别相关。
此外，因为将编码重组AAV载体产生必不可少的所有元件的所有核酸序列连续克隆在同一核酸载体内，所以当将该载体引入哺乳动物宿主细胞时，载体中并入的所有基因将整合在内源哺乳动物宿主细胞基因组内的一个基因座处。这使得更容易选择稳定的克隆，其中AAV生产所需的基因无一已经整合至可引起基因沉默的基因组区域中。当在几种质粒上提供AAV载体产生所需的基因(其可以在宿主细胞基因组内的不同基因座处随机整合)时，对于一种或多种基因可能发生这种情况。
因此，本发明提供了一种AAV载体生产细胞，其简单且针对用于治疗应用的大规模工业生产进行优化，并且克服了与现有细胞系相关的缺点。此外，本发明提供了用于产生所述AAV载体生产细胞和用于其中的核酸载体的方法。
因此，根据本发明的第一个方面，提供了腺相关病毒(AAV)载体生产细胞，其包含编码以下的核酸序列：
AAV rep和cap基因，
辅助病毒基因，和
所述AAV载体的DNA基因组；
其中所述AAV rep基因包含内含子，所述内含子包含转录终止序列，所述转录终止序列具有位于所述转录终止序列上游的第一重组位点和位于所述转录终止序列下游的第二重组位点；且
其中所述核酸序列全部一起整合在所述AAV载体生产细胞基因组内的单一基因座处。
根据本发明的一个进一步方面，提供了包含非哺乳动物复制起点且能够容纳至少25千碱基(kb)的DNA的核酸载体，其特征在于所述核酸载体包含编码以下的核酸序列：
AAV rep和cap基因；
辅助病毒基因；和
AAV载体的DNA基因组；
其中所述rep基因包含内含子，所述内含子包含转录终止序列，所述转录终止序列具有位于所述转录终止序列上游的第一重组位点和位于所述转录终止序列下游的第二重组位点；且
其中编码AAV rep和cap基因、每种辅助病毒基因和AAV载体的DNA基因组的核酸序列作为单独的表达盒排列在所述核酸载体内。
根据本发明的又一个进一步方面，提供了产生稳定的AAV载体生产细胞系的方法，其包括：
(a) 将如本文所定义的核酸载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中；和
(b) 在所述培养物内选择具有在整合至所述哺乳动物宿主细胞的内源染色体中的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞。
在本发明的一个进一步方面，提供了通过本文所述的方法获得的AAV载体生产细胞。
在本发明的一个进一步方面，提供了产生复制缺陷型AAV载体的方法，其包括：
(a) 将如本文所定义的核酸载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中；和
(b) 在所述培养物内选择具有在整合至所述哺乳动物宿主细胞的内源染色体中的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞；和
(c) 在产生复制缺陷型AAV载体的条件下进一步培养选择的哺乳动物宿主细胞。
在本发明的又一个进一步方面，提供了通过本文所述的方法获得的复制缺陷型AAV载体。
图/附图描述
图1：Peggy Sue western印迹，其显示用于Rep2Cap2的Rep蛋白的表达。
图2：Peggy Sue western印迹，其显示用于Rep2Cap5的Rep蛋白的表达。
图3：条形图，其显示在条件转录下使用瞬时转染方法通过产生的重组AAV载体与辅助病毒基因转导的% GFP阳性CHO细胞。
图4：条形图，其显示使用瞬时转染方法通过产生的重组AAV载体与Cre依赖性的rep/cap表达质粒转导的% GFP阳性CHO细胞。
图5：显示根据本发明的一个实施方案的核酸载体的示意图。
发明详述
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文提及的所有专利和出版物都通过引用以其整体并入。
术语“包含(comprising)”涵盖“包括(including)”或“由…组成(consisting)”，例如,“包含(comprising)”X的组合物可以仅由X组成或可以包括额外的某物，例如X+Y。
术语“基本上由...组成”将特征的范围限制为指定的材料或步骤以及不实质影响所请求保护的特征的基本特性的那些。
术语“由...组成”排除任何额外组分的存在。
关于数值x的术语“约”是指例如x±10%、5%、2%或1%。
如本文所用的术语“转染(transfection)”、“转化(transformation)”和“转导(transduction)”可用于描述将非哺乳动物或病毒的载体插入靶细胞。插入载体通常称为细菌细胞的转化和真核细胞的转染，尽管插入病毒载体也可称为转导。技术人员将意识到通常使用的不同的非病毒转染方法，其包括但不限于使用物理方法(例如，电穿孔、细胞挤压(cell squeezing)、声致穿孔、光学转染、原生质体融合、穿刺转染(impalefection)、磁转染、基因枪或颗粒轰击)、化学试剂(例如，磷酸钙、高度支化的有机化合物或阳离子聚合物)或阳离子脂质(例如，脂质转染)。许多转染方法需要使载体DNA溶液与细胞接触，然后使其生长并针对标记基因表达进行选择。
插入的遗传物质稳定或瞬时地存在于细胞中。为了稳定转染，插入的遗传物质被整合至宿主细胞基因组中，并且甚至在宿主细胞已经复制后也维持转基因表达。术语“稳定转染的”或“稳定细胞”是指能够将引入的遗传物质传递给它们的后代(即子细胞)的细胞系，这是因为转染的DNA已经并入内源染色体或经由外源染色体的稳定遗传。
与稳定转染的基因相反，瞬时转染的基因仅持续有限的时间段表达，并且不整合至宿主细胞基因组中。瞬时转染的遗传物质可能由于环境因素和细胞分裂而丢失。
术语“生产细胞”是指具有稳定整合至宿主细胞基因组中的AAV包装基因(rep和cap基因)、所需的辅助病毒基因和重组AAV载体的DNA基因组(例如，由两个AAV反向末端重复(ITR)侧接的目标转基因)的细胞系。本领域技术人员将理解，本文所述的核酸载体可用于生成生产细胞系。将进一步理解，本文所述的生产细胞不指其中已经整合天然AAV前病毒的细胞。
术语“基因”是本领域中众所周知的术语。如本文所用，基因包括编码蛋白或被转录成功能性RNA产物的表达的核酸序列。通常，基因包括表达的核酸序列，其具有可操作连接的调节序列，包括但不限于启动子、增强子、操纵子和终止子。如果两个序列相对于彼此顺式排列以预期的方式起作用，则它们是“可操作连接的”。术语“表达的”、“表达”意指通过其将核酸中编码的信息(通常是基因)转化为核糖核酸和/或蛋白或其翻译后修饰形式的整个过程。
如本文所用的“转基因”是编码目标基因、诸如但不限于允许遗传或药物选择的基因(例如，赋予抗生素抗性的基因，或报告基因)的核酸序列。或者，该基因可以是替代或增强缺陷基因功能的治疗性基因，其用于针对病原体进行免疫以引发免疫原性应答。
本领域中已知的一些重组AAV载体制造方法涉及将转移载体(包含由两个AAV ITR侧接的目标转基因的核酸载体)瞬时转染至稳定表达包装基因(并且在一些情况下还有辅助病毒基因)的细胞系中。该过程减少完全瞬时转染过程的缺点，但没有完全除去它们。因此，这种重组AAV载体制造的杂合方法可论证地具有稳定和瞬时方法的综合复杂性。
与利用瞬时转染的方法相比，基于生产细胞的AAV载体制造需要更复杂的细胞系开发阶段。然而，该方法具有以下优点：在制造期间需要较少的起始材料和操作，使得可能出错的要素更少。而且，如本文所公开的简化的制造过程对于可扩展至大规模、工业上可应用的生产系统更好，并且能够更好地满足大量患者群体的需求。
在AAV的上下文中，术语“病毒载体”或“病毒粒子”是指适合用于携带待转移至宿主细胞中的遗传物质的AAV颗粒(即，AAV载体，在本专利申请中别处也称为“重组AAV载体”)。AAV载体可以被称为空的或满的，也就是说，分别不含或含有AAV载体的DNA基因组。在AAV载体的情况下，已对AAV基因组进行修饰，以除去两个AAV ITR序列之间的rep和cap基因。本发明的AAV载体(即AAV载体)的DNA基因组通常包含由两个AAV ITR侧接的转基因。将理解的是，术语“核酸载体”不指或不包括“病毒载体”(例如，将用于转移至宿主细胞中的DNA基因组衣壳化的AAV载体)。相反，术语“核酸载体”是指遗传构建体。
术语“内含子”或“内含子序列”是指基因内的非编码序列，其在将前体信使RNA修饰成成熟信使RNA (mRNA)期间通过RNA剪接除去。因此，该术语既指基因内的DNA序列，又指未加工的前体信使RNA转录物中的相应序列。在编码基因的核酸序列包含与插入的序列一起形成共有剪接供体/受体序列的核酸时，可以将内含子插入该位置。然后在转录后加工期间剪接出插入的序列。用于将编码内含子的核酸序列插入表达的序列的方法是本领域中众所周知的，并且可以使用任何此类方法来这么做。
或者，已显示在增强子/启动子区域的下游和cDNA插入物的上游使用内含子增加基因表达的水平。表达的增加依赖于特定的cDNA插入物。
因此，本发明的核酸载体可以包括内含子，诸如人绒毛膜促性腺激素内含子、人β球蛋白内含子、兔β球蛋白内含子II或嵌合人β球蛋白-免疫球蛋白内含子。在一个实施方案中，内含子是人β球蛋白内含子和/或兔β球蛋白内含子II。
术语“转录终止序列”、“转录终止子”是指通过在新合成的RNA转录物中提供信号来介导转录终止的核酸序列，所述信号触发从转录复合物(即RNA聚合酶)释放转录RNA的过程。在真核转录中，所述转录终止序列是聚腺苷酸化(polyA)信号序列，其使得宿主因子能够在转录期间将聚腺苷(polyA)尾部添加至新生mRNA的末端。polyA尾部是一段最多达300个腺苷核糖核苷酸的序列，其保护mRNA免于酶促降解并且还有助于翻译。因此，本发明的核酸载体可以包括polyA信号序列，诸如猿猴病毒40 (SV40)早期或晚期polyA信号、人β球蛋白或兔β球蛋白polyA信号、人胰岛素polyA信号或牛生长激素polyA信号。在一个实施方案中，polyA信号序列是猿猴病毒40 (SV40) polyA信号。在另一个实施方案中，polyA信号序列是人β球蛋白polyA信号。
术语“重组位点”和“重组酶”是本领域中众所周知的，并且用于指位点特异性重组过程的组分。例如，酪氨酸重组酶的成员，即Cre和FLP，已经在本领域中有效地用作在真核生物中用于介导位点特异性DNA插入或靶向的DNA缺失的分子工具。Cre重组酶重组一对短靶序列或重组位点，称为LoxP序列。类似地，FLP重组酶识别并靶向FRT序列。通过进一步实例的方式，重组酶包括转座酶，其将一对短靶序列或重组位点(称为转座子反向末端重复(转座子ITR))重组。DNA转座子，也称为2类可转座元件，在两个末端被末端反向重复侧接。反向重复是彼此的互补物(在一个末端的重复是相对末端的重复的镜像，并且由与相对末端的重复互补的核苷酸构成)。
如本领域中所用的术语“基因座”是指染色体上或基因组DNA的任何区域上的特定位置，出于正式连锁分析或分子遗传研究的目的，所述特定位置被认为是离散的遗传单位。为了如本发明中在宿主细胞基因组中整合对于编码产生重组AAV载体所必需的基因的核酸序列的目的，离散的遗传单位是内源宿主细胞基因组上的两个DNA碱基对，在其之间插入序列(例如插入位点)。因此，如本文所用的术语“基因座”不是指基因组DNA的大区域，例如含有大基因家族的兆碱基大小的区域，而是指基因组上的特定位置。
术语“核酸载体”是指能够将外来(即外源)遗传物质人工携带至另一细胞中的媒介物，其可以在所述另一细胞中复制和/或表达。载体的实例包括非哺乳动物核酸载体，诸如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、P1-衍生的人工染色体(PAC)、粘粒或F粘粒(fosmid)。术语“核酸载体DNA”是指核酸载体的DNA，在其中包含编码各种基因或元件的核酸序列。
术语“非哺乳动物复制起点”是指其中引发复制并源自非哺乳动物来源的核酸序列。这使得本文所述的核酸载体能够在合适的宿主细胞(例如，微生物细胞，诸如细菌或酵母细胞)中与内源染色体一起稳定复制和分离，使得其可传递给宿主细胞后代(除了当宿主细胞是哺乳动物宿主细胞时)。在哺乳动物宿主细胞中，具有非哺乳动物复制起点的核酸载体将整合至哺乳动物宿主细胞的内源染色体中或在哺乳动物宿主细胞复制后丢失。例如，具有非哺乳动物复制起点的核酸载体诸如细菌人工染色体(BAC)、P1-衍生的人工染色体(PAC)、粘粒或F粘粒能够在细菌细胞(诸如大肠杆菌)中与内源染色体一起稳定复制和分离。然而，如果将它们引入哺乳动物宿主细胞，BAC、PAC、粘粒、F粘粒或质粒将整合或在哺乳动物宿主细胞复制后丢失。酵母人工染色体(YAC)能够在酵母细胞中与内源染色体一起稳定复制和分离。然而，如果它们被引入哺乳动物宿主细胞，YAC将整合或在哺乳动物宿主细胞复制后丢失。因此，在本上下文中，本文所述的核酸载体充当DNA的储库(即，对于产生AAV载体所必需的基因)，其可容易地转移至哺乳动物细胞中以生成用于产生重组AAV载体的稳定生产细胞系。非哺乳动物复制起点的实例包括细菌的复制起点，诸如oriC、oriV或oriS，或酵母的复制起点，也称为自主复制序列(ARS元件)。
在一个实施方案中，所述核酸载体包含非哺乳动物的复制起点并且能够容纳至少25千碱基(kb)的DNA。在一个实施方案中，核酸载体能够容纳至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340或350kb的DNA。应理解的是，提及“容纳能力”具有其通常的含义，并且暗示核酸载体的插入物大小的上限不小于请求保护的大小(即不小于25kb的DNA)。
术语“内源染色体”或“内源基因组”是指在生成或引入外源核酸载体诸如本文所述的核酸载体之前在宿主细胞中发现的基因组DNA。优选地，所述核酸载体是细菌人工染色体。
术语“启动子”是指驱动基因表达的序列。为了驱动高水平表达，使用高效启动子可以是有益的。合适的启动子的实例可以包括启动子诸如人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子或人延伸因子1-α(pEF)启动子。在一个实施方案中，所述启动子是诱导型启动子(在本申请中的别处也称为条件启动子)，以允许对其所连接的基因的表达进行时间调节。诱导型启动子和诱导型表达系统是本领域中众所周知的。
术语“可选择标记”是指将有助于选择活跃地表达核酸序列的细胞的基因。合适的可选择标记的实例包括编码对抗生素的抗性的酶(即抗生素抗性基因)，所述抗生素例如卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟菌素或博莱霉素。合适的可选择标记的另一个实例是荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)或蓝色荧光蛋白(BFP)。
“基因扩增”是指这样的过程，通过该过程，基因组的特定DNA序列(即基因)相对于基因组中的其他序列不成比例地复制，使得扩增的DNA序列变得以比这种不成比例的复制前基因组中最初存在的拷贝数更高的拷贝数存在。如本文关于基因或核酸序列所用的“扩增的”或“扩增”是指凭借基因扩增以两个或更多个拷贝存在于宿主细胞系中的基因或核酸序列。
提及如本文所用的“可扩增选择标记基因”是指允许在适当的生长条件下扩增该基因的基因。所述可扩增选择标记基因能够通过扩增以增加表达产物(即，由可扩增选择标记基因编码的蛋白的表达)而响应于抑制剂或必需代谢产物的缺乏。在一个实施方案中，所述可扩增选择标记基因可以被表征为能够与营养缺陷型宿主互补。
如本文所用的术语“表达构建体”或“表达盒”是指能够驱动一种或多种并入的多核苷酸的表达的功能性表达单元，也就是说含有一个或多个基因和控制其表达的序列的DNA序列。表达盒通常包括该多核苷酸和该多核苷酸的转录和翻译所必需的组分。例如，所述盒可以包括包含启动子、翻译起始信号、转录终止子(例如polyA信号序列)和/或自切割肽序列(例如P2A序列)的核酸序列(即重组DNA)。在一个实施方案中，所述单独表达盒包含启动子和/或转录终止子。在一个实施方案中，所述单独表达盒包含被IRES分隔的两个基因，两者均从单一启动子转录。为了避免疑问，rep和cap基因(其从3种不同启动子产生几种转录物，然后将其剪接成7种不同蛋白)形成单一连续基因元件，并且由于AAV基因组的紧凑性质而不能彼此分离。因此，技术人员将理解，rep和cap基因包含在单个表达盒中。因此，表达盒可以包含多于一个启动子。
在一个实施方案中，排列核酸载体中的所有表达盒，使得它们以相同方向转录。先前已显示这提高构建体中表达盒的总体表达(Throm等人, (2009) Blood 113: 5104-5110)。
腺相关病毒(AAV)载体生产细胞
根据本发明的一个方面，提供了腺相关病毒(AAV)载体生产细胞，其包含编码以下的核酸序列：
AAV rep和cap基因，
辅助病毒基因，和
所述AAV载体的DNA基因组；
其中所述AAV rep基因包含内含子，所述内含子包含转录终止序列，所述转录终止序列具有位于所述转录终止序列上游的第一重组位点和位于所述转录终止序列下游的第二重组位点；且
其中所述核酸序列全部一起整合于AAV载体生产细胞基因组内的单一基因座处。
应理解的是，这些编码各种基因的核酸序列作为单独的表达盒存在，其防止任何重组以形成能够复制的病毒的风险。为了避免疑问，编码rep和cap基因的核酸序列存在于同一(即一个)表达盒中。
在一个实施方案中，所述AAV载体生产细胞是哺乳动物细胞。在一个进一步实施方案中，所述哺乳动物细胞选自HEK293细胞、CHO细胞、Jurkat细胞、K562细胞、PerC6细胞、HeLa细胞或其衍生物或功能等同物。在又一个进一步实施方案中，所述哺乳动物宿主细胞是HEK293细胞，或源自HEK293细胞。此类细胞可以是粘附细胞系(即它们以附着于表面的单层生长)或悬浮适应/非粘附细胞系(即它们在培养基中悬浮生长)。在一个进一步实施方案中，所述HEK293细胞是HEK293T细胞。
术语“HEK293细胞”是指用机械剪切的腺病毒5 (Ad5) DNA的片段转染的人胚胎肾脏细胞(Graham等人(1977) J. Gen. Virol. 36:59)。由转录单元E1A和E1B组成的腺病毒5基因组的早期区域1 (E1)稳定地整合至HEK293细胞基因组中。由于HEK293细胞稳定表达Ad5 E1A和E1B，因此在HEK293生产细胞中重组AAV的产生仅需要用剩余的必需腺病毒辅助基因(E2A、E4和VA)和AAV基因组进行转染。因此，HEK293通常用于AAV产生中。合适的市售细胞系的其他实例包括T REX™ (Life Technologies)细胞系。因此，在一个实施方案中，所述辅助病毒基因包括全部或部分辅助病毒基因E2A、E4和VA。
腺相关病毒
腺相关病毒(AAV)是依赖细小病毒属(genus Dependoparvovirus)的一部分，其属于细小病毒科。AAV是一种小的、无包膜的、二十面体病毒，其具有近似4.7千碱基(kb)至6kb长的单链DNA (ssDNA)基因组。已经发现了几种血清型，其中AAV血清型2 (AAV2)是迄今为止检查最广泛的血清型。
AAV基因组由两个145碱基的反向末端重复(ITR)侧接的两个开放阅读框rep和cap基因(在本申请中别处也被称为rep/cap基因)组成。这些ITR碱基对允许合成互补DNA链。翻译rep和cap基因以产生多种不同的蛋白：rep基因编码AAV生命周期所需的蛋白Rep78、Rep68、Rep52、Rep40；cap基因编码作为衣壳蛋白的VP1、VP2、VP3。当构建AAV转移质粒时，将转基因置于两个ITR之间，并且rep和cap基因以反式提供。这是为了确保宿主细胞产生的重组AAV载体是复制缺陷的。
AAV rep编码序列至少编码病毒基因组复制和包装成新病毒粒子所必需的那些复制蛋白。rep基因通常将编码至少一个大Rep蛋白(即Rep78/68)和一个小Rep蛋白(即Rep52/40)，然而，在本文所述的实施方案中，rep基因不需要编码所有AAV Rep蛋白。因此，在一个实施方案中，Rep蛋白包含Rep78蛋白和Rep52和/或Rep40蛋白。在一个替代实施方案中，Rep蛋白包含Rep68和Rep52和/或Rep40蛋白。在一个进一步实施方案中，Rep蛋白包含Rep68和Rep52蛋白，Rep68和Rep40蛋白，Rep78和Rep52蛋白或Rep78和Rep40蛋白。在又一个进一步实施方案中，Rep蛋白包含Rep78、Rep68、Rep52和Rep40蛋白。
AAV cap基因编码形成功能性AAV衣壳(即可以包装DNA并感染靶细胞)的结构蛋白。通常，所述cap基因将编码所有AAV衣壳亚基，但只要产生功能性衣壳，就可以编码少于所有衣壳亚基。在一个实施方案中，Cap蛋白包含VP1、VP2和/或VP3。
AAV ITR序列各自包含145个碱基，并且是AAV基因组复制和包装成衣壳所必需的唯一顺式作用元件。通常，ITR将在载体基因组的5'和3'末端，并且侧接异源核酸(转基因)，但不需要与其邻接。ITR可以彼此相同或不同。
AAV ITR可以来自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11或13，蛇AAV，禽AAV，牛AAV，犬AAV，马AAV，牛AAV，山羊AAV，虾AAV或现在已知或以后发现的任何其他AAV。AAV ITR不需要具有天然末端重复序列(例如，天然AAV ITR序列可以通过插入、缺失、截短和/或错义突变进行改变)，只要末端重复介导期望的功能，例如复制、病毒包装和/或整合等。
提及如本文所用的AAV包括，但不限于，AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型3(包括血清型3A和3B)(AAV3)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)、AAV血清型12(AAV12)、AAV血清型13(AAV13)、蛇AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV和现在已知或以后发现的任何其他AAV。参见例如Fields等人，Virology，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)。
提及AAV可以包括人工AAV血清型，其包括但不限于具有非天然存在的衣壳蛋白的AAV。可以通过任何合适的技术，使用一种AAV血清型序列(例如VP1衣壳蛋白的片段)与异源序列的组合，生成这种人工衣壳，所述异源序列可以获得自另一种AAV血清型(已知或新型的)、相同AAV血清型的非连续部分、非AAV病毒来源或非病毒来源。人工AAV血清型可以是，但不限于，嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或“人源化”AAV衣壳。
在一个实施方案中，编码AAV载体的rep和cap基因和/或DNA基因组的核酸序列(即AAV核酸序列)源自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13或其组合。在一个进一步实施方案中，编码AAV载体的rep和cap基因和/或DNA基因组的核酸序列源自AAV2、AAV5、AAV8和/或AAV9。
或者，在一个实施方案中，rep基因序列来自AAV血清型，其不同于提供cap序列的AAV血清型。因此，在一个实施方案中，将rep序列与不同AAV血清型的cap序列框内融合以形成嵌合AAV载体。例如，在一个实施方案中，rep基因源自AAV2，且cap基因源自AAV2或AAV5，以分别产生AAV2-样和AAV5-样颗粒。这些可以被命名为rep2cap2和rep2cap5。
AAV的各种血清型的基因组序列以及天然ITR、Rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域中已知的。此类序列可见于文献中或公共数据库诸如GenBank中。参见，例如，GenBank登录号NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、AY631966、AX753250、EU285562、NC_001358、NC_001540、AF513851、AF513852和AY530579；其公开内容通过引用并入本文用于教导AAV核酸和氨基酸序列。
组织特异性被认为由衣壳血清型决定，且因此AAV载体的假型化可用于改变其向性范围。这使AAV成为优先转导特定细胞类型的有用系统。不受理论所束缚，表1概述用于转导特定组织的最佳血清型：
表1：用于转导给定器官的最佳AAV血清型
| 组织 | 最佳血清型 |
| CNS | AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9 |
| 心脏 | AAV1、AAV8、AAV9 |
| 肾 | AAV2 |
| 肝 | AAV2、AAV3、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10 |
| 肺 | AAV4、AAV5、AAV6、AAV9 |
| 胰腺 | AAV8 |
| 感光细胞 | AAV2、AAV5、AAV8 |
| RPE(视网膜色素上皮) | AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8 |
| 骨骼肌 | AAV1、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9 |
| 脑 | AAV4、AAV9、AAV10 |
提及“假型化”是指来自不同病毒血清型的衣壳和基因组的混合。这些血清型用斜杠表示，例如，AAV2/5指示一种病毒，其包含包装在来自AAV血清型5的衣壳中的AAV血清型2的基因组。这些假型化病毒的使用可以提高转导效率以及改变向性。例如，AAV2/5靶向未由AAV2/2有效转导的神经元，并且在脑中更广泛分布，表明提高的转导效率。这些杂合病毒中的许多已经在本领域中被很好地表征。
辅助病毒基因
除了rep和cap基因以外，AAV还需要辅助病毒或含有AAV复制所必需的基因的质粒，因为AAV不具有自身复制的能力。在辅助病毒不存在的情况下，AAV可以并入宿主细胞基因组中，在染色体19的特定位点处。AAV复制所必需的辅助病毒序列是本领域中已知的，例如，参见Cell & Gene Therapy Insights, “Gene Therapy and Viral Vectors:Advances and Challenges” (Cell Gene Therapy Insights 2016;2(5),553-575)。通常，这些序列将由辅助腺病毒或疱疹病毒载体提供。所述辅助病毒基因编码蛋白和非编码RNA。
在一个实施方案中，所述辅助病毒基因源自腺病毒。在一个进一步实施方案中，所述腺病毒选自腺病毒2和腺病毒5。在一个实施方案中，所述辅助病毒基因包含E1A、E1B、E2A、E4和VA基因。
一些辅助基因可以由哺乳动物宿主细胞系表达，而其他辅助基因通过载体引入。例如，HEK 293细胞(ATCC CRL-1573)组成型产生腺病毒E1A和E1B蛋白。因此，为了产生重组AAV，仅将产生重组AAV载体所需的辅助基因，诸如E2A、E4和VA，引入HEK293宿主细胞中。
在一个实施方案中，所述辅助病毒基因包含源自腺病毒、尤其是腺病毒2的E4、E2A和VA基因各自的全部或部分。已经发现AAV复制不需要所有天然腺病毒基因，例如，AAV复制仅需要由E4基因的开放阅读框6(ORF 6)编码的E4 34 kD蛋白。因此，在一个进一步实施方案中，所述辅助病毒基因包含E4 ORF6编码区、腺病毒E2A 72kD编码区(编码E2A 72kD DNA-结合蛋白)和VA基因。在又一个进一步实施方案中，所述辅助病毒基因还包含腺病毒E1A和E1B基因。
在一个替代实施方案中，所述辅助病毒基因源自疱疹病毒。在一个进一步实施方案中，所述疱疹病毒选自：单纯疱疹病毒(HSV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)和伪狂犬病病毒(PRV)。
每个辅助病毒基因可以由各自的原始启动子或异源启动子控制。
已经报道，在HEK293细胞中产生AAV所需的腺病毒辅助基因(E2A、E4和VA)对宿主细胞有潜在毒性(Ferrari等人, 1996, Journal of Virology 70: 3227-3234)。当转染至哺乳动物细胞中时，这些辅助基因的天然启动子有组成型活性。因此，在一个实施方案中，所述辅助病毒基因中的一种或多种在转录控制之下。在一个实施方案中，所有辅助病毒基因都在转录控制之下。在又另一个实施方案中，E4、E2A和VA辅助病毒基因在转录控制之下。在一个进一步实施方案中，CMV-TO2启动子与E2A基因和/或E4基因可操作连接。在又一个进一步实施方案中，TetO操纵子序列与VA的天然启动子可操作连接。
通过将AAV载体产生所需的辅助病毒基因整合至宿主细胞基因组中，应理解该方法可以被认为是无辅助病毒的方法，因为其不需要与野生型辅助病毒共感染。因此，这避免野生型辅助病毒(例如腺病毒)的污染，鉴于载体安全性和特异性，这是非常不期望的。
REP抑制
生成其中重组AAV载体所需的所有遗传元件稳定整合至宿主细胞基因组中的生产细胞系的主要困难是Rep蛋白的组成型表达，众所周知，Rep蛋白是细胞毒性(Yang等人,1994, J. Virol. 68:4847-4856)和抑制细胞的(Schmidt等人, 2000, J. Virol. 74:9441-9450)。这意味着稳定表达Rep蛋白的细胞将无法存活以达到在大规模生物反应器中产生重组AAV载体所需的密度。由于基于E1A介导的rep基因启动子p5和p19的活化，在生成基于HEK293的生产细胞系时，该困难变得复杂。调节Rep表达的另一层复杂性是p19启动子的位置，其位于由p5启动子表达的Rep蛋白(Rep78和Rep68)的编码区域内。作为结果，p19启动子的操纵将不可避免地引起Rep78和Rep68的编码序列中的突变，其可能导致这些必需的Rep蛋白的结构和功能的破坏。此外，对天然rep启动子的破坏将影响有效AAV载体产生所需的各种Rep和Cap蛋白的正确化学计量。
因此，Rep表达需要在生产细胞生长期间被紧密调节，并在AAV载体生产期间被高度诱导。
本发明的AAV载体生产细胞在rep基因内包含双重剪接开关，用于控制Rep蛋白的表达。双重剪接开关是包含可切除的转录终止序列的内含子(“终止内含子”)。可切除的终止序列是由一对重组位点侧接的终止序列。除了转录终止序列以外，在侧接重组位点内可存在额外核酸序列。内含子和内含子序列的实例是本领域中众所周知的。在一个实施方案中，所述内含子是来自人绒毛膜促性腺激素基因的内含子。
终止内含子位于Rep编码区内。修饰所述Rep编码区，使得当插入时，内含子的5’和3’末端以及它们与之邻接的Rep编码区的核酸序列分别形成剪接供体/受体序列，以使得能够在RNA加工期间剪接出终止内含子。例如，在紧接内含子的5’的外显子侧可能存在A/C AG序列，并且在紧接内含子的3’的外显子侧是G核苷酸。因此，可以将所述内含子插入rep基因中的AAG ^ G (其中^表示插入位点)序列中，以提供最终序列为内含子-CAG / G的AAG/GTPuAGU-中间(Pu表示嘌呤)。因此，可以将终止内含子插入rep基因中存在AAGG或CAGG序列的任何位置。
在一个实施方案中，所述终止内含子位于p19启动子下游的Rep编码区内。以该方式，将所述终止内含子定位在由所有四个Rep蛋白共有的阅读框内，使得可以同时控制所有四种rep基因产物的表达。
当终止内含子有活性时，rep基因的转录在转录终止序列处提前终止，使得防止全长rep转录物的产生并抑制Rep表达。以这种方式，Rep产生的水平足够低或完全不存在以减轻对细胞的毒性，并允许携带失活的rep基因的细胞在细胞生长期间繁殖。
所述转录终止序列可以是能够转录终止的任何序列。在一个实施方案中，所述转录终止序列是聚腺苷酸化(polyA)信号序列。在一个进一步实施方案中，所述终止内含子包含串联的一个或多个polyA信号序列，诸如串联的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个polyA信号序列。在一个优选的实施方案中，所述终止内含子包含串联的3个polyA信号序列。
Qiao等人 (2002 J. Virol.76:13015-13027)已经显示，基因和一个或多个polyA信号序列的组合在转录终止中具有协同作用。因此，在一个实施方案中，所述转录终止序列可以是基因。在一个进一步实施方案中，所述转录终止序列是polyA信号序列和基因的组合。在又一个进一步实施方案中，所述终止序列是串联的两个或更多个polyA信号序列，诸如2、3、4、5、6、7、8、9或更多个，随后为基因。在一个实施方案中，所述终止序列是串联的三个polyA信号序列，随后为基因。为了方便建立具有在双重剪接开关的控制下的rep基因的细胞系，在一个实施方案中，所述转录终止序列的基因是可选择标记，诸如但不限于潮霉素、嘌呤霉素或杀稻瘟素S抗性基因。
rep基因在重组酶(重组酶)存在的情况下被活化，因为终止内含子从rep基因除去。所述重组酶通过重组事件剪接出内含子，或反转两个包含终止序列的重组位点之间的区域。反转终止序列也具有终止转录抑制的作用。以这种方式，恢复了rep基因的全长的表达。内含子的剩余部分经由RNA剪接从全长前体mRNA精确除去，恢复了rep基因的编码序列，以产生四个Rep蛋白。Rep表达的这种控制被称为“双重剪接开关”，因为在转录序列能够被翻译成Rep蛋白之前，发生两个剪接事件(DNA和RNA剪接)。
在rep/cap基因插入转移载体的ITR之间的情况下，在除去转录终止序列后，rep基因中的内含子残基可能大小足够长以充当填充物，以减轻能够复制的AAV的形成。例如，在一个示例性实施方案中，残余内含子使rep/cap基因大小增加404 bp，这足以使其对于AAV衣壳包装限制太大。
位点特异性DNA重组酶广泛用于多细胞生物中，以操纵基因组的结构，并且进而控制基因表达。源自细菌和真菌的这些酶催化对于每种重组酶特异性的短靶位点(即重组位点)序列之间的定向敏感重组反应。许多类型的位点特异性重组系统是本领域中已知的，并且可以在本发明中使用任何合适的重组系统。例如，在一个实施方案中，重组位点选自或源自λ噬菌体的int/att系统、噬菌体P1的Cre/lox系统、酵母的FLP/FRT系统、噬菌体Mu的Gin/gix重组酶系统、Cin重组酶系统、大肠杆菌的Pin重组酶系统和pSR1质粒的R/RS系统或其任何组合。
最广泛使用的重组酶是Cre和FLP，其分别识别LoxP和FRT重组位点。在一个实施方案中，所述重组酶是Cre重组酶或FLP重组酶。在一个实施方案中，所述Cre重组酶是密码子优化的Cre重组酶。在一个实施方案中，所述重组位点是LoxP位点。在一个实施方案中，所述重组位点是FRT位点。
转座子/转座酶系统是本领域中众所周知的(Pray, L. (2008) Transposons: The jumping genes. Nature Education 1(1):204)。在一个实施方案中，重组位点和重组酶是转座子/转座酶系统。1型转座子保持在原处并自我复制，用于插入其他位置，而不是2型转座子的期望的“剪切和粘贴”机制，其中DNA的片段从一个位置移动至另一个位置。因此，在一个实施方案中，所述转座子是2型转座子。在一个实施方案中，所述转座子不是1型转座子。在一个实施方案中，所述重组位点是转座子反向末端重复(转座子ITR)。在一个实施方案中，所述重组酶是转座酶。在一个实施方案中，所述转座子ITR和转座酶是真核的。在实施方案中，所述重组位点和重组酶是真核转座子/转座酶系统。在一个实施方案中，所述转座子ITR和转座酶来自相同物种。合适的转座子ITR包括但不限于睡美人(SleepingBeauty)，来自北美豹蛙的Tc1-样转座子，来自粉纹夜蛾(T. ni)的piggyBac转座子，来自青鳉的hAT-样转座子Tol2，和来自Macdunnoghia crassisigna (M. crassisigna)、Bactrocera minuta、Eumeta japonica或棉铃虫(Helicoverpa armigera)的转座子。在一个实施方案中，所述转座子ITR和转座酶来自M. crassisigna。
已经报道，可能通过突变piggyBac系统中使用的甘蓝蠖度尺蛾(cabbage loopermoth)(粉纹夜蛾(Trichoplusia ni))转座酶中的3个氨基酸(R372A、K375A、D450N)来产生切除+整合-表型(Li等人, 2013 “PiggyBac transposase tools for genomeengineering” PNAS 110: E2279-E2287，突变的反式)。以这种方式，通过将DOX添加至用这种构建体稳定转染的细胞中来表达转座酶将导致不可逆地除去rep启动子下游的转录终止子，导致更大的Rep表达。
来自Macdunnoughia crassisigna的转座酶与来自粉纹夜蛾的转座酶具有98.82%同一性。Yusa等人 (Yusa K等人 “A hyperactive piggyBac transposase for mammalianapplications, 2011, PNAS 108: 1531-1536)发现粉纹夜蛾转座酶中的7个氨基酸取代(I30V、S103P、G165S、M282V、S509G、N538K、N571S)导致过高活性表型。这些取代被应用于M. crassisigna转座酶氨基酸序列。另外，Li等人 (2013, PNAS 110: E2279-E2287)发现在粉纹夜蛾转座酶中导致切除+整合-表型的3个氨基酸取代(R372A、K375A、D450N)也被应用于M. crassisigna转座酶序列。
修饰的M. crassisigna转座酶氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)。在一个实施方案中，编码所述转座酶的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码来自粉纹夜蛾的转座酶的氨基酸序列包含突变R372A、K375A和D450N。在一个实施方案中，所述转座酶包含突变R372A、K375A和D450N。在一个实施方案中，编码来自M. crassisigna的转座酶的氨基酸序列包含突变I30V、S103P、G165S、M282V、S509G、N538K、N571S。在一个实施方案中，所述转座酶包含突变I30V、S103P、G165S、M282V、S509G、N538K、N571S。在一个实施方案中，编码来自M. crassisigna的转座酶的氨基酸序列包含突变I30V、S103P、G165S、M282V、S509G、N538K、N571S、R372A、K375A和D450N。在一个实施方案中，所述转座酶包含突变I30V、S103P、G165S、M282V、S509G、N538K、N571S、R372A、K375A和D450N。
可以使用许多方法将重组酶引入稳定表达包含终止内含子的rep基因的生产细胞中。所述重组酶可以以蛋白形式或作为编码重组酶基因的核酸序列提供给AAV载体生产细胞。用于将外来蛋白或编码目标蛋白的核酸序列引入细胞的任何方法是本领域中众所周知的，可用于将重组酶引入AAV载体生产细胞。在一种方法中，可以在培养基中提供重组酶用于例如通过脂质转染跨细胞膜运输。在另一种方法中，可以将编码重组酶的核酸序列转移至生产细胞中。本领域中众所周知的任何基因转移方法都是适用的。因此，在一个实施方案中，所述AAV载体生产细胞进一步包含编码重组酶基因的核酸。然而，从安全性方面(病毒介导的基因转移)或成本方面(非病毒介导的基因转移)来看，在大规模AAV载体生产中为治疗用途增加基因转移步骤可能是不期望的。
因此，通过经由将重组酶基因稳定转染至生产细胞基因组中来产生AAV载体生产细胞，可以避免分开的重组酶基因转移步骤。在一个实施方案中，所述AAV载体生产细胞基因组包含编码重组酶基因的核酸序列。在一个进一步实施方案中，所述编码重组酶基因的核酸序列与编码AAV rep和cap基因、辅助病毒基因和AAV载体的DNA基因组的核酸序列一起整合在所述AAV载体生产细胞基因组内的单一基因座处。
在AAV载体生产细胞具有稳定整合至其基因组中的重组酶基因的情况下，将需要抑制重组酶基因的表达，直至当期望诱导rep基因时。因此，需要重组酶控制系统。在没有重组酶控制系统的情况下，所述重组酶基因将组成型表达以产生重组酶，所述重组酶将进而识别重组位点并剪接出它们之间含有终止序列的区域，导致产生Rep蛋白。因此，在一个实施方案中，所述AAV载体生产细胞进一步包含重组酶控制系统。
所述重组酶控制系统是能够隔绝重组酶的任何系统。所述重组酶控制系统可以起作用以控制重组酶基因的表达，控制重组酶基因转录物的翻译或控制重组酶活性。
在一个实施方案中，所述重组酶控制系统包含在诱导型启动子(即条件启动子)的控制下的重组酶基因，这在下面进一步解释。
在一个进一步实施方案中，所述重组酶控制系统包含与重组酶基因可操作连接的突变的类固醇激素受体配体-结合结构域(LBD)。某些重组酶具有易位入哺乳动物细胞核的倾向。例如，已经显示Cre蛋白含有某些决定簇序列，其允许主动转运至核中(Andreas等人,2002, Nucleic Acids Res 27:4703-4709)。为了在蛋白水平上控制重组酶活性，已经产生与类固醇激素受体配体-结合结构域(LBD)融合的嵌合重组酶。此类嵌合重组酶的LBD能够与合成激动剂相互作用，但不能结合生理类固醇。在没有合成激动剂的情况下，所述结合结构域与细胞质中存在的热休克蛋白复合物相互作用，导致重组酶易位入核中受损，并由于空间位阻而降低活性。相反，在合成激动剂存在的情况下，配体未结合结构域不与细胞质蛋白相互作用，并且重组是自由发生的。
在一个实施方案中，所述LBD是雌激素受体配体结合结构域。在这种情况下，所述合成激动剂是他莫昔芬。在一个进一步实施方案中，所述雌激素受体配体结合结构域是ERT2。ERT2是对他莫昔芬具有更高亲和力的雌激素受体配体结合结构域。在一个实施方案中，重组酶，任选地密码子优化的重组酶，被ERT2侧接。Casanova等人 (2002, Genesis 34:208-214)生成了通过将两个ERT2结构域融合至密码子改进的Cre重组酶的两个末端上而生成的他莫昔芬可诱导的融合蛋白用于脑中的重组研究。据报道，该融合蛋白在他莫昔芬不存在的情况下是细胞质的，并且在他莫昔芬施用后易位入核中。在他莫昔芬不存在的情况下，未检测到背景重组酶活性。
在一个进一步实施方案中，所述重组酶控制系统包含在诱导型启动子的控制下的重组酶基因和与所述重组酶基因可操作连接的类固醇激素受体配体-结合结构域。
诱导型启动子
诱导型表达系统在其中期望提供对特定核酸序列的表达的调节的应用中是有利的。在本发明中，通过将诱导型启动子可操作连接至编码重组酶基因的核酸序列，获得对重组酶调节的Rep表达的外源控制。在本发明的上下文中，诱导型启动子包含相关的应答元件。在一个进一步实施方案中，还通过将转录控制元件可操作连接至一个或多个辅助病毒基因，获得对辅助病毒基因的表达的外源控制。所述转录控制元件可以是诱导型启动子或简单地是应答元件，其中将使用天然启动子。例如，仅TetO操纵子序列可以与辅助基因的天然启动子(其为Pol III启动子)一起使用，并且如果使用标准的Pol II诱导型启动子，则不能正确转录。
在一个实施方案中，所述诱导型启动子是Tet响应性启动子(Ptet启动子)。所述Tet响应性启动子包含至少一个Tet操纵子。Tet操纵子(四环素控制的转录活化)可用于可诱导基因表达的方法中，其中在抗生素四环素或其衍生物之一(例如多西环素(DOX))存在的情况下可逆地启动或关闭转录。在一个实施方案中，所述诱导剂是四环素或其衍生物。
在自然界中，Ptet启动子表达TetR(阻遏蛋白)和TetA(将四环素抗生素泵出细胞的蛋白)。Tet操纵子系统是广泛可用的，诸如可得自Invitrogen的pcDNATM4/TO哺乳动物表达载体中使用的Tet操纵子。
在一个实施方案中，Tet响应性启动子用于控制编码重组酶基因的核酸序列的表达。在一个实施方案中，一种或多种辅助病毒基因(例如，对于腺病毒辅助基因，包含E1A、E1B、E2A、E4和VA中的一种或多种的任何组合)在诱导型表达系统的控制之下。如前所示，据报道E4蛋白潜在地对细胞有细胞毒性(Ferrari等人, 1996, Journal of Virology 70:3227-3234)。因此，可能期望能够控制E4蛋白的表达。类似地，在Rep表达泄漏的情况下，可能期望控制E2A的表达以减轻任何rep/cap基因扩增。在一个进一步实施方案中，Tet应答性启动子用于控制编码一种或多种辅助病毒基因、例如E2A、E4和VA的核酸序列的表达。
在一个实施方案中，AAV载体生产细胞系进一步包含编码TetR基因的核酸序列。在一个进一步实施方案中，TetR是TetR-KRAB。TetR-KRAB是由Deuschle等人 (1995, MolCell Biol 15:1907-14)首次描述的杂合蛋白，其中来自人Kox1锌指蛋白的Krüppel相关盒(KRAB)结构域与源自大肠杆菌的Tn10的Tet阻遏物的C-末端融合。该杂合蛋白具有能够通过结合距转录起始位点长距离的tetO位点而使基因表达沉默的优点。在施用四环素或其衍生物(其阻止TetR-KRAB与tetO序列的结合)后，启动子活性得到恢复。
在一个实施方案中，通过“Tet-On”系统提供编码重组酶基因和/或一种或多种辅助病毒基因的核酸序列的表达的外源控制。在这种情况下，在四环素或其衍生物存在的情况下，可逆地开启转录控制下的核酸序列的转录。此类诱导型启动子在最小启动子上游含有Tet操纵子序列的阵列，所述最小启动子主要基于CMV立即早期启动子。还需要在AAV载体生产细胞系中组成型表达Tet阻遏蛋白，例如TetR-KRAB。
在正常细胞培养条件下，Tet-响应性启动子被TetR阻遏物结合。当细胞处于正确的密度以起始重组AAV载体产生时，将多西环素添加至细胞生长培养基中使TetR不稳定并允许重组酶基因的转录，和在进一步实施方案中，还允许在转录控制下的辅助病毒基因中的一种或多种的转录。
在一个实施方案中，所述启动子是pCMV-TO2、Pol II启动子。pCMV-TO2在2x Tet操纵子序列上游含有CMV增强子和启动子。
本领域技术人员将理解，与引入宿主细胞基因组中的核酸序列相关的上述实施方案也适用于本发明的核酸载体中包含的核酸序列。
方法
根据本发明的一个方面，提供了产生稳定的AAV载体生产细胞系的方法，其包括：
(a) 将本文所述的核酸载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中；和
(b) 在培养物内选择具有在整合至哺乳动物宿主细胞的内源染色体中的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞。
技术人员将意识到，可以使用本领域中已知的合适方法，例如脂质介导的转染、显微注射、细胞(诸如微细胞)融合、电穿孔或微粒轰击，将核酸载体引入宿主细胞。在一个实施方案中，通过电穿孔将核酸载体引入宿主细胞。应理解的是，用于引入核酸载体的方法的选择可以根据使用的哺乳动物宿主细胞的类型来选择。
技术人员将意识到本领域中用于将编码先前概述的蛋白的重组核酸序列整合至宿主细胞基因组中用于生成AAV载体生产细胞系的方法，例如，Yuan等人 (Yuan等人(2011) Hum. Gene Ther. 22:613)(其通过引用并入本文)中公开的方法。
使用单一核酸载体将本文定义的核酸序列引入哺乳动物宿主细胞，所述单一核酸载体包含非哺乳动物复制起点且能够容纳至少25千碱基(kb)的DNA。
根据本发明的一个方面，提供了包含非哺乳动物复制起点且能够容纳至少25千碱基(kb)的DNA的核酸载体，其特征在于所述核酸载体包含编码以下的核酸序列：
AAV rep和cap基因；
辅助病毒基因；和
AAV载体的DNA基因组；
其中所述rep基因包含内含子，所述内含子包含转录终止序列，所述转录终止序列具有位于所述转录终止序列上游的第一重组位点和位于所述转录终止序列下游的第二重组位点；且
其中编码AAV rep和cap基因、每种辅助病毒基因和AAV载体的DNA基因组的核酸序列作为单独的表达盒排列在所述核酸载体内。
目前用于生成AAV载体的方法涉及将病毒基因(包装基因或辅助病毒基因)和/或转基因中的一种或多种瞬时转染至宿主细胞中。然而，许多缺点与该方法相关，因为其成本高且费力，使得其对于大规模AAV载体生产不是最佳的。
一种解决方案是工程改造生产细胞系，以提供一种简化且可扩展的用于大规模临床级制备重组AAV用于治疗用途的方法，所述生产细胞系稳定地并入产生重组AAV载体所需的所有基因和控制所述基因的表达所需的遗传元件，特别是rep基因(用于控制先前概述的Rep和AAV辅助基因表达的遗传元件)。然而，这种生产细胞在本领域中是不可用的。
通过将所有基因和调节元件包括在核酸载体中，可以在一个单一步骤中将这些插入哺乳动物宿主细胞的内源染色体中以产生AAV载体生产细胞。因此，如本文所提出，使用核酸载体将减少选择压力，减少沉默时间范围并且允许更快速筛选潜在的生产细胞。此外，核酸载体上包括的AAV载体产生所需的基因将全部被整合至哺乳动物宿主细胞的内源染色体中的单一基因座处。这将降低单独病毒基因变得沉默的风险并确保均匀表达所有病毒基因。
此外，通过控制已知对细胞有毒性的Rep蛋白的表达，和在一些实施方案中，还控制辅助病毒基因中的一种或多种的表达，可能建立稳定并入包装基因(rep和cap基因)和辅助病毒基因的AAV载体生产细胞系，其具有正常的生长速度和高稳定性，以便能够达到在大规模生物反应器中产生AAV载体所需的细胞密度。
应理解的是，核酸载体构建体可以在宿主细胞基因组中在不同染色体上的多个不同位置处整合多于一次(尽管所有编码的核酸序列都存在于单一基因座中)。这对于增加转基因的表达水平可能是有益的，并且可潜在地提高AAV滴度。
所述核酸载体包含编码重组AAV载体的DNA基因组的核酸序列。当复制该核酸序列时，其将被衣壳化于细胞产生的AAV载体内，并且，因此，充当AAV载体的“基因组”。应理解的是，AAV载体的DNA基因组通常被包括在用于瞬时转染方法中的“转移质粒”或“转移载体”上。所述转移质粒通常在两个AAV ITR之间含有可操作连接至转基因的启动子(例如CMV)(和任选聚腺苷酸化[polyA]信号)。因此，提及如本文所用的“AAV载体的DNA基因组”是指由AAV ITR侧接的核酸序列(通常编码目标转基因)。因此，在一个实施方案中，所述AAV载体的DNA基因组包含在两个AAV LTR之间编码的一个或多个转基因。
在一个实施方案中，在核酸载体中包括AAV载体(即转移载体)的DNA基因组的多个拷贝。预期转移载体的多个拷贝导致更高的病毒载体滴度。例如，核酸载体可以包括AAV载体(即转移载体)的DNA基因组的两个或更多个，诸如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个或更多个拷贝。
除了终止内含子中的重组位点以外，所述核酸载体可以含有一个或多个重组位点。这会允许靶序列在重组酶存在的情况下以位点特异性方式整合至哺乳动物宿主细胞的内源染色体中。重组酶催化在两个重组位点之间的重组反应。在一个实施方案中，重组位点是att位点(例如来自λ噬菌体)，其中att位点允许在λ整合酶存在的情况下的定点整合。应理解的是，提及“λ整合酶”包括提及仍与int/att系统相容的突变体整合酶，例如在WO2002/097059中描述的修饰的λ整合酶。
所述核酸序列各自作为各个表达盒被排列在核酸载体内。技术人员将理解，cap基因从位于rep基因内的p40启动子转录，使得rep和cap基因(即rep/cap基因)没有分离且存在于单个表达盒中。
在一个实施方案中，所述核酸载体进一步包含编码重组酶基因的核酸序列，所述核酸序列作为单独表达盒排列在所述核酸载体内。在一个进一步实施方案中，所述重组酶基因是Cre重组酶基因。所述Cre重组酶基因可以是密码子优化的(iCre)。
在一个实施方案中，所述核酸载体进一步包含重组酶控制系统。在一个进一步实施方案中，所述重组酶控制系统包含在诱导型启动子的控制下的重组酶基因和/或与所述重组酶可操作连接的类固醇激素受体配体-结合结构域。在一个进一步实施方案中，所述类固醇激素受体配体-结合结构域是雌激素受体配体结合-结构域(ER)。在一个实施方案中，所述ER在所述重组酶基因的上游和下游可操作连接(即，所述重组酶基因由ER侧接)。在一个实施方案中，所述ER是ERT2。
在一个实施方案中，所述核酸载体另外包含绝缘子，诸如染色质绝缘子。术语“绝缘子”是本领域中众所周知的，是指一类DNA序列元件，其具有保护基因免于从其周围环境发出的不适当信号的共同能力。(West等人, 2002, Genes Dev 16:271-288)。在一个进一步实施方案中，所述绝缘子(诸如染色质绝缘子)存在于每个核酸序列之间。在该上下文中的核酸序列是指表达盒中的核酸序列，使得绝缘子序列存在于表达盒之间。在一个实施方案中，绝缘子存在于所述表达盒各自之间。
当产生将稳定整合至宿主细胞基因组中的大型基因构建体时，经常必需用绝缘子序列分开所述构建体的每个元件(即表达盒)。瞬时转染方法掩盖了多基因载体的主要问题，即来自串联启动子的启动子干扰(Moriarity等人 (2013) Nucleic Acids Res. 41:e92)。Moriarity等人产生一种大型稳定构建体，其在每个表达元件之间包含两个串联拷贝的cHS4绝缘子(2xcHS4)。绝缘子序列是来自鸡β-样球蛋白基因簇的1.2 kb cHS4元件。这些DNA的延伸段充当有效的增强剂阻断剂，并且显示其克服启动子干扰。不受理论的束缚，两个串联拷贝的cHS4被认为通过提供几种蛋白(CBP、CTCF和USF1)的结合位点来减轻启动子干扰，所述蛋白通过募集染色质修饰宿主因子来维持开放的染色质状态(Yahata等人(2007) J. Mol. Biol. 374:580)。
此外，所述绝缘子元件也可以用作安全特征，以减轻由引入宿主基因组的增强子元件(其有时可以提高宿主癌基因的水平)引起的问题。Rivella等人 (Rivella等人(2000) J Virol. 74: 4679)还显示，当cHS4被并入在逆转录病毒增强子/启动子的上游时，来自整合的逆转录病毒的转基因表达得到改进，并且5’长末端重复的甲基化(其牵涉于整合的逆转录病毒的沉默)减少。由于上面概述的原因，因此，当产生稳定的AAV载体生产BAC构建体以在每个表达元件之间包括绝缘子时，这是有利的。
在一个实施方案中，所述绝缘子与鸡(原鸡(Gallus gallus)) HS4 (cHS4)绝缘子序列(例如参见Genome登录号U78775.2，碱基对1至1205)具有至少90%的序列同一性，例如至少95%的序列同一性。在一个进一步实施方案中，所述绝缘子包含两个串联的cHS4绝缘子序列(近似2.4千碱基)，即2xcHS4。
为了将稳定的AAV载体生产构建体的每个表达盒(即分别编码生成AAV载体生产细胞系所需的基因的核酸序列，如先前所概述)连同2xcHS4元件依次克隆至BAC中，产生在稀有切割限制性位点的下游含有cHS4的供体质粒是有帮助的，所述供体质粒会允许在将该元件和2xcHS4两者均转移至BAC之前克隆cHS4旁边的每个元件。为了促进这一点，表达盒和2xcHS4的克隆位点可以被大范围核酸酶位点侧接，所述大范围核酸酶位点是限制性酶的切割位点，其具有长识别序列，其很少出现，甚至在较长的构建体中。大范围核酸酶限制性酶I-SceI和PI-PspI的限制性位点可以分别存在于供体质粒中的表达盒的5’末端和2xcHS4的3’末端。I-SceI和PI-PspI产生相容的突出端。这会允许将克隆至供体质粒中的每个表达盒连同2xcHS4通过如Liu等人 (Liu等人 (2014) PLoS One 9:e110852)中所概述的所谓的iBrick克隆依次克隆至BAC中的前一元件加cHS4的下游。
在一个进一步实施方案中，绝缘子可以存在于每个辅助病毒基因(例如E1A、E1B、E2A、E4和/或VA，或者在基于HEK293的生产细胞中，E2A、E4和/或VA)之间。这有助于防止相邻病毒核酸序列之间的启动子干扰(即，来自一个转录单元的启动子损害相邻转录单元的表达)。不受理论所束缚，这也被认为有助于使病毒序列之间重组以生成能够复制的病毒的风险最小化。
例如，在一个示例性实施方案中，所述核酸载体包含以下插入物：与CMV启动子和选择标记可操作连接的TetR-KRAB基因(其包含IRES)，绝缘子(诸如染色质绝缘子)，与CMVTO2启动子可操作连接的腺病毒辅助基因E2A，绝缘子(诸如染色质绝缘子)，与CMVTO2启动子可操作连接的腺病毒辅助基因E4、绝缘子(诸如染色质绝缘子)，7个TetO序列，与启动子可操作连接的腺病毒辅助基因VA，绝缘子(诸如染色质绝缘子)，编码AAV rep和cap基因的核酸序列，其在P19和P40启动子之间具有内含子，含有LoxP位点，随后为转录终止子序列，随后为潮霉素基因，随后为LoxP位点，绝缘子(诸如染色质绝缘子)，与CMVTO2启动子可操作连接的编码Cre或ERT2-Cre-ERT2的核酸序列，绝缘子(诸如染色质绝缘子)，与两个AAVITR之间的启动子和多个克隆位点可操作连接的包含转基因的核酸序列。图5中示意性提供了核酸载体的示例性实施方案。
在一个实施方案中，核酸载体选自：细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、P1-衍生人工染色体(PAC)、F粘粒或粘粒。在一个进一步实施方案中，核酸载体是细菌人工染色体(BAC)。在一个实施方案中，所述核酸载体是质粒。
细菌人工染色体
术语“细菌人工染色体”或“BAC”是指源自细菌质粒的DNA构建体，其能够容纳大型的外源DNA插入物。它们通常可以容纳近似350kb的最大DNA插入物。BAC开发自充分表征的细菌功能性育性质粒(F-质粒)，其含有促进质粒在细菌细胞分裂后均匀分布的分配基因。这允许BAC与内源细菌基因组(诸如大肠杆菌)一起被稳定复制和分离。BAC通常含有至少一个拷贝的复制起点(诸如oriS或oriV基因)、repE基因(用于质粒复制和拷贝数调节)和分配基因(诸如sopA、sopB、parA、parB和/或parC)，其确保BAC在细菌细胞中的稳定维持。BAC是天然环状的和超螺旋的，其使得它们比线性人工染色体诸如YAC更容易恢复。它们也可以使用简单的方法诸如电穿孔相对容易地引入细菌宿主细胞。
在一个实施方案中，细菌人工染色体包含oriS基因。在一个实施方案中，细菌人工染色体包含repE基因。在一个实施方案中，细菌人工染色体包含分配基因。在一个进一步实施方案中，分配基因选自sopA、sopB、parA、parB和/或parC。在又一个进一步实施方案中，细菌人工染色体包含sopA和sopB基因。
用于本发明中的BAC可以从商业来源获得，例如来自LUCIGEN™的pSMART BAC (对于完整骨架序列，参见Genome登录号EU101022.1)。该BAC含有L-阿拉伯糖“拷贝”系统，其也含有oriV中等拷贝复制起点，其仅在TrfA复制蛋白存在的情况下才有活性。TrfA的基因可以在L-阿拉伯糖诱导型启动子araC-PBAD的控制下并入细菌宿主细胞的基因组中(参见Wild等人，(2002) Genome Res. 12(9): 1434–1444)。L-阿拉伯糖的添加诱导TrfA的表达，TrfA活化oriV，引起质粒复制至最多达50个拷贝/细胞。
酵母人工染色体
术语“酵母人工染色体”或“YAC”是指其中酵母DNA并入细菌质粒中的染色体。它们含有自主复制序列(ARS)(即复制起点)、着丝粒和端粒。与BAC不同，YAC是线性的，且因此在染色体的每个末端含有酵母端粒，以在其传递至宿主细胞后代上时保护末端免于降解。YAC可以容纳一定范围的DNA插入物大小；100-2000kb的任何大小。
P1-衍生的人工染色体
术语“P1-衍生的人工染色体”或“PAC”是指源自P1-噬菌体和细菌F-质粒的DNA的DNA构建体。它们通常可以容纳近似100-300kb的最大DNA插入物，并用作大肠杆菌中的克隆载体。PAC具有与BAC类似的优点，诸如易于纯化并引入细菌宿主细胞。
粘粒和F粘粒
术语“粘粒”是指源自细菌质粒的DNA构建体，其另外含有源自噬菌体λ的cos位点。粘粒通常含有细菌复制起点(诸如oriV)、选择标记、克隆位点和至少一个cos位点。粘粒通常可以接受40-45kb的最大DNA插入物。已显示粘粒在感染大肠杆菌细胞方面比标准细菌质粒更有效。术语“F粘粒”是指与粘粒类似的非哺乳动物核酸载体，除了其基于细菌F-质粒。具体而言，它们使用F-质粒的复制起点和分配机制来允许克隆大的DNA片段。F粘粒通常可以接受40kb的最大DNA插入物。
应理解的是，编码复制缺陷型AAV载体的核酸序列可以与野生型基因相同或源自野生型基因，即，该序列可以是包含在野生型病毒中的遗传上或其他方式改变版本的序列。因此，引入核酸载体或宿主细胞基因组中的病毒基因也可以指野生型基因的密码子优化版本。
本领域技术人员将理解，与核酸载体相关的实施方案也适用于AAV载体生产细胞。通过实例的方式，但不限于，所述宿主细胞基因组可以在其中整合的编码重组AAV载体产生所需的基因的核酸序列之间包含绝缘子。
一旦转染至哺乳动物宿主细胞中，核酸载体将随机整合至哺乳动物宿主细胞的内源基因组中。因此，该方法还包括选择其中已经整合在核酸载体上编码的核酸的哺乳动物宿主细胞(例如，使用抗生素抗性选择标记，诸如博莱霉素抗性标记)。
技术人员将意识到促进核酸载体整合的方法，例如，如果核酸载体是天然环状的(例如，BAC、PAC、粘粒或F粘粒)，则将其线性化。核酸载体可以另外包含与哺乳动物宿主细胞的内源染色体共有同源性的区域，以引导整合至内源基因组内的选定位点。此外，如果重组位点存在于核酸载体上，则这些可用于靶向重组。例如，核酸载体可含有LoxP位点，其与Cre重组酶(即，使用源自P1噬菌体的Cre/lox系统)组合时允许靶向整合。或者(或另外)，重组位点是att位点(例如来自λ噬菌体)，其中att位点允许在λ整合酶存在的情况下进行定点整合。这将允许病毒基因被靶向至内源基因组内的基因座。
其他靶向整合方法是本领域中众所周知的。例如，可以使用诱导基因组DNA的靶向切割的方法来促进选择的染色体基因座处的靶向重组。这些方法经常涉及使用工程改造的切割系统来诱导内源基因组中的双链断裂(DSB)或切口以诱导通过天然过程(诸如非同源性末端接合(NHEJ))修复断裂或使用修复模板修复(即，同源性定向修复或HDR)。
通过使用特定的核酸酶诸如工程改造的锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、使用CRISPR/Cas9系统与工程改造的crRNA/tracr RNA('单指导RNA')指导特异性切割和/或使用基于Argonaute系统的核酸酶(例如来自嗜热栖热菌(T. thermophilus)，称为'TtAgo'，参见Swarts等人，(2014) Nature 507(7491): 258-261)，可发生切割。使用这些核酸酶系统之一的靶向切割可以用于使用HDR或NHEJ介导的过程将核酸插入特定的靶位置。因此，在一个实施方案中，该方法另外包括使用至少一种核酸酶将在核酸载体上编码的核酸序列整合至哺乳动物宿主细胞的基因组(即内源染色体)中，其中所述至少一种核酸酶切割哺乳动物宿主细胞的基因组，使得核酸序列整合至细胞的基因组中。在一个进一步实施方案中，所述核酸酶选自锌指核酸酶(ZFN)，TALE核酸酶(TALEN)，CRISPR/Cas核酸酶系统及其组合。
图5中示意性代表本发明的核酸载体的一个实施方案。
额外组分
在一个实施方案中，所述核酸载体包含可选择标记。在其中终止内含子包含可选择标记的实施方案中，所述可选择标记可以是除了终止内含子中的可选择标记以外不同的可选择标记。所述可选择标记允许选择已经并入核酸载体序列的细胞。在一个进一步实施方案中，可选择标记是药物抗性基因，诸如抗生素抗性基因，例如博莱霉素、卡那霉素或嘌呤霉素抗性基因，特别是博莱霉素(ZeoR)抗性基因。在又一个进一步实施方案中，所述博莱霉素抗性基因源自印度异壁链霉菌(Streptoalloteichus hindustans)ble基因，例如参见GenBank登录号X52869.1，从碱基对3至377。
基因扩增的自然现象已经在生物制药工业中被开发为增加细胞系产生的重组产物的滴度的方式。在重组基因已整合至宿主细胞的基因组中的情况下，可以通过选择其中整合至宿主细胞基因组中后已扩增重组基因的细胞系来增加重组基因的拷贝数和伴随表达的重组蛋白的量。因此，在一个实施方案中，所述可选择标记是可扩增选择标记。
可以通过用可扩增选择标记基因稳定转染宿主细胞来诱导基因扩增。稳定转染的宿主细胞经受渐增浓度的毒性药物，已知所述毒性药物抑制可扩增选择标记。例如，可以在含有毒性药物的培养基中培养转染的细胞，所述毒性药物的浓度实现在将亲本细胞(即未转染的细胞)铺板于含有毒性药物的培养基中后的3-5天内的大于98%的细胞的杀死。通过这种抑制，可以选择细胞群体，其具有增加的可扩增选择标记的表达水平，和因此对所用浓度的药物的抗性。
如上所示，本文公开的核酸载体允许其中含有的所有表达盒(即核酸载体DNA)在宿主细胞基因组内的单一基因座处一起整合。由于基因扩增的过程引起可扩增选择标记基因和周围DNA序列的扩增，因此也将扩增整合的核酸载体DNA中的剩余DNA序列。以此方式，可以提供用于稳定整合至宿主细胞基因组中的病毒载体基因的基因扩增的方法。
每种可扩增选择标记具有相关的选择剂(即毒性药物)，其在扩增和选择方案期间被添加至细胞培养基中。合适的可扩增选择标记/选择剂组合包括腺苷脱氨酶/脱氧助间型霉素、天冬氨酸转氨甲酰酶/ N(磷酸乙酰基)-L-天冬氨酸、二氢叶酸还原酶/甲氨蝶呤、谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸亚砜亚胺、金属硫蛋白-l/重金属。
在一个实施方案中，在表达盒中提供了可扩增选择标记基因和/或可选择标记。
在一个实施方案中，所述可扩增选择标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)。DHFR选择方法涉及将dhfr基因(可扩增选择标记基因)并入核酸载体，由此诱导对核酸载体内的其他表达盒的DHFR选择压力。宿主细胞用核酸载体转染，并在渐增浓度的DHFR抑制剂甲氨蝶呤(MTX)存在的情况下生长，以选择已扩增整合至宿主基因组中的dhfr基因和伴随剩余的整合核酸载体DNA的细胞。
在一个实施方案中，所述dhfr基因与Genome登录号NM_010049.3具有至少60%序列同一性，诸如至少70%、80%、90%或100%序列同一性。
在另一个实施方案中，所述可扩增选择标记是谷氨酰胺合成酶(GS)。GS选择方法涉及将gs基因并入核酸载体，由此诱导对核酸载体内的其他表达盒的GS选择压力。宿主细胞用核酸载体转染，并在渐增浓度的GS抑制剂甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)存在的情况下生长，以选择已扩增整合至宿主基因组中的gs基因和伴随剩余的整合核酸载体DNA的细胞。
包含gs基因的核酸序列的表达构建体可以含有本领域中已知的编码gs基因的表达构建体的核酸序列(例如WO874462，其中含有的序列通过引用并入本文)。
通过以这种方式使用可扩增选择标记和相关的选择剂，随后为培养期以允许选择在新的(增加的)浓度的相关试剂中生长的细胞，可以扩增携带选择压力的基因组的区域，由此增加可扩增选择标记的拷贝数。因此，当将包含病毒基因的核酸载体的表达盒与包含可扩增选择标记基因的表达盒一起整合至宿主基因组中的单一基因座处时，这些表达盒也被扩增。因此，然后，针对滴度/产率筛选通过此类轮次的扩增和选择而生长的细胞系，并选择最佳克隆用于AAV载体的随后产生。
在一个优选实施方案中，所述宿主细胞对于可扩增选择标记是阴性的。也就是说，所述宿主细胞的内源基因组不包含内源的可扩增选择标记基因。例如，当使用DHFR作为可扩增选择标记时，优选采用DHFR阴性的宿主株，诸如CHO DG44或CHO DUX-B11。
然而，本发明不受限于特定宿主细胞系的选择。可以在本发明的方法中使用任何细胞系，其具有快速生长速率(即，倍增时间为12小时或更短)并且能够以合理的速率扩增可扩增选择标记基因而不以相似或更高的速率扩增内源可扩增选择标记基因。
通过确定细胞在渐增浓度的选择剂中生长的能力与可扩增选择标记的拷贝数增加(这可以通过经由Southern印迹证明可扩增标记的拷贝数的增加直接测量或通过经由Northern印迹或qPCR证明由可扩增标记产生的mRNA的量的增加间接测量)相关，鉴定用显性标记(即外源可扩增选择标记)转导的细胞系。
在宿主细胞包含内源可扩增选择标记基因的情况下，除了可扩增选择标记以外，核酸载体可以进一步包含编码可选择标记的核酸序列。这避免了在用相关选择剂进行选择期间扩增内源可扩增选择标记基因的问题。所述宿主细胞用包含可扩增选择标记以及可选择标记的核酸载体转染。首先针对在可选择标记的抗生素诸如博莱霉素或潮霉素p中生长的能力选择转染的宿主细胞。然后针对在渐增浓度的选择剂诸如MTX中生长的能力选择细胞。
在一个实施方案中，核酸载体包含除了终止内含子中存在的polyA信号以外的polyA信号。polyA信号的使用具有保护mRNA免于酶促降解并帮助翻译的优点。在一个进一步实施方案中，polyA信号获得自或源自SV40、牛生长激素和/或人β球蛋白。在一个实施方案中，polyA信号源自SV40早期polyA信号(例如参见Genome登录号EF579804.1，来自负链的碱基对2668至2538)。在一个实施方案中，polyA信号源自人β球蛋白polyA信号(例如，参见Genome登录号GU324922.1，碱基对3394至4162)。
在一个实施方案中，除了终止内含子以外，核酸载体另外包含内含子序列。已知在增强子/启动子区下游和cDNA插入物(即转基因)上游使用内含子增加插入物的表达水平。在一个进一步实施方案中，内含子序列是人β球蛋白内含子或兔β球蛋白内含子II序列。在一个实施方案中，人β球蛋白内含子源自在Genome登录号KM504957.1可得的序列(例如来自碱基对476至1393)。在一个实施方案中，兔β球蛋白内含子II源自在Genome登录号V00882.1可得的序列(例如，碱基对718至1290)。
在一个实施方案中，核酸载体另外包含土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。已经显示WPRE的存在增强表达，且因此可能有利于获得高水平的表达。在一个进一步实施方案中，WPRE源自在Genome登录号J04514.1可得的序列(例如，碱基对1093至1684)。
在一个实施方案中，核酸载体另外包含内部核糖体进入位点(IRES)。IRES允许以独立于末端的方式起始翻译。IRES是结构化的RNA元件，其通常见于病毒的5'-非翻译区(UTR)中，在5'-帽的下游(其是组装起始复合物所需的)。IRES被翻译起始因子所识别，并允许不依赖于帽的翻译。在一个进一步实施方案中，IRES源自脑心肌炎病毒(EMCV)基因组(例如，参见Genome登录号KF836387.1，碱基对151至724)。
在一个实施方案中，核酸载体另外包含多克隆位点(MCS)。MCS是核酸载体内的含有多个限制性位点(例如10、15或20个位点)的DNA短片段。这些位点通常在核酸载体内仅出现一次，以确保核酸内切酶仅在一个位点处切割。这允许使用适当的核酸内切酶(即限制性酶)容易地插入病毒基因。
本领域技术人员将理解，所述表达盒可以在核酸载体内以任何顺序排列。
可以将核酸序列依次引入核酸载体中。这允许在每次整合后进行选择，以确保所有需要的核酸序列均成功整合至核酸载体中。或者，将至少两个或更多个核酸序列同时引入核酸载体中。
应理解的是，可以通过本领域中已知的标准分子克隆技术，例如使用限制性核酸内切酶和连接技术，将本文所述的额外基因引入核酸载体中。此外，可以通过标准技术(诸如，电穿孔)将核酸载体，尤其是BAC、PAC、F粘粒和/或粘粒引入细菌宿主细胞(诸如大肠杆菌细胞，特别是大肠杆菌菌株DH10B)。
根据本发明的一个进一步方面，提供了通过本文定义的方法获得的AAV载体生产细胞。
使用本文定义的方法获得的细胞系可用于产生高滴度的AAV载体。病毒滴度可通过定量PCR(qPCR)(其提供AAV颗粒的基因组拷贝数)和通过ELISA(其提供感染性病毒滴度的TCID50量度)进行测量。通过比较两个测量值，可以测定用AAV批次的转导效率。
本文中提及术语“高滴度”是指能够转导靶细胞诸如患者细胞的有效量的AAV载体。在一个实施方案中，高滴度在没有浓缩的情况下为超过106 TU/ml (TU＝转导单位)。
在一个实施方案中，本文定义的方法是可扩展的，因此它们可以在任何期望体积的培养基中实施，例如，10 ml(例如在摇瓶中)至10 L、50 L、100 L或更大(例如在生物反应器诸如波浪式生物反应器系统和搅拌釜中)。
根据本发明的一个进一步方面，提供了产生复制缺陷型AAV载体的方法，其包括：
(a) 将本文所述的核酸载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中；和
(b) 在培养物内选择具有在整合至哺乳动物宿主细胞的内源染色体中的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞；和
(c) 在产生复制缺陷型AAV载体的条件下进一步培养选择的哺乳动物宿主细胞。
技术人员应理解，本文描述的方法中使用的条件将取决于所使用的宿主细胞。典型的条件，例如待使用的培养基或温度，是本领域中众所周知的。在一个实施方案中，培养通过在湿润条件下孵育哺乳动物宿主细胞来进行。在一个进一步实施方案中，湿润条件包括在37℃、5% CO2下孵育转染的细胞。在一个实施方案中，使用选自以下的培养基进行培养：含有10% (vol/vol)胎牛血清(FBS)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)，无血清UltraCULTURETM培养基(Lonza，目录号12-725F)或FreeStyleTM表达培养基(ThermoFisher，目录号12338-018)。
适当的培养方法是本领域技术人员众所周知的。例如，可以在悬浮液和/或无动物组分的条件下培养细胞。在一个实施方案中，所述细胞适合于在任何体积的培养基、从10ml(例如在摇瓶中)至10 L、50 L、100 L或更多(例如在生物反应器中)中培养。
如本文所述，使用请求保护的发明降低质粒制造的成本，降低对转染试剂(例如，聚乙烯亚胺[PEI])的需求，降低所需的Benzonase处理量(病毒收获物中DNA的量减少，因此需要更少的Benzonase以除去下游处理中的过量)并降低测试的成本(无需测试病毒产品中的残留质粒)。所有这些优点可以被认为是本发明的方面。
在一个实施方案中，所述方法另外包括分离复制缺陷型AAV载体。例如，在一个实施方案中，通过使用过滤器来进行分离。在一个进一步实施方案中，所述过滤器是低蛋白结合膜(例如，0.22μm低蛋白结合膜或0.45μm低蛋白结合膜)，诸如聚偏氟乙烯(PVDF)或聚醚砜(PES)人工膜。
一旦在哺乳动物宿主细胞内，存在于核酸载体上的核酸序列可被整合至内源基因组内的随机位置中。整合步骤可以如上文所述促进，例如使用线性化和/或共享同源性的区域。重组位点也可用于靶向重组。
如果靶基因被整合至具有选择标记(诸如抗生素抗性基因)的内源染色体中，则该方法可以还包括选择其中病毒核酸已成功整合的哺乳动物宿主细胞。
一旦分离，可以浓缩AAV载体用于体内应用。浓缩方法包括例如超速离心、沉淀或阴离子交换色谱。超速离心作为小规模AAV载体浓缩的快速方法是有用的。或者，阴离子交换色谱(例如使用Mustang Q阴离子交换膜盒)或沉淀(例如使用PEG 6000)对于处理大体积的AAV载体上清液特别有用。
根据本发明的一个进一步方面，提供了通过本文定义的方法获得的复制缺陷型AAV载体。
将注意的是，在本文所述的方法中使用的核酸载体的实施方案也被作为AAV载体生产细胞的实施方案，且反之亦然，只要所述实施方案涉及经由相应方法整合至AAV载体生产细胞的宿主基因组中的核酸载体的特征。
现在将参考以下非限制性实施例更详细地描述本发明。
实施例
实施例1
对用于AAV载体生产的标准包装质粒(rep和cap基因)、辅助病毒质粒(E2A、E4和VA基因)和转移载体质粒(由ITR序列侧接的转基因，其编码重组AAV载体的DNA基因组)进行以下修饰。
含有由LoxP位点侧接的转录终止序列的终止内含子的设计
为了在计算机芯片上重新产生3个SV40 polyA序列，从完整的SV40基因组(登录号J02400.1)拷贝早期polyA序列，并且串联连接3个拷贝。
将HSV TK启动子序列置于潮霉素抗性基因序列(GenBank登录号U40398.1)的上游。将HSV TK启动子和潮霉素抗性基因置于3个SV40 poly A序列的下游。
LoxP位点的序列直接取自Qiao等人 (2002, Journal of Virology76: 13015-13027)。将该序列粘贴在3x polyA-HygR片段的5’和3’末端，导致LoxP位点以相同方向侧接所述转录终止子。
人绒毛膜促性腺激素(hCG)内含子1序列获得自hCG基因5β亚基(登录号X00265.1)。将LoxP侧接的3x SV40 polyA-HygR序列插入hCG内含子中的碱基196处。完整终止内含子序列的长度为3120 bp。
将终止内含子克隆至AAV rep基因中
将终止内含子插入rep2cap2和rep2cap5表达质粒中相对于野生型AAV2基因组序列(GenBank登录号：J01901)的位置1022处。这在启动子P19下游的rep基因内。该位置含有待插入(AAG/G)的内含子的共有剪接供体/受体序列。
密码子优化的Cre (iCre)序列的设计
Cre的密码子改进的变体，称为iCre，由Shimshek等人(2002 Genesis 32: 19-26)设计，并且显示，当瞬时转染至CV1-5B细胞中时，与野生型Cre相比，所述Cre的密码子改进的变体将含有“floxed”终止密码子的LacZ的β-半乳糖苷酶活性恢复接近2倍(Casanova等人, 2002 Genesis 34: 208-214)。
Cre序列获得自GenBank登录号DQ023272。iCre序列获得自GenBank登录号AY056050。
克隆基因的CMV-TO2启动子用于Tet诱导的表达
除了调节Rep表达以外，可能还必需调节BAC中的腺病毒2辅助基因(对于HEK293细胞，E2A、E4和VA)的表达，因为这些同样对细胞有潜在毒性(Ferrari等人, 1996, JournalOf Virology 70: 3227-3234)。因此，分别在PCMV-TO2的下游克隆E2A DNA结合蛋白编码区和含有所有6个E4 ORF的E4区域。然而，从Pol III启动子转录的VA，如果置于PCMV-TO2的下游，将无法正确地转录。因此，将几个TetO序列置于天然VA启动子的上游，并且在没有多西环素的情况下，TetR-KRAB与这些位点的结合应当抑制转录。
因此，使用Gibson组装法，将CMV-TO2启动子分别克隆在Cre、iCre、ERT2-Cre-ERT2、ERT2-iCre-ERT2、腺病毒2 E2A和E4的上游。此外，使用Gibson组装法，将7x TetO序列克隆在腺病毒2 VA的上游。
TetR-KRAB的设计
Cre的表达在条件启动子(PCMV-TO2)的控制下，所述条件启动子(PCMV-TO2)在正常细胞条件下被转录阻遏物TetR-KRAB结合。当细胞处于正确的密度以开始rAAV产生时，将多西环素添加至细胞生长培养基中使TetR-KRAB阻遏物不稳定并允许Cre基因的转录。随后，所述Cre重组酶将在AAV rep基因中的重组内含子中剪接出LoxP侧接的转录终止子，允许rep基因的转录。该系统意味着Rep仅在向培养基中添加多西环素后才在细胞中表达，减轻了对细胞的毒性，直至它们达到适合用于AAV载体生产所需的密度。
通过Gibson组装法，将编码来自人Kox1基因的KRAB结构域的序列克隆在密码子优化的TetR基因的3’末端，以将在PCMV启动子控制下的TetR基因转化为TetR-KRAB基因。
他莫昔芬调节的ERT2Cre/iCreERT2的设计
在Tet条件表达系统的控制下的任何泄漏的Cre表达仍然可以有效地从重组AAVrep基因除去转录终止子，并且降低培养物中稳定细胞的活力。因此，作为对此的保护措施，如Casanova等人(2002, Genesis 34: 208-214)中所述，通过经由将Cer基因用ERT2结构域侧接来将其修饰而增加额外层的Cre重组酶控制。蛋白的N和C末端的这些ERT2结构域抑制Cre进入细胞核，直至将4-羟基-他莫昔芬添加至细胞培养基中，在蛋白水平上给出对Cre活性的一定水平的控制，其可以减轻在转录水平的任何渗漏表达的影响。
使用Gibson组装法，将ERT2结构域序列(Wagner J, Metzger D, Chambon P(1997) Biochem Biophys Res Commun 237:752–757)克隆在Cre和iCre基因的5’和3’末端，在CMVTO2条件启动子的下游。
实施例2
测试Cre从rep基因除去终止内含子的能力的瞬时转染方法
如上所示，将含有3个SV40 poly A转录终止位点和潮霉素抗性基因(全部被LoxP位点侧接)的终止内含子插入我们的rep2/cap2和rep2/cap5表达质粒中的P19启动子下游的AAV2 rep序列中。所述终止内含子应当抑制用这些质粒转染的细胞中的Rep蛋白的表达，除非Cre也在细胞中表达。Cre表达质粒的共转染应当重组2个LoxP位点，剪接出转录终止子，并允许RNA聚合酶读通剩余的内含子。先前已经构建了几种质粒，其中将各种Cre变体(野生型Cre、iCre、ERT2-Cre-ERT2和ERT2-iCre-ERT2)克隆在CMVTO2启动子的下游，所述CMVTO2启动子在Tet阻遏蛋白不存在的情况下在细胞中具有组成性活性。ERT2侧接的Cre蛋白还需要4-羟基-他莫昔芬来充当配体，其允许它们进入细胞核。
针对它们终止产生Rep蛋白的能力，测试重组rep内含子中存在的终止内含子的能力。另外，针对它们在它们共转染至其中的细胞中恢复Rep表达的能力测试各种Cre表达质粒。
粘附的HEK 293T细胞用TrypLE Express分解，重悬浮于DMEM + 10% FCS中，使用NucleoCounter NC-250计数，并稀释至2 x 105个细胞/ml。将细胞以1 ml/孔铺板在24-孔板中，并在37℃下孵育过夜。第二天，24-孔板中的细胞是亚汇合的。各孔细胞用下面列出的质粒的组合(参考图1和2)共转染，每种质粒以0.5 µg/孔使用。在使用的情况下，将4-羟基他莫昔芬以1 µM(溶解于乙醇中的1 mM储备物的1:1000稀释物)添加至细胞生长培养基中。
图1
1.pG.AAV2.R2C2 + pG3.Ad2辅助质粒
2.pG.AAV2.R2C2-hCG内含子3x pA Hyg + pG3.Ad2辅助质粒
3.pG.AAV2.R2C2-hCG内含子3x pA Hyg + pG3.Ad2辅助质粒 + pG3.CMVTO2-Cre
4.pG.AAV2.R2C2-hCG内含子3x pA Hyg + pG3.Ad2辅助质粒 + pG3.CMVTO2-iCre
5.pG.AAV2.R2C2-hCG内含子3x pA Hyg + pG3.Ad2辅助质粒 + pG3.CMVTO2-ERT2-Cre-ERT2
6.pG.AAV2.R2C2-hCG内含子3x pA Hyg + pG3.Ad2辅助质粒 + pG3.CMVTO2-ERT2-iCre-ERT2
7.pG.AAV2.R2C2-hCG内含子3x pA Hyg + pG3.Ad2辅助质粒 + pG3.CMVTO2-ERT2-Cre-ERT2 + 4-羟基他莫昔芬
8.pG.AAV2.R2C2-hCG内含子3x pA Hyg + pG3.Ad2辅助质粒 + pG3.CMVTO2-ERT2-iCre-ERT2 + 4-羟基他莫昔芬
9.pG.AAV2.R2C2-hCG内含子3x pA Hyg (阴性对照)
10.pG3.Ad2辅助质粒 GSK (阴性对照)
11.pG.AAV2.R2C2-hCG内含子3x pA Hyg + pG3.Ad2辅助质粒 GSK +pG3.CMVTO2-Cre + 1 µM 4-羟基他莫昔芬 (在该情况下，4-羟基他莫昔芬在ERT2不存在的情况下具有任何作用)
12.未转染的细胞。
图2
1.pG2.AAV5.R2C5 + pG3.Ad2辅助质粒
2.pG2.AAV5.R2C5-hCG内含子3x pA Hyg + pG3.Ad2辅助质粒
3.pG2.AAV5.R2C5-hCG内含子3x pA Hyg + pG3.Ad2辅助质粒 + pG3.CMVTO2-Cre
4.pG2.AAV5.R2C5-hCG内含子3x pA Hyg + pG3.Ad2辅助质粒 + pG3.CMVTO2-iCre
5.pG2.AAV5.R2C5-hCG内含子3x pA Hyg + pG3.Ad2辅助质粒 + pG3.CMVTO2-ERT2-Cre-ERT2
6.pG2.AAV5.R2C5-hCG内含子3x pA Hyg + pG3.Ad2辅助质粒 + pG3.CMVTO2-ERT2-iCre-ERT2
7.pG2.AAV5.R2C5-hCG内含子3x pA Hyg + pG3.Ad2辅助质粒 + pG3.CMVTO2-ERT2-Cre-ERT2 + 4-羟基他莫昔芬
8.pG2.AAV5.R2C5-hCG内含子3x pA Hyg + pG3.Ad2辅助质粒 + pG3.CMVTO2-ERT2-iCre-ERT2 + 4-羟基他莫昔芬
9.pG3.Ad2辅助质粒
10.pG2.AAV5.R2C5-hCG内含子3x pA Hyg (阴性对照)
11.pG2.AAV5.R2C5-hCG内含子3x pA Hyg + 1 µM 4-羟基他莫昔芬 (阴性对照)
12.未转染的细胞。
将质粒全部添加至含有75 µl OPTI MEM的管中。向每个管中进一步添加含有2 μlPEI Pro的75 μl OPTI MEM。通过短暂涡旋混合含有转染混合物的管，并在室温下孵育10分钟。此后，将生长培养基从24-孔板中的细胞除去，并用150 μl每种转染混合物替换。10分钟孵育后，用1 ml DMEM + 10% FCS将孔加满，并将板在37℃下孵育24小时。第二天，从含有转染细胞的孔除去培养基，并通过添加300 μl/孔的含有1 x HaltTM蛋白酶抑制剂的M-PER哺乳动物蛋白提取试剂来裂解细胞，并上下吸液。然后将管以14,000 x g旋转5分钟以除去细胞碎片，并将裂解物转移至新管中。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒测定每个样品的总蛋白浓度。如试剂盒手册中所述设置BSA标准曲线。将体积为25 μl的每个标准和样品一式三份添加至平底96-孔板中，并将200 μl BCA工作试剂添加至每个孔中。将板在37℃下孵育30分钟，且然后使用FlexStation 3在562 nm的波长处测量吸光度。使用M-PER裂解缓冲液将样品全部针对0.25 mg/ml的浓度归一化。
使用Peggy Sue大小方案制备样品用于运行。将体积为1 μl的来自标准包装1的重构的荧光主混合物添加至eppendorf管中的4 μl的每个样品。然后将样品和来自标准包装1的生物素化梯涡旋并通过在95℃加热5分钟进行变性。然后将样品旋转下来并放在冰上。将αAAV Rep一抗(1:100稀释)和αβ-肌动蛋白一抗(1:500稀释)在抗体稀释液2中组合。将样品、抗体、鲁米诺/过氧化物混合物、一抗和二抗(αMouse，纯净使用)、链霉抗生物素蛋白-HRP以及分离和堆积基质装载在来自Peggy和Sally Sue 12-230 kDa分离试剂盒的板上。
由于技术困难，该板需要在周末在4℃下储存，并且将其在下周一在Peggy Sue上运行。将板安装在带盖的Peggy Sue上，并将每个样品和试剂的位置输入Compass for SW软件中。安装一组新的来自Peggy和Sally Sue 12-230 kDa分离试剂盒的毛细管，且然后将Peggy Sue运行过夜。
如所预期，在用Ad2辅助质粒和rep2/cap2或rep2/cap5表达质粒共转染的细胞的裂解物中检测到Rep2的所有4种剪接变体。用Ad2辅助质粒和pG.AAV2.R2C2-hCG内含子3xpA Hyg或pG2.AAV5.R2C5-hCG内含子3x pA Hyg共转染的细胞的裂解物不含任何可检测到的Rep2蛋白。它们确实含有β-肌动蛋白条带，证明这不是由于Peggy Sue上的毛细血管失败导致。这显示在rep中的P19启动子下游含有LoxP-侧接的3x SV40 polyA转录终止子和潮霉素抗性基因的内含子有效地抑制Rep的表达。
用Ad2辅助质粒和pG.AAV2.R2C2-hCG内含子3x pA Hyg或pG2.AAV5.R2C5-hCG内含子3x pA Hyg连同Cre或iCre表达质粒共转染的细胞的裂解物含有高水平的Rep2蛋白。这显示通过LoxP位点的Cre重组从rep中的P19下游的hCG内含子除去3x SV40 polyA转录终止子和潮霉素抗性基因恢复表达。在每种情况下，iCre表达质粒在恢复Rep2表达方面似乎比野生型Cre表达质粒稍微更有效。
在4-羟基他莫昔芬不存在的情况下，用Ad2辅助质粒和pG.AAV2.R2C2-hCG内含子3x pA Hyg或pG2.AAV5.R2C5-hCG内含子3x pA Hyg连同ERT2-Cre-ERT2或ERT2-iCre-ERT2表达质粒共转染的细胞的裂解物仅表达痕量的Rep2蛋白。这可能是由于ERT2-侧接的Cre蛋白的残余活性，所述ERT2-侧接的Cre蛋白可能在细胞中处于此类高水平，且因此，少量能够在配体不存在的情况下进入细胞核并从rep2中的内含子切割转录终止子。或者，DMEM细胞培养基中的酚红可以充当弱雌激素受体配体。在生长培养基中存在1 µM 4-羟基他莫昔芬的情况下，用这些质粒转染的细胞具有的Rep2表达水平与用Cre和iCre表达质粒转染的那些细胞相似。因此，4-羟基他莫昔芬的添加恢复了ERT2-侧接的Cre蛋白的完整Cre活性。在每种情况下，用表达ERT2-iCre-ERT2的质粒转染的细胞在4-羟基他莫昔芬不存在的情况下具有较低的残余Rep2表达，并且在4-羟基他莫昔芬存在的情况下的Rep2表达水平高于用EET2-Cre-ERT2转染的细胞。。
在阴性未转染的细胞裂解物中未检测到Rep2。β-肌动蛋白抗体显示装载不完全均匀，但足够好，足以显示Rep2表达的任何不存在不是由于毛细血管的失败。在其中裂解物含有Rep2的毛细管中，较低的Rep2剪接变体使β-肌动蛋白信号模糊。
该实验显示，克隆至AAV2 rep基因中的终止内含子中的LoxP-侧接的转录终止子有效地抑制Rep2表达，并且细胞中的Cre活性可以恢复该Rep2表达。该实验还显示，ERT2-侧接的Cre蛋白的活性在4-羟基他莫昔芬上是条件性的，尽管在该配体不存在的情况下，它们的确具有低水平的残余活性。同样，密码子改进的iCre恢复了比野生型Cre略高的Rep2表达。
含有该重组rep基因的稳定转染的细胞系直到Cre表达被活化才表达Rep。在条件启动子的控制下的Cre基因因此可以用于开启Rep表达，并且一旦细胞在生物反应器中已经达到最佳密度，就起始AAV载体生产，减轻与Rep表达相关的毒性，直至它们达到该点。
实施例3
确定具有条件启动子的腺病毒2辅助基因维持AAV载体产生的能力和确定Cre-依
赖性的rep/cap是否能够产生功能性AAV载体的测试
设计并构建了用于重组AAV载体产生的稳定BAC构建体，其中腺病毒2 E2A和E4基因的天然启动子被条件启动子CMV-TO2替代。BAC在组成型启动子PCMV的下游还携带DOX-敏感的“tet-on”转录阻遏基因TetR-KRAB。用该构建体转染的细胞将组成性表达TetR-KRAB，所述TetR-KRAB结合E2A和E4 ORF上游的CMVTO2启动子，阻断其转录，直至将多西环素添加至细胞生长培养基中。由于TetR-KRAB还能够通过结合附近的Tet操纵子序列来阻断从Pol.III启动子转录，将7个Tet操纵子置于VA天然Pol. III启动子的上游，因此该功能性RNA的表达在正常条件下也将被阻断。
替代E2A和E4的内源启动子是否会破坏它们的表达且因此抑制它们在载体产生期间向细胞中的AAV Rep和Cap蛋白提供辅助功能的能力是未知的。
重要的是，与其中所有Ad2辅助基因都保留其内源启动子的类似构建体(BAC6)相比，测试包含具有条件启动子的所有Ad2辅助基因和TetR-KRAB基因的BAC构建体(CreBAC6)在HEK293 T细胞中瞬时AAV载体产生期间提供辅助功能的能力。为了使CreBAC6具有作为辅助者的活性，其需要向细胞生长培养基中添加DOX。通过用这些BAC连同携带AAV rep/cap的质粒(pG2.AAV2.R2C5-内含子)和载体产生的瞬时3-质粒系统中使用的EGFP表达转移载体(pG.AAV2.C.GFP.P2a.fLuc.W6.ssb)转染数烧瓶的悬浮适应的HEK293细胞并对其进行孵育来测试辅助功能。产生的任何载体可以通过裂解细胞来收获，并用于转导受体CHO细胞。通过经由流式细胞术测量GFP阳性细胞的百分比来评价转导水平，且因此评价功能性AAV载体产生的水平。
AAV产生
一烧瓶的HEK293Tsa细胞(如本申请中所用的HEK293Tsa细胞是指悬浮适应的HEK293T细胞)用3-质粒系统的标准质粒转染，用于瞬时产生rAAV5 (pG3.Ad2 Helper GSK、pG2.AAV5.R2C5-内含子和pG.AAV2.C.GFP.P2a.fLuc.W6.ssb)作为已知的阳性对照。
将HEK293Tsa细胞以2x106个细胞/ml接种于250 ml培养摇瓶中，60 ml/瓶的BalanCD HEK293培养基，2% Glutamax，0.1% Pluronic F-68。由于待针对辅助功能进行测试的BAC的体积大且产量有限，因此不可能以1.6 : 1 : 1辅助质粒 : rep/cap质粒(即包装质粒) : 转移载体的用于产生rAAV的3-质粒瞬时系统的通常摩尔比转染细胞。通常。由于该原因，其中BAC提供辅助功能的转染的摩尔比为0.62 : 1.0 : 0.86。以1.6 : 1 :0.86的辅助质粒 : rep/cap质粒 : 转移载体质粒的摩尔比使用3-质粒系统质粒。向一烧瓶用Cre-依赖性rep/cap质粒(pG2.AAV5.R2C5-hCG内含子3x pA HygR)转染的细胞中添加8.4 µg pG3.CMVTO2-iCre。还包括不含rep/cap质粒(仅辅助和转移载体)的阴性对照转染。一烧瓶的细胞是未转染的对照。将质粒添加至含有58.5 μl PEI Pro的6 ml Opti-MEM培养基中。将转染混合物涡旋并在室温下孵育15分钟，然后添加至含有细胞的摇瓶中。向用CreBAC6转染的细胞的烧瓶之一中，将DOX添加至细胞培养基中，至2 µg/ml的最终浓度。将细胞在37℃下振荡孵育。第二天，向每个烧瓶中添加1 M丁酸钠至5 mM的最终浓度。
转染后72小时后，通过以1,300 rpm离心10分钟使细胞沉淀，并重悬浮于4 ml裂解缓冲液中。通过3个循环的在干冰加乙醇中冷冻、随后在37℃下解冻，裂解细胞。然后将Benzonase以50 U/ml添加至裂解物中，并将管在37℃下孵育30分钟。然后通过以1,300 rpm离心10分钟将裂解物澄清，其后将上清液等分并弃去沉淀物。
AAV转导
将接受用AAV2和AAV5两者转导的CHO细胞以8 x 103个细胞/孔铺板在96孔板中(在每孔200 μl含有10% FCS、1x Glutamax和1x非必需氨基酸的DMEM中生长)。第二天，将20µl含有rAAV5的细胞裂解物和阴性对照裂解物中的每一种一式两份添加至CHO细胞的孔中。将CHO细胞的板在37℃下孵育5小时，其后，从孔中吸取含有裂解物的培养基，并用新鲜培养基替代。然后将板在37℃下再孵育67小时。然后从转导的CHO细胞中吸取培养基，并用200 μl EDTA溶液分解细胞，且然后在Accuri C6流式细胞仪上进行分析以测量GFP荧光水平，并且还用FlowJo软件进行分析。将活细胞群体在(FSC-A/SSC-A)上进行门控，然后为单细胞建立门控(FSC-A/FSC-H)。未转导的CHO细胞用于设置基线荧光(FL1-A/FSC-A)，在其之上，细胞可以被视为GFP阳性。计算每个转导细胞孔的荧光基线以上的细胞百分比，然后计算每个重复的平均值和标准偏差。结果显示于图3中。
图3显示其中所有Ad2辅助基因都保留其内源启动子的BAC能够在瞬时AAV载体产生中提供辅助功能。相对低水平的转导受体细胞(~2.4 %)(反映了相对低滴度的重组载体)可能是由于生产细胞的转染中使用的次优质粒比率以及如此大的(>30 kb)构建体至细胞中的低转导效率。在细胞培养基中不存在DOX的情况下，其中所有辅助基因都在条件控制下的CreBAC6没有为转染的细胞提供足够的辅助基因功能，无法产生足够的重组载体以将CHO细胞转导至可检测的荧光水平。这是由于以下事实：在DOX不存在的情况下，用该BAC转染的细胞将持续表达TetR-KRAB，其抑制所有辅助基因的转录。这显示，在DOX不存在的情况下，这些基因从该BAC的表达被显著抑制。这将可能降低Ad2辅助蛋白对用这种构建体稳定转染的细胞的毒性水平。在细胞培养基中存在2 µg/ml DOX的情况下，用CreBAC6转染的细胞产生的重组AAV载体的水平足够高，足以转导的CHO细胞的百分比大于(~3.4 %)比用来自以保留内源性启动子的辅助BAC转染的细胞的裂解物转导的那些。可能的是，当TetR-KRAB抑制被缓解时，CMVTO2启动子比E2A和E4的内源性启动子活性更高，允许这些基因在转染细胞中的表达水平更高，导致重组载体生产水平更高。该数据显示，E2A和E4辅助基因的表达没有通过用条件启动子替代它们的天然启动子而被破坏，并且甚至可以被改善。
用阴性对照仅辅助质粒+转移载体转染的细胞裂解物转导的细胞没有任何可检测的荧光水平。这显示在转导的CHO细胞中在基线以上测量的所有荧光是由于EGFP基因向细胞中的AAV转导递送，而不是由于EGFP蛋白从生产细胞裂解物向细胞中的吸收。
图4显示，如所预期，用3-质粒系统转染的细胞能够产生足够量的重组AAV5载体，足以将受体细胞转导至高水平(~52.3 %)。
在Cre表达质粒不存在的情况下，用Cre-依赖性的rep/cap表达质粒(即包含终止内含子的rep基因) (pG2.AAV5.R2C5-hCG内含子3x pA HygR)连同Ad2辅助质粒和EGFP转移载体转染的细胞没有产生重组载体至能够在转导细胞中产生可检测荧光的水平。这显示，在Cre不存在的情况下，包含终止内含子的rep基因是功能沉默的。
用Cre-依赖性的rep/cap表达质粒连同Ad2辅助质粒、EGFP转移载体和iCre表达质粒(pG3.CMVTO2-iCre)转染的细胞产生的重组载体足以将受体细胞转导至高水平(~22.2%)，尽管不如用标准的非Cre-依赖性的rep/cap转染的细胞那么多。这显示，该Cre-依赖性的rep基因(即包含终止内含子的rep基因)能够产生功能性AAV载体。与非Cre-依赖性的rep/cap质粒相比，产生的载体的量较低，可能是由于多种因素而不是剪接变体比率的破坏。可能的是，由于首先需要翻译iCre和重组LoxP位点，Rep表达的延迟可能导致较低的载体产率。可能的是，细胞中iCre表达的水平不是最佳的，并且用较大量iCre表达质粒转染细胞可能导致更高的载体产率。可能的是，由于iCre在细胞中不断表达并且有活性，因此转录终止子可能被重新插入它们已经被除去的rep基因中，导致Rep表达不断在细胞中流通。使用不同的试剂盒(分别为Qiagen Plasmid Plus Midi Kit和Nucleobond Xtra Maxi EFKit)纯化Cre-依赖性和标准的rep/cap质粒，并且这可能简单地是标准rep/cap质粒制备物的质量较高的情况。
因此，图3中的数据显示，当它们被活化时，用条件启动子替代Ad2辅助基因的内源性启动子并不负面影响它们的表达。图4中的数据显示，在Cre/iCre存在的情况下，Cre-依赖性的rep能够产生功能性重组AAV载体。当未被活化时，条件辅助基因和Cre-依赖性的rep两者均为功能沉默的。因此，在稳定的AAV生产BAC构建体中，在其中已经整合构建体的细胞中，所有细胞毒性都应当被抑制，允许它们正常分裂，直至开始重组载体产生。
实施例4
AAV细菌人工染色体的设计
使用以下方法将元件克隆至BAC中。
1. 每个元件使用校对DNA聚合酶与引物(其包括独特限制性位点，其允许将该元件克隆至BAC供体质粒pDonor的多克隆位点中)进行PCR扩增。
2. 将PCR扩增的片段凝胶纯化，并连接至TOPO克隆质粒pCR-Blunt II TOPO中。该连接用于转化化学感受态的大肠杆菌。
3. 从大肠杆菌液体培养物提取含有PCR扩增元件的质粒，并用2种限制性酶消化，所述限制性酶的位点通过PCR引物引入。
4. 通过琼脂糖凝胶电泳分离消化的质粒，并将消化的元件从凝胶切下并纯化。
5. 将消化和纯化的元件连接至pDonor的多克隆位点中。该质粒在多克隆位点附近含有2个鸡超敏绝缘子位点(2xcHS4)。将元件定向克隆至pDonor中，使得2xcHS4位于元件的3’末端。大范围核酸酶I-SceI的限制性位点位于pDonor中定向克隆元件的5’末端的上游，而大范围核酸酶PI-PspI的限制性位点位于2xcHS4的3’末端。该连接用于转化化学感受态的大肠杆菌。
6. 从大肠杆菌液体培养物提取携带定向克隆元件的pDonor质粒，并首先在37℃下用大范围核酸酶I-SceI消化，且然后在65℃下用PI-PspI消化。
7. 通过琼脂糖凝胶电泳分离消化的质粒，并从凝胶切下在3’末端包括2xcHS4的消化元件并纯化。
8. BAC含有单个PI-PspI限制性位点。BAC DNA在65℃下用PI-PspI消化，且然后通过向消化反应中添加FastAP碱性磷酸酶并将其在37℃下孵育30分钟来去磷酸化。然后通过在75℃下孵育反应5分钟来使FastAP失活。
9. 大范围核酸酶I-SceI和PI-PspI切割DNA，留下相容、但不对称的突出端。因此，可以将在3’末端具有2xcHS4的I-SceI和PI-PspI消化的元件定向连接至PI-PspI消化的BAC中。在该元件的5’末端的I-SceI突出端将结合BAC中的PI-PspI突出端之一，产生新序列，其不再可以被I-SceI或PI-PspI切割。在该元件下游2xcHS4的3’末端的PI-PspI突出端将结合BAC中的其他PI-PspI突出端，导致在连接的BAC中的2xcHS4的3’末端形成新的PI-PspI位点。该连接用于使用电穿孔仪转化电感受态的大肠杆菌。
10. 从大肠杆菌液体培养物提取BAC，所述BAC现在含有在3’末端具有2xcHS4的新克隆的元件。该BAC可以用PI-PspI消化并去磷酸化，并将已经定向亚克隆至pDonor中的另外的元件连接至该位点中。首先克隆至pDonor中的任何新元件，当连接至BAC中时，将始终在先前克隆片段的其5’末端具有2xcHS4，并在其已经克隆至pDonor中之后在其3’末端具有2xcHS4。
以这种方式产生的核酸载体的示意图显示于图5中。
实施例5
用AAV5 BAC构建体转染的细胞的稳定合并物的生成
在粘附的HEK293T细胞中进行rAAV BAC构建体的转染和选择。对在摇床培养的BalanCD培养基中生长的悬浮适应的HEK293Tsa pre-MCB细胞进行计数，并以2 x 105个细胞/ml重悬浮于含有10% FCS的DMEM培养基中，其将它们恢复至粘附行为。将细胞铺板在6-孔板中，每孔2ml，然后将其在37℃下孵育过夜。第二天，将含有EGFP转移载体(TetR-KRABiCreBAC9b-GFP和TetR iCreBAC9b-GFP)的稳定AAV BAC构建体的大量制备物转染至铺板的细胞中。每种转染含有添加至300 µl OPTI-MEM 的5 µg来自BAC大量制备物的DNA，向其中添加5 µl PEI-pro。将管短暂涡旋并孵育10分钟。此后，将转染混合物添加至每个孔中。48小时后，将孔吸液，并用含有10% FCS和300 µg/ml博莱霉素的DMEM替代培养基。将该板孵育几天，在此期间大多数未转染的细胞死亡并漂浮在孔的表面上。将培养基用含有10% FCS和300 µg/ml博莱霉素的新鲜DMEM培养基替代几次。7天后，孔中的细胞大部分为EGFP阳性，并以正常速率加倍。
稳定合并物的诱导重组AAV载体产生
对用TetR-KRAB iCreBAC9b-GFP和TetR iCreBAC9b-GFP构建体稳定转染的HEK293T细胞的合并物进行计数，并以1 x 107个细胞/烧瓶铺板于T175烧瓶中的25 ml含有10% FCS和50 µg/ml博莱霉素的DMEM中。将所有烧瓶的细胞在37℃下孵育过夜。第二天，通过用含有10% FCS与2 µg/ml DOX和5 mM丁酸钠的新鲜DMEM替代培养基来诱导细胞中的载体产生。一个烧瓶的两种稳定合并物中的每一种未诱导，作为阴性对照。添加DOX后72小时，收获1个诱导烧瓶和未诱导对照的细胞。添加DOX后96小时，收获另一个诱导烧瓶的稳定合并物中的每一种。
为了从诱导和未诱导的细胞中获得裂解物，细胞通过以1,300 rpm离心10分钟来沉淀，并重悬浮于2 ml裂解缓冲液中。然后细胞通过3个循环的在干冰加乙醇中冷冻、随后在37℃下解冻来裂解。将裂解物通过以1,300 rpm离心10分钟来澄清，其后将上清液移至新管中并弃去沉淀。
用来自稳定生产者的裂解物转导受体细胞
将接受用AAV5转导的CHO细胞以8 x 103个细胞/孔铺板在96孔板中(在每孔200 μl含有10% FCS、1x Glutamax和1x非必需氨基酸的DMEM中生长)。第二天，将20 µl含有rAAV5的细胞裂解物和阴性对照裂解物中的每一种一式两份添加至CHO细胞的孔中。将CHO细胞的板在37℃下孵育5小时，其后，从孔中吸取含有裂解物的培养基，并用新鲜培养基替代。然后将板在37℃下再孵育67小时。然后从转导的CHO细胞中吸取培养基，并用200 μl EDTA溶液分解细胞，且然后在Accuri C6流式细胞仪上进行分析以测量GFP荧光水平。将活细胞群体在(FSC-A/SSC-A)上进行门控，然后为单细胞建立门控(FSC-A/FSC-H)。未转导的CHO细胞用于设置基线荧光(FL1-A/FSC-A)，在其之上，细胞可以被视为GFP阳性。计算每个转导细胞孔的荧光基线以上的细胞百分比。用来自诱导的稳定合并物的裂解物转导的细胞无一显示高于基线的任何GFP荧光。
用AAV5 BAC构建体转染的细胞的稳定合并物的RNAseq分析
为了确定构建体在细胞中是否在机制上有功能，比较来自DOX-诱导和未诱导的细胞的所有聚腺苷酸化RNA的RNA测序分析。对用TetRKRAB iCreBAC9b-GFP和TetRiCreBAC9b-GFP构建体稳定转染的HEK293T细胞的合并物进行计数，在含有10% FBS的DMEM中稀释至3 x 105个细胞/ml，并各自铺板于6-孔板中，每孔2 ml。将板在37℃下孵育过夜。第二天，通过将培养基换为含有10% FBS、2 µg/ml DOX和5 mM丁酸钠的DMEM来诱导每种稳定合并物的3个孔。在每个板的剩余3个孔中，将培养基简单地替换为新鲜的DMEM + 10%FCS。将板在37℃下孵育5天，其后未诱导的细胞通过如下来收获：用胰蛋白酶分解它们，将它们重悬浮于1 ml培养基中，并以300 xg 将它们旋转下来以沉淀细胞。吸出培养基，并将细胞沉淀物储存在-80℃。将诱导细胞的培养基用含有10% FBS、2 µg/ml DOX和5 mM丁酸钠的新鲜DMEM培养基替代，并将板在37℃下再孵育2天。此后，还收获诱导的细胞，沉淀并储存在-80℃。通过GeneWiz使用Illumina对从细胞沉淀提取的聚腺苷酸化RNA进行RNA seq分析。将读取值返回至GSK，在这里使用IGV软件将其与BAC序列进行比对(数据未显示)。
比对显示，如所预期，TetR、TetR-KRAB和EGFP-fLuc(其中全部都在构建体中组成型CMV启动子的控制下)都在DOX-诱导和未诱导的HEK 293T细胞中表达。然而，比对还显示，构建体中条件表达的ORF：E2A、E4、iCre和rep2cap5，如所设计，在DOX-诱导的细胞中转录活化，而在未诱导的细胞中未检测到它们。在DOX-诱导的细胞RNA中与这些ORF对齐的读取值数显著低于与组成型活性ORF对齐的读取值数。在未诱导的细胞中无法检测到这些转录物的事实证实，在DOX不存在的情况下，这些ORF的转录物被TetR和TetR-KRAB阻断。没有读取值与来自任何细胞的RNA中的VA ORF对齐。这是预期的，因为仅纯化了聚腺苷酸化的RNA，并且从pol. III启动子表达的VA未被聚腺苷酸化。这全部证实所述构建体在HEK 293T细胞中在机制上有功能，并且在DOX-诱导的细胞中缺乏可检测的Rep蛋白或转导载体最可能是由于转录物的低水平。
下表2对于两种稳定合并物(诱导和未诱导)显示了BAC构建体ORF各自的每百万转录物的数目(TPM)：
构建体的TetR部分的读取值数为约每百万个转录物3600-5100个。EGFP-fLuc转录物以与TetR相似的水平存在。
在条件表达的ORF中，DOX在表达TetR的细胞中最高地诱导E2A。在表达TetR或TetR-KRAB的未诱导的细胞中，无法检测到E2A转录物。这意味着标准的GSK密码子优化的TetR蛋白足以在正常生长条件下完全阻断CMVTO2启动子下游基因的转录，并且通过TetR-KRAB中的KRAB结构域对周围DNA进行额外的异染色质化并不一定增强在这种基因的情况下的负调控。在用TetR构建体稳定转染的细胞中，通过向细胞生长培养基中添加DOX对 E2A转录的诱导是用TetR-KRAB构建体稳定转染的细胞的6.89倍。可能这是由于通过KRAB结构域的负调控增加。iCre基因在诱导的TetR表达细胞中的表达水平也比诱导的TetR-KRAB表达细胞更高(2.71 x)。
在两种稳定合并物内，E4和rep2cap5 ORF以甚至更低的水平表达。
与E2A和iCre相反，E4 ORF在表达TetR-KRAB的DOX诱导的细胞中比表达TetR的细胞表达更高(5.65 x)。一种假设是，E4 ORF6对细胞有高毒性，并且当BAC构建体首次转染至细胞中时，在TetR或TetR-KRAB蛋白以足够的水平表达之前存在时间窗口，并且在此期间，CMVTO2启动子下游的条件表达的基因可以转录并产生蛋白。由于其毒性，可能针对选择E4ORF，并且只有其中DNA的该区域已被沉默或分裂的细胞才存活，导致缺乏E4区域的稳定细胞。可能表达TetR-KRAB的细胞(比单独的TetR提供更严格的负调控)比表达TetR的细胞更可能在更早的时间停止产生E4 ORF6蛋白，导致更多的BAC的完整E4区域整合至其基因组中的细胞存活。为了避免BAC的E4区域被针对选择，可能必需用TetR/TetR-KRAB RNA预转染细胞，使得E4的CMVTO2启动子一进入细胞就被结合并阻断转录。
这也显示，rep2cap5转录物在诱导的细胞中增加。在未诱导的细胞中看到的rep转录物水平低是因为，在HEK293细胞中，rep启动子有组成型活性。由于P19下游的转录终止子在DOX不存在的情况下仍然在原位，因此这些转录物代表了短的、过早终止的RNA。DOX-诱导的稳定合并物中的rep2cap5转录物增加是由于转录终止子的除去，允许转录物行进通过整个ORF，尽管转录物的实际数可能实际上没有增加。诱导细胞中的rep2cap5 RNA的这种增加证明，诱导细胞中的iCre的水平足够高，足以重组侧接转录终止子的LoxP位点。
可能在每种稳定合并物中，存在具有大量整合的细胞，如果克隆，则其能够在DOX诱导后产生可检测水平的重组AAV载体。
转座酶调节的rep/cap的构建
测试额外的BAC构建体，其中rep启动子下游的转录终止子被转座子ITR侧接，并且iCre被转座酶替代。
已经报道，可能通过突变piggyBac系统中使用的甘蓝蠖度尺蛾(cabbage loopermoth)(粉纹夜蛾(Trichoplusia ni))转座酶中的3个氨基酸来产生切除+整合-表型(Li等人, 2013 “PiggyBac transposase tools for genome engineering” PNAS 110: E2279-E2287)。这将意味着，通过将DOX添加至用这种构建体稳定转染的细胞中来表达转座酶将导致不可逆地除去rep启动子下游的转录终止子，希望导致更大的Rep表达。
来自Macdunnoughia crassisigna的转座酶与来自粉纹夜蛾的转座酶具有98.82%同一性。Yusa等人 (Yusa K等人 “A hyperactive piggyBac transposase for mammalianapplications, 2011, PNAS 108: 1531-1536)发现粉纹夜蛾转座酶中的7个氨基酸取代(I30V、S103P、G165S、M282V、S509G、N538K、N571S)导致过高活性表型。这些取代被应用于M. crassisigna转座酶氨基酸序列。另外，Li等人(2013, PNAS 110: E2279-E2287)发现在粉纹夜蛾转座酶中导致切除+整合-表型的3个氨基酸取代(R372A、K375A、D450N)也被应用于M. crassisigna转座酶序列。修饰的M. crassisigna转座酶氨基酸序列如下所示，其中过高活性表型取代以红色突出，且切除+整合-表型取代以绿色突出。
修饰的M. crassisigna转座酶氨基酸序列(SEQ ID NO:1)如下所示，其中过高活性表型加下划线并呈粗体，且切除+整合-表型取代呈粗体斜体：
将该氨基酸序列转化为密码子优化的DNA序列并合成。
还合成了来自M. crassisigna转座子(EU287451)的ITR。
为了生成用于将转座子ITR侧接的转录终止子克隆至rep中的内含子中的DNA片段，设计引物(参见表3)以便用引物Int-3'ITR Gib F & Int-5'ITR Gib R PCR扩增GSK的内部rep2cap5表达质粒pG2.AAV5.R2C5-内含子(9.15 kb片段)的整个序列。使用引物3xpA-5'ITR Gib F & 3xpA-3'ITR Gib R从pUC57.Int-3A-Hyg PCR扩增含有转录终止子的2.72kb片段。使用引物5'ITR-Int Gib F & 5'ITR-3xpA Gib R从pUC57.5’-ITR扩增349 bp 5’转座子ITR。使用引物3'ITR-3xpA Gib F & 3'ITR-Int Gib R从pUC57.3’-ITR扩增278 bp3’转座子ITR。
表3 引物序列
所有引物均订购自ThermoFisher Scientific。加下划线的核苷酸表示引物中包括的5'突出端，以提供PCR产物中与Gibson克隆反应中与之相邻组装的序列重叠的区域。
进行2个转座子ITR和转录终止子的PCR，随后扩增pG2.AAV5.R2C5-内含子。首先通过重叠PCR将2个转座子ITR连接在3 x pA HygR转录终止子片段的任一侧。使用引物5’ITR-Int Gib F & 3xpA-3’ITR Gib R在PCR中组合5’-ITR和转录终止子的片段。然后在PCR中使用引物5’ITR-Int Gib F & 3’ITR-Int Gib R将该片段与3’转座子ITR片段组合。
将等体积的5 μl 5’ITR-3xpA-HygR-3’ITR片段和pG2.AAV5.R2C5-内含子片段组合，并使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Mastermix克隆。
如下将M. crassisigna转座酶克隆在CMVTO2启动子的下游。
为了生成用于克隆CMV-TO2启动子下游和SV40 polyA上游的M. crassisigna转座酶的DNA片段，设计引物以PCR扩增作为4.25 kb片段的pG3.CMVTO2-。含有的引物与转座酶序列末端重叠。
将等体积的5 μl pG3.CMVTO2片段和M. crassisigna转座酶片段组合，并使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Mastermix克隆。
转座酶调节的rep2cap5在瞬时转染的细胞中产生功能性AAV载体的测试
为了测试转座酶除去重组转座子inrep和起始AAV载体生产的能力，在瞬时转染中测试所述组分。各烧瓶的悬浮适应的HEK 293细胞用如下质粒转染：
1. rep2/cap5 + 辅助质粒 + EGFP转移载体质粒
2. rep2/cap5-转座子3xpA + 辅助质粒 + EGFP转移载体质粒
3. rep2/cap5-转座子3xpA + 辅助质粒 + EGFP转移载体质粒+转座酶
4. rep2/cap5-LoxP 3xpA + 辅助质粒 + EGFP转移载体质粒
5. rep2/cap5-LoxP 3xpA + 辅助质粒 + EGFP转移载体质粒+ iCre
6. 辅助质粒 + EGFP转移载体质粒
7. 未转染的细胞
转染程序如下。
将HEK293Tsa细胞以2x106个细胞/ml接种于250 ml培养摇瓶中，60 ml/瓶的BalanCD HEK293培养基，2% Glutamax，0.1% Pluronic F-68中。所述质粒以辅助质粒与rep/cap质粒的1.6 : 1 : 1摩尔比使用，以转移载体质粒。将质粒添加至含有58.5 μl PEIPro的6 ml Opti-MEM培养基中。将转染混合物涡旋并在室温下孵育15分钟，然后添加至含有细胞的摇瓶中。将细胞在37℃下振荡孵育。第二天，向每个烧瓶中添加1 M丁酸钠至5 mM的最终浓度。
转染后72小时后，通过以1,300 rpm离心10分钟使细胞沉淀，并重悬浮于4 ml裂解缓冲液中。通过3个循环的在干冰加乙醇中冷冻、随后在37℃下解冻，裂解细胞。然后将Benzonase以50 U/ml添加至裂解物中，并将管在37℃下孵育30分钟。然后通过以1,300 rpm离心10分钟将裂解物澄清，其后收获上清液并弃去沉淀物。
将接受用AAV5转导的CHO细胞以8 x 103个细胞/孔铺板在96孔板中(在每孔200 μl含有10% FCS、1x Glutamax和1x非必需氨基酸的DMEM中生长)。第二天，将20 µl含有rAAV5的细胞裂解物和阴性对照裂解物中的每一种一式两份添加至CHO细胞的孔中。将CHO细胞的板在37℃下孵育5小时，其后，从孔中吸取含有裂解物的培养基，并用新鲜培养基替代。然后将板在37℃下再孵育67小时。然后从转导的CHO细胞中吸取培养基，并用200 μl EDTA溶液分解细胞，且然后在流式细胞仪上进行分析以测量GFP荧光水平。将活细胞群体在(FSC-A/SSC-A)上进行门控，然后为单细胞建立门控(FSC-A/FSC-H)。未转导的CHO细胞用于设置基线荧光(FL1-A/FSC-A)，在其之上，细胞可以被视为GFP阳性。计算每个转导细胞孔的荧光基线以上的细胞百分比，然后计算每个重复的平均值和标准偏差。这些显示于表4中：
| Ad2辅助质粒 + rep2cap5 + EGFP转移质粒 | 42.05 |
| Ad2辅助质粒 + rep2cap5-转座子+ EGFP转移质粒 | 0.535 |
| Ad2辅助质粒 + rep2cap5-转座子 + EGFP转移质粒 +转座酶 | 20.55 |
| Ad2辅助质粒 + rep2cap5-loxP + EGFP转移质粒 | 0.0235 |
| Ad2辅助质粒 + rep2cap5-loxP + EGFP转移质粒 + iCre | 22.4 |
| Ad2辅助质粒 + EGFP转移质粒 | 0.0395 |
| 未转染 | 0 |
用使用组成型、转座酶依赖性和Cre-依赖性rep2/cap5产生的rAAV转导的比较
该数据显示，如所预期，用标准3-质粒系统转染的细胞能够产生足够量的重组AAV5载体，足以将受体细胞转导至高水平(~42%)。
在转座酶表达质粒不存在的情况下，用转座子-依赖性rep/cap表达质粒(pG2.AAV5.R2C5-内含子可转座3x pA)连同Ad2辅助质粒和EGFP转移载体转染的细胞没有产生重组载体至能够在转导细胞中产生可检测荧光的水平。这显示，在转座酶不存在的情况下，该重组rep/cap是功能上沉默的，并且是由于转录终止子。
用转座子-依赖性rep/cap表达质粒连同Ad2辅助质粒、EGFP转移载体和M. crassisigna转座酶表达质粒(pG3.CMVTO2-M. crassisigna转座酶)转染的细胞产生足够的重组载体，足以将受体细胞转导至高水平(~20.6 %)。这与当Cre-依赖性的rep/cap表达质粒(pG2.AAV5.R2C5-hCG内含子3x pA HygR)与Ad2辅助质粒、EGFP转移载体和iCre表达质粒(pG3.CMVTO2-iCre)共转染时产生的重组载体的量相当(22.4%)，尽管不如用标准的非转座酶-依赖性rep/cap转染的细胞那么多。这表明该转座酶-依赖性rep基因能够产生功能性AAV载体。与非转座酶-依赖性的rep/cap质粒相比产生的载体量较少可能是由于许多因素。可能Rep表达由于首先需要翻译转座酶和重组ITR导致的延迟可能导致较低的载体产率。可能细胞中转座酶表达的水平不是最佳的，并且用更大量的转座酶表达质粒转染细胞可能导致更高的载体产率。
该数据显示，在转座酶存在的情况下，转座酶-依赖性rep能够产生功能性重组AAV载体。当未活化时，转座酶-依赖性rep是功能上沉默的。与Cre-依赖性的rep基因不同，用切除阳性/整合阴性重组转座酶除去转录终止子是不可逆的。这应当导致诱导稳定细胞后Rep蛋白更稳定的表达。
Claims (35)
1.腺相关病毒(AAV)载体生产细胞，其包含编码以下的核酸序列：
AAV rep和cap基因，
辅助病毒基因，和
所述AAV载体的DNA基因组；
其中所述AAV rep基因包含内含子，所述内含子包含转录终止序列，所述转录终止序列具有位于所述转录终止序列上游的第一重组位点和位于所述转录终止序列下游的第二重组位点；且
其中所述核酸序列全部一起整合在所述AAV载体生产细胞基因组内的单一基因座处。
2.根据权利要求1所述的AAV载体生产细胞，其中所述内含子进一步包含所述重组位点之间的基因，任选地其中所述基因是可选择标记基因，进一步任选地其中所述可选择标记是潮霉素。
3.根据权利要求1或2所述的AAV载体生产细胞，其进一步包含编码重组酶基因的核酸序列。
4.根据权利要求3所述的AAV载体生产细胞，其中所述编码重组酶基因的核酸序列与编码AAV rep和cap基因、辅助病毒基因和AAV载体的DNA基因组的核酸序列一起整合在所述AAV载体生产细胞基因组内的单一基因座处。
5.根据权利要求3或4所述的AAV载体生产细胞，其进一步包含重组酶控制系统。
6.根据权利要求5所述的AAV载体生产细胞，其中所述重组酶控制系统包含在诱导型启动子的控制下的重组酶基因和/或与所述重组酶可操作连接的类固醇激素受体配体-结合结构域。
7.根据权利要求6所述的AAV载体生产细胞，其中所述类固醇激素受体配体-结合结构域是雌激素受体配体结合-结构域(ER)，任选地其中所述ER是ERT2。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的AAV载体生产细胞，其中所述重组位点是LoxP位点，且所述重组酶基因是cre重组酶基因，任选地其中所述cre重组酶基因是密码子优化的cre重组酶基因(icre)。
9.根据权利要求3至7中任一项所述的AAV载体生产细胞，其中所述重组位点是转座子ITR，且所述重组酶基因是转座酶基因，任选地其中所述转座酶基因是密码子优化的转座酶基因。
10.根据权利要求9所述的AAV载体生产细胞，其中所述转座子ITR和转座酶基因是真核的。
11.根据权利要求10所述的AAV载体生产细胞，其中所述转座子ITR和转座酶源自粉纹夜蛾(T. ni)、Macdunnoghia crassisigna (M. crassisigna)、Bactrocera minuta、Eumeta japonica或棉铃虫(Helicoverpa armigera)。
12.根据任一前述权利要求所述的AAV载体生产细胞，其中所述辅助病毒基因中的一种或多种在转录控制下。
13.根据权利要求6或12所述的AAV载体生产细胞，其中所述诱导型启动子或转录控制分别包含pCMV-TO2启动子。
14.根据任一前述权利要求所述的AAV载体生产细胞，其进一步包含绝缘子，任选地其中所述绝缘子存在于所述核酸序列各自之间。
15.根据任一前述权利要求所述的AAV载体生产细胞，其进一步包含可选择标记，任选地其中所述可选择标记是可扩增选择标记。
16.包含非哺乳动物复制起点且能够容纳至少25千碱基(kb)的DNA的核酸载体，其特征在于所述核酸载体包含编码以下的核酸序列：
AAV rep和cap基因；
辅助病毒基因；和
AAV载体的DNA基因组；
其中所述rep基因包含内含子，所述内含子包含转录终止序列，所述转录终止序列具有位于所述转录终止序列上游的第一重组位点和位于所述转录终止序列下游的第二重组位点；且
其中编码AAV rep和cap基因、每种辅助病毒基因和AAV载体的DNA基因组的核酸序列作为单独的表达盒排列在所述核酸载体内。
17.根据权利要求16所述的核酸载体，其中所述内含子进一步包含所述重组位点之间的基因，任选地其中所述基因是可选择标记基因，进一步任选地其中所述可选择标记是潮霉素。
18.权利要求16或17的核酸载体，其进一步包含编码重组酶基因的核酸序列，所述核酸序列作为单独表达盒排列在所述核酸载体内。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的核酸载体，其进一步包含重组酶控制元件。
20.根据权利要求19所述的核酸载体，其中所述重组酶控制元件包含与重组酶基因可操作连接的诱导型启动子和/或与所述重组酶基因融合的类固醇激素受体配体-结合结构域。
21.根据权利要求20所述的核酸载体，其中所述类固醇激素受体配体-结合结构域是雌激素受体配体结合-结构域(ER)，任选地其中所述ER是ERT2。
22.根据权利要求21所述的核酸载体，其中所述ER在所述重组酶基因的上游和下游可操作连接。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的核酸载体，其中所述重组位点是LoxP位点，且所述重组酶基因是cre重组酶基因，任选地其中所述cre重组酶基因是密码子优化的cre重组酶基因(icre)。
24.根据权利要求18至22中任一项所述的核酸载体，其中所述重组位点是转座子ITR，且所述重组酶基因是转座酶基因，任选地其中所述转座酶基因是密码子优化的转座酶基因。
25.根据权利要求24所述的核酸载体，其中所述转座子ITR和转座酶基因是真核的。
26.根据权利要求25所述的核酸载体，其中所述转座子ITR和转座酶基因源自粉纹夜蛾(T. ni)、Macdunnoghia crassisigna (M. crassisigna)、Bactrocera minuta、Eumeta japonica或棉铃虫(Helicoverpa armigera)。
27.根据权利要求16至26中任一项所述的核酸载体，其中所述辅助病毒基因中的一种或多种作为单独的表达盒在转录控制下。
28.根据权利要求16至27中任一项所述的核酸载体，其进一步包含绝缘子，任选地其中所述绝缘子存在于所述表达盒各自之间。
29.根据权利要求16至28中任一项所述的核酸载体，其进一步包含可选择标记，任选地其中所述可选择标记是可扩增选择标记。
30.根据权利要求16至29中任一项所述的核酸载体，其中所述载体选自以下之一：细菌人工染色体、酵母人工染色体、P1-衍生的人工染色体、F粘粒或粘粒。
31.产生稳定的AAV载体生产细胞系的方法，其包括：
(a) 将根据权利要求16-30中任一项所述的核酸载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中；和
(b) 在所述培养物内选择具有在整合至所述哺乳动物宿主细胞的内源染色体中的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞。
32.通过权利要求31的方法获得的AAV载体生产细胞。
33.产生复制缺陷型AAV载体的方法，其包括：
(a) 将根据权利要求16-30中任一项所述的核酸载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中；和
(b) 在所述培养物内选择具有在整合至所述哺乳动物宿主细胞的内源染色体中的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞；和
(c) 在产生复制缺陷型AAV载体的条件下进一步培养选择的哺乳动物宿主细胞。
34.通过权利要求33的方法获得的复制缺陷型AAV载体。
35.根据权利要求31或33所述的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞是HEK293细胞。
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