CN116262934B - 转录单元及制备空壳腺相关病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及转录单元及制备空壳腺相关病毒的方法。本发明提供的转录单元包括启动子和AAV病毒的Cap基因，为真核生物PolII启动子或原核生物启动子中的任意一种。本发明通过对Cap转录单元进行改造，从而提高空壳腺相关病毒产量。
Description
本申请要求于2021年12月15日提交中国专利局、申请号为202111533735.7、发明名称为“转录单元及制备空壳腺相关病毒的方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及转录单元及制备空壳腺相关病毒的方法。
背景技术
腺相关病毒AAV(adeno-associate virus)隶属于细小病毒科依赖病毒属，是一种最小、最简单的动物病毒，最初是作为腺病毒污染物而被发现并得名。AAV是无包膜的单链线状DNA病毒，其基因组约4.7kb，两末端为反向末端重复序列，衣壳由三个亚基VP1，VP2和VP3按1:1:10比例组成二十面体结构。野生型AAV的VP1，VP2和VP3的转录是由位于Rep蛋白上的P40启动子介导的，3个蛋白的表达由相同的转录本前体通过不同的剪切方式，形成两种成熟的RNA，一种表达VP1蛋白，一种表达VP2和VP3蛋白。AAV具有非整合、无致病性、携带的治疗基因表达时间长、靶向性好等特点，因此被广泛应用于遗传性疾病的临床治疗中。针对不同疾病已进行了接近300例基于AAV病毒载体的临床试验并取得了突破性的进展，目前已有三种AAV病毒载体介导的基因治疗新药Glybera(AAV1)、Luxturna(AAV2)和Zolgensma(AAV9)获得商业化批准，AAV基因疗法的巨大成功开创了单基因疾病治疗的新时代，同时也极大地鼓舞了人们攻克“疑难杂症”的信心。
目前，常规的AAV重组病毒包装体系主要由四部分构成：1)不同血清型Rep-Cap基因表达质粒，载体结构类似于野生型AAV病毒基因组，无ITR结构，Rep基因由P5启动子启动子介导表达，而Cap基因的表达依赖于Rep蛋白对P40启动子的激活；2)包装辅助质粒，提供病毒包装所需的辅助基因，如E2A、E4、VA等；3)AAV表达载体，仅包含外源基因表达盒及两端的ITR结构，可作为AAV基因组被衣壳包裹组装形成重组AAV；4)包装细胞系HEK293T，该细胞基因组中整合了部分5型血清型腺病毒基因组，为AAV重组病毒的包装提供辅助支持。与其他病毒相比，在培养细胞中进行重组AAV病毒包装具有一个显著的特征，即会不可避免地产生大量特殊的空壳病毒(50％～90％)，且不同血清型、不同包装方法对AAV病毒空壳率的影响也是非常显著的。这些空壳病毒由AAV病毒的三种衣壳蛋白(VP1～3)构成，不包含携带治疗基因的AAV病毒基因组，故不仅无法为疾病治疗带来益处，反而会引起机体针对AAV病毒载体自身产生更强的体液免疫及T细胞免疫应答，从而导致毒副作用及部分治疗效果丧失。因此，在GMP等级的AAV病毒制备中，常常对AAV空壳率提出了严格的要求，现阶段主要利用密度梯度离心方法对实心AAV病毒进行纯化回收，可将空壳率降低至20％以下。
在临床试验中，常常需要设立各种对照以排除各种不利因素对实验组药物安全性及有效性进行客观评估的影响。在临床高剂量给药的情况下，衣壳蛋白是AAV基因治疗中引起机体免疫原性和细胞毒性的主要成分，因此，为了充分评估AAV衣壳蛋白对疗效的影响，设立空壳病毒对照便显得尤其重要。目前，AAV空壳病毒的获得主要依靠两种途径，其一是将常规包装的AAV病毒进行密度梯度离心，收集空壳病毒所在的条带，其二是将AAV病毒的衣壳蛋白基因Cap克隆到腺病毒载体或杆状病毒载体上，利用腺病毒或杆状病毒来生产AAV空壳病毒。第一种方法所得到的AAV空壳包含一定比例的实心或半实心AAV病毒。第二种方法获得AAV空壳常伴有腺病毒或杆状病毒的污染，这些方法均无法有效获得高纯度的空壳AAV病毒。因此，进一步开发空壳腺相关病毒的方法对于评估疗效具有非常重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供转录单元及更高效制备空壳腺相关病毒的方法。
本发明提供的转录单元，包括启动子和Cap基因；
所述Cap基因为AAV病毒的Cap基因；
所述启动子选自真核生物Pol II启动子或原核生物启动子中的任意一种。
AAV病毒的Cap基因通过选择性剪接和翻译起始，分别产生三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。本发明对表达Cap基因的载体中的Cap转录单元进行改造，从而提高空壳腺相关病毒产量。
本发明中，所述启动子为EF1A、CMV、hPGK、SV40、CBh、TRE、SFFV或EFS中的任意一种。
本发明中，所述AAV病毒的血清型为AAV 1、AAV 2、AAV 3、AAV 4、AAV 5、AAV 6、AAV6.2、AAV 7、AAV 8、AAV 9或AAV rh10或它们的衍生变体。
本发明中，所述启动子和Cap基因中间还包括Rep基因的内含子。
所述Rep基因的内含子中包括剪接供体位点的序列。
本发明中，所述剪接供体位点的序列为U1 snRNA识别结合的保守序列。
一些实施例中，所述剪接供体位点的序列为GTAAGTAA(SEQ ID NO:1)。
一些具体实施例中，所述Rep基因的内含子的序列为GTAAGTAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAG(SEQ ID NO:2)。
本发明所述的转录单元的3’端还包括终止子。
本发明中，所述终止子为任意能起到终止转录作用的元件，一些实施例中，所述终止子选自SV40终止子、hGH终止子、BGH终止子或rbGlob终止子中至少一种。
本发明还提供了一种表达载体，其包括本发明所述的转录单元。
一些实施例中，所述表达载体依次包括如下元件：origin元件、抗性筛选标记、本发明所述的转录单元。
本发明所述表达载体的构建方法包括，将Cap基因表达载体上的Cap基因启动子替换为真核生物Pol II启动子或原核生物启动子中的任意一种。
一些实施例中，所述构建方法还包括将其Rep内含子的剪接供体周边序列突变为snRNA识别结合的保守序列。
本发明还提供了一种质粒组合，其包括：包装辅助质粒和所述的表达载体。本发明中所述包装辅助质粒为phelper质粒。
采用本发明提供的表达载体在转染宿主时，可以不采用被包装质粒。
本发明还提供了一种宿主，其为转化或转染有本发明所述的表达载体或所述质粒组合的细胞。
本发明所述细胞为动物细胞、真菌细胞或原核生物细胞。
一些实施例中，所述动物细胞为293T细胞。
本发明所述宿主的构建方法，包括将所述的表达载体经转化或转染入宿主细胞。
本发明所述转录单元、表达载体或所述宿主在制备空壳腺相关病毒中的应用。
本发明还提供了一种空壳腺相关病毒的制备方法，其包括培养所述宿主后，获得含有空壳腺相关病毒的培养液。
一些实施例中，所述培养液经纯化获得空壳腺相关病毒，所述纯化的方法为密度梯度离心或柱纯化。本发明中，所述密度梯度离心采用氯化铯法或碘克沙醇法。
本发明所述制备方法制得的空壳腺相关病毒。
本发明提供的转录单元包括启动子和AAV病毒的Cap基因，为真核生物PolII启动子或原核生物启动子中的任意一种。本发明通过对Cap转录单元进行改造，从而提高空壳腺相关病毒产量。实验表明，采用本发明提供的转录单元构建表达载体后，转染宿主细胞，能够获得大量空壳腺相关病毒。
附图说明
图1示现有Cap基因表达载体示意图；
图2示本发明Rep-Cap表达载体图谱；
图3示不同转染组合WB检测；
图4示制备获得的AAV空壳形态；
图5示不同启动子均可正常表达AAV空壳蛋白。
具体实施方式
本发明提供了转录单元及制备空壳腺相关病毒的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中，所述转录单元(transcription unit)是一段以启动子开始至终止子结束的DNA序列。本发明所述的转录单元是AAV病毒Cap基因的转录单元。
启动子(Promoters)是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。在本发明提供的转录单元中，启动子由原P40启动子替换为真核生物PolII启动子或原核生物启动子，从而提高Cap基因的表达量。本发明中，所述原核启动子可以是常用于进行体外转录的T7启动子，例如来自T7噬菌体的启动子。本发明中，所述PolII启动子选自EF1A、CMV、hPGK、SV40、CBh、SFFV、TRE、EFS中至少一种。本发明所述的PolII启动子来自于人类或病毒基因组，例如EF1A，hPGK和EFS来源于人；CMV来源于人巨细胞病毒；SV40来源于猿猴病毒；SFFV来源于脾脏病灶形成病毒；CBh和TRE是合成型启动子，本发明实施例中，以CMV启动子为例启动Cap基因的表达。具体实施例中，采用的CMV启动子核酸序列的GenBank登录号为X03922.1。此外，就EF1A、hPGK、SV40、CBh、SFFV、TRE、EFS进行初步验证，结果表明以这些启动子构建转录单元后制备空壳腺相关病毒也能取得良好效果,总产量都可达到150μg以上，与未经改造的载体进行表达获得空壳腺相关病毒的量存在显著性差异，p<0.05。
本发明所述转录单元中，所述Cap基因为来自AAV病毒的Cap基因。实验表明，本发明提供的转录单元构建入表达载体，能够实现多种AAV血清型空壳腺相关病毒的构建。本发明中，所述AAV病毒的血清型为AAV 1、AAV 2、AAV 3、AAV 4、AAV 5、AAV 6、AAV 6.2、AAV 7、AAV 8、AAV 9或AAV rh10或它们的衍生变体。其中，
AAV1的Cap基因的GenBank登录号为AF063497.1，
AAV 2的Cap基因的GenBank登录号为AF043303.1，
AAV 3的Cap基因的GenBank登录号为AF028705.1，
AAV 4的Cap基因的GenBank登录号为AF028705.1，
AAV 5的Cap基因的GenBank登录号为Y18065.1，
AAV 6的Cap基因的GenBank登录号为AF028704.1，
AAV 6.2的Cap基因的GenBank登录号为EU368910.1，
AAV 7的Cap基因的GenBank登录号为AF513851，
AAV 8的Cap基因的GenBank登录号为AF513852，
AAV 9的Cap基因的GenBank登录号为AY530579.1，
AAV rh10的Cap基因的GenBank登录号为AY243015.1。
剪接供体位点(donor splicing site)又称donor位点，其位于所述启动子和Cap基因中间的Rep内含子内部。本发明对其进行改造。提高前体RNA(pre-mRNA)与小核RNA(snRNA)的结合能力，进而增强衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3)mRNA水平的剪接，在不影响各蛋白间的最优比例(1：1：10)的情况下提高了衣壳蛋白的表达水平，进而大幅提高了AAV空壳病毒的产量。一些实施例中，所述剪接供体位点的序列如SEQ ID NO:1所示。一些实施例中，所述转录单元包括顺序连接的：CMV启动子、Rep内含子和AAV Cap基因。
本发明中，所述的表达载体以真核生物或原核生物的质粒载体为骨架，其中包括本发明所述的转录单元。本发明实施例中，所述表达载体在常规的Rep-Cap表达载体的基础上进行改造。所述常规的Rep-Cap表达载体包括Rep和Cap基因，Cap基因的表达受Rep蛋白的调控。
本发明所述的宿主中转化或转染有本发明所述的表达载体。本发明中，所述表达载体可以单独转化入宿主以作为扩大培养或质粒保存的目的。也可与包装辅助质粒共同转染入宿主，以作为生产AAV空壳病毒的宿主细胞。本发明中，所述表达载体与包装辅助质粒共同转染入宿主细胞，经过培养获得AAV空壳病毒。所述宿主细胞可为动物细胞，真菌细胞或原核生物细胞。一些实施例中，所述宿主细胞为动物细胞，所述宿主细胞为人源细胞。一些具体实施例中，所述宿主细胞为HEK293T细胞或Sf9细胞。
具体的，在本发明中，为了规避现有空壳病毒生产所面临的存在其他非预期病毒杂质、纯化操作繁琐等缺点，建立一种更为直接、快速、高效的AAV空壳病毒包装系统，本专利构建了一种腺相关病毒衣壳蛋白Cap表达载体(见图1)，该载体与常规Rep-Cap表达载体(见图2)在结构上的主要不同之处在于：1)将原始AAV病毒Cap基因的启动子P40替换为真核生物PolII启动子(能够在HEK293T细胞具有转录活性，如CMV启动子)或原核生物启动子如T7启动子(可通过体外转录出RNA后转染HEK293T细胞)，该载体只表达Cap衣壳蛋白，不表达Rep蛋白；2)进一步优化Cap基因上游的剪接供体位点周边序列，提高前体RNA(pre-mRNA)与小核RNA(snRNA)的结合能力，进而增强衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3)mRNA水平的剪接，在不影响各蛋白间的最优比例(1：1：10)的情况下提高了衣壳蛋白的表达水平，进而大幅提高了AAV空壳病毒的产量。将Cap基因表达载体和AAV病毒包装辅助质粒共转染到HEK293T细胞中，48小时后离心收集细胞并进行裂解以释放AAV空壳病毒，然后使用氯化铯或碘克沙醇梯度离心或是柱纯化的方法进一步纯化获得AAV空壳病毒。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
为了建立一种直接、快速、高效的AAV空壳病毒包装方法，采用本发明的Cap基因表达载体和常规的Rep-Cap表达载体(P5-rep-P40-cap2)进行比较，在蛋白水平对Cap基因的表达进行western blot检测。实验流程如下：
1.Cap基因表达载体CMV-AAV2 cap的构建
(1)AbsI+HindIII酶切Rep-Cap表达质粒P5-rep-P40-cap2(购自Addgene，货号为104963)，回收包含原始剪接供体位点的3’Rep序列及Cap序列的骨架大片段；
(2)以CMV为模板(GenBank:X03922.1)，设计引物PCR扩增并回收CMV启动子片段：
AbsI-CMV-F attgggtaccgggccccccctcgagtcgcgatgtacgggccagatata
HindIII-CMV-R tgtctgcgtagttgatcgaagcttgggtctccctatagtgagtcgta
(3)将PCR产物与骨架大片段进行Gibson反应；
(4)将Gibson反应产物转化到VB UltraStable感受态细胞中；
(5)挑单克隆PCR鉴定。
2.质粒的转染
(1)按照表1将同一组别的质粒利用转染试剂共转染到1瓶T175的HEK293T细胞中；
表1生产空壳AAV病毒的不同质粒转染组合
3.样品的收集和检测
(1)48小时后离心收集细胞，每瓶细胞加入2ml裂解液进行重悬用于WB检测。
(2)将重悬液反复冻融3次，离心收集上清，取1mL病毒上清进行留样，得到未超滤样品；
(3)剩余1mL病毒上清使用100kDa超滤管进行超滤一次(10min)，超滤到样品剩余100ul以下；
(4)加入裂解液补充到1ml进行混合得到超滤截留样品；
(5)将未超滤样品和截留样品进行SDS-PAGE电泳，对照为232.61ng的利用杆状病毒生产的AAV2空壳病毒；
(6)将电泳完成后的PAGE胶转PVDF膜，与一抗Anti-AAV孵育；
(7)接着使用二抗Goat anti-mouse(货号：碧云天A0216)孵育；
(8)清洗拍照(图3)，检测分析游离VP1、VP2、VP3蛋白大小是否分别为87kDa、73kDa、62kDa。
由图3可知，各转染组实验中，组1和组2相比，被包装质粒的加入提高了Cap衣壳蛋白的表达，其中由于组1和组2的VP1和VP2由于产量过低检测不出目的条带。组3和组4细胞样品中三种蛋白的整体表达量要比组1和组2细胞样品高约20倍，且不会受到是否加入被包装质粒的干扰。这说明与常规Rep-Cap表达载体相比，利用本专利构建的Cap基因表达载体与辅助质粒共转染细胞可获得高产量的衣壳蛋白。另外，各组超滤与未超滤样品的蛋白产量基本一致，说超滤的方法能够很好地截留衣壳蛋白，达到部分纯化衣壳蛋白的目的。
实施例2
比较不同的方法生产空壳腺相关病毒的产量。
1、按照表2将以下组别质粒利用转染试剂共转染到3个细胞工厂(货号：耐思771302)的HEK293T细胞。
表2实验分组
| 生产方法 | 辅助载体 | Rep-Cap表达载体 | Cap表达载体 | 包装细胞 | 细胞量 |
| 直接分离法 | phelper | P5-rep-P40-cap2 | / | 293T | 3.6×109 |
| 杆状病毒法 | / | PH-rep-P10-cap2 | / | Sf9 | 3.6×109 |
| 本发明方法 | phelper | / | CMV-AAV2 cap | 293T | 1.8×109 |
2、48h后离心收集细胞沉淀，并使用PBS进行重悬，将重悬液反复冻融3次以裂解释放空壳腺相关病毒颗粒形成AAV病毒悬液；
3、按顺序在离心管底部加入氯化铯溶液：2mL 1.25g/cm3氯化铯溶液、2.5mL1.35g/cm3氯化铯溶液、1.5mL 1.5g/cm3氯化铯溶液，并在离心管外侧用笔比划上每个氯化铯的梯度分界面；
4、缓慢在离心管上面加入4-6mLAAV病毒悬液，超速离心：4℃，2h，40,000rpm，使得空病毒颗粒与细胞碎片、杂蛋白等分离。
5、离心完成后，可在1.35g/cm3氯化铯溶液分界面和1.5g/cm3氯化铯溶液分界面之间观察到明显的白色条带，即为空的腺相关病毒颗粒；
6、收集该条带，并使用100kDa浓缩超滤管和置换溶液PBS进一步超滤，收集获得浓缩的空壳腺相关病毒；
7、使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：碧云天P0012S)对空壳病毒进行浓度测定。结果如表3：
表3实验结果
| 生产方法 | 空壳腺相关病毒总产量 | 单细胞产量 |
| 直接分离法 | 31.429μg | 8.73fg |
| 杆状病毒法 | 92.38μg | 25.66fg |
| 本发明方法 | 184.41μg | 102.44fg |
结果：三种空壳AAV生产方法进行比较，产量如表3所示，其中本发明方法获得的空壳腺相关病毒产量最佳，与其他各组存在显著性差异。
实施例3
针对AAV2、AAV8和AAV9血清型构建优化型Cap基因，将Cap基因上游Rep内含子中的剪接供体位点周边序列突变为snRNA识别结合的保守序列(Rep内含子序列如SEQ ID NO:2所示)，构建不同的Cap基因表达载体生产空壳腺相关病毒。
1、3种优化型Cap基因表达载体的构建(CMV-AAV2 cap-mt、CMV-AAV8cap-mt、CMV-AAV9 cap-mt)
1)HindIII+BamHI酶切Cap基因表达载体CMV-AAV2 cap，回收包含CMV的骨架大片段；
2)分别以常规的AAV2、8、9的Rep-Cap表达载体为模板，设计引物两轮PCR扩增带入包含snRNA识别结合保守序列的AAV2、8、9Cap PCR产物；
HindIII-Rep2-F：attaatacgactcactatagggagacccaagcttcgatcaactacgcagacaggtaagtaaacaaatg
Cap2-R：cagagaccaaagttcaactgaaacgaattaaacggtttattgattaacaagcaattacagattacgagtcaggtatctg
Cap8-R：cagagaccaaagttcaactgaaacgaattaaacggtttattgattaacaagcaattacagattacgggtgaggtaacg
Cap9-R：cagagaccaaagttcaactgaaacgaattaaacggtttattgattaacaagcaattacagattacgagtcaggtatctg
BamHI-R：ggcggccgttactagtggatcctagagcatggaaactagataagaaagaaatacgcagagaccaaagttcaactgaaacg
3)将PCR产物与骨架大片段进行Gibson反应；
4)Gibson反应产物转化到VB UltraStable感受态细胞中；
5)挑单克隆PCR鉴定。
2、将4种不同的Cap基因表达载体分别转染3个细胞工厂，48h后离心收集细胞沉淀，并使用PBS进行重悬，将重悬液反复冻融3次以裂解释放空壳腺相关病毒颗粒形成AAV病毒悬液；
3、将碘克沙醇用10mL注射器依次由低浓度到高浓度(15％～60％)加入离心管中，用记号笔标记每一层碘克沙醇的位置；
4、用注射器缓慢滴加AAV病毒悬液，69000rpm，18℃离心1h；
5、离心后，取出离心管，收集碘克沙醇40％与60％之间界面的液体，使用100kDa浓缩超滤管和置换溶液PBS进一步超滤，收集获得浓缩的空壳腺相关病毒；
5、使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：碧云天P0012S)对空壳病毒进行浓度测定。
6、SDS-PAGE电泳检测空壳病毒，结果如表4。
表4空壳病毒产量
| AAV血清型 | Cap表达载体 | 293T包装细胞量 | 空壳腺相关病毒总产量 |
| AAV2 | CMV-Cap2 | 3.6×109 | 150.25μg |
| AAV2 | CMV-AAV2 cap-mt | 3.6×109 | 565.98μg |
| AAV8 | CMV-AAV8 cap-mt | 3.6×109 | 2653.29μg |
| AAV9 | CMV-AAV9 cap-mt | 3.6×109 | 1206.21μg |
结果表4所示，把剪接供体位点周边序列突变为snRNA识别结合的保守序列，AAV2血清型的空壳产量提升了接近4倍，效果显著，p<0.05。其他两种血清的空壳病毒产量也非常高，相对于为改造的载体进行表达的量而言存在显著性差异，p<0.05。通过负染TEM电镜观察AAV空壳形态(图4)，病毒颗粒完整且与预期空壳状态符合。
实施例4
测试不同的启动子生产空壳腺相关病毒的能力。
1、分别使用EF1A(Nucl Acids Res.18:5322(1990)；PLoS One.5:e10611(2010))、CBh(Hum Gene Ther.22:1143(2011))、SFFV(J Virol.69:7541(1995)；Hum Gene Ther.13: 803(2002))、EFS(Nat Methods.11:783(2014))、SV40(Nature.290:304(1981)；PLoS One.5:e10611(2010))、hPGK(PLoS One.4:e5046(2009))等真核生物Pol II启动子构建AAV空壳表达载体；
2、以CMV-AAV2 cap骨架为模板，将骨架中的CMV启动子依次替换为上述1的启动子，获得7个AAV空壳表达载体；
3、按表5组别，将同一组别的质粒利用转染试剂共转染到1个10cm的HEK293T细胞中；
表5质粒转染试剂
4、转染48h后，收集细胞，每组细胞4℃、4000rpm离心10分钟，弃上清；然后使用1mlPBS重悬，取100ul，4℃、4000rpm离心5分钟，弃上清，加入1ml RIPA裂解液，吹打混匀后4℃、4000rpm离心5分钟，收取上清蛋白质；
5、测定蛋白浓度后，取20ug进行western blot检测Cap基因的表达情况，并以AAV2病毒作为阳性对照(组别10)；
结果：上述启动子均可正常表达AAV空壳蛋白，产量大于P40启动子(组9)，部分启动子的产量甚至高于CMV启动子。
利用本专利设计的载体可平行生产出不同血清型的空壳腺相关病毒，只需简单置换不同血清型的Cap基因序列即可生产出不同血清的空壳AAV，具有广谱适用性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 云舟生物科技（广州）有限公司
<120> 转录单元及制备空壳腺相关病毒的方法
<130> MP22012778
<150> 202111533735.7
<151> 2021-12-15
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtaagtaa 8
<210> 2
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtaagtaaac aaatgttctc gtcacgtggg catgaatctg atgctgtttc cctgcagaca 60
atgcgagaga atgaatcaga attcaaatat ctgcttcact cacggacaga aagactgttt 120
agagtgcttt cccgtgtcag aatctcaacc cgtttctgtc gtcaaaaagg cgtatcagaa 180
actgtgctac attcatcata tcatgggaaa ggtgccagac gcttgcactg cctgcgatct 240
ggtcaatgtg gatttggatg actgcatctt tgaacaataa atgatttaaa tcag 294
Claims (8)
1.转录单元，其特征在于，由启动子和Cap基因组成；
所述Cap基因为AAV病毒的Cap基因；
所述启动子和Cap基因中间还包括Rep基因的内含子，所述Rep基因的内含子包括剪接供体位点，所述剪接供体位点的序列为snRNA识别结合的保守序列；所述剪接供体位点的序列如SEQ ID NO:1所示；所述Rep基因的内含子的序列如SEQ ID NO:2所示；
所述启动子选自真核生物Pol II启动子或原核生物启动子中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的转录单元，其特征在于，
所述启动子为EF1A、CMV、hPGK、SV40、CBh、TRE、SFFV或EFS中的任意一种；
所述AAV病毒的血清型为AAV 1、AAV 2、AAV 3、AAV 4、AAV 5、AAV 6、AAV 6.2、AAV 7、AAV 8、AAV 9或AAV rh10。
3.根据权利要求2所述的转录单元，其特征在于，所述的转录单元的3’端还包括终止子。
4.表达载体，其特征在于，包括权利要求1~3任一项所述的转录单元。
5.质粒组合，其特征在于，包括：包装辅助质粒和权利要求4所述的表达载体。
6.宿主，其特征在于，其为转化或转染有权利要求4所述的表达载体或权利要求5所述质粒组合的细胞。
7.权利要求1~3任一项所述的转录单元、权利要求4所述的表达载体或权利要求6所述宿主在制备空壳腺相关病毒中的应用。
8.一种空壳腺相关病毒的制备方法，其特征在于，培养权利要求6所述宿主后，获得含有空壳腺相关病毒的培养液。
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| WO2017108931A1 (en) * | 2015-12-22 | 2017-06-29 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Improved hybrid dual recombinant aav vector systems for gene therapy |
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
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| High-titer, wild-type free recombinant adeno-associated virus vector production using intron-containing helper plasmids;L Cao 等;J Virol.;第74卷(第24期);参见摘要 * |
| Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells;Haifeng Chen等;Mol Ther.;第16卷(第5期);参见摘要 * |
| Manufacturing of adeno-associated viruses, for example: AAV2;Haifeng Chen;Methods Mol Biol.;第737卷;参见摘要 * |
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