BR112021004386A2 - linhagens celulares produtoras de vetores virais adenoassociados - Google Patents

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Abstract

LINHAGENS CELULARES PRODUTORAS DE VETORES VIRAIS ADENOASSOCIADOS. A presente invenção refere-se a uma célula produtora de vetor viral adenoassociado (AAV) compreendendo sequências de ácido nucleico que codificam os genes rep e cap de AAV, genes de vírus auxiliares e um genoma de DNA do vetor AAV; o gene rep de AAV compreendendo um íntron, o íntron compreendendo uma sequência de terminação de transcrição com um primeiro sítio de recombinação localizado a montante e um segundo sítio de recombinação localizado a jusante da sequência de terminação de transcrição; e as sequências de ácido nucleico todas integradas em um único lócus dentro do genoma da célula produtora de vetor AAV. A invenção também se refere a métodos para a produção de linhagens celulares produtoras de vetor AAV.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "LINHA- GENS CELULARES PRODUTORAS DE VETORES VIRAIS ADENO- ASSOCIADOS".
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se às linhagens celulares pro- dutoras de vetores AAV, métodos para produzir as mesmas e vetores de ácido nucleico para uso nos referidos métodos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] O vírus adenoassociado (AAV) foi descoberto em 1965, como um contaminante de preparações de adenovírus. O AAV possui um genoma linear de DNA de fita simples (ssDNA) de aproximada- mente 4,7 quilobases (kb), com duas repetições terminais invertidas ao longo de 145 nucleotídeos (ITR) nas extremidades. As ITRs flanquei- am dois quadros de leitura abertos (genes rep e cap) que codificam uma série de polipeptídeos Rep (replicação) e Cap (capsídeo). Os po- lipeptídeos Rep (Rep78, Rep68, Rep62 e Rep40) são proteínas não estruturais, que estão envolvidas na replicação, resgate e integração do genoma do AAV. As proteínas Cap, (VP1, VP2 e VP3) são proteí- nas estruturais, que formam a cápside do vírion. O AAV foi classificado como Dependoparvovirus (um gênero da família Parvoviridae) porque requer coinfecção com vírus auxiliares tais como adenovírus, vírus de herpes simples (HSV) ou vírus da varíola para infecção produtiva na cultura de células. Por exemplo, o adenovírus fornece genes que de- vem ser expressos para a replicação de AAV e produção de vírions: E1A, E1B, E2A, E4 e o VA (Atchison et al. (1965) Science 149:754; Buller et al. (1981) J. Virol. 40:241).
[003] Os vetores AAV demonstraram transdução e expressão gênica de longo prazo e possuem a capacidade de infectar células tan- to em divisão quanto quiescentes. Além disso, atualmente não se sabe que o AAV provoca doenças e, portanto, provoca pouca ou nenhuma toxicidade e inflamação in vivo. Essas características levaram o AAV a se tornar um vetor desejável para aplicações em terapia gênica.
[004] Vários métodos de produção de vetor AAV em linhagens celulares são comumente utilizados e podem ser divididos em duas estratégias diferentes. A primeira estratégia é baseada na cotransfec- ção transiente livre de vírus auxiliar do tipo selvagem de todos os ele- mentos (plasmídeo expressando DNA do vetor AAV (transgene flan- queado por ITRs de AAV), plasmídeo expressando genes rep e cap, plasmídeo expressando genes de vírus auxiliares, comumente isola- dos de adenovírus), que são necessários para a produção do vetor AAV em células hospedeiras, tais como células HEK293 (Xia et al. (1996) J. Virol. 70:8098). Embora o método de cotransfecção transitó- ria gere títulos elevados de vetores AAV que são livres de adenovírus, o processo é muito trabalhoso, caro e difícil de elevar para produção em grande escala.
[005] A segunda estratégia envolve a infecção de vírus auxiliares do tipo selvagem (por exemplo, adenovírus do tipo selvagem) de li- nhagens celulares que abrigam de forma estável os genes rep e cap, assim como o transgene flanqueado pelas ITRs de AAV. Embora o método induzível de adenovírus do tipo selvagem possa ser ampliado em culturas e produzir vetores AAV com títulos elevados, é muito de- safiador remover completamente o adenovírus do produto de AAV. A contaminação por adenovírus do tipo selvagem é altamente indesejá- vel em vista da segurança e especificidade do vetor.
[006] As desvantagens dos métodos atuais de produção de vetor AAV podem ser superadas pelo fornecimento de uma linhagem celular produtora estável para produção de grau clínico em grande escala de vetores AAV recombinantes para uso clínico. No entanto, a criação de uma linhagem celular que expressa constitutivamente os genes rep e cap tem sido difícil devido aos efeitos citotóxicos e antiproliferativos das proteínas Rep na célula hospedeira que podem limitar severamen- te sua utilidade como uma linhagem celular produtora de vetor AAV. Por exemplo, Rep78 mostrou induzir a apoptose independente de p53, atribuível em parte à ligação ao DNA e atividades ATPase-helicase de Rep78. Além disso, Rep78 é conhecido por inibir a progressão do ciclo celular, em particular, incluindo a parada completa dentro da fase S. O Rep78, junto com o Rep68, também produz cortes na cromatina celu- lar, induzindo uma resposta de dano ao DNA levando a blocos G 1 e G2. Além disso, Rep78 demonstrou afetar as vias de transdução de sinal de cAMP, que desempenham um papel central na regulação do crescimento e desenvolvimento celular (Schmidt et al. (2000) J. Virol. 74:9441; Berthet et al. (2005) PNAS 102:13634; Schmidt et al. (2002) J. Virol. 76:1033).
[007] Como tais, as linhagens celulares estáveis que expressam constitutivamente as proteínas Rep não são capazes de sobreviver para atingir a densidade celular necessária para produzir vetores AAV em um biorreator em grande escala. Portanto, seria desejável ter uma linhagem celular produtora estável tendo integrado de forma estável em seu genoma todos os elementos genéticos e sistemas de controle necessários para a produção induzível de um vetor AAV recombinante para superar uma ou mais desvantagens associadas aos métodos e linhagens celulares existentes.
SUMARIO DA INVENÇÃO
[008] Os presentes inventores desenvolveram uma nova linha- gem celular produtora de vetor AAV em que todas as sequências de ácido nucleico que codificam os genes virais (AAV e vírus auxiliar) e transgene essencial para a produção de AAV recombinante são inte- grados em um único lócus dentro do genoma da célula produtora de vetor AAV e em que a expressão das proteínas Rep pode ser regulada para permitir a manipulação eficiente da linhagem celular produtora,
por exemplo, durante a geração da linhagem celular, banco de células e expansão celular. A expressão de Rep é controlada utilizando um sistema de controle de expressão no qual todos os transcritos de rep de ambos os promotores de rep, P5 e P19, são prematuramente ter- minados até um ponto de tempo em que a expressão de Rep é dese- jada. A vantagem deste sistema é que é possível manter todos os promotores nativos dos genes rep e cap a fim de manter a estequio- metria correta dos vários transcritos do gene rep e cap necessários para a produção eficiente do vetor AAV. Além disso, como o sistema de controle de expressão está contido em um íntron dentro do gene rep, que é removido durante o processamento do RNA, ele também possui a vantagem adicional de que a integridade do mRNA dos genes rep e cap não é afetada.
[009] Para produzir a nova linhagem celular produtora de vetor AAV da invenção, os inventores desenvolveram uma nova maneira de produzir linhagens celulares produtoras que envolve o uso de vetores de ácido nucleico compreendendo uma origem de replicação de não mamífero e a capacidade de conter pelo menos 25 quilobases (kb) de DNA, tal como os cromossomos artificiais bacterianos, carregando to- dos os vírus adenoassociados (AAV) e genes auxiliares, e o transgene essencial para a produção do vetor AAV recombinante.
[010] O uso de um vetor de ácido nucleico compreendendo uma origem de replicação de não mamífero e que possui a capacidade de conter pelo menos 25 kb de DNA (isto é, DNA de grande constructo) possui várias vantagens. No primeiro caso, os vetores podem em pri- meiro lugar ser manipulados em células de não mamíferos (por exem- plo, células microbianas, tais como células bacterianas) em vez de cé- lulas hospedeiras de mamíferos, tornando-os muito mais fáceis de tra- balhar (por exemplo, cromossomos artificiais bacterianos podem ser primeiro manipulados em E. coli). Uma vez que o vetor de ácido nu-
cleico foi preparado, ele pode ser introduzido em uma célula hospedei- ra de mamífero e quaisquer células nas quais o vetor de ácido nucleico foi integrado em um ou vários dos cromossomos endógenos podem ser selecionadas a fim de isolar uma linhagem celular estável.
[011] A introdução do vetor de ácido nucleico em células hospe- deiras de mamíferos também ocorre em uma única etapa, ajudando a reduzir a pressão de seleção e o período de tempo de silenciamento. Isso leva em conta um rastreamento mais rápido de células produtoras em potencial e reduz o custo dos materiais porque apenas um único vetor é utilizado, em comparação com os métodos precedentes que envolvem o rastreamento de cada um dos múltiplos vetores de plas- mídeo. Em particular, o uso deste sistema reduz o custo de fabricação de plasmídeo, reduz a necessidade de reagentes de transfecção (por exemplo, Polietilenimina (PEI)), reduz a quantidade de tratamento com Benzonase™ requerido (existe uma quantidade reduzida de DNA na colheita viral, portanto, menos Benzonase™ é necessário para remo- ver o excesso no processamento a jusante) e reduz os custos de teste (não há necessidade de testar o plasmídeo residual no produto viral). Estas vantagens são particularmente pertinentes para a produção in- dustrial em grande escala de vetores AAV recombinantes para aplica- ção terapêutica, que devem cumprir os requisitos de GMP.
[012] Além disso, visto que todas as sequências de ácido nuclei- co que codificam todos os elementos essenciais para a produção do vetor AAV recombinante são clonadas contiguamente dentro do mes- mo vetor de ácido nucleico, quando o vetor é introduzido nas células hospedeiras de mamífero, todos os genes incorporados no vetor irão se integrar em um lócus dentro do genoma da célula hospedeira de mamífero endógeno. Isso torna mais fácil selecionar clones estáveis em que nenhum dos genes requeridos para a produção de AAV se in- tegrou em uma região do genoma que pode provocar o silenciamento do gene. Isso pode ocorrer a um ou mais genes quando os genes ne- cessários para a produção do vetor AAV são fornecidos em vários plasmídeos que podem se integrar aleatoriamente em diferentes lócus dentro do genoma da célula hospedeira.
[013] Assim, a presente invenção fornece uma célula produtora de vetor AAV que é simples e otimizada para produção industrial em grande escala para aplicações terapêuticas e supera as desvantagens associadas às linhagens celulares existentes. Além disso, a invenção fornece métodos para a produção da referida célula produtora de vetor AAV e vetores de ácido nucleico para uso nesta invenção.
[014] Portanto, de acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecida uma célula produtora de vetor viral adenoassociado (AAV) compreendendo sequências de ácido nucleico que codificam: genes rep e cap de AAV, genes de vírus auxiliares e um genoma de DNA do vetor AAV; em que o gene rep de AAV compreende um íntron, dito ín- tron compreendendo uma sequência de terminação da transcrição com um primeiro sítio de recombinação localizado a montante e um segundo sítio de recombinação localizado a jusante da referida se- quência de terminação da transcrição; e em que ditas sequências de ácido nucleico são todas inte- gradas em um único lócus dentro do genoma da célula produtora do vetor AAV.
[015] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um vetor de ácido nucleico compreendendo uma origem de replicação de não mamífero e a capacidade de conter pelo menos 25 quilobases (kb) de DNA, especificado pelo fato de que dito vetor de ácido nucleico compreende sequências de ácido nucleico que codificam: genes rep e cap de AAV;
genes de vírus auxiliares; e um genoma de DNA de um vetor AAV; em que o gene rep compreende um íntron, dito íntron com- preendendo uma sequência de terminação da transcrição com um primeiro sítio de recombinação localizado a montante e um segundo sítio de recombinação localizado a jusante da sequência de termina- ção da transcrição; e em que as sequências de ácido nucleico que codificam os genes rep e cap de AAV, cada um dos genes do vírus auxiliar e o ge- noma de DNA do vetor AAV são dispostos como cassetes de expres- são individuais dentro do vetor de ácido nucleico.
[016] De acordo com ainda um outro aspecto da invenção, é for- necido um método de produção de uma linhagem celular produtora de vetor AAV estável, compreendendo: (a) a introdução do vetor de ácido nucleico conforme defini- do nesta invenção, em uma cultura de células hospedeiras de mamífe- ro; e (b) a seleção dentro da cultura de uma célula hospedeira de mamífero que possui as sequências de ácido nucleico codificadas no vetor integrado em um cromossomo endógeno da célula hospedeira de mamífero.
[017] Em um outro aspecto da invenção, é fornecida uma célula produtora de vetor AAV obtida pelo método no presente documento descrito.
[018] Em um outro aspecto da invenção, é fornecido um método para produzir um vetor AAV com defeito de replicação, compreenden- do: (a) a introdução do vetor de ácido nucleico conforme defini- do nesta invenção em uma cultura de células hospedeiras de mamífe- ro; e
(b) a seleção dentro da cultura de uma célula hospedeira de mamífero que possui as sequências de ácido nucleico codificadas no vetor integrado em um cromossomo endógeno da célula hospedeira de mamífero; e (c) o cultivo adicional da célula hospedeira de mamífero se- lecionada sob condições nas quais o vetor AAV defeituoso para repli- cação é produzido.
[019] Em mais um outro aspecto da invenção, é fornecido um ve- tor AAV de replicação defeituosa obtido pelo método no presente do- cumento descrito. DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS FIG. 1: Um western blot de Peggy Sue que mostra a ex- pressão de proteínas Rep para Rep2Cap2. FIG. 2: Um western blot de Peggy Sue que mostra a ex- pressão de proteínas Rep para Rep2Cap5. FIG. 3: Um gráfico de barras mostrando a % de células CHO positivas para GFP transduzidas por vetores AAV recombinantes produzidos utilizando métodos de transfecção transiente com genes de vírus auxiliares sob transcrição condicional. FIG. 4: Um gráfico de barras mostrando a % de células CHO positivas para GFP transduzidas por vetores AAV recombinantes produzidos utilizando métodos de transfecção transiente com plasmí- deo de expressão rep/cap dependente de Cre. FIG. 5: Um diagrama esquemático que mostra um vetor de ácido nucleico de acordo com uma modalidade da invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES
[020] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos no presente documento utilizados possuem o mes- mo significado que é comumente entendido por uma pessoa de habili-
dade na técnica à qual esta invenção pertence. Todas as patentes e publicações no presente documento referidas são incorporadas por referência na sua totalidade.
[021] O termo "compreendendo" abrange "incluindo" ou "consis- tindo", por exemplo, uma composição "compreendendo" X pode con- sistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.
[022] O termo "consistindo essencialmente em" limita o escopo do recurso aos materiais ou etapas especificados e aqueles que não afetam materialmente as características básicas do aspecto reivindi- cado.
[023] O termo “consistindo em” exclui a presença de qualquer componente adicional.
[024] O termo "cerca de" em relação a um valor numérico x mé- dia, por exemplo, x ± 10%, 5%, 2% ou 1%.
[025] Os termos "transfecção", "transformação" e "transdução", conforme utilizados nesta invenção, podem ser utilizados para descre- ver a inserção do vetor não mamífero ou viral em uma célula alvo. A inserção de um vetor é geralmente chamada de transformação para células bacterianas e transfecção para células eucarióticas, embora a inserção de um vetor viral também possa ser chamada de transdução. A pessoa versada estará ciente dos diferentes métodos de transfecção não viral comumente utilizados, que incluem, mas não são limitados a estes, o uso de métodos físicos (por exemplo, eletroporação, com- pressão de células, sonoporação, transfecção óptica, fusão de proto- plastos, impalefecção, magnetofecção, biobalística ou bombardeio de partículas), reagentes químicos (por exemplo, fosfato de cálcio, com- postos orgânicos altamente ramificados ou polímeros catiônicos) ou lipídios catiônicos (por exemplo, lipofecção). Muitos métodos de trans- fecção requerem o contato de soluções de DNA do vetor com as célu-
las, que são depois cultivadas e selecionadas para a expressão de um gene marcador.
[026] Os materiais genéticos inseridos existem nas células de forma estável ou transitória. Para a transfecção estável, o material ge- nético inserido é integrado no genoma da célula hospedeira e sustenta a expressão do transgene mesmo após as células hospedeiras terem se replicado. Portanto, o termo "estavelmente transfectado" ou "célula estável" refere-se às linhagens celulares que são capazes de passar material genético introduzido para sua progênie (isto é, células filhas), visto que o DNA transfectado foi incorporado nos cromossomos endó- genos ou por meio de herança estável de cromossomos exógenos.
[027] Em contraste com os genes transfectados de forma estável, os genes transfectados transitoriamente são expressos apenas por um período de tempo limitado e não são integrados no genoma da célula hospedeira. Materiais genéticos transfectados transitoriamente podem ser perdidos por fatores ambientais e divisão celular.
[028] O termo "célula produtora" refere-se a uma linhagem celular com genes de acondicionamento de AAV (genes rep e cap), os genes do vírus auxiliar conforme necessário e um genoma de DNA do vetor AAV recombinante (por exemplo, um transgene de interesse flanquea- do pelas duas repetições terminais invertidas (ITRs) do AAV), integra- dos de forma estável no genoma da célula hospedeira. Será compre- endido por uma pessoa versada na técnica que os vetores de ácido nucleico no presente documento descritos podem ser utilizados para gerar as linhagens celulares produtoras. Será ainda compreendido que as células produtoras no presente documento descritas não se referem às células nas quais o provírus AAV natural foi integrado.
[029] O termo "gene" é um termo bem conhecido na técnica. Conforme no presente documento utilizado, um gene inclui uma se- quência de ácido nucleico expressa que codifica uma proteína ou é transcrita em um produto de RNA funcional. Geralmente, um gene in- clui a sequência de ácido nucleico expressa, com sequências regula- doras ligadas de maneira operável incluindo, mas não limitado a pro- motores, intensificadores, operadores e terminadores. Duas sequên- cias estão "ligadas de maneira operável" se estiverem dispostas em cis para atuar de uma maneira esperada em conexão entre si. Os ter- mos "expresso", "expressão" significam o processo geral pelo qual a informação codificada em um ácido nucleico, tipicamente um gene, é convertida em ácido ribonucleico e/ou uma proteína ou uma versão modificada pós-translação do mesmo.
[030] Um "transgene", como no presente documento utilizado, é uma sequência de ácido nucleico que codifica um gene de interesse, tal como, sem limitação, um gene para permitir a seleção genética ou de fármacos (por exemplo, um gene que confere resistência a antibió- ticos ou um gene repórter). Alternativamente, o gene pode ser um ge- ne terapêutico que substitui ou aumenta a função de um gene defeitu- oso, utilizado para imunização contra agentes para provocar uma res- posta imunogênica.
[031] Alguns métodos de fabricação de vetor AAV recombinante conhecidos na técnica envolvem transfecção transitória de um vetor de transferência (vetor de ácido nucleico compreendendo um transgene de interesse flanqueado pelas duas ITRs de AAV) em uma linhagem celular que expressa de forma estável os genes de acondicionamento e, em alguns casos, adicionalmente os genes de vírus auxiliares. Este processo reduz as desvantagens de um processo de transfecção intei- ramente transitório, mas não as remove completamente. Assim, tal método híbrido de fabricação de vetor AAV recombinante sem dúvida possui a complexidade combinada de abordagens tanto estáveis quan- to transitórias.
[032] A fabricação de vetores AAV baseados em células produto-
ras requer uma fase de desenvolvimento de linhagem celular mais complexa do que um processo que utiliza transfecção transitória. No entanto, esse processo possui as vantagens de exigir menos materiais de partida e operações durante a fabricação, de modo que há menos elementos que podem dar errado. Além do mais, o processo de fabri- cação simplificado conforme divulgado nesta invenção é melhor com relação à facilitada de expansão para o sistema de produção industri- almente aplicável em grande escala e é mais capaz de atender à de- manda de grandes populações de pacientes.
[033] Os termos "vetor viral" ou um "vírion" no contexto de AAV, referem-se a uma partícula de AAV (isto é, vetor AAV, também referido em outro lugar no pedido de patente como "vetor AAV recombinante") adequada para transportar material genético a ser transferido em uma célula hospedeira. O vetor AAV pode ser referido como vazio ou cheio, quer dizer, não contém ou contém um genoma de DNA do vetor AAV, respectivamente. No caso de vetores AAV, o genoma de AAV foi modi- ficado para remover os genes rep e cap entre as duas sequências de ITR do AAV. O genoma de DNA do vetor AAV da invenção (isto é, ve- tor AAV) tipicamente compreende um transgene flanqueado pelas du- as ITRs de AAV. Ficará entendido que o termo "vetor de ácido nuclei- co" não se refere ou inclui "vetores virais" (por exemplo, vetor AAV en- capsidando um genoma de DNA para transferência em uma célula hospedeira). Em vez disso, o termo "vetor de ácido nucleico" se refere a uma construção genética.
[034] O termo "íntron" ou "sequência de íntron" refere-se a uma sequência não codificante dentro de um gene que é removido através da junção de RNA durante a modificação do RNA mensageiro precur- sor em RNA mensageiro maduro (mRNA). Assim, o termo refere-se tanto à sequência de DNA dentro de um gene quanto à sequência cor- respondente no transcrito de RNA mensageiro precursor não proces-
sado. Onde uma sequência de ácido nucleico que codifica um gene compreende ácidos nucleicos que, juntamente com uma sequência inserida, formam uma sequência doadora/aceitante de junção de con- senso, pode ser inserido um íntron nesta posição. As sequências inse- ridas são então unidas durante o processamento pós-transcricional. Os métodos para a inserção de sequências de ácido nucleico que co- dificam um íntron em uma sequência expressa são bem conhecidos na técnica e qualquer um desses métodos pode ser utilizado para fazê-lo.
[035] Alternativamente, o uso de um íntron a jusante da região intensificadora/promotora e a montante da inserção de cDNA mostrou aumentar o nível de expressão do gene. O aumento na expressão de- pende da inserção de cDNA particular.
[036] Consequentemente, o vetor de ácido nucleico da presente invenção pode incluir íntrons, tais como íntron de gonadotrofina coriô- nica humana, íntron de beta globina humana, íntron de beta globina de coelho II ou um íntron de beta globina-imunoglobulina humana quimé- rica. Em uma modalidade, o íntron é um íntron de beta globina huma- na e/ou um íntron de beta globina de coelho II.
[037] O termo "sequência de terminação da transcrição" "termi- nador da transcrição" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que atua como mediador da terminação da transcrição ao fornecer sinais no transcrito de RNA recentemente sintetizado que desencadeia pro- cessos que liberam o RNA transcrito do complexo transcricional (isto é, RNA polimerase). Na transcrição eucariótica, a sequência de termi- nação da transcrição é uma sequência de sinal de poliadenilação (po- liA), que permite que os fatores do hospedeiro adicionem uma cauda de poliadenosina (poliA) ao final do mRNA nascente durante a trans- crição. A cauda poliA é um trecho de até 300 ribonucleotídeos de ade- nosina que protege o mRNA da degradação enzimática e também au- xilia na translação. Consequentemente, os vetores de ácido nucleico da presente invenção podem incluir uma sequência de sinal poliA tal como os sinais precoces ou tardios de poliA de vírus símio 40 (SV40), os sinais poliA de beta globina humana ou beta globina de coelho, o sinal poliA de insulina humana ou o sinal poliA do hormônio de cresci- mento bovino. Em uma modalidade, a sequência de sinal poliA é o si- nal poliA do vírus símio 40 (SV40). Em outra modalidade, a sequência de sinal poliA é o sinal poliA da beta globina humana.
[038] Os termos "sítio de recombinação" e "recombinase" são bem conhecidos na técnica e são utilizados para se referir aos compo- nentes do processo de recombinação específica do sítio. Por exemplo, os membros das tirosina recombinases, a saber Cre e FLP, têm sido efetivamente usados na técnica como ferramentas moleculares para uso em eucariotas para mediar inserções de DNA específicas do sítio ou deleções de DNA direcionadas. A Cre recombinase recombina um par de sequências alvo curtas, ou sítios de recombinação, chamados de sequência LoxP. Da mesma forma, a FLP recombinase reconhece e direciona a sequência FRT. A título de exemplo adicional, a recom- binase inclui a transposase, que recombina um par de sequências alvo curtas, ou sítios de recombinação, conhecidos como repetição terminal invertida do transpóson (ITR do transpóson). Os transpósons de DNA, também conhecidos como elementos transponíveis de classe 2, são flanqueados em ambas as extremidades por repetições terminais in- vertidas. As repetições invertidas são complementos entre si (a repeti- ção em uma extremidade é uma imagem espelhada e composta de nucleotídeos complementares à repetição na extremidade oposta).
[039] O termo "lócus", conforme utilizado na técnica, refere-se a uma localização específica em um cromossomo, ou qualquer região do DNA genômico que é considerada uma unidade genética discreta para o propósito de análise de ligação formal ou estudos de genética mole- cular. Para os propósitos de integração de sequências de ácido nuclei-
co que codificam os genes essenciais para a produção de um vetor AAV recombinante no genoma de uma célula hospedeira como na presente invenção, a unidade genética discreta é dois pares de base de DNA no genoma da célula hospedeira endógena entre os quais as sequências são inseridas (por exemplo, sítio de inserção). Consequen- temente, o termo "lócus" como no presente documento utilizado, não se refere a uma grande região do DNA genômico, por exemplo, uma região de tamanho megabase contendo uma grande família de genes, mas uma localização específica no genoma.
[040] O termo "vetor de ácido nucleico" refere-se a um veículo que é capaz de transportar artificialmente material genético estranho (isto é, exógeno) para outra célula, onde pode ser replicado e/ou ex- presso. Exemplos de vetores incluem vetores de ácido nucleico de não mamíferos, tais como cromossomos artificiais bacterianos (BACs), cromossomos artificiais de levedura (YACs), cromossomos artificiais derivados de P1 (PACs), cosmídeos ou fosmídeos. O termo "DNA de vetor de ácido nucleico" refere-se ao DNA do vetor de ácido nucleico, compreendendo as sequências de ácido nucleico que codificam vários genes ou elementos nas mesmas.
[041] O termo "origem de replicação de não mamífero" refere-se a uma sequência de ácido nucleico onde a replicação é iniciada e que é derivada de uma fonte de não mamífero. Isso permite que os vetores de ácido nucleico no presente documento descritos se repliquem e se- greguem de forma estável ao lado de cromossomos endógenos em uma célula hospedeira adequada (por exemplo, uma célula microbia- na, tal como uma célula bacteriana ou de levedura) de modo que seja transmissível para a descendência da célula hospedeira, exceto quan- do a célula hospedeira for uma célula hospedeira de mamífero. Em células hospedeiras de mamíferos, os vetores de ácido nucleico com origens de replicação de não mamíferos irão se integrar nos cromos-
somos endógenos da célula hospedeira de mamífero ou serão perdi- dos na replicação da célula hospedeira de mamífero. Por exemplo, ve- tores de ácido nucleico com origens de replicação de não mamíferos, tais como cromossomos artificiais bacterianos (BAC), cromossomos artificiais derivados de P1 (PAC), cosmídeos ou fosmídeos, são capa- zes de se replicar e segregar de forma estável ao lado de cromosso- mos endógenos em células bacterianas (tais como E. coli). No entanto, se forem introduzidos em células hospedeiras de mamífero, o BAC, PAC, cosmídeo, fosmídeo ou plasmídeos irão se integrar ou serão perdidos na replicação da célula hospedeira de mamífero. Os cromos- somos artificiais de levedura (YAC) são capazes de se replicar e se- gregar de forma estável ao lado dos cromossomos endógenos em cé- lulas de levedura. No entanto, se forem introduzidos em células hos- pedeiras de mamíferos, o YAC se integrará ou será perdido na replica- ção das células hospedeiras de mamíferos. Portanto, neste contexto, os vetores de ácido nucleico no presente documento descritos atuam como reservatórios de DNA (isto é, para os genes essenciais para a produção do vetor AAV), que podem ser facilmente transferidos para células de mamíferos para gerar linhagens celulares produtoras está- veis para a produção do vetor AAV recombinante. Exemplos de ori- gens de replicação não mamíferas incluem origens bacterianas de re- plicação, tais como oriC, oriV ou oriS, ou origens de replicação de le- vedura, também conhecidas como Sequências de Replicação Autô- noma (elementos da ARS).
[042] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende uma origem de replicação de não mamífero e é capaz de conter pelo menos 25 quilobases (kb) de DNA. Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico possui a capacidade de reter pelo menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290,
300, 310, 320, 330, 340 ou 350 kb de DNA. Ficará entendido que as referências à "capacidade de retenção" possuem seu significado usual e implicam que o limite superior para o tamanho da inserção para o vetor de ácido nucleico não é menor do que o tamanho reivindicado (isto é, não menos do que 25 kb de DNA).
[043] O termo "cromossomos endógenos" ou "genoma endóge- no" refere-se ao DNA genômico encontrado na célula hospedeira an- tes da geração ou introdução de um vetor de ácido nucleico exógeno, tal como o vetor de ácido nucleico no presente documento descrito. De preferência, o vetor de ácido nucleico é um cromossomo bacteriano artificial.
[044] O termo "promotor" refere-se a uma sequência que conduz a expressão do gene. Para conduzir um alto nível de expressão, pode ser benéfico utilizar um promotor de alta eficiência. Exemplos de pro- motores adequados podem incluir um promotor, tal como o promotor precoce imediato do citomegalovírus humano (CMV), promotor do ví- rus formador de foco do baço (SFFV), promotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV) ou promotor do fator de alongamento humano 1-alfa (pEF). Em uma modalidade, o promotor é um promotor induzível (tam- bém referido em outro lugar no pedido como um promotor condicional) para levar em conta a regulação temporal da expressão de um gene ao qual está ligado. Os promotores induzíveis e os sistemas de ex- pressão induzíveis são bem conhecidos na técnica.
[045] O termo "marcador selecionável" refere-se a um gene que ajudará a selecionar células que expressam ativamente uma sequên- cia de ácido nucleico. Exemplos de marcadores de seleção adequados incluem enzimas que codificam resistência a um antibiótico (isto é, um gene de resistência a antibiótico), por exemplo, canamicina, neomici- na, puromicina, higromicina, blasticidina ou zeocina. Outro exemplo de marcadores de seleção adequados são proteínas fluorescentes, por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente vermelha (RFP) ou proteína fluorescente azul (BFP).
[046] "Amplificação do gene" refere-se a um processo pelo qual sequências de DNA específicas do genoma (isto é, genes) são des- proporcionalmente replicadas em relação às outras sequências no ge- noma, de modo que as sequências de DNA amplificadas se tornam presentes em um número de cópias maior do que estava inicialmente presente no genoma antes de tal replicação desproporcional. "Amplifi- cado" ou "amplificação" como no presente documento utilizado com referência a um gene ou sequência de ácido nucleico, refere-se a um gene ou sequência de ácido nucleico presente em duas ou mais có- pias em uma linhagem celular hospedeira em virtude da amplificação do gene.
[047] As referências a um "gene marcador de seleção amplificá- vel" como no presente documento utilizado, referem-se a um gene que permite a amplificação desse gene sob condições de crescimento apropriadas. O gene marcador de seleção amplificável é capaz de responder a um inibidor ou à falta de um metabólito essencial por am- plificação para aumentar o produto de expressão (isto é, a expressão da proteína codificada pelo gene marcador de seleção amplificável). Em uma modalidade, o gene marcador de seleção amplificável pode ser especificado como sendo capaz de complementar um hospedeiro auxotrófico.
[048] O termo "constructo de expressão" ou "cassete de expres- são" como no presente documento utilizado, refere-se a uma unidade de expressão funcional, capaz de conduzir a expressão de um ou mais polinucleotídeos incorporados, isto é, uma sequência de DNA conten- do um ou mais genes e sequências que controlam seus expressão. Cassetes de expressão geralmente incluem o polinucleotídeo e os componentes necessários para a transcrição e translação do polinu-
cleotídeo. Por exemplo, o cassete pode incluir uma sequência de ácido nucleico (isto é, DNA recombinante), incluindo um promotor, um sinal de iniciação da translação, um terminador da transcrição (por exemplo, uma sequência de sinal poliA) e/ou uma sequência de peptídeo de au- toclivagem (por exemplo, sequência P2A). Em uma modalidade, o cassete de expressão individual compreende um promotor e/ou um terminador de transcrição. Em uma modalidade, o cassete de expres- são individual compreende dois genes separados por um IRES que são ambos transcritos a partir de um único promotor. Para evitar dúvi- das, os genes rep e cap, que produzem vários transcritos de 3 promo- tores diferentes que são então unidos em 7 proteínas diferentes, for- mam um único elemento genético contíguo e não podem ser separa- dos um do outro devido à natureza compacta do genoma de AAV. Como tal, a pessoa versada na técnica entenderá que os genes rep e cap estão incluídos em um único cassete de expressão. Portanto, os cassetes de expressão podem compreender mais do que um promo- tor.
[049] Em uma modalidade, todos os cassetes de expressão no vetor de ácido nucleico são dispostos de modo que sejam transcritos na mesma direção. Isto foi precedentemente mostrado de melhorar a expressão geral dos cassetes de expressão em um constructo (Throm et al., (2009) Blood 113: 5104-5110).
CÉLULA PRODUTORA DE VETOR VIRAL ADENOASSOCIADO (AAV)
[050] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecida uma célula produtora de vetor viral adenoassociado (AAV) compreendendo sequências de ácido nucleico que codificam: genes rep e cap de AAV, genes de vírus auxiliares, e um genoma de DNA do vetor AAV;
em que o gene rep de AAV compreende um íntron, dito ín- tron compreendendo uma sequência de terminação da transcrição com um primeiro sítio de recombinação localizado a montante e um segundo sítio de recombinação localizado a jusante da referida se- quência de terminação da transcrição; e em que as referidas sequências de ácido nucleico são to- das integradas entre si em um único lócus dentro do genoma da célula produtora do vetor AAV.
[051] Ficará entendido que estas sequências de ácido nucleico que codificam os vários genes estão presentes como cassetes de ex- pressão individuais, o que evita qualquer risco de recombinação para formar vírus competentes para a replicação. Para evitar dúvidas, as sequências de ácido nucleico que codificam os genes rep e cap estão presentes no mesmo (isto é, um) cassete de expressão.
[052] Em uma modalidade, a célula produtora do vetor AAV é uma célula de mamífero. Em uma outra modalidade, a célula de mamí- fero é selecionada de uma célula HEK293, célula CHO, célula Jurkat, célula K562, célula PerC6, célula HeLa ou um derivado ou equivalente funcional das mesmas. Em mais uma outra modalidade, a célula hos- pedeira de mamífero é uma célula HEK293 ou derivada de uma célula HEK293. Essas células podem ser linhagens celulares aderentes (isto é, elas crescem em uma única camada ligada a uma superfície) ou linhagens celulares adaptadas a suspensão/não aderentes (isto é, elas crescem em suspensão em um meio de cultura). Em outra modalida- de, a célula HEK293 é uma célula HEK293T.
[053] O termo "célula HEK293" refere-se às células de rim embri- onário humano que foram transfectadas com fragmentos de DNA de adenovírus 5 (Ad5) mecanicamente cortados (Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36:59). A região inicial 1 (E1) do genoma do adenovírus 5, que consiste nas unidades de transcrição E1A e E1B, está estavel-
mente integrada no genoma da célula HEK293. Uma vez que as célu- las HEK293 expressam de forma estável Ad5 E1A e E1B, a produção de AAV recombinante em células produtoras de HEK293 requer ape- nas a transfecção com os genes auxiliares de adenovírus essenciais remanescentes (E2A, E4 e VA) e o genoma de AAV. Como tal, HEK293 é comumente utilizada na produção de AAV. Outros exem- plos de linhagens celulares adequadas disponíveis comercialmente incluem linhagens celulares T REX™ (Life Technologies). Consequen- temente, em uma modalidade, os genes do vírus auxiliar compreen- dem todos ou parte dos genes do vírus auxiliar E2A, E4 e VA.
VÍRUS ADENOASSOCIADO
[054] Os vírus adenoassociados (AAV) fazem parte do gênero Dependoparvovirus, que pertence à família Parvoviridae. O AAV é um pequeno vírus icosaédrico sem envoltório com genoma de DNA de fita simples (ssDNA) de aproximadamente 4,7 quilobases (kb) a 6 kb de comprimento. Vários sorotipos foram descobertos, com o AAV sorotipo 2 (AAV2) como o sorotipo mais extensivamente examinado até agora.
[055] O genoma de AAV consiste em dois quadros de leitura abertos, genes rep e cap (também referidos em outro lugar no pedido como gene rep/cap), flanqueados por duas repetições terminais inver- tidas de 145 bases (ITRs). Estes pares de bases de ITRs levam em conta a síntese da fita de DNA complementar. Os genes rep e cap são trasladados para produzir várias proteínas distintas: o gene rep codifi- ca as proteínas Rep78, Rep68, Rep52, Rep40, que são necessárias para o ciclo de vida do AAV; o gene cap codifica VP1, VP2, VP3, que são as proteínas da cápside. Ao construir um plasmídeo de transfe- rência de AAV, o transgene é colocado entre as duas ITRs e os genes rep e cap são fornecidos em trans. Isto é para garantir que o vetor AAV recombinante produzido pela célula hospedeira seja deficiente para replicação.
[056] As sequências de codificação rep de AAV codificam pelo menos aquelas proteínas de replicação que são necessárias para a replicação do genoma viral e acondicionamento em novos vírions. O gene rep geralmente codificará pelo menos uma proteína Rep grande (isto é, Rep78/68) e uma proteína Rep pequena (isto é, Rep52/40), no entanto, nas modalidades no presente documento descritas, o gene rep não precisa codificar todas as proteínas Rep do AAV. Portanto, em uma modalidade, as proteínas Rep compreendem a proteína Rep78 e as proteínas Rep52 e/ou Rep40. Em uma modalidade alternativa, as proteínas Rep compreendem as proteínas Rep68 e Rep52 e/ou Rep40. Em uma outra modalidade, as proteínas Rep compreendem as proteínas Rep68 e Rep52, proteínas Rep68 e Rep40, proteínas Rep78 e Rep52 ou proteínas Rep78 e Rep40. Em ainda outra modalidade, as proteínas Rep compreendem as proteínas Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40.
[057] O gene cap de AAV codifica as proteínas estruturais que formam uma cápside de AAV funcional (isto é, pode acondicionar o DNA e infectar células alvo). Tipicamente, o gene cap codificará todas as subunidades da cápside do AAV, mas menos do que todas as su- bunidades da cápside podem ser codificadas, contanto que uma cápside funcional seja produzida. Em uma modalidade, as proteínas Cap compreendem VP1, VP2 e/ou VP3.
[058] As sequências de ITR do AAV compreendem 145 bases cada e são os únicos elementos de ação cis necessários para a repli- cação do genoma de AAV e acondicionamento na cápside. Normal- mente, as ITRs estarão nas extremidades 5' e 3' do genoma do vetor e flanqueiam o ácido nucleico heterólogo (transgene), mas não precisam ser contíguos a ele. As ITRs podem ser iguais ou diferentes entre si.
[059] Uma ITR de AAV pode ser de qualquer AAV, incluindo, mas não limitado a sorotipos 1, 2, 3a, 3b, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 13, AAV de cobra, AAV de aves, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV bovino, AAV de cabra, AAV de camarão ou qualquer outro AAV agora conhecido ou descoberto posteriormente. Uma ITR de AAV não preci- sa ter a sequência de repetição terminal nativa (por exemplo, uma se- quência de ITR do AAV nativa pode ser alterada por inserção, exclu- são, truncamento e/ou mutações de sentido trocado), contanto que a repetição terminal atue como mediador das funções desejadas, por exemplo, replicação, acondicionamento de vírus e/ou integração, e semelhantes.
[060] As referências para o AAV como no presente documento utilizadas, incluem, mas não são limitadas a estas, AAV sorotipo 1 (AAV1), AAV sorotipo 2 (AAV2), AAV sorotipo 3 (incluindo sorotipos 3A e 3B) (AAV3), AAV sorotipo 4 (AAV4), AAV sorotipo 5 (AAV5), AAV sorotipo 6 (AAV6), AAV sorotipo 7 (AAV7), AAV sorotipo 8 (AAV8), AAV sorotipo 9 (AAV9), AAV sorotipo 10 (AAV10), AAV sorotipo 11 (AAV11), AAV sorotipo 12 (AAV12), AAV sorotipo 13 (AAV13), AAV de cobra, AAV de aves, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV ovi- no, AAV de cabra, AAV de camarão, e qualquer outro AAV agora co- nhecido ou descoberto posteriormente. Veja, por exemplo, Fields et al. Virology, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers).
[061] As referências ao AAV podem incluir sorotipos de AAV arti- ficiais que incluem, sem limitação, AAV com uma proteína da cápside de ocorrência não natural. Uma tal cápside artificial pode ser gerada por qualquer técnica adequada, utilizando uma sequência de sorotipo de AAV (por exemplo, um fragmento de uma proteína da cápside VP1) em combinação com sequências heterólogas que podem ser obtidas a partir de outro sorotipo de AAV (conhecido ou novo), porções não con- tíguas do mesmo sorotipo de AAV, de uma fonte viral não AAV ou de uma fonte não viral. Um sorotipo de AAV artificial pode ser, sem limita- ção, uma cápside de AAV quimérico, uma cápside de AAV recombi-
nante ou uma cápside de AAV "humanizado".
[062] Em uma modalidade, as sequências de ácido nucleico que codificam os genes rep e cap e/ou o genoma de DNA do vetor AAV (isto é, as sequências de ácido nucleico do AAV) são derivadas de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 ou combinações dos mesmos. Em uma outra modalidade, as sequências de ácido nucleico que codificam os genes rep e cap e/ou o genoma de DNA do vetor AAV são derivadas de AAV2, AAV5, AAV8 e/ou AAV9.
[063] Alternativamente, em uma modalidade, as sequências do gene rep são de um sorotipo de AAV que difere daquele que fornece as sequências cap. Portanto, em uma modalidade, as sequências rep são fundidas na estrutura para sequências cap de um sorotipo de AAV diferente para formar um vetor AAV quimérico. Por exemplo, em uma modalidade, o gene rep é derivado de AAV2 e o gene cap é derivado de AAV2 ou AAV5 para produzir partículas semelhantes a AAV2 e se- melhantes a AAV5, respectivamente. Eles podem ser chamados de rep2cap2 e rep2cap5.
[064] As sequências genômicas de vários sorotipos de AAV, as- sim como as sequências das ITRs nativas, proteínas Rep e subunida- des da cápside são conhecidas na técnica. Essas sequências podem ser encontradas na literatura ou em bancos de dados públicos, tais como o GenBank. Ver, por exemplo, GenBank Accession Nos. NC_002077, NC_001401, NC_001729, NC_001863, NC_001829, NC_001862, NC_000883, NC_001701, NC_001510, NC_006152, NC_006261, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, AY631966, AX753250, EU285562, NC_001358, NC_001540, AF513851, AF513852 e AY530579; cujas divulgações são no presente documento incorporadas por referência para o ensino de sequências de ácido nucleico e aminoácido de AAV.
[065] Acredita-se que a especificidade do tecido seja determina- da pelo sorotipo da cápside e, portanto, a pseudotipagem de vetores AAV pode ser utilizada para alterar sua faixa de tropismo. Isso torna o AAV um sistema útil para de preferência transduzir os tipos de células específicos. Sem ser limitado pela teoria, a Tabela 1 resume os soroti- pos ideais para transdução de tecidos específicos: TABELA 1: Sorotipos de AAV ideais para transdução de um determi- nado órgão Tecido Sorotipo Ideal CNS AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9 Coração AAV1, AAV8, AAV9 Rim AAV2 Fígado AAV2, AAV3, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 Pulmão AAV4, AAV5, AAV6, AAV9 Pâncreas AAV8 Células Fotorreceptoras AAV2, AAV5, AAV8 RPE (Epitélio Pigmentar da AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8 Retina) Músculo Estriado AAV1, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 Cérebro AAV4, AAV9, AAV10
[066] Referências à "pseudotipagem" referem-se à mistura de uma cápside e genoma de diferentes sorotipos virais. Esses sorotipos são indicados por uma barra, por exemplo, AAV2/5 indica um vírus contendo o genoma do AAV sorotipo 2 acondicionado na cápside do AAV sorotipo 5. O uso desses vírus pseudotipados pode melhorar a eficiência de transdução, assim como alterar o tropismo. Por exemplo, AAV2/5 tem como alvo neurônios que não são transduzidos de forma eficiente por AAV2/2 e é distribuído mais amplamente no cérebro, indi- cando eficiência de transdução melhorada. Muitos desses vírus híbri-
dos foram bem especificados na técnica.
GENES DE VÍRUS AUXILIAR
[067] Além dos genes rep e cap, o AAV requer um vírus auxiliar ou plasmídeo contendo os genes necessários para a replicação do AAV, visto que o AAV não possui a capacidade de se replicar por con- ta própria. Na ausência de vírus auxiliares, os AAVs podem ser incor- porados ao genoma da célula hospedeira, em um sítio específico do cromossomo 19. As sequências de vírus auxiliares necessárias para a replicação de AAV são conhecidas na técnica, por exemplo, ver Cell & Gene Therapy Insights, “Gene Therapy and Viral Vectors: Advances and Challenges” (Cell Gene Therapy Insights 2016;2(5),553-575). Tipi- camente, essas sequências serão fornecidas por um adenovírus auxi- liar ou vetor de vírus do herpes. Os genes do vírus auxiliar codificam proteínas e RNA não codificante.
[068] Em uma modalidade, os genes do vírus auxiliar são deriva- dos de adenovírus. Em uma outra modalidade, o adenovírus é seleci- onado do adenovírus 2 e adenovírus 5. Em uma modalidade, os genes do vírus auxiliar compreendem os genes E1A, E1B, E2A, E4 e VA.
[069] Alguns dos genes auxiliares podem ser expressos pela li- nhagem celular hospedeira de mamífero, enquanto outros genes auxi- liares são introduzidos por um vetor. Por exemplo, as células HEK 293 (ATCC CRL-1573) produzem constitutivamente as proteínas adenovi- rais E1A e E1B. Assim, para a produção de AAV recombinante, ape- nas os genes auxiliares necessários para a produção de um vetor AAV recombinante, tal como E2A, E4 e VA, são introduzidos na célula hos- pedeira HEK293.
[070] Em uma modalidade, os genes do vírus auxiliar compreen- dem todos ou parte de cada um dos genes E4, E2A e VA derivados de adenovírus, em particular adenovírus 2. Foi observado que nem todos os genes de adenovírus nativos são necessários para a replicação de
AAV, por exemplo, apenas a proteína E4 de 34 kD codificada pelo quadro de leitura aberto 6 (ORF 6) do gene E4 é necessária para a replicação do AAV. Portanto, em uma outra modalidade, os genes do vírus auxiliar compreendem uma região de codificação E4 de ORF6, uma região de codificação de adenovírus E2A de 72 kD (que codifica para a proteína de ligação ao DNA de E2A de 72 kD) e um gene VA. Em mais uma outra modalidade, os genes do vírus auxiliar compreen- dem adicionalmente os genes E1A e E1B do adenovírus.
[071] Em uma modalidade alternativa, os genes do vírus auxiliar são derivados do vírus do herpes. Em uma outra modalidade, o vírus do herpes é selecionado a partir de: vírus do herpes simples (HSV), vírus Epstein-Barr (EBV), citomegalovírus (CMV) e vírus da pseudor- raiva (PRV).
[072] Cada um dos genes do vírus auxiliar pode ser controlado pelo respectivo promotor original ou por promotores heterólogos.
[073] Foi relatado que os genes auxiliares de adenovírus que são necessários para a produção de AAV em células HEK 293 (E2A, E4 e VA) são potencialmente tóxicos para as células hospedeiras (Ferrari et al., 1996, Journal of Virology 70: 3227-3234). Quando transfectados em células de mamífero, os promotores nativos destes genes auxilia- res são constitutivamente ativos. Conforme for, em uma modalidade, um ou mais dos genes do vírus auxiliar estão sob controle da transcri- ção. Em uma modalidade, todos os genes do vírus auxiliar estão sob controle da transcrição. Em ainda outra modalidade, os genes do vírus auxiliar E4, E2A e VA estão sob controle da transcrição. Em uma outra modalidade, um promotor CMV-TO2 está ligado de maneira operável ao gene E2A e/ou ao gene E4. Em mais uma outra modalidade, a se- quência do operador TetO está ligada de maneira operável a um pro- motor nativo de VA.
[074] Ao integrar os genes do vírus auxiliar necessários para a produção do vetor AAV no genoma da célula hospedeira, ficará enten- dido que este método pode ser considerado um método livre de vírus auxiliar porque não requer coinfecção com um vírus auxiliar do tipo selvagem. Isto, portanto, evita a contaminação do vírus auxiliar do tipo selvagem (por exemplo, adenovírus) que é altamente indesejável em vista da segurança e especificidade do vetor.
REPRESSÃO DO REP
[075] Uma grande dificuldade em gerar uma linhagem celular produtora na qual todos os elementos genéticos necessários para um vetor AAV recombinante são integrados de forma estável no genoma da célula hospedeira é a expressão constitutiva de proteínas Rep, que são bem conhecidas por serem citotóxicas (Yang et al., 1994, J. Virol. 68:4847-4856) e citostáticas (Schmidt et al., 2000, J. Virol. 74:9441- 9450). Isso significa que as células que expressam de forma estável a proteína Rep não sobreviverão para atingir a densidade necessária para produzir vetores AAV recombinantes em um biorreator em grande escala. Esta dificuldade é agravada ao gerar uma linhagem celular produtora baseada em HEK293, devido à ativação mediada por E1A dos promotores do gene rep, p5 e p19. Um outro nível de complexida- de na regulação da expressão de Rep é a localização do promotor p19, que está situado na região de codificação das proteínas Rep ex- pressas pelo promotor p5 (Rep78 e Rep68). Como um resultado, a manipulação do promotor p19 irá inevitavelmente provocar mutações nas sequências de codificação de Rep78 e Rep68, o que provavel- mente resultará na interrupção da estrutura e funções dessas proteí- nas Rep essenciais. Além disso, a interrupção dos promotores rep na- tivos afetará a estequiometria correta das várias proteínas Rep e Cap necessária para a produção eficiente do vetor AAV.
[076] Portanto, a expressão de Rep precisa ser rigidamente regu- lada durante o crescimento da célula produtora e altamente induzida durante a produção do vetor AAV.
[077] A célula produtora de vetor AAV da presente invenção compreende uma reação de troca de junção dupla dentro do gene rep para controlar a expressão de proteínas Rep. A reação de troca de junção dupla é um íntron que compreende uma sequência de termina- ção da transcrição removível ("íntron de terminação"). A sequência de terminação removível é uma sequência de terminação flanqueada por um par de sítios de recombinação. Pode haver sequências de ácido nucleico adicionais dentro dos sítios de recombinação de flanquea- mento além da sequência de terminação da transcrição. Os íntrons e exemplos de sequências de íntrons são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, o íntron é um íntron do gene da gonadotrofina coriônica humana.
[078] O íntron de terminação está posicionado dentro da região de codificação de Rep. A região de codificação de Rep é modificada de modo que, quando inserida, as extremidades 5' e 3' do íntron e a sequência de ácido nucleico da região de codificação de Rep com a qual são contíguas, respectivamente, formam uma sequência doado- ra/aceitante de união, para permitir a junção fora do íntron de termina- ção durante o processamento do RNA. Por exemplo, no lado do éxon imediatamente 5' do íntron, pode haver uma sequência A/C A G e imediatamente 3' do íntron é um nucleotídeo G. Assim, o íntron pode ser inserido em uma sequência AAG^G (onde ^ significa um sítio de inserção) no gene rep para fornecer a sequência final AAG/GTPuAGU- mediano do íntron-CAG / G (Pu significando uma purina). Portanto, o íntron de terminação pode ser inserido em qualquer lugar no gene rep onde haja uma sequência AAGG ou CAGG.
[079] Em uma modalidade, o íntron de terminação está posicio- nado dentro da região de codificação de Rep a jusante do promotor p19. Desta forma, o íntron de terminação é posicionado dentro de um quadro de leitura compartilhado por todas as quatro proteínas Rep, de modo que a expressão de todos os quatro produtos do gene rep possa ser controlada simultaneamente.
[080] Quando o íntron de terminação está ativo, a transcrição do gene rep é encerrada prematuramente na sequência de terminação da transcrição, de modo que a produção de transcritos rep de comprimen- to total seja evitada e a expressão de Rep seja inibida. Desta forma, os níveis de produção de Rep são suficientemente baixos ou completa- mente ausentes para aliviar a toxicidade para as células e permitir a propagação das células portadoras do gene rep inativado durante o crescimento celular.
[081] A sequência de terminação da transcrição pode ser qual- quer sequência que seja capaz de término da transcrição. Em uma modalidade, a sequência de terminação da transcrição é a sequência de sinal de poliadenilação (poliA). Em outra modalidade, o íntron de terminação compreende uma ou mais sequências de sinal poliA em tandem, como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais sequências de sinal po- liA em tandem. Em uma modalidade preferida, o íntron de terminação compreende 3 sequências de sinal poliA em tandem.
[082] Foi demonstrado por Qiao et al (2002 J. Virol.76:13015- 13027) que uma combinação de um gene e uma ou mais sequências de sinal poliA possuem um efeito sinérgico na terminação da transcri- ção. Portanto, em uma modalidade, a sequência de terminação da transcrição pode ser um gene. Em uma outra modalidade, a sequência de terminação da transcrição é uma combinação de uma sequência de sinal poliA e um gene. Em mais uma outra modalidade, a sequência de terminação é duas ou mais sequências de sinal poliA em tandem, co- mo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais, seguido por um gene. Em uma moda- lidade, a sequência de terminação é três sequências de sinal poliA em tandem seguidas por um gene. Por conveniência de estabelecer uma linhagem celular com o gene rep sob controle da reação de troca de junção dupla, em uma modalidade, o gene da sequência de termina- ção de transcrição é um marcador selecionável, tal como, sem limita- ção, genes de resistência à higromicina, puromicina ou blasticidina S.
[083] O gene rep é ativado na presença de uma enzima recombi- nase (recombinase) à medida que o íntron de terminação é removido do gene rep. A recombinase separa o íntron por meio de eventos de recombinação, ou inverte, a região entre os dois sítios de recombina- ção contendo a sequência de terminação. A inversão da sequência de terminação também tem o efeito de interromper a inibição da transcri- ção. Desta forma, a expressão de todo o comprimento do gene rep é restaurada. O restante do íntron é removido com precisão do mRNA precursor de comprimento total por meio da junção de RNA, restau- rando a sequência de codificação do gene rep para produzir as quatro proteínas Rep. Este controle da expressão de Rep é referido como uma "reação de troca de junção dupla" porque dois eventos de junção ocorrem (junção de DNA e RNA) antes que a sequência transcrita seja capaz de ser trasladada nas proteínas Rep.
[084] O íntron remanescente no gene rep após a remoção da se- quência de terminação de transcrição pode ser longo o suficiente em tamanho para atuar como uma vedação para mitigar a formação de AAV competente para replicação no caso em que o gene rep/cap se insere entre as ITRs do vetor de transferência. Por exemplo, em uma modalidade exemplar, o íntron remanescente aumenta o tamanho do gene rep/cap em 404 bp, o que é suficiente para torná-lo muito grande para o limite de acondicionamento da cápside de AAV.
[085] As recombinases de DNA específicas do sítio são ampla- mente utilizadas em organismos multicelulares para manipular a estru- tura dos genomas e, por sua vez, controlar a expressão gênica. Estas enzimas, derivadas de bactérias e fungos, catalisam as reações de recombinação direcionalmente sensíveis entre as sequências de sítio alvo curto (isto é, sítio de recombinação) que são específicas para ca- da recombinase. Muitos tipos de sistemas de recombinação de sítio específico são conhecidos na técnica, e qualquer sistema de recombi- nação adequado pode ser utilizado na presente invenção. Por exem- plo, em uma modalidade, os sítios de recombinação são selecionados ou derivados do sistema int/att do fago lambda, o sistema Cre/lox do bacteriófago P1, o sistema FLP/FRT de levedura, o sistema de recom- binase Gin/gix de fago Mu, o sistema Cin recombinase, o sistema Pin recombinase de E. coli e o sistema R/RS do plasmídeo pSR1, ou qualquer combinação dos mesmos. As recombinases mais amplamen- te utilizadas são Cre e FLP, que reconhecem os sítios de recombina- ção LoxP e FRT, respectivamente. Em uma modalidade, a recombi- nase é uma recombinase Cre ou uma recombinase FLP. Em uma mo- dalidade, a recombinase Cre é uma recombinase Cre otimizada com códon. Em uma modalidade, o sítio de recombinação é um sítio LoxP. Em uma modalidade, o sítio de recombinação é um sítio FRT.
[086] Os sistemas transpóson/transposase são bem conhecidos na técnica (Pray, L. (2008) Transposons: The jumping genes. Nature Education 1(1):204). Em uma modalidade, os sítios de recombinação e a recombinase é um sistema transpóson/transposase. Os transpósons do tipo 1 permanecem no lugar e se replicam para inserção em outros locais, em vez do mecanismo de "cortar e colar" desejado dos trans- pósons do tipo 2, em que segmentos de DNA se movem de um lugar para outro. Portanto, em uma modalidade, o transpóson é um trans- póson do tipo 2. Em uma modalidade, o transpóson não é um trans- póson do tipo 1. Em uma modalidade, os sítios de recombinação é uma repetição terminal invertida do transpóson (ITR do transpóson). Em uma modalidade, a recombinase é uma transposase. Em uma mo- dalidade, a ITR do transpóson e a transposase são eucarióticas. Na modalidade, o sítio de recombinação e a recombinase são um sistema de transpóson/transposase eucariótico. Em uma modalidade, a ITR de transpóson e a transposase são da mesma espécie. As ITRs de trans- póson adequadas incluem, mas não são limitadas a estas, Sleeping Beauty, transpóson tipo Tc1 de Rana pipiens, transpóson piggyBac de Trcihoplusia ni (T. ni), transpóson tipo hAT Tol2 de Oryzias latipes e transpósons de Macdunnoghia crassisigna (M. crassisigna), Bactroce- ra minuta, Eumeta japonica ou Helicoverpa armigera. Em uma modali- dade, a ITR do transpóson e a transposase são de M. crassisigna.
[087] Foi relatado que é possível, por meio da mutação de 3 ami- noácidos (R372A, K375A, D450N) na transposase da mariposa do re- polho (Trichoplusia ni) utilizada no sistema piggyBac para criar uma excisão + integração - fenótipo (Li et al., 2013 “PiggyBac transposase tools for genome engineering” PNAS 110: E2279-E2287, the mutated trans). Desta forma, a expressão da transposase através da adição de DOX às células estavelmente transfectadas com um tal constructo re- sultaria em uma remoção irreversível dos terminadores da transcrição a jusante dos promotores rep, resultando em maior expressão de Rep.
[088] A transposase de Macdunnoughia crassisigna é 98,82% idêntica àquela de Trichoplusia ni. Yusa et al. (Yusa K et al “A hyperac- tive piggyBac transposase for mammalian applications, 2011, PNAS 108: 1531-1536) encontraram 7 substituições de aminoácido (I30V, S103P, G165S, M282V, S509G, N538K, N571S) na transposase de Trichoplusia ni em um fonótipo hiperativo. Estas substituições foram aplicadas à sequência de aminoácido da transposase de M. crassisig- na. Adicionalmente, 3 substituições de aminoácidos encontradas por Li et al. (2013, PNAS 110: E2279-E2287) para resultar em uma excisão + integração - fonótipo na transposase de Trichoplusia ni (R372A, K375A, D450N) também foram aplicadas à sequência de transposase de M. crassisigna.
[089] A sequência de aminoácido da transposase de M. crassi- signa modificada (SEQ ID NO: 1). Em uma modalidade, a sequência de aminoácido que codifica a transposase compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a sequência de aminoácido que codifica a transposase de Trichoplusia ni compreende as mutações R372A, K375A e D450N. Em uma modalidade, a trans- posase compreende as mutações R372A, K375A e D450N. Em uma modalidade, a sequência de aminoácido que codifica a transposase de M. crassisigna compreende as mutações I30V, S103P, G165S, M282V, S509G, N538K, N571S. Em uma modalidade, a transposase compreende as mutações I30V, S103P, G165S, M282V, S509G, N538K, N571S. Em uma modalidade, a sequência de aminoácido que codifica a transposase de M. crassisigna compreende as mutações I30V, S103P, G165S, M282V, S509G, N538K, N571S, R372A, K375A e D450N. Em uma modalidade, a transposase compreende as muta- ções I30V, S103P, G165S, M282V, S509G, N538K, N571S, R372A, K375A e D450N.
[090] Vários métodos podem ser utilizados para introduzir a re- combinase dentro da célula produtora que expressa de forma estável o gene rep compreendendo o íntron de terminação. A recombinase pode ser fornecida à célula produtora do vetor AAV na forma de proteína ou como uma sequência de ácido nucleico que codifica um gene de re- combinase. Quaisquer métodos para introduzir uma proteína estranha ou sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de interesse em uma célula são bem conhecidos na técnica, podem ser utilizados para introduzir a recombinase na célula produtora do vetor AAV. Em um método, as enzimas recombinase podem ser fornecidas no meio para transporte através da membrana celular, por exemplo, através da lipofecção. Em outro método, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma recombinase pode ser transferida para a célula produto-
ra. Qualquer método de transferência de gene bem conhecido na téc- nica pode ser aplicável. Consequentemente, em uma modalidade, a célula produtora do vetor AAV compreende ainda ácido nucleico que codifica um gene de recombinase. No entanto, a adição de uma etapa de transferência de gene na produção de vetor AAV em grande escala para uso terapêutico pode ser indesejável, do ponto de vista de segu- rança (transferência de gene mediada por vírus) ou aspecto de custo (transferência de genes não mediada por vírus).
[091] Portanto, uma etapa separada de transferência do gene da recombinase pode ser evitada pela produção de uma célula produtora de vetor AAV por transfecção estável do gene da recombinase no ge- noma da célula produtora. Em uma modalidade, o genoma da célula produtora do vetor AAV compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um gene da recombinase. Em uma outra modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica o gene da recombinase é integrada juntamente com as sequências de ácido nucleico que codifi- cam os genes rep e cap do AAV, os genes do vírus auxiliar e o geno- ma de DNA do vetor AAV em um único lócus dentro do genoma celular produtor do vetor AAV.
[092] Quando uma célula produtora de vetor AAV possui um ge- ne da recombinase integrado de forma estável em seu genoma, a ex- pressão do gene da recombinase precisará ser reprimida até um mo- mento em que a indução do gene rep seja desejada. Portanto, um sis- tema de controle de recombinase é necessário. Na ausência de um sistema de controle de recombinase, o gene da recombinase será ex- presso constitutivamente para produzir enzimas recombinase, que por sua vez reconhecerão os sítios de recombinação e dividirão a região entre eles contendo a sequência de terminação resultante da produção das proteínas Rep. Portanto, em uma modalidade, a célula produtora de vetor AAV compreende ainda um sistema de controle de recombi-
nase.
[093] O sistema de controle da recombinase é qualquer sistema capaz de sequestrar a enzima recombinase. O sistema de controle da recombinase pode atuar para controlar a expressão do gene da re- combinase, para controlar a translação do transcrito do gene da re- combinase ou controlar a atividade da enzima recombinase.
[094] Em uma modalidade, o sistema de controle de recombinase compreende um gene da recombinase sob o controle de um promotor induzível (isto é, promotor condicional), explicado mais abaixo.
[095] Em uma outra modalidade, o sistema de controle da re- combinase compreende um domínio de ligação ao ligante do receptor do hormônio esteróide mutado (LBD) ligado de maneira operável ao gene da recombinase. Certas recombinases possuem uma propensão para translocar para o núcleo da célula de mamífero. Por exemplo, foi demonstrado que a proteína Cre contém certas sequências determi- nantes que levam em conta o transporte ativo para o núcleo (Andreas et al., 2002, Nucleic Acids Res 27:4703-4709). A fim de obter o contro- le da atividade de recombinase no nível da proteína, foram criadas re- combinases quiméricas fundidas aos domínios de ligação ao ligante do receptor de hormônio esteróide (LBD). O LBD de tais recombinases quiméricas é capaz de interagir com agonistas sintéticos, mas incapa- zes de se ligar a esteróides fisiológicos. Na ausência de um agonista sintético, o domínio de ligação interage com o complexo de proteína de choque térmico presente no citoplasma, resultando em transloca- ção de recombinase prejudicada para dentro do núcleo e diminuição da atividade devido ao impedimento estérico. Por outro lado, na pre- sença de um agonista sintético, o domínio não ligado ao ligante não interage com as proteínas citoplásmicas e a recombinação é livre para ocorrer.
[096] Em uma modalidade, o LBD é um domínio de ligação ao ligante do receptor de estrogênio. Nesse caso, o agonista sintético é o tamoxifeno. Em uma outra modalidade, o domínio de ligação ao ligante do receptor de estrogênio é ERT2. ERT2 é um domínio de ligação ao ligante do receptor de estrogênio com maior afinidade com relação ao tamoxifeno. Em uma modalidade, a recombinase, opcionalmente uma recombinase otimizada por códons, é flanqueada por ERT2. Casanova et al. (2002, Genesis 34:208-214) geraram uma proteína de fusão in- duzível por tamoxifeno gerada pela fusão de dois domínios ERT2 em ambas as extremidades de um códon melhorado Cre recombinase pa- ra estudos de recombinação no cérebro. A proteína de fusão foi rela- tada como sendo citoplasmática na ausência de tamoxifeno e translo- cada para dentro do núcleo após a administração de tamoxifeno. Na ausência de tamoxifeno, nenhuma atividade de recombinase em se- gundo plano foi detectada.
[097] Em uma outra modalidade, o sistema de controle da re- combinase compreende um gene da recombinase sob o controle de um promotor induzível e um domínio de ligação ao ligante do receptor do hormônio esteróide ligado de maneira operável ao gene da recom- binase.
PROMOTORES INDUZÍVEIS
[098] O sistema de expressão induzível é vantajoso em aplica- ções em que é desejável fornecer regulação sobre a expressão de se- quências de ácido nucleico específicas. Na presente invenção, o con- trole exógeno sobre a expressão de Rep regulada por recombinase é obtido através da ligação operacional de um promotor induzível às se- quências de ácido nucleico que codificam o gene da recombinase. Um promotor induzível no contexto desta invenção compreende um ele- mento de resposta associado. Em uma outra modalidade, o controle exógeno sobre a expressão dos genes do vírus auxiliar também é ob- tido de maneira operável por um elemento de controle da transcrição para um ou mais dos genes do vírus auxiliar. O elemento de controle da transcrição pode ser um promotor induzível ou simplesmente um elemento de resposta, onde um promotor nativo deve ser utilizado. Por exemplo, apenas as sequências de operador TetO podem ser usadas com o promotor nativo do gene auxiliar, que é um promotor Pol III e não deve transcrever corretamente se um promotor induzível Pol II pa- drão for utilizado.
[099] Em uma modalidade, o promotor induzível é um promotor responsivo a Tet (promotor Ptet). O promotor responsivo a Tet com- preende pelo menos um óperon Tet. Um óperon Tet (Ativação Trans- cricional Controlada por Tetraciclina) pode ser utilizado em um método de expressão gênica induzível, em que a transcrição é reversivelmente ligada ou desligada na presença do antibiótico tetraciclina ou um de seus derivados (por exemplo, doxiciclina (DOX)). Em uma modalidade, o agente indutor é tetraciclina ou um derivado da mesma.
[0100] Na natureza, o promotor Ptet expressa TetR, o repressor, e TetA, a proteína que bombeia o antibiótico tetraciclina para fora da cé- lula. Os sistemas óperon Tet estão amplamente disponíveis, tais como o óperon Tet utilizado no vetor de expressão de mamífero pcD- NA™4/TO disponível da Invitrogen.
[0101] Em uma modalidade, um promotor responsivo a Tet é utili- zado para controlar a expressão das sequências de ácido nucleico que codificam o gene da recombinase. Em uma modalidade, um ou mais dos genes de vírus auxiliares (por exemplo, para genes auxiliares de adenovírus, qualquer combinação compreendendo um ou mais de E1A, E1B, E2A, E4 e VA), estão sob o controle de um sistema de ex- pressão induzível. Conforme observado precedentemente, a proteína E4 é relatada como potencialmente citotóxica para as células (Ferrari et al., 1996, Journal of Virology 70: 3227-3234). Como tal, pode ser desejável ser capaz de controlar a expressão da proteína E4. Da mesma forma, pode ser desejável controlar a expressão de E2A para aliviar qualquer amplificação do gene rep/cap no caso de expressão de Rep avariada. Em uma outra modalidade, um promotor responsivo a Tet é utilizado para controlar a expressão das sequências de ácido nu- cleico que codificam um ou mais dos genes de vírus auxiliares, por exemplo, E2A, E4 e VA.
[0102] Em uma modalidade, a linhagem celular produtora de vetor AAV ainda compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um gene TetR. Em outra modalidade, o TetR é TetR-KRAB. TetR- KRAB é uma proteína híbrida descrita pela primeira vez por Deuschle et al. (1995, Mol Cell Biol 15:1907-14) em que o domínio da caixa as- sociada a Krüppel (KRAB) da proteína dedo de zinco Kox1 humana é fundido ao C-terminal do repressor Tet derivado de Tn10 de E. coli. Esta proteína híbrida possui a vantagem de ser capaz de silenciar a expressão de um gene ligando-se a sítios tetO a uma longa distância do sítio de início da transcrição. A atividade do promotor é restaurada após a administração de tetraciclina ou seu derivado, o que evita a li- gação de TetR-KRAB às sequências de tetO.
[0103] Em uma modalidade, o controle exógeno da expressão das sequências de ácido nucleico que codificam o gene da recombinase e/ou um ou mais genes do vírus auxiliar é fornecido por um sistema "Tet-On". Neste caso, a transcrição das sequências de ácido nucleico sob controle da transcrição é reversivelmente ligada na presença de tetraciclina ou seu derivado. Esses promotores induzíveis contêm ma- trizes de sequências de óperon Tet a montante de um promotor míni- mo, principalmente com base no promotor inicial imediato de CMV. Uma proteína repressora de Tet, por exemplo, TetR-KRAB, também é necessária para ser expressa constitutivamente na linhagem celular produtora de vetor AAV.
[0104] Sob condições normais de cultura de células, o promotor responsivo a Tet é ligado ao repressor TetR. A adição de doxiciclina ao meio de crescimento celular, quando as células estão na densidade correta para iniciar a produção do vetor AAV recombinante, desestabi- liza o TetR e permite a transcrição do gene da recombinase e, em ou- tras modalidades, também um ou mais genes do vírus auxiliar sob controle de transcrição.
[0105] Em uma modalidade, o promotor é pCMV-TO2, um promo- tor Pol II. pCMV-TO2 contém um intensificador e promotor CMV a montante de 2x sequências de óperon Tet.
[0106] Ficará entendido pela pessoa versada na técnica que as modalidades acima relacionadas com as sequências de ácido nucleico introduzidas no genoma da célula hospedeira também são aplicáveis às sequências de ácido nucleico compreendidas no vetor de ácido nu- cleico da invenção.
MÉTODOS
[0107] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um método de produção de uma linhagem celular produtora de vetor AAV estável, compreendendo: (a) a introdução do vetor de ácido nucleico no presente do- cumento descrito em uma cultura de células hospedeiras de mamífero; e (b) a seleção dentro da cultura de uma célula hospedeira de mamífero que possui as sequências de ácido nucleico codificadas no vetor integrado em um cromossomo endógeno da célula hospedeira de mamífero.
[0108] A pessoa versada estará ciente de que a introdução de um vetor de ácido nucleico na célula hospedeira pode ser executada utili- zando métodos adequados conhecidos na técnica, por exemplo, trans- fecção mediada por lipídios, microinjeção, fusão de células (tal como microcélulas), eletroporação ou bombardeamento de microprojéteis.
Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico é introduzido na célula hospedeira por eletroporação. Ficará entendido que a escolha do mé- todo a ser utilizado para a introdução do vetor de ácido nucleico pode ser escolhida dependendo do tipo de célula hospedeira de mamífero utilizada.
[0109] A pessoa versada na técnica estará ciente dos métodos na técnica para integrar sequências de ácido nucleico recombinantes que codificam as proteínas delineadas precedentemente no genoma da célula hospedeira para gerar uma linhagem celular produtora de vetor AAV, por exemplo, aquela divulgada em Yuan et al. (Yuan et al. (2011) Hum. Gene Ther. 22:613), que é no presente documento incorporado por referência.
[0110] As sequências de ácido nucleico no presente documento definidas são introduzidas na célula hospedeira de mamífero utilizando um único vetor de ácido nucleico compreendendo uma origem de re- plicação de não mamífero e a capacidade de conter pelo menos 25 quilobases (kb) de DNA.
[0111] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um vetor de ácido nucleico que compreende uma origem de replicação de não mamífero e a capacidade de conter pelo menos 25 quilobases (kb) de DNA, especificado pelo fato de que o referido vetor de ácido nuclei- co compreende sequências de ácido nucleico que codificam: genes rep e cap de AAV; genes de vírus auxiliares; e um genoma de DNA de um vetor AAV; em que o gene rep compreende um íntron, dito íntron com- preendendo uma sequência de terminação da transcrição com um primeiro sítio de recombinação localizado a montante e um segundo sítio de recombinação localizado a jusante da sequência de termina- ção da transcrição; e em que as sequências de ácido nucleico que codificam os genes rep e cap de AAV, cada um dos genes do vírus auxiliar e o ge- noma de DNA do vetor AAV são dispostos como cassetes de expres- são individuais dentro do vetor de ácido nucleico.
[0112] Os métodos atuais para gerar vetores AAV envolvem a transfecção transitória de um ou mais dos genes virais (genes de em- pacotamento ou genes de vírus auxiliares) e/ou transgene em uma cé- lula hospedeira. No entanto, muitas desvantagens foram associadas a este método porque é caro e trabalhoso, de modo que não é ideal para a produção de vetores AAV em grande escala.
[0113] Uma solução seria projetar uma linhagem celular produtora que incorpore de forma estável todos os genes necessários para a produção de um vetor AAV recombinante e elementos genéticos ne- cessários para controlar a expressão dos referidos genes, particular- mente o gene rep (os elementos genéticos para o controle de Rep e expressão de gene auxiliar do AAV descrita precedentemente), para fornecer um método simplificado e escalonável para a fabricação de grau clínico em grande escala de AAV recombinante para uso terapêu- tico. No entanto, uma tal célula produtora não está disponível na técni- ca.
[0114] Através da inclusão de todos os genes e elementos regula- dores em um vetor de ácido nucleico, estes podem ser inseridos nos cromossomos endógenos de uma célula hospedeira de mamífero em uma única etapa para produzir uma célula produtora de vetor AAV. Portanto, o uso de um vetor de ácido nucleico, como no presente do- cumento proposto, reduziria a pressão de seleção, reduziria o período de silenciamento e levaria em conta um rastreamento mais rápido de células produtoras potenciais. Além disso, os genes necessários para a produção do vetor AAV incluídos no vetor de ácido nucleico seriam todos integrados nos cromossomos endógenos da célula hospedeira de mamífero em um único lócus. Isso reduziria o risco de genes virais individuais serem silenciados e garantiria que todos os genes virais fossem expressos uniformemente.
[0115] Além disso, através do controle da expressão das proteínas Rep conhecidas por serem tóxicas para as células e, em algumas mo- dalidades, a expressão de um ou mais dos genes do vírus auxiliar também, é possível estabelecer linhagens celulares produtoras de ve- tor AAV incorporando de forma estável os genes de acondicionamento (genes rep e cap) e os genes do vírus auxiliar, que possui uma taxa de crescimento normal e alta estabilidade de modo a ser capaz de alcan- çar a densidade celular necessária para produzir vetores AAV em um biorreator em grande escala.
[0116] Ficará entendido que o constructo do vetor de ácido nuclei- co pode integrar mais de uma vez no genoma da célula hospedeira em vários sítios diferentes em diferentes cromossomos (embora com to- das as sequências de ácido nucleico codificadas presentes em um único lócus). Isso pode ser benéfico para aumentar os níveis de ex- pressão dos transgenes e pode melhorar potencialmente os títulos de AAV.
[0117] O vetor de ácido nucléico compreende sequências de ácido nucléico que codificam o genoma de DNA do vetor AAV recombinante. Quando esta sequência de ácido nucleico é replicada, ela se tornará encapsidada dentro do vetor AAV produzido pela célula e, portanto, atuará como o "genoma" do vetor AAV. Ficará entendido que o geno- ma de DNA do vetor AAV é geralmente incluído no "plasmídeo de transferência" ou "vetor de transferência" utilizado nos métodos de transfecção transitória. O plasmídeo de transferência geralmente con- tém um promotor (tal como CMV) ligado de maneira operável ao transgene (e opcionalmente um sinal de poliadenilação [poliA]), entre as duas ITRs do AAV. Portanto, a referência ao "genoma de DNA do vetor AAV", tal como no presente documento utilizado, refere-se a uma sequência de ácido nucleico (geralmente codificando o transgene de interesse) flanqueada por ITRs do AAV. Assim, em uma modalidade, o genoma de DNA do vetor AAV compreende um ou mais transgenes codificados entre duas ITRs do AAV.
[0118] Em uma modalidade, várias cópias do genoma de DNA do vetor AAV (isto é, o vetor de transferência) estão incluídas no vetor de ácido nucleico. Espera-se que várias cópias do vetor de transferência resultem em títulos de vetor viral mais elevados. Por exemplo, o vetor de ácido nucleico pode incluir duas ou mais, tais como três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez ou mais cópias do genoma de DNA do vetor AAV (isto é, o vetor de transferência).
[0119] O vetor de ácido nucleico pode conter um ou uma plurali- dade de sítios de recombinação, além dos sítios de recombinação no íntron de terminação. Isso permitiria que as sequências alvo fossem integradas nos cromossomos endógenos da célula hospedeira de mamífero de uma maneira específica para o sítio na presença de uma enzima recombinase. A enzima recombinase catalisa a reação de re- combinação entre dois sítios de recombinação. Em uma modalidade, o sítio de recombinação é um sítio att (por exemplo, do fago lambda), em que o sítio att permite a integração direcionada ao sítio na presen- ça de uma lambda integrase. Ficará entendido que a referência à "lambda integrase" inclui referências a integrases mutantes que ainda são compatíveis com o sistema int/att, por exemplo, as lambda inte- grases modificadas descritas na WO 2002/097059.
[0120] Cada uma das sequências de ácido nucleico é organizada como cassetes de expressão individuais dentro do vetor de ácido nu- cleico. A pessoa versada na técnica irá compreender que o gene cap é transcrito a partir do promotor p40, que está localizado dentro do gene rep, de modo que os genes rep e cap (isto é, gene rep/cap) não são separados e estão presentes em um único cassete de expressão.
[0121] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico ainda com- preende sequências de ácido nucleico que codificam um gene da re- combinase, disposto como um cassete de expressão individual dentro do vetor de ácido nucleico. Em uma outra modalidade, o gene da re- combinase é um gene Cre da recombinase. O gene Cre da recombi- nase pode ser otimizado por códons (iCre).
[0122] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico ainda com- preende um sistema de controle da recombinase. Em uma outra mo- dalidade, o sistema de controle da recombinase compreende um gene da recombinase sob o controle de um promotor induzível e/ou um do- mínio de ligação ao ligante do receptor do hormônio esteróide ligado de maneira operável à recombinase. Em uma outra modalidade, o do- mínio de ligação ao ligante do receptor do hormônio esteróide é um domínio de ligação ao ligante do receptor de estrogênio (ER). Em uma modalidade, o ER está ligado de maneira operável a montante e a ju- sante do gene da recombinase (isto é, o gene da recombinase é flan- queado por ER). Em uma modalidade, o ER é ERT2.
[0123] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente um isolador, tal como um isolador de cromatina. O termo "isolador" é bem conhecido na técnica e se refere a uma classe de elementos de sequência de DNA que possuem uma capacidade comum para proteger genes de sinais inadequados que emanam de seu ambiente circundante. (West et al., 2002, Genes Dev 16:271-288). Em uma outra modalidade, o isolador (como um isolador de cromatina) está presente entre cada uma das sequências de ácido nucleico. As sequências de ácido nucleico, neste contexto, referem-se às sequên- cias de ácido nucleico em um cassete de expressão, de modo que as sequências de isolador estão presentes entre os cassetes de expres- são. Em uma modalidade, um isolador está presente entre cada um dos cassetes de expressão.
[0124] Quando se cria uma grande construção genética que será integrada de forma estável no genoma de uma célula hospedeira, mui- tas vezes é necessário separar cada elemento (isto é, cassete de ex- pressão) do constructo com uma sequência de isolador. Os métodos de transfecção transitória mascaram um grande problema com vetores multigênicos, nomeadamente a interferência do promotor de promoto- res em tandem (Moriarity et al. (2013) Nucleic Acids Res. 41:e92). Mo- riarity et al. criaram um grande constructo estável que incluiu duas có- pias em tandem do isolador cHS4 (2xcHS4) entre cada elemento de expressão. A sequência de isolador é um elemento cHS4 de 1,2 kb do grupo de genes da globina semelhante à β de frango. Esses trechos de DNA atuam como potentes bloqueadores do intensificador e mos- traram superar a interferência do promotor. Sem estar limitado pela teoria, duas cópias em tandem de cHS4 são consideradas para aliviar a interferência do promotor, fornecendo sítios de ligação para várias proteínas (CBP, CTCF e USF1) que mantêm um estado de cromatina aberto ao recrutar fatores hospedeiros modificadores da cromatina (Yahata et al. (2007) J. Mol. Biol. 374:580).
[0125] Além disso, os elementos isoladores também podem ser usados como um recurso de segurança para aliviar problemas decor- rentes de elementos intensificadores introduzidos no genoma do hos- pedeiro, que às vezes podem elevar os níveis de oncogenes do hos- pedeiro. Rivella et al. (Rivella et al. (2000) J Virol. 74: 4679) também mostraram que a expressão do transgene de retrovírus integrados foi melhorada e a metilação da repetição terminal longa 5', que está impli- cada no silenciamento de retrovírus integrados, foi reduzida quando o cHS4 foi incorporado a montante do intensificador/promotor retroviral. Pelas razões delineadas acima, é, portanto, vantajoso quando se cria os constructos de BAC de produtor de vetor AAV estáveis para incluir um isolador entre cada elemento de expressão.
[0126] Em uma modalidade, o isolador possui pelo menos 90% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 95% de identidade de sequência, com a sequência de isolador HS4 (cHS4) de frango (Gallus gallus) (por exemplo, ver Genome Accession No. U78775.2, pares de bases 1 a 1205). Em uma outra modalidade, o isolador com- preende duas sequências de isolador cHS4 em tandem (aproximada- mente 2,4 quilobases), isto é, 2xcHS4.
[0127] A fim de clonar sequencialmente cada cassete de expres- são do constructo do produtor de vetor AAV estável (isto é, sequências de ácido nucleico que codificam os genes necessários para gerar uma linhagem celular produtora de vetor AAV, respectivamente, conforme descrito precedentemente) em um BAC juntamente com elementos 2xcHS4, é útil criar um plasmídeo doador contendo cHS4 a jusante de sítios de restrição de corte raros, que permitiria a clonagem de cada elemento próximo ao cHS4 antes de transferir o elemento e o 2xcHS4 para o BAC. Para facilitar isso, o sítio de clonagem para os cassetes de expressão e o 2xcHS4 poderia ser flanqueado por sítios de me- ganuclease, sítios de corte para enzimas de restrição com longas se- quências de reconhecimento que raramente aparecem, mesmo em construções longas. Os sítios de restrição das enzimas de restrição de meganuclease I-SceI e PI-PspI podem estar presentes no plasmídeo doador na extremidade 5' do cassete de expressão e 3' de 2xcHS4, respectivamente. I-SceI e PI-PspI criam saliências compatíveis. Isso permitiria que cada cassete de expressão clonado no plasmídeo doa- dor fosse sequencialmente clonado, junta de 2xcHS4, no BAC a jusan- te do elemento precedente mais cHS4 pela assim chamada clonagem iBrick, conforme descrito em Liu et al. (Liu et al. (2014) PLoS One 9:e110852).
[0128] Em uma outra modalidade, um isolador pode estar presente entre cada um dos genes de vírus auxiliares (por exemplo, E1A, E1B, E2A, E4 e/ou VA, ou em células produtoras baseadas em HEK293, E2A, E4 e/ou VA). Isto ajuda a prevenir a interferência do promotor (isto é, quando o promotor de uma unidade de transcrição prejudica a expressão de uma unidade de transcrição adjacente) entre sequências de ácido nucleico virais adjacentes. Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que isso também ajude a minimizar o risco de recombina- ção entre as sequências virais para gerar vírus competentes para re- plicação.
[0129] Por exemplo, em uma modalidade exemplar, o vetor de ácido nucleico compreende a seguinte inserção: um gene TetR-KRAB ligado de maneira operável a um promotor CMV e um marcador de seleção compreendendo IRES, um isolador (tal como um isolador de cromatina), um gene auxiliar de adenovírus E2A ligado de maneira operável a um promotor CMVTO2, um isolador (tal como um isolador de cromatina), um gene auxiliar de adenovírus E4 ligado de maneira operável a um promotor CMVTO2, um isolador (tal como um isolador de cromatina), 7 sequências de TetO, um gene auxiliar de adenovírus VA ligado de maneira operável a um promotor, um isolador (tal como um isolador de cromatina), uma sequência de ácido nucleico que codi- fica os genes rep e cap de AAV com um íntron entre os promotores P19 e P40 contendo um sítio LoxP seguido por uma sequência de terminação de transcrição seguida por um gene higromicina seguido por um sítio LoxP, um isolador (tal como um isolador de cromatina), uma sequência de ácido nucleico que codifica Cre ou ERT2-Cre-ERT2 ligada de maneira operável a um promotor CMVTO2, um isolador (tal como um isolador de cromatina), uma sequência de ácido nucleico que compreende um transgene ligado de maneira operável a um promotor entre duas ITRs do AAV e um sítio de clonagem múltipla. Uma modali- dade exemplar do vetor de ácido nucleico é fornecida esquematica-
mente na Figura 5.
[0130] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico é seleciona- do de: um cromossomo artificial bacteriano (BAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC), um cromossomo artificial derivado de P1 (PAC), fosmídeo ou cosmídeo. Em uma outra modalidade, o vetor de ácido nucleico é um cromossomo artificial bacteriano (BAC). Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico é um plasmídeo. Cromossomos artificiais bacterianos
[0131] O termo "cromossomo artificial bacteriano " ou "BAC" refe- re-se a um constructo de DNA derivada de plasmídeos bacterianos que é capaz de conter uma grande inserção de DNA exógeno. Eles geralmente podem conter uma inserção máxima de DNA de aproxima- damente 350 kb. Os BACs foram desenvolvidos a partir do plasmídeo de fertilidade funcional bacteriano bem especificado (plasmídeo F) que contém genes de divisão que promovem a distribuição uniforme de plasmídeos após a divisão celular bacteriana. Isso permite que os BACs sejam replicados de forma estável e segregados ao lado de ge- nomas bacterianos endógenos (tais como E. coli). O BAC geralmente contém pelo menos uma cópia de uma origem de replicação (tal como o gene oriS ou oriV), o gene repE (para replicação de plasmídeo e re- gulação do número de cópias) e genes de divisão (tal como sopA, sopB, parA, parB e/ou parC) que garante a manutenção estável do BAC nas células bacterianas. Os BACs são naturalmente circulares e superenrolados, o que os torna mais fáceis de recuperar do que os cromossomos artificiais lineares, tais como os YACs. Eles também po- dem ser introduzidos em células hospedeiras bacterianas com relativa facilidade, utilizando métodos simples, tal como eletroporação.
[0132] Em uma modalidade, o cromossomo artificial bacteriano compreende um gene oriS. Em uma modalidade, o cromossomo artifi- cial bacteriano compreende um gene repE. Em uma modalidade, o cromossomo artificial bacteriano compreende genes de divisão. Em uma outra modalidade, os genes de divisão são selecionados de sopA, sopB, parA, parB e/ou parC. Em mais outra modalidade, o cromosso- mo artificial bacteriano compreende um gene sopA e sopB.
[0133] O BAC para uso na presente invenção pode ser obtido de fontes comerciais, por exemplo, o pSMART BAC da LUCIGEN™ (con- sulte o Genome Accession No. EU101022.1 para a sequência comple- ta da cadeia principal). Este BAC contém o sistema de “cópia” de L- arabinose, que também contém a origem de replicação da cópia média oriV, que é ativa apenas na presença da proteína de replicação TrfA. O gene para TrfA pode ser incorporado no genoma de células hospe- deiras bacterianas sob o controle do promotor L-arabinose induzível araC-PBAD (ver Wild et al. (2002) Genome Res. 12(9): 1434-1444). A adição de L-arabinose induz a expressão de TrfA, que ativa o oriV, fa- zendo com que o plasmídeo se replique em até 50 cópias por célula. Cromossomos artificiais de levedura
[0134] O termo "cromossomo artificial de levedura" ou "YAC" refe- re-se a cromossomos nos quais o DNA de levedura é incorporado em plasmídeos bacterianos. Eles contêm uma sequência de replicação autônoma (ARS) (isto é, uma origem de replicação), um centrômero e telômeros. Ao contrário dos BACs, o YAC é linear e, portanto, contém telômeros de levedura em cada extremidade do cromossomo para pro- teger as extremidades da degradação à medida que é passado para a progênie da célula hospedeira. Os YACs podem conter uma variedade de tamanhos de inserções de DNA; qualquer coisa entre 100 a 2000 kb. Cromossomos Artificiais derivados de P1
[0135] O termo "cromossomo artificial derivado de P1" ou "PAC" refere-se aos constructos de DNA derivados do DNA do bacteriófago P1 e do plasmídeo F bacteriano. Eles geralmente podem conter uma inserção máxima de DNA de aproximadamente 100 a 300 kb e são utilizados como vetores de clonagem em E. coli. Os PACs possuem vantagens semelhantes aos BACs, tais como serem fáceis de purificar e introduzir nas células hospedeiras bacterianas. Cosmídeos e Fosmídeos
[0136] O termo "cosmídeo" refere-se aos constructos de DNA de- rivados de plasmídeos bacterianos que, adicionalmente, contêm sítios cos derivados do bacteriófago lambda. Os cosmídeos geralmente con- têm uma origem de replicação bacteriana (tal como oriV), um marca- dor de seleção, um sítio de clonagem e pelo menos um sítio cos. Os cosmídeos geralmente podem aceitar uma inserção máxima de DNA de 40 a 45 kb. Os cosmídeos demonstraram ser mais eficientes na in- fecção de células de E. coli do que os plasmídeos bacterianos padrão. O termo "fosmídeo" refere-se a vetores de ácido nucleico de não ma- míferos que são semelhantes a cosmídeos, exceto que são baseados no plasmídeo F bacteriano. Em particular, eles utilizam a origem de replicação do plasmídeo F e mecanismos de divisão para permitir a clonagem de grandes fragmentos de DNA. Os fosmídeos geralmente podem aceitar uma inserção máxima de DNA de 40 kb.
[0137] Ficará entendido que as sequências de ácido nucleico que codificam o vetor AAV defeituoso de replicação podem ser iguais ou derivadas dos genes do tipo selvagem, isto é, as sequências podem ser geneticamente ou de outro modo versões alteradas de sequências contidas no vírus do tipo selvagem. Portanto, os genes virais incorpo- rados aos vetores de ácido nucleico ou genomas de células hospedei- ras também podem se referir a versões otimizadas pelos códons dos genes do tipo selvagem.
[0138] Será entendido pelo especialista na técnica que as modali- dades relacionadas ao vetor de ácido nucleico também são aplicáveis à célula produtora de vetor AAV. A título de exemplo, e sem limitação,
o genoma da célula hospedeira pode compreender isoladores entre as sequências de ácido nucleico que codificam o gene necessário para a produção do vetor AAV recombinante nele integrado.
[0139] Assim que transfectado na célula hospedeira de mamífero, o vetor de ácido nucleico irá integrar aleatoriamente no genoma endó- geno da célula hospedeira de mamífero. Portanto, o método compre- ende adicionalmente a seleção da célula hospedeira de mamífero na qual os ácidos nucleicos codificados no vetor de ácido nucleico foram integrados (por exemplo, utilizando um marcador de seleção de resis- tência a antibióticos, tal como um marcador de resistência à zeocina).
[0140] A pessoa versada estará ciente dos métodos para encora- jar a integração do vetor de ácido nucleico, por exemplo, linearização do vetor de ácido nucleico se for naturalmente circular (por exemplo, BACs, PACs, cosmídeos ou fosmídeos). O vetor de ácido nucleico po- de compreender adicionalmente áreas de homologia compartilhada com os cromossomos endógenos da célula hospedeira de mamífero para orientar a integração a um sítio selecionado dentro do genoma endógeno. Além disso, se os sítios de recombinação estiverem pre- sentes no vetor de ácido nucleico, eles podem ser utilizados para re- combinação direcionada. Por exemplo, o vetor de ácido nucleico pode conter um sítio LoxP que leva em conta a integração direcionada quando combinado com a Crê recombinase (isto é, utilizando o siste- ma Cre/lox derivado do bacteriófago P1). Alternativamente (ou adicio- nalmente), o sítio de recombinação é um sítio att (por exemplo, do fa- go lambda), em que o sítio att permite a integração direcionada ao sítio na presença de uma lambda integrase. Isso permitiria que os genes virais fossem direcionados a um lócus dentro do genoma endógeno.
[0141] Outros métodos de integração direcionada são bem conhe- cidos na técnica. Por exemplo, os métodos de indução da clivagem direcionada do DNA genômico podem ser utilizados para encorajar a recombinação direcionada em um lócus cromossômico selecionado. Esses métodos frequentemente envolvem o uso de sistemas de cliva- gem projetados para induzir uma quebra de fita dupla (DSB) ou um incisão no genoma endógeno para induzir o reparo da quebra por pro- cessos naturais, tais como junção de extremidade não homóloga (NHEJ) ou reparo utilizando um modelo de reparo (isto é, reparo dire- cionado por homologia ou HDR).
[0142] A clivagem pode ocorrer por meio do uso de nucleases es- pecíficas tais como nucleases dedo de zinco projetadas (ZFN), ativa- dor de transcrição como nucleases efetoras (TALENs), utilizando o sis- tema CRISPR/Cas9 com um crRNA/tracr RNA projetado ('RNA de guia único') para guiar a clivagem específica e/ou utilizando nucleases com base no sistema Argonaute (por exemplo, de T. thermophilus, conhe- cido como 'TtAgo', ver Swarts et al. (2014) Nature 507(7491): 258- 261). A clivagem direcionada utilizando um desses sistemas de nu- clease pode ser explorada para inserir um ácido nucleico em um sítio alvo específico utilizando processos mediados por HDR ou NHEJ. Por- tanto, em uma modalidade, o método compreende adicionalmente a integração das sequências de ácido nucleico codificadas no vetor de ácido nucleico no genoma (isto é, um cromossomo endógeno) da célu- la hospedeira de mamífero utilizando pelo menos uma nuclease, em que pelo menos uma nuclease cliva o genoma da célula hospedeira de mamífero de tal modo que as sequências de ácido nucleico sejam in- tegradas no genoma da célula. Em uma outra modalidade, a nuclease é selecionada a partir do grupo que consiste em uma nuclease dedo de zinco (ZFN), uma nuclease TALE (TALEN), um sistema de nu- clease CRISPR/Cas e combinações dos mesmos.
[0143] Uma modalidade de um vetor de ácido nucleico da presente invenção é representada esquematicamente na Figura 5. Componentes Adicionais
[0144] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende um marcador selecionável. Nas modalidades em que o íntron de ter- minação compreende um marcador selecionável, o marcador selecio- nável pode ser um marcador selecionável diferente além do marcador selecionável no íntron de terminação. O marcador selecionável permite que as células que incorporaram as sequências do vetor de ácido nu- cleico sejam selecionadas. Em uma outra modalidade, o marcador se- lecionável é um gene de resistência a fármacos, tal como um gene de resistência a antibióticos, por exemplo, um gene de resistência à zeo- cina, canamicina ou puromicina, em particular um gene de resistência à zeocina (ZeoR). Em mais uma outra modalidade, o gene de resis- tência à zeocina é derivado do gene Streptoalloteichus hindustans ble, por exemplo, ver o Genome Accession No. X52869.1 dos pares de ba- ses de 3 a 377.
[0145] O fenômeno natural da amplificação gênica tem sido explo- rado na indústria biofarmacêutica como forma de aumentar o título de um produto recombinante produzido por uma linhagem celular. Quan- do um gene recombinante foi integrado ao genoma da célula hospe- deira, o número de cópias do gene recombinante e concomitantemen- te a quantidade de proteína recombinante expressa podem ser aumen- tados através da seleção de linhagens celulares nas quais o gene re- combinante foi amplificado após integração no genoma da célula hos- pedeira. Portanto, em uma modalidade, o marcador selecionável é um marcador de seleção amplificável.
[0146] A amplificação do gene pode ser induzida por transfecção estável de uma célula hospedeira com um gene marcador de seleção amplificável. As células hospedeiras transfectadas de forma estável são submetidas a concentrações crescentes de um fármaco tóxico, que é conhecido por inibir o marcador de seleção amplificável. Por exemplo, as células transfectadas podem ser cultivadas em um meio que contém o fármaco tóxico em uma concentração para atingir a mor- te de mais de 98% das células dentro de 3 a 5 dias após o plaquea- mento das células progenitoras (isto é, células não transfectadas) em meio contendo o fármaco tóxico. Por meio dessa inibição, as popula- ções de células podem ser selecionadas que apresentam níveis de expressão aumentados do marcador de seleção amplificável e, conse- quentemente, resistência ao fármaco na concentração usada.
[0147] Como observado acima, o vetor de ácido nucleico divulga- do nesta invenção permite que todos os cassetes de expressão nele contidos (isto é, DNA do vetor de ácido nucleico) sejam integrados em um único lócus dentro do genoma da célula hospedeira. Como o pro- cesso de amplificação do gene provoca a amplificação do gene mar- cador de seleção amplificável e das sequências de DNA circundantes, as sequências de DNA remanescentes no DNA do vetor de ácido nu- cleico integrado também serão amplificadas. Desta forma, é possível fornecer um processo para a amplificação de genes de vetores virais integrados de forma estável no genoma de uma célula hospedeira.
[0148] Cada marcador de seleção amplificável possui um agente de seleção associado (isto é, um fármaco tóxico), que é adicionado ao meio de cultura de células durante a amplificação e os regimes de se- leção. Combinações de marcador de seleção/agente de seleção ampli- ficáveis adequadas incluem adenosina desaminase / desoxicoformici- na, aspartato transcarbamilase / N (fosfoacetil)-L-aspartato, diidrofolato redutase / metotrexato, glutamina sintetase / metionina sulfoximina, metaltioneína-1 / metal pesado.
[0149] Em uma modalidade, o gene marcador de seleção amplifi- cável e/ou o marcador selecionável é fornecido em um cassete de ex- pressão.
[0150] Em uma modalidade, o marcador de seleção amplificável é diidrofolato redutase (DHFR). O método de seleção de DHFR envolve a incorporação do gene dhfr (gene do marcador de seleção amplificá- vel) ao vetor de ácido nucleico, induzindo assim uma pressão de sele- ção de DHFR aos outros cassetes de expressão dentro do vetor de ácido nucleico. A célula hospedeira é transfectada com o vetor de áci- do nucleico e cultivada na presença de concentrações crescentes de inibidor de DHFR, metotrexato (MTX), para selecionar células que am- plificaram o gene dhfr integrado no genoma do hospedeiro e concomi- tantemente, o DNA do vetor de ácido nucleico integrado remanescen- te.
[0151] Em uma modalidade, o gene dhfr compreende pelo menos 60% de identidade de sequência, tal como pelo menos 70%, 80%, 90% ou 100% de identidade de sequência com o Genome Accession No. NM_010049.3.
[0152] Em outra modalidade, o marcador de seleção amplificável é a glutamina sintetase (GS). O método de seleção de GS envolve a in- corporação do gene gs ao vetor de ácido nucleico, induzindo assim uma pressão de seleção de GS aos outros cassetes de expressão dentro do vetor de ácido nucleico. A célula hospedeira é transfectada com o vetor de ácido nucleico e cultivada na presença de concentra- ções crescentes do inibidor de GS metionina sulfoximina (MSX) para selecionar células que amplificaram o gene gs integrado no genoma do hospedeiro e concomitantemente, o DNA do vetor de ácido nucleico integrado remanescente.
[0153] O constructo de expressão compreendendo sequências de ácido nucleico do gene gs pode conter sequências de ácido nucleico de constructos de expressão que codificam o gene gs conhecido na técnica (por exemplo, WO874462, cujas sequências nela contidas são no presente documento incorporadas por referência).
[0154] Através do uso do marcador de seleção amplificável e do agente de seleção associado desta forma, seguido por um período de cultivo para permitir a seleção de células que crescem na nova (au- mentada) concentração do agente associado, a área do genoma que abriga a pressão de seleção pode amplificar, aumentando assim o número de cópias do marcador de seleção amplificável. Consequen- temente, quando os cassetes de expressão do vetor de ácido nucleico compreendendo os genes virais são integradas no genoma do hospe- deiro em um único lócus juntamente com um cassete de expressão que compreende o gene marcador de seleção amplificável, esses cas- setes de expressão também são amplificadas. Portanto, as linhagens celulares que crescem por meio de tais rodadas de amplificação e se- leção são então rastreadas em título/rendimento e o melhor clone é selecionado para a produção subsequente do vetor AAV.
[0155] Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira é nega- tiva para o marcador de seleção amplificável. Isso quer dizer que o cromossomo endógeno da célula hospedeira não compreende um ge- ne marcador de seleção amplificável endógeno. Por exemplo, ao utili- zar DHFR como o marcador de seleção amplificável, é preferível usar cepas hospedeiras DHFR-negativas, tais como CHO DG44 ou CHO DUX-B11.
[0156] No entanto, a invenção não está limitada pela escolha de uma linhagem celular hospedeira particular. Qualquer linhagem celular que tem uma taxa rápida de crescimento (isto é, um tempo de duplica- ção de 12 horas ou menos) e que é capaz de amplificar o gene mar- cador de seleção amplificável em uma taxa razoável, sem amplificação do gene marcador de seleção amplificável endógeno em uma taxa semelhante ou mais elevada pode ser utilizada nos métodos da pre- sente invenção.
[0157] As linhagens celulares transduzidas com o marcador domi- nante (isto é, marcador de seleção amplificável exógeno) são identifi- cadas através da determinação de que a capacidade da célula de crescer em concentrações crescentes do agente de seleção se corre- laciona com um aumento no número de cópias do marcador de sele- ção amplificável (isso pode ser medido diretamente pela demonstração de um aumento no número de cópias do marcador amplificável por Southern blotting ou indiretamente pela demonstração de um aumento na quantidade de mRNA produzido a partir do marcador amplificável por Northern blotting ou qPCR).
[0158] Quando uma célula hospedeira compreende um gene mar- cador de seleção amplificável endógeno, o vetor de ácido nucleico po- de compreender ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica um marcador selecionável além do marcador de seleção amplificável. Isto contorna o problema de amplificação do gene do marcador de se- leção amplificável endógeno durante a seleção com o agente de sele- ção associado. As células hospedeiras são transfectadas com um ve- tor de ácido nucleico compreendendo um marcador de seleção ampli- ficável, assim como um marcador selecionável. As células hospedeiras transfectadas são em primeiro lugar selecionadas pela capacidade de crescer no antibiótico do marcador selecionável, tal como zeocina ou higromicina p. As células são então selecionadas quanto à capacidade de crescer em concentrações crescentes do agente de seleção, tal como MTX.
[0159] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende um sinal poliA adicionalmente ao sinal poliA presente no íntron de ter- minação. O uso de um sinal poliA tem a vantagem de proteger o mRNA da degradação enzimática e auxiliar na translação. Em uma outra modalidade, o sinal poliA é obtido ou derivado de SV40, hormô- nio de crescimento bovino e/ou beta globina humana. Em uma modali- dade, o sinal poliA é derivado do sinal poliA inicial de SV40 (por exem- plo, ver o Genome Accession No. EF579804.1, pares de bases 2668 a 2538 da fita negativa). Em uma modalidade, o sinal poliA é derivado do sinal poliA de beta globina humana (por exemplo, ver o Genome Accession No. GU324922.1, pares de bases 3394 a 4162).
[0160] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico adicional- mente compreende uma sequência de íntron além do íntron de termi- nação. A utilização de um íntron a jusante da região intensificado- ra/promotora e a montante da inserção de cDNA (isto é, o transgene) é conhecida de aumentar o nível de expressão da inserção. Em uma ou- tra modalidade, a sequência de íntron é um intron de beta globina hu- mana ou a sequência de intron de beta globina de coelho II. Em uma modalidade, o íntron de beta globina humana é derivado da sequência disponível no Genome Accession No. KM504957.1 (por exemplo, de pares de bases 476 a 1393). Em uma modalidade, o íntron II de beta globina de coelho é derivado da sequência disponível no Genome Ac- cession No. V00882.1 (por exemplo, de pares de bases 718 a 1290).
[0161] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico adicional- mente compreende um elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota (WPRE). Foi demonstrado que a presença do WPRE aumenta a expressão e, como tal, é provável que seja benéfica na obtenção de altos níveis de expressão. Em uma outra modalidade, o WPRE é derivado da sequência disponível no Genome Accession No. J04514.1 (por exemplo, de pares de bases 1093 a 1684).
[0162] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico adicional- mente compreende um local de entrada de ribossomo interno (IRES). Um IRES permite o início da translação de uma maneira independente da extremidade. Um IRES é um elemento de RNA estruturado que ge- ralmente é encontrado na região 5' não trasladada (UTR) de vírus a jusante do 5'-cap (que é necessário para a montagem do complexo de iniciação). O IRES é reconhecido por fatores de iniciação da transla- ção e permite a translação independente de cap. Em uma outra moda- lidade, o IRES é derivado do genoma do vírus da Encefalomiocardite
(EMCV) (por exemplo, ver o Genome Accession No. KF836387.1, pa- res de bases 151 a 724).
[0163] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico adicional- mente compreende um Sítio de Múltiplas Clonagens (MCS). Um MCS é um segmento curto de DNA dentro do vetor de ácido nucleico que contém vários sítios de restrição (por exemplo, 10, 15 ou 20 sítios). Esses sítios geralmente ocorrem apenas uma vez no vetor de ácido nucleico para garantir que a endonuclease corte apenas em um sítio. Isto permite que os genes virais sejam facilmente inseridos utilizando as endonucleases apropriadas (isto é, enzimas de restrição).
[0164] Será entendido por uma pessoa versada na técnica que os cassetes de expressão podem ser dispostos em qualquer ordem den- tro do vetor de ácido nucleico.
[0165] As sequências de ácido nucleico podem ser introduzidas no vetor de ácido nucleico sequencialmente. Isso leva em conta a seleção após cada integração para garantir que todas as sequências de ácido nucleico necessárias sejam integradas com sucesso no vetor de ácido nucleico. Alternativamente, pelo menos duas ou mais das sequências de ácido nucleico são introduzidas no vetor de ácido nucleico simulta- neamente.
[0166] Ficará entendido que os genes adicionais no presente do- cumento descritos podem ser introduzidos no vetor de ácido nucleico por técnicas de clonagem molecular padrão conhecidas na especiali- dade, por exemplo, utilizando endonucleases de restrição e técnicas de ligação. Além disso, o vetor de ácido nucleico, em particular BACs, PACs, fosmídeos e/ou cosmídeos, pode ser introduzido nas células hospedeiras bacterianas (tais como células de E. coli, em particular a cepa de E. coli DH10B) por técnicas padrão, tais como eletroporação.
[0167] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecida uma célula produtora de vetor AAV obtida pelos métodos no presente documento definidos.
[0168] A linhagem celular obtida utilizando os métodos no presen- te documento definidos pode ser utilizada para produzir um alto título de vetor AAV. O título viral pode ser medido por PCR quantitativo (qPCR), que fornece o número de cópias do genoma de partículas de AAV, e por ELISA, que fornece a medida TCID50 do título de vírus in- feccioso. Mediante a comparação das duas medições, a eficiência de transdução com a batelada de AAV pode ser determinada.
[0169] As referências nesta invenção ao termo "alto título" refe- rem-se a uma quantidade eficaz de vetores AAV que é capaz de transduzir uma célula alvo, tal como uma célula de paciente. Em uma modalidade, um alto título está em excesso de 106 TU/ml sem concen- tração (TU = unidades de transdução).
[0170] Em uma modalidade, os métodos no presente documento definidos são escalonáveis, de modo que podem ser realizados em qualquer volume desejado de meio de cultura, por exemplo, de 10 ml (por exemplo, em frascos agitadores) a 10 L, 50 L, 100 L ou mais (por exemplo, em biorreatores, tal como sistemas de biorreatores de ondas e tanques agitados).
[0171] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um método para produzir um vetor AAV com defeito de replicação, compreendendo: (a) a introdução do vetor de ácido nucleico no presente do- cumento descrito em uma cultura de células hospedeiras de mamífero; e (b) a seleção dentro da cultura de uma célula hospedeira de mamífero que possui as sequências de ácido nucleico codificadas no vetor integrado em um cromossomo endógeno da célula hospedeira de mamífero; e (c) o cultivo adicional da célula hospedeira de mamífero se-
lecionada sob condições nas quais o vetor AAV defeituoso para repli- cação é produzido.
[0172] Ficará entendido pela pessoa versada na técnica que as condições utilizadas no método descrito nesta invenção serão depen- dentes da célula hospedeira utilizada. As condições típicas, por exem- plo, o meio de cultura ou temperatura a ser utilizado, são bem conhe- cidas na técnica. Em uma modalidade, o cultivo é executado através da incubação da célula hospedeira de mamífero sob condições úmi- das. Em uma outra modalidade, as condições úmidas compreendem a incubação das células transfectadas a 37 °C em CO2 5%. Em uma modalidade, o cultivo é executado utilizando um meio de cultura sele- cionado de: meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% (vol/vol) de soro fetal bovino (FBS), meio UltraCULTURETM sem soro (Lonza, Cat. No. 12-725F), ou meio de expressão FreeStyleTM (Thermo Fisher, Cat. No. 12338 018).
[0173] Os métodos de cultivo apropriados são bem conhecidos da pessoa versada na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada em suspensão e/ou em condições livres de componentes animais. Em uma modalidade, a célula é adequada para o cultivo em qualquer vo- lume de meio de cultura, de 10 ml (por exemplo, em frascos agitado- res) a 10 L, 50 L, 100 L ou mais (por exemplo, em biorreatores).
[0174] Conforme no presente documento descrito, o uso da inven- ção reivindicada reduz o custo de fabricação de plasmídeo, reduz a necessidade de reagentes de transfecção (por exemplo, Polietilenimi- na [PEI]), reduz a quantidade de tratamento com Benzonase necessá- ria (há uma quantidade reduzida de DNA na colheita viral, portanto, menos Benzonase é necessária para remover o excesso no proces- samento a jusante) e reduz os custos do teste (não há necessidade de testar o plasmídeo residual no produto viral). Todas essas vantagens podem ser consideradas como aspectos da invenção.
[0175] Em uma modalidade, o método adicionalmente compreen- de o isolamento do vetor AAV defeituoso para replicação. Por exem- plo, em uma modalidade, o isolamento é executado utilizando um filtro. Em uma outra modalidade, o filtro é uma membrana de ligação de bai- xa proteína (por exemplo, uma membrana de ligação de baixa proteína de 0,22 μm ou uma membrana de ligação de baixa proteína de 0,45 μm), tal como fluoreto de polivinilideno (PVDF) ou membranas artifici- ais de polietersulfona (PES).
[0176] Uma vez dentro da célula hospedeira de mamífero, as se- quências de ácido nucleico presentes no vetor de ácido nucleico po- dem se integrar em um local aleatório dentro do genoma endógeno. A etapa de integração pode ser incentivada conforme descrito nesta in- venção precedentemente, por exemplo, utilizando linearização e/ou áreas de homologia compartilhada. Os sítios de recombinação tam- bém podem ser utilizados para a recombinação direcionada.
[0177] Se os genes alvo são integrados nos cromossomos endó- genos com um marcador seletivo, tal como um gene de resistência a antibióticos, então o método pode compreender adicionalmente a se- leção de células hospedeiras de mamífero nas quais os ácidos nuclei- cos virais se integraram com sucesso.
[0178] Uma vez isolados, os vetores AAV podem ser concentrados para aplicações in vivo. Os métodos de concentração incluem, por exemplo, ultracentrifugação, precipitação ou cromatografia de troca aniônica. A ultracentrifugação é útil como um método rápido para a concentração do vetor AAV em pequena escala. Alternativamente, a cromatografia de troca aniônica (por exemplo, utilizando cartuchos de membrana de troca aniônica Mustang Q) ou precipitação (por exem- plo, utilizando PEG 6000) são particularmente úteis para o processa- mento de grandes volumes de sobrenadantes de vetor AAV.
[0179] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecido um vetor AAV de replicação defeituosa obtido pelo método no presen- te documento definido.
[0180] Será observado que as modalidades dos vetores de ácido nucleico utilizados nos métodos descritos nesta invenção também são tomadas como modalidades das células produtoras de vetor AAV e vice-versa, na medida em que as modalidades se referem a caracterís- ticas do vetor de ácido nucleico que estão integradas no genoma hos- pedeiro da célula produtora de vetor AAV através do respectivo méto- do.
[0181] A invenção será agora descrita com maiores detalhes com referência aos seguintes Exemplos não limitativos.
EXEMPLOS Exemplo 1
[0182] As seguintes modificações foram feitas no plasmídeo de acondicionamento padrão (genes rep e cap), plasmídeo de vírus auxi- liar (genes E2A, E4 e VA) e plasmídeo de vetor de transferência (transgene flanqueado por sequências de ITR, que codifica o genoma de DNA do vetor AAV recombinante) utilizados para a produção de vetores AAV. Projeto de intron de terminação contendo sequências de terminação de transcrição flanqueadas por sítios LoxP
[0183] Para recriar as 3 sequências poliA de SV40 in silico, a se- quência poliA inicial foi copiada do genoma SV40 completo (número de acesso J02400.1) e 3 cópias foram ligadas em tandem.
[0184] Uma sequência do promotor HSV TK foi colocada a mon- tante de uma sequência do gene de resistência à higromicina (número de acesso do GenBank U40398.1). O promotor HSV TK e o gene de resistência à higromicina foram colocados a jusante das 3 sequências poliA de SV40.
[0185] A sequência dos sítios LoxP foi retirada diretamente de
Qiao et al. (2002, Journal of Virology 76: 13015-13027). Esta sequên- cia foi colada nas extremidades 5' e 3' do fragmento poliA-HygR 3x, resultando em sítios LoxP que flanqueiam os terminadores transcricio- nais na mesma orientação.
[0186] A sequência do íntron 1 da gonadotrofina coriônica humana (hCG) foi obtida a partir da subunidade beta do gene 5 da hCG (núme- ro de acesso X00265.1). A sequência de poliA-HygR de 3x SV40 flan- queada por LoxP foi inserida no íntron de hCG na base 196. O com- primento da sequência de terminação completa do íntron foi 3120 pb. Clonagem do íntron de terminação no gene rep de AAV
[0187] O íntron de terminação foi inserido nos plasmídeos de ex- pressão rep2cap2 e rep2cap5 na posição 1022 em relação à sequên- cia do genoma de AAV2 do tipo selvagem (número de acesso Gen- Bank: J01901). Isto está dentro do gene rep a jusante do promotor P19. Esta posição contém uma sequência de consenso da união doa- dor/aceitante para um íntron a ser inserido (AAG/G). Projeto de sequência de Cre (iCre) otimizada por códon
[0188] Uma variante melhorada pelo códon de Cre, denominada iCre, foi projetada por Shimshek et al. (2002 Genesis 32: 19-26) e foi mostrado de restaurar quase 2x a atividade de β-galactosidase de LacZ contendo um códon de parada "floxed" em comparação com Cre do tipo selvagem quando transitoriamente transfectado em células CV1-5B (Casanova et al., 2002 Gênesis 34: 208-214).
[0189] A sequência de Cre foi obtida do número de acesso Gen- Bank DQ023272. A sequência de iCre foi obtida a partir do número de acesso GenBank AY056050. Clonagem do promotor CMV-TO2 de genes para expressão induzida por Tet
[0190] Além de regular a expressão de Rep, pode ser necessário regular a expressão dos genes auxiliares do Adenovírus 2 no BAC
(E2A, E4 e VA com células HEK293), pois estes também são potenci- almente tóxicos para as células (Ferrari et al., 1996, Journal Of Viro- logy 70: 3227-3234). Portanto, a região de codificação da proteína de ligação ao DNA E2A e a região E4 contendo todas as 6 ORFs de E4 foram clonadas, respectivamente, a jusante de PCMV-TO2. No entan- to, VA, sendo transcrito de um promotor Pol III, não transcreveria cor- retamente se colocado a jusante de PCMV-TO2. Portanto, várias se- quências de TetO foram colocadas a montante do promotor VA nativo e a ligação de TetR-KRAB a esses sítios deve inibir a transcrição na ausência de doxiciclina.
[0191] Consequentemente, o promotor CMV-TO2 foi clonado a montante de Cre, iCre, ERT2-Cre-ERT2, ERT2-iCre-ERT2, Adenovírus 2 E2A e E4 individualmente utilizando montagem Gibson. Além disso, sequências TetO 7x foram clonadas a montante do Adenovírus 2 VA utilizando a montagem Gibson. Projeto de TetR-KRAB
[0192] A expressão de Cre está sob o controle de um promotor condicional (PCMV-TO2) que, em condições celulares normais, é liga- do pelo repressor transcricional TetR-KRAB. A adição de doxiciclina ao meio de crescimento celular, quando as células estão na densidade correta para iniciar a produção de rAAV, desestabiliza o repressor TetR-KRAB e permite a transcrição do gene Cre. Subsequentemente, a Cre recombinase irá emendar os terminadores transcricionais flan- queados por LoxP em um íntron recombinante no gene rep de AAV, permitindo a transcrição do gene rep. Este sistema significa que Rep só é expressa em células após adição de doxiciclina ao meio, aliviando a toxicidade para as células até que atinjam a densidade necessária adequada para a produção do vetor AAV.
[0193] Uma sequência que codifica o domínio KRAB do gene Kox1 humano clonado na extremidade 3' do gene TetR com códon otimiza-
do por montagem de Gibson, para converter o gene TetR sob o contro- le de um promotor PCMV em um gene TetR-KRAB. Projeto de ERT2Cre/iCreERT2 regulado por tamoxifeno
[0194] Qualquer expressão de Cre avariada sob o controle do sis- tema de expressão condicional de Tet ainda poderia remover efetiva- mente os terminadores transcricionais do gene rep de AAV recombi- nante e reduzir a viabilidade das células estáveis em cultura. Portanto, como uma salvaguarda contra isso, uma camada adicional de controle de recombinase Cre foi adicionada através da modificação do gene Cre, flanqueando-o com domínios ERT2, conforme descrito em Casa- nova et al. (2002, Genesis 34: 208-214). Esses domínios ERT2 nos N- e C-terminais da proteína inibem o Cre de entrar no núcleo até que 4- hidróxi-tamoxifeno seja adicionado ao meio de cultura celular, dando um nível de controle sobre a atividade Cre no nível da proteína que pode aliviar os efeitos de qualquer expressão avariada no nível trans- cricional.
[0195] Sequências de domínio ERT2 (Wagner J, Metzger D, Chambon P (1997) Biochem Biophys Res Commun 237:752-757) fo- ram clonadas nas extremidades 5' e 3' dos genes Cre e iCre, a jusante do promotor condicional CMVTO2 utilizando a montagem Gibson. Exemplo 2 Método de transfecção transitória para testar a capacidade de Cre em remover o íntron de terminação do gene rep
[0196] Um íntron de terminação contendo 3 sítios de terminação de transcrição de SV40 poli A e um gene de resistência à higromicina, todos flanqueados por sítios LoxP, foi inserido na sequência AAV2 rep a jusante do promotor P19 em nossos plasmídeos de expressão rep2/cap2 e rep2/cap5, como observado acima. O íntron de termina- ção deve inibir a expressão de proteínas Rep em células transfectadas com esses plasmídeos, a menos que Cre também seja expresso nas células. A cotransfecção de um plasmídeo de expressão Cre deve re- combinar os 2 sítios LoxP, separando os terminadores da transcrição e permitindo que a RNA polimerase ler através do íntron remanescente. Vários plasmídeos foram construídos precedentemente em que várias variantes Cre (Cre, iCre, ERT2-Cre-ERT2 e ERT2-iCre-ERT2 tipo sel- vagem) foram clonados a jusante do promotor CMVTO2, que é consti- tutivamente ativo nas células na ausência de uma proteína repressora Tet. As proteínas Cre flanqueadas por ERT2 também requerem 4- hidróxi-tamoxifeno para atuar como um ligante que lhes permite entrar no núcleo.
[0197] A capacidade do íntron de terminação presente no íntron rep recombinante foi testada quanto à sua capacidade de impedir a produção da proteína Rep. Além disso, os vários plasmídeos de ex- pressão Cre foram testados quanto à sua capacidade de restaurar a expressão de Rep nas células para as quais eles são cotransfectados.
[0198] As células HEK 293T aderentes foram desagregadas com TrypLE Express, colocadas novamente em suspensão em DMEM + 10% FCS, contadas utilizando um NucleoCounter NC-250 e diluídas para 2 x 105 células/ml. As células foram plaqueadas em uma placa de 24 cavidades, 1 ml por cavidade, e incubadas durante a noite a 37 oC. No dia seguinte, as células na placa de 24 cavidades estavam subcon- fluentes. As cavidades de células foram co-transfectadas com as com- binações de plasmídeos listados abaixo (com referência às Figuras 1 e 2), cada plasmídeo foi utilizado em 0,5 µg/cavidade. Quando utilizado, 4-hidroxitamoxifeno foi adicionado ao meio de crescimento celular em 1 µM (diluição 1:1000 de estoque 1 mM dissolvido em etanol). Figura 1
1. pG.AAV2.R2C2 + pG3.Ad2 Auxiliar
2. pG.AAV2.R2C2-hCG íntron 3x pA Hyg + pG3.Ad2 Auxili- ar
3. pG.AAV2.R2C2-hCG íntron 3x pA Hyg + pG3.Ad2 Auxili- ar + pG3.CMVTO2-Cre
4. pG.AAV2.R2C2-hCG íntron 3x pA Hyg + pG3.Ad2 Auxili- ar + pG3.CMVTO2-iCre
5. pG.AAV2.R2C2-hCG íntron 3x pA Hyg + pG3.Ad2 Auxili- ar + pG3.CMVTO2-ERT2-Cre-ERT2
6. pG.AAV2.R2C2-hCG íntron 3x pA Hyg + pG3.Ad2 Auxili- ar + pG3.CMVTO2-ERT2-iCre-ERT2
7. pG.AAV2.R2C2-hCG íntron 3x pA Hyg + pG3.Ad2 Auxili- ar + pG3.CMVTO2-ERT2-Cre-ERT2 + 4-hidroxitamoxifeno
8. pG.AAV2.R2C2-hCG íntron 3x pA Hyg + pG3.Ad2 Auxili- ar + pG3.CMVTO2-ERT2-iCre-ERT2 + 4-hidroxitamoxifeno
9. pG.AAV2.R2C2-hCG íntron 3x pA Hyg (controle negati- vo)
10. pG3.Ad2 Auxiliar GSK (controle negativo)
11. pG.AAV2.R2C2-hCG íntron 3x pA Hyg + pG3.Ad2 Au- xiliar GSK + pG3.CMVTO2-Cre + 1 µM 4-hidroxitamoxifeno (no caso 4- hidroxitamoxifeno possui qualquer efeito na ausência de ERT2)
12. Células não transfectadas. Figura 2
1. pG2.AAV5.R2C5 + pG3.Ad2 Auxiliar
2. pG2.AAV5.R2C5-hCG íntron 3x pA Hyg + pG3.Ad2 Auxi- liar
3. pG2.AAV5.R2C5-hCG íntron 3x pA Hyg + pG3.Ad2 Auxi- liar + pG3.CMVTO2-Cre
4. pG2.AAV5.R2C5-hCG íntron 3x pA Hyg + pG3.Ad2 Auxi- liar + pG3.CMVTO2-iCre
5. pG2.AAV5.R2C5-hCG íntron 3x pA Hyg + pG3.Ad2 Auxi- liar + pG3.CMVTO2-ERT2-Cre-ERT2
6. pG2.AAV5.R2C5-hCG íntron 3x pA Hyg + pG3.Ad2 Auxi-
liar + pG3.CMVTO2-ERT2-iCre-ERT2
7. pG2.AAV5.R2C5-hCG íntron 3x pA Hyg + pG3.Ad2 Auxi- liar + pG3.CMVTO2-ERT2-Cre-ERT2 + 4-hidroxitamoxifeno
8. pG2.AAV5.R2C5-hCG íntron 3x pA Hyg + pG3.Ad2 Auxi- liar + pG3.CMVTO2-ERT2-iCre-ERT2 + 4-hidroxitamoxifeno
9. pG3.Ad2 Auxiliar
10. pG2.AAV5.R2C5-hCG íntron 3x pA Hyg (controle nega- tivo)
11. pG2.AAV5.R2C5-hCG íntron 3x pA Hyg + 1 µM 4- hidroxitamoxifeno (controle negativo)
12. Células não transfectadas
[0199] Os plasmídeos foram todos adicionados a tubos contendo 75 µl de OPTI MEM. Para cada tubo, mais 75 μl de OPTI MEM con- tendo 2 μl de PEI Pro foram adicionados. Os tubos contendo as mistu- ras de transfecção foram misturados através de vórtice brevemente e incubados na temperatura ambiente durante 10 minutos. Após isso, o meio de crescimento foi removido das células na placa de 24 cavida- des e substituído por 150 μl de cada uma das misturas de transfecção. Após uma incubação de 10 minutos, as cavidades foram completadas com 1 ml de DMEM + FCS a 10% e a placa incubada a 37 oC durante 24 horas. No dia seguinte, o meio foi removido das cavidades conten- do as células transfectadas e as células foram submetidas à lise atra- vés da adição de 300 μl por cavidade de reagente de extração de pro- teína de mamífero M-PER contendo inibidor de protease Halt™ 1 x e pipetado para cima e para baixo. Os tubos foram então centrifugados em 14.000 x g durante 5 minutos para remover os resíduos celulares e os lisados transferidos para novos tubos. A concentração total de pro- teína de cada amostra foi determinada utilizando um kit de ensaio de proteína Pierce BCA. Uma curva padrão BSA foi configurada conforme descrito no manual do kit. Um volume de 25 μl de cada padrão e amostra foi adicionado a uma placa de 96 cavidades de fundo plano em triplicata e 200 μl do reagente de trabalho BCA foram adicionados a cada cavidade. A placa foi incubada a 37 oC durante 30 minutos e a absorbância foi então medida em um comprimento de onda de 562 nm utilizando um FlexStation 3. As amostras foram todas normalizadas para uma concentração de 0,25 mg/ml utilizando tampão de lise M- PER.
[0200] As amostras foram preparadas para execução utilizando o protocolo de tamanho de Peggy Sue. Um volume de 1 μl de master mix fluorescente reconstituído do Pacote Padrão 1 foi adicionado a 4 μl de cada uma das amostras em tubos eppendorf. As amostras e a es- cada biotinilada do Pacote Padrão 1 foram então agitadas e desnatu- radas por aquecimento a 95 oC durante 5 minutos. As amostras foram então centrifugadas e colocadas no gelo. O anticorpo primário αAAV Rep (diluído 1:100) e o anticorpo primário αβ-Actin (diluído 1:500) fo- ram combinados no diluente de anticorpo 2. As amostras, anticorpo, mistura de luminol/peróxido, anticorpo primário e secundário (camun- dongo α, utilizado puro), estreptavidina-HRP e as matrizes de separa- ção e empilhamento foram carregadas em uma placa do kit de separa- ção Peggy and Sally Sue 12-230 kDa.
[0201] Devido às dificuldades técnicas, a placa precisou ser arma- zenada a 4 oC no fim de semana e foi operada na segunda-feira se- guinte no Peggy Sue. A placa foi montada no Peggy Sue com a tampa e as posições de cada amostra e reagente inseridas no software Com- pass for SW. Um novo conjunto de capilares do kit de separação Pe- ggy and Sally Sue 12-230 kDa foi instalado e o Peggy Sue foi então operado durante a noite.
[0202] Como esperado, todas as 4 variantes de união de Rep2 fo- ram detectadas no lisado de células cotransfectadas com o plasmídeo auxiliar Ad2 e os plasmídeos de expressão rep2/cap2 ou rep2/cap5. O lisado de células cotransfectadas com o plasmídeo auxiliar Ad2 e o pG.AAV2.R2C2-hCG íntron 3x pA Hyg ou o pG2.AAV5.R2C5-hCG ín- tron 3x pA Hyg não continha qualquer proteína Rep2 detectável. Eles continham a faixa β-Actin, provando que isso não era devido a uma falha capilar em Peggy Sue. Isto mostra que o íntron contendo os ter- minadores transcricionais 3x SV40 polyA flanqueados por LoxP e o gene de resistência à higromicina a jusante do promotor P19 em rep é eficaz na inibição da expressão de Rep.
[0203] O lisado de células cotransfectadas com o plasmídeo auxi- liar Ad2 e o pG.AAV2.R2C2-hCG íntron 3x pA Hyg ou o pG2.AAV5.R2C5-hCG íntron 3x pA Hyg juntamente com os plasmí- deos de expressão Cre ou iCre continham níveis elevados de proteína Rep2. Isso mostra que a remoção dos terminadores de transcrição 3x SV40 poliA e do gene de resistência à higromicina do íntron hCG a jusante de P19 em rep por recombinação Cre dos sítios LoxP restau- rou a expressão. Em cada caso, o plasmídeo de expressão iCre pare- cia ser ligeiramente mais eficaz na restauração da expressão Rep2 do que o plasmídeo de expressão Cre do tipo selvagem.
[0204] Lisado de células cotransfectadas com o plasmídeo auxiliar Ad2 e o pG.AAV2.R2C2-hCG íntron 3x pA Hyg ou o pG2.AAV5.R2C5- hCG íntron 3x pA Hyg juntamente com os plasmídeos de expressão ERT2-Cre-ERT2 ou ERT2-iCre-ERT2, na ausência de 4- hidroxitamoxifeno, expressaram apenas vestígios de proteína Rep2. Isso foi provavelmente devido à atividade residual das proteínas Cre flanqueadas por ERT2 que estavam possivelmente em níveis tão ele- vados na célula e, portanto, pequenas quantidades foram capazes de entrar nos núcleos da célula na ausência de ligante e clivar os termi- nadores de transcrição do íntron em rep2. Alternativamente, o verme- lho de fenol no meio de cultura de células DMEM pode atuar como um ligante receptor de estrogênio fraco. As células transfectadas com es-
tes plasmídeos na presença de 4-hidroxitamoxifeno 1 µM no meio de crescimento tinham níveis de expressão Rep2 semelhantes aos das células transfectadas com os plasmídeos de expressão Cre e iCre. A adição de 4-hidroxitamoxifeno, portanto, restaurou a atividade total de Cre para as proteínas Cre flanqueadas por ERT2. Em cada caso, as células transfectadas com os plasmídeos que expressam ERT2-iCre- ERT2 tinham menor expressão de Rep2 residual na ausência de 4- hidroxitamoxifeno e níveis mais elevados de expressão de Rep2 na presença de 4-hidroxitamoxifeno do que as células transfectadas com EET2-Cre-ERT2.
[0205] Nenhuma Rep2 foi detectada no lisado de células não transfectadas negativas. O anticorpo β-Actin mostrou que o carrega- mento não era completamente uniforme, mas bom o suficiente para mostrar que qualquer ausência de expressão de Rep2 não era devido à falha do capilar. Em capilares onde o lisado continha Rep2, as vari- antes de união Rep2 inferiores obscureceram o sinal de β-Actin.
[0206] Esta experiência mostra que os terminadores de transcrição flanqueados por LoxP no íntron de terminação clonado no gene rep do AAV2 foram eficazes na inibição da expressão de Rep2, e que a ativi- dade Cre nas células poderia restaurar esta expressão de Rep2. Este experimento também mostrou que a atividade das proteínas Cre flan- queadas por ERT2 era condicional no 4-hidroxitamoxifeno, embora eles tivessem baixos níveis de atividade residual na ausência deste ligante. Da mesma forma, o códon iCre melhorado restaurou a expres- são de Rep2 ligeiramente mais elevada do que o Cre do tipo selva- gem.
[0207] Uma linhagem celular estavelmente transfectada contendo este gene rep recombinante não expressaria Rep até que a expressão de Cre fosse ativada. O gene Cre, sob o controle de um promotor con- dicional, pode, portanto, ser utilizado para ativar a expressão de Rep e iniciar a produção do vetor AAV, visto que as células alcançaram a densidade ideal em um biorreator, aliviando a toxicidade associada à expressão de Rep até que atinjam aquele ponto. Exemplo 3 Teste para determinar a capacidade dos genes auxiliares do Adenoví- rus 2 com promotores condicionais para sustentar a produção do vetor AAV e para determinar se rep/cap dependente de Cre é capaz de pro- duzir o vetor AAV funcional
[0208] Um constructo de BAC estável foi projetado e construído para a produção do vetor AAV recombinante em que os promotores nativos dos genes E2A e E4 do Adenovírus 2 foram substituídos pelo promotor condicional CMV-TO2. O BAC também carrega o gene re- pressor transcricional "tet-on" sensível a DOX TetR-KRAB a jusante do promotor constitutivo PCMV. As células transfectadas com este cons- tructo expressariam constitutivamente TetR-KRAB que se liga aos promotores CMVTO2 a montante das ORFs E2A e E4, bloqueando a sua transcrição até que a doxiciclina seja adicionada ao meio de cres- cimento celular. Como TetR-KRAB também é capaz de bloquear a transcrição de promotores Pol. III através da ligação às sequências de óperon Tet próximas, 7 óperons Tet foram colocados a montante do promotor Pol. III nativo VA, de modo que a expressão deste RNA fun- cional também seria bloqueada sob condições normais.
[0209] Não se sabia se a substituição dos promotores endógenos de E2A e E4 iria interromper sua expressão e, portanto, inibir sua ca- pacidade de fornecer funções auxiliares às proteínas Rep e Cap do AAV nas células durante a produção do vetor.
[0210] Era importante testar a capacidade do constructo de BAC compreendendo todos os genes auxiliares Ad2 com promotores condi- cionais e o gene TetR-KRAB (CreBAC6) para fornecer função auxiliar durante a produção de vetor AAV transiente em células T HEK293 em comparação com um constructo semelhante em que todos os genes auxiliares Ad2 retiveram seus promotores endógenos (BAC6). Para o CreBAC6 ser ativo como auxiliar, seria necessária a adição de DOX ao meio de crescimento celular. A função auxiliar foi testada pela trans- fecção de frascos de células HEK293 adaptadas em suspensão com estes BACs juntamente com plasmídeos carregando rep/cap de AAV (pG2.AAV2.R2C5-íntron) e o vetor de transferência de expressão de EGFP (pG.AAV2.C.GFP.P2a.fLuc.W6.ssb) utilizado no sistema transi- ente de 3 plasmídeos de produção de vetores e sua incubação. Qual- quer vetor produzido pode ser colhido por lise das células e utilizado para transduzir células CHO receptoras. O nível de transdução e, por- tanto, o nível de produção do vetor AAV funcional foi avaliado através da medição da porcentagem de células GFP positivas por citometria de fluxo. Produção de AAV
[0211] Um frasco de células HEK293Tsa (células HEK293Tsa co- mo utilizadas neste pedido refere-se às células HEK293T adaptadas em suspensão) foi transfectado com os plasmídeos padrão do sistema de 3 plasmídeos para produção transiente de rAAV5 (pG3.Ad2 Auxiliar GSK, pG2.AAV5.R2C5-íntron e pG.AAV2.C.GFP.P2a.fLuc.W6.ssb) como um controle positivo conhecido.
[0212] As células HEK293Tsa foram semeadas em frascos de cul- tura agitadores de 250 ml a 2 x 106 células por ml, 60 ml por frasco em meio BalanCD HEK293, 2% Glutamax, 0,1% Pluronic F-68. Devido ao grande tamanho e rendimento limitado dos BACs a serem testados com relação à função auxiliar, não foi possível transfectar células na relação molar usual para um sistema transiente de 3 plasmídeos para a produção de rAAV de 1,6:1:1 de plasmídeo auxiliar : plasmídeo rep/cap (isto é, plasmídeo de acondicionamento): vetor de transferên- cia, usual. Por esse motivo, as transfecções nas quais os BACs forne-
ceram funções auxiliares estavam em uma relação molar de 0,62 : 1,0 : 0,86. Os plasmídeos de sistema de 3 plasmídeos foram utilizados em uma relação molar de 1,6 : 1 : 0,86 de plasmídeo auxiliar para plasmí- deo rep/cap para transferir o vetor de plasmídeo. A um frasco de célu- las transfectadas com o plasmídeo rep/cap dependente de Cre (pG2.AAV5.R2C5-hCG íntron 3x pA HygR), foram adicionados 8,4 µg de pG3.CMVTO2-iCre. Uma transfecção de controle negativo não con- tendo plasmídeo rep/cap (auxiliar e vetor de transferência apenas) também foi incluída. Um frasco de células era um controle não trans- fectado. Os plasmídeos foram adicionados em 6 ml de meio Opti-MEM contendo 58,5 μl de PEI Pro. As misturas de transfecção foram subme- tidas á vórtice e incubadas na temperatura ambiente durante 15 minu- tos antes de serem adicionadas a frascos agitadores contendo as célu- las. A um dos frascos de células transfectadas com CreBAC6, DOX foi adicionado ao meio de cultura de células para uma concentração final de 2 µg/ml. As células foram incubadas a 37 oC com agitação. No dia seguinte, butirato de sódio 1 M foi adicionado a cada frasco para uma concentração final de 5 mM.
[0213] Após 72 horas após a transfecção, as células foram precipi- tadas por centrifugação em 1.300 rpm durante 10 minutos e colocadas novamente em suspensão em 4 ml de tampão de lise. As células fo- ram submetidas à lise por 3 x ciclos de congelamento em gelo seco mais etanol seguido de descongelamento a 37 oC. A benzonase foi então adicionada aos lisados em 50 U/ml e os tubos incubados a 37 oC durante 30 minutos. O lisado foi então limpo por centrifugação em
1.300 rpm durante 10 minutos, após o que o sobrenadante foi dividido em alíquotas e o sedimento descartado. Transdução do AAV
[0214] As células CHO, que são receptivas à transdução com AAV2 e AAV5, foram semeadas em uma placa de 96 cavidades a 8 x
103 células/cavidade (desenvolvendo em 200 μl por cavidade de DMEM contendo 10% de FCS, 1x Glutamax e 1x aminoácidos não es- senciais) No dia seguinte, 20 µl de cada um dos lisados de células contendo o rAAV5 e os lisados de controle negativo foram adicionados às cavidades de células CHO em duplicata. A placa de células CHO foi incubada durante 5 horas a 37 oC, após o que o meio contendo os li- sados foi aspirado das cavidades e substituído por meio fresco. A pla- ca foi então incubada a 37 oC durante mais 67 horas. O meio foi então aspirado das células CHO transduzidas e as células foram desagrega- das com 200 μl de solução de EDTA e foram então analisadas em um citômetro de fluxo Accuri C6 para medir o nível de fluorescência GFP e também analisadas com o software FlowJo. A população de células vivas foi bloqueada em (FSC-A / SSC-A) e, em seguida, uma porta foi configurada para células individuais (FSC-A / FSC-H). Células CHO não transduzidas foram utilizadas para definir a fluorescência de linha de base (FL1-A/FSC-A) acima da qual as células poderiam ser consi- deradas GFP positivas. A porcentagem de células acima da linha de base de fluorescência foi calculada para cada uma das cavidades de células transduzidas, a média e o desvio padrão foram então calcula- dos para cada uma das duplicatas. Os resultados são mostrados na Figura 3.
[0215] A Figura 3 mostra que o BAC no qual todos os genes auxi- liares Ad2 retêm seus promotores endógenos foi capaz de fornecer função auxiliar na produção de vetores AAV transientes. O nível relati- vamente baixo de células receptoras transduzidas (~2,4%), refletindo um vetor recombinante de título relativamente baixo, foi provavelmente devido à relação de plasmídeo subideal utilizada nas transfecções das células produtoras e a baixa eficiência de transdução de um tal grande constructo (> 30 kb) nas células. Na ausência de DOX no meio de cul- tura de células, CreBAC6, em que todos os genes auxiliares estão sob controle condicional, não forneceu função do gene auxiliar suficiente para as células transfectadas produzirem vetor recombinante suficien- te para transduzir as células CHO em níveis detectáveis de fluores- cência. Isso se deve ao fato de que, na ausência de DOX, as células transfectadas com este BAC estariam constantemente expressando TetR-KRAB que inibe a transcrição de todos os genes auxiliares. Isso mostra que a expressão desses genes a partir deste BAC é significati- vamente suprimida na ausência de DOX. Isto irá provavelmente redu- zir o nível de toxicidade das proteínas auxiliares Ad2 nas células trans- fectadas de forma estável com tal constructo. As células transfectadas com CreBAC6 na presença de 2 µg/ml de DOX no meio de cultura ce- lular produziram o vetor AAV recombinante em níveis elevados o sufi- ciente para transduzir uma porcentagem maior de células CHO (~3,4%) do que aquelas transduzidas com lisado de células transfec- tadas com o BAC auxiliar retendo os promotores endógenos. É possí- vel que, quando aliviado da repressão de TetR-KRAB, o promotor CMVTO2 seja mais ativo do que os promotores endógenos de E2A e E4, levando em conta um maior nível de expressão desses genes em células transfectadas, resultando em níveis mais elevados de produ- ção de vetor recombinante. Estes dados mostram que a expressão dos genes auxiliares E2A e E4 não é interrompida pela substituição de seus promotores nativos por promotor condicional e pode até ser me- lhorada.
[0216] As células transduzidas com o plasmídeo auxiliar de contro- le negativo + vetor de transferência apenas o lisado de células trans- fectadas não tinham nenhum nível detectável de fluorescência. Isso mostra que toda a fluorescência medida acima da linha de base nas células CHO transduzidas foi devido à distribuição de transdução de AAV do gene EGFP nas células e não devido à absorção da proteína EGFP do lisado de células produtoras nas células.
[0217] A Figura 4 mostra que, como esperado, as células transfec- tadas com o sistema de 3 plasmídeos são capazes de produzir quanti- dades de vetor AAV5 recombinante o suficiente para transduzir células receptoras em níveis elevados (~52,3%).
[0218] Células transfectadas com o plasmídeo de expressão rep/cap dependente de Cre (isto é, gene rep compreendendo o íntron de terminação) (pG2.AAV5.R2C5-hCG íntron 3x pA HygR) juntamente com o plasmídeo auxiliar Ad2 e o vetor de transferência EGFP na au- sência de um plasmídeo de expressão Cre não produziram vetor re- combinante em níveis capazes de produzir fluorescência detectável em células transduzidas. Isso mostra que, na ausência de Cre, o gene rep que compreende o íntron de terminação é funcionalmente silencio- so.
[0219] As células transfectadas com o plasmídeo de expressão rep/cap dependente de Cre juntamente com o plasmídeo auxiliar Ad2, vetor de transferência EGFP e um plasmídeo de expressão iCre (pG3.CMVTO2-iCre) produziram vetor recombinante suficiente para transduzir as células receptoras em níveis elevados (~22,2%), embora não tanto quanto as células transfectadas com o padrão rep/cap não dependente de Cre. Isso mostra que este gene rep dependente de Cre (isto é, gene rep compreendendo o íntron de terminação) é capaz de produzir um vetor AAV funcional. A menor quantidade de vetor produ- zida em comparação com o plasmídeo rep/cap não dependente de Cre pode ser devido a uma série de fatores além da interrupção das rela- ções de variantes de processamento. É possível que o atraso na ex- pressão de Rep devido ao requisito para iCre ser primeiro trasladado e os sítios LoxP recombinarem possa resultar em rendimentos mais bai- xos de vetor. É possível que o nível de expressão de iCre nas células não seja o ideal e que a transfecção de células com uma quantidade maior do plasmídeo de expressão de iCre pode resultar em rendimen-
tos de vetor mais elevados. É possível que, como o iCre é constante- mente expresso e ativo nas células, os terminadores da transcrição pudessem ser reinseridos em genes rep nos quais já foram removidos, resultando na expressão de Rep constantemente em fluxo nas células. Os plasmídeos de rep/cap dependentes de Cre e padrão foram purifi- cados utilizando kits diferentes (Qiagen Plasmid Plus Midi Kit e Nu- cleobond Xtra Maxi EF Kit, respectivamente) e poderiam simplesmente ser o caso em que a qualidade da preparação de plasmídeo rep/cap padrão fosse maior.
[0220] Portanto, os dados na Figura 3 mostram que a substituição dos promotores endógenos dos genes auxiliares Ad2 por promotores condicionais não afeta negativamente sua expressão quando eles são ativados. Os dados na Figura 4 mostram que o rep dependente de Cre é capaz de produzir um vetor AAV recombinante funcional na presen- ça de Cre/iCre. Ambos os genes auxiliares condicionais e o rep de- pendente de Cre são funcionalmente silenciosos quando não ativados. Portanto, no constructo de BAC produtor de AAV estável quando toda a toxicidade celular deve ser suprimida nas células nas quais o cons- tructo foi integrado, se permite que eles se dividam normalmente até que a produção do vetor recombinante seja iniciada. Exemplo 4 Projeto de Cromossomo Artificial Bacteriano de AAV
[0221] O método abaixo foi utilizado para clonar os elementos no BAC.
1. Cada elemento é amplificado por PCR utilizando uma prova de leitura de DNA polimerase com iniciadores que incluem sítios de restrição exclusivos que permitirão que o elemento seja clonado no sítio de clonagem múltipla do plasmídeo doador de BAC, pDonor.
2. O fragmento amplificado por PCR é purificado em gel e ligado ao plasmídeo de clonagem TOPO pCR-Blunt II TOPO. Esta li-
gação é utilizada para transformar E. coli quimicamente competente.
3. O plasmídeo contendo o elemento amplificado por PCR é extraído de uma cultura de caldo de E. coli e digerido com as 2 enzi- mas de restrição para as quais os sítios foram introduzidos pelos inici- adores de PCR.
4. O plasmídeo digerido é separado por eletroforese em gel de agarose e o elemento digerido é removido do gel e purificado.
5. O elemento digerido e purificado é ligado ao sítio de clo- nagem múltipla de pDonor. Este plasmídeo contém 2 sítios isoladores hipersensíveis de galinha (2xcHS4) próximos do sítio de clonagem múltipla. Os elementos são clonados em pDonor de forma direcional de modo que o 2xcHS4 esteja situado na extremidade 3' do elemento. Um sítio de restrição para a enzima meganuclease I-SceI está situado em pDonor a montante da extremidade 5' do elemento clonado de forma direcional, enquanto que um sítio de restrição para a enzima meganuclease PI-PspI está situado na extremidade 3' de 2xcHS4. Es- ta ligação é utilizada para transformar E. coli quimicamente competen- te.
6. O plasmídeo pDonor que carrega o elemento clonado de forma direcional é extraído de uma cultura de caldo de E. coli e digeri- do em primeiro lugar com a meganuclease I-SceI a 37 oC e depois com PI-PspI a 65 oC.
7. O plasmídeo digerido é separado por eletroforese em gel de agarose e o elemento digerido incluindo 2xcHS4 na extremidade 3' é removido do gel e purificado.
8. O BAC contém um único sítio de restrição PI-PspI. O DNA de BAC é digerido com PI-PspI a 65 oC e depois desfosforilado pela adição de fosfatase alcalina FastAP à reação de digestão e incu- bação a 37 oC durante 30 minutos. A FastAP é então desativada atra- vés da incubação da reação a 75 oC durante 5 minutos.
9. As meganucleases I-SceI e PI-PspI clivam o DNA dei- xando saliências que são compatíveis, mas assimétricas. Portanto, o elemento digerido I-SceI e PI-PspI com 2xcHS4 na extremidade 3' po- de ser ligado de forma direcional ao BAC digerido por PI-PspI. A sali- ência I-SceI na extremidade 5' do elemento ligará uma das saliências PI-PspI no BAC, resultando em uma nova sequência que não pode mais ser cortada por I-SceI ou PI-PspI. A saliência PI-PspI na extremi- dade 3' do 2xcHS4 a jusante do elemento se ligará a outra saliência PI-PspI no BAC, resultando na formação de um novo sítio PI-PspI no BAC ligado na extremidade 3' do 2xcHS4. Esta ligação é utilizada para transformar E. coli eletrocompetente utilizando um dispositivo de ele- troporação.
10. O BAC, agora contendo o elemento recém-clonado com 2xcHS4 na extremidade 3', é extraído de uma cultura de caldo de E. coli. Este BAC pode ser digerido com PI-PspI e desfosforilado e outros elementos que foram subclonados de forma direcional em pDonor po- dem ser ligados neste sítio. Qualquer novo elemento que foi em pri- meiro lugar clonado em pDonor, quando ligado ao BAC, sempre terá 2xcHS4 em sua extremidade 5' do fragmento clonado precedentemen- te e 2xcHS4 em sua extremidade 3' após ter sido clonado em pDonor.
[0222] Um diagrama esquemático de um vetor de ácido nucleico produzido desta forma é mostrado na Figura 5. Exemplo 5 Geração de pools estáveis de células transfectadas com constructos de BAC de AAV5
[0223] A transfecção e seleção dos constructos de BAC de rAAV foram executadas em células HEK293T aderentes. Células HEK293Tsa pré-MCB adaptadas à suspensão crescendo em meio Ba- lanCD em cultura agitadora foram contadas e colocadas novamente em suspensão em 2 x 105 células/ml em meio DMEM contendo 10%
de FCS, que as reverte ao comportamento aderente. As células foram semeadas em uma placa de 6 cavidades, 2 ml por cavidade, que foi então incubada durante a noite a 37 oC. No dia seguinte, os maxipreps dos constructos de BAC de AAV estáveis contendo o vetor de transfe- rência EGFP: TetR-KRAB iCreBAC9b-GFP e TetR iCreBAC9b-GFP foram transfectados nas células plaqueadas. Cada transfecção conti- nha 5 µg de DNA de um BAC maxiprep adicionado a 300 µl de OPTI- MEM, ao qual foram adicionados 5 µl de PEI-pro. Os tubos foram bre- vemente agitados em vórtice e incubados durante 10 minutos. Em se- guida, as misturas de transfecção foram adicionadas a cada cavidade. Após 48 horas, as cavidades foram aspiradas e o meio substituído por DMEM contendo 10% de FCS e 300 µg/ml de zeocina. A placa foi in- cubada durante vários dias, durante os quais a maior parte das células não transfectadas morreu e flutuou para fora da superfície das cavida- des. O meio foi substituído várias vezes por meio DMEM fresco con- tendo 10% de FCS e 300 µg/ml de Zeocina. Após 7 dias, as células nas cavidades eram principalmente EGFP positivas e duplicação em uma taxa normal. Produção de vetor AAV recombinante por indução de Pools Está- veis
[0224] Os pools de células HEK293T transfectadas de forma está- vel com os constructos TetR-KRAB iCreBAC9b-GFP e TetR iCre- BAC9b-GFP foram contados e semeados em frascos T175 a 1 x 10 7 células por frasco em 25 ml de DMEM contendo 10% de FCS e 50 µg/ml de zeocina. Todos os frascos de células foram incubados duran- te a noite a 37 oC. No dia seguinte, a produção de vetor nas células foi induzida através da substituição do meio por DMEM fresco contendo 10% de FCS com 2 µg/ml de DOX e butirato de sódio 5 mM. Um fras- co de cada um dos dois pools estáveis foi deixado sem indução como controle negativo. As células de 1 frasco induzido e os controles não induzidos foram colhidas 72 horas após a adição de DOX. Outro frasco induzido de cada um dos pools estáveis foi colhido 96 horas após a adição de DOX.
[0225] Para obter o lisado das células induzidas e não induzidas, as células foram precipitadas por centrifugação em 1.300 rpm durante 10 minutos e colocadas novamente em suspensão em 2 ml de tampão de lise. As células foram então submetidas à lise por 3 x ciclos de con- gelamento em gelo seco mais etanol seguido de descongelamento a 37 oC. Os lisados foram clarificados através da centrifugação em 1.300 rpm durante 10 minutos, após o que os sobrenadantes foram removi- dos para novos tubos e os microgrânulos descartados. Transdução de células receptoras com lisados de produtores es- táveis
[0226] As células CHO, que são receptivas à transdução com AAV5, foram plaqueadas em uma placa de 96 cavidades em 8 x 103 células/cavidade (desenvolvendo em 200 μl por cavidade de DMEM contendo 10% de FCS, 1x Glutamax e 1x aminoácidos não essenci- ais). No dia seguinte, 20 µl de cada um dos lisados de células conten- do o rAAV5 e os lisados de controle negativo foram adicionados às cavidades de células CHO em duplicata. A placa de células CHO foi incubada durante 5 horas a 37 oC, após o que o meio contendo os li- sados foi aspirado das cavidades e substituído por meio fresco. A pla- ca foi então incubada a 37 oC durante mais 67 horas. O meio foi então aspirado das células CHO transduzidas e as células foram desagrega- das com 200 μl de solução de EDTA e foram então analisadas em um citômetro de fluxo Accuri C6 para medir o nível de fluorescência de GFP. A população de células vivas foi bloqueada em (FSC-A/SSC-A) e, em seguida, uma porta foi configurada para células individuais (FSC-A/FSC-H). Células CHO não transduzidas foram utilizadas para definir a fluorescência de linha de base (FL1-A/FSC-A) acima da qual as células poderiam ser consideradas GFP positivas. A porcentagem de células acima da linha de base de fluorescência foi calculada para cada uma das cavidades de células transduzidas. Nenhuma das célu- las transduzidas com lisados dos pools estáveis induzidos apresentou qualquer fluorescência GFP acima da linha de base. Análise de RNAseq de pools estáveis de células transfectadas com os constructos de BAC de AAV5
[0227] A fim de determinar se os constructos eram mecanicamente funcionais nas células, a análise de sequenciamento de RNA de todo o RNA poliadenilado de células induzidas e não induzidas por DOX foi comparada. Os pools de células HEK293T transfectadas de forma es- tável com os constructos TetRKRAB iCreBAC9b-GFP e TetR iCre- BAC9b-GFP foram contados, diluídos em DMEM contendo 10% de FBS para 3 x 105 células/ml, e cada um plaqueado em placas de 6 ca- vidades, 2 ml por cavidade. As placas foram incubadas durante a noite a 37 oC. No dia seguinte, 3 cavidades de cada pool estável foram in- duzidas mediante a mudança do meio para DMEM contendo 10% de FBS, 2 µg/ml de DOX e butirato de sódio 5 mM. O meio foi simples- mente substituído por DMEM + 10% FCS fresco nas 3 cavidades res- tantes de cada placa. As placas foram incubadas durante 5 dias a 37 o C após os quais as células não induzidas foram colhidas por desa- gregação com tripsina, colocadas em suspensão em 1 ml de meio e centrifugação a 300 x g para sedimentar as células. O meio foi aspira- do e os sedimentos celulares foram armazenados a -80 oC. O meio das células induzidas foi substituído por meio DMEM fresco contendo 10% de FBS, 2 µg/ml de DOX e butirato de sódio 5 mM e as placas foram incubadas durante mais 2 dias a 37 oC. Em seguida, as células induzidas também foram colhidas, precipitadas e armazenadas a -80 o C. A análise de seq de RNA foi executada em RNA poliadenilado ex- traído dos microgrênulos de células por GeneWiz utilizando um Illumi-
na. As leituras foram retornadas ao GSK onde foram alinhadas com as sequências de BAC utilizando o software IGV (dados não mostrados).
[0228] Os alinhamentos mostraram que TetR, TetR-KRAB e EGFP-fLuc, todos os quais estão sob o controle do promotor CMV constitutivo nos constructos, são, como esperado, expressos em célu- las HEK 293T induzidas por DOX e não induzidas. No entanto, os ali- nhamentos também mostraram que os ORFs expressos condicional- mente nos constructos: E2A, E4, iCre e rep2cap5, são, conforme pro- jetados, transcricionalmente ativados nas células induzidas por DOX, embora não pudessem ser detectados nas células não induzidas. O número de leituras alinhadas a esses ORFs no RNA das células indu- zidas por DOX foi substancialmente menor do que o número de leitu- ras que se alinham aos ORFs constitutivamente ativos. O fato de que esses transcritos não puderam ser detectados nas células não induzi- das confirma que a transcrição desses ORFs é bloqueada por TetR e por TetR-KRAB na ausência de DOX. Nenhuma leitura alinhada ao VA ORF no RNA de qualquer uma das células. Isso era esperado, uma vez que apenas o RNA poliadenilado foi purificado e VA, sendo ex- presso a partir de um promotor pol. III, não é poliadenilado. Tudo isso confirmou que os constructos eram mecanicamente funcionais em cé- lulas HEK 293T e que a falta de proteína Rep detectável ou vetor de transdução em células induzidas por DOX era provavelmente devido ao baixo nível de transcritos.
[0229] O número de transcrições por milhão (TPM) para cada um dos ORFs de constructo de BAC é mostrado abaixo na tabela 2 para ambos os microgrânulos estáveis, induzidos e não induzidos: Pool estável de BAC do AAV Pool estável de BAC do HEK293T TetR AAV HEK293T TetRKRAB Elemento Não induzido Induzido Não induzido Induzido de BAC TetR 3641,203 3813,955 4680,331 5103,172
Pool estável de BAC do AAV Pool estável de BAC do HEK293T TetR AAV HEK293T TetRKRAB Elemento Não induzido Induzido Não induzido Induzido de BAC Ad2 E2A 3,498 789,634 0,230 114,586 Ad2 E4 0,072 3,530 0,016 19,891 AAV 20,145 38,072 17,083 42,005 rep2/cap5 iCre 4,869 220,547 0,519 81,279 GFP-Luc 6200,196 3526,372 1637,245 1915,951
[0230] O número de leituras para a parte TetR dos constructos foi em torno de 3600 a 5100 por milhão de transcrições. Os transcritos EGFP-fLuc estavam presentes em níveis semelhantes aos de TetR.
[0231] Dos ORFs condicionalmente expressos, E2A é mais alta- mente induzida por DOX em células que expressam TetR. Em células não induzidas que expressam TetR ou TetR-KRAB, nenhum transcrito E2A pôde ser detectado. Isso significa que a proteína TetR otimizada por códon GSK padrão é suficiente para bloquear completamente a transcrição de genes a jusante do promotor CMVTO2 sob condições normais de crescimento e que a heterocromatinização extra do DNA circundante pelo domínio KRAB em TetR-KRAB não é necessária para aumentar a regulação negativa no caso deste gene. A indução da transcrição de E2A pela adição de DOX ao meio de crescimento celu- lar foi 6,89 x maior em células estavelmente transfectadas com o cons- tructo TetR do que com o constructo TetR-KRAB. É possível que isso se deva ao aumento da regulação negativa pelo domínio KRAB. O ge- ne iCre também foi expresso em níveis mais elevados (2,71 x) nas cé- lulas que expressam TetR induzidas do que nas células que expres- sam TetR-KRAB induzidas.
[0232] Os ORFs E4 e rep2cap5 foram expressos em níveis ainda mais baixos em ambos os pools estáveis.
[0233] Inversamente a E2A e iCre, o ORF E4 foi expresso mais altamente (5,65 x) em células induzidas por DOX que expressam
TetR-KRAB do que aquelas que expressam TetR. Uma hipótese é que ORF6 E4 é altamente tóxico para as células e que quando os cons- tructos de BAC são transfectados pela primeira vez nas células, há uma janela de tempo antes que a proteína TetR ou TetR-KRAB seja expressa em níveis suficientes e, durante a qual, os genes condicio- nalmente expressa a jusante do promotor CMVTO2 podem ser trans- critos e a proteína produzida. Devido à sua toxicidade, é possível que o ORF E4 seja selecionado em sentido oposto e apenas as células nas quais essa região do DNA foi silenciada ou dividida sobrevivam, resultando em células estáveis sem a região E4. É possível que as cé- lulas que expressam TetR-KRAB, que fornece uma regulação negativa mais rigorosa do que TetR isoladamente, sejam mais propensas a pa- rar a proteína de ORF6 E4 sendo produzida em um momento prece- dente do que células que expressam TetR, resultando em mais células sobreviventes com a região E4 intacta do BAC integrado em seu ge- noma. A fim de evitar que a região E4 do BAC seja selecionada em sentido oposto, pode ser necessário pré-transfectar as células com um RNA TetR / TetR-KRAB de modo que o promotor CMVTO2 de E4 seja ligado e a transcrição bloqueada assim que entra nas células.
[0234] Isso também mostrou que os transcritos de rep2cap5 au- mentam nas células induzidas. Os baixos níveis de transcritos rep ob- servados em células não induzidas foram porque, nas células HEK293, os promotores rep são constitutivamente ativos. Como os terminadores de transcrição a jusante de P19 ainda estão no lugar na ausência de DOX, esses transcritos representam os RNAs curtos pre- maturamente terminados. O aumento nas transcrições de rep2cap5 nos pools estáveis induzidos por DOX é devido à remoção dos termi- nadores de transcrição, permitindo que as transcrições prossigam por todo o ORF, embora seja provável que o número real de transcrições não aumente realmente. Este aumento no RNA rep2cap5 em células induzidas é a prova de que os níveis de iCre nas células induzidas são altos o suficiente para recombinar os sítios LoxP que flanqueiam os terminadores de transcrição.
[0235] Era possível que dentro de cada um dos pools estáveis, existissem células com um grande número de integrações que, se clo- nadas, seriam capazes de produzir níveis detectáveis de vetor AAV recombinante após indução de DOX. Construção de um rep/cap regulado por transposase
[0236] Constructos de BAC adicionais foram testados em que os terminadores de transcrição a jusante dos promotores rep são flan- queados por ITRs do transpóson e iCre é substituído por uma transpo- sase.
[0237] Foi relatado que é possível, por meio da mutação de 3 ami- noácidos na transposase da mariposa do repolho (Trichoplusia ni) utili- zados no sistema piggyBac, criar uma excisão + integração - fenótipo (Li et al., 2013 “PiggyBac transposase tools for genome engineering” PNAS 110: E2279-E2287). Isso significaria que a expressão da trans- posase através da adição de DOX às células transfectadas de forma estável com tal constructo resultaria em uma remoção irreversível dos terminadores de transcrição a jusante dos promotores rep, esperanço- samente resultando em uma maior expressão de Rep.
[0238] A transposase de Macdunnoughia crassisigna é 98,82% idêntica à de Trichoplusia ni. Yusa et al. (Yusa K et al “A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications, 2011, PNAS 108: 1531-1536) encontraram 7 substituições de aminoácidos (I30V, S103P, G165S, M282V, S509G, N538K, N571S) na transposase de Trichoplusia ni em um fonótipo hiperativo. Estas substituições foram aplicadas à sequência de aminoácido da transposase de M. crassisig- na. Adicionalmente, 3 substituições de aminoácido encontradas por Li et al. (2013, PNAS 110: E2279-E2287) para resultar em uma excisão + integração - fonótipo na transposase de Trichoplusia ni (R372A, K375A, D450N) também foram aplicadas à sequência de transposase de M. crassisigna. A sequência de aminoácido da transposase de M. crassisigna modificada é mostrada abaixo com substituições de fenóti- po hiperativas destacadas em vermelho e excisão + integração - subs- tituições de fenótipo destacadas em verde.
[0239] A sequência de aminoácido da transposase de M. crassi- signa modificada (SEQ ID NO: 1) é mostrada abaixo com substituições de fenótipo hiperativas sublinhadas e em negrito, e excisão + integra- ção - substituições de fenótipo em negrito itálico: Sbjct 1 MGSSINDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEVSDHVSEDDVQSDTEEAFIDEVHEVQPTSSG 60 Sbjct 61 SEILDEQNVIEQPGSSLASNRTLTLPQRTIRGKNKHCWSTSKPTRRSRVSALNIVRSQRG 120 Sbjct 121 PTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISEIVKWTNAEISLKRRESMTSATFRDTNEDEIYAFF 180 Sbjct 181 GILVMTAVRKDNHMSTDDLFDRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDV 240 Sbjct 241 FTPVRKIWDLFIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRVYIPNKPSKYGIKILMMCD 300 Sbjct 301 SGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDNWFTSIPLAKNLLQ 360 Sbjct 361 EPYKLTIVGTVASNAREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDGPLTLVSYKPKPAKMVYLLSSC 420 Sbjct 421 DEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGVDTLNQMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACIN 480 Sbjct 481 SFIIYSHNVSSKGEKVQSRKNFMRNLYMGLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNISNILPKEV 540 Sbjct 541 PGTSDDSTEEPVTKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF 594
[0240] Esta sequência de aminoácido foi convertida em uma se- quência de DNA otimizada por códons e sintetizada.
[0241] As ITRs do transpóson de M. crassisigna (EU287451) tam- bém foram sintetizadas.
[0242] Para gerar fragmentos de DNA para a clonagem dos termi- nadores de transcrição flanqueados por ITR do transpóson no íntron em rep, os iniciadores foram projetados (ver tabela 3) para amplificar por PCR todas as sequências do plasmídeo de expressão rep2cap5 interno de GSK pG2.AAV5.R2C5-íntron um fragmento de 9,15 kb com os iniciadores Int-3'ITR Gib F & Int-5'ITR Gib R. O fragmento de 2,72 kb contendo os terminadores de transcrição foi amplificado por PCR a partir de pUC57.Int-3A-Hyg utilizando os iniciadores 3xpA-5'ITR Gib F & 3xpA-3'ITR Gib R. A ITR do transpóson 5' de 349 pb foi amplificada a partir de pUC57.5'-ITR utilizando os iniciadores 5'ITR-Int Gib F &
5'ITR-3xpA Gib R. A ITR do transpóson 3' de 278 pb foi amplificada a partir de pUC57.3'-ITR usando os iniciadores 3'ITR-3xpA Gib F & 3'ITR-Int Gib R. Tabela 3. Sequências de iniciador Nome Sequência Int-3'ITR Gib F (SEQ ATATGATTATCTTTCTAGGGTTAAATCACTGAATCCGG- ID NO: 2) GAGCAC Int-5'ITR Gib R (SEQ CGCAGACTATCTTTCTAGGGTTAATTCTATGCCCAGCACG ID NO: 3) 5'ITR-Int Gib F (SEQ CGTGCTGGGCATAGAATTAACCCTAGAAAGATAGTCTGCG ID NO: 4) 5'ITR-3xpA Gib R ATTATGATCAGAAGATCTGGGATATCTATAACAAGAAAA- (SEQ ID NO: 5) TATATATATAATAAG 3xpA-5'ITR Gib F ATTTTCTTGTTATAGATATCCCAGATCTTCTGATCATAAT- (SEQ ID NO: 6) CAG 3xpA-3'ITR Gib R ATAAAGTAACAAAACTTTTAGGATCCCGAGCTTGGCACTG (SEQ ID NO: 7) 3'ITR-3xpA Gib CAGTGCCAAGCTCGGGATCCTAAAAGTTTTGTTACTTTA- F (SEQ ID NO: 8) TAGAAGAAATTTTGAG 3'ITR-Int Gib R (SEQ TCCCGGATTCAGTGATTTAACCCTAGAAAGATAATCATA- ID NO: 9 TTGTGAC PolyA-Transpose Gib TGTGCCAATCTTGCTTCTGAGAATTCACCCCACCAGTG- F (SEQ ID NO: 10) CAG CMVTO2-Transpose TCGTTGATAGACGAACCCATGGTGGCGGCCTTTG- Gib R (SEQ ID NO: CCAAAG 11) Todos os iniciadores foram encomendados da ThermoFisher Scientific. Os nucleotídeos sublinhados indicam uma saliência 5' incluída no iniciador para fornecer uma região de so- breposição no produto de PCR com a sequência que deveria ser montada adjacente na reação de clonagem de Gibson.
[0243] As PCRs para as 2 ITRs do transpóson e os terminadores de transcrição foram executados, seguidos pela amplificação do íntron pG2.AAV5.R2C5. As 2 ITRs do transpóson foram unidas de ambos os lados do fragmento do terminador de transcrição HygR 3 x pA através da sobreposição de PCR em primeiro lugar. Os fragmentos da 5'-ITR e dos terminadores de transcrição foram combinados em uma PCR utili-
zando os iniciadores 5'ITR-Int Gib F & 3xpA-3'ITR Gib R. Este frag- mento foi então combinado com o fragmento da ITR do transpóson 3' em uma PCR utilizando os iniciadores 5'ITR-Int Gib F e 3'ITR-Int Gib R.
[0244] Volumes iguais de 5 μl do fragmento 5’ITR-3xpA-HygR- 3’ITR e do fragmento pG2.AAV5.R2C5-íntron foram combinados e clo- nados utilizando NEBuilder HiFi DNA Assembly Mastermix.
[0245] A transposase de M. crassisigna foi clonada a jusante do promotor CMVTO2 como se segue.
[0246] Para gerar fragmentos de DNA para a clonagem da trans- posase de M. crassisigna a jusante do promotor CMV-TO2 e a mon- tante de um SV40 poliA, os iniciadores foram projetados para amplifi- car por PCR pG3.CMVTO2- como um fragmento de 4,25 kb. Os inicia- dores continham sobreposições com as extremidades da sequência de transposase.
[0247] Volumes iguais de 5 μl do fragmento pG3.CMVTO2 e do fragmento de transposase de M. crassisigna foram combinados e clo- nados utilizando NEBuilder HiFi DNA Assembly Mastermix. Teste do rep2cap5 regulado por transposase para produzir o ve- tor AAV funcional em células transitoriamente transfectadas
[0248] A fim de testar a capacidade da transposase em remover o transpóson recombinante inrep e iniciar a produção do vetor AAV, os componentes foram testados em transfecção transiente. Os frascos de células HEK 293 adaptadas à suspensão foram transfectados com plasmídeos como segue:
1. rep2/cap5 + plasmídeo auxiliar + plasmídeo de vetor de transferência EGFP
2. rep2/cap5-transpóson 3xpA + plasmídeo auxiliar + plas- mídeo de vetor de transferência EGFP
3. rep2/cap5-transpóson 3xpA + plasmídeo auxiliar + plas-
mídeo de vetor de transferência EGFP + transposase
4. rep2/cap5-LoxP 3xpA + plasmídeo auxiliar + plasmídeo de vetor de transferência EGFP
5. rep2/cap5-LoxP 3xpA + plasmídeo auxiliar + plasmídeo de vetor de transferência EGFP + iCre
6. plasmídeo auxiliar + plasmídeo de vetor de transferência
EGFP
7. células não transfectadas
[0249] O procedimento de transfecção foi como se segue.
[0250] As células HEK293Tsa foram semeadas em frascos agita- dores de cultura de 250 ml em 2 x 106 células por ml, 60 ml por frasco em meio BalanCD HEK293, 2% Glutamax, 0,1% Pluronic F-68. Os plasmídeos foram utilizados em uma relação molar de 1,6:1:1 de plasmídeo auxiliar para plasmídeo rep/cap para transferir o plasmídeo do vetor. Os plasmídeos foram adicionados em 6 ml de meio Opti- MEM contendo 58,5 μl de PEI Pro. As misturas de transfecção foram submetidas à vórtice e incubadas na temperatura ambiente durante 15 minutos antes de serem adicionadas aos frascos agitadores contendo as células. As células foram incubadas a 37 oC com agitação. No dia seguinte, butirato de sódio 1 M foi adicionado a cada frasco para uma concentração final de 5 mM.
[0251] Após 72 horas após a transfecção, as células foram precipi- tadas por centrifugação em 1.300 rpm durante 10 minutos e colocadas novamente em suspensão em 4 ml de tampão de lise. As células fo- ram submetidas à lise por 3 x ciclos de congelamento em gelo seco mais etanol seguido de descongelamento a 37 oC. A benzonase foi então adicionada aos lisados em 50 U/ml e os tubos incubados a 37 oC durante 30 minutos. O lisado foi então limpo por centrifugação em
1.300 rpm durante 10 minutos, após o que o sobrenadante foi colhido e o microgrânulo descartado.
[0252] As células CHO, que são receptivas à transdução com AAV5, foram semeadas em uma placa de 96 cavidades em 8 x 103 cé- lulas/cavidade (desenvolvendo em 200 μl por cavidade de DMEM con- tendo 10% FCS, 1x Glutamax e 1x aminoácidos não essenciais). No dia seguinte, 20 µl de cada um dos lisados de células contendo o rA- AV5 e os lisados de controle negativo foram adicionados às cavidades de células CHO em duplicata. A placa de células CHO foi incubada durante 5 horas a 37 oC, após o que, o meio contendo os lisados foi aspirado das cavidades e substituído por meio fresco. A placa foi en- tão incubada a 37 oC durante mais 67 horas. O meio foi então aspirado das células CHO transduzidas e as células foram desagregadas com 200 μl de solução de EDTA e foram então analisadas em um citômetro de fluxo para medir o nível de fluorescência de GFP. A população de células vivas foi bloqueada em (FSC-A/SSC-A) e, em seguida, uma porta foi configurada para células individuais (FSC-A/FSC-H). Células CHO não transduzidas foram utilizadas para definir a fluorescência de linha de base (FL1-A/FSC-A) acima da qual as células poderiam ser consideradas GFP positivas. A porcentagem de células acima da linha de base de fluorescência foi calculada para cada uma das cavidades de células transduzidas, a média e o desvio padrão foram então calcu- lados para cada uma das duplicatas. São mostrados na tabela 4: Tabela 4 - porcentagem de células acima da linha de base de fluores- cência Ad2 Auxiliar + rep2cap5 + transferência de EGFP 42,05 Ad2 Auxiliar + rep2cap5-transpóson + transferência de 0,535
EGFP Ad2 Auxiliar + rep2cap5-transpóson + transferência de 20,55 EGFP + transposase Ad2 Auxiliar + rep2cap5-loxP + transferência de EGFP 0,0235 Ad2 Auxiliar + rep2cap5-loxP + transferência de EGFP + 22,4 iCre Ad2 Auxiliar + transferência de EGFP 0,0395 Não transfectada 0
Comparação da transdução com rAAV produzido utilizando rep2/cap5 constitutivo, dependente da transposase e dependente de Cre
[0253] Estes dados mostram que, como esperado, as células transfectadas com o sistema de 3 plasmídeos padrão são capazes de produzir quantidades de vetor AAV5 recombinante, o suficiente para transduzir células receptoras para níveis elevados (~42%).
[0254] As células transfectadas com o plasmídeo de expressão rep/cap dependente de transpóson (pG2.AAV5.R2C5-íntron reversível 3x pA) juntamente com o plasmídeo auxiliar Ad2 e o vetor de transfe- rência de EGFP na ausência de um plasmídeo de expressão de trans- posase não produziram vetor recombinante para níveis capazes de produzir fluorescência detectável em células transduzidas. Isto mostra que, na ausência de transposase, este rep/cap recombinante é funcio- nalmente silencioso e deve-se aos terminadores da transcrição.
[0255] As células transfectadas com o plasmídeo de expressão rep/cap dependente do transpóson juntamente com o plasmídeo auxi- liar Ad2, o vetor de transferência EGFP e o plasmídeo de expressão da transposase de M. crassisigna (transposase pG3.CMVTO2-M. Crassisigna) produziram vetor recombinante suficiente para transduzir células receptoras em alto níveis (~20,6%). Isso foi comparável à quantidade de vetor recombinante produzido quando o plasmídeo de expressão rep/cap dependente de Cre (pG2.AAV5.R2C5-hCG íntron 3x pA HygR) foi cotransfectado com o plasmídeo auxiliar Ad2, o vetor de transferência EGFP e o plasmídeo de expressão iCre (pG3.CMVTO2-iCre) (22,4%), embora não tanto quanto as células transfectadas com o rep/cap não dependente da transposase padrão. Isto indica que este gene rep dependente da transposase é capaz de produzir o vetor AAV funcional. A menor quantidade de vetor produzi- da em comparação com o plasmídeo rep/cap não dependente da transposase pode ser devido a uma série de fatores. É possível que o atraso na expressão de Rep devido ao requisito para a transposase ser em primeiro lugar trasladada e as ITRs para recombinar, poderia resultar em rendimentos mais baixos de vetor. É possível que o nível de expressão da transposase nas células não fosse ideal e que a transfecção de células com uma quantidade maior do plasmídeo de expressão da transposase pudesse resultar em rendimentos de vetor mais elevados.
[0256] Estes dados mostram que o rep dependente da transposa- se é capaz de produzir o vetor AAV recombinante funcional na presen- ça da transposase. O rep dependente da transposase é funcionalmen- te silencioso quando não está ativado. Ao contrário do gene rep de- pendente de Cre, a remoção dos terminadores de transcrição com a transposase recombinante de excisão positiva/integração negativa não é reversível. Isso deve resultar em uma expressão mais estável da proteína Rep após a indução de células estáveis.

Claims (35)

REIVINDICAÇÕES
1. Célula produtora de vetor viral adenoassociado (AAV), caracterizada pelo fato de que compreende sequências de ácido nu- cleico que codificam: genes rep e cap de AAV, genes de vírus auxiliares e um genoma de DNA do vetor AAV; em que o gene rep de AAV compreende um íntron, dito ín- tron compreendendo uma sequência de terminação de transcrição com um primeiro sítio de recombinação localizado a montante e um segundo sítio de recombinação localizado a jusante da referida se- quência de terminação de transcrição; e em que as referidas sequências de ácido nucleico são to- das integradas entre si em um único lócus dentro do genoma da célula produtora de vetor AAV.
2. Célula produtora de vetor AAV de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada pelo fato de que o íntron ainda compreende um gene entre os sítios de recombinação, opcionalmente em que o gene é um gene marcador selecionável, ainda opcionalmente em que o mar- cador selecionável é higromicina.
3. Célula produtora de vetor AAV de acordo com a reivindi- cação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que ainda compreende a se- quência de ácido nucleico que codifica um gene da recombinase.
4. Célula produtora de vetor AAV de acordo com a reivindi- cação 3, caracterizada pelo fato de que as referidas sequências de ácido nucleico que codificam o gene da recombinase são integradas juntamente com as sequências de ácido nucleico que codificam os ge- nes rep e cap do AAV, os genes do vírus auxiliar e o genoma de DNA do vetor AAV em um único lócus dentro do genoma da célula produto- ra de vetor AAV.
5. Célula produtora de vetor AAV de acordo com a reivindi- cação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um sistema de controle da recombinase.
6. Célula produtora de vetor AAV de acordo com a reivindi- cação 5, caracterizada pelo fato de que o sistema de controle da re- combinase compreende um gene da recombinase sob o controle de um promotor induzível e/ou um domínio de ligação ao ligante do recep- tor de hormônio esteróide ligado de maneira operável à recombinase.
7. Célula produtora de vetor AAV de acordo com a reivindi- cação 6, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação ao ligan- te do receptor de hormônio esteróide é um domínio de ligação ao li- gante do receptor de estrogênio (ER), opcionalmente em que o ER é ERT2.
8. Célula produtora de vetor AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizada pelo fato de que o sítio de recombinação é um sítio LoxP e o gene recombinase é um gene cre recombinase, opcionalmente em que o gene cre recombinase é um gene cre recombinase otimizado por códons (icre).
9. Célula produtora de vetor AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizada pelo fato de que o sítio de recombinação é uma ITR de transpóson e o gene da recombinase é um gene da transposase, opcionalmente em que o gene da transposa- se é um gene da transposase otimizado por códon.
10. Célula produtora de vetor AAV de acordo com a reivin- dicação 9, caracterizada pelo fato de que a ITR de transpóson e o ge- ne da transposase são eucarióticos.
11. Célula produtora de vetor AAV de acordo com a reivin- dicação 10, caracterizada pelo fato de que a ITR de transpóson e a transposase são derivadas de Trcihoplusia ni (T. ni), Macdunnoghia crassisigna (M. crassisigna), Bactrocera minuta, Eumeta japonica ou
Helicoverpa armigera.
12. Célula produtora de vetor AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que um ou mais dos genes do vírus auxiliar estão sob controle transcricional.
13. Célula produtora de vetor AAV de acordo com a reivin- dicação 6 ou 12, caracterizada pelo fato de que o promotor induzível ou controle transcricional, respectivamente, compreende um promotor pCMV-TO2.
14. Célula produtora de vetor AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um isolador, opcionalmente em que o isolador está presente entre cada uma das sequências de ácido nucleico.
15. Célula produtora de vetor AAV de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um marcador selecionável, opcionalmente em que o marcador selecionável é um marcador de seleção amplificável.
16. Vetor de ácido nucleico compreendendo uma origem de replicação de não mamífero e a capacidade de conter pelo menos 25 quilobases (kb) de DNA, caracterizado pelo fato de que dito vetor de áci- do nucleico compreende sequências de ácido nucleico que codificam: genes rep e cap de AAV; genes de vírus auxiliares; e um genoma de DNA de um vetor AAV; em que o gene rep compreende um íntron, dito íntron com- preendendo uma sequência de terminação de transcrição com um primeiro sítio de recombinação localizado a montante e um segundo sítio de recombinação localizado a jusante da sequência de termina- ção de transcrição; e em que as sequências de ácido nucleico que codificam os genes rep e cap de AAV, cada um dos genes do vírus auxiliar e do ge-
noma de DNA do vetor AAV são dispostos como cassetes de expres- são individuais dentro do vetor de ácido nucleico.
17. Vetor de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o íntron ainda compreende um gene entre os sítios de recombinação, opcionalmente em que o gene é um gene marcador selecionável, ainda opcionalmente em que o marcador selecionável é higromicina.
18. Vetor de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que ainda compreende sequên- cias de ácido nucleico que codificam um gene da recombinase, dispos- to como um cassete de expressão individual dentro do vetor de ácido nucleico.
19. Vetor de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que ainda com- preende um elemento de controle da recombinase.
20. Vetor de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o elemento de controle da recombi- nase compreende um promotor induzível ligado de maneira operável a um gene da recombinase e/ou um domínio de ligação ao ligante do receptor de hormônio esteróide fundido ao gene da recombinase.
21. Vetor de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao ligante do receptor de hormônio esteróide é um domínio de ligação do ligante do receptor de estrogênio (ER), opcionalmente em que o ER é ERT2.
22. Vetor de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o ER está ligado de maneira operá- vel a montante e a jusante do gene da recombinase.
23. Vetor de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de que o sítio de recombinação é um sítio LoxP e o gene recombinase é um gene cre recombinase, opcionalmente em que o gene cre recombinase é um gene cre recombinase otimizado por códons (icre).
24. Vetor de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de que o sítio de recombinação é uma ITR do transpóson e o gene da recombinase é um gene da transposase, opcionalmente em que o gene da transposa- se é um gene da transposase otimizado por códon.
25. Vetor de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a ITR do transpóson e o gene da transposase são eucarióticos.
26. Vetor de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a ITR do transpóson e o gene da transposase são derivados de Trcihoplusia ni (T. ni), Macdunnoghia crassisigna (M. crassisigna), Bactrocera minuta, Eumeta japonica ou Helicoverpa armigera.
27. Vetor de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 26, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos genes de vírus auxiliares estão sob controle transcricional como um cassete de expressão individual.
28. Vetor de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 27, caracterizado pelo fato de que ainda com- preende um isolador, opcionalmente em que o isolador está presente entre cada um dos cassetes de expressão.
29. Vetor de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 28, caracterizado pelo fato de que ainda com- preende um marcador selecionável, opcionalmente em que o marca- dor selecionável é um marcador de seleção amplificável.
30. Vetor de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 29, caracterizado pelo fato de que o vetor é selecionado de um de: um cromossomo artificial bacteriano, um cro-
mossomo artificial de levedura, um cromossomo artificial derivado de P1, um fosmídeo ou um cosmídeo.
31. Método de produção de uma linhagem celular produtora de vetor AAV estável, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) a introdução do vetor de ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 30 em uma cultura de célu- las hospedeiras de mamífero; e (b) a seleção dentro da cultura de uma célula hospedeira de mamífero que possui as sequências de ácido nucleico codificadas no vetor integradas em um cromossomo endógeno da célula hospedeira de mamífero.
32. Célula produtora de vetor AAV, caracterizada pelo fato de que é obtida pelo método como definido na reivindicação 31.
33. Método de produção de um vetor AAV com defeito de replicação, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) a introdução do vetor de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 30 em uma cultura de células hospedeiras de mamífero; e (b) a seleção dentro da cultura de uma célula hospedeira de mamífero que possui as sequências de ácido nucleico codificadas no vetor integradas em um cromossomo endógeno da célula hospedeira de mamífero; e (c) o cultivo adicional da célula hospedeira de mamífero se- lecionada sob condições nas quais o vetor AAV com defeito de repli- cação é produzido.
34. Vetor AAV com defeito de replicação, caracterizado pe- lo fato de que é obtido pelo método como definido na reivindicação 33.
35. Método de acordo com a reivindicação 31 ou 33, carac- terizado pelo fato de que a célula hospedeira de mamífero é uma célu- la HEK293.
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