CN116411024A - 用于生产重组腺相关病毒的质粒系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于生产重组腺相关病毒的质粒系统,其包含含有填充序列的转基因质粒。具体而言,本发明提供含有源自λ噬菌体的填充序列的转基因质粒和包含所述转基因质粒的三质粒系统。本发明还提供所述转基因质粒的构建方法,以及使用所述转基因质粒或所述三质粒系统降低产生的rAAV产品中质粒DNA残留量的方法。
Description
技术领域
本发明属于基因治疗领域。具体而言,本发明涉及用于生产重组腺相关病毒(Recombinant Adeno-associated virus,rAAV)的质粒系统,特别是三质粒系统,其包含含有填充序列的转基因质粒,所述填充序列源自噬菌体,例如λ噬菌体。本发明的质粒系统在用于生产rAAV时,能够降低rAAV产品中残留的来自质粒系统的质粒DNA的含量,特别是错包质粒DNA的残留量。
背景技术
基因治疗是指使用基因修复的方法治疗人类疾病,其通过将外源基因递送到患者体内适当的受体细胞中进行,例如可以引入一个缺陷基因的健康拷贝或纠正一个突变基因,从而恢复对应基因的正常生物学功能。
大多数基因治疗利用病毒或非病毒作为载体来递送外源转基因。作为可使用的病毒载体,主要有慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒(AAV)载体。腺相关病毒(AAV)载体由于其安全性高、免疫原性低、稳定性高、特异性强、宿主细胞范围广、在体内表达外源基因时间长等优势,已被公认为治疗基因体内递送的主要载体。腺相关病毒载体的规模化放大生产是基于重组腺相关病毒(rAAV)的基因治疗的重要技术基础。
为了生产用于治疗的rAAV载体,当前主要采用三质粒体系瞬时共转染宿主工程细胞如HEK293细胞来实现。三质粒体系中包括如下三个质粒:转基因质粒,其中含有转基因和AAV反向末端重复序列(ITR);包装质粒(AAV-RC),其中含有AAV包装所需的AAV复制(rep)和衣壳(cap)基因;以及辅助质粒(pHelper),其中包括AAV复制必不可少的辅助病毒如腺病毒的元件。
在使用三质粒瞬时转染法时,收获的含有AAV的细胞培养液需经物理或化学方法裂解细胞来释放AAV和消化核酸,再经过多步工艺步骤进行捕获AAV、除杂、精纯,最终灌装成制剂。收获的病毒样品一般需要进行多步工艺步骤,从包含rAAV载体颗粒的产物中去除与产品和生产过程有关的杂质,这些杂质包括宿主细胞蛋白(HCP)残余物、质粒DNA残余物和病毒空壳。与质粒DNA残余物相关的杂质包括来自三种质粒的质粒骨架DNA,当它们错包至病毒衣壳中时,这些残余物会对治疗成分造成污染,导致不想要的副作用,例如诱发肿瘤或发生遗传毒性,并且由于包装在衣壳之中,这些残余物较难通过后续工艺去除。
在传统载体生产工艺中,主要通过优化工艺步骤来降低AAV载体生产中的质粒DNA残留,例如通过在病毒收获液中补加全能核酸酶并在适当温度孵育以降解不想要的残留DNA,再进行离子交换层析等纯化步骤来捕获AAV样品。然而,上述方法存在一些问题,包括难以去除包装在病毒衣壳内部的质粒DNA残留。另外,在质粒DNA残留较高的情况下,这些方法也难以达到预期目标,引入的核酸酶还需要通过多步额外工艺步骤去除,且工艺可重复性需经过验证,进一步增加了额外的工艺步骤和生产成本。
因此,仍然需要开发更为便捷、通用的制备高纯度AAV载体的三质粒系统和方法。
发明内容
发明人发现,通过在转基因质粒的两个ITR之外,即从5’ITR上游到3’ITR下游之间插入源自噬菌体的填充序列,从而使转基因质粒的大小达到特定水平,可以有效阻止质粒骨架DNA包装到AAV衣壳中,实现降低错包到衣壳中的质粒DNA的目的。同时由于噬菌体的感染具有宿主特异性,其只会感染特定宿主菌,对于哺乳动物(例如,人)体内的细胞是安全的。在rAAV的生产中引入源自噬菌体的序列时,即使有可能产生外源序列残留,对于人的免疫系统也更为安全。具体而言,发明人使用包含源自λ噬菌体的填充序列的转基因质粒生产AAV病毒颗粒时,能够使收获的AAV病毒颗粒中错包质粒DNA的量降低约3倍~13倍,根据不同血清型,最低可将质粒DNA残留降低至1.00E+09个拷贝/E12 vg以下,由此完成了本发明。
因此,第一方面,本发明提供用于生产AAV的三质粒系统的转基因质粒,其包含转基因和填充序列,所述填充序列为源自λ噬菌体(Lambda phage)基因组的核苷酸序列。
在优选的实施方案中,所述填充序列在所述转基因质粒中位于5’ITR上游和3’ITR下游之间。
在优选的实施方案中,所述转基因质粒包含自互补ITR(self-complementaryITRs;scITR),且所述填充序列的长度至少为2300bp,例如2300-5000bp,优选2500-5000bp。在另一个优选的实施方案中所述转基因质粒包含单链ITR(single strand ITRs;ssITR),且所述填充序列的长度至少为4700bp,例如4700-7000bp,优选5000-7000bp。
在优选的实施方案中,所述填充序列在rAAV载体的生产细胞中不具有生物学活性。
第二方面,本发明提供产生腺相关病毒(AAV)病毒颗粒的质粒系统,其中包括:
(1)第一方面的转基因质粒;
(2)包含AAV Rep和Cap基因的包装质粒(AAV-RC plasmid);和
(3)AAV辅助质粒(Helper plasmid),
其中在所述转基因质粒包含填充序列,所述填充序列为源自λ噬菌体基因组的核苷酸序列。
第三方面,本发明提供含有第一方面的转基因质粒或第二方面的质粒系统的宿主细胞。
第四方面,本发明提供使用第三方面的宿主细胞产生的rAAV载体。
第五方面,本发明提供一种降低rAAV载体生产中质粒DNA杂质的方法,所述方法包括在包含转基因的转基因质粒中插入填充序列,所述填充序列源自λ噬菌体的核苷酸序列。
第六方面,本发明提供源自λ噬菌体基因组的核苷酸序列作为填充序列的用途,所述填充序列用于插入到用于生产AAV载体的三质粒系统的转基因质粒中,从而降低使用所述三质粒系统生产的AAV载体产品中的错包质粒DNA残留的水平。
在第五和第六方面的优选实施方案中,将所述填充序列插入到所述转基因质粒中使其位于5’ITR上游和3’ITR下游之间。
在第五和第六方面的优选实施方案中,所述转基因质粒包含自互补ITR(self-complementary ITRs;scITR),且所述填充序列的长度至少为2300bp,例如2300-5000bp,优选2500-5000bp,更优选3000-5000bp。在另一个优选的实施方案中所述转基因质粒包含单链ITR(single strand ITRs;ssITR),且所述填充序列的长度至少为4700bp,例如4700-7000bp,优选5000-7000bp。
在第五和第六方面的优选实施方案中,所述填充序列在rAAV载体的生产细胞中不具有生物学活性。
在第五和第六方面的具体实施方案中,所述填充序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1(λ1)或SEQ ID NO:2(λ2)所示。
附图说明
图1为本发明构建的以报告基因(通过2A肽连接的荧光素酶报告基因(Luc)编码序列和绿色荧光蛋白基因(GFP)编码序列)作为转基因的腺相关病毒转基因质粒(K103-GFP)的质粒示意图。
图2为本发明构建的以报告基因为转基因且包含源自λ噬菌体的片段2(λ2)作为填充序列的腺相关病毒转基因质粒(λ2-GFP)的质粒示意图。
图3为本发明构建的以SMN1(Survival Motor Neuron 1,运动神经元存活基因1)编码序列为转基因的腺相关病毒转基因质粒(K103-SMN)的质粒示意图。
图4为本发明构建的以SMN1编码序列为转基因且包含源自λ噬菌体的片段1(λ1)作为填充序列的腺相关病毒质粒载体(λ1-SMN)的质粒示意图。
图5为本发明构建的以SMN1编码序列为转基因且包含源自λ噬菌体的片段2(λ2)作为填充序列的腺相关病毒质粒载体(λ2-SMN)的质粒示意图。
图6为K103-GFP、λ2-GFP质粒与不同包装质粒组合用于生产AAV载体时,获得的AAV载体样品经AC后的AAV基因组滴度的统计图。“AC”代表亲和层析。
图7为K103-GFP、λ2-GFP质粒与不同包装质粒组合用于生产AAV载体时,获得的AAV载体样品中质粒DNA残留量检测值的直方图。
图8为λ2-GFP质粒与不同包装质粒组合用于生产AAV载体时,与不含填充序列λ2的K103-GFP质粒相比,获得的AAV载体样品中质粒DNA残留降低的倍数的直方图。
图9为使用K103-SMN、λ1-SMN、λ2-SMN质粒所获得的病毒颗粒在通过亲和层析(AC)纯化后,AAV基因组滴度的直方图。
图10为使用K103-SMN、λ1-SMN、λ2-SMN质粒所获得的病毒颗粒中,质粒DNA残留量检测值的直方图。
图11为与不插入填充序列的K103-SMN质粒相比,使用λ1-SMN、λ2-SMN质粒获得的AAV载体样品中,质粒DNA残留量降低的倍数的直方图。
具体实施方式
定义
“AAV”指腺相关病毒,也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒,需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。AAV基因组中包含位于两个末端的“反向重复序列(ITR)”之间的cap和rep基因。AAV能感染多种细胞,包括人的细胞。rep基因产物存在时,病毒DNA很容易整合到人类第19号染色体。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。“rep基因”指AAV基因组中的rep基因,由4个重叠基因Rep78、Rep68、Rep52和Rep40组成,其可产生四种不同的复制蛋白,参与病毒的复制、包装和整合。“cap基因”指AAV基因组中的衣壳蛋白(capsid)编码基因,其可产生VP1、VP2、VP3三种不同的衣壳蛋白。
“rAAV”指重组腺相关病毒。在rAAV中,通常将转基因置于两个ITR之间,替换天然AAV中的rep基因和cap基因。在本申请的上下文中,除非另有说明,“rAAV载体”“rAAV病毒粒子”和“rAAV病毒颗粒”具有相同的含义,是指包含包裹在rAAV衣壳中的载体基因组的病毒颗粒。
“重组腺相关病毒产品”“rAAV产品”“rAAV病毒产品”与“rAAV病毒载体的产品”以相同意义使用,指包含rAAV载体的产品,如组合物、制剂,其包括生产过程中的中间产物和终产品。
“ssAAV”是指单链腺相关病毒载体。“scAAV”是指自互补腺相关病毒载体。
“转基因”指像一个生物体中引入的来自另一个生物的外源基因。在本发明的上下文中,转基因由rAAV递送。转基因可以是编码序列或非编码序列。本发明中的转基因的实例如治疗基因和/或报告基因。
“错误包装质粒DNA”或“错包质粒DNA”在本文的上下文中指被包装到rAAV病毒颗粒中的非rAAV的质粒DNA,包括来自宿主细胞的DNA、来自质粒的DNA。
“宿主细胞DNA”或“HCD”指可能出现于生物制品中的来自宿主细胞的DNA片段。如来自生产病毒的宿主细胞的DNA。
“质粒DNA”是所有来自包装rAAV所用的多种质粒的DNA的统称,所述多种质粒通常为两种或三种。在本发明的具体实施方案中,采用三质粒系统包装rAAV。
“质粒DNA残留”或“质粒DNA杂质”是指三质粒共转染细胞并在细胞内组装成rAAV后,产生的错误包装到病毒内的质粒DNA分子。
“转基因质粒”指AAV的三质粒生产系统中包含转基因的质粒。
“包装质粒”指AAV的三质粒生产系统中包含rep和cap基因的质粒。
“辅助质粒”指AAV的三质粒生产系统中包含辅助病毒元件的质粒。
“填充序列”指插入到用于生产AAV的三质粒系统的转基因质粒中以显著增加质粒大小的外源核苷酸序列。
“工程细胞株”、“工程细胞系”或“工程细胞”在本文中可互换使用,指适用于批量生产细胞产品如表达蛋白的稳定细胞株,特别指适用于腺相关病毒转染的细胞株,可以是经过基因工程处理的,也可以是未经基因工程处理的。
“核酸分子”包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
“核酸酶”指能够通过切割核酸分子中核苷酸之间的磷酸二酯键的酶。“DNA酶”或“DNase”指能够消化DNA的核酸酶。“全能核酸酶”指能够降解DNA和RNA的核酸酶。
“λ噬菌体”指埃希氏菌属病毒Lambda(Escherichia virus Lambda),也称为肠杆菌属噬菌体λ(Enterobacteria phageλ),其感染大肠杆菌。λ噬菌体基因组如NCBI GenBank登录号J02459.1所示。
“SMN1”指运动神经元存活基因1(Survival Motor Neurons gene 1)。在人体内,编码SMN1的SMN1基因异常会导致脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy,SMA)。在同一染色体上的SMN2基因与SMN1基因的序列高度相似。SMN基因会影响SMA的严重程度。
填充序列和三质粒AAV生产系统
本发明通过将来自λ噬菌体(Lambda phage)基因组的核苷酸序列作为填充序列插入用于生产AAV的三质粒系统的转基因质粒中,实现了降低生产的AAV载体中质粒DNA残留量的效果。
噬菌体(bacteriophage)是一种感染细菌和古细菌的病毒,字面意思是“吃细菌的病毒”。在感染细菌的过程中,噬菌体通过特异性识别并结合细菌表面的受体吸附并侵入宿主细菌,借由细菌的细胞机构进行噬菌体遗传物质的复制并组装成子代噬菌体,最终裂解细菌并释放子代。因此,噬菌体对细菌的感染可导致细菌的裂解死亡。对宿主细菌细胞表面受体的特异性识别使得噬菌体有严格的宿主特异性,不会感染宿主之外的细胞,如人体细胞。近年,美国FDA同意了静脉注射的噬菌体临床试验,也说明了噬菌体对于人体是相对安全的。例如,本文中具体使用的λ噬菌体主要感染大肠杆菌,将源自λ噬菌体的核酸序列作为填充序列插入质粒骨架,其在功能上是沉默的,并且即使可能发生残留,在理论上对人体免疫系统而言也是安全的。
作为本发明的填充序列,所述填充序列源自噬菌体的基因组,优选λ噬菌体的基因组,并且具有至少2300bp的长度,可以在2300至7000bp之间。具体而言,填充序列的长度与AAV的类型为ssAAV和scAAV中的哪一种有关。当所述转基因质粒包含自互补ITR(self-complementary ITRs;scITR),即所述AAV为scAAV时,所述填充序列的长度优选至少为2300bp,优选3000-5000bp。当所述转基因质粒包含单链ITR(single strand ITRs;ssITR),即所述AAV为ssAAV时,所述填充序列的长度至少为4700bp,优选5000-7000bp。因此,在最优选的实施方案中,填充序列的长度为5000bp左右,这个长度可以同时适用于ssAAV和scAAV而无需额外调整。
作为本发明的优选实施方式,选择源自λ噬菌体基因组的填充序列。λ噬菌体基因组的核苷酸序列是本领域已知的,其可从公共数据库获得,例如如NCBI GenBank登录号J02459.1所示,总长度为48502bp。在从λ噬菌体基因组的全序列截取填充序列时,可以包含λ噬菌体基因的编码序列。
在优选的实施方案中,所述填充序列在rAAV载体的生产细胞中不具有生物学活性。在优选的实施方案中,所述填充序列在计划使用rAAV载体的受试者体内不具有生物学活性。“不具有生物学活性”意味着所述填充序列除了以本身长度扩充了质粒骨架尺寸的结构性功能之外,不具有提供任何生物学活性的功能。例如,所述填充序列不包含所述转基因质粒中的转基因编码序列、来源于腺相关病毒和腺病毒的基因编码序列、多聚腺苷酸(polyA)和抗生素抗性基因。所述来源于腺相关病毒和腺病毒的基因编码序列为包装质粒(AAV-RC)中的AAV复制蛋白Rep和衣壳蛋白Cap的编码序列,和AAV辅助质粒(Helper)中的腺病毒元件E2A/B、E4 orf 6和VA的编码序列。例如,所述转基因是治疗基因和/或报告基因。所述填充序列包含噬菌体基因的编码序列的部分片段,即不包含任何噬菌体基因的完整编码序列。
在具体的实施方案中,本发明的填充序列为5000bp并且具有如SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示的核苷酸序列。然而,本领域技术人员应该理解的是,也可以使用从λ噬菌体基因组或其他噬菌体基因组截取的类似长度的序列,只要其也符合上述限定条件并且是在rAAV载体的生产细胞中不具有生物学活性的序列即可。
本发明的填充序列也可以是天然λ噬菌体基因组片段的变体,例如包含一个或多个核苷酸的取代、添加、删除和/或截短等修饰的变体,只要经修饰后的核苷酸序列长度符合本发明的限定,且在rAAV载体的生产细胞中不具有生物学活性即可。在一个实施方案中,所述填充序列是与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少约50%序列同一性、至少约60%序列同一性、至少约70%序列同一性、至少约80%序列同一性、至少约85%序列同一性、至少约90%序列同一性、至少约95%序列同一性的核苷酸序列,并且在rAAV载体的生产细胞中不具有生物学活性。
在将填充序列插入到转基因质粒中时,优选将其插入到两个ITR之外。“ITR之外”意味着其属于质粒骨架的一部分,而不属于会包装到AAV载体产品中的AAV基因组的一部分。例如,转基因在转基因质粒中会位于两个ITR之内。换言之,所述填充序列在所述转基因质粒中位于5’ITR上游和3’ITR下游之间的位置。填充序列的插入不应破坏质粒上其他元件例如复制起始位点、抗生素抗性基因的功能。
在一个实施方案中,所述填充序列位于5’ITR和复制起始位点之间。在一个实施方案中,所述填充序列位于5’ITR和抗生素抗性基因之间。在转基因质粒中,复制起始位点和抗生素抗性基因的位置可以互换。抗生素抗性基因可以是本领域常规使用的抗生素抗性基因。在一个实施方案中,所述填充序列可以被拆分为两个或更多个片段,插入转基因质粒中的不同位置,所述位置可以选自如上所述的任意位置。
插入填充序列的方法可以通过本领域常规的基因工程方法完成。例如,可以以含有目的核苷酸序列如填充序列的质粒为模板通过同源重组等常规分子克隆方式将填充序列插入预定的位置。随着技术的发展,也考虑到可以在设计好质粒结构之后,使用合成技术来合成整个质粒,虽然在这种情况下可能不包含“插入”的步骤,但也应将通过这种方法获得的质粒视为本发明的一部分。
转基因质粒还包括转基因,其位于两个ITR之内。本发明不限制转基因的类型,其可以是基因编码序列或非编码序列。例如,转基因可以是治疗基因和/或报告基因。所述治疗基因编码具有治疗活性的产物。例如,所述治疗基因编码的蛋白可以用于替代疗法(replacement therapy)中以治疗因所述蛋白缺陷而导致的疾病。在作为基因编码序列时,可以编码一个或多个目标产物。在编码超过一个目标产物时,其间可以通过可裂解接头连接,例如2A肽,如E2A、P2A、T2A、F2A。对转基因的长度没有特殊限定,可以为本领域适用的那些。例如,转基因的长度优选符合AAV的包装能力。对于ssAAV而言,两个ITR之间包含转基因的序列优选不超过4.7kb。对于scAAV而言,两个ITR之间包含转基因的序列优选不超过2.3kb。
除了转基因质粒之外,三质粒系统还包含包装质粒(反式提供具有AAV复制和包装功能的蛋白Rep和Cap)和辅助质粒(提供腺相关病毒Ad5的重要元件E2A/B、E4 orf 6、VA)。
在本发明的三质粒系统中,除了包含填充序列的转基因质粒,还包含生产AAV所需的包装质粒和辅助质粒。可以使用任何合适的包装质粒和辅助质粒。
包装质粒中包含的cap基因可以为编码任意AAV血清型衣壳蛋白的cap基因。AAV血清型指AAV的抗血清类型。目前已发现数十种不同衣壳蛋白的AAV,不同的AAV具有不同的衣壳蛋白空间结构、序列和组织特异性,因而其识别与结合的细胞表面受体也相应地有很大差别,因此它们在体内产生不同的抗血清类型。示例性的AAV血清型包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV12、AAVrh10、AAV-PHP.eB、AAV-PSP.S、AAV-DJ、AAVDJ/8、AAVDJ/9、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.3.1。在优选的实施方案中,AAV血清型可以选自下组:AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9。
包装质粒中包含的rep基因可以源自不同血清型的AAV。在优选的实施方案中,rep基因是AAV2血清型的rep基因。
当包装质粒包含来自AAV x血清型的rep基因和来自AAV y血清型的cap基因时,通常将其表示为AAVx/y。例如,当包装质粒包含来自AAV2血清型的rep基因和来自AAV血清型1的cap基因时,可将其表示为AAV2/1。相应地,可使用的包装质粒可以为AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8、AAV2/9。
辅助质粒为AAV包装提供所需的来自辅助病毒,通常为腺病毒(Adenovirus,缩写为“Ad”)的基因产物,因此辅助质粒通常包括Ad的E1A/B、E2A/B、E4 orf 6、VA基因中的一种或多种。作为常用的Ad可列举Ad5和Ad2,优选Ad5。辅助质粒中包含的基因可能取决于生产细胞的类型。例如在使用HEK293细胞作为生产细胞时,由于HEK293细胞包含E1A和E1B,则可以使用仅含E2A、E4 orf 6和VA基因的辅助质粒。
本发明可以使用常用的腺相关病毒工程细胞株作为生产细胞,例如HEK293细胞系(293细胞系)、Sf9细胞系,优选HEK293细胞系。在示例性实施方案中,使用包含本发明的转基因质粒的三质粒体系瞬时共转染HEK293细胞,例如悬浮培养的HEK293细胞,由此来生产AAV载体。
在本发明中,除了转基因质粒中必需包括的填充序列之外,AAV生产体系特别是各个质粒的具体结构可能进行多种变化,例如具体的元件类型、AAV的血清型、具体的转基因等。本发明意图将这些内容纳入本发明的保护范围。
在采用不同的元件类型、AAV血清型、转基因的组合时,rAAV的生产效率可能不同。所述生产效率可以通过生产获得的病毒颗粒量来体现。正确包装的病毒颗粒的量可以通过测量正确包装的病毒基因组的滴度来测定,病毒基因组的滴度即含有基因组DNA的病毒数量。所述测定可以使用Real-tme PCR(qPCR)、DNA斑点杂交、数字PCR或本领域已知的任何合适的方法,通过测定病毒基因组核酸的拷贝数来确定。优选在测定之前去除病毒之外的其他核酸物质,例如通过核酸酶去除,从而确保对正确包装的基因组核酸的准确测定。在本发明中,含有填充序列的质粒与不含有填充序列的对应质粒相比,可能会有更高或更低的rAAV生产效率,例如获得更高或更低的病毒基因组滴度。优选地,使用本发明的含有填充序列的转基因质粒进行生产时,能够获得理想的病毒生产效率,例如与不含填充序列但其他条件相同时具有相当的病毒生产效率。
质粒DNA残留量的降低
rAAV的生产主要包括质粒制备、生产细胞扩增、用质粒转染生产细胞、病毒载体生产、病毒载体纯化、制剂灌装等步骤。最终产品中的rAAV是包装了重组病毒基因组的病毒颗粒。受限于生产工艺,终产品的病毒颗粒中会存在一些不应被包装在内的重组病毒基因组之外的核酸,终产品中还会在病毒颗粒之外存在游离的核酸,这些核酸都会影响产品质量,可统称为杂质DNA。
根据杂质DNA所处的位置和状态,将其分为两大类。将错误包装在病毒颗粒内部的目标重组病毒基因组之外的杂质DNA统称为“错误包装DNA”或“错包DNA”,将处于病毒颗粒之外的杂质DNA统称为“游离DNA”。相较于游离DNA,错包DNA被包装到病毒衣壳中,会更难去除。根据杂质DNA的来源,也将其分为两大类。将来源于生产细胞的DNA称为“宿主细胞DNA”或“HCD”,将来源于质粒的DNA称为质粒DNA。
本发明的包含填充序列的转基因质粒能够降低rAAV载体产品中的错包质粒DNA。
在本发明中,对宿主细胞DNA残留例如质粒DNA残留的定量检测优选使用Real-time PCR(qPCR)进行。Real-time PCR在PCR扩增过程中通过荧光信号对PCR进程进行实时检测,也可称为荧光定量PCR。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。
在一些实施方案中,杂质质粒DNA的含量用重量表示,例如以ng表示。在一些实施方案中,杂质质粒DNA的含量用摩尔表示,例如以nM表示。在一些实施方案中,杂质质粒DNA的含量以拷贝数表示。杂质质粒DNA的含量也可以相对于rAAV病毒基因组的含量表示,例如以杂质质粒DNA的拷贝数相对于rAAV病毒基因组(vector genome;vg)的拷贝数表示。
为了检验质粒DNA杂质,可以针对待检测质粒中所特有的序列设计探针和引物。可以为三个质粒分别设计探针和引物,也可以针对三质粒系统中三个质粒所共有的部分设计探针和引物,例如针对抗生素抗性基因设计了探针和引物。
为了准确检验错包质粒DNA,可以在检测前加入核酸酶对rAAV载体产品中存在的游离核酸进行消化。所述核酸酶可以是任何能够降解DNA的酶,例如DNase I、全能核酸酶如Benzonase、TurboNuclease。
在优选的实施方案中,当使用包含本发明的填充序列的转基因质粒进行AAV载体生产时,相较于使用不含所述填充序列的转基因质粒但其他条件均相同的情况而言,能够使错包质粒DNA的量(例如拷贝数)降低至少50%,优选至少75%,更优选降低约90%(即大约一个数量级),或降低更多。
在优选的实施方案中,当使用包含本发明的填充序列的转基因质粒进行AAV载体生产时,能将错包质粒DNA降低至约1E+10个拷贝/E12 vg或更低,优选降低至约5E+09个拷贝/E12 vg或更低,更优选降低至约1E+09个拷贝/E12 vg或更低,还更优选降低至约8E+08个拷贝/E12 vg或更低。本领域技术人员能够理解,在实际生产中,错包质粒DNA的最终水平会因生产体系中采用的不同具体条件而有所变化。
在优选的实施方案中,当使用包含本发明的填充序列的转基因质粒进行AAV载体生产时,相较于使用不含所述填充序列的转基因质粒但其他条件均相同的情况而言,不显著影响AAV载体产品的病毒基因组滴度。
本发明包含如下各段的具体实施方案。
第一组实施方案涉及一种产生rAAV载体的质粒系统,包括:
a)转基因质粒,其包含填充序列和转基因序列,
b)包装质粒,其包含编码AAV复制蛋白Rep和衣壳蛋白Cap的核苷酸序列;和
c)AAV辅助质粒,其包含腺病毒5的E2A、E4、VA基因序列;
其中所述填充序列的核苷酸序列源自λ噬菌体基因组并且长度为2.3kb~7.0kb。
在所述质粒系统的优选实施方案中,其中所述填充序列在rAAV载体的生产细胞中不具有生物学活性。
在所述质粒系统的优选实施方案中,其中所述填充序列不包含任何噬菌体基因的完整编码序列。
在所述质粒系统的优选实施方案中,所述填充序列包含来自λ噬菌体基因组的核苷酸序列或由其组成。
在所述质粒系统的优选实施方案中,所述填充序列为SEQ ID No:1或SEQ ID No:2所示的核苷酸序列,或与SEQ ID No:1或SEQ ID No:2具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性并且在rAAV载体的生产细胞中不具有生物学活性的核苷酸序列。
在所述质粒系统的优选实施方案中,其中所述转基因质粒包含选自下组的一种或多种元件:增强子、启动子、转基因、ITR、抗生素抗性基因、ori、多聚腺苷酸环化序列(polyA)和内含子。
在所述质粒系统的优选实施方案中,所述填充序列位于5’ITR上游和3’ITR下游之间的位置。例如,所述填充序列位于5’ITR上游与抗生素抗性基因之间、3’ITR下游与复制起始位点之间和/或复制起始位点与抗生素抗性基因之间。
在所述质粒系统的优选实施方案中,所述ITR为ssITR,且转基因质粒的填充序列核苷酸序列长度为4.7~7.0kb。
在所述质粒系统的另一个优选实施方案中,其中所述ITR为scITR,且转基因质粒的填充序列的核苷酸序列长度为2.3~5.0kb。
在所述质粒系统的另一个优选实施方案中,其中所述启动子为磷酸甘油酸酯激酶基因来源的哺乳动物启动子(PGK1)、人类巨细胞病毒来源的强哺乳动物表达启动子(CMV)、CMV增强子融合的鸡β-肌动蛋白启动子(CβA)、β-肌动蛋白基因来源的哺乳动物启动子(human beta actin)、人延长因子1ɑ来源的强哺乳动物表达启动子(EF-1α)、强杂交哺乳动物启动子(CAG)、人类泛素C基因来源的哺乳动物启动子(Ubc),优选为人类巨细胞病毒来源的强哺乳动物表达启动子(CMV)、人延长因子1ɑ来源的强哺乳动物表达启动子(EF-1α)、CMV增强子融合的鸡β-肌动蛋白启动子(CβA),更优选为人类巨细胞病毒来源的强哺乳动物表达启动子(CMV)、或人延长因子1ɑ来源的强哺乳动物表达启动子(EF-1α)。
在所述质粒系统的具体实施方案中,其中所述转基因质粒具有图2、图4或图5所示的结构,其中作为转基因序列的报告基因(GFP gene、luciferase reporter gene)和SMN1基因能够被其他转基因的核苷酸序列置换。
在所述质粒系统的具体实施方案中,所述转基因为编码绿色荧光蛋白基因、荧光素酶报告基因、脊髓性肌萎缩致病基因的核苷酸序列。
在所述质粒系统的具体实施方案中,所述Rep来自AAV2血清型。
在所述质粒系统的具体实施方案中,与Rep的血清型独立地,所述Cap来自AAV血清型2、5、6、8或9,优选来自AAV血清型2、8或9。
在所述质粒系统的具体实施方案中,所述质粒系统包含:
a)转基因质粒,其包含位于两个ITR之外的填充序列和位于两个ITR之间的转基因序列,其中所述填充序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示;
b)包装质粒,其包含编码AAV复制蛋白Rep和衣壳蛋白Cap的核苷酸序列,其中所述Rep来自AAV血清型2,所述Cap来自AAV血清型2、8或9;和
c)AAV辅助质粒,其包含腺病毒5的E2A、E4、VA基因序列。
在所述质粒系统的具体实施方案中,所述质粒系统选自如下各组:
(1)转基因质粒为λ2-GFP,包装质粒为pAAV2/2,辅助质粒为pHelper-1;
(2)转基因质粒为λ2-GFP,包装质粒为pAAV2/8,辅助质粒为pHelper-1;
(3)转基因质粒为λ2-GFP,包装质粒为pAAV2/9,辅助质粒为pHelper-1;
(4)转基因质粒为λ1-SMN,包装质粒为pAAV2/9,辅助质粒为pHelper-1;或
(5)转基因质粒为λ2-SMN,包装质粒为pAAV2/9,辅助质粒为pHelper-1。
在所述质粒系统的具体实施方案中,其中所述转基因质粒为如图2所示的λ2-GFP、如图4所示的λ1-SMN、如图5所示的λ2-SMN,其中Luc-GFP和SMN1编码区基因序列能够被其他转基因序列替换。
所述包装质粒包含如下元件:复制起始位点、启动子、AAV衣壳蛋白Cap的编码序列、AAV复制蛋白Rep的编码序列、抗生素抗性基因。所述抗生素抗性基因可以为氨苄西林或硫酸卡那霉素抗性基因。所述AAV复制蛋白Rep优选来自AAV血清型2,且所述AAV衣壳蛋白Cap优选来自AAV血清型2(pAAV2/2)、血清型8(pAAV2/8)或血清型9(pAAV2/9)。
所述pHelper-1质粒包含如下元件:复制起始位点、抗生素抗性基因、VA编码序列、E4编码序列、E2A编码序列。所述抗生素抗性基因可以为硫酸卡那霉素抗性基因。
第二组实施方案涉及一种在生产rAAV载体的三质粒系统中使用的转基因质粒,其包含填充序列和转基因序列,其中所述填充序列的核苷酸序列源自噬菌体基因组并且长度为2.3kb~7.0kb。
在所述转基因质粒的优选实施方案中,所述转基因质粒无噬菌体活性。
在所述转基因质粒的优选实施方案中,所述填充序列在rAAV载体的生产细胞中不具有生物学活性。
在所述转基因质粒的优选实施方案中,所述填充序列包含来自λ噬菌体基因组的核酸序列。
在所述转基因质粒的优选实施方案中,其中所述填充序列为SEQ ID No:1或SEQID No:2所示的核苷酸序列,或与SEQ ID No:1或SEQ ID No:2具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性并且在rAAV载体的生产细胞中不具有生物学活性的核苷酸序列。
在所述转基因质粒的优选实施方案中,所述转基因质粒包含选自下组的一种或多种元件:增强子、启动子、转基因、ITR、抗生素抗性基因、复制起始位点、多聚腺苷酸环化序列(polyA)和内含子。
在所述转基因质粒的优选实施方案中,所述填充序列位于5’ITR上游,优选位于5’ITR上游与抗生素抗性基因之间、3’ITR下游与ori序列之间或复制起始位点与抗生素抗性基因之间。优选地,所述填充序列位于5’ITR上游和抗生素抗性基因之间。
在所述转基因质粒的具体实施方案中,所述ITR为ssITR,且转基因质粒的填充序列核苷酸序列长度为4.7~7.0kb。
在所述转基因质粒的另一个具体实施方案中,其中所述ITR为scITR,且转基因质粒的填充序列的核苷酸序列长度2.3~5.0kb。
在所述转基因质粒的具体实施方案中,其中所述抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因(Kanamycin resistance gene,Kana或KanR)。
在所述转基因质粒的具体实施方案中,其中所述填充序列位于ori和KanR之间。
在所述转基因质粒的具体实施方案中,其中所述启动子为PGK1、CMV、CβA、人β-肌动蛋白、EF-1α、CAG、Ubc。优选地,所述启动子为CMV、EF-1α、CβA。更优选地,所述启动子为CMV、EF-1α。
在所述转基因质粒的具体实施方案中,其中所述转基因质粒在5’-3’的方向上的元件依次包含:5’ITR、增强子和启动子的组合或单独的启动子、转基因、polyA、3’ITR、ori、KanR和填充序列。
在所述转基因质粒的具体实施方案中,所述5’ITR和3’ITR为ssITR,优选所述ssITR为AAV2 ITR或其突变体或其截短体。在另一个具体实施方案中,所述5’ITR和3’ITR为scITR,优选所述scITR为AAV2 ITR或其突变体或其截短体。在所述转基因质粒的具体实施方案中,其中增强子为CMV,启动子为CMV,转基因序列为荧光素酶报告基因和/或绿色荧光蛋白基因,和/或polyA为SV40 polyA。
在所述转基因质粒的具体实施方案中,其中所述转基因质粒优选具有图2、图4或图5所示的结构,其中Luc-GFP和SMN1编码区基因序列能够被其他转基因序列替换。
第三组实施方案提供第二组实施方案中的转基因质粒的制备方法,包括将所述填充序列插入包含转基因序列的转基因质粒中。在所述制备方法的优选实施方案中,所述插入通过同源重组进行。
第四组实施方案提供一种组合物,其包含第二组实施方案中所述的转基因质粒。
第五组实施方案提供一种试剂盒,其包含第一组实施方案中的三质粒系统,或第二组实施方案中所述的转基因质粒。
第六组实施方案提供第一组实施方案中的三质粒系统,或第二组实施方案中的转基因质粒在产生AAV载体中的用途。
第七组实施方案提供降低AAV载体产品中错包质粒DNA的方法,所述方法包括使用转基因质粒、包装质粒、辅助质粒生产所述AAV载体产品,其中所述转基因质粒为第二组实施方案中所述的转基因质粒。
在所述方法的优选实施方案中,其中所述错包质粒DNA的含量比未插入填充序列但其他相同的转基因质粒生产的AAV载体产品中错包质粒DNA的含量降低至少30%,优选至少50%,更优选至少70%,还更优选至少90%,甚至更多。优选地,所述错包质粒DNA的含量通过qPCR法测定。
在所述方法的优选实施方案中,所述方法包括对所述AAV载体产品进行纯化。例如,所述纯化采用亲和层析进行。
在所述方法的具体实施方案中,所述AAV载体的衣壳蛋白为AAV2或AAV8血清型时,使用POROS CaptureSelect AAVX(Thermo)柱进行亲和层析;当所述AAV载体的衣壳蛋白为AAV9血清型时,使用POROS CaptureSelect AAV9(Thermo)柱进行亲和层析。
在所述方法的具体实施方案中,其中生产所述AAV病毒颗粒的步骤中,裂解细胞时在裂解体系中加入全能核酸酶。
第八组实施方案提供一种制备AAV载体的方法,包括使用第一组实施方案中的三质粒系统。
在制备AAV载体的方法的具体实施方案中,包括如下步骤:
(i)通过PCR扩增获得如SEQ ID No:1或SEQ ID No:2所示的核苷酸序列作为填充序列;
(ii)通过同源重组将所述填充序列连接到转基因质粒中;和
(iii)使用包含插入了填充序列的转基因质粒、包装质粒、辅助质粒的三质粒系统对悬浮培养的HEK293细胞进行瞬时共转染,转染72h后收获含有AAV载体的产物。
实施例
为了更全面地理解和应用本发明,下文将参考实施例和附图详细描述本发明,所述实施例仅是意图举例说明本发明,而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例1.含有填充序列的腺相关病毒质粒的构建
在本实施例中通过分子克隆技术进行分子构建,分别在转基因质粒的骨架中插入了两种来自λ噬菌体基因组的片段,从而构建了含有填充序列并分别以报告基因(Luc-GFP)和SMN1编码序列为转基因的转基因质粒。
1.1分子构建
(1)用PCR扩增方法,将来自λ噬菌体基因组的片段2(基因组序列的第7161-12160位)的核苷酸序列(SEQ ID No:2)用同源重组的方式分别连接到具有图1所示结构的表达荧光素酶(Luc)和绿色荧光素酶报告基因(GFP)的质粒(简称“K103-GFP”)中,所述GFP质粒在两个AAV2 ssITR序列之间包含CMV增强子、CMV启动子、荧光素酶(Luc)编码基因、T2A、GFP编码基因、SV40 poly(A),并带有卡那霉素抗性基因和复制起始位点。片段2被插入位于5’ITR上游和卡那霉素抗性基因之间的位置,将获得的改造质粒称为“λ2-GFP”,其结构如图2所示。
(2)用PCR扩增方法,分别将来自λ噬菌体基因组的片段1(基因组序列的第2161-7160位,SEQ ID No:1)、片段2(7161-12160位,同上)的核苷酸序列用同源重组方式连接到具有图3所示结构的表达SMN1的质粒(简称“K103-SMN”)中。所述K103-SMN转基因质粒在两个AAV2 scITR序列之间包含EF-1ɑ启动子、内含子和SMN1基因(SMN1的氨基酸序列如SEQ IDNo:3所示)、土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、猴空泡病毒PolyA(SV40poly(A)),并带有卡那霉素抗性基因和复制起始位点。片段1或片段2被插入位于5’ITR上游和卡那霉素抗性基因之间的位置,将获得的改造质粒分别称为λ1-SMN、λ2-SMN,分别如图4和图5所示。
(3)将构建好的质粒K103-GFP、λ2-GFP、K103-SMN、λ1-SMN、λ2-SMN质粒分别转化到stbl3(ThermoFisher Scientific)或DH5ɑ(ThermoFisher Scientific)感受态细胞中。
(4)通过核苷酸测序鉴定确认获得了构建正确的质粒载体,即K103-GFP、λ2-GFP、K103-SMN、λ1-SMN、λ2-SMN五种病毒载体质粒。
1.2质粒制备
用EndoFree plasmid Giga Kit(QIANGEN,货号12391)对在1.1中构建完成的质粒载体进行了质粒的制备,获得了K103-GFP、λ2-GFP、K103-SMN、λ1-SMN、λ2-SMN质粒。另外还用同样的试剂盒制备了辅助质粒pHelper-1(启研,经改造),以及包含三种不同血清型的衣壳蛋白的包装质粒pAAV2/2(淼灵质粒平台)、pAAV2/8(购自丰晖生物,经改造)、pAAV2/9(自主设计)。
所述pHelper-1质粒包含如下元件:复制起始位点、卡那霉素抗性基因、f1噬菌体的ori、E2A编码序列、E4编码序列、VA编码序列。
所述pAAV2/2、pAAV2/8、pAAV2/9包含如下元件:氨苄西林抗性(血清型2)或卡那霉素抗性基因(血清型8和血清型9)、复制起始位点、启动子、AAV复制蛋白Rep的编码序列(血清型2)、AAV衣壳蛋白Cap的编码序列(分别为血清型2、8、9)。
对上述制备完成的质粒分别检测了质粒浓度(紫外分光光度计法)、A260/280(紫外分光光度计法)、超螺旋质粒比例(琼脂糖凝胶电泳密度测定法)、内毒素(凝胶法)。
将经QC检测质量合格的质粒进行细胞转染实验。
1.3结果分析
结果显示,制备的上述质粒的质粒浓度范围为1000-3000ng/μl之间(具体见下表1)。这些质粒的超螺旋质粒比例≥80%,内毒素≤40EU/mg,A260/280为1.8-2.0,符合细胞转染所需的质粒质量要求,简称“转染级质粒”,可用于下一步细胞转染实验。
表1.质粒浓度检测结果
质粒名称 | 质粒浓度(ng/μl) |
λ1-SMN | 1046 |
λ2-SMN | 1015 |
K103-SMN | 1253 |
pHelper-1(批次1) | 1053 |
pAAV2/9(批次1) | 1093 |
λ2-GFP | 1056 |
K103-GFP | 2670 |
pHelper-1(批次2) | 1204 |
pAAV2/2 | 1709 |
pAAV2/8 | 2245 |
pAAV2/9(批次2) | 2352 |
实施例2.以报告基因为转基因使用包含或不含填充序列的三质粒系统制备病毒
样品
在本实施例中,将上述实施例1获得的转染级K103-GFP和λ2-GFP质粒分别与不同的转染级包装质粒(分别包含AAV2、AAV8和AAV9的衣壳蛋白编码序列)组合,再结合转染级的辅助质粒共形成6种三质粒体系(GFP、RC、Helper),并进行了瞬转细胞试验。
2.1三质粒(GFP、RC、Helper)转染体系组合
6种三质粒体系的组成如下表2所示。转染级质粒的制备如实施例1中所述。包装质粒的血清型如下表2中所示,分别为血清型AAV2、AAV8、AAV9。辅助质粒为Ad5型辅助质粒pHelper-1(批次2),其中含有腺相关病毒Ad5的重要元件E2A、E4、VA。
表2.三质粒共转染体系组合(GFP类)
2.2细胞转染
使用上述六种三质粒体系分别瞬时共转染了HEK293悬浮细胞。
2.2.1试验材料
HEK293细胞:Viral Production Cells 2.0(Gibco,A52021)。
细胞培养基:OPM-293CD05 Medium(奥浦迈,81075-001)。
细胞活率:≥90%。
PEI MAX:转染级线性化聚乙烯亚胺PEI 40000(Transfection Grade LinearPolyethylenimine Hydrochloride,MW 40,000)(生产商:Polysciences,货号:24765)。
将细胞-转染混合物体系的配方示于下表3中。
表3.细胞-转染混合物配方
从表3中可见,在质粒培养基混合物中包含三质粒,具体比例为转基因质粒:辅助质粒:包装质粒(摩尔比例)=1:1:1。三质粒的总质量按转染时质粒与细胞的比例为1μg质粒/10E+6活细胞数计算。
PEI-MAX的质量按总质粒质量(μg):PEI MAX质量(μg)=1:2计算。
2.2.2转染步骤
用细胞培养基按上述配方分别配制质粒培养基混合物和PEI-MAX培养基混合物,并按体积1:1将PEI-MAX培养基混合物加入到质粒培养基混合物中,混匀后静置10min,得到转染混合物。
将转染混合物转移至装有所述体积的含细胞的培养基的细胞摇瓶中,置于立式二氧化碳振荡培养箱中在8%CO2、37℃、125rpm条件下振荡培养。振荡培养72h时结束产毒培养,收获病毒样品。
2.3病毒样品的亲和层析(AC,Affinity Chromatography)
结束产毒培养后,向细胞收获液中加入终浓度为0.5%的聚山梨酯20、3mmol/L的氯化镁、20mmol/L的Tris-HCl、50U/ml的全能核酸酶,pH控制在7.6-7.8之间,在37℃、125rpm振荡培养条件下裂解细胞,裂解时间不低于2.5h。然后4℃,10,000rpm高速离心60min分离上清,上清再经0.22μm滤膜过滤后获得澄清料液,用于进行亲和捕获。
对于不同血清型的衣壳使用不同的亲和层析柱,具体如下:
POROS CaptureSelect AAVX(Thermo)柱,用于AAV2(表2中的GFP01、GFP04组)和AAV8(表2中的GFP02、GFP05组)血清型;
POROS CaptureSelect AAV9(Thermo)柱,用于AAV9(表2中的GFP03、GFP06组)血清型。
使用至少5个柱体积的平衡缓冲液(20mmol/L Tris,150mmol/L NaCl,0.001%泊洛沙姆188,pH7.5)平衡柱子,将澄清料液上样至平衡好的亲和层析柱中,保留时间不低于2分钟。结束上样后,再次使用平衡缓冲液平衡至少5个柱体积。再以洗脱缓冲液(柠檬酸-磷酸氢二钠,500mmol/L NaCl,0.001%泊洛沙姆188,pH2.5)直接洗脱病毒样品,获得包含病毒的洗脱液,并于30分钟内以pH8.5的1mol/L Tris-HCl对酸性洗脱获得的洗脱液进行中和,获得最终病毒样品。最终病毒样品分别进行基因组滴度、质粒DNA残留量的检测。
2.4基因组滴度检测
2.4.1质粒标准品的制备
将2.3中获得的最终病毒样品用脱氧核糖核酸酶I(RQ1 RNase-Free DNase)消化后,基于TaqMan探针法,对病毒基因组滴度进行荧光定量PCR(qPCR)法检测。
为了进行qPCR,首先制备线性化质粒标准品,即用质粒小提中量试剂盒(生产商:天根生化科技有限公司,货号:DP106-2)抽提对应的三质粒体系中的转基因质粒,抽提好的质粒用限制酶酶切以使其线性化。使用的限制酶根据质粒序列选择,以保证在质粒中仅含一个该限制酶的酶切位点。酶切质粒DNA之后,用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测,并用TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(生产商:TaKaRa,货号:9762)回收该线性化质粒。再用紫外可见分光光度计检测线性化质粒浓度(μg/ml)。根据质粒浓度和质粒分子量,计算相应质粒拷贝数。质粒拷贝数的计算公式如下:
拷贝数(copies/ml)=[6.02×1023×核酸浓度(μg/ml)×10-6]/(DNA长度×660)。
2.4.2标准曲线的制备:
使用上述制备好的线性化的质粒标准品进行梯度稀释来制作标准曲线。制作了质粒标准品的7个10倍梯度稀释,分别稀释至1×1012拷贝数/ml、1×1011拷贝数/ml、1×1010拷贝数/ml、1×109拷贝数/ml、1×108拷贝数/ml、1×107拷贝数/ml、1×106拷贝数/ml,每个梯度进行2个复孔。
2.4.3供试品的处理:
PCR管中分别加入5μl病毒样品、1.5μl RQ1 RNase-Free DNase、4.5μl 10×DNaseI缓冲液和34μl无菌水,于37℃孵育30min;加入10μl stop solution,混匀,65℃加热处理10min。即供试品稀释倍数为10倍。再将供试品平衡至室温后,用水再将供试品分别稀释10倍、100倍。
2.4.4 qPCR检测
分别以2.4.3中不同稀释倍数的供试品、质粒标准品和作为阴性对照的ddH2O为模板DNA,使用AceQ Universal U+Probe Master Mix V2(Vazyme,#Q513)进行qPCR扩增。qPCR的引物和探针序列如下表4所示,并按下表5配制反应体系(根据仪器型号,决定是否进行Rox校准)。
表4.引物、探针信息表
名称 | 编号 | 序列 |
上游引物-1 | GFP-F | 5’-TCCGCCACAACATCGAGGAC-3’(SEQ ID NO:4) |
下游引物-1 | GFP-R | 5’-GTAGTGGTTGTCGGGCAGCA-3’(SEQ ID NO:5) |
探针-1 | GFP-P | 5’FAM-CAGCGTGCAGCTCGCCGACC-3’BHQ-1(SEQ ID NO:6) |
上游引物-2 | SMN-F | 5’-CACCATCGCCAGCATCGACT-3’(SEQ ID NO:7) |
下游引物-2 | SMN-R | 5’-ATGTTGTTGGCCACCTCGCA-3’(SEQ ID NO:8) |
探针-2 | SMN-P | 5’FAM-TGCTCCTCCCGGTTCCCGTAGCC-3’BHQ(SEQ ID NO:9) |
引物、探针均由铂尚生物技术(上海)有限公司合成。
表5.qPCR扩增体系如下表:
名称 | 体积(μl)/孔 |
AceQ Universal U+Probe Master Mix V2 | 10 |
转基因编码区-F(10μM) | 0.4 |
转基因编码区-R(10μM) | 0.4 |
转基因编码区探针(10μM) | 0.2 |
转基因质粒DNA | 5 |
ddH2O | 4 |
扩增条件:37℃预孵育2min;95℃预变性10min;95℃变性10s,62℃退火和延伸共15s,进行40个循环。
2.4.5结果计算:
(1)以定量PCR仪软件自动优化得到的循环阈值(Cycle Threshold value,Ct值)或Cq值为纵坐标,起始模板中质粒质量的对数为横坐标,建立标准曲线。将待测样品的Ct值代入线性方程,计算出其初始拷贝数。
(2)计算供试品不同稀释倍数的平均值。
2.4.6判定标准
病毒基因组滴度结果被接受的标准(系统适应性)如下:
(1)扩增曲线光滑平稳,峰值较高,指数增长期和线性增长期和平台期平稳;
(2)标准曲线的相应系数r≥0.99;效率在-3.1~-3.8之间。
病毒基因组滴度可以以单位体积内的病毒载体基因组数量(vg/ml)或者单位体积内的基因组拷贝数(gc/ml)表示,两个单位可以互换使用。
病毒基因组滴度检测结果示于表6和图6。
表6.检测结果
基因组滴度是含有基因组DNA的病毒数量。在提取病毒核酸进行PCR之前,对病毒之外的DNA通过消化酶降解进行了处理,因此测定对象为包装在病毒颗粒内部的基因组DNA,故该方法所测得的病毒核酸拷贝数能较准确地反映总的完整病毒颗粒数。
在上述6组质粒组合中,对于同一转基因质粒和辅助质粒的组合,在使用不同血清型的包装质粒时,AC样品基因组滴度会略有不同。对于同一血清型的包装质粒和辅助质粒的组合,在使用不同转基因质粒时,含有填充序列的转基因质粒的基因组滴度均略低于无填充序列的转基因质粒。在使用不同的血清型时,由病毒基因组滴度所体现的产能有所不同,并且含有填充序列的转基因质粒的产能略低于小骨架质粒1.2-8.3倍,但所有结果都处于产能合理范围内。
2.5质粒DNA残留检测
2.5.1质粒标准品的制备
质粒标准品和标准曲线的制作参照2.4.1和2.4.2。标准曲线稀释步骤见下表7,标准曲线的范围为STD1~STD6。
表7.标准曲线参考稀释步骤
稀释管 | 稀释过程 | 浓度 |
STD0 | 线性质粒参考品 | 1012Copies/ml |
STD1 | 10μl STD0+90μl水 | 1011Copies/ml |
STD2 | 10μl STD1+90μl水 | 1010Copies/ml |
STD3 | 10μl STD2+90μl水 | 109Copies/ml |
STD4 | 10μl STD3+90μl水 | 108Copies/ml |
STD5 | 10μl STD4+90μl水 | 107Copies/ml |
STD6 | 10μl STD5+90μl水 | 106Copies/ml |
NTC | 90μl水 | NA |
2.5.2样本提取
方法参照宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒(磁珠法)(湖州申科生物技术股份有限公司,SK030203D100)。具体操作步骤如下。
2.5.2.1样本稀释
供试品稀释:取出供试品平衡至室温,稀释至5000倍。
加标回收对照样品(Extraction recovery control,ERC):取稀释后的供试品100μl加入10μl STD3,混匀。
阴性提取样品(Negative control sample,NCS):取100μl的供试品稀释液于离心管中。
2.5.2.2酶解
每100μl待检测样本中加入10μl 5M NaCl。
加入110μl蛋白酶K消化液,振荡混匀,55℃孵育1h。
2.5.2.3结合
孵育完成后,取出样本,瞬时离心。加入工作结合液209.2μl,振荡混匀。
瞬时离心后,分别加入200μl异丙醇,10μl磁珠。漩涡震荡器上振荡5min。10000rpm离心10s富集磁珠,之后静置于磁性分离架上5min至溶液澄清,移液枪移除上清。(注意枪头不要搅动磁珠)。
2.5.2.4洗涤
从磁性分离架上取下含有磁珠的离心管,加入700μl洗涤液A,振荡10s使磁珠和洗涤液A混匀。10000rpm离心10s富集磁珠,之后静置于磁性分离架上1min至溶液澄清,移液枪移除上清。完成第1次磁珠洗涤。
从磁性分离架上取下含有磁珠的离心管,加入700μl洗涤液B,振荡10s使磁珠和洗涤液B混匀。10000rpm离心10s富集磁珠,之后静置于磁性分离架上1min至溶液澄清,移液枪移除上清。完成第2次磁珠洗涤。
从磁性分离架上取下离心管,打开管盖在室温下干燥30s~3min,除去残留的乙醇。(干燥时间依具体情况而定)。
2.5.2.5洗脱
沿离心管壁加入100μl 70℃预热的洗脱液,漩涡振荡使磁珠和洗脱液混匀,70℃孵育7min。孵育过程中可再次振荡混匀2-3次。孵育完成后,15000rpm离心20s,然后静置于磁性分离架上1min,待磁珠分离后,用枪头小心转移溶液到干净的离心管中。
将上一步获得的溶液15000rpm离心2min,然后静置于磁性分离架上1min,待磁珠分离后,用枪头再次转移溶液到干净离心管,所得即为样本纯化液。
2.6质粒DNA残留量qPCR检测
表8.引物、探针信息表
引物、探针均由铂尚生物技术(上海)有限公司合成。
表9.单孔qPCR公共反应体系配制信息表
组份 | 单孔反应 |
AceQ Universal U+Probe Master Mix V2 | 10μl |
Kan-F(10μM) | 0.4μl |
Kan-R(10μM) | 0.4μl |
Kan-P探针(10μM) | 0.2μl |
水 | 4μl |
总体积 | 15μl |
注:每个样本按照3复孔执行。
2.7 qPCR反应体系的制备(20μl)
表10.qPCR反应体系配制信息表
组份 | 单孔反应 |
标准曲线 | 15μl qPCR MIX+5μl SD1~SD6 |
NTC | 15μl qPCR MIX+5μl水 |
NCS | 15μl qPCR MIX+5μl NCS纯化液 |
待测样本 | 15μl qPCR MIX+5μl待测样本 |
ERC | 15μl qPCR MIX+5μl样本ERC纯化液 |
2.8 qPCR程序参数设置
2.8.1创建新检测探针,选择报告荧光基团为FAM,猝灭荧光基团为TAMRA。
2.8.2设置反应程序
表11.qPCR程序信息表
2.9结果分析
2.9.1 ERC回收率
ERC回收率按照如下等式计算。
2.9.2检测结果
检测结果以Copies/ml表示,等于QPCR仪器导出结果均值乘以稀释倍数。
2.9.3系统适应性
系统适应性应满足以下条件:
标准曲线的R2≥0.98;
扩增效率为80%-120%;
NCS与NTC应均无扩增,若有,则其Ct值应不小于标准曲线最低点平均值的Ct值;
ERC的回收率应在50%~150%之间;
复孔间的相对标准偏差(RSD)应不大于15%,若超出标准,可舍去偏离较大的点,标准曲线总共舍去孔应不超过3个;
适当条件下,可以剔除标准曲线第一个或第六个点,系统适应性仍应满足以上条件。
2.9.4数据处理及统计分析
采用QPCR仪器进行扩增,扩增结束后以QPCR仪软件自动优化得到的循环阈值(Cycle Threshold value,Ct值)为纵坐标,起始模板中质粒参考品浓度的对数为横坐标,建立标准曲线。将待测样品的Ct值代入线性方程,计算出其初始浓度。
结果保留2位有效数字。
表12.错包质粒DNA残留检测结果
使用如表12中所示的6组的质粒DNA残留值(拷贝数/E12 vg)制作直方图,示于图7。进一步地,按照包装质粒的血清型将6组数据分为三组,计算同组中与未插入填充片段的组相比,插入填充片段的组的质粒DNA残留值的降低倍数,并将结果示于图8。
从表12和图8可知,结果显示:
(1)对于血清型AAV2,在使用相同的辅助质粒时,转基因质粒λ2-GFP相较于转基因质粒K103-GFP而言,在获得的样品中错包的质粒DNA残留量降低了15.1倍;
(2)对于血清型AAV8,在使用相同的辅助质粒时,转基因质粒λ2-GFP相较于转基因质粒K103-GFP而言,在获得的样品中错包的质粒DNA残留量降低了2.3倍;
(3)对于血清型AAV9,在使用相同的辅助质粒时,转基因质粒λ2-GFP相较于转基因质粒K103-GFP而言,在获得的样品中错包的质粒DNA残留量降低了7.4倍。
以上结果显示,通过插入λ噬菌体的填充序列λ2片段获得的转基因质粒与血清型AAV2、8、9中任一种的衣壳搭配,均能实现显著的错包的质粒DNA残留量降低效果,至少可达2倍,可以高达15倍以上。由此可知,在不同血清型中,插入来自λ噬菌体的填充序列的策略均适用。
实施例3.以SMN为转基因使用包含或不含填充序列的三质粒系统制备病毒样品
在本实施例中,使用上述实施例1获得的转染级λ1-SMN、λ2-SMN和K103-SMN质粒与包含AAV9衣壳蛋白的包装质粒,形成了如下表13所示的三种三质粒体系SMN 01~03,用于瞬转细胞试验。
表13.三质粒共转染体系组合(SMN类)
序号 | 转基因质粒 | 辅助质粒 | 包装质粒(AAV9) |
SMN01 | λ1-SMN | pHelper-1 | pAAV2/9 |
SMN02 | λ2-SMN | pHelper-1 | pAAV2/9 |
SMN03 | K103-SMN | pHelper-1 | pAAV2/9 |
使用三质粒体系瞬时共转染HEK293悬浮细胞,除三质粒中的转基因质粒,所用引物和探针是分别针对不同的质粒和检测方法进行设计的以外,实验材料及步骤同实施例2。
将基因组滴度、质粒DNA残留的检测结果示于表14和图9;将质粒DNA残留值,及与未插入填充序列的组相比,插入片段的组的质粒DNA残留量的降低倍数作图,示于图10和图11。
表14.检测结果
从质粒DNA残留量的结果可知,在使用相同的辅助质粒和包含相同血清型(AAV9)衣壳的包装质粒时,在不同的转基因质粒中,与K103-SMN质粒相比,λ1-SMN质粒的错包的质粒DNA残留量降低了约9.9倍,λ2-SMN质粒的错包的质粒DNA残留量降低了约9.0倍。可见采用本发明的两种填充序列的转基因质粒(λ1-SMN和λ2-SMN)相较于对照质粒而言,均能显著降低DNA残留量。
综合实施例2和实施例3的结果可知,两种来源于λ噬菌体基因组的填充片段(λ1片段与λ2片段)核苷酸序列不同,且包含λ噬菌体中的编码序列片段,但并不会影响AAV载体的包装,也不会起到治疗作用。这些结果说明,通过插入来自λ噬菌体基因组的填充片段,能够在使用不同血清型衣壳、不同转基因质粒时,实现显著的错包的质粒DNA残留量降低。
序列信息
大肠杆菌噬菌体Lambda基因组片段1(2161-7160位),SEQ ID NO:1
TCCGGGTGATCCCCATTAAAGGGGCATCCGTCTACGGAAAGCCGGTGGCCAGCATGCCACGTAAGCGAAACAAAAACGGGGTTTACCTTACCGAAATCGGTACGGATACCGCGAAAGAGCAGATTTATAACCGCTTCACACTGACGCCGGAAGGGGATGAACCGCTTCCCGGTGCCGTTCACTTCCCGAATAACCCGGATATTTTTGATCTGACCGAAGCGCAGCAGCTGACTGCTGAAGAGCAGGTCGAAAAATGGGTGGATGGCAGGAAAAAAATACTGTGGGACAGCAAAAAGCGACGCAATGAGGCACTCGACTGCTTCGTTTATGCGCTGGCGGCGCTGCGCATCAGTATTTCCCGCTGGCAGCTGGATCTCAGTGCGCTGCTGGCGAGCCTGCAGGAAGAGGATGGTGCAGCAACCAACAAGAAAACACTGGCAGATTACGCCCGTGCCTTATCCGGAGAGGATGAATGACGCGACAGGAAGAACTTGCCGCTGCCCGTGCGGCACTGCATGACCTGATGACAGGTAAACGGGTGGCAACAGTACAGAAAGACGGACGAAGGGTGGAGTTTACGGCCACTTCCGTGTCTGACCTGAAAAAATATATTGCAGAGCTGGAAGTGCAGACCGGCATGACACAGCGACGCAGGGGACCTGCAGGATTTTATGTATGAAAACGCCCACCATTCCCACCCTTCTGGGGCCGGACGGCATGACATCGCTGCGCGAATATGCCGGTTATCACGGCGGTGGCAGCGGATTTGGAGGGCAGTTGCGGTCGTGGAACCCACCGAGTGAAAGTGTGGATGCAGCCCTGTTGCCCAACTTTACCCGTGGCAATGCCCGCGCAGACGATCTGGTACGCAATAACGGCTATGCCGCCAACGCCATCCAGCTGCATCAGGATCATATCGTCGGGTCTTTTTTCCGGCTCAGTCATCGCCCAAGCTGGCGCTATCTGGGCATCGGGGAGGAAGAAGCCCGTGCCTTTTCCCGCGAGGTTGAAGCGGCATGGAAAGAGTTTGCCGAGGATGACTGCTGCTGCATTGACGTTGAGCGAAAACGCACGTTTACCATGATGATTCGGGAAGGTGTGGCCATGCACGCCTTTAACGGTGAACTGTTCGTTCAGGCCACCTGGGATACCAGTTCGTCGCGGCTTTTCCGGACACAGTTCCGGATGGTCAGCCCGAAGCGCATCAGCAACCCGAACAATACCGGCGACAGCCGGAACTGCCGTGCCGGTGTGCAGATTAATGACAGCGGTGCGGCGCTGGGATATTACGTCAGCGAGGACGGGTATCCTGGCTGGATGCCGCAGAAATGGACATGGATACCCCGTGAGTTACCCGGCGGGCGCGCCTCGTTCATTCACGTTTTTGAACCCGTGGAGGACGGGCAGACTCGCGGTGCAAATGTGTTTTACAGCGTGATGGAGCAGATGAAGATGCTCGACACGCTGCAGAACACGCAGCTGCAGAGCGCCATTGTGAAGGCGATGTATGCCGCCACCATTGAGAGTGAGCTGGATACGCAGTCAGCGATGGATTTTATTCTGGGCGCGAACAGTCAGGAGCAGCGGGAAAGGCTGACCGGCTGGATTGGTGAAATTGCCGCGTATTACGCCGCAGCGCCGGTCCGGCTGGGAGGCGCAAAAGTACCGCACCTGATGCCGGGTGACTCACTGAACCTGCAGACGGCTCAGGATACGGATAACGGCTACTCCGTGTTTGAGCAGTCACTGCTGCGGTATATCGCTGCCGGGCTGGGTGTCTCGTATGAGCAGCTTTCCCGGAATTACGCCCAGATGAGCTACTCCACGGCACGGGCCAGTGCGAACGAGTCGTGGGCGTACTTTATGGGGCGGCGAAAATTCGTCGCATCCCGTCAGGCGAGCCAGATGTTTCTGTGCTGGCTGGAAGAGGCCATCGTTCGCCGCGTGGTGACGTTACCTTCAAAAGCGCGCTTCAGTTTTCAGGAAGCCCGCAGTGCCTGGGGGAACTGCGACTGGATAGGCTCCGGTCGTATGGCCATCGATGGTCTGAAAGAAGTTCAGGAAGCGGTGATGCTGATAGAAGCCGGACTGAGTACCTACGAGAAAGAGTGCGCAAAACGCGGTGACGACTATCAGGAAATTTTTGCCCAGCAGGTCCGTGAAACGATGGAGCGCCGTGCAGCCGGTCTTAAACCGCCCGCCTGGGCGGCTGCAGCATTTGAATCCGGGCTGCGACAATCAACAGAGGAGGAGAAGAGTGACAGCAGAGCTGCGTAATCTCCCGCATATTGCCAGCATGGCCTTTAATGAGCCGCTGATGCTTGAACCCGCCTATGCGCGGGTTTTCTTTTGTGCGCTTGCAGGCCAGCTTGGGATCAGCAGCCTGACGGATGCGGTGTCCGGCGACAGCCTGACTGCCCAGGAGGCACTCGCGACGCTGGCATTATCCGGTGATGATGACGGACCACGACAGGCCCGCAGTTATCAGGTCATGAACGGCATCGCCGTGCTGCCGGTGTCCGGCACGCTGGTCAGCCGGACGCGGGCGCTGCAGCCGTACTCGGGGATGACCGGTTACAACGGCATTATCGCCCGTCTGCAACAGGCTGCCAGCGATCCGATGGTGGACGGCATTCTGCTCGATATGGACACGCCCGGCGGGATGGTGGCGGGGGCATTTGACTGCGCTGACATCATCGCCCGTGTGCGTGACATAAAACCGGTATGGGCGCTTGCCAACGACATGAACTGCAGTGCAGGTCAGTTGCTTGCCAGTGCCGCCTCCCGGCGTCTGGTCACGCAGACCGCCCGGACAGGCTCCATCGGCGTCATGATGGCTCACAGTAATTACGGTGCTGCGCTGGAGAAACAGGGTGTGGAAATCACGCTGATTTACAGCGGCAGCCATAAGGTGGATGGCAACCCCTACAGCCATCTTCCGGATGACGTCCGGGAGACACTGCAGTCCCGGATGGACGCAACCCGCCAGATGTTTGCGCAGAAGGTGTCGGCATATACCGGCCTGTCCGTGCAGGTTGTGCTGGATACCGAGGCTGCAGTGTACAGCGGTCAGGAGGCCATTGATGCCGGACTGGCTGATGAACTTGTTAACAGCACCGATGCGATCACCGTCATGCGTGATGCACTGGATGCACGTAAATCCCGTCTCTCAGGAGGGCGAATGACCAAAGAGACTCAATCAACAACTGTTTCAGCCACTGCTTCGCAGGCTGACGTTACTGACGTGGTGCCAGCGACGGAGGGCGAGAACGCCAGCGCGGCGCAGCCGGACGTGAACGCGCAGATCACCGCAGCGGTTGCGGCAGAAAACAGCCGCATTATGGGGATCCTCAACTGTGAGGAGGCTCACGGACGCGAAGAACAGGCACGCGTGCTGGCAGAAACCCCCGGTATGACCGTGAAAACGGCCCGCCGCATTCTGGCCGCAGCACCACAGAGTGCACAGGCGCGCAGTGACACTGCGCTGGATCGTCTGATGCAGGGGGCACCGGCACCGCTGGCTGCAGGTAACCCGGCATCTGATGCCGTTAACGATTTGCTGAACACACCAGTGTAAGGGATGTTTATGACGAGCAAAGAAACCTTTACCCATTACCAGCCGCAGGGCAACAGTGACCCGGCTCATACCGCAACCGCGCCCGGCGGATTGAGTGCGAAAGCGCCTGCAATGACCCCGCTGATGCTGGACACCTCCAGCCGTAAGCTGGTTGCGTGGGATGGCACCACCGACGGTGCTGCCGTTGGCATTCTTGCGGTTGCTGCTGACCAGACCAGCACCACGCTGACGTTCTACAAGTCCGGCACGTTCCGTTATGAGGATGTGCTCTGGCCGGAGGCTGCCAGCGACGAGACGAAAAAACGGACCGCGTTTGCCGGAACGGCAATCAGCATCGTTTAACTTTACCCTTCATCACTAAAGGCCGCCTGTGCGGCTTTTTTTACGGGATTTTTTTATGTCGATGTACACAACCGCCCAACTGCTGGCGGCAAATGAGCAGAAATTTAAGTTTGATCCGCTGTTTCTGCGTCTCTTTTTCCGTGAGAGCTATCCCTTCACCACGGAGAAAGTCTATCTCTCACAAATTCCGGGACTGGTAAACATGGCGCTGTACGTTTCGCCGATTGTTTCCGGTGAGGTTATCCGTTCCCGTGGCGGCTCCACCTCTGAATTTACGCCGGGATATGTCAAGCCGAAGCATGAAGTGAATCCGCAGATGACCCTGCGTCGCCTGCCGGATGAAGATCCGCAGAATCTGGCGGACCCGGCTTACCGCCGCCGTCGCATCATCATGCAGAACATGCGTGACGAAGAGCTGGCCATTGCTCAGGTCGAAGAGATGCAGGCAGTTTCTGCCGTGCTTAAGGGCAAATACACCATGACCGGTGAAGCCTTCGATCCGGTTGAGGTGGATATGGGCCGCAGTGAGGAGAATAACATCACGCAGTCCGGCGGCACGGAGTGGAGCAAGCGTGACAAGTCCACGTATGACCCGACCGACGATATCGAAGCCTACGCGCTGAACGCCAGCGGTGTGGTGAATATCATCGTGTTCGATCCGAAAGGCTGGGCGCTGTTCCGTTCCTTCAAAGCCGTCAAGGAGAAGCTGGATACCCGTCGTGGCTCTAATTCCGAGCTGGAGACAGCGGTGAAAGACCTGGGCAAAGCGGTGTCCTATAAGGGGATGTATGGCGATGTGGCCATCGTCGTGTATTCCGGACAGTACGTGGAAAACGGCGTCAAAAAGAACTTCCTGCCGGACAACACGATGGTGCTGGGGAACACTCAGGCACGCGGTCTGCGCACCTATGGCTGCATTCAGGATGCGGACGCACAGCGCGAAGGCATTAACGCCTCTGCCCGTTACCCGAAAAACTGGGTGACCACCGGCGATCCGGCGCGTGAGTTCACCATGATTCAGTCAGCACCGCTGATGCTGCTGGCTGACCCTGATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGGCGTAA
大肠杆菌噬菌体Lambda基因组片段2(7161-12160位),SEQ ID NO:2
TCATGGCCCTTCGGGGCCATTGTTTCTCTGTGGAGGAGTCCATGACGAAAGATGAACTGATTGCCCGTCTCCGCTCGCTGGGTGAACAACTGAACCGTGATGTCAGCCTGACGGGGACGAAAGAAGAACTGGCGCTCCGTGTGGCAGAGCTGAAAGAGGAGCTTGATGACACGGATGAAACTGCCGGTCAGGACACCCCTCTCAGCCGGGAAAATGTGCTGACCGGACATGAAAATGAGGTGGGATCAGCGCAGCCGGATACCGTGATTCTGGATACGTCTGAACTGGTCACGGTCGTGGCACTGGTGAAGCTGCATACTGATGCACTTCACGCCACGCGGGATGAACCTGTGGCATTTGTGCTGCCGGGAACGGCGTTTCGTGTCTCTGCCGGTGTGGCAGCCGAAATGACAGAGCGCGGCCTGGCCAGAATGCAATAACGGGAGGCGCTGTGGCTGATTTCGATAACCTGTTCGATGCTGCCATTGCCCGCGCCGATGAAACGATACGCGGGTACATGGGAACGTCAGCCACCATTACATCCGGTGAGCAGTCAGGTGCGGTGATACGTGGTGTTTTTGATGACCCTGAAAATATCAGCTATGCCGGACAGGGCGTGCGCGTTGAAGGCTCCAGCCCGTCCCTGTTTGTCCGGACTGATGAGGTGCGGCAGCTGCGGCGTGGAGACACGCTGACCATCGGTGAGGAAAATTTCTGGGTAGATCGGGTTTCGCCGGATGATGGCGGAAGTTGTCATCTCTGGCTTGGACGGGGCGTACCGCCTGCCGTTAACCGTCGCCGCTGAAAGGGGGATGTATGGCCATAAAAGGTCTTGAGCAGGCCGTTGAAAACCTCAGCCGTATCAGCAAAACGGCGGTGCCTGGTGCCGCCGCAATGGCCATTAACCGCGTTGCTTCATCCGCGATATCGCAGTCGGCGTCACAGGTTGCCCGTGAGACAAAGGTACGCCGGAAACTGGTAAAGGAAAGGGCCAGGCTGAAAAGGGCCACGGTCAAAAATCCGCAGGCCAGAATCAAAGTTAACCGGGGGGATTTGCCCGTAATCAAGCTGGGTAATGCGCGGGTTGTCCTTTCGCGCCGCAGGCGTCGTAAAAAGGGGCAGCGTTCATCCCTGAAAGGTGGCGGCAGCGTGCTTGTGGTGGGTAACCGTCGTATTCCCGGCGCGTTTATTCAGCAACTGAAAAATGGCCGGTGGCATGTCATGCAGCGTGTGGCTGGGAAAAACCGTTACCCCATTGATGTGGTGAAAATCCCGATGGCGGTGCCGCTGACCACGGCGTTTAAACAAAATATTGAGCGGATACGGCGTGAACGTCTTCCGAAAGAGCTGGGCTATGCGCTGCAGCATCAACTGAGGATGGTAATAAAGCGATGAAACATACTGAACTCCGTGCAGCCGTACTGGATGCACTGGAGAAGCATGACACCGGGGCGACGTTTTTTGATGGTCGCCCCGCTGTTTTTGATGAGGCGGATTTTCCGGCAGTTGCCGTTTATCTCACCGGCGCTGAATACACGGGCGAAGAGCTGGACAGCGATACCTGGCAGGCGGAGCTGCATATCGAAGTTTTCCTGCCTGCTCAGGTGCCGGATTCAGAGCTGGATGCGTGGATGGAGTCCCGGATTTATCCGGTGATGAGCGATATCCCGGCACTGTCAGATTTGATCACCAGTATGGTGGCCAGCGGCTATGACTACCGGCGCGACGATGATGCGGGCTTGTGGAGTTCAGCCGATCTGACTTATGTCATTACCTATGAAATGTGAGGACGCTATGCCTGTACCAAATCCTACAATGCCGGTGAAAGGTGCCGGGACCACCCTGTGGGTTTATAAGGGGAGCGGTGACCCTTACGCGAATCCGCTTTCAGACGTTGACTGGTCGCGTCTGGCAAAAGTTAAAGACCTGACGCCCGGCGAACTGACCGCTGAGTCCTATGACGACAGCTATCTCGATGATGAAGATGCAGACTGGACTGCGACCGGGCAGGGGCAGAAATCTGCCGGAGATACCAGCTTCACGCTGGCGTGGATGCCCGGAGAGCAGGGGCAGCAGGCGCTGCTGGCGTGGTTTAATGAAGGCGATACCCGTGCCTATAAAATCCGCTTCCCGAACGGCACGGTCGATGTGTTCCGTGGCTGGGTCAGCAGTATCGGTAAGGCGGTGACGGCGAAGGAAGTGATCACCCGCACGGTGAAAGTCACCAATGTGGGACGTCCGTCGATGGCAGAAGATCGCAGCACGGTAACAGCGGCAACCGGCATGACCGTGACGCCTGCCAGCACCTCGGTGGTGAAAGGGCAGAGCACCACGCTGACCGTGGCCTTCCAGCCGGAGGGCGTAACCGACAAGAGCTTTCGTGCGGTGTCTGCGGATAAAACAAAAGCCACCGTGTCGGTCAGTGGTATGACCATCACCGTGAACGGCGTTGCTGCAGGCAAGGTCAACATTCCGGTTGTATCCGGTAATGGTGAGTTTGCTGCGGTTGCAGAAATTACCGTCACCGCCAGTTAATCCGGAGAGTCAGCGATGTTCCTGAAAACCGAATCATTTGAACATAACGGTGTGACCGTCACGCTTTCTGAACTGTCAGCCCTGCAGCGCATTGAGCATCTCGCCCTGATGAAACGGCAGGCAGAACAGGCGGAGTCAGACAGCAACCGGAAGTTTACTGTGGAAGACGCCATCAGAACCGGCGCGTTTCTGGTGGCGATGTCCCTGTGGCATAACCATCCGCAGAAGACGCAGATGCCGTCCATGAATGAAGCCGTTAAACAGATTGAGCAGGAAGTGCTTACCACCTGGCCCACGGAGGCAATTTCTCATGCTGAAAACGTGGTGTACCGGCTGTCTGGTATGTATGAGTTTGTGGTGAATAATGCCCCTGAACAGACAGAGGACGCCGGGCCCGCAGAGCCTGTTTCTGCGGGAAAGTGTTCGACGGTGAGCTGAGTTTTGCCCTGAAACTGGCGCGTGAGATGGGGCGACCCGACTGGCGTGCCATGCTTGCCGGGATGTCATCCACGGAGTATGCCGACTGGCACCGCTTTTACAGTACCCATTATTTTCATGATGTTCTGCTGGATATGCACTTTTCCGGGCTGACGTACACCGTGCTCAGCCTGTTTTTCAGCGATCCGGATATGCATCCGCTGGATTTCAGTCTGCTGAACCGGCGCGAGGCTGACGAAGAGCCTGAAGATGATGTGCTGATGCAGAAAGCGGCAGGGCTTGCCGGAGGTGTCCGCTTTGGCCCGGACGGGAATGAAGTTATCCCCGCTTCCCCGGATGTGGCGGACATGACGGAGGATGACGTAATGCTGATGACAGTATCAGAAGGGATCGCAGGAGGAGTCCGGTATGGCTGAACCGGTAGGCGATCTGGTCGTTGATTTGAGTCTGGATGCGGCCAGATTTGACGAGCAGATGGCCAGAGTCAGGCGTCATTTTTCTGGTACGGAAAGTGATGCGAAAAAAACAGCGGCAGTCGTTGAACAGTCGCTGAGCCGACAGGCGCTGGCTGCACAGAAAGCGGGGATTTCCGTCGGGCAGTATAAAGCCGCCATGCGTATGCTGCCTGCACAGTTCACCGACGTGGCCACGCAGCTTGCAGGCGGGCAAAGTCCGTGGCTGATCCTGCTGCAACAGGGGGGGCAGGTGAAGGACTCCTTCGGCGGGATGATCCCCATGTTCAGGGGGCTTGCCGGTGCGATCACCCTGCCGATGGTGGGGGCCACCTCGCTGGCGGTGGCGACCGGTGCGCTGGCGTATGCCTGGTATCAGGGCAACTCAACCCTGTCCGATTTCAACAAAACGCTGGTCCTTTCCGGCAATCAGGCGGGACTGACGGCAGATCGTATGCTGGTCCTGTCCAGAGCCGGGCAGGCGGCAGGGCTGACGTTTAACCAGACCAGCGAGTCACTCAGCGCACTGGTTAAGGCGGGGGTAAGCGGTGAGGCTCAGATTGCGTCCATCAGCCAGAGTGTGGCGCGTTTCTCCTCTGCATCCGGCGTGGAGGTGGACAAGGTCGCTGAAGCCTTCGGGAAGCTGACCACAGACCCGACGTCGGGGCTGACGGCGATGGCTCGCCAGTTCCATAACGTGTCGGCGGAGCAGATTGCGTATGTTGCTCAGTTGCAGCGTTCCGGCGATGAAGCCGGGGCATTGCAGGCGGCGAACGAGGCCGCAACGAAAGGGTTTGATGACCAGACCCGCCGCCTGAAAGAGAACATGGGCACGCTGGAGACCTGGGCAGACAGGACTGCGCGGGCATTCAAATCCATGTGGGATGCGGTGCTGGATATTGGTCGTCCTGATACCGCGCAGGAGATGCTGATTAAGGCAGAGGCTGCGTATAAGAAAGCAGACGACATCTGGAATCTGCGCAAGGATGATTATTTTGTTAACGATGAAGCGCGGGCGCGTTACTGGGATGATCGTGAAAAGGCCCGTCTTGCGCTTGAAGCCGCCCGAAAGAAGGCTGAGCAGCAGACTCAACAGGACAAAAATGCGCAGCAGCAGAGCGATACCGAAGCGTCACGGCTGAAATATACCGAAGAGGCGCAGAAGGCTTACGAACGGCTGCAGACGCCGCTGGAGAAATATACCGCCCGTCAGGAAGAACTGAACAAGGCACTGAAAGACGGGAAAATCCTGCAGGCGGATTACAACACGCTGATGGCGGCGGCGAAAAAGGATTATGAAGCGACGCTGAAAAAGCCGAAACAGTCCAGCGTGAAGGTGTCTGCGGGCGATCGTCAGGAAGACAGTGCTCATGCTGCCCTGCTGACGCTTCAGGCAGAACTCCGGACGCTGGAGAAGCATGCCGGAGCAAATGAGAAAATCAGCCAGCAGCGCCGGGATTTGTGGAAGGCGGAGAGTCAGTTCGCGGTACTGGAGGAGGCGGCGCAACGTCGCCAGCTGTCTGCACAGGAGAAATCCCTGCTGGCGCATAAAGATGAGACGCTGGAGTACAAACG
人SMN1编码区对应氨基酸序列,SEQ ID NO:3
MAMSSGGSGGGVPEQEDSVLFRRGTGQSDDSDIWDDTALIKAYDKAVASFKHALKNGDICETSGKPKTTPKRKPAKKNKSQKKNTAASLQQWKVGDKCSAIWSEDGCIYPATIASIDFKRETCVVVYTGYGNREEQNLSDLLSPICEVANNIEQNAQENENESQVSTDESENSRSPGNKSDNIKPKSAPWNSFLPPPPPMPGPRLGPGKPGLKFNGPPPPPPPPPPHLLSCWLPPFPSGPPIIPPPPPICPDSLDDADALGSMLISWYMSGYHTGYYMGFRQNQKEGRCSHSLN。
Claims (10)
1.用于生产重组腺相关病毒(rAAV)载体的三质粒系统的转基因质粒,其包含转基因和填充序列,所述填充序列为源自λ噬菌体基因组的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的转基因质粒,其中
所述转基因质粒包含自互补ITR(scITR),且所述填充序列的长度为至少2300bp;或
所述转基因质粒包含单链ITR(ssITR),且所述填充序列的长度为至少4700bp。
3.根据权利要求1所述的转基因质粒,其中所述填充序列在rAAV载体的生产细胞中除结构功能外,不具有生物学活性。
4.根据权利要求3所述的转基因质粒,其中所述填充序列的核苷酸序列为如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列,或为与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少50%序列同一性的核苷酸序列。
5.一种用于生产rAAV载体的质粒系统,所述质粒系统包括:
(1)权利要求1-4任一项所述的转基因质粒;
(2)包装质粒,其包含编码AAV复制蛋白(Rep)和衣壳蛋白(Cap)的核苷酸序列;和
(3)AAV辅助质粒,其包含编码腺病毒元件。
6.宿主细胞,其含有权利要求1-4中任一项所述的转基因质粒或权利要求5所述的质粒系统。
7.降低rAAV载体生产中质粒DNA杂质的方法,所述方法包括在包含转基因的转基因质粒中插入填充序列,所述填充序列为源自λ噬菌体基因组的核苷酸序列。
8.根据权利要求7所述的方法,其中
所述转基因质粒包含自互补ITR,且所述填充序列的长度为至少2300bp;或
所述转基因质粒包含单链ITR,且所述填充序列的长度为至少4700bp。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其中所述填充序列的核苷酸序列为如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列,或为与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少50%序列同一性并且在rAAV载体的生产细胞中不具有生物学活性的核苷酸序列。
10.源自λ噬菌体基因组的核苷酸序列作为填充序列的用途,所述填充序列用于插入到用于生产AAV载体的三质粒系统的转基因质粒中,从而降低使用所述三质粒系统生产的AAV载体产品中的错包质粒DNA残留的水平。
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CN117660534A (zh) * | 2023-12-13 | 2024-03-08 | 广州派真生物技术有限公司 | 一种降低重组腺相关病毒中宿主细胞dna残留的辅助质粒及应用 |
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CN117683797B (zh) * | 2023-12-04 | 2024-07-05 | 广州派真生物技术有限公司 | 一种用于重组腺相关病毒包装的质粒系统及其应用 |
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