JP2022526639A - 組換えアデノ随伴ウイルス組成物の特性評価のためのサイズ排除クロマトグラフィーの方法 - Google Patents
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Abstract
Description
組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベースのベクターは、現在最も広く使用されている開発中の遺伝子療法製品である。rAAVベクターシステムの使用が好まれる理由は、部分的には、野生型ウイルスに関連する疾患がないこと、AAVの形質導入が非分裂細胞にも分裂細胞にも可能であること、及び臨床試験で結果的に長期のロバストな導入遺伝子発現が観察されていることによるものであり、このことは、遺伝子療法の適応症における点で、送達の大きな可能性を示している。加えて、種々の天然及び組換えrAAVベクター血清型は、種々の組織、器官、及び細胞を特異的に標的とし、ベクターに対する任意の既存の免疫を回避するのに役立ち、そのためAAVベース遺伝子療法の治療応用を拡大する。複製欠損型ウイルス(例えば、AAV)ベース遺伝子療法がより広く後期臨床段階及び商業的使用に採用され得る前に、組換えウイルス粒子を大規模生産するための新たな方法を開発する必要がある。
a)組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を含む組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階;および
b)変性したrAAV粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
rAAVゲノムを単離する方法。
AAVゲノムを回収する段階をさらに含む、[1]の方法。
約260nm及び約280nmの一方または両方で、溶出液のUV吸光度を測定する段階をさらに含む、[1]の方法。
単離されたrAAV粒子を含む組成物のベクターゲノムサイズ純度を決定する方法であって、前記方法が、
a)前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階;
b)変性したrAAV粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階;
c)約260nm及び約280nmの一方または両方で、溶出液のUV吸光度を測定する段階;ならびに
d)rAAV粒子を含む前記組成物のベクターゲノムサイズ純度を決定する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
前記方法。
カプシド内のAAVベクターゲノムのフォールディングまたは二次構造を評価する方法であって、前記方法が、
a)組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階;
b)変性したrAAV粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階;ならびに
c)約260nm及び約280nmの一方または両方で、溶出液のUV吸光度を測定する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
前記方法。
単離されたrAAV粒子を含む組成物のベクターゲノム力価(Vg)を決定する方法であって、前記方法が、
a)前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階;
b)変性したrAAV粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階;
c)約260nm及び約280nmの一方または両方で、溶出液のUV吸光度を測定する段階;ならびに
d)rAAV粒子を含む前記組成物のVgを決定する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
前記方法。
前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階が、dsDNAのSECシグナルを実質的に最大化する条件に、前記組成物を曝露することを含む、[1]~[6]のいずれか1つの方法。
前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階が、前記組成物中の実質的にすべてのウイルスゲノムを変性させるのに必要な最低温度と比べて10℃以内で上回る温度に、前記組成物を曝露することを含む、[1]~[6]のいずれか1つの方法。
前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階が、AUCによって決定される、同じ組成物の充填不完全なカプシドの割合(%)と相関する、断片DNAの割合(%)の決定をもたらす条件に、前記組成物を供することを含む、[1]~[6]のいずれか1つの方法。
前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階が、dsDNAのSECシグナルを実質的に最大化する熱変性に、前記組成物を曝露することを含む、[1]~[6]のいずれか1つの方法。
前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階が、AUCによって決定される、同じ組成物の充填不完全なカプシドの割合(%)と相関する、断片DNAの割合(%)の決定をもたらす熱変性に、前記組成物を供することを含む、[1]~[6]のいずれか1つの方法。
前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階が、前記組成物を、約65℃~約95℃、任意選択で約70℃~約90℃、約75℃~約85℃、または約80℃~約85℃の温度でインキュベートすることを含む、[1]~[6]のいずれか1つの方法。
前記インキュベートが、約70℃、約75℃、約80℃、約85℃、または約90℃である、[12]の方法。
前記インキュベートが約75℃である、[12]の方法。
前記インキュベートが約80℃である、[12]の方法。
前記インキュベートが約85℃である、[12]の方法。
前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階が、前記組成物を約65℃~約95℃の温度で約5分~60分間インキュベートすることを含む、[12]~[16]のいずれか1つの方法。
前記インキュベートが、約10分、約15分、約20分、約25分、約30分、約35分、約40分、約45分、または約60分間である、[17]の方法。
前記インキュベートが約10分間である、[17]の方法。
前記インキュベートが約15分間である、[17]の方法。
前記インキュベートが約20分間である、[17]の方法。
前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階が、界面活性剤の存在下で前記組成物を約65℃~約95℃の温度で約5分~60分間インキュベートすることを含む、[12]~[21]のいずれか1つの方法。
前記界面活性剤が、SDS、臭化トリメチルアンモニウム(ETMAB)、ポリソルベート80、ポリソルベート20、Pluronic F-68、またはそれらの組合せを含む、[22]の方法。
前記界面活性剤が、約0.005%~約0.5%の濃度を有する、[22]の方法。
前記界面活性剤が、約0.005%~約0.5%のSDSを含む、[22]の方法。
前記界面活性剤が、約0.05%のSDSを含む、[22]の方法。
前記変性プロセスによって、試料中の実質的にすべてのウイルス粒子が変性する、[12]~[26]のいずれか1つの方法。
前記変性プロセスによって、試料中の少なくとも約95%のウイルス粒子が変性する、[12]~[26]のいずれか1つの方法。
変性したrAAV粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階が、前記組成物を、約50nm~約500nmの公称孔径を備えるサイズ排除クロマトグラフィー樹脂に接触させることを含む、[1]~[28]のいずれか1つの方法。
前記公称孔径が、約100nm、200nm、300nm、または400nmである、[29]の方法。
前記公称孔径が約200nmである、[29]の方法。
サイズ排除クロマトグラフィーが、高速液体クロマトグラフィーまたは超高速液体クロマトグラフィーシステムの使用を含む、[1]~[31]のいずれか1つの方法。
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、及び界面活性剤を含む、[1]~[32]のいずれか1つの方法。
前記移動相が、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、及びそれらの組合せからなる群から選択される塩を含む、[1]~[33]のいずれか1つの方法。
前記移動相が、塩化ナトリウムを含む、[34]の方法。
前記移動相が、ポリソルベート80、ポロキサマー188、ポロキサマー407、ポリソルベート20、Pluronic F-68、またはBRIJ 35、及びそれらの組合せからなる群から選択される界面活性剤を含む、[1]~[35]のいずれか1つの方法。
前記移動相が、ポリソルベート80を含む、[36]の方法。
前記移動相が、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド(DMSO)、テトラヒドロフラン(THF)、トリフルオロエタノール(TFE)、ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、及びそれらの組合せからなる群から選択される有機溶媒を含む、[1]~[37]のいずれか1つの方法。
前記移動相が、メタノールを含む、[38]の方法。
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、緩衝剤をさらに含む、[1]~[39]のいずれか1つの方法。
前記緩衝剤が、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、HEPES、MES、トリス、ビス-トリス、MOPS、TES、ビシン、グリシン、トリシン、N-グリシルグリシン、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、グリシルグリシン、リジン、アルギニン、及びそれらの組合せからなる群から選択される、[40]の方法。
前記緩衝剤がリン酸ナトリウムである、[40]の方法。
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベート80、及びメタノールを含む、[1]~[42]のいずれか1つの方法。
前記移動相が、約5mM~約50mMのリン酸ナトリウム、約100mM~約500mMの塩化ナトリウム、約0.01%~約0.5%のポリソルベート80、及び約5%~約50%のメタノールを含み、かつ約6.0~8.5のpHを有する、[43]の方法。
前記移動相が、約10mMのリン酸ナトリウム、約300mMの塩化ナトリウム、約0.05%のポリソルベート80、及び約20%のメタノールを含み、かつ約7.5のpHを有する、[43]の方法。
rAAV粒子を含む前記組成物が、約2E+10ゲノムコピー/ml~約1E+14ゲノムコピー/mlを含む、[1]~[45]のいずれか1つの方法。
本明細書において、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ゲノムを単離する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、rAAV粒子を含む組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供した後、変性したrAAV粒子を含む組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供することを含む。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、さらに緩衝剤を含む。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語及び科学的用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本開示の方法の理解を容易にするため、以下に複数の用語及び表現を定義する。
いくつかの実施形態では、本開示は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ゲノムを単離する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、rAAV粒子を含む組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供した後、変性したrAAV粒子を含む組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供することを含む。いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、さらに緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベート80、及びメタノールを含む。
提供する方法は、任意の単離されたrAAV粒子を含む組成物のベクターゲノムサイズ純度の決定、カプシド内のベクターゲノムのフォールディングまたは二次構造の評価、及び任意の単離されたrAAV粒子を含む組成物のベクターゲノム力価(Vg)の決定を含むがこれらに限定されない、任意の単離された組換えAAV粒子の特性評価に適している。さらに、提供する方法は、任意の単離された組換えAAV粒子から、AAVゲノムを単離するのに適している。そのため、rAAVは、当技術分野で公知の任意の血清型、修飾物、もしくは派生物、またはこれらの任意の組合せ(例えば、2つ以上の血清型を含む(例えば、rAAV2、rAAV8、及びrAAV9粒子のうちの2つ以上を含む)rAAV粒子集団)とすることができる。いくつかの実施形態では、rAAV粒子は、AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7,AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15、及びAAV-16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、もしくはAAV.HSC16、または他のrAAV粒子、あるいはこれらのうちの2つ以上の組合せである。
いくつかの実施形態では、本開示は、(a)不純物を含むフィード(例えば、rAAV生成培養物)からrAAV粒子を単離し、(b)単離されたrAAV粒子を、本明細書に開示する方法を使用して特性評価することを含む、単離された組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を含む組成物の生成方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する単離された組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を含む製剤の製造方法は、(a)不純物を含むフィード(例えば、rAAV生成培養物)からrAAV粒子を単離し、(b)単離されたrAAV粒子を、本明細書に開示する方法を使用して特性評価し、そして(c)単離されたrAAV粒子を製剤化して、製剤を製造することを含む。
製品の純度は、安全性と有効性に影響を及ぼし得る治療用生物製剤の重要な品質属性であるため、リリース試験を含む管理の保証が重要である。AAVベクターゲノムは細胞核に送達され、カプシドタンパク質よりもはるかに長く、長期間持続し得る。したがって、AAV製品のベクターゲノム純度を評価することが望ましい。空のカプシドと完全なカプシドの比を定量化するインタクトなAAVの相対純度は、分析用超遠心法(AUC)、低温電子顕微鏡法、及びイオン交換クロマトグラフィーによって測定することができる。さらに、充填不完全なカプシドと呼ばれることが多い、断片化ゲノム及び非導入遺伝子に関連するDNA混入物を有するベクターの存在は、AUCによって解決することができる。カプシドタンパク質の純度は、SDS-PAGEまたはSDS-CGEで測定することができる。キャピラリー電気泳動及びゲル電気泳動によってAAVゲノムを分析するためのいくつかの研究が発表されているものの、AAVゲノムの純度を決定するためのコンセンサスのとれた方法は確立されていない。本明細書において、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により、AAVベクターゲノムの純度及び構造を高感度かつ高再現性で評価するためのハイスループット法を開示する。
rAAV試料のSEC特性を、75℃で10分間、85℃で10分間、または85℃で20分間の変性後に分析した。図4。75℃に10分間曝露した試料に、一部が二次構造を有するssDNAが存在していたことは、熱処理によって完全に変性していなかったことを示している。ssDNAの完全な変性/線形化にとって、85℃、20分間は最適であった。3つすべての試料で少量のトランケートされたベクターゲノムが観察された。75℃で10分間の変性後の同じrAAVの異なる製剤のSEC分析により、一部が二次構造を有するssDNAのレベルが、異なる製剤間で異なることが示された。
rAAV試料のSEC特性を、75℃、80℃、85℃、90℃、または95℃で20分間の熱変性後に分析した。図5。dsDNAのシグナル強度は、例えば実施例2に示すデータに基づいて予想されるように、75℃よりも80℃及び85℃での熱変性後に高かった。驚くべきことに、熱変性温度を90℃及び95℃までさらに上昇させることにより、dsDNAシグナルが失われた。これらの結果は、最大のシグナルをもたらす最適な熱変性温度があり、試験した特定の試料の最適な熱変性温度が約80℃~約85℃の範囲であったことを示した。90℃及び95℃での20分間のインキュベーションでは、AAVゲノムが有意に分解されるとは予想されなかったため、この観察結果は驚くべきものであった。いかなる特定の理論にも制限されるものではないが、高温、すなわち、90℃及び95℃でのインキュベーションは、物質の損失を生じさせ得、及び/または人工的なDNA断片を生じさせ得る。観察された物質の損失及び断片化は、AAVベクターゲノムの熱不安定性を示していたが、これはAAV製品ごとに異なる可能性があり、おそらくベクター配列及びDNAコンストラクトの設計に関連している。
85℃で20分間の処理による完全な変性の後、3つの異なるrAAV粒子を含む組成物中に低レベルの断片化DNAが観察された。図3。AUCによって決定された部分充填rAAV粒子のレベルと、DNA-SECによって検出された断片化DNAのレベルは、一致した結果を示した。図6。したがって、本明細書に開示するDNA-SEC法を、AUCに対するハイスループット直交法として使用して、トランケート型ベクターゲノムを含む部分充填rAAV粒子の比率を定量化することができる。
DNA-SECによって決定される断片DNAの割合(%)とAUCによって決定される充填不完全なカプシドの割合(%)の間の良好な相関は、DNA-SECを使用して、多数の試料中の充填不完全なカプシドのレベルを迅速に評価して、製品開発及びプロセス最適化をサポートすることができることを示している。
本明細書に開示するDNA-SEC及びddPCRを使用して、複数のrAAV製剤について、ウイルスゲノムコピー(VGC)力価を測定した。DNA-SEC及びddPCRは、AAV製品に対して全体的に一致したVGC力価の結果を示した。
特定のAAV集団、例えば、アニオン交換クロマトグラフィーから分離されたAAV集団(図7中のAAV_2)は、変性に対する耐性の増加を示した。ddPCRによって決定されたこれらのAAVベクターのゲノム含有量は、分光光度法またはSEC定量化によって決定された含有量よりも低く、これは、コンパクトなDNA構造の存在と、PCR効率を向上させるためのさらなる変性の必要性を示している。本明細書に示すように、様々な変性条件を使用することにより、本明細書に開示するDNA-SEC法を使用して、カプシド内のAAVベクターゲノムの二次構造/フォールディングに関する情報を提供することができ、これは、潜在的にPCRベースのアッセイの効率と効力に影響を与え得る。
DNA-SECは、プロセス最適化と製品の特性評価をサポートするハイスループットスクリーニングアッセイとして使用することができる。図8は、5つの異なる最適化されたプロセスによって生成される5つのrAAV製剤のDNA-SEC特性を示す。弱い変性と強い変性の両方の後に、DNA-SEC特性を決定した。ゲノム断片の割合(%)は、5つのrAAV製剤間で、3.9%から7.7%の間で様々に異なっていた。
本明細書に記載のDNA-SECアッセイは、信頼性の高い方法を提供し、このアッセイを、精度、線形性及び定量限界(LoQ)に関する性能について試験した。再現性は、同じSEC実行中の5%以内の繰り返し性、10%以内の中間精度であった。アッセイは線形性を示し、AAVの2.9E+10~29E+10GCの検出範囲、及びAAVの約2E+10GCのLoQであった。図9。
Claims (46)
- a)組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を含む組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階;および
b)変性したrAAV粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
rAAVゲノムを単離する方法。 - AAVゲノムを回収する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 約260nm及び約280nmの一方または両方で、溶出液のUV吸光度を測定する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 単離されたrAAV粒子を含む組成物のベクターゲノムサイズ純度を決定する方法であって、前記方法が、
a)前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階;
b)変性したrAAV粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階;
c)約260nm及び約280nmの一方または両方で、溶出液のUV吸光度を測定する段階;ならびに
d)rAAV粒子を含む前記組成物のベクターゲノムサイズ純度を決定する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
前記方法。 - カプシド内のAAVベクターゲノムのフォールディングまたは二次構造を評価する方法であって、前記方法が、
a)組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階;
b)変性したrAAV粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階;ならびに
c)約260nm及び約280nmの一方または両方で、溶出液のUV吸光度を測定する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
前記方法。 - 単離されたrAAV粒子を含む組成物のベクターゲノム力価(Vg)を決定する方法であって、前記方法が、
a)前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階;
b)変性したrAAV粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階;
c)約260nm及び約280nmの一方または両方で、溶出液のUV吸光度を測定する段階;ならびに
d)rAAV粒子を含む前記組成物のVgを決定する段階
を含み、
前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、または界面活性剤を含む、
前記方法。 - 前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階が、dsDNAのSECシグナルを実質的に最大化する条件に、前記組成物を曝露することを含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階が、前記組成物中の実質的にすべてのウイルスゲノムを変性させるのに必要な最低温度と比べて10℃以内で上回る温度に、前記組成物を曝露することを含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階が、AUCによって決定される、同じ組成物の充填不完全なカプシドの割合(%)と相関する、断片DNAの割合(%)の決定をもたらす条件に、前記組成物を供することを含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階が、dsDNAのSECシグナルを実質的に最大化する熱変性に、前記組成物を曝露することを含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階が、AUCによって決定される、同じ組成物の充填不完全なカプシドの割合(%)と相関する、断片DNAの割合(%)の決定をもたらす熱変性に、前記組成物を供することを含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階が、前記組成物を、約65℃~約95℃、任意選択で約70℃~約90℃、約75℃~約85℃、または約80℃~約85℃の温度でインキュベートすることを含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インキュベートが、約70℃、約75℃、約80℃、約85℃、または約90℃である、請求項12に記載の方法。
- 前記インキュベートが約75℃である、請求項12に記載の方法。
- 前記インキュベートが約80℃である、請求項12に記載の方法。
- 前記インキュベートが約85℃である、請求項12に記載の方法。
- 前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階が、前記組成物を約65℃~約95℃の温度で約5分~60分間インキュベートすることを含む、請求項12~16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インキュベートが、約10分、約15分、約20分、約25分、約30分、約35分、約40分、約45分、または約60分間である、請求項17に記載の方法。
- 前記インキュベートが約10分間である、請求項17に記載の方法。
- 前記インキュベートが約15分間である、請求項17に記載の方法。
- 前記インキュベートが約20分間である、請求項17に記載の方法。
- 前記組成物を、rAAV粒子が変性する条件に供する段階が、界面活性剤の存在下で前記組成物を約65℃~約95℃の温度で約5分~60分間インキュベートすることを含む、請求項12~21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、SDS、臭化トリメチルアンモニウム(ETMAB)、ポリソルベート80、ポリソルベート20、Pluronic F-68、またはそれらの組合せを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、約0.005%~約0.5%の濃度を有する、請求項22に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、約0.005%~約0.5%のSDSを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、約0.05%のSDSを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記変性プロセスによって、試料中の実質的にすべてのウイルス粒子が変性する、請求項12~26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変性プロセスによって、試料中の少なくとも約95%のウイルス粒子が変性する、請求項12~26のいずれか一項に記載の方法。
- 変性したrAAV粒子を含む前記組成物を、サイズ排除クロマトグラフィーに供する段階が、前記組成物を、約50nm~約500nmの公称孔径を備えるサイズ排除クロマトグラフィー樹脂に接触させることを含む、請求項1~28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記公称孔径が、約100nm、200nm、300nm、または400nmである、請求項28に記載の方法。
- 前記公称孔径が約200nmである、請求項28に記載の方法。
- サイズ排除クロマトグラフィーが、高速液体クロマトグラフィーまたは超高速液体クロマトグラフィーシステムの使用を含む、請求項1~31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、塩、有機溶媒、及び界面活性剤を含む、請求項1~32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記移動相が、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、及びそれらの組合せからなる群から選択される塩を含む、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記移動相が、塩化ナトリウムを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記移動相が、ポリソルベート80、ポロキサマー188、ポロキサマー407、ポリソルベート20、Pluronic F-68、またはBRIJ 35、及びそれらの組合せからなる群から選択される界面活性剤を含む、請求項1~35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記移動相が、ポリソルベート80を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記移動相が、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド(DMSO)、テトラヒドロフラン(THF)、トリフルオロエタノール(TFE)、ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)、及びそれらの組合せからなる群から選択される有機溶媒を含む、請求項1~37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記移動相が、メタノールを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、緩衝剤をさらに含む、請求項1~39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記緩衝剤が、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、HEPES、MES、トリス、ビス-トリス、MOPS、TES、ビシン、グリシン、トリシン、N-グリシルグリシン、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、グリシルグリシン、リジン、アルギニン、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項40に記載の方法。
- 前記緩衝剤がリン酸ナトリウムである、請求項40に記載の方法。
- 前記サイズ排除クロマトグラフィーの移動相が、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベート80、及びメタノールを含む、請求項1~42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記移動相が、約5mM~約50mMのリン酸ナトリウム、約100mM~約500mMの塩化ナトリウム、約0.01%~約0.5%のポリソルベート80、及び約5%~約50%のメタノールを含み、かつ約6.0~8.5のpHを有する、請求項43に記載の方法。
- 前記移動相が、約10mMのリン酸ナトリウム、約300mMの塩化ナトリウム、約0.05%のポリソルベート80、及び約20%のメタノールを含み、かつ約7.5のpHを有する、請求項43に記載の方法。
- rAAV粒子を含む前記組成物が、約2E+10ゲノムコピー/ml~約1E+14ゲノムコピー/mlを含む、請求項1~45のいずれか一項に記載の方法。
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