CN115806596A - 腺相关病毒突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了腺相关病毒突变体及其应用，所述腺相关病毒突变体的外壳蛋白包括SEQ ID NO:1～5所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1～5具有98％以上同一性、且具有相同或相似生物学功能的氨基酸序列。本发明通过对野生型腺相关病毒的外壳蛋白编码基因进行拼接重组，构建腺相关病毒库，采用抗AAV外壳蛋白的中和抗体筛选得到腺相关病毒突变体，对人源肝脏细胞的感染能力强，并能够躲避中和抗体的中和作用，有针对性地解决了血友病治疗领域存在的技术障碍。

Description

腺相关病毒突变体及其应用
本申请是申请号为202010442092.4专利申请的分案申请(原申请的申请日为2020年5月22日，发明名称为腺相关病毒突变体及其应用)。
技术领域
本发明属于基因工程和生物工程技术领域，涉及腺相关病毒突变体及其应用。
背景技术
最近几年，腺相关病毒(AAV)作为基因治疗的载体应用于临床治疗多种基因缺陷病，如B型血友病、DMD进行性肌萎缩、SMA运动障碍等，取得了令人振奋的结果。尤其是AAV在血友病治疗中的成功应用，有望挽救成千上万个对常规治疗手段无效的病人。有文献报道，注射承载九因子基因的AAV后，血友病病人未出现严重的免疫反应，AAV对肝脏的损伤也是一过性的；注射AAV后，病人外周血中九因子的水平恢复至正常水平的10％左右，并且长期稳定表达，基本脱离了对九因子重组蛋白的依赖性。针对八因子缺失导致的A型血友病，初步的临床实验正在进行中。但是，编码凝血八因子的基因较长，约4.5kbp，加上启动子和终止序列，全序列的基因长度已经超过了AAV的包装范围，这是AAV基因治疗方法在治疗A型血友病中遇到的主要障碍，也是目前的研究热点。
然而，AAV基因治疗方法在治疗血友病方面也存在一些局限性。其中之一在于正常人和血友病病人的外周血中存在一定比例的抗AAV外壳蛋白中和抗体，因此，在评估病人能否进行AAV基因治疗前，需要首先检测外周血中是否存在中和抗体，如果病人体内存在抗AAV的中和抗体，便不适合进行AAV基因治疗。考虑到AAV基因治疗方法是具有广泛前景的血友病治疗方法，帮助AAV躲过体内中和抗体的清除作用就显得特别重要。
针对这一问题，研究人员提出了多种方法，包括空壳蛋白中和法、免疫抑制剂预处理法、小片段DNA中和法、AAV外壳蛋白突变法等。空壳蛋白中和法是指在注射AAV时，混入大量的AAV空壳蛋白，用以抵消AAV被体内中和抗体清除的压力，从而增加感染效率。但是研究发现，AAV空壳蛋白更容易被抗原提呈细胞提呈，激发强烈的T细胞免疫反应，增强了T细胞对AAV的清除效果，最终导致AAV的转导效率变低。免疫抑制剂预处理法是指在注射AAV前，给病人注射适量的免疫抑制剂，如地塞米松，这种方法虽然可以在一定程度上提高AAV的转导效率，但是提高程度有限，因为地塞米松对免疫的抑制是广泛的，不能特异性清除针对AAV的中和抗体以及识别AAV的T/B细胞。小片段DNA中和法是指使用能够特异性封闭AAV中和抗体的小片段DNA，应用前景较好，但是尚未出现相关临床应用报道。AAV外壳蛋白突变法是指将中和抗体识别的AAV外壳蛋白氨基酸序列中的某些位点进行突变，降低中和抗体对AAV的识别能力，从而躲避中和抗体的清除作用，目前有大量的研究报道，但是躲避中和抗体的原因和方式尚无法阐明。
因此，对AAV进行改造从而躲过体内中和抗体的清除作用，提高AAV的适用范围，在基因缺陷病治疗领域具有重要意义和广泛的应用前景。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了腺相关病毒突变体及其应用，所述腺相关病毒突变体对人源肝脏细胞的感染能力强，并能够躲避中和抗体的中和作用，有针对性地解决了存在抗AAV中和抗体的血友病患者在接受基因治疗时遇到的障碍。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种腺相关病毒突变体，所述腺相关病毒突变体的外壳蛋白包括SEQ ID NO:1～5所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:1：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGGTESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDKERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPHPIGTRYLTRPL；
SEQ ID NO:2：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYNLNGRNSLANPGIAMASHKDDKERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPHPIGTRYLTRPL；
SEQ ID NO:3：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDRQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMASHKDDKERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL；
SEQ ID NO:4：
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMASHKDDKERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPHPIGTRYLTRPL；
SEQ ID NO:5：
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDKERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL。
本发明中，通过对野生型腺相关病毒的外壳蛋白编码基因进行拼接重组，构建腺相关病毒库，采用抗AAV外壳蛋白的中和抗体筛选得到五种腺相关病毒突变体，所述腺相关病毒突变体的外壳蛋白包括SEQ ID NO:1～5所示的氨基酸序列，得到的腺相关病毒突变体具有逃避抗AAV中和抗体的能力，并对人肝脏细胞具有高效特异的感染能力，在血友病基因治疗领域具有广泛的应用前景。
本发明筛选得到的五种腺相关病毒突变体的序列同源性高，与野生型AAV9进行序列比对后发现，位于AAV外壳蛋白氨基酸序列N端第100位到第200位氨基酸可能是抗AAV中和抗体的高频识别区。
优选地，所述腺相关病毒突变体的外壳蛋白还包括与SEQ ID NO:1～5具有98％以上同一性、且具有相同或相似生物学功能的氨基酸序列，例如可以是所述腺相关病毒突变体的外壳蛋白与SEQ ID NO:1～5的同一性达到98％，且具有逃避抗AAV中和抗体的能力。
第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的腺相关病毒突变体，或编码与第一方面所述的腺相关病毒突变体具有相同或相似生物学功能的蛋白。
优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:6～10所示的核酸序列和/或SEQ ID NO:6～10的互补序列；
SEQ ID NO:6：
GCGATCTGGTCATGTGGATTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGATGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGGCTTCTTGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGCGGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCTGTAGAGCAGTCTCCTCAGGAACCGGACTCCTCCGCGGGTATTGGCAAATCGGGTGCACAGCCCGCCAAAAAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGGCACAGAGTCAGTTCCAGACCCTCAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAGCGCCCTCTGGTGTGGGACCTAATACAATGGCTGCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAGTGCTTCAACGGGGGCCAGCAACGACAACCACTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTTAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAGCTTCAAGCTCTTCAACATCCAGGTCAAGGAGGTCACGCAGAATGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAACCTCACCAGCACCATCCAGGTGTTTACGGACTCGGAGTACCAGCTGCCGTACGTTCTCGGCTCCGCCCACCAGGGCTGCCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTCTTCATGATTCCTCAGTACGGGTACCTGACTCTGAACAATGGCAGTCAGGCCGTGGGACGCTCCTCCTTCTACTGCCTGGAATACTTTCCTTCGCAGATGCTGAGAACCGGCAACAACTTCCAGTTTACTTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAGAGCTTGGACCGGCTGATGAATCCTCTGATTGACCAGTACCTGTACTACTTGTCTCGGACTCAAACAACAGGAGGCACGGCAAATACGCAGACTCTGGGCTTCAGCCAAGGTGGGCCTAATACAATGGCCAATCAGGCAAAGAACTGGCTGCCAGGACCCTGTTACCGCCAACAACGCGTCTCAACGACAACCGGGCAAAACAACAATAGCAACTTTGCCTGGACTGCTGGGACCAAATACCATCTGAATGGAAGAAATTCATTGGCTAATCCTGGCATCGCTATGGCAACACACAAAGACGACAAGGAGCGTTTTTTTCCCAGTAACGGGATCCTGATTTTTGGCAAACAAAATGCTGCCAGAGACAATGCGGATTACAGCGATGTCATGCTCACCAGCGAGGAAGAAATCAAAACCACTAACCCTGTGGCTACAGAGGAATACGGTATCGTGGCAGATAACTTGCAGCAGCAAAACACGGCTCCTCAAATTGGAACTGTCAACAGCCAGGGGGCCTTACCCGGTATGGTCTGGCAGAACCGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAGATTCCTCACACGGACGGCAACTTCCACCCGTCTCCGCTGATGGGCGGCTTTGGCCTGAAACATCCTCCGCCTCAGATCCTGATCAAGAACACGCCTGTACCTGCGGATCCTCCGACCACCTTCAACCAGTCAAAGCTGAACTCTTTCATCACGCAATACAGCACCGGACAGGTCAGCGTGGAAATTGAATGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCCGAGATCCAGTACACCTCCAACTACTACAAATCTACTAGTGTGGACTTTGCTGTTAATACAGAAGGCGTGTACTCTGAACCCCACCCCATTGGCACCCGTTACCTCACCCGTCCCCTGTAATTGTCTGTTAATCAATAAACCGGTTGATTCGTTTCAGTTGAACTTTGGTGTCGTCTAGAGGGCCGCTCGATAAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTTCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCACGAAAGAACATGTGAGCAAAACGCCAGCAAAAGCCAGGAACCGTAAAAAGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGATCTCA；
SEQ ID NO:7：
GGTCATGTGGTTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGACGACAGCAGGGGTCTTGTGCTTCCTGGGTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGAGAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAAGCCTACGACCGGCAGCTCGACAGCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCGGAGTTTCAGGAGCGCCTTAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGACGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTTGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCTGTAGAGCAGTCTCCTCAGGAACCGGACTCCTCCGCGGGTATTGGCAAATCGGGTGCACAGCCCGCCAAAAAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACTCAGAGTCAGTTCCAGACCCTCAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAGCGCCCTCTGGTGTGGGACCTAATACAATGGCTTCAGGTGGTGGCGCACCAGTGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACTTACAACAACCATCTCTACAAGCAAATCTCCAGTGCTTCAACGGGGGCCAGCAACGACAACCACTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCTAAGCGACTCAACTTCAAACTCTTCAACATTCAGGTCAAAGAGGTTACGGACAACAATGGAGTCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTCCAGGTCTTCACGGACTCGGAGTACCAGTTGCCGTACGTCCTCGGCTCTGCGCACCAGGGCTGCCTCCCTCCGTTCCCGGCGGACGTGTTCATGATTCCTCAGTACGGCTACCTAACGCTCAACAATGGCAGCCAGGCAGTGGGACGGTCATCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCATCGCAGATGCTGAGAACCGGCAACAACTTCCAGTTTACTTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAGAGCTTGGACCGGCTGATGAATCCTCTGATTGACCAGTACCTGTACTACTTGTCTCGGACTCAAACAACAGGAGGCACGGCAAATACGCAGACTCTGGGCTTCAGCCAAGGTGGGCCTAATACAATGGCCAATCAGGCAAAGAACTGGCTGCCAGGACCCTGTTACCGCCAACAACGCGTCTCAACGACAACCGGGCAAAACAACAATAGCAACTTTGCCTGGACTGCTGGGACCAAATACAATCTGAATGGAAGAAATTCATTGGCTAATCCTGGCATCGCTATGGCCTCACACAAAGACGACAAGGAGCGTTTTTTTCCCAGTAACGGGATCCTGATTTTTGGCAAACAAAATGCTGCCAGAGACAATGCGGATTACAGCGATGTCATGCTCACCAGCGAGGAAGAAATCAAAACCACTAACCCTGTGGCTACAGAGGAATACGGTATCGTGGCAGATAACTTGCAGCAGCAAAACACGGCTCCTCAAATTGGAACTGTCAACAGCCAGGGGGCCTTACCCGGTATGGTCTGGCAGAACCGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAGATTCCTCACACGGACGGCAACTTCCACCCGTCTCCGCTGATGGGCGGCTTTGGCCTGAAACATCCTCCGCCTCAGATCCTGATCAAGAACACGCCTGTACCTGCGGATCCTCCGACCACCTTCAACCAGTCAAAGCTGAACTCTTTCATCACGCAATACAGCACCGGACAGGTCAGCGTGGAAATTGAATGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCCGAGATCCAGTACACCTCCAACTACTACAAATCTACAAGTGTGGACTTTGCTGTTAATACAGAAGGCGTGTACTCTGAACCCCACCCCATTGGCACCCGTTACCTCACCCGTCCCCTGTAATTGTCTGTTAATCAATAAACCGGTTGATTCGTTTCAGTTGAACTTTGGTGTCGTCTAGAGGGCCGCTCGATAAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTTCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCCTGACGAGCATCACAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATAACAGGCGTTTCCCCCTGGAGCTCCCTCGTGCGCTCCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTACCGGATACCTGTCCGCCGTTCCCCCTTCCGGGAGCGTGCGCCTT；
SEQ ID NO:8：
GGTCATGTGGATTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGACGACAGCAGGGGTCTTGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGATGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCGGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCGGAGTTTCAGGAGCGCCTTAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGAGGGTTCTCGAACCTTTTGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCTGTAGAGCAGTCGCCACAAGAGCCAGACTCCTCCTCGGGCATTGGCAAGACAGGCCAGCAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTTGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCAGACCCTCAACCAATCGGAGAACCTCCCGCAGCCCCCTCAGGTGTGGGATCTCTTACAATGGCTTCAGGTGGTGGCGCACCAGTGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACTTACAACAACCATCTCTACAAGCAAATCTCCAGTGCTTCAACGGGGGCCAGCAACGACAACCACTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCTAAGCGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATTCAGGTCAAAGAGGTTACGGACAACAATGGAGTCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTCCAGGTCTTCACGGACTCGGAGTACCAGTTGCCGTACGTCCTCGGCTCTGCGCACCAGGGCTGCCTCCCTCCGTTCCCGGCGGACGTGTTCATGATTCCGCAGTACGGCTACCTAACGCTCAACAATGGCAGCCAGGCAGTGGGACGGTCATCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCATCGCAGATGCTGAGAACCGGCAACAACTTCCAGTTTACTTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCCCACAGCCAGAGCTTGGACCGGCTGATGAATCCTCTGATTGACCAGTACCTGTACTACTTGTCTCGGACTCAAACAACAGGAGGCACGGCAAATACGCAGACTCTGGGCTTCAGCCAAGGTGGGCCTAATACAATGGCCAATCAGGCAAAGAACTGGCTGCCAGGACCCTGTTACCGCCAACAACGCGTCTCAACGACAACCGGGCAAAACAACAATAGCAACTTTGCCTGGACTGCTGGGACCAAATACCATCTGAATGGAAGAAATTCATTGGCTAATCCTGGCATCGCTATGGCCTCACACAAAGACGACAAGGAGCGTTTTTTTCCCAGTAACGGGATCCTGATTTTTGGCAAACAAAATGCTGCCAGAGACAATGCGGATTACAGCGATGTCATGCTCACCAGCGAGGAAGAAATCAAAACCACTAACCCTGTGGCTACAGAGGAATACGGTATCGTGGCAGATAACTTGCAGCAGCAAAACACGGCTCCTCAAATTGGAACTGTCAACAGCCAGGGGGCCTTACCCGGTATGGTCTGGCAGAACCGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAGATTCCTCACACGGACGGCAACTTCCACCCGTCTCCGCTGATGGGCGGCTTTGGCCTGAAACATCCTCCGCCTCAGATCCTGATCAAGAACACGCCTGTACCTGCGGATCCTCCGACCACCTTCAACCAGTCAAAGCTGAACTCTTTCATCACGCAATACAGCACCGGACAGGTCAGCGTGGAAATTGAATGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCCGAGATCCAGTACACCTCCAACTACTACAAATCTACAAGTGTGGACTTTGCTGTTAATACAGAAGGCGTGTACTCTGAACCCCGCCCCATTGGCACCCGTTACCTCACCCGTAATCTGTAATTGCTTGTTAATCAATAAACCGTTTAATTCGTTTCAGTTGAACTTTGGTGTCGTCTAGAGGGCCGCTCGATAAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTTCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGCCAGCAAAACGCCAGGAACCGTAAAAAGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGCTCCGCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCTGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCTGTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACTGTCCGCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGTATCTCAGTTCGTGTAGTCGTCGCTCAGCTGGGCTGGGTGCACGACCCCGTTCAGCCCGACGCTGCGCCTTATCGGTACTATCGTCT；
SEQ ID NO:9：
GGTCATGTGGATTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGACTTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGATGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGAGGGTTCTCGAACCTTTTGGTCTGGTTGAGGAAGGTGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAACGTCCGGTAGAGCAGTCGCCACAAGAGCCAGACTCCTCCTCGGGCATTGGCAAGACAGGCCAGCAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTTGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCAGACCCTCAACCAATCGGAGAACCTCCCGCAGCCCCCTCAGGTGTGGGATCTCTTACAATGGCTTCAGGTGGTGGCGCACCAGTGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACTTACAACAACCATCTCTACAAGCAAATCTCCAGTGCTTCAACGGGGGCCAGCAACGACAACCACTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCTAAGCGACTCAACTTCAAACTCTTCAACATTCAGGTCAAAGAGGTTACGGACAACAATGGAGTCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTCCAGGTCTTCACGGACTCGGAGTACCAGTTGCCGTACGTCCTCGGCTCTGCGCACCAGGGCTGCCTCCCTCCGTTCCCGGCGGACGTGTTCATGATTCCGCAGTACGGCTACCTAACGCTTAACAATGGCAGCCAGGCAGTGGGACGGTCATCCTTCTACTGCCTGGAATACTTTCCTTCGCAGATGCTGAGAACCGGCAACAACTTCCAGTTTACTTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCCCACAGCCAGAGCTTGGACCGGCTGATGAATCCTCTGATTGACCAGTACCTGTACTACTTGTCTCGGACTCAAACAACAGGAGGCACGGCAAATACGCAGACTCTGGGCTTCAGCCAAGGTGGGCCTAATACAATGGCCAATCAGGCAAAGAACTGGCTGCCAGGACCCTGTTACCGCCAACAACGCGTCTCAACGACAACCGGGCAAAACAACAATAGCAACTTTGCCTGGACTGCTGGGACCAAATACCATCTGAATGGAAGAAATTCATTGGCTAATCCTGGCATCGCTATGGCCTCACACAAAGACGACAAGGAGCGTTTTTTTCCCAGTAACGGGATCCTGATTTTTGGCAAACAAAATGCTGCCAGAGACAATGCGGATTACAGCGATGTCATGCTCACCAGCGAGGAAGAAATCAAAACCACTAACCCTGTGGCTACAGAGGAATACGGTATCGTGGCAGATAACTTGCAGCAGCAAAACACGGCTCCTCAAATTGGAACTGTCAACAGCCAGGGGGCCTTACCCGGTATGGTCTGGCAGAACCGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAGATTCCTCACACGGACGGCAACTTCCACCCGTCTCCGCTGATGGGCGGCTTTGGCCTGAAACATCCTCCGCCTCAGATCCTGATCAAGAACACGCCTGTACCTGCGGATCCTCCGACCACCTTCAACCAGTCAAAGCTGAACTCTTTCATCACGCAATACAGCACCGGACAGGTCAGCGTGGAAATTGAATGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCCGAGATCCAGTACACCTCCAACTACTACAAATCTACAAGTGTGGACTTTGCTGTTAATACAGAAGGCGTGTACTCTGAACCCCACCCCATTGGCACCCGTTACCTCACCCGTCCCCTGTAATTGTCTGTTAATCAATAAACCGGTTGATTCGTTTCAGTTGAACTTTGGTGTCGTCTAGAGGGCCGCTCGATAAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTTCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAAGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTCGGTGTAGTCGTCGCTCCAAGCTGGGCTGGGTGCACGAACCCCGTCAGCCCGAC；
SEQ ID NO:10：
GGTCATGTGGATTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGCGCTGAAACCTGGAGCCCCGAAGCCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAACGTCCGGTAGAGCAGTCGCCACAAGAGCCAGACTCCTCCTCGGGCATCGGCAAGACAGGCCAGCAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTTGGTCAGACTGGCGACTCAGAGTCAGTCCCCGACCCACAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAACCCCCGCTGCTGTGGGACCTACTACAATGGCTTCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACATGGGCCTTGCCCACCTATAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAGTGCTTCAACGGGGGCCAGCAACGACAACCACTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCTAAGCGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATTCAGGTCAAAGAGGTTACGGACAACAATGGAGTCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTCCAGGTCTTCACGGACTCGGAGTACCAGTTGCCGTACGTCCTCGGCTCTGCGCACCAGGGCTGCCTCCCTCCGTTCCCGGCGGACGTGTTCATGATTCCTCAGTACGGGTATCTGACGCTTAATGATGGAAGCCAGGCCGTGGGACGCTCCTCCTTCTACTGCCTGGAATACTTTCCTTCGCAGATGCTGAGAACCGGCAACAACTTCCAGTTTACTTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCCCACAGCCAGAGCTTGGACCGGCTGATGAATCCTCTGATTGACCAGTACCTGTACTACTTGTCTCGGACTCAAACAACAGGAGGCACGGCAAATACGCAGACTCTGGGCTTCAGCCAAGGTGGGCCTAATACAATGGCCAATCAGGCAAAGAACTGGCTGCCAGGACCCTGTTACCGCCAACAACGCGTCTCAACGACAACCGGGCAAAACAACAATAGCAACTTTGCCTGGACTGCTGGGACCAAATACCATCTGAATGGAAGAAATTCATTGGCTAATCCTGGCATCGCTATGGCAACACACAAAGACGACAAGGAGCGTTTTTTTCCCAGTAACGGGATCCTGATTTTTGGCAAACAAAATGCTGCCAGAGACAATGCGGATTACAGCGATGTCATGCTCACCAGCGAGGAAGAAATCAAAACCACTAACCCTGTGGCTACAGAGGAATACGGTATCGTGGCAGATAACTTGCAGCAGCAAAACACGGCTCCTCAAATTGGAACTGTCAACAGCCAGGGGGCCTTACCCGGTATGGTCTGGCAGAACCGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAGATTCCTCACACGGACGGCAACTTCCACCCGTCTCCGCTGATGGGCGGCTTTGGCCTGAAACATCCTCCGCCTCAGATCCTGATCAAGAACACGCCTGTACCTGCGGATCCTCCGACCACCTTCAACCAGTCAAAGCTGAACTCTTTCATCACGCAATACAGCACCGGACAGGTCAGCGTGGAAATTGAATGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCCGAGATCCAGTACACCTCCAACTACTACAAATCTACAAGTGTGGACTTTGCTGTTAATACAGAAGGCGTGTACTCTGAACCCCGCCCCATTGGCACCCGTTACCTCACCCGTAATCTGTAATTGCTTGTTAATCAATAAACCGTTTAATTCGTTTCAGTTGAACTTTGGTGTCGTCTAGAGGGCCGCTCGATAAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTTCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCTGTTCCGACCTGCCGCTTACCGGATACTGTCCGCTTTCTCCCTTCGGGAGCGTGCGCTTTCTCATAGCT。
本发明中，SEQ ID NO:6所示的核酸序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码序列，SEQ ID NO:7所示的核酸序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的编码序列，SEQ IDNO:8所示的核酸序列为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的编码序列，SEQ ID NO:9所示的核酸序列为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的编码序列，SEQ ID NO:10所示的核酸序列为SEQID NO:5所示的氨基酸序列的编码序列。
第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括插入有第二方面所述的核酸分子的野生型腺相关病毒载体。
优选地，所述野生型腺相关病毒载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10中的任意一种，优选为AAV2。
第四方面，本发明提供了一种腺相关病毒库，所述腺相关病毒库包括第一方面所述的腺相关病毒突变体。
优选地，所述腺相关病毒库还包括不具有躲避抗腺相关病毒外壳蛋白中和抗体能力的野生型和/或突变型腺相关病毒。
第五方面，本发明提供了一种第四方面所述的腺相关病毒库的构建方法，所述方法包括：
(1)PCR扩增野生型腺相关病毒的外壳蛋白编码基因；
(2)将扩增产物采用DNA酶消化后，选取长度为100～300bp的DNA片段进行重新拼接；
(3)将拼接产物插入野生型腺相关病毒载体中，得到腺相关病毒载体库；
(4)将所述腺相关病毒载体库与辅助质粒共转染哺乳细胞后，制备得到所述腺相关病毒库。
优选地，步骤(1)所述的PCR引物包括SEQ ID NO:11～12所示的核酸序列；
SEQ ID NO:11：5’-ATAAAGCGAGTAGTC-3’；
SEQ ID NO:12：5’-GAGGGTATGCGACAT-3’。
优选地，步骤(2)所述拼接方法为将长度为100～300bp的DNA片段与DNA聚合酶混合，在96～41℃范围内进行梯度降温，通过Shuffling PCR得到拼接产物。
本发明中，选择长度为100～300bp的DNA片段作为拼接片段，不仅丰富了拼接产物的序列多样性，提高了腺相关病毒库中的病毒量，而且保证了Shuffling PCR的拼接效率，提高拼接产物的拼接成功率，有助于高效筛选得到能够躲避中和抗体中和作用的腺相关病毒突变体。
优选地，步骤(3)所述野生型腺相关病毒载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10中的任意一种，优选为AAV2。
第六方面，本发明提供了一种第一方面所述的腺相关病毒突变体的筛选方法，所述方法包括：
将第四方面所述的腺相关病毒库与人静脉注射用人免疫球蛋白混合孵育，随后导入肝脏细胞人源化小鼠中；
导入腺病毒，饲养一段时间后，分离小鼠肝脏中的人源细胞，提取DNA；
采用SEQ ID NO:13～14所示的引物对进行PCR扩增，将扩增产物插入野生型腺相关病毒载体，与辅助质粒共转染哺乳细胞；培养后裂解哺乳细胞，得到所述腺相关病毒突变体；
SEQ ID NO:13：CAACTCCATCACTAGGGGTTC；
SEQ ID NO:14：CATGGGAAAGGTGCCAGA。
本发明中，上游引物SEQ ID NO:13根据AAV2-rep基因设计，下游引物SEQ ID NO:14根据AAV2-ITR质粒的下游共有序列设计。
第七方面，本发明提供了一种腺相关病毒突变体的制备方法，所述方法包括采用第三方面所述的表达载体与辅助质粒共转染哺乳细胞；培养后裂解哺乳细胞，得到所述腺相关病毒突变体。
第八方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的腺相关病毒突变体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体或第四方面所述的腺相关病毒库中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第九方面，本发明提供了一种第一方面所述的腺相关病毒突变体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的腺相关病毒库或第八方面所述的药物组合物在制备基因缺陷病治疗药物中的应用。
优选地，所述基因缺陷病包括血友病。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过对野生型腺相关病毒的外壳蛋白编码基因进行拼接重组，构建腺相关病毒库，采用抗AAV外壳蛋白的中和抗体筛选得到五种腺相关病毒突变体，具有逃避抗AAV中和抗体的能力，并对人肝脏细胞具有高效特异的感染能力；
(2)本发明筛选得到的五种腺相关病毒突变体的序列同源性高，与野生型AAV9进行序列比对后发现，位于AAV外壳蛋白氨基酸序列N端第100位到第200位氨基酸可能是抗AAV中和抗体的高频识别区；
(3)本发明的腺相关病毒突变体在血友病基因治疗领域具有广泛的应用前景和巨大的市场价值。
附图说明
图1为AAV突变体中外壳蛋白基因序列的来源以及序列中存在的点突变；
图2为AAV突变体和野生型的进化关系；
图3为AAV野生型和突变型在HEK293细胞系中的包装效率；
图4为AAV野生型和突变型体外对Huh7细胞的感染效率；
图5为AAV野生型和突变型体外对IVIG中和抗体的逃避能力；
图6(A)为AAV野生型和突变型体外对正常人外周血血清中和抗体的逃避能力，图6(B)为AAV野生型和突变型体外对血友病病人外周血血清中和抗体的逃避能力；
图7为突变型2-10体内对人肝脏细胞的感染效率；
图8(A)为基因治疗过程示意图，图8(B)为治疗效果。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1腺相关病毒突变体的获取
本实施例首先采用含有特定序列和酶切位点的PCR引物(SEQ ID NO:11～12)进行普通PCR，扩增购买自美国BioAsk公司的野生型腺相关病毒(AAV)1～10的外壳蛋白编码基因，使得PCR产物的质量达到1μg以上；随后将获得的PCR产物混合并采用Shuffling PCR试剂盒处理，得到AAV外壳蛋白突变体库，具体步骤如下：
将10μg野生型AAV外壳蛋白基因扩增混合产物与1U DNA酶在37℃下共孵育5min，使用1μL 100mM EDTA终止反应，75℃灭活10min；将DNA酶消化的产物中长度为100～300bp的片段使用DNA纯化试剂盒纯化；使用高保真酶PFU将纯化的DNA片段进行重新拼接，具体的拼接条件见表1；将获得的拼接产物重组插入AAV2-ITR质粒中，得到AAV载体库；
表1 Shuffling PCR条件
Figure BDA0003743971470000111
Figure BDA0003743971470000121
将辅助质粒pXX6-80和AAV载体库按照1:2的比例转染入HEK293细胞系；48h后，收集细胞，将细胞反复冻融和超声裂解；在一定密度的氯化铯溶液中进行超速离心过夜，收集离心管中不同层次的氯化铯溶液，将含有AAV的氯化铯溶液放入透析袋，并置于PBS中透析，最终获得含有AAV的PBS溶液，即为AAV库；
将含有1×1013个病毒的100μLAAV库与100μL 1mg/mL人静脉注射用人免疫球蛋白(IVIG)在4℃下共孵育2h，随后采用内眦静脉注射的方法将AAV和IVIG混合物注射入肝脏细胞人源化小鼠中；第三天，内眦静脉注射1×107μg腺病毒dl309；第五天，分离小鼠肝脏中的人源细胞，并提取DNA，采用引物对F1(SEQ ID NO:13)：CAACTCCATCACTAGGGGTTC和R1(SEQID NO:14)：CATGGGAAAGGTGCCAGA和高保真PFU酶扩增外壳蛋白基因，重新连接整合入AAVrep-cap包装质粒中。
以上步骤重复三次，获得腺相关病毒突变体，所述突变体可以逃避体内抗AAV外壳蛋白的中和抗体的中和作用，突变体的外壳蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1～5所示，核酸序列如SEQ ID NO:6～10所示。
图1所示为各个突变体中外壳蛋白基因序列的来源以及序列中存在的点突变；进一步采用Clustral W进化分析方法，计算AAV各突变体与野生型AAV的进化关系，结果如图2所示，采用DNAMAN软件的Alignment对突变体2-10(SEQ ID NO:1)、2-19(SEQ ID NO:2)、4-24(SEQ ID NO:3)、1-1(SEQ ID NO:4)、1-18(SEQ ID NO:5)进行分析，5个序列的同源矩阵如表2所示，发现SEQ ID NO:1～5的同源性为98.02％，由此得出与SEQ ID NO:1～5具有超过98％同源性的序列具有逃避中和抗体的能力。
表2
LP1-1.seq 100％
LP1-11.seq 96.7％ 100％
LP2-10.seq 97.0％ 96.5％ 100％
LP3-19.seq 95.2％ 97.0％ 94.8％ 100％
LP4-24.seq 97.8％ 98.4％ 95.7％ 97.1％ 100％
实施例2腺相关病毒突变体的包装
质粒大提获取各个突变体的Cap-Rep质粒、荧光素酶质粒pTR-CBh-luc和辅助质粒pXX6-80，其中，pTR-CBh-luc需要通过Sma1酶切检测AAV基因组两端的回文序列ITR是否完整，所有质粒预先进行DNA琼脂糖凝胶电泳检测条带是否单一、是否具有超螺旋结构，并确保质粒溶液没有被大量可溶蛋白污染；
提前16小时将培养好的无细菌、病毒和病原体污染的HEK293传代至新培养皿(15cm直径)，密度为饱和密度的70％左右，培养基为10％FBS+DMEM；
配制转染溶液，每个15cm培养皿中的细胞需要pTR-CBh-luc质粒9μg、突变体Cap-Rep质粒12μg、pXX6-80质粒15μg，将三种质粒加至500μL DMEM培养基中混匀，随后边震荡边逐滴加入150μL 1μg/μLPEI，室温静置10min，将混合物滴加至细胞培养上清；
48小时后，将HEK293吹打至悬浮状态，2000rpm离心5min收集细胞沉淀，用8.7mL超纯水重悬，在干冰和温水之间反复冻融三次，超声2min裂解细胞，加入5g氯化铯，超声2min，置于冰上；
4℃、12000rpm离心20min，不可溶的细胞碎片悬浮在氯化铯溶液表面，小心将下层透明的氯化铯溶液转移至超速离心管中，采用Sorvall WX 80+Ultracentrifuge超速离心机在65000rpm、15下离心18小时，刹车降为5；
将离心完成的氯化铯溶液逐层取出，每层的体积约为1mL，采用折光光度计进行测量，折光率约为1.37的氯化铯溶液即为包含有AAV的氯化铯溶液；
将含有AAV的氯化铯溶液转移至透析袋，放入提前预冷的PBS中进行透析，透析三次，最后收取含有AAV的PBS溶液；
对获得的AAV进行浓度的测量，取90μL含有AAV的PBS溶液，加入10μLDNA酶，37℃消化1小时，加入6μL 0.5M EDTA终止反应；随后加入100μL蛋白酶消化液，55℃消化2小时，95℃灭活5min；将AAV溶液用超纯水稀释1000倍，作为实时定量PCR的模版，进行定量PCR分析，计算AAV的浓度。
结果如图3所示，AAV2和AAV3具有较高的包装效率(Packaging efficiency)，其他的野生型和突变型AAV的包装效率尚可。
实施例3腺相关病毒突变体的体外感染效率
将实施例2获得的野生型和突变型AAV的浓度调整至相同的浓度，利用人肝脏肿瘤细胞系Huh7检测AAV的体外感染效率。
首先，将Huh7均匀分至96孔板，培养16小时后将总量为1×108μg的AAV加至每个孔中，设置3个复孔；
继续培养Huh748小时后，使用Promega荧光素酶检测试剂盒检测每孔荧光素酶的表达水平。
结果如图4所示，野生型AAV1、AAV2、AAV3、AAV6和突变型2-10和2-20对Huh7细胞的感染效率较高(AAV expression efficiency in huh7_48hour)。
实施例4腺相关病毒突变体躲避IVIG中和抗体的效率
前期实验发现，在人的IVIG中存在所有野生型AAV的中和抗体。本实施例首先将原浓度为50μg/μL的IVIG按照1:2的比例进行梯度稀释，最大稀释比例为1:8192，IVIG稀释液的终体积为20μL；并将野生型和突变型AAV调整为20μL含有1×108μg病毒；
将IVIG梯度稀释液与不同的野生型和突变型AAV在4℃下孵育30min，孵育完成后将混合物加至预先培养在96孔板中的Huh7细胞(无血清培养)，继续培养48小时；48小时后采用Promega荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶的表达水平。
如图5所示，野生型AAV1、2、3、6、8较容易被IVIG中存在的天然中和抗体所中和，野生型AAV9对中和抗体的抵抗能力较强；突变型1-1、1-18、3-19、4-24对中和抗体的抵抗能力较强，突变型2-10几乎完全逃避IVIG的中和作用。由此说明，突变体库中成功筛选出能够逃避IVIG中的中和抗体的突变型AAV。
实施例5腺相关病毒突变体躲避外周血中和抗体的效率
本实施例首先确定采集的19例健康人外周血血清和26例血友病病人外周血血清中AAV抗体浓度的大致范围，随后按照1:2的比例进行8个梯度稀释，并设置无中和抗体PBS对照组；
将20μL血清稀释液与20μL(1×108μg)不同的野生型和突变型AAV在4℃下孵育30min，孵育完成后将混合物加至预先培养在96孔板中的Huh7细胞(无血清培养)，继续培养48小时；48小时后采用Promega荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶的表达水平，并计算血清样本中AAV中和抗体的滴度。
健康血清样本和病人血清样本的抗AAV中和抗体的滴度分别如图6(A)和图6(B)所示，将数据进行可视化分析，标尺显示血清的稀释倍数，稀释倍数越高颜色越深，说明血清中含有的中和抗体越多。对结果进行分析发现，相较于健康人外周血血清中抗AAV中和抗体的阳性率，血友病病人外周血血清中抗AAV中和抗体的阳性率较低，但是仍然有近三分之一的血友病病人的外周血血清中存在抗AAV中和抗体；突变型2-10能够显著躲避中和抗体的中和作用，将血清中野生型AAV中和抗体的阳性率由三分之一降低至八分之一，突变型2-10的使用有望使更多的血友病病人接受AAV基因治疗。
由于突变型2-10可以有效逃避AAV中和抗体，比较野生型AAV和突变型AAV的抗体表达谱发现，AAV9和2-10的抗体表达谱较相似，根据图1各个突变体的来源分析，位于外壳蛋白氨基酸序列N端第100位到第200位氨基酸可能是抗AAV中和抗体的高频识别区。
实施例6腺相关病毒突变体2-10的体内感染效率
本实施例采用肝脏细胞人源化小鼠进行体内实验的验证，肝脏细胞人源化小鼠既能代表体内的复杂环境又能直接检测AAV对人肝脏细胞的感染表达效率。AAV8作为AAV基因治疗载体已经成功应用于多项临床实验，本实施例采用AAV8-GFP作为对照，检测突变型2-10GFP在肝脏人源化小鼠中的感染表达效率。
将1×1011μgAAV8-GFP和2-10GFP经静脉注射入肝脏细胞人源化小鼠中，7天后分离小鼠的肝脏，并进行免疫荧光染色，使用TRITC标记的抗人白蛋白(albumin)抗体进行染色，共聚焦荧光显微镜观察并拍照。
如图7所示，AAV8与2-10在肝脏细胞人源化小鼠中，对人肝脏细胞的感染能力没有明显区别，说明2-10在进化出躲避AAV中和抗体的能力的同时，并没有减弱其在体内对人肝脏细胞的特异性感染能力。
实施例7腺病毒突变体LP2-10对AAV中和抗体阳性的凝血因子9基因缺陷小鼠的基因治疗效果
本实施例中，我们模拟体内存在AAV中和抗体的血友病患者的基因治疗过程，如图8(A)所示，首先皮下注射AAVs(AAV1/2/3/6/8/9混合物)免疫F9 KO小鼠，第13天取外周血，使用AAV中和抗体检测系统检测有无成功诱导出抗AAV的中和抗体，结果表明，AAVs作为抗原能诱导出抗AAV1/2/3/6/8的中和抗体；第14天静脉注射AAV8/F9和LP2-10-F9，第28、42天取外周血，检测hF9的水平，如图8(B)所示，在有中和抗体的小鼠中，LP2-10作为载体的基因治疗组小鼠的hF9水平明显高于AAV8组，在没有免疫的小鼠中，LP2-10的基因治疗效果随稍低于AAV8但无显著差异。
综上所述，本发明通过对野生型腺相关病毒的外壳蛋白编码基因进行拼接重组，构建腺相关病毒库，采用抗AAV外壳蛋白的中和抗体筛选得到五种腺相关病毒突变体，具有逃避抗AAV中和抗体的能力，并对人肝脏细胞具有高效特异的感染能力，在血友病基因治疗领域具有广泛的应用前景和巨大的市场价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种腺相关病毒突变体，其特征在于，所述腺相关病毒突变体的外壳蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO:2所示的序列。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的腺相关病毒突变体；
优选地，所述核酸分子的核酸序列包括SEQ ID NO:7所示的序列。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括插入有权利要求2所述的核酸分子的野生型腺相关病毒载体；
优选地，所述野生型腺相关病毒载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10中的任意一种，优选为AAV2。
4.一种腺相关病毒库，其特征在于，所述腺相关病毒库包括权利要求1所述的腺相关病毒突变体。
5.一种权利要求4所述的腺相关病毒库的构建方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)PCR扩增野生型腺相关病毒的外壳蛋白编码基因；
(2)将扩增产物采用DNA酶消化后，选取长度为100～300bp的DNA片段进行重新拼接；
(3)将拼接产物插入野生型腺相关病毒载体中，得到腺相关病毒载体库；
(4)将所述腺相关病毒载体库与辅助质粒共转染哺乳细胞后，制备得到所述腺相关病毒库。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的PCR引物包括SEQ ID NO:11～12所示的核酸序列；
优选地，步骤(2)所述拼接方法为将长度为100～300bp的DNA片段与DNA聚合酶混合，在96～41℃范围内进行梯度降温，通过ShufflingPCR得到拼接产物；
优选地，步骤(3)所述野生型腺相关病毒载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10中的任意一种，优选为AAV2。
7.一种权利要求1所述的腺相关病毒突变体的筛选方法，其特征在于，所述方法包括：
将权利要求4所述的腺相关病毒库与人静脉注射用人免疫球蛋白混合孵育，随后导入肝脏细胞人源化小鼠中；
导入腺病毒，饲养一段时间后，分离小鼠肝脏中的人源细胞，提取DNA；
采用SEQ ID NO:13～14所示的引物对进行PCR扩增，将扩增产物插入野生型腺相关病毒载体，与辅助质粒共转染哺乳细胞；培养后裂解哺乳细胞，得到所述腺相关病毒突变体。
8.一种腺相关病毒突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求3所述的表达载体与辅助质粒共转染哺乳细胞；培养后裂解哺乳细胞，得到所述腺相关病毒突变体。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的腺相关病毒突变体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的表达载体或权利要求4所述的腺相关病毒库中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
10.一种权利要求1所述的腺相关病毒突变体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的表达载体、权利要求4所述的腺相关病毒库或权利要求9所述的药物组合物在制备基因缺陷病治疗药物中的应用；
优选地，所述基因缺陷病包括血友病、先天性黑曚、杜氏肌营养不良症或脊髓性肌萎缩症中的任意一种或至少两种的组合。
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