KR102482744B1 - 아데노-연관 바이러스 정제 방법 - Google Patents
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Abstract
아데노-연관 바이러스 (AAV) 제품을 생산하는 방법, 아데노-연관 바이러스를 정제하는 방법, 및 빈 AAV 캡시드 및 완전 AAV 캡시드를 포함하는 농축된 AAV 분획으로부터 완전 AAV 캡시드를 정제하는 방법이 본원에서 제공된다.
Description
관련 출원
본 출원은 2016년 11월 4일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/417,775를 우선권 주장하고, 이는 이에 의해 전문이 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 아데노-연관 바이러스 (AAV)를 정제하는 물질 및 방법에 관한 것이다.
배경
아데노-연관 바이러스 (AAV)는 선형 단일-가닥 DNA 게놈을 패키징하는, 외피를 보유하지 않는 소형 바이러스이다. AAV에 의한 증식성 감염이 헬퍼바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스의 존재 하에서만 발생하기 때문에, AAV는 파르보비리다에(Parvoviridae) 과, 디펜도바이러스(Dependovirus) 속에 속한다. 헬퍼 바이러스의 부재 하에서도, AAV (혈청형 2)는 숙주 인간 게놈의 19q13.4 염색체 내로 통합됨으로써 잠복기를 달성할 수 있다. 이는 부위-특이적 통합이 가능한 것으로 공지된 유일한 포유동물 DNA 바이러스이다 (Daya and Berns, Clinical Microbiology Reviews, pages 583-593 (2008)).
AAV가 임상에서 안전하게 사용되기 위하여, AAV는 이의 게놈 내의 몇몇 위치에서 유전자 변형되었다. 예를 들어, 바이러스 복제에 필요한 Rep 유전자, 및 부위-특이적 통합에 필요한 요소가 다수의 바이러스 벡터에서 AAV 게놈으로부터 제거되었다. 이러한 재조합 AAV (rAAV)는 염색체외 상태로 존재하고, 게놈 DNA 내로의 통합 효율이 매우 낮다. 따라서, 전적으로 제거되지 않더라도, rAAV가 숙주 세포에서 무작위 돌연변이유발을 유도할 가능성이 감소된다. 이러한 성질 및 병원성 결여로 인해, rAAV는 임상전 및 임상 용도의 다양한 측면에서 유전자 요법 벡터로서의 큰 가망성을 나타냈다. 새로운 혈청형 및 자가-상보적 벡터가 임상에서 테스트 중이다. 이러한 진행 중인 벡터 개발과 함께, 높은 순도 및 효력의 rAAV 벡터를 높은 역가 양으로 효율적으로 생성시킬 수 있는, 규모조정이 가능한 제작 공정에 지속적인 노력이 집중되었다.
인간 투여에 적절한 AAV 제품을 정제하기 위한 효율적인 대규모 방법을 디자인하려는 노력이 대단하였으나, 더 양호한 AAV 정제 방법이 여전히 요구된다. 예를 들어, 세포 배양물에서 AAV를 생성시키는 현재의 방법은 "빈" 캡시드의 형성을 초래하고, 이는 캡시드 항원에 대한 T-세포-매개 면역 반응을 일으켜서, 저등급 간독성 및 부분적인 발현 상실을 일으키는 것으로 나타났다 (Wright, Molec Therapy 22(1): 1-2 (2014)). 따라서, 최종 AAV 제품으로부터 빈 AAV 캡시드를 제거하기 위한 단계를 포함하는 AAV 정제 방법이 요망된다.
개요
세포 배양에서의 AAV 벡터 생성의 특색은 벡터 게놈이 결여된 "빈" 캡시드가 과량으로 형성되는 것이다. 이같은 빈 캡시드는 트랜스진 생산과 연관된 치료 이익을 제공할 수 없다. 임상 결과에 대한 빈 캡시드의 효과는 명확하지 않다. 그러나, 벡터에 대한 선천 또는 적응 면역 반응을 증가시킬 잠재력이 있고, 그러면 이는 빈 캡시드를 유전자 요법 환경에서 우려가 되게 한다. (Wright, Molecular Therapy 22: 1-2 (2014)).
아데노-연관 바이러스 (AAV) 제품을 생산하는 방법, AAV를 정제하는 방법, 및 빈 AAV 캡시드 및 완전(full) AAV 캡시드를 포함하는 농축된 AAV 분획으로부터 완전 AAV 캡시드를 정제하는 방법이 본원에서 제공된다. 본원에서 제공되는 방법이 AAV의 대규모 생산에 적절하고, 임상 용도에 적절한, 고도로 순수한 강력한 제품을 제공하기 때문에, 본 개시내용의 방법은 관련 기술 분야에 공지된 것들에 비해 유리하다. 예시적 측면에서, 본원에 기술된 방법은 균질한 집단 및 높은 순도의 AAV 입자를 포함하는 AAV 제품을 제공한다. 예시적 측면에서, 본원에 기술된 방법은 전장 벡터 DNA를 포함하는 AAV 제품을 제공한다. 예시적 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 빈 AAV 입자 (말단절단되거나 불완전한 벡터 DNA를 함유하는 것을 포함함), 단백질 조성이 불안정하고 올리고머화된 구조를 지니는 AAV 입자, 또는 오염 바이러스, 예를 들어, 비-AAV, 지질-외피 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 원치 않는 오염물이 실질적으로 없는 AAV 제품을 제공한다. 예시적 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 관심 단백질을 코딩하는 DNA (cDNA)를 높은 양으로 함유하는 AAV 제품을 제공한다.
예시적 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 완전 AAV 캡시드를 빈 AAV 캡시드로부터 분리하는 초원심분리 단계를 포함한다. 예시적 측면에서, 방법은 (i) 로터 내로 농축된 AAV 분획을 각각의 당 농도가 상이한 적어도 2개의 당 용액과 함께 로딩하는 단계, (ii) 로딩된 로터를 포함하는 초원심분리기를 배치 모드로 작동시켜, 당 구배를 형성시키는 단계, (iii) 당 구배의 분획을 수득하여, 완전 AAV 캡시드를 포함하는 AAV 분획을 수득하는 단계를 포함한다. 예시적 측면에서, 로터는 구역 로터이다.
예시적 측면에서, 적어도 2개의 당 용액은 각각 약 45% (w/w) 내지 약 65% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다. 예시적 측면에서, 하나의 당 용액은 약 52% (w/w) 내지 약 58% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하고, 또 다른 당 용액은 약 57% (w/w) 내지 약 63% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다. 임의적으로, 약 47% (w/w) 내지 약 53% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 또 다른 당 용액이 있다. 로터 또는 구획의 바닥으로 로딩될 때, 로딩 시퀀스의 순서는 먼저, 존재한다면, 약 47% (w/w) 내지 약 53% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액, 그 후 약 52% (w/w) 내지 약 58% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액, 그 후 약 57% (w/w) 내지 약 63% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액일 수 있다.
특정 실시양태에서, 프로세싱될 샘플이 당 용액의 첨가 전에 첨가된다. 특정 실시양태에서, 초원심분리는 연속 유동 방식으로 수행되고, 샘플은 원심분리 동안 밀도 구배가 달성된 후에 로딩된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 완전 AAV 캡시드를 빈 AAV 캡시드로부터 분리하는 초원심분리 단계를 포함한다. 예시적 측면에서, 방법은 (i) 농축된 AAV 분획을 각각의 당 농도가 상이하고, 약 45% (w/w) 내지 약 65% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 각각 포함하는 적어도 2개의 당 용액과 함께 로터 내로 로딩하는 단계, (ii) 로딩된 로터를 포함하는 초원심분리기를 배치 모드로 작동시켜, 당 구배를 형성시키는 단계, (iii) 당 구배의 분획을 수득하여, AAV 분획 내의 적어도 또는 약 60%의 AAV 입자가 완전 AAV 캡시드인 AAV 분획을 수득하는 단계를 포함한다. 예시적 측면에서, 로터는 구역 로터이다. 특정 실시양태에서, 당 용액의 부피는 구역 로터의 부피의 약 50% 이상이다. 특정 실시양태에서, 당 용액 및 AAV 분획의 총 부피는 구역 로터의 부피 이하이다. 특정 실시양태에서, 당 용액의 부피 대 AAV 분획의 부피의 비는 1 이하이다.
특정 실시양태에서, 각각의 당 용액은 약 50% (w/w) 내지 약 60% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다. 특정 실시양태에서, 각각의 당 용액은 약 55% (w/w) 내지 약 60% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다. 특정 실시양태에서, 당 용액 중 적어도 하나는 약 50% (w/w) 수크로스를 초과하는 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다. 특정 실시양태에서, 당 용액 중 적어도 하나는 약 55% (w/w) 수크로스를 초과하는 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다. 특정 실시양태에서, 당 용액 중 적어도 하나는 약 60% (w/w) 내지 약 65% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다.
특정 실시양태에서, 하나의 당 용액은 약 52% (w/w) 내지 약 58% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하고, 여기서 제2 당 용액은 약 57% (w/w) 내지 약 63% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하며, 임의적으로, 제3 당 용액은 약 47% (w/w) 내지 약 53% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다.
특정 측면에서, 2개의 당 용액이 구역 로터 내로 로딩된다. 특정 실시양태에서, 2개의 당 용액이 구역 로터 내로 로딩되고, 여기서 하나의 당 용액은 약 52% (w/w) 내지 약 58% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하고, 제2 당 용액은 약 57% (w/w) 내지 약 63% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다.
특정 측면에서, 적어도 3개의 당 용액이 구역 로터 내로 로딩된다. 특정 실시양태에서, 3개의 당 용액이 구역 로터 내로 로딩된다. 특정 실시양태에서, 3개의 당 용액이 구역 로터 내로 로딩되고, 여기서 하나의 당 용액은 약 47% (w/w) 내지 약 53% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하고, 제2 당 용액은 약 52% (w/w) 내지 약 58% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하며, 제3 당 용액은 약 57% (w/w) 내지 약 63% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다.
특정 실시양태에서, 농축된 AAV 분획은 약 52% (w/w) 내지 약 58% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액 전에 로딩되고, 약 52% (w/w) 내지 약 58% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액은 약 57% (w/w) 내지 약 63% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액 전에 로딩된다.
특정 실시양태에서, 농축된 AAV 분획은 약 47% (w/w) 내지 약 53% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액 전에 로딩되고, 약 47% (w/w) 내지 약 53% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액은 약 52% (w/w) 내지 약 58% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액 전에 로딩되며, 약 52% (w/w) 내지 약 58% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액은 약 57% (w/w) 내지 약 63% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액 전에 로딩된다.
특정 실시양태에서, 각각의 당 용액은 동일한 부피로 구역 로터 내에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 최소 당 농도의 당 용액은 구역 로터 내의 다른 당 용액 중 적어도 하나의 부피의 2배인 부피로 구역 로터 내에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 최소 당 농도의 당 용액은 적어도 구역 로터에서 조합되는 모든 다른 당 용액의 부피인 부피로 구역 로터 내에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 최소 당 농도의 당 용액은 최대 당 농도의 당 용액의 부피의 적어도 2배인 부피로 구역 로터 내에 로딩되고, 임의적으로, 최대 당 농도의 당 용액의 부피는 중간 당 농도의 당 용액의 부피와 동일하다. 특정 실시양태에서, 적어도 2개의 당 용액이 구역 로터 내로 로딩되고, 여기서 최소 당 농도의 당 용액은 구역 로터 내의 적어도 하나의 다른 당 용액의 부피의 적어도 2배인 부피로 구역 로터 내에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 적어도 2개의 당 용액이 구역 로터 내로 로딩되고, 여기서 최소 당 농도의 당 용액은 구역 로터 내의 적어도 하나의 다른 당 용액과 동일한 부피인 부피로 구역 로터 내에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 최소 당 농도의 당 용액은 농축된 AAV 분획의 부피의 절반인 부피로 구역 로터 내에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 구역 로터 내에 로딩되는 총 당 구배의 부피 대 AAV 분획의 부피의 비는 약 1:1 내지 약 1:5이다.
특정 측면에서, AAV 분획은 완충 용액을 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충 용액은, 비제한적으로, 포스페이트 완충제, 히스티딘 (예를 들어, L-히스티딘), 시트르산나트륨, HEPES, 트리스(Tris), 바이신, 글리신, N-글리실글리신, 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 글리실 글리신, 라이신, 아르기닌, 인산나트륨, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 분획은 트리스HCl 및 NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 트리스HCl은 약 20 내지 약 50 mM의 농도이고, NaCl은 약 150 mM 내지 약 900 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, NaCl은 약 500 mM 내지 약 750 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, 완충 용액의 pH는 약 7.4 내지 약 9.0이다. 특정 실시양태에서, 완충제는 8.5의 pH로 약 50 mM 트리스HCl 및 약 500 mM NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충제는 8.0의 pH로 약 50 mM 트리스HCl 및 약 750 mM NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충 용액은 45-55% (w/w) 에틸렌 글리콜을 포함한다.
특정 실시양태에서, 각각의 당 용액은 이당류 또는 삼당류를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이당류는 수크로스, 말토스, 락토스, 및 이들의 조합물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 각각의 당 용액은 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 각각의 당 용액은 트리스HCl 및 NaCl을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 트리스HCl은 약 20 내지 약 50 mM의 농도이고, NaCl은 약 150 mM 내지 약 500 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, 완충 용액의 pH는 약 7.4 내지 약 8.5이다. 특정 실시양태에서, 완충제는 7.4의 pH로 20 mM 트리스HCl 및 8 g/L NaCl을 포함한다.
특정 측면에서, 방법은 초원심분리기를 10,000 rpm 미만의 제1 회전 속도에서 60분 미만 동안, 그리고 약 30,000 내지 약 40,000 rpm 범위 내의 제2 회전 속도에서 적어도 4시간 동안 작동시키는 것을 포함한다.
특정 측면에서, 방법은 초원심분리기를 10,000 rpm 미만의 제1 회전 속도에서 60분 미만 동안, 그리고 약 30,000 내지 약 40,000 rpm 범위 내의 제2 회전 속도에서 적어도 12시간 동안 작동시키는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 회전 속도는 약 3,000 rpm 내지 약 6,000 rpm, 임의적으로는 약 4,000 rpm이다. 특정 실시양태에서, 제2 회전 속도는 약 35,000 rpm이고, 임의적으로는 약 4 내지 약 6시간 동안 유지된다. 특정 실시양태에서, 제2 회전 속도는 적어도 약 16시간 또는 적어도 20시간 동안 유지된다. 특정 실시양태에서, 제2 회전 속도는 약 35,000 rpm이고, 임의적으로는 약 16 내지 약 20시간 동안 유지된다.
특정 실시양태에서, 구역 로터 내로 로딩된 농축된 AAV 분획은 적어도 1×1012개의 AAV 캡시드/mL를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 삼중 플라스미드 시스템으로 형질감염된 HEK293 세포를 포함하는 세포 배양물로부터의 상청액을 수확하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 (i) HEK293 세포를 형질감염시키고 나서 약 3 내지 약 5일 후에, 또는 (ii) 세포 배양물의 세포 밀도가 약 5×106개의 세포/mL 이상이고, 이의 세포 생존율이 50%를 초과할 때 상청액을 수확하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 수확된 상청액을 심층 여과를 통해 여과하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 수확된 상청액을 셀룰로스 및 펄라이트를 포함하고 최소 투과율이 약 500 L/㎡인 필터를 통해 여과하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 수확된 상청액을 최소 세공 크기가 약 0.2 ㎛인 필터를 통해 여과하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 한외/투석여과 시스템을 사용하여 AAV 분획을 농축하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 AAV 분획을 AAV가 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 칼럼을 관류하는 것을 허용하는 조건 하에 AEX 크로마토그래피 칼럼에 적용하는 단계 전, 후, 또는 전 및 후에 한외/투석여과 시스템을 사용하여 AAV 분획을 농축하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 용매 세제로 AAV 분획의 지질-외피 바이러스를 불활성화시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 35 nm 초과의 바이러스를 제거하기 위한 AAV 분획의 나노여과를 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 촉수성 겔을 포함하는 칼럼으로 AEX 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 연마 단계를 포함한다.
특정 실시양태에서, 방법은 (i) AAV 분획을 AAV가 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 칼럼을 관류하는 것을 허용하는 조건 하에 AEX 크로마토그래피 칼럼에 적용하는 단계, (ii) AAV를 포함하는 관류물을 수집하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 분획은 약 100 mM 내지 약 150 mM NaCl을 포함하는 로딩 완충제와 함께 AEX 크로마토그래피 칼럼에 적용되고, 임의적으로, 로딩 완충제의 pH는 약 8 내지 약 9이다. 특정 실시양태에서, 로딩 완충제는 약 115 mM 내지 약 130 mM NaCl을 포함하고, 임의적으로, 로딩 완충제는 약 120 mM 내지 약 125 mM NaCl을 포함한다.
특정 실시양태에서, 숙주 세포 단백질이 제거된다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포 단백질은 HSP70 및/또는 LDH이다.
예시적 측면에서, 당 구배로부터 수득된 분획 내의 AAV 입자의 적어도 또는 약 55%가 완전 AAV 캡시드이다. 예시적 측면에서, 당 구배로부터 수득된 분획 내의 AAV 입자의 적어도 또는 약 60%가 완전 AAV 캡시드이다. 예시적 측면에서, 당 구배로부터 수득된 분획 내의 AAV 입자의 약 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상이 완전 AAV 캡시드이다.
특정 실시양태에서, 방법은 AAV 분획을 AAV-특이적 ELISA를 통해 테스트하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 특이적 ELISA는 AAV에 대해 특이적인 샌드위치 ELISA이다. 특정 실시양태에서, 방법은 정량적 PCR을 통해 효력을 측정하는 단계를 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, 또는 AAV10이다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV8이다.
상기 및 본원에서 기술된 방법에 의해 생산된 AAV 제품이 본원에서 또한 제공된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 예시적인 본 개시내용의 방법의 개략도이다.
도 2는 시간 경과 (일)에 걸쳐 플롯팅된 형질감염된 세포 배양물의 상청액 ml 당 바이러스 입자의 양 (바이러스 그램)의 그래프이다. 2 L 규모 (2개의 상이한 PEI 로트로의 4개의 병행 런)의 확립된 표준 조건 (예를 들어 pH, 온도, 진탕 속도) 하에서의 HEK293 세포 배양물에서의 AAV8의 증식: 세포 배양 상청액 내의 역가의 증가가 FIX 특이적 qPCR에 의해 경시적으로 측정됨 (T01=형질감염 제1일, T02=형질감염 제2일 등). 3 × 2 L 규모 바이오리액터에서의 FIX 특이적 qPCR에 의해 역가를 측정하였다.
도 3은 시간 경과 (일)에 걸쳐 플롯팅된 형질감염된 세포 배양물의 상청액 ml 당 바이러스 입자의 양 (바이러스 그램)의 그래프이다. 2 L 규모 (2개의 상이한 PEI 로트로의 4개의 병행 런)의 확립된 표준 조건 (예를 들어 pH, 온도, 진탕 속도) 하에서의 HEK293 세포 배양물에서의 AAV8의 증식: 세포 배양 상청액 내의 역가의 증가가 AAV-특이적 ELISA에 의해 경시적으로 측정됨 (T01=형질감염 제1일, T02=형질감염 제2일 등). 3 × 2 L 규모 바이오리액터에서의 AAV-특이적 ELISA에 의해 역가를 측정하였다.
도 4는 2개의 압력 센서를 통해 연속적으로 측정된 바와 같은 심층 여과 단계 동안의 압력 및 유속의 그래프이다 (심층 여과 전의 압력 1, 심층 필터 후, 막 필터 전의 압력 2; 유동 = 유량계로 측정된 바와 같은 유속).
도 5는 음성 (비-결합) 모드의 AEX 무스탕(Mustang) Q 크로마토그래피의 관류 생성물의 그래프이다.
도 6은 지시된 분획의 은 염색 (왼쪽) 및 웨스턴 블롯 (오른쪽)이다.
도 7은 지시된 분획의 은 염색 (왼쪽) 및 웨스턴 블롯 (오른쪽)이다.
도 8은 빈 캡시드 대 완전 캡시드를 분리하는 초원심분리 용리 프로파일의 그래프이다. 분획은 각각 50 ml이었다.
도 9는 지시된 분획의 은 염색 (왼쪽) 및 웨스턴 블롯 (오른쪽)이다.
도 10은 프락토겔(Fractogel) TMAE 상에서의 AAV8의 최종 연마이다.
도 11은 예시적인 본 개시내용의 방법의 개략도이다.
도 12는 상이한 DNA 서열 변이체들을 함유하는 입자를 포함하는, 수성 용액 내의 50-55-60% 프로토콜을 사용하는 분리된 완전 AAV8 입자 및 빈 AAV8 입자의 초원심분리를 나타내는 곡선이다. 벡터 DNA는 이중 가닥이고, 전장이 약 4.8 kB인 인간 응고 인자 IX 파두아(Padua)였다. UC 프로파일에서 지시된 바와 같은 단일 분획이 4 ml AEX-TMAE 칼럼 상에서 프로세싱되고, 최종 제품으로 제형되었다. 각각의 제형된 분획을 분석하였다. 분획 10 내지 14가 풀링되었고, 전장 벡터 DNA가 있는 AAV8을 함유하는 상동성 최종 제품을 나타낸다. 분획 15 내지 21 및 추가적으로 분획 25 및 26가 별개로 프로세싱되고, AAV8 입자 내에 캡슐화된 벡터 DNA의 감소되는 길이를 나타낸다. 이는 도 14 및 15의 xDNA-아가로스 겔 및 도 16에 나타난 분석용 초원심분리의 데이터 (AUC)에서 나타난다.
도 13은 지시된 분획의 은 염색 (왼쪽) 및 웨스턴 블롯 (오른쪽)이다.
도 14는 실시예 9에 기술된 AAV8 입자의 초원심분리로부터 취한 하기 샘플의 1% 아가로스 겔의 사진이다: 레인 1 = 마커; 레인 2 = PV007 (원래의 채텀(Chatham) 프로세스로부터 유래된 AAV8); 레인 3 = 분획 15; 레인 4 = 분획 16; 레인 5 = 분획 17; 레인 6 = 분획 18; 레인 7 = 분획 19; 레인 8 = 분획 20; 레인 9 = 분획 21; 레인 10 = 분획 25; 레인 11 = 분획 26; 레인 12 = 임상 투여용 제품 AAV8; 및 레인 13 = 마커. BDS = 벌크 약물 물질 (최종 희석 TMAE-용리액). 이러한 도면은 초원심분리에서 더 높은 수크로스 밀도에서 수득된 UV 피크의 풀링된 분획 10 내지 14가 벡터 DNA의 더 작은 DNA 변이체에 대한 어떠한 추가 힌트도 없이 고도로 순수한 단일 DNA 밴드를 함유한다는 것을 나타낸다.
도 15는 실시예 9에 기술된 AAV8 입자의 초원심분리로부터 취한 하기 샘플의 0.8% 알칼리성 아가로스 겔의 사진이다: 레인 1 = 마커; 레인 2 = PV007 (원래의 채텀 프로세스로부터 유래된 AAV8); 레인 3 = 분획 15; 레인 4 = 분획 16; 레인 5 = 분획 17; 레인 6 = 분획 18; 레인 7 = 분획 19; 레인 8 = 분획 20; 레인 9 = 분획 21; 레인 10 = 분획 25; 레인 11 = 분획 26; 레인 12 = 임상 투여용 제품 AAV8; 및 레인 13 = 마커. BDS = 벌크 약물 물질 (최종 희석 TMAE-용리액). 이러한 도면은 초원심분리에서 더 높은 수크로스 밀도에서 수득된 UV 피크의 풀링된 분획 10 내지 14가 벡터 DNA의 더 작은 DNA 변이체에 대한 어떠한 추가 힌트도 없이 고도로 순수한 단일 DNA 밴드를 함유한다는 것을 나타낸다.
도 16a-16b는 출발 물질로서의 분석용 초원심분리 (AUC)의 지시된 분획으로부터 유래된 프락토겔 TMAE 용리 프로파일을 나타낸다. 완전 캡시드 및 빈 캡시드가 화살표로 확인된다. 불완전한 벡터 DNA를 함유하는 캡시드 (본원에서 또한 빈 캡시드로 정의됨)의 하위집단이 또한 확인된다. 데이터는 표 17에서 또한 표시된다. 분획에 관하여 도 12를 참조한다.
도 17은 트리스/NaCl 내의 50% (w/w) 에틸렌 글리콜 완충 용액 내의 AAV8이 55% 및 60% 수크로스 용액으로의 수크로스 구배를 사용하여 20시간 동안 35,000 rpm에서 초원심분리된 초원심분리 용리 프로파일의 그래프이다. AAV8 로딩 샘플 대 수크로스 구배의 비는 1:1이다. 벡터 DNA는 단일 가닥의 자가-상보적이고, 전장 (2.6 kB)인 인간 응고 인자 IX 파두아이다.
도 18은 55-60% 당 층 프로토콜로 초원심분리를 사용하여 인간 응고 인자 IX 파두아의 단일 가닥 벡터 DNA (2.6 kB)를 함유하는 AAV8을 분리하는 것의 그래프이고, 여기서 AAV8 샘플은 트리스/NaCl 내의 50% (w/w) 에틸렌 글리콜 완충 용액 내에서 로딩된다. 각각의 분획을 AAV8 ITR qPCR, AAV8 항원, WAX (약한 음이온 교환기 - 완전 캡시드)를 통해 테스트한다. DNA/AAV 비는 ITR qPCR 벡터 게놈 (vg/ml) / AAV8 캡시드 항원 ELISA (cp/ml)의 비이다. 그래프가 동일한 축 상에 제시되도록 하기 위해 데이터가 정규화되었다.
도 19는 트리스/NaCl 완충제 내의 50% (w/w) 에틸렌 글리콜 내의 AAV8이 55% 및 60% 수크로스 용액으로의 수크로스 구배를 통해 20시간 동안 35000 rpm에서 초원심분리된 초원심분리 용리 프로파일의 그래프이다. AAV8 로딩 샘플 대 수크로스 구배의 비는 1:1이고, 코어 부피는 3,200 ml이다. 벡터 DNA는 전장 (~4.8 kB)의 인간 응고 인자 VIII이다.
도 20은 하위종 분리를 실연하는 분획 8-10 (도 19 참조)로부터의 침강 계수 그래프의 오버레이이다. 화살표는 UC-구배에서 밀도가 더 높은 분획에서 더 낮은 밀도로 중량이 더 낮은 AAV8를 향한 이동을 가리킨다. 분획 8 > 분획 9 > 분획 10.
도 21은 50-55-60% 당 층 프로토콜로 초원심분리를 사용하여 인간 응고 인자 IX 파두아의 단일 가닥 벡터 DNA (2.6 kB)를 함유하는 AAV8을 분리하는 것의 그래프이고, 여기서 AAV8 샘플은 트리스HCl/NaCl 완충 용액 내에서 로딩된다. 각각의 분획을 AAV8 ITR qPCR 및 ELISA를 통해 테스트한다. DNA/AAV 비는 ITR qPCR 벡터 게놈 (vg/ml) / AAV8 캡시드 항원 ELISA (cp/ml)의 비이다. 그래프가 동일한 축 상에 제시되도록 하기 위해 데이터가 정규화되었다.
도 22는 트리스/NaCl 완충제 내의 50% (w/w) 에틸렌 글리콜 내의 AAV8이 55% 및 60% 수크로스 용액으로의 수크로스 구배를 통해 20시간 동안 35000 rpm에서 초원심분리된 초원심분리 용리 프로파일의 그래프이다. AAV8 로딩 샘플 대 수크로스 구배의 비는 1:1이고, 코어 부피는 7,700 ml이다. 벡터 DNA는 단일 가닥의 자가-상보적이고, (~2.6 kB)인 인간 응고 인자 IX 파두아이다.
도 1은 예시적인 본 개시내용의 방법의 개략도이다.
도 2는 시간 경과 (일)에 걸쳐 플롯팅된 형질감염된 세포 배양물의 상청액 ml 당 바이러스 입자의 양 (바이러스 그램)의 그래프이다. 2 L 규모 (2개의 상이한 PEI 로트로의 4개의 병행 런)의 확립된 표준 조건 (예를 들어 pH, 온도, 진탕 속도) 하에서의 HEK293 세포 배양물에서의 AAV8의 증식: 세포 배양 상청액 내의 역가의 증가가 FIX 특이적 qPCR에 의해 경시적으로 측정됨 (T01=형질감염 제1일, T02=형질감염 제2일 등). 3 × 2 L 규모 바이오리액터에서의 FIX 특이적 qPCR에 의해 역가를 측정하였다.
도 3은 시간 경과 (일)에 걸쳐 플롯팅된 형질감염된 세포 배양물의 상청액 ml 당 바이러스 입자의 양 (바이러스 그램)의 그래프이다. 2 L 규모 (2개의 상이한 PEI 로트로의 4개의 병행 런)의 확립된 표준 조건 (예를 들어 pH, 온도, 진탕 속도) 하에서의 HEK293 세포 배양물에서의 AAV8의 증식: 세포 배양 상청액 내의 역가의 증가가 AAV-특이적 ELISA에 의해 경시적으로 측정됨 (T01=형질감염 제1일, T02=형질감염 제2일 등). 3 × 2 L 규모 바이오리액터에서의 AAV-특이적 ELISA에 의해 역가를 측정하였다.
도 4는 2개의 압력 센서를 통해 연속적으로 측정된 바와 같은 심층 여과 단계 동안의 압력 및 유속의 그래프이다 (심층 여과 전의 압력 1, 심층 필터 후, 막 필터 전의 압력 2; 유동 = 유량계로 측정된 바와 같은 유속).
도 5는 음성 (비-결합) 모드의 AEX 무스탕(Mustang) Q 크로마토그래피의 관류 생성물의 그래프이다.
도 6은 지시된 분획의 은 염색 (왼쪽) 및 웨스턴 블롯 (오른쪽)이다.
도 7은 지시된 분획의 은 염색 (왼쪽) 및 웨스턴 블롯 (오른쪽)이다.
도 8은 빈 캡시드 대 완전 캡시드를 분리하는 초원심분리 용리 프로파일의 그래프이다. 분획은 각각 50 ml이었다.
도 9는 지시된 분획의 은 염색 (왼쪽) 및 웨스턴 블롯 (오른쪽)이다.
도 10은 프락토겔(Fractogel) TMAE 상에서의 AAV8의 최종 연마이다.
도 11은 예시적인 본 개시내용의 방법의 개략도이다.
도 12는 상이한 DNA 서열 변이체들을 함유하는 입자를 포함하는, 수성 용액 내의 50-55-60% 프로토콜을 사용하는 분리된 완전 AAV8 입자 및 빈 AAV8 입자의 초원심분리를 나타내는 곡선이다. 벡터 DNA는 이중 가닥이고, 전장이 약 4.8 kB인 인간 응고 인자 IX 파두아(Padua)였다. UC 프로파일에서 지시된 바와 같은 단일 분획이 4 ml AEX-TMAE 칼럼 상에서 프로세싱되고, 최종 제품으로 제형되었다. 각각의 제형된 분획을 분석하였다. 분획 10 내지 14가 풀링되었고, 전장 벡터 DNA가 있는 AAV8을 함유하는 상동성 최종 제품을 나타낸다. 분획 15 내지 21 및 추가적으로 분획 25 및 26가 별개로 프로세싱되고, AAV8 입자 내에 캡슐화된 벡터 DNA의 감소되는 길이를 나타낸다. 이는 도 14 및 15의 xDNA-아가로스 겔 및 도 16에 나타난 분석용 초원심분리의 데이터 (AUC)에서 나타난다.
도 13은 지시된 분획의 은 염색 (왼쪽) 및 웨스턴 블롯 (오른쪽)이다.
도 14는 실시예 9에 기술된 AAV8 입자의 초원심분리로부터 취한 하기 샘플의 1% 아가로스 겔의 사진이다: 레인 1 = 마커; 레인 2 = PV007 (원래의 채텀(Chatham) 프로세스로부터 유래된 AAV8); 레인 3 = 분획 15; 레인 4 = 분획 16; 레인 5 = 분획 17; 레인 6 = 분획 18; 레인 7 = 분획 19; 레인 8 = 분획 20; 레인 9 = 분획 21; 레인 10 = 분획 25; 레인 11 = 분획 26; 레인 12 = 임상 투여용 제품 AAV8; 및 레인 13 = 마커. BDS = 벌크 약물 물질 (최종 희석 TMAE-용리액). 이러한 도면은 초원심분리에서 더 높은 수크로스 밀도에서 수득된 UV 피크의 풀링된 분획 10 내지 14가 벡터 DNA의 더 작은 DNA 변이체에 대한 어떠한 추가 힌트도 없이 고도로 순수한 단일 DNA 밴드를 함유한다는 것을 나타낸다.
도 15는 실시예 9에 기술된 AAV8 입자의 초원심분리로부터 취한 하기 샘플의 0.8% 알칼리성 아가로스 겔의 사진이다: 레인 1 = 마커; 레인 2 = PV007 (원래의 채텀 프로세스로부터 유래된 AAV8); 레인 3 = 분획 15; 레인 4 = 분획 16; 레인 5 = 분획 17; 레인 6 = 분획 18; 레인 7 = 분획 19; 레인 8 = 분획 20; 레인 9 = 분획 21; 레인 10 = 분획 25; 레인 11 = 분획 26; 레인 12 = 임상 투여용 제품 AAV8; 및 레인 13 = 마커. BDS = 벌크 약물 물질 (최종 희석 TMAE-용리액). 이러한 도면은 초원심분리에서 더 높은 수크로스 밀도에서 수득된 UV 피크의 풀링된 분획 10 내지 14가 벡터 DNA의 더 작은 DNA 변이체에 대한 어떠한 추가 힌트도 없이 고도로 순수한 단일 DNA 밴드를 함유한다는 것을 나타낸다.
도 16a-16b는 출발 물질로서의 분석용 초원심분리 (AUC)의 지시된 분획으로부터 유래된 프락토겔 TMAE 용리 프로파일을 나타낸다. 완전 캡시드 및 빈 캡시드가 화살표로 확인된다. 불완전한 벡터 DNA를 함유하는 캡시드 (본원에서 또한 빈 캡시드로 정의됨)의 하위집단이 또한 확인된다. 데이터는 표 17에서 또한 표시된다. 분획에 관하여 도 12를 참조한다.
도 17은 트리스/NaCl 내의 50% (w/w) 에틸렌 글리콜 완충 용액 내의 AAV8이 55% 및 60% 수크로스 용액으로의 수크로스 구배를 사용하여 20시간 동안 35,000 rpm에서 초원심분리된 초원심분리 용리 프로파일의 그래프이다. AAV8 로딩 샘플 대 수크로스 구배의 비는 1:1이다. 벡터 DNA는 단일 가닥의 자가-상보적이고, 전장 (2.6 kB)인 인간 응고 인자 IX 파두아이다.
도 18은 55-60% 당 층 프로토콜로 초원심분리를 사용하여 인간 응고 인자 IX 파두아의 단일 가닥 벡터 DNA (2.6 kB)를 함유하는 AAV8을 분리하는 것의 그래프이고, 여기서 AAV8 샘플은 트리스/NaCl 내의 50% (w/w) 에틸렌 글리콜 완충 용액 내에서 로딩된다. 각각의 분획을 AAV8 ITR qPCR, AAV8 항원, WAX (약한 음이온 교환기 - 완전 캡시드)를 통해 테스트한다. DNA/AAV 비는 ITR qPCR 벡터 게놈 (vg/ml) / AAV8 캡시드 항원 ELISA (cp/ml)의 비이다. 그래프가 동일한 축 상에 제시되도록 하기 위해 데이터가 정규화되었다.
도 19는 트리스/NaCl 완충제 내의 50% (w/w) 에틸렌 글리콜 내의 AAV8이 55% 및 60% 수크로스 용액으로의 수크로스 구배를 통해 20시간 동안 35000 rpm에서 초원심분리된 초원심분리 용리 프로파일의 그래프이다. AAV8 로딩 샘플 대 수크로스 구배의 비는 1:1이고, 코어 부피는 3,200 ml이다. 벡터 DNA는 전장 (~4.8 kB)의 인간 응고 인자 VIII이다.
도 20은 하위종 분리를 실연하는 분획 8-10 (도 19 참조)로부터의 침강 계수 그래프의 오버레이이다. 화살표는 UC-구배에서 밀도가 더 높은 분획에서 더 낮은 밀도로 중량이 더 낮은 AAV8를 향한 이동을 가리킨다. 분획 8 > 분획 9 > 분획 10.
도 21은 50-55-60% 당 층 프로토콜로 초원심분리를 사용하여 인간 응고 인자 IX 파두아의 단일 가닥 벡터 DNA (2.6 kB)를 함유하는 AAV8을 분리하는 것의 그래프이고, 여기서 AAV8 샘플은 트리스HCl/NaCl 완충 용액 내에서 로딩된다. 각각의 분획을 AAV8 ITR qPCR 및 ELISA를 통해 테스트한다. DNA/AAV 비는 ITR qPCR 벡터 게놈 (vg/ml) / AAV8 캡시드 항원 ELISA (cp/ml)의 비이다. 그래프가 동일한 축 상에 제시되도록 하기 위해 데이터가 정규화되었다.
도 22는 트리스/NaCl 완충제 내의 50% (w/w) 에틸렌 글리콜 내의 AAV8이 55% 및 60% 수크로스 용액으로의 수크로스 구배를 통해 20시간 동안 35000 rpm에서 초원심분리된 초원심분리 용리 프로파일의 그래프이다. AAV8 로딩 샘플 대 수크로스 구배의 비는 1:1이고, 코어 부피는 7,700 ml이다. 벡터 DNA는 단일 가닥의 자가-상보적이고, (~2.6 kB)인 인간 응고 인자 IX 파두아이다.
상세한 설명
아데노-연관 바이러스 (AAV) 제품을 생산하는 방법, AAV를 정제하는 방법, 및 빈 AAV 캡시드 및 완전 AAV 캡시드를 포함하는 농축된 AAV 분획으로부터 완전 AAV 캡시드를 정제하는 방법이 본원에서 제공된다.
유리하게는, 큰 부피의 출발 물질, 예를 들어, 세포 배양물로 방법의 규모가 조정가능하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법은 적어도 또는 약 150 L, 적어도 또는 약 250 L, 적어도 또는 약 500 L, 적어도 또는 약 600 L, 적어도 또는 약 700 L, 적어도 또는 약 800 L, 적어도 또는 약 900 L, 또는 적어도 또는 약 1000 L의 부피로부터 AAV를 정제할 수 있는 대규모 방법이다. 특정 실시양태에서, 적어도 또는 약 1250 L, 적어도 또는 약 1500 L, 적어도 또는 약 2000 L, 적어도 또는 약 2500 L, 적어도 또는 약 3000 L, 적어도 또는 약 4000 L, 적어도 또는 약 5000 L, 적어도 또는 약 6000 L, 적어도 또는 약 7000 L, 적어도 또는 약 8000 L, 적어도 또는 약 9000 L, 적어도 또는 약 10,000 L, 또는 그 초과의 출발 물질 (예를 들어, 세포 배양물)의 최소 부피로 방법의 규모가 조정가능하다. 예를 들어, 약 1000 L 또는 약 10,000 L 또는 25,000 L 또는 그 초과의 최소 부피의 AAV를 생산하는 세포 배양물로 방법이 수행된다.
본원에 기술된 AAV의 생산 및 정제 방법은 이러한 방법이 고역가 AAV 생산을 초래하기 때문에 또한 유리하다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 1010개의 바이러스 입자 (vp)를 포함하는 AAV 제품이 약 1000 L의 출발 물질 (예를 들어, 세포 배양물)로부터 생산된다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 1011개의 바이러스 입자 (vp)를 포함하는 AAV 제품이 약 1000 L의 출발 물질 (예를 들어, 세포 배양물)로부터 생산된다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 1012개의 바이러스 입자 (vp)를 포함하는 AAV 제품이 약 1000 L의 출발 물질 (예를 들어, 세포 배양물)로부터 생산된다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 1013개의 바이러스 입자 (vp)를 포함하는 AAV 제품이 약 1000 L의 출발 물질 (예를 들어, 세포 배양물)로부터 생산된다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 1014개의 바이러스 입자 (vp)를 포함하는 AAV 제품이 약 1000 L의 출발 물질 (예를 들어, 세포 배양물)로부터 생산된다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 1015개의 바이러스 입자 (vp)를 포함하는 AAV 제품이 약 1000 L의 출발 물질 (예를 들어, 세포 배양물)로부터 생산된다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 2×1015개의 바이러스 입자 (vp)를 포함하는 AAV 제품이 약 1000 L의 출발 물질 (예를 들어, 세포 배양물)로부터 생산된다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 5×1015개의 바이러스 입자 (vp)를 포함하는 AAV 제품이 약 1000 L의 출발 물질 (예를 들어, 세포 배양물)로부터 생산된다.
고수율의 AAV를 제공하는 본 개시내용의 방법은, 특정 실시양태에서, 나노여과 단계에서 사용된 필터의 배제 사양보다 큰 바이러스 입자를 제거하는 나노여과 단계를 포함한다. 이러한 여과 단계는 최종 AAV 제품이 다른 방법에 의해 달성된 AAV 제품에 비교하여 인간 투여를 위한 더욱 안전한 제품이도록 허용한다. 나노여과 단계는 나노여과 단계에서 사용되는 필터의 배제 사양보다 큰 바이러스에 대한 효과적인 바이러스 감소 단계이고, 이는, 특정 실시양태에서, 본원에서 추가로 기술된 바와 같이, 방법이 나노여과를 통해 AAV 제품으로부터 4 로그 초과의 오염물 바이러스를 제거하는 능력을 지닌다는 것을 의미한다.
본원에 기술된 방법의 또 다른 장점은 방법이 고도로 순수한 AAV 제품을 초래한다는 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법을 통해 생산된 AAV 제품은 하나 이상의 오염물이 실질적으로 없다: 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 핵산 (예를 들어, 숙주 세포 DNA), 플라스미드 DNA, 빈 바이러스 벡터 (말단절단 또는 불완전 벡터 DNA를 포함함), 단백질 조성이 불완전하고 올리고머화된 구조를 지니는 AAV 입자, 또는 오염 바이러스, 예를 들어, 비-AAV, 지질 외피 바이러스, 열 충격 단백질 70 (HSP70), 락테이트 데히드로게나제 (LDH), 프로테아솜, 오염물 비-AAV 바이러스 (예를 들어, 지질-외피 바이러스), 숙주 세포 배양물 성분 (예를 들어, 펩티드, 항생제), 공정 관련 성분 (예를 들어 0.3% 트리-n-부틸포스페이트; 1.0% 트리톤 X100, 폴리에틸렌이민), 미코플라즈마, 발열원, 박테리아 내독소, 및 우발적인 작용제. 순도를 평가하기 위해 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 사용하는, 박층 크로마토그래피 (TLC), 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA), 또는 ITR qPCR와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 표준 분석 방법에 의해 결정되었을 때 불순물이 없는 것으로 나타나거나 또는 추가 정제가 물질의 물리적 및 화학적 성질, 예컨대 효소적 및 생물학적 활성을 검출가능하게 변경시키지 않도록 실질적으로 순수하면 AAV 제품은 실질적으로 없는 것으로 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 용어 "불순물이 실질적으로 없는"은 완전 캡시드 AAV가 아닌 물질이 약 50% (건조 중량 기준), 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만인 AAV의 제제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 용어 "불순물이 실질적으로 없는"은 불순물이 AAV 제품의 부피의 약 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% AAV 또는 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만을 나타내는 AAV의 제제를 포함한다.
예시적 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 출발 물질 (예를 들어, 세포 배양물)에서 발견되는 오염물의 적어도 또는 약 50%가 제거된 정제된 AAV 제품을 제공한다. 예시적 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 출발 물질 (예를 들어, 세포 배양물)에서 발견되는 오염물의 적어도 또는 약 60%가 제거된 정제된 AAV 제품을 제공한다. 예시적 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 출발 물질 (예를 들어, 세포 배양물)에서 발견되는 오염물의 적어도 또는 약 70%가 제거된 정제된 AAV 제품을 제공한다. 예시적 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 출발 물질 (예를 들어, 세포 배양물)에서 발견되는 오염물의 적어도 또는 약 80%가 제거된 정제된 AAV 제품을 제공한다. 예시적 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 출발 물질 (예를 들어, 세포 배양물)에서 발견되는 오염물의 적어도 또는 약 90%가 제거된 정제된 AAV 제품을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법을 통해 생산된 AAV 제품은 인간에게 투여하는데 적절하다. 특정 실시양태에서, AAV는 재조합 AAV (rAAV)이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법을 통해 생산된 AAV 제품은 무균성이고/이거나 우수 의약품 제조 관리 기준 (GMP) 등급이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법을 통해 생산된 AAV 제품은 유전자 요법 의약 제품에 대한 미국 약전 챕터 1046 또는 유럽 약전에 기재되어 있거나 또는 미국 식품의약청(U.S. Food and Drug Administration) (USFDA) 또는 유럽 의약품국(European Medicines Agency) (EMA)이 요구하는 바와 같은 요건을 준수한다.
추가적으로, 본원에 기술된 방법으로부터 생산된 AAV 제품은 고도로 효력이 있다. AAV 제품, 예를 들어, AAV8 제품의 효력은 (1) 마우스 혈장 mL 당 유닛 (FIX 또는 FVIII)으로 제공되는 생체내 생물효력 (예를 들어, 마우스에서의 활성 단백질 생산); 또는 (2) 시험관내 생물효력의 관점에서 기술될 수 있다. 시험관내 생물효력 테스트는 AAV 벡터가 관심 단백질을 발현하여 배지 내로 분비하는 세포, 예를 들어, HepG2 세포에 형질도입되는 잠재력을 측정하고, 이러한 양을 ELISA 기술 및/또는 효소 활성에 의해 결정한다. 생체내 및 시험관내 생물효력을 측정하는 적절한 방법이 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 또한 본원에서 실시예 12로서 기술된다.
추가 실시양태에서, 본원에 기술된 방법으로부터 생산된 AAV 제품은 우수한 DNA/AAV 비를 나타낸다. 예시적 실시양태에서, 본원에 기술된 방법으로부터 생산된 AAV 제품은 우수한 비의 벡터 게놈/AAV ㎍을 나타내고, 이는 AAV 제품에 높은 양의 완전 바이러스 입자가 있다는 것을 실연한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 AAV 분획을 AAV-특이적 ELISA를 통해 테스트하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV-특이적 ELISA는 AAV 분획의 효력에 대한 대표적인 판독을 제공하는데 충분한데, 이는 AAV 분획 내의 캡시드의 대다수가 완전 캡시드이기 때문이다.
당 구배 초원심분리
예시적 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 밀도 구배가 형성되는 초원심분리 단계를 포함한다. 이론에 제한되기를 원치 않지만, 초원심분리 단계는 완전 AAV 캡시드가 빈 AAV 캡시드로부터 분리되게 허용하는 것으로 생각된다. 본원에서 사용된 바와 같이, AAV 또는 AAV 캡시드 또는 AAV 입자와 관련된 용어 "완전 AAV 캡시드"는 완전한 벡터 게놈을 함유하는 것들을 지칭한다. 완전 AAV 캡시드는 수용 환자에게 치료 이익을 제공할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, AAV 또는 AAV 캡시드 또는 AAV 입자와 관련된 용어는 완전한 (즉, 완전) 벡터 게놈이 결여된 것들을 지칭한다. 특정 실시양태에서, "빈"은 "불완전한 벡터 DNA" 또는 "말단절단 벡터 DNA"를 또한 포함할 수 있다. 이같은 빈 AAV 또는 빈 AAV 캡시드 또는 빈 AAV 입자는 부분적으로 또는 전체적으로 벡터 게놈이 결여될 수 있고, 즉, 이는 부분적으로 비어 있거나 또는 완전히 비어 있을 수 있으며, 따라서, 치료 이익을 제공할 수 없다.
따라서, 본 개시내용은 빈 AAV 캡시드로부터 완전 AAV 캡시드를 분리하는 방법 또는 완전 AAV 캡시드 및 빈 AAV 캡시드를 포함하는 농축된 AAV 분획으로부터 완전 AAV 캡시드를 정제하는 방법을 제공한다. 예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 (i) 로터 내로 농축된 AAV 분획 (예를 들어, AAV를 포함하는 용액)을 각각 당 용액의 당 농도가 상이한 적어도 2개의 당 용액과 함께 로딩하는 단계, (ii) 로딩된 로터를 포함하는 초원심분리기를 배치 모드로 작동시켜, 당 구배를 형성시키는 단계, (iii) 당 구배의 분획을 수득하여, 완전 AAV 캡시드를 포함하는 AAV 분획을 수득하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 당 용액이 로딩된다. 특정 실시양태에서, 2개의 당 용액이 로딩된다. 특정 실시양태에서, 3개의 당 용액이 로딩된다.
로딩 시퀀스의 순서는 먼저 AAV 분획 (예를 들어, AAV를 포함하는 용액), 그 후 가장 낮은 농도의 당 용액, 그 후 다음으로 더 농축된 당 용액 등일 수 있다.
예시적 측면에서, 방법은 로터 내로 AAV 분획 (예를 들어, AAV를 포함하는 용액)을 각각의 당 용액이 (a) 당 농도가 상이하고 (b) 약 45% (w/w) 내지 약 65% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 적어도 2개의 당 용액과 함께 로딩하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 약 50% (w/w) 내지 약 60% (w/w) 수크로스 또는 약 55% (w/w) 내지 약 60% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다.
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 당 용액이 52-58% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하고, 적어도 또 다른 당 용액이 57-63% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하며, 임의적으로, 또 다른 당 용액이 47-53% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다.
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 당 용액이 54-56% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하고, 적어도 또 다른 당 용액이 59-61% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하며, 임의적으로, 또 다른 당 용액이 49-51% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다.
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 당 용액이 약 54% (w/w)를 초과하는 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하고, 적어도 또 다른 당 용액이 약 59% (w/w)를 초과하는 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하며, 임의적으로, 또 다른 당 용액은 약 49% (w/w)를 초과하는 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도이다.
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 당 용액이 약 55% (w/w) 이상의 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하고, 적어도 또 다른 당 용액이 약 60% (w/w) 이상의 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하며, 임의적으로, 또 다른 당 용액은 약 50% (w/w) 이상의 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도이다.
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 당 용액이 약 55% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하고, 적어도 또 다른 당 용액이 약 60% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하며, 임의적으로, 또 다른 당 용액은 약 50% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도이다.
로딩 시퀀스의 순서는 먼저 AAV 분획 (예를 들어, AAV를 포함하는 용액), 그 후 가장 낮은 농도의 당 용액, 그 후 다음으로 더 농축된 당 용액일 수 있다 (예를 들어, 먼저, 존재한다면, 47-53% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액, 그 후 52-58% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액, 그 후 57-63% (w/w) 수크로스)의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액).
적어도 하나의 당 용액이 52-58% (w/w) 수크로스, 53-57% (w/w) 수크로스 또는 약 55% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하고, 적어도 또 다른 당 용액이 57-63% (w/w) 수크로스, 58-62% (w/w) 수크로스 또는 약 60% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 실시양태의 장점은 이같은 당 용액으로 형성된 구배가 AAV 캡시드의 개선된 분리를 제공할 수 있다는 것이다.
예시적 측면에서, 방법은 로터 내로 AAV 분획 (예를 들어, AAV를 포함하는 용액)을 각각의 당 용액이 (a) 당 농도가 상이하고 (b) 약 45% (w/w) 내지 약 65% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 적어도 3개의 당 용액과 함께 로딩하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 약 50% (w/w) 내지 약 60% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다.
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 당 용액이 47-53% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하고, 적어도 또 다른 당 용액이 52-58% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하며, 적어도 또 다른 당 용액이 57-63% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다.
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 당 용액이 49-51% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하고, 적어도 또 다른 당 용액이 54-56% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하며, 적어도 또 다른 당 용액이 59-61% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다.
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 당 용액이 약 49% (w/w)를 초과하는 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하고, 적어도 또 다른 당 용액이 약 54% (w/w)를 초과하는 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하며, 적어도 하나의 당 용액이 약 49% (w/w)를 초과하는 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다.
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 당 용액이 약 50% (w/w) 수크로스 이상의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하고, 적어도 또 다른 당 용액이 약 55% (w/w) 수크로스 이상의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하며, 적어도 하나의 당 용액이 약 60% (w/w) 수크로스 이상의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다.
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 당 용액이 약 50% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하고, 적어도 하나의 당 용액이 약 55% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하며, 적어도 또 다른 당 용액이 약 60% (w/w)의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다.
특정 실시양태에서, 로딩 시퀀스의 순서는 먼저 47-53% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액, 그 후 52-58% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액, 그 후 57-63% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액일 수 있다.
로딩 시퀀스의 순서는 먼저 AAV 분획 (예를 들어, AAV를 포함하는 용액), 그 후 가장 낮은 농도의 당 용액, 그 후 다음으로 농축된 당 용액일 수 있다 (예를 들어, 먼저 47-53% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액, 그 후 52-58% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액, 그 후 57-63% (w/w) 수크로스)의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액).
예시적 측면에서, 각각의 AAV 분획 및/또는 당 용액은 추가적인 성분, 예를 들어, 완충 작용제, 염 등을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 각각의 AAV 분획 및/또는 당 용액은, 개별적으로, 약 5.5 내지 약 8.5의 pH를 안정화시키기 위해 임의의 완충제 물질 또는 이들의 조합물을 포함한다. 허용가능한 완충제의 예는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 비제한적으로, 포스페이트 완충제, 히스티딘 (예를 들어, L-히스티딘), 시트르산나트륨, HEPES, 트리스, 바이신, 글리신, N-글리실글리신, 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 글리실 글리신, 라이신, 아르기닌, 인산나트륨, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충제는 트리스HCl 또는 트리스HCl/NaCl이다. 완충제/분획/용액의 pH는 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 또는 9.0일 수 있다. 완충제/분획/용액의 pH는 7.0 내지 9.0, 7.1 내지 8.9, 7.2 to 9.0, 7.0 내지 8.8, 7.2 내지 8.8, 7.1 내지 8.6, 7.3 내지 8.9, 7.4 내지 9.0, 또는 7.4 내지 8.5일 수 있다. 특정 실시양태에서, 각각의 완충제, AAV 분획 및/또는 당 용액은, 개별적으로, pH가 약 7.4이다. 특정 실시양태에서, 각각의 완충제, AAV 분획 및/또는 당 용액은, 개별적으로, pH가 약 8.0이다. 특정 실시양태에서, 각각의 완충제, AAV 분획 및/또는 당 용액은, 개별적으로, pH가 약 8.5이다.
특정 실시양태에서, 완충제는 트리스HCl/NaCl일 수 있다. 특정 실시양태에서, 트리스HCl은 약 10 mM 내지 약 100 mM 또는 약 20 내지 약 50 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, 트리스HCl은 약 10 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 또는 약 100 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, NaCl은 약 100 mM 내지 약 1 M, 약 150 mM 내지 약 750 mM, 약 150 mM 내지 약 500 mM, 또는 약 500 mM 내지 약 750 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, NaCl의 농도는 약 100 mM, 약 120 mM, 약 125 mM 약 130 mM, 약 136 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 175 mM, 약 200 mM, 약 225 mM, 약 250 mM, 약 275 mM, 약 300 mM, 약 325 mM, 약 350 mM, 약 375 mM, 약 400 mM, 약 425 mM, 약 450 mM, 약 475 mM, 약 500 mM, 약 525 mM, 약 550 mM, 약 575 mM, 약 600 mM, 약 625 mM, 약 650 mM, 약 675 mM, 약 700 mM, 약 725 mM, 약 750 mM, 약 775 mM, 약 800 mM, 약 825 mM, 약 850 mM, 약 875 mM, 약 900 mM, 약 925 mM, 약 950 mM, 약 975 mM, 또는 약 1 M이다. 특정 실시양태에서, 트리스HCl은 약 10 mM 내지 약 100 mM 또는 약 20 mM 내지 약 50 mM의 농도이고, NaCl은 약 100 mM 내지 약 1M, 약 150 mM 내지 약 750 mM, 약 150 mM 내지 약 500 mM, 또는 약 500 mM 내지 약 750 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, 트리스HCl은 약 50 mM의 농도이고, NaCl은 약 500 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, 트리스HCl은 약 20 mM의 농도이고, NaCl은 약 136 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, 트리스HCl은 약 50 mM의 농도이고, NaCl은 약 750 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, 완충제는 pH 약 7.4의 트리스HCl/NaCl 완충제이다. 특정 실시양태에서, 완충제는 pH 약 8.0의 트리스HCl/NaCl 완충제이다. 특정 실시양태에서, 완충제는 pH 약 8.5의 트리스HCl/NaCl 완충제이다.
특정 실시양태에서, AAV 분획 용액은 pH 8.5에서 약 50 mM 트리스HCl 및 500 mM NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV 분획 용액은 pH 8.0에서 약 50 mM 트리스HCl 및 750 mM NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 당 용액은 pH 7.4에서 약 20 mM 트리스HCl 및 136 mM NaCl을 포함한다.
예시적 측면에서, 방법은 로터 내로 완충된 에틸렌 글리콜 용액을 포함하는 AAV 분획 (예를 들어, AAV를 포함하는 용액), 및 각각의 당 용액이 (a) 당 농도가 상이하고 (b) 약 45% (w/w) 내지 약 65% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 적어도 2개의 당 용액을 로딩하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 약 50% (w/w) 내지 약 60% (w/w) 수크로스 또는 약 55% (w/w) 내지 약 60% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다. 당 농도의 범위는 상기 열거된 바와 동일하다. 완충된 에틸렌 글리콜 용액을 사용하는 것의 장점은 얕은 구배가 수행될 수 있다는 것이다. 이론에 제한되기를 원치 않으면서, 에틸렌 글리콜 용액이 초원심분리 매트릭스의 점도 및/또는 밀도 성질을 변화시킬 수 있다. 프로세싱 시간 증가와 조합하여 에틸렌 글리콜을 첨가하는 것이 얕은 구배를 생성시키고, 이는 완전 캡시드를 빈 캡시드로부터 더 작은 벡터 DNA (예를 들어, ≤ 3 kb 또는 ≤ 5 kb)를 함유하는 빈 캡시드로부터 분리하는 것을 허용한다는 것이 뜻밖에 발견되었다. 본원에서 사용된 바와 같이, "얕은 구배"는 용액 밀도 또는 구배-형성-용질 농도 (예를 들어, 수크로스 구배)가 거리에 대비하여 점진적으로 변화되는 구배이다. 이는 용액 밀도 또는 구배-형성-용질 농도가 거리에 대비하여 급속하게 변화되는 구배에 대조적이다. 예를 들어, 약 2.5 내지 약 5.0 kb인 DNA 벡터가 있는 AAV는 로딩 완충제가 약 45% 내지 약 55% 에틸렌 글리콜 용액을 포함할 때 더욱 효율적으로 분할될 수 있다. 특정 실시양태에서, AAV 분획 용액에서 에틸렌 글리콜을 사용하는 것은 약 2.5 내지 약 3.0 kb인 DNA 벡터의 분리를 허용한다. 특정 실시양태에서, 방법은 약 2.5, 약 2.6, 약 2.7, 약 2.8, 약 2.9, 약 3.0, 약 3.1, 약 3.2, 약 3.3, 약 3.4, 약 3.5, 약 3.6, 약 3.7, 약 3.8, 약 3.9, 약 4.0, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 또는 약 5.0 kb인 DNA 벡터의 더 큰 분할을 허용한다. 특정 실시양태에서, 적어도 3개의 상이한 당 농도가 있는 당 용액으로 강화된 분할이 발생한다. 특정 실시양태에서, 적어도 2개의 상이한 당 농도가 있는 당 용액으로 강화된 분할이 발생한다. 특정 실시양태에서, 2개의 상이한 당 농도가 있는 당 용액으로 강화된 분할이 발생한다. 특정 실시양태에서, 52-58% (w/w) 수크로스, 53-57% (w/w) 수크로스 또는 약 55% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도의 하나의 당 용액을 사용하고, 적어도 또 다른 당 용액이 57-63% (w/w) 수크로스, 58-62% (w/w) 수크로스 또는 약 60% (w/w) 수크로스의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함할 때 강화된 분할이 발생한다.
예시적 측면에서, 방법은 로터 내로 완충된 에틸렌 글리콜 용액이 있는 AAV 분획 (예를 들어, AAV를 포함하는 용액), 및 각각의 당 용액이 (a) 당 농도가 상이하고 (b) 약 45% (w/w) 내지 약 65% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 적어도 3개의 당 용액을 로딩하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 약 50% (w/w) 내지 약 60% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함한다. 당 농도의 범위는 상기 열거된 바와 동일하다.
완충된 에틸렌 글리콜 용액은 약 5.5 내지 약 8.5의 pH를 안정화시키기 위해 임의의 완충제 물질 또는 이의 조합물을 포함할 수 있다. 허용가능한 완충 작용제의 예는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 비제한적으로, 포스페이트 완충제, 히스티딘, 시트르산나트륨, HEPES, 트리스, 바이신, 글리신, N-글리실글리신, 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 글리실 글리신, 라이신, 아르기닌, 인산나트륨, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충제는 트리스HCl 또는 트리스HCl/NaCl이다. 완충제/용액의 pH는 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 또는 9.0일 수 있다. 완충제/용액의 pH는 7.0 내지 9.0, 7.1 내지 8.9, 7.2 내지 9.0, 7.0 내지 8.8, 7.2 내지 8.8, 7.1 내지 8.6, 7.3 내지 8.9, 7.4 내지 9.0, 또는 7.4 내지 8.5일 수 있다. 특정 실시양태에서, 완충제/용액은 약 7.4의 pH이다. 특정 실시양태에서, 완충제/용액은 약 8.0의 pH이다. 특정 실시양태에서, 완충제/용액은 약 8.5의 pH이다.
특정 실시양태에서, 완충된 에틸렌 글리콜 용액은 트리스HCl/NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 트리스HCl은 약 10 mM 내지 약 100 mM 또는 약 20 내지 약 50 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, 트리스HCl은 약 10 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 40 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 또는 약 100 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, NaCl은 약 100 mM 내지 약 1 M, 약 150 mM 내지 약 750 mM, 또는 약 150 mM 내지 약 500 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, NaCl의 농도는 약 100 mM, 약 120 mM, 약 125 mM 약 130 mM, 약 136 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 175 mM, 약 200 mM, 약 225 mM, 약 250 mM, 약 275 mM, 약 300 mM, 약 325 mM, 약 350 mM, 약 375 mM, 약 400 mM, 약 425 mM, 약 450 mM, 약 475 mM, 약 500 mM, 약 525 mM, 약 550 mM, 약 575 mM, 약 600 mM, 약 625 mM, 약 650 mM, 약 675 mM, 약 700 mM, 약 725 mM, 약 750 mM, 약 775 mM, 약 800 mM, 약 825 mM, 약 850 mM, 약 875 mM, 약 900 mM, 약 925 mM, 약 950 mM, 약 975 mM, 또는 약 1 M이다. 특정 실시양태에서, 트리스HCl는 약 10 mM 내지 약 100 mM 또는 약 20 mM 내지 약 50 mM의 농도이고, NaCl은 약 100 mM 내지 약 1M, 약 150 mM 내지 약 750 mM, 약 150 mM 내지 약 500 mM, 또는 약 500 mM 내지 약 750 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, 트리스HCl은 약 50 mM의 농도이고, NaCl은 약 500 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, 트리스HCl은 약 20 mM의 농도이고, NaCl은 약 136 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, 트리스HCl은 약 50 mM의 농도이고, NaCl은 약 750 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, 완충제는 pH 약 7.4의 트리스HCl/NaCl 완충제이다. 특정 실시양태에서, 완충제는 pH 약 8.0의 트리스HCl/NaCl 완충제이다. 특정 실시양태에서, 완충제는 pH 약 8.5의 트리스HCl/NaCl 완충제이다.
완충된 에틸렌 글리콜 용액은 45% 내지 55% (w/w), 46% 내지 54% (w/w), 45% 내지 53% (w/w), 47% 내지 55% (w/w), 또는 48% 내지 52% (w/w)의 완충제 (예를 들어, 트리스HCl/NaCl)를 포함할 수 있다. 완충된 에틸렌 글리콜 용액은 40% (w/w), 41% (w/w), 42% (w/w), 43% (w/w), 44% (w/w), 45% (w/w), 46% (w/w), 47% (w/w), 48% (w/w), 49% (w/w), 50% (w/w), 51% (w/w), 52% (w/w), 53% (w/w), 54% (w/w), 55% (w/w), 56% (w/w), 57% (w/w), 58% (w/w), 59% (w/w), 또는 60% (w/w)의 완충제 (예를 들어, 트리스HCl/NaCl)를 포함할 수 있다. 완충된 에틸렌 글리콜 용액은 수성일 수 있다.
특정 실시양태에서, 완충된 에틸렌 글리콜 용액은 8.0의 pH에서 45-55% (w/w) 에틸렌 글리콜, 50 mM 트리스HCl, 및 750 mM NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충된 에틸렌 글리콜 용액은 8.0의 pH에서 50% (w/w) 에틸렌 글리콜, 50 mM 트리스HCl, 및 750 mM NaCl을 포함한다.
특정 실시양태에서, 초원심분리기 로터 코어의 부피는 약 800 ml 내지 약 9000 ml이다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기 로터 코어의 부피는 약 800 ml 내지 약 7700 ml이다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기 로터 코어의 부피는 약 800 ml이다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기 로터 코어의 부피는 약 1600 ml이다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기 로터 코어의 부피는 약 3200 ml이다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기 로터 코어의 부피는 약 7700 ml이다.
특정 실시양태에서, 당 용액은 일정한 유속으로 로딩된다. 특정 실시양태에서, 일정한 유속은 약 0.25 L/시 내지 약 10 L/시 또는 약 1.5 L/시 내지 약 7 L/시이다. 특정 실시양태에서, 일정한 유속은 약 0.25 L/시, 약 0.5 L/시, 약 0.75 L/시, 약 1 L/시, 약 1.25 L/시, 약 1.5 L/시, 약 1.75 L/시, 약 2 L/시, 약 2.5 L/시, 약 3 L/시, 약 3.5 L/시, 약 4 L/시, 약 4.5 L/시, 약 5 L/시, 약 5.5 L/시, 약 6 L/시, 약 6.5 L/시, 약 7 L/시, 약 7.5 L/시, 약 8 L/시, 약 8.5 L/시, 약 9 L/시, 약 9.5 L/시, 또는 약 10 L/시이다.
특정 실시양태에서, 방법은 로터 내로 약 45-55% (w/w)의 AAV 분획 (완충된 에틸렌 글리콜 용액이 있거나 또는 없음) 및 약 45-55% (w/w)의 적어도 2개의 당 용액을 로딩하는 것을 포함한다. 예시적 실시양태에서, 방법은 로터 내로 약 50% (w/w)의 AAV 분획 (완충된 에틸렌 글리콜 용액이 있거나 또는 없음) 및 약 50% (w/w)의 적어도 2개의 당 용액을 로딩하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기 로터 코어의 부피는 약 800 ml 내지 약 3200 ml이고, 로터에 약 45-55% (w/w)의 AAV 분획 (완충된 에틸렌 글리콜 용액이 있거나 또는 없음) 및 약 45-55% (w/w)의 적어도 2개의 당 용액이 로딩된다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기 로터 코어의 부피는 약 800 ml 내지 약 3200 ml이고, 로터에 약 50% (w/w)의 AAV 분획 (완충된 에틸렌 글리콜 용액이 있거나 또는 없음) 및 총계로 약 50% (w/w)의 적어도 2개의 당 용액이 로딩된다. 예를 들어, 로터 코어가 800 ml이면, AAV 분획은 400 ml일 수 있고, 총 당 용액 부분은 400 ml이다.
특정 실시양태에서, 방법은 로터 내로 약 65-85% (w/w)의 AAV 분획 (완충된 에틸렌 글리콜 용액이 있거나 또는 없음) 및 15-35% (w/w)의 적어도 2개의 당 용액을 로딩하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 로터 내로 약 70-80% (w/w)의 AAV 분획 (완충된 에틸렌 글리콜 용액이 있거나 또는 없음) 및 약 20-30% (w/w)의 적어도 2개의 당 용액을 로딩하는 것을 포함한다. 예시적 실시양태에서, 방법은 로터 내로 약 75% (w/w)의 AAV 분획 (완충된 에틸렌 글리콜 용액이 있거나 또는 없음) 및 약 25% (w/w)의 적어도 2개의 당 용액을 로딩하는 것을 포함한다. 예시적 실시양태에서, 방법은 로터 내로 약 74% (w/w)의 AAV 분획 (완충된 에틸렌 글리콜 용액이 있거나 또는 없음) 및 약 26% (w/w)의 적어도 2개의 당 용액을 로딩하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기 로터 코어의 부피는 약 7700 ml 내지 약 9000 ml이고, 로터에 약 70-80% (w/w)의 AAV 분획 (완충된 에틸렌 글리콜 용액이 있거나 또는 없음) 및 약 20-30% (w/w)의 적어도 2개의 당 용액이 로딩된다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기 로터 코어의 부피는 약 7700 ml 내지 약 9000 ml이고, 로터에 약 75% (w/w)의 AAV 분획 (완충된 에틸렌 글리콜 용액이 있거나 또는 없음) 및 약 25% (w/w)의 적어도 2개의 당 용액이 로딩된다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기 로터 코어의 부피는 약 7700 ml 내지 약 9000 ml이고, 로터에 약 74% (w/w)의 AAV 분획 (완충된 에틸렌 글리콜 용액이 있거나 또는 없음) 및 약 26% (w/w)의 적어도 2개의 당 용액이 로딩된다. 예를 들어, 로터 코어가 7700 ml이면, AAV 분획은 6100 ml일 수 있고, 총 당 용액 부분은 1600 ml일 수 있다.
특정 실시양태에서, 당 용액은 대략적으로 동일한 부피로 첨가된다. 특정 실시양태에서, 방법은 적어도 2개의 당 용액을 로딩하는 것을 포함하고, 최소 당 농도의 당 용액은 로터 내의 다른 당 용액의 부피와 동일한 부피로 로터에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 방법은 적어도 2개의 당 용액을 로딩하는 것을 포함하고, 최소 당 농도의 당 용액은 로터 내의 다른 당 용액 중 하나의 부피의 2배인 부피로 로터에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 방법은 적어도 2개의 당 용액을 로딩하는 것을 포함하고, 최소 당 농도의 당 용액은 로터 내의 다른 당 용액의 부피의 약 1.6배 또는 약 2.6배인 부피로 로터에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 방법은 적어도 2개의 당 용액을 로딩하는 것을 포함하고, 최소 당 농도의 당 용액은 로터 내의 다른 당 용액 중 하나의 부피의 절반인 부피로 로터에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 최소 당 농도의 당 용액은 최대 당 농도의 당 용액의 부피의 2배인 부피로 로터에 로딩되고, 임의적으로, 여기서 최대 당 농도의 당 용액의 부피는 중간 당 농도의 당 용액의 부피와 동일하다. 특정 실시양태에서, 최소 당 농도의 당 용액은 최대 당 농도의 당 용액의 부피의 약 2.6배인 부피로 로터에 로딩되고, 임의적으로, 여기서 중간 당 농도의 당 용액의 부피는 최대 당 농도의 당 용액의 부피의 약 1.6배이다. 특정 실시양태에서, 최소 당 농도의 당 용액은 최대 당 농도의 당 용액의 부피와 동일한 부피로 로터에 로딩되고, 임의적으로, 여기서 최대 당 농도의 당 용액의 부피는 중간 당 농도의 당 용액의 부피의 절반이다. 특정 실시양태에서, 최소 당 농도의 당 용액은 AAV 분획의 부피의 절반인 부피로 로터에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 최소 당 농도의 당 용액은 AAV 분획의 부피의 3/4인 부피로 로터에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 당 용액의 부피 대 AAV 분획의 부피의 비는 1 이하이다.
특정 실시양태에서, 방법은 2개의 당 용액을 로딩하는 것을 포함하고, 최소 당 농도의 당 용액은 로터 내의 최대 당 용액의 부피와 동일한 부피로 로터에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 최소 당 농도의 당 용액은 AAV 분획의 부피의 절반인 부피로 로터에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 당 용액의 부피 대 AAV 분획의 부피의 비는 1 이하이다.
특정 실시양태에서, 방법은 3개의 당 용액을 로딩하는 것을 포함하고, 최소 당 농도의 당 용액은 로터 내의 다른 2개의 당 용액 중 하나의 부피의 적어도 2배인 부피로 로터에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 최소 당 농도의 당 용액은 최대 당 농도의 당 용액의 부피의 2배인 부피로 로터에 로딩되고, 임의적으로, 여기서 최대 당 농도의 당 용액의 부피는 중간 당 농도의 당 용액의 부피와 동일하다. 예를 들어, 최소 당 용액의 당 용액은 약 750 ml 내지 약 900 ml 또는 약 800 ml의 부피일 수 있고, 중간 당 농도의 당 용액은 약 350 ml 내지 약 450 ml 또는 약 400 ml의 부피일 수 있으며, 최대 당 농도의 당 용액은 약 350 ml 내지 약 450 ml 또는 약 400 ml의 부피일 수 있다. 특정 실시양태에서, 최소 당 농도의 당 용액은 AAV 분획의 부피의 절반인 부피로 로터에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 최소 당 농도의 당 용액은 AAV 분획의 부피의 3/4인 부피로 로터에 로딩된다. 특정 실시양태에서, 당 용액의 부피 대 AAV 분획의 부피의 비는 1 이하이다. 예시적 측면에서, 로터는 구역 로터이다. 특정 실시양태에서, 당 용액 및 AAV 분획의 총 부피는 구역 로터의 부피 이하이다. 특정 실시양태에서, 구역 로터 내의 용액들의 총 부피의 부피는 약 800 ml 내지 9 L이다. 특정 실시양태에서, 당 용액의 부피는 구역 로터의 부피의 약 50% 이상이다. 예를 들어, 당 용액의 부피는 부피가 약 3200 ml 미만, 예를 들어, 약 3200 ml, 약 1600 ml, 또는 약 800 ml 미만인 구역 로터의 부피의 약 50% 이하이다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 7 L 초과, 예를 들어, 7.7 L의 코어가 사용될 때, 당 용액의 부피는 구역 로터의 부피의 약 25% 이하이다.
특정 실시양태에서, 구역 로터에 로딩된 총 당 구배의 부피 대 AAV 분획의 부피의 비는 약 1:1 내지 약 1:5이다. 일부 실시양태에서, 구역 로터에 로딩된 총 당 구배의 부피 대 AAV 분획의 부피는 약 1:1, 약 1:1.25, 약 1:1.5, 약 1:1.75, 약 1:2, 약 1:2.25, 약 1:2.5, 약 1:2.75, 약 1:3, 약 1:3.25, 약 1:3.5, 약 1:3.75, 약 1:4, 약 1:4.25, 약 1:4.5, 약 1:4.75, 또는 약 1:5이다.
예시적 측면에서, 방법은 구역 로터 내로 농축된 AAV 분획을 각각의 당 농도가 상이하고 각각 약 45% (w/w) 내지 약 65% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도 (상기 개요된 바와 같은 범위)와 등가인 농도로 당을 포함하는 적어도 2개의 당 용액과 함께 로딩하는 것을 포함하고, 여기서 (A) 당 용액의 부피는 구역 로터의 부피의 약 50% 이거나, (B) 당 용액 및 AAV 분획의 총 부피는 구역 로터의 부피 이하이거나, (C) 당 용액의 부피 대 AAV 분획의 부피의 비는 1 이하이거나, 또는 (D) (A), (B) 및 (C)의 조합이다. 특정 실시양태에서, 구역 로터 내의 용액의 총 부피의 부피는 약 800 ml 내지 9 L이다. 특정 실시양태에서, 당 용액의 부피는 구역 로터의 부피의 구역 로터의 부피의 약 50% 이상이다. 예를 들어, 당 용액의 부피는 부피가 약 3200 ml 미만, 예를 들어, 약 3200 ml, 약 1600 ml, 또는 약 800 ml 미만인 구역 로터의 부피의 약 50% 이하이다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 7 L 초과, 예를 들어, 7.7 L의 코어가 사용될 때, 당 용액의 부피는 구역 로터의 부피의 약 25% 이하이다.
예시적 측면에서, 각각의 당 용액은 가용성 탄수화물 또는 탄수화물 혼합물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 각각의 당 용액은 이당류 (예를 들어, 수크로스, 말토스 또는 락토스) 및/또는 삼당류를 포함한다. 특정 실시양태에서, 당 용액의 밀도는 농도가 약 45% (w/w) 내지 약 65% (w/w) 범위인 수크로스 용액의 밀도와 동일하다. 특정 실시양태에서, 당 용액 중 적어도 하나는 소정의 온도에서의 약 60% 수크로스와 동일한 밀도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 범위는 상기 열거된 바와 같다.
본원에서의 목적을 위해, 수크로스 이외의 당이 사용될 수 있고, 단, 당 용액 내의 당은 상술된 범위 내이거나 특정 양 (%(w/w))인 수크로스 농도와 등가인 농도여야 한다. 수크로스의 농도는 수성 용액의 당 함량을 브릭스 도 ("°Bx")로 결정하는 굴절 지수 방법에 의해 결정될 수 있고, 여기서 1도 브릭스는 용액 100 그램 내의 수크로스 1 그램이다. 브릭스 도는 용액의 강도를 질량 백분율로서 나타낸다 - 용액이 순수한 수크로스 이외의 용해된 고체를 함유하면, °Bx는 용해된 고체 함량에 가까울 뿐이다. 순수한 용액의 경우, 수크로스의 농도는 밀도 측정에 의해서 결정될 수도 있다. 신원 및 농도 양쪽 모두의 결정이 필요한 경우, 시판되는 효소 키트를 적용하여 수크로스 농도를 결정하고 수크로스를 다른 이당류 및 탄수화물로부터 구별할 수 있다. 수크로스 검정법 키트, 예컨대 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미주리주 세인트 루이스)가 카탈로그 번호 SCA20으로 판매하는 것을 사용할 수 있다.
예시적 측면에서, 각각의 당 용액은 수크로스를 포함한다. 예시적 측면에서, 방법은 로터 (예를 들어, 구역 로터) 내로 AAV 분획 (예를 들어, AAV를 포함하는 용액)을 각각의 수크로스 용액이 (a) 수크로스 농도가 상이하고, (b) 약 45% (w/w) 내지 약 65% (w/w) 수크로스 범위의 농도로 수크로스를 포함하는 적어도 2개의 수크로스 용액과 함께 로딩하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 용액이 52-58% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하고, 적어도 또 다른 용액이 57-63% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하며, 임의적으로 적어도 또 다른 용액이 47-53% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 용액이 54-56% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하고, 적어도 또 다른 용액이 59-61% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하며, 임의적으로, 적어도 또 다른 용액이 49-51% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 용액이 약 54% (w/w)를 초과하는 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하고, 적어도 또 다른 용액이 약 59% (w/w)를 초과하는 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하며, 임의적으로, 적어도 또 다른 용액이 약 49% (w/w)를 초과하는 수크로스의 농도로 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 용액이 약 55% (w/w) 이상의 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하고, 적어도 하나의 용액이 약 60% (w/w) 이상의 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하며, 임의적으로, 적어도 하나의 용액이 약 50% (w/w) 이상의 수크로스의 농도로 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 용액이 약 55% (w/w) 수크로스와 동일한 농도로 수크로스를 포함하고, 적어도 하나의 용액이 약 60% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하며, 임의적으로, 적어도 하나의 용액이 약 50% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV를 포함하는 용액은 완충 용액 (예를 들어, 트리스HCl/NaCl 완충제)이다. 특정 실시양태에서, AAV를 포함하는 용액은 상기 기술된 바와 같은 완충된 에틸렌 글리콜 용액이다. 특정 실시양태에서, 완충된 에틸렌 글리콜 용액은 수성 용액이다. 특정 실시양태에서, 완충된 에틸렌 글리콜 용액은 45-55% (w/w)의 에틸렌 글리콜, 및 트리스HCl 및 NaCl을 포함하는 완충제를 포함하는 수성 용액이다. 특정 실시양태에서, 트리스HCl은 약 20 내지 약 50 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, NaCl은 약 100 mM 내지 약 750 mM 또는 약 150 mM 내지 약 500 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, 트리스HCl은 약 20 내지 약 50 mM의 농도이고, NaCl은 약 100 mM 내지 약 750 mM, 약 150 mM 내지 약 500 mM, 또는 약 500 mM 내지 약 750 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, AAV를 포함하는 용액의 pH는 7.4 내지 8.5, 7.6 내지 8.3, 7.8 내지 8.5, 7.4 내지 7.8, 7.6 내지 8.0, 7.8 내지 8.2, 또는 8.0 내지 8.5이다.
예시적 측면에서, 방법은 로터 (예를 들어, 구역 로터) 내로 AAV 분획 (예를 들어, AAV를 포함하는 용액)을 각각의 수크로스 용액이 (a) 수크로스 농도가 상이하고, (b) 약 50% (w/w) 내지 약 60% (w/w) 수크로스 범위의 농도로 수크로스를 포함하는 적어도 2개의 수크로스 용액과 함께 로딩하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 용액이 52-58% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하고, 적어도 또 다른 용액이 57-63% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 용액이 54-56% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하고, 적어도 또 다른 용액이 59-61% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 용액이 약 54% (w/w)를 초과하는 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하며, 적어도 또 다른 용액이 약 59% (w/w)를 초과하는 수크로스의 농도로 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 용액이 약 55% (w/w) 이상의 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하고, 적어도 하나의 용액이 약 60% (w/w) 이상의 수크로스의 농도로 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 용액이 약 55% (w/w) 수크로스와 동일한 농도로 수크로스를 포함하고, 적어도 하나의 용액이 약 60% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV를 포함하는 용액은 완충 용액 (예를 들어, 트리스HCl/NaCl 완충제)이다. 특정 실시양태에서, AAV를 포함하는 용액은 상기 기술된 바와 같은 완충된 에틸렌 글리콜 용액이다
예시적 측면에서, 방법은 로터 (예를 들어, 구역 로터) 내로 AAV 분획 (예를 들어, AAV를 포함하는 용액)을 각각의 수크로스 용액이 (a) 수크로스 농도가 상이하고, (b) 약 45% (w/w) 내지 약 65% (w/w) 수크로스 범위이고, 임의적으로는 약 50% (w/w) 내지 약 60% (w/w)인 농도로 수크로스를 포함하는 적어도 3개의 수크로스 용액과 함께 로딩하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 용액이 47-53% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하고, 적어도 또 다른 용액이 52-58% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하며, 적어도 또 다른 용액이 57-63% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 용액이 49-51% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하고, 적어도 또 다른 용액이 54-56% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하며, 적어도 또 다른 용액이 59-61% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 용액이 약 49% (w/w)를 초과하는 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하고, 적어도 또 다른 용액이 54% (w/w)를 초과하는 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하며, 적어도 또 다른 용액이 약 59% (w/w)를 초과하는 수크로스의 농도로 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 용액이 약 50% (w/w) 이상의 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하고, 적어도 하나의 용액이 약 55% (w/w) 이상의 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하며, 적어도 하나의 용액이 약 60% (w/w) 이상의 수크로스의 농도로 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 용액이 약 50% (w/w) 수크로스와 동일한 농도로 수크로스를 포함하고, 적어도 하나의 용액이 약 55% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하며, 적어도 하나의 용액이 약 60% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV를 포함하는 용액은 완충 용액 (예를 들어, 트리스HCl/NaCl 완충제)이다. 특정 실시양태에서, AAV를 포함하는 용액은 상기 기술된 바와 같은 완충된 에틸렌 글리콜 용액이다.
예시적 측면에서, 방법은 로터 (예를 들어, 구역 로터) 내로 3개, 4개, 5개, 6개 또는 이를 초과하는 개수의 수크로스 용액을 로딩하는 것을 포함하고, 각각의 수크로스 용액은 (a) 상이한 수크로스 농도를 갖고, (b) 약 45% (w/w) 내지 약 65% (w/w) 수크로스 범위, 임의적으로는 약 50% (w/w) 내지 약 60% (w/w) 범위, 또는 임의적으로는 약 55% (w/w) 내지 약 60% (w/w) 범위의 농도로 수크로스를 포함한다. 수크로스 농도의 완전한 범위는 당 용액의 범위와 관련하여 상기 열거된 바와 같다. 수크로스 용액 대 AAV 분획 및/또는 다른 당 용액의 비는 상기 열거된 바와 같다.
예시적 측면에서, 최저 수크로스 농도의 수크로스 용액의 부피 및 최고 수크로스 농도의 수크로스 용액의 부피는 각각 로터 부피의 약 20% 내지 약 30% 및 약 20% 내지 약 30%이다. 특정 실시양태에서, 최저 수크로스 농도의 수크로스 용액의 부피, 중간 수크로스 농도의 수크로스 용액의 부피 및 최고 수크로스 농도의 수크로스 용액의 부피는 각각 로터 부피의 약 25%이다. 예시적 측면에서, 최저 수크로스 농도의 수크로스 용액, 중간 수크로스 농도의 수크로스 용액 및 최고 수크로스 농도의 수크로스 용액의 부피는 각각 로터 부피의 약 20% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 15%, 및 약 10% 내지 약 15%이다. 특정 실시양태에서, 최저 수크로스 농도의 수크로스 용액, 중간 수크로스 농도의 수크로스 용액 및 최고 수크로스 농도의 수크로스 용액의 부피는 각각 로터 부피의 약 25%, 약 12.5%, 및 약 12.5%이다. 특정 실시양태에서, 초원심분리 코어 부피 또는 로터 부피는 약 200 mL 내지 약 10,000 mL의 범위 내, 약 700 mL 내지 약 8500 mL의 범위 내, 또는 약 700 mL 내지 약 7,700 mL의 범위 내이다.
광범위한 초원심분리 코어가 이용가능하고, 관련 기술분야의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 이용가능한 최소 초원심분리 코어는 200 mL 히타치(Hitachi) CC40S인 한편, 최대 코어는 8,000 mL 히타치 CC40이다. CC40CT3 코어 E 모든 기타 연속 유동 초원심분리 및 기타 공급원으로부터의 코어를 사용할 수 있다.
예시적 측면에서, 방법은 로터 (예를 들어, 구역 로터)를 포함하는 초원심분리기를 배치 모드로 작동시키고, 그 결과 당 구배가 형성되는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기는 10,000 rpm 미만의 제1 회전 속도에서 구동된다. 특정 실시양태에서, 제1 회전 속도는 약 3,000 rpm 내지 약 6,000 rpm (예를 들어, 4,000 rpm 또는 5,000 rpm)이고, 제1 회전 속도는 약 15 내지 약 25분 이내에 달성된다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기는 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서 제1 회전 속도에서 구동된다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기는 궁극적으로 더 높은 회전 속도를 달성하기 위한 목적으로 제1 회전 속도에서 구동된다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기는 제2 회전 속도로 가속되고, 이는 제1 회전 속도의 적어도 2× 또는 적어도 3× 더 크다. 특정 실시양태에서, 제2 회전 속도는 초원심분리기를 약 5 내지 약 60분 동안 가속시킬 때 달성된다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기는 약 30,000 rpm 이상의 제2 회전 속도에서 구동된다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기는 약 30,000 rpm 이상, 약 50,000 rpm 이하의 제2 회전 속도에서 구동된다. 특정 실시양태에서, 제2 회전 속도는 약 30,000 rpm 내지 약 40,000 rpm, 예를 들어, 약 35,000 rpm이다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기는 적어도 또는 약 3시간, 적어도 또는 약 4시간, 적어도 또는 약 5시간, 또는 적어도 또는 약 6시간, 적어도 또는 약 10시간, 적어도 또는 약 12시간, 적어도 또는 약 14시간, 적어도 또는 약 16시간, 적어도 또는 약 18시간, 적어도 또는 약 20시간, 또는 적어도 또는 약 22시간 동안 제2 회전 속도에서 구동된다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기는 적어도 또는 약 4시간 동안 제2 회전 속도에서 구동된다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기는 약 16 내지 약 20시간 동안 제2 회전 속도에서 구동된다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기는 적어도 또는 약 16시간 동안 제2 회전 속도에서 구동된다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기는 약 15℃ 내지 약 30℃의 온도, 예를 들어, 적어도 약 18℃, 약 20℃ 내지 약 25℃ (예를 들어, 약 22℃)에서 제2 회전 속도에서 구동된다. 특정 실시양태에서, 후속적으로 초원심분리기는, 예를 들어, 제1 회전 속도, 예를 들어, 약 4,000 rpm으로, 임의적으로는 약 5 내지 약 90분의 과정에 걸쳐, 회전 속도를 감속시키도록 작동된다. 특정 실시양태에서, 감속은 약 18℃ 미만, 약 2℃ 내지 약 10℃, 또는 약 8℃ 미만의 온도에서 발생한다. 특정 실시양태에서, 초원심분리기가 정지되기 전까지 초원심분리기는 약 8℃ 미만의 온도에서 적어도 30분 동안 구동된다.
예시적 측면에서, 방법은 당 구배의 분획을 수득하여 AAV 분획을 수득하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 수득된 AAV 분획은 완전 캡시드가 60%를 초과한다. 특정 실시양태에서, 수득된 AAV 분획은 70-80%의 완전 캡시드가 있다. 특정 실시양태에서, 당 구배의 하나 이상의 분획이 수득되고, 특정 실시양태에서, 이러한 분획은 더 높은 밀도 분획을 함유하는 구배로부터 수득된다. 특정 실시양태에서, 도 8에 나타난 바와 같은 분획 7-11과 등가인 분획이 수득된다. 특정 실시양태에서, 실시예9에 기술된 바와 같은 분획 10-14와 등가인 분획이 수득된다. 특정 실시양태에서, 실시예 16에 기술된 바와 같은 분획 1-8과 등가인 분획이 수득된다. 특정 실시양태에서, 빈 캡시드로부터 완전 캡시드를 함유하는 임의의 분획이 밀도 구배 내의 로터로부터 용리될 때 이들의 밀도 차이에 의해 분리된다. 작은 부피에서의 분획화 후의 분석적 테스트에 의해 [예를 들어, 실시예 9에 기술된 바와 같이], 또는 UV 신호의 인라인 측정으로부터의 UV 신호에 따른 분획화 (예를 들어 UV 254 nm/UV 280 nm 신호 및 이들의 비의 인라인 제어)에 의해 분리 제어가 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, AAV 분획은 초원심분리 단계에서 더 높은 수크로스 밀도의 구역으로부터 수득된다. 특정 실시양태에서, 수득된 AAV (예를 들어, AAV8) 분획은 사용된 UC 코어의 부피에 독립적으로 [254 nm에서의 UV 신호]/[280 nm에서의 UV 신호]의 비에 의해 대부분이 완전 캡시드인 것으로 확증된다 (예를 들어, >60% 완전 캡시드). 이러한 비 (OD 254 nm/OD 280 nm)가 >1이면, 분획은 완전 캡시드이다.
예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법으로 AAV 캡시드의 적어도 50%가 완전 AAV 캡시드인 AAV 제품이 산출된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법으로 AAV 캡시드의 적어도 55%가 완전 AAV 캡시드인 AAV 제품이 산출된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법으로 AAV 캡시드의 적어도 60%가 완전 AAV 캡시드인 AAV 제품이 산출된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법으로 AAV 캡시드의 적어도 70%가 완전 AAV 캡시드인 AAV 제품이 산출된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법으로 AAV 캡시드의 적어도 80%가 완전 AAV 캡시드인 AAV 제품이 산출된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법으로 AAV 캡시드의 적어도 90%가 완전 AAV 캡시드인 AAV 제품이 산출된다. "적어도 50%"는 50%가 최소 백분율인 범위를 지칭한다는 것이 이해될 것이다. 다양한 실시양태에서, 이같은 범위의 최대 백분율은 100%이지만, 최대 백분율이, 예를 들어, 99%, 98%, 95%, 80%, 85% 등인 하위 범위 또한 본원에서 구상된다. 완전 캡시드 대 빈 캡시드의 양을 측정하기 위한 적절한 방법이 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 완전 캡시드와 빈 캡시드의 구별을 허용하는 검출 설정을 사용하는 음성 염색 트랜스일렉트론 현미경 및 분석적 음이온 교환기 크로마토그래피를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Lock et al., Human Gene Ther Part B 23:56-64 (2012)]; 및 [Qu et al., J Virol Methods 140: 183-192 (2007)]을 참조한다.
예시적 측면에서, 당 (예를 들어, 수크로스) 용액들은 농도 면에서 약 5% (w/w) 내지 약 15% (w/w)만큼 상이하다. 특정 실시양태에서, 당 용액들은 수크로스-등가 농도 면에서 약 5% (w/w) 내지 약 10% (w/w), 약 4% (w/w) 내지 약 8%(w/w), 또는 약 2%(w/w) 내지 약 3% (w/w)만큼 상이하다. 특정 실시양태에서, 당 용액들은 수크로스를 포함하고, 수크로스 농도 면에서 약 5% (w/w) 내지 약 10% (w/w), 약 4% (w/w) 내지 약 8%(w/w), 또는 약 2%(w/w) 내지 약 3% (w/w)만큼 상이하다.
예시적 측면에서, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 입자를 정제하는 방법 및/또는 완전 바이러스 입자를 빈 캡시드로부터 분리하는 방법은 rAAV 입자를 포함하는 분획을 각각의 수크로스 용액이 약 50% (w/w) 내지 약 65% (w/w) 범위의 상이한 수크로스 농도를 포함하는 2개의 수크로스 용액과 함께 10,000 rpm 미만의 제1 회전 속도 (예를 들어, 4,000 rpm)에서 약 15분 내지 약 45분 또는 약 17분 내지 약 25분 동안, 그리고 약 30,000 내지 약 40,000 rpm 범위 내의 제2 회전 속도 (예를 들어, 35,000 rpm)에서 적어도 4시간 또는 약 16 내지 약 20시간 동안 초원심분리하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나의 용액은 약 55% (w/w) 수크로스와 동일한 농도로 수크로스를 포함하고, 하나의 용액은 약 60% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함한다. 예시적 측면에서, 초원심분리 단계는 본질적으로 실시예 6에 기술된 바와 같이 수행된다.
예시적 측면에서, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 입자를 정제하는 방법 및/또는 빈 캡시드로부터 완전 바이러스 입자를 분리하는 방법은 rAAV 입자를 포함하는 분획을 각각의 수크로스 용액이 약 45% (w/w) 내지 약 65% (w/w) 범위의 상이한 수크로스 농도를 포함하는 3개의 수크로스 용액과 함께 10,000 rpm 미만의 제1 회전 속도 (예를 들어, 4,000 rpm)에서 약 15분 내지 약 45분 또는 약 17분 내지 약 25분 동안, 그리고 약 30,000 내지 약 40,000 rpm 범위 내의 제2 회전 속도 (예를 들어, 35,000 rpm)에서 적어도 4시간 또는 약 16 내지 약 20시간 동안 초원심분리하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나의 용액은 약 50% (w/w) 수크로스와 동일한 농도로 수크로스를 포함하고, 하나의 용액은 약 55% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함하며, 하나의 용액은 약 60% (w/w) 수크로스의 농도로 수크로스를 포함한다. 예시적 측면에서, 초원심분리 단계는 본질적으로 실시예 7 또는 9에 기술된 바와 같이 수행된다.
rAAV 입자 공급원
본 개시내용의 방법과 관련하여, AAV는 임의의 AAV 혈청형의 것일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 의해 정제된 AAV는 AAV1 혈청형, AAV2 혈청형, AAV3 혈청형, AAV4 혈청형, AAV5 혈청형, AAV6 혈청형, AAV7 혈청형, AAV8 혈청형, AAV9 혈청형, 또는 AAV10 혈청형의 것이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 의해 정제된 AAV 입자는 AAV8 혈청형의 것이다. 본 발명의 방법과 관련하여, 로터 내로 로딩되는 AAV 분획은 농축된 AAV 분획의 예시적 측면이다. 특정 실시양태에서, 로터 내로 로딩되는 AAV 분획은 mL 당 적어도 1×101개0, 1×1011개 또는 1×1012개의 AAV 캡시드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 로터 내로 로딩되는 AAV 분획은 mL 당 적어도 1×1012개의 AAV 캡시드를 포함하고, 여기서 AAV 캡시드는 빈 AAV 캡시드 및 완전 AAV 캡시드를 포함한다.
특정 실시양태에서, AAV 분획은 형질감염된 숙주 세포에 의해 생산된 AAV 분획을 나타낸다. 특정 실시양태에서, AAV 분획은 삼중 플라스미드 시스템으로 형질감염된 숙주 세포를 포함하는 세포 배양물로부터 수확된 상청액을 나타내고, 여기서 시스템의 한 플라스미드는 관심 유전자 또는 cDNA를 포함하고, 한 플라스미드는 캡시드 단백질 VP1, 캡시드 단백질 VP2 및/또는 캡시드 단백질 VP3을 코딩한다. 특정 실시양태에서, VP1, VP2, 및/또는 VP3은 AAV8 VP1, AAV8 VP2, 및/또는 AAV8 VP3이다. rAAV 생산을 목적으로 하는 삼중 플라스미드 형질감염이 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Qu et al., 2015, 상기 문헌] 및 [Mizukami et al., "A Protocol for AAV vector production and purification." PhD dissertation, Division of Genetic Therapeutics, Center for Molecular Medicine, 1998]; 및 [Kotin et al., Hum Mol Genet 20(R1): R2-R6 (2011)]을 참조한다. 특정 실시양태에서, 형질감염은 무기 화합물, 예를 들어, 인산칼슘, 또는 유기 화합물, 폴리에틸렌이민 (PEI), 또는 비-화학적 수단, 예를 들어, 전기천공을 사용하여 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, 숙주 세포는 부착성 세포이다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 현탁 세포이다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 HEK293 세포 또는 Sf9 세포 (예를 들어, 배큘로바이러스로 감염된 Sf9 세포)이다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 혈청 및 단백질이 없는 배양 배지를 포함한다. 특정 실시양태에서, 배지는 화학적으로 규정되고, 동물 유래 성분, 예를 들어, 가수분해물이 없다.
특정 실시양태에서, rAAV 입자를 포함하는 분획은 삼중 플라스미드 시스템으로 형질감염된 HEK293 세포를 포함하는 분획을 나타낸다. 특정 실시양태에서, rAAV 입자를 포함하는 분획은 HEK293 세포의 형질감염으로부터 약 3 내지 약 5일 후에 또는 세포 배양물의 세포 밀도가 약 5×106개의 세포/mL 이상이고 세포 생존율이 약 50% 이상일 때 수확된 상청액의 분획을 나타낸다. 특정 실시양태에서, rAAV 입자를 포함하는 분획은 실시예 1에 기술된 바와 같은 HEK293 세포를 포함하는 분획을 나타낸다.
특정 실시양태에서, AAV는 삼중 플라스미드 형질감염에 이어지는 1 내지 5일 이후의 수확에 의해 제조된다. 특정 실시양태에서, AAV는 세포 파괴로부터 제조된다.
특정 실시양태에서, AAV는 하기에 의해 제조된다: HEK293 세포는 부착성이고, 화학적으로 규정될 수 있고 동물 유래 성분, 예를 들어, 혈청 및 단백질이 없을 수 있는 시판되는 배양 배지에서 성장된다. 세포를 약 3×106 내지 약 12×106개의 세포/ml, 예를 들어, 약 6×106 내지 약 10×106개의 세포/ml의 세포 밀도로 배양한다. 그 후, 세포 밀도가 약 3-5×106개의 세포/ml이도록 세포를 약 1:2 비로 분할한다. 분할 후, 세포를 (1) AAV 생산에 필수적인 하나 이상의 헬퍼 바이러스 기능을 제공할 수 있는 헬퍼 플라스미드, (2) 바이러스의 캡시드 생성, 복제 및 패키징에서 수반되는 하나 이상의 유전자를 코딩하는 플라스미드, 및 (3) 생성된 rAAV 입자 내로 패키징될 관심 유전자 (GOI)를 포함하는 플라스미드를 포함하는 3개의 플라스미드로 형질감염시킬 수 있다. 예를 들어, GOI는 벡터 DNA의 전장이 2.6 kB인, 단일 가닥의 자가-상보적 형태인 인간 응고 인자 IX 파두아를 포함하는 벡터 DNA일 수 있다. 또 다른 예로서, GOI는 벡터 DNA의 전장이 4.8 kB인, 이중 가닥의 자가-상보적 형태인 인간 응고 인자 IX 파두아를 포함하는 벡터 DNA일 수 있다. 또 다른 예로서, GOI는 벡터 DNA의 전장이 4.8 kB인, 단일 가닥의 자가-상보적 형태인 B-도메인 결실 인간 응고 인자 VIII를 포함하는 벡터 DNA일 수 있다. 다른 GOI가 사용될 수 있다. 양이온성 중합체를 사용하는 것에 의해서와 같이, 형질감염은 일시적인 방식으로 수행될 수 있다. 용리 전에, HEK293 세포주를 적어도 약 3일, 예를 들어, 3-5일 동안 배양한 후에 수확할 수 있다.
추가 단계
본 개시내용의 방법은 본원에 개시된 단계들의 임의의 조합을 포함하고, 임의적으로 하나 이상의 추가적인 단계와 조합될 수 있다. 따라서, 예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 본원에 기술된 바와 같은 삼중 플라스미드 시스템으로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계를 추가로 포함한다. 예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 삼중 플라스미드 시스템으로 형질감염된 숙주 세포, 예를 들어, HEK293 세포 또는 Sf9 (예를 들어, 배큘로바이러스 감염 Sf9 세포)를 포함하는 세포 배양물로부터 상청액을 수확하는 것을 포함한다. 예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 HEK293 세포의 형질감염으로부터 약 3 내지 약 5일 후에 또는 세포 배양물의 세포 밀도가 약 5×106개의 세포/mL 이상이고 세포 생존율이 50% 이상일 때 상청액을 수확하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV는 세포 파괴로부터 제조된다. 예시적 측면에서, 형질감염 및 수확 단계는 본원에 기술된 초원심분리 단계 이전에 발생한다. 본 개시내용의 방법은 AAV의 순도를 추가로 증가시킬 수 있고, 후속 단계를 위해 다른 원치 않는 성분을 제거하고/하거나 분획을 농축하고/하거나 분획을 컨디셔닝할 수 있는 또 다른 추가적인 단계를 포함할 수 있다. 추가적인 단계는 상기 기술된 초원심분리 단계 전 또는 후에 발생할 수 있다.
예시적 측면에서, 방법은 심층 여과 단계를 포함한다. 예시적 측면에서, 방법은 형질감염된 HEK293 세포 배양 상청액의 분획을 셀룰로스 및 펄라이트를 포함하고 최소 투과율이 약 500 L/㎡인 필터를 사용하는 심층 여과에 적용하는 것을 포함한다. 예시적 측면에서, 방법은 최소 세공 크기가 약 0.2 ㎛인 필터의 사용을 추가로 포함한다. 예시적 측면에서, 심층 여과에 최소 세공 크기가 약 0.2 ㎛인 필터를 통한 여과가 이어진다. 예시적 측면에서, 심층 필터 및 최소 세공 크기가 약 0.2 ㎛인 필터 중 하나 또는 양쪽 모두를 세정하고, 세정물을 수집한다. 예시적 측면에서, 세정물을 함께 풀링하고, 심층 여과 및 최소 세공 크기가 약 0.2 ㎛인 필터로의 여과 시에 수득된 여과물과 조합한다. 실시예 2는 심층 여과 및 최소 세공 크기가 약 0.2 ㎛인 필터를 통한 여과의 예시적인 방법을 제공한다. 예시적 측면에서, 심층 여과 단계 및 기타 여과 단계는 본원에 기술된 초원심분리 단계 전에 발생한다.
특정 실시양태에서, 수확은 하기에 의해 수행된다: 세포 배양물의 상청액을 이러한 시점에 심층 여과를 통해, 예를 들어, 약 150 내지 약 250 L의 AAV-함유 세포 현탁액을 심층 필터 요소 및 폴리에테르술폰 요소를 통해 여과함으로써 수확한다. 유속은 약 40 kg/시 내지 약 280 kg/시, 또는 약 60 kg/시 내지 240 kg/시일 수 있다. 총 압력은 1.7 바 미만이다. 2개의 필터에 약 10 내지 약 30 L의 트리스 완충 염수 (TBS) 완충제를 플러싱한다. 그 후, 여과된 발효 브로스 또는 수확물을 수집한다. 심층 여과 절차는 AAV 입자의 적어도 60% 또는 65%를 유지하면서 적어도 단백질의 70% 및 HEK293 세포 DNA의 60%를 제거할 수 있다.
특정 실시양태에서, 하기와 같이 수확물을 농축 및 컨디셔닝하기 위해 AAV 분획을 함유하는 수확물을 한외/투석여과 (UF/DF) 및 TFF에 적용한다: 수확물을 TFF를 사용하여 약 10 L 내지 약 15 L의 표적 부피로 약 10배 내지 약 20배 농축한다. 그 후, 농축된 수확물을 2개의 투석여과 단계에 적용하여, 농축된 수확물을 약 8.3 내지 약 8.7의 pH 및 약 13 mS/cm 내지 약 17 mS/cm의 전도도로 컨디셔닝한다. 각각의 투석여과 단계는 투석여과 완충제, 예를 들어, 50 mM 트리스 및 500 mM NaCl을 포함하고, pH가 8.5±0.2이며, 25℃인 제1 완충제, 및 50 mM 트리스 및 125 mM NaCl을 포함하고, pH가 8.5±0.2이며 25℃인 제2 완충제와의 5배 부피 교환을 통해 수행될 수 있다. 그 후, TFF에 착수하여, 보전물을 약 8 L 내지 약 12 L의 최종 표적 부피로 농축한다. 그 후, 농축물을 0.2 ㎛ 필터 요소를 통해 여과한다. 필터 요소에 약 1.5 내지 약 2.5의 제2 투석여과 완충제를 플러싱시킴으로써 AAV 수율이 증가될 수 있다.
예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 포함한다. 예시적 측면에서, 방법은 음성 크로마토그래피 단계를 포함하고, 이에 의해 원치 않는 성분은 크로마토그래피 수지에 결합하고 원하는 AAV는 크로마토그래피 수지에 결합하지 않는다. 예시적 측면에서, 방법은 음성 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 단계, 또는 "비-결합 모드"의 AEX 크로마토그래피 단계를 포함한다. 실시예 4에서 이같은 단계가 기술된다. 따라서, 예시적 실시양태에서, AAV 입자를 정제하는 방법은 AAV가 AEX 크로마토그래피 칼럼 또는 막을 관류하게 허용하는 조건 하에 분획을 AEX 크로마토그래피 칼럼 또는 또는 막에 적용하고, AAV 입자를 수확하는 것에 의해, AAV 입자를 포함하는 분획 상에서 음성 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함한다. 예시적 측면에서, 분획은 약 100 mM 내지 약 150 mM 염, 예를 들어, NaCl을 포함하는 로딩 완충제와 함께 AEX 크로마토그래피 칼럼 또는 막에 적용되고, 임의적으로, 여기서 로딩 완충제의 pH는 약 8 내지 약 9이다. 예시적 측면에서, 로딩 완충제는 약 115 mM 내지 약 130 mM 염, 예를 들어, NaCl을 포함하고, 임의적으로, 로딩 완충제는 약 120 mM 내지 약 125 mM 염, 예를 들어, NaCl을 포함한다. 예시적 측면에서, 음성 AEX 단계는 본원에 기술된 초원심분리 단계 이전에 발생한다.
예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 한외/투석여과 시스템을 사용하여 AAV 분획을 농축하는 것을 포함한다. 예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 1회 이상의 접선 유동 여과 (TFF) 단계를 포함한다. 예시적 측면에서, AAV 분획에 한외/투석여과가 진행된다. 예시적 측면에서, AAV 분획은 음성 AEX 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 단계 전에, 음성 AEX 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 단계 후에, 또는 음성 AEX 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 단계 전 및 후에 한외/투석여과 시스템으로 농축된다. 실시예 3 및 5에서 이같은 TFF 단계가 기술된다. 예시적 측면에서, TFF 단계는 본원에 기술된 초원심분리 단계 전에 발생한다.
특정 실시양태에서, 하기와 같이 음성 AEX 크로마토그래피 후에 추가적인 TFF 단계가 수행된다: AEX 크로마토그래피로부터 수득된 AAV-함유 관류 분획을 농축하고, 완충제, 예를 들어, 약 8.3 내지 약 8.7의 pH에서 약 500 mM NaCl, 약 50 mM 트리스HCl을 포함하는 것에 대해 투석여과하여, 초원심분리용으로 생성물을 컨디셔닝한다. 그 후, TFF 단계를 수행한다.
특정 실시양태에서, 빈 AAV 입자 및 완전 AAV 입자를 하기와 같이 "2개의 수크로스 프로토콜" 초원심분리에 의해 서로 분리한다. 트리스HCl / NaCl 완충제 내의 AAV를 포함하는 농축물에 55% (w/w) 수크로스 농도로 수크로스를 포함하는 제1 수크로스 용액, 그 후 60% (w/w) 수크로스 농도로 수크로스를 포함하는 제2 수크로스 용액이 이어진다. 특정 실시양태에서, AAV 용액은 약 50 mM 트리스HCl, 및 약 500 mM NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 수크로스 용액은 약 50 mM 트리스HCl 및 약 136 mM NaCl을 포함한다. 초원심분리는 초기에는 2-10 ℃의 온도에서 약 4,000 rpm에서 수행되고, 속도가 약 33,000 rpm 내지 약 37,000 rpm으로 증가되고, 온도가 약 20 ℃ 내지 약 25 ℃로 증가되며, 그 후 약 4시간, 약 14시간 내지 약 20시간, 또는 약 16시간 내지 약 20시간 동안 유지된다. 그 후, 분획을 수집한다.
특정 실시양태에서, 빈 AAV 입자 및 완전 AAV 입자를 하기와 같이 "2개의 당 프로토콜" 초원심분리에 의해 서로 분리한다. 트리스HCl / NaCl 완충제 내의 AAV 및 45-50% (w/w) 에틸렌 글리콜을 함유하는 완충된 에틸렌 글리콜 용액을 포함하는 농축물에 55% (w/w) 수크로스 농도로 수크로스를 포함하는 제1 수크로스 용액, 그 후 60% (w/w) 수크로스 농도로 수크로스를 포함하는 제2 수크로스 용액이 이어진다. 특정 실시양태에서, AAV 용액은 약 55% 에틸렌 글리콜, 약 50 mM 트리스HCl, 및 약 750 mM NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 수크로스 용액은 약 50 mM 트리스HCl 및 약 136 mM NaCl을 포함한다. 초원심분리는 초기에는 2-10 ℃의 온도에서 약 4,000 rpm에서 수행되고, 속도가 약 33,000 rpm 내지 약 37,000 rpm으로 증가되고, 온도가 약 20 ℃ 내지 약 25 ℃로 증가되며, 그 후 약 4시간, 약 14시간 내지 약 20시간, 또는 약 16시간 내지 약 20시간 동안 유지된다. 그 후, 분획을 수집한다.
특정 실시양태에서, 빈 AAV 입자 및 완전 AAV 입자를 하기와 같이 "3개의 당 프로토콜" 초원심분리에 의해 서로 분리한다. 트리스HCl / NaCl 완충제 내의 AAV를 포함하는 농축물에 50% (w/w) 수크로스 농도로 수크로스를 포함하는 제1 수크로스 용액, 55% (w/w) 수크로스 농도로 수크로스를 포함하는 제2 수크로스 용액 및 60% (w/w) 수크로스 농도로 수크로스를 포함하는 제3 수크로스 용액이 이어진다. 제1 수크로스 용액이 로터의 바닥 내로 로딩되고, 제2 수크로스 용액 및 제3 수크로스 용액이 이어진다. 특정 실시양태에서, AAV 용액은 약 50 mM 트리스HCl, 및 약 500 mM NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 수크로스 용액은 약 50 mM 트리스HCl 및 약 136 mM NaCl을 포함한다. 초원심분리는 초기에는 2-10 ℃의 온도에서 약 4,000 rpm에서 수행되고, 속도가 약 33,000 rpm 내지 약 37,000 rpm으로 증가되고, 온도가 약 20 ℃ 내지 약 25 ℃로 증가되며, 그 후 약 3시간 내지 약 6시간, 약 4시간 내지, 약 14시간 내지 약 20시간, 또는 약 16시간 내지 약 20시간 동안 유지된다. 그 후, 분획을 수집한다.
특정 실시양태에서, 빈 AAV 입자 및 완전 AAV 입자를 하기와 같이 "3개의 수크로스 프로토콜" 초원심분리에 의해 서로 분리한다. 트리스HCl / NaCl 완충제 내의 AAV 및 45-50% (w/w) 에틸렌 글리콜을 함유하는 완충된 에틸렌 글리콜 용액을 포함하는 농축물에 50% (w/w) 수크로스 농도로 수크로스를 포함하는 제1 수크로스 용액, 55% (w/w) 수크로스 농도로 수크로스를 포함하는 제2 수크로스 용액 및 60% (w/w) 수크로스 농도로 수크로스를 포함하는 제3 수크로스 용액이 이어진다. 제1 수크로스 용액이 로터의 바닥 내로 로딩되고, 제2 수크로스 용액 및 제3 수크로스 용액이 이어진다. 특정 실시양태에서, AAV 용액은 약 55% 에틸렌 글리콜, 약 50 mM 트리스HCl, 및 약 750 mM NaCl을 포함한다. 특정 실시양태에서, 수크로스 용액은 약 50 mM 트리스HCl 및 약 136 mM NaCl을 포함한다. 초원심분리는 초기에는 2-10 ℃의 온도에서 약 4,000 rpm에서 수행되고, 속도가 약 33,000 rpm 내지 약 37,000 rpm으로 증가되고, 온도가 약 20 ℃ 내지 약 25 ℃로 증가되며, 그 후 약 3시간 내지 약 6시간, 약 4시간 내지, 약 14시간 내지 약 20시간, 또는 약 16시간 내지 약 20시간 동안 유지된다. 그 후, 분획을 수집한다.
예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 AAV 입자를 포함하는 분획을 용매 세제로 처리하여 지질 외피 바이러스를 불활성화시키는 것을 포함한다. 실시예 8에서 지질 외피 바이러스 불활성화의 예시적인 방법이 기술된다. 예시적 측면에서, 용매 세제 처리 단계는 본원에 기술된 초원심분리 단계 후에 발생한다.
예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 rAAV 입자를 포함하는 분획을 여과하여 분획 내의 rAAV 입자보다 더 큰 크기의 바이러스를 제거하는 것을 포함한다. 예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 AAV 입자를 포함하는 분획을 여과하여 크기가 약 35 nm 이상인 바이러스를 제거하는 것을 포함한다. 예시적 측면에서, 필터의 세공 크기는 나노미터 범위이고, 예시적 측면에서, 방법은 나노여과를 포함한다. 예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 물 유동 방법에 의해 결정된 바와 같은 35 나노미터 ±2 나노미터 범위의 세공 크기의 나노필터를 사용하는 것을 포함한다. 이같은 세공 크기를 갖는 예시적인 나노필터는 천연 소수성 구리암모늄 재생 셀룰로스로 구축된 미세세공성 중공 섬유의 다발을 함유한다. 필터 유형의 분류는 막 구조, 물질 및 판매자에 의존적이다. 예시적 측면에서, 나노필터는 필터에 핀홀 또는 대형 결손이 없다는 것을 확증하기 위해 통합성 누출 테스트로 테스트되고, 제형 완충제로 예비-세정된다.
예시적인 나노여과가 본원에서 실시예 10으로서 기술된다.
예시적 측면에서, rAAV 입자를 포함하는 분획, 예를 들어, 음이온 교환 용리물은 바이러스 입자의 농도를 조정하기 위해 용리 완충제 (PBS + 600 mM NaCl)로 예비-희석된다.
예시적 측면에서, 여과 단계 동안, 필터에 걸친 압력 차이가 유지된다. 예시적 측면에서, 압력 (필터에 걸친 압력 강하)은 약 0.02 MPa 내지 약 0.1 MPa이다. 예시적 측면에서, 압력 (예를 들어, 필터에 걸친 압력 강하)은 약 0.02 MPa 내지 약 0.08 MPa이다. 필터가 데드-엔드 모드로 러닝되는 경우, 적용되는 샘플의 공급 압력에 의해 (즉, 공급 압력에 영향을 미치는 특정 유동으로의 펌프 조정에 의해) 압력 차이가 초래될 수 있다. 예시적 측면에서, 여과는 나노필터를 통해 데드-엔드 모드로 0.1 MPa를 초과하지 않는 일정한 압력 하에 수행된다. 예시적 측면에서, 필터는 접선 유동 방법으로 러닝된다. 예시적 측면에서, 회수된 바이러스 입자의 수율이 나노필터를 완충제 (예를 들어 제형 완충제)로 사후-세정하는 것에 의해 증가된다. 예시적 측면에서, 나노필터 세공 크기 분포가 변화되지 않는다는 것과 나노필터가 여과 동안 이의 통합성을 유지한다는 것을 결정하기 위해 누출 테스트 및/또는 금 입자 테스트로 나노필터의 사후-통합성 테스트가 수행된다. 예시적 측면에서, 샘플 수율을 증가시키기 위해 50 L를 초과하는 용액이 ㎡ 필터 면적 당 적용된다.
예시적 측면에서, rAAV 입자보다 큰 바이러스를 제거하기 위한 여과 단계는 본 개시내용의 공정 동안 1회 발생한다. 예시적 측면에서, 여과 단계는 공정 동안 2회 발생한다. 예시적 측면에서, rAAV 입자보다 큰 바이러스를 제거하기 위한 여과 단계는 본원에 기술된 초원심분리 단계 후에 발생한다. 예시적 측면에서, rAAV 입자보다 큰 바이러스를 제거하기 위한 여과 단계는 연마 단계 후에 발생한다.
예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은, 임의적으로는 촉수성 겔을 포함하는 칼럼으로, AEX 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 연마 단계를 포함한다. 실시예 8에서 이같은 연마 단계를 포함하는 예시적인 방법이 기술된다. 예시적 측면에서, 연마 단계는 본원에 기술된 초원심분리 단계 후에 발생한다.
예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 하나 이상의 품질 제어 단계, 예를 들어, 방법의 하나 이상의 단계 후에 (예를 들어, 각각의 단계 후에) 수득된 AAV 분획의 효력, DNA/AAV 비, 또는 특이적 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 qPCR, 예를 들어, ITR qPCR을 사용함으로써 분획 내의 AAV의 존재에 대해 검정하는 것을 포함한다. ITR qPCR은 분획 내의 AAV 역전 말단 반복부 (ITR) 핵산의 양을 측정하기 위한 정량적 PCR 기반 검정법이다. 다른 AAV-특이적, 또는 AAV8-특이적 서열이 qPCR에 의해 검정될 수 있다.
예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 ELISA를 사용함으로써 분획 내의 AAV의 존재에 대해 검정하는 것을 포함한다. 예시적 측면에서, ELISA는 샌드위치 ELISA이다. 예시적 측면에서, 샌드위치 ELISA는 AAV 에피토프에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 예시적 측면에서, AAV 에피토프는 어셈블리된 AAV 캡시드 상에 존재하는 입체형상 에피토프이다. DNA/AAV 비를 테스트하는 적절한 방법이 본원에서 실시예 12로 기술된다. 본원에서 논의된 바와 같이, ELISA는 AAV 분획의 효력을 결정하는 방식으로서 qPCR을 대체할 수 있다. 예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 AAV-특이적 ELISA를 통해 AAV 분획을 테스트하는 것을 포함하고, 방법은 정량적 PCR을 통해 효력을 측정하는 방법을 포함하지 않는다. 예시적 측면에서, AAV-특이적 ELISA는 AAV 분획의 효력에 대한 대표적인 판독을 제공하는데 충분한데, 이는 AAV 분획 내의 캡시드의 대다수가 완전 캡시드이기 때문이다.
예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 본 개시내용의 단계 중 하나 이상 후의 AAV에 대해 특이적인 ELISA를 포함한다. 예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 초원심분리 후에 수득된 AAV 분획을 AAV-특이적 ELISA를 통해 테스트하여 이러한 분획 내의 AAV의 DNA/AAV 비를 결정하는 것을 포함한다. 예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 심층 여과 후에 수득된 AAV 분획을 AAV-특이적 ELISA를 통해 테스트하여 이러한 분획 내의 AAV의 DNA/AAV 비를 결정하는 것을 포함한다. 예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 한외 / 투석여과 시스템을 사용하여 AAV 분획을 농축한 후에 수득된 AAV 분획을 AAV-특이적 ELISA를 통해 테스트하여 이러한 분획 내의 AAV의 DNA/AAV 비를 결정하는 것을 포함한다. 예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 접선 유동 여과 (TFF) 단계 후에 수득된 AAV 분획을 AAV-특이적 ELISA를 통해 테스트하여 이러한 분획 내의 AAV의 DNA/AAV 비를 결정하는 것을 포함한다. 예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 음성 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 후에 수득된 AAV 분획을 AAV-특이적 ELISA를 통해 테스트하여 이러한 분획 내의 AAV의 DNA/AAV 비를 결정하는 것을 포함한다. 예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 연마 단계 후에 수득된 AAV 분획을 AAV-특이적 ELISA를 통해 테스트하여 이러한 분획 내의 AAV의 DNA/AAV 비를 결정하는 것을 포함한다.
예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 도 1에 도해된 단계 중 하나 또는 이의 조합을 포함한다. 예시적 측면에서, 본 개시내용의 방법은 도 1에 도해된 모든 단계를 포함한다.
본 개시내용의 방법에 의해 생산된 AAV 제품이 본원에서 추가로 제공된다. 예시적 측면에서, AAV 제품은 약 1000 L의 출발 물질 (예를 들어, 세포 배양물)로부터 생산된 적어도 약 1012개의 바이러스 입자 (vp) 또는 약 1000 L의 출발 물질 (예를 들어, 세포 배양물)로부터 생산된 적어도 약 1013개의 바이러스 입자 (vp)를 포함하고, 여기서 AAV 제품 내에 존재하는 AAV 캡시드의 적어도 50% 또는 적어도 55%가 완전 AAV 캡시드이다. 예시적 측면에서, 본 개시내용의 AAV 제품은 고도로 순수하고, 고도로 효력이 있으며, 인간에서의 임상 용도에 적절하다. 예시적 측면에서, AAV 제품은 균질한 집단 및 높은 순도의 AAV 입자를 포함한다. 예시적 측면에서, AAV 제품은 전장 벡터 DNA를 포함한다. 예시적 실시양태에서, AAV 제품은 말단절단되거나 불완전한 벡터 DNA를 함유하는 AAV 입자, 단백질 조성이 불안정하고 올리고머화된 구조를 지니는 AAV 입자, 또는 오염 바이러스, 예를 들어, 비-AAV, 지질-외피 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 원치 않는 오염물이 실질적으로 없다. 예시적 실시양태에서, AAV 제품은 관심 단백질의 코딩 cDNA를 높은 양으로 함유한다. 예시적 측면에서, 본 개시내용의 AAV 제품은 인간에게 투여하는데 적절하다. 예시적 측면에서, AAV 제품은 무균성이고/이거나 우수 의약품 제조 관리 기준 (GMP) 등급이다. 예시적 측면에서, AAV 제품은 유전자 요법 의약 제품에 대한 미국 약전 챕터 1046 또는 유럽 약전에 기재되어 있거나 또는 미국 식품의약청 (USFDA) 또는 유럽 의약품국 (EMA)이 요구하는 바와 같은 요건을 준수한다. 예시적 측면에서, AAV 제품은 거의 가공 또는 취급하지 않으면서 또는 가공 또는 취급하지 않으면서 인간에게 직접적으로 투여하기 위한 즉석 사용 제품이다.
하기 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위해 제공되고, 어떠한 방식으로도 이의 범주를 제한하도록 제공되지 않는다.
실시예
실시예 1
하기 실시예는 HEK293 세포주를 삼중 플라스미드 시스템으로 형질감염시켜 관심 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV 입자를 생산하는 예시적인 방법을 기술한다.
부착성 HEK293 세포를 화학적으로 규정되고 동물-유래 성분, 단백질 및 혈청이 없는 시판되는 배양 배지 내에서 현탁 조건에서 배양시킨다. 세포를 약 6-10×106개의 세포/ml의 세포 밀도로 배양한다. 형질감염 전에, 약 3-5×106개의 세포/ml의 세포 밀도에 도달하도록 약 1:2의 분할을 수행한다.
세포를 3개의 플라스미드로 형질감염시킨다: (1) 생산적 AAV 감염에 필수적인 헬퍼 바이러스 기능을 제공하는 헬퍼 플라스미드, (2) 바이러스의 캡시드 생성, 복제 및 패키징과 관련된 모든 정보를 보유하는 repcap-플라스미드, 및 (3) 생성된 rAAV 입자 내로 패키징되는, 관심 유전자 (GOI)를 함유하는 플라스미드. 예를 들어, GOI는 인자 IX 파두아 벡터 DNA (단일 가닥 (~2.6 kb) 또는 이중 가닥 (~4.8 kb)) 또는 인자 VIII 단일 가닥 벡터 DNA (~4.8kb)일 수 있다.
HEK293 세포의 일시적인 형질감염을 양이온성 중합체인 폴리에틸렌이민 (PEI)을 사용하여 수행한다. 간략하게, PEI 및 플라스미드 DNA의 예비-복합체 형성이 발생하게 하기 위해, 형질감염 믹스를 세포 배양물과 블렌딩하기 전에 PEI 및 플라스미드 DNA를 10분 초과 동안 4 내지 37℃의 온도에서 인큐베이션한다. 예비-형성된 복합체를 형질감염 믹스와 함께 세포 배양물에 첨가하고, 약 3 내지 4시간 동안 30℃ 내지 40℃, 예를 들어, 약 37℃의 온도에서 인큐베이션한다. 0.6 g/L 글루타민을 포함하는, 화학적으로 규정되고, 동물 성분이 없으며, 단백질이 없는 세포 배양 배지인 배지, 예를 들어, 하이클론(Hyclone)™ CDM4HEK293을 예를 들어 포함하는 공지된 정지 배지를 형질감염된 배양물 내로 첨가함으로써 형질감염이 정지된다.
GOI를 보유하는 rAAV 입자가 형질감염 후 3-5일의 기간에 걸쳐 HEK293 세포주 내에 있다. 도 2 및 3에 나타난 바와 같이, HEK293 세포 배양물은 형질감염 후 약 5일인 시점에 >50%의 생존율로 높은 세포 밀도 (예를 들어, 약 5×106개의 세포/mL 초과)를 나타낸다.
실시예 2
하기 실시예는 형질감염된 HEK293 세포 배양물의 상청액을 수확하는 예시적인 방법을 기술한다.
실시예 1에 논의된 바와 같이, rAAV 생산은 형질감염 후 첫 3일 내지 약 5일 이내에 발생한다. 이러한 시간틀의 말기에, HEK293 세포 배양물은 >50%의 생존율로 높은 세포 밀도 (예를 들어, 약 5×106개의 세포/mL 초과)를 나타낸다. 이러한 시점에 세포 배양물의 상청액을 심층 여과를 통해 수확하였다. 약 200 L (±20 L) AAV-함유 세포 현탁액을 셀룰로스-기반 심층 필터 요소 (예를 들어 폴(Pall), STAX K900P; 4 ㎡) 및 0.2 ㎛ 폴리에테르술폰 (PES) 필터 요소 (예를 들어 폴, ECV; 2×5인치, 평행)를 통해 여과함으로써 AAV 입자를 세포 및 세포 잔해물로부터 분리하였다. 필터를 통과하는 전형적인 유속은 160 ± 100 kg/시였고, 총 압력은 <1.7 바였다. 2개의 필터에 약 10 - 30 L 트리스 완충 염수 (TBS) 완충제 (20 mM 트리스, 8 g/L NaCl, 25℃에서 pH 7.4 ± 0.2)를 플러싱하였다. 필터 플러시와 함께, 여과된 여과 브로스를 500 L 백에 수집하고, 수확물로 지칭한다. 수확 단계 파라미터 및 수확 단계 후의 수확물의 특성화 (수율)가 각각 표 1 및 2에서 확인된다. 도 4는 수확 단계의 압력 및 유속의 연속적인 기록을 제공한다.
<표 1>
<표 2>
표 2에 나타난 바와 같이, 여과 전에 세포 현탁액에서 발견된 단백질의 70% 초과 및 HEK DNA의 62% 초과가 이러한 여과 단계를 통해 제거되었다. 정량적 PCR (qPCR)에 의해 측정된 바와 같은 수확물 및 필터 플러시 (P)를 함유하는 풀링된 분획 내의 AAV 역전 말단 반복부 (ITR) 핵산의 양은 여과 전에 세포 현탁액에서 확인된 것의 약 절반이었다. 또한, ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 여과-전 세포 현탁액의 AAV의 65% 초과가 여과 시 유지되었다.
실시예 3
하기 실시예는 한외/투석여과 (UF/DF) 접선 유동 여과 (TFF) 방식을 통해 수확물을 농축 및 여과하는 예시적인 방식을 기술한다.
실시예 2에서 수득된 수확물을 UF/DF TFF 시스템에 적용하여 수확물을 농축 및 컨디셔닝하였다. 제1 단계에서, 수확물을 3×0.5 ㎡ 폴 T-시리즈 오메가 센트라메이트(Pall T-series Omega Centramate) 막 100 kDa (파트 번호: OS100T06)을 사용하여 TFF에 의해 12 L의 표적 부피로 약 16배 농축하였다. 그 후, 농축된 수확물을 2회의 투석여과 단계에 적용하여, 배지 성분을 감소시키고, 농축된 수확물을 pH 8.5 및 전도도 15 mS/cm로 컨디셔닝하였다. 제1 투석여과 단계를 투석여과 완충제 1 (DB1: 50 mM 트리스 / 500 mM NaCl / 25℃에서 pH 8.5±0.2)로의 5배 부피 교환을 통해 수행하였다. 제2 투석여과 단계를 투석 여과 완충제 2 (DB2: 50 mM 트리스 / 125 mM NaCl / 25℃에서 pH 8.5±0.2)로의 5배 부피 교환을 통해 수행하였다. 각각의 투석여과 단계를 3×0.5 ㎡ 폴 T-시리즈 오메가 센트라메이트 막 100 kDa (파트 번호: OS100T06)을 사용함으로써 수행하였다. 제2 투석여과 단계 후, 잔류물을 상기 기술된 바와 같이 TFF에 의해 10 L의 최종 표적 부피로 농축하였다. 그 후, 10 L의 농축물을 0.2 ㎛ 필터 요소 (5 인치, 폴 ECV 필터, 파트 번호: NP5LUECVP1S)를 통해 여과하였다. AAV8 수율을 증가시키기 위해, UF/DF 막, UF/DF 시스템 및 0.2 ㎛ 필터에 약 2 L의 DB2를 플러싱하였다. 잔류물 및 필터 플러시를 수집하고, 후속 포착 단계용으로 제조하기 위해 백에서 혼합하였다. 도 7은 은 염색 (왼쪽) 및 웨스턴 블롯 (오른쪽)으로 TFF의 중간 단계를 나타낸다. UF/DF TFF 단계의 파라미터 및 생성된 컨디셔닝 농축물의 특성화 [UF/DF TFF 단계 후]가 각각 표 3 및 4에서 확인된다.
은 염색에 대한 설명
NuPAGE 4-12% 비스-트리스 미디 겔 1.0 mm. 20웰 카탈로그 번호. WG1402BX10
MES SDS 런닝 완충제. 인비트로젠(Invitrogen). 카탈로그 번호 NP0002
70℃에서 SB+DTT 인큐베이션 10분, 10분 냉각, JAA 처리
웨스턴 블롯에 대한 설명
NuPAGE 4-12% 비스-트리스 미디 겔 1.0 mm. 20웰 카탈로그 번호 WG1402BX10
MES SDS 런닝 완충제. 인비트로젠. 카탈로그 번호 NP0002
70℃에서 SB+DTT 인큐베이션 10분, 10분 냉각, JAA 처리
1차 항체 : AAV (아데노-연관 바이러스)의 VP1. VP2 및 VP3에 대한 Mab
단백질 A 친화력 크로마토그래피
PROGEN61058
2차 항체 : 염소 항-마우스 ALP
시그마 A4656 1:2000 1시간
<표 3>
<표 4>
표 4에 나타난 바와 같이, 생성된 컨디셔닝된 농축물의 부피는 초기 부피의 약 6%였지만, 농축물 내의 AAV의 백분율은 ELISA에 의해 측정 시 74%였다.
실시예 4
이러한 실시예는 음이온 교환기로의 음성 크로마토그래피의 예시적인 방법을 실연한다.
실시예 3에 기술된 바와 같은 TFF에 의한 수확물의 농축 및 투석여과 후, AAV 함유 완충제를 무스탕 음이온 교환기 막 (폴 파트 번호 XT5000MSTGQP1)을 사용하는 음성 크로마토그래피를 위해 125 mM NaCl/50 mM 트리스HCl/pH 8.5로 컨디셔닝하였다. 이러한 조건에서, AAV는 음이온 교환기 막에 결합하지 않고, 대신, 칼럼을 통과하여 유동한다. 칼럼 로딩 후, 2회의 총 부피 (2× 막 캡슐과 동일)의 플러시 완충제 (125 mM NaCl/50 mM 트리스 HCl; pH 8.5)를 사용하여 임의의 양의 비-결합 AAV8을 칼럼으로부터 플러싱시켰다. 도 5는 음성 (비-결합) 모드의 AEX 무스탕 Q 크로마토그래피의 관류 생성물의 크로마토그램을 제공한다. 용리를 수행하여 결합 단백질을 검사하였다. 표 5는 음성 크로마토그래피 단계의 체계를 상술하고, 표 6은 수율을 상술한다.
<표 5>
<표 6>
표 6에 나타난 바와 같이, 음성 크로마토그래피 단계가 유의한 양의 AAV를 남기면서 실질적인 양의 총 단백질을 성공적으로 제거하였다. 이러한 순도 증가가 도 6에서 은 염색 및 웨스턴 블롯에 의해 또한 도해된다. 관류 분획은 AAV의 초기 양의 약 65%를 포함한 반면, 용리 분획 내에는 AAV의 6% 미만이 존재하였다. 또한, 관류 분획의 단백질 총량이 유의하게 감소하였다. 총 단백질의 약 34%만 FT 분획 내에 잔존하였다.
은 염색에 대한 설명
NuPAGE 4-12% 비스-트리스 미디 겔 1.0 mm. 20웰 카탈로그 번호. WG1402BX10
MES SDS 런닝 완충제. 인비트로젠. 카탈로그 번호 NP0002
70℃에서 SB+DTT 인큐베이션 10분, 10분 냉각, JAA 처리
웨스턴 블롯에 대한 설명
NuPAGE 4-12% 비스-트리스 미디 겔 1.0 mm. 20웰 카탈로그 번호 WG1402BX10
MES SDS 런닝 완충제. 인비트로젠. 카탈로그 번호 NP0002
70℃에서 SB+DTT 인큐베이션 10분, 10분 냉각, JAA 처리
1차 항체 : AAV (아데노-연관 바이러스)의 VP1. VP2 및 VP3에 대한 Mab
단백질 A 친화력 크로마토그래피
PROGEN61058
2차 항체 : 염소 항-마우스 ALP
시그마 A4656 1:2000 1시간
실시예 5
이러한 실시예는 제2 TFF 단계의 예시적인 방법을 실연한다.
음성 크로마토그래피 (실시예 4)를 통해 수득된 AAV8-함유 관류 (FT) 분획을 농축하고, 500 mM NaCl/50 mM 트리스HCl; pH 8.5를 포함하는 투석여과 완충제 (DB1)에 대해 투석여과하여, 생성물을 이후의 초원심분리 (UC) 단계 (예를 들어, 실시예 6, 7, 9, 14, 또는 16)을 위해 컨디셔닝하였다. 제2 TFF 단계 (TFF2)를 4×0.1 ㎡ 폴 T-시리즈 오메가 센트라메이트 막 100 kDa (4× 폴. 파트 번호: OS100T12) 및 폴 UF/DF 시스템 CM500을 사용하여 수행하였다. 초원심분리/투석여과 후, 생성물을 1200 ml의 표적 부피로 농축하고, 시스템으로부터 배수시켰다. AAV8 수율을 증가시키기 위해, 후속하여 막 및 UF/DF 시스템에 약 400 ml 투석여과 완충제를 플러싱시켰다 (10분, 1 바 공급물 압력에서 잔류물 측에서 재순환). 막 플러시 및 농축 생성물을 풀링하고, 생물부하 감소를 위해 0.2 ㎛ 필터 (폴 파트 번호: KA02EAVP2S)를 사용하여 여과하였다. 표 7은 TFF2의 체계를 상술하고, 표 8은 이러한 단계의 수율을 상술한다.
<표 7>
<표 8>
표 8에 나타난 바와 같이, TFF2 단계가 초기 AAV의 88%를 유지시키면서 부피를 원래 부피 (로드 부피)의 약 7.5%로 감소시켰다.
실시예 6
이러한 실시예는 50% (w/w) 완충된 에틸렌 글리콜 용액 및 50% (w/w) 수크로스 구배를 사용하여 초원심분리를 통해 빈 AAV 입자를 완전 AAV 입자로부터 분리하는 예시적인 방법을 실연한다. 이러한 단계는 숙주 세포 단백질 (예를 들어, HSP70)을 추가적으로 제거한다. "빈 캡시드"와 같은 제품과 관련된 불순물 및 숙주 세포 단백질 예컨대 HSP70 및 LDH 또한 이러한 단계를 통해 제거된다.
단일 가닥 자가-상보적 형태 (2.6 kb)의 인간 응고 인자 IX 파두아의 벡터 DNA를 포함하는 AAV8 샘플을 함유하는 pH 8.0의 50 mM 트리스HCl/750 mM NaCl 내의 50% (w/w) 에틸렌 글리콜 완충 용액을 초원심분리기 (UC) 내로 로딩한 후, 수크로스 농도 면에서 다른 2개의 상이한 수크로스 용액을 로딩하였다. 최초로 UC 내로 로딩된 수크로스 용액은 수크로스 농도가 55%였다. 제1 수크로스 용액 직후에 UC 내로 로딩된 수크로스 용액은 수크로스 농도가 60%였다. 로딩된 샘플 대 수크로스 구배의 비는 1:1이고, 수크로스 용액들은 부피가 동일하였다. 총 코어 부피는 1,600 ml이다.
2.42 g의 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (트로메타몰(Trometamol))을 8.00 g 염화나트륨 및 550.00 g 수크로스와 혼합함으로써 수크로스 농도가 55%인 완충된 수크로스 용액 1 킬로그램이 제조되었다. 필요하다면 1 M NaOH 및 25% HCl을 사용하여 pH를 조정하면서 WFI를 거의 1 kg까지 첨가하였다. 그 후, WFI를 1 kg까지 첨가하였다.
2.42 g의 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (트로메타몰)을 8.00 g 염화나트륨 및 600.00 g 수크로스와 혼합함으로써 수크로스 농도가 60%인 완충된 수크로스 용액 1 킬로그램이 제조되었다. 필요하다면 1 M NaOH 및 25% HCl을 사용하여 pH를 조정하면서 WFI를 거의 1 kg까지 첨가하였다. 그 후, WFI를 1 kg까지 첨가하였다.
회전 속도가 4,000 rpm으로 설정되고 온도가 2-10℃에서 유지된 밀도 구배가 1차 UC 단계 동안 형성된다. 제1 단계 후, 회전 속도가 35,000 rpm으로 증가되었고, 온도가 22 ℃로 증가되었다. 더 높은 속도 및 온도에서의 이러한 제2 단계 동안, 완전 AAV 입자가 빈 캡시드로부터 분리되었다. 20시간 후, 초원심분리기를 정지시키고, 완전 AAV 입자의 대부분을 함유하는 분획들을 수집하였다. 구배를 구축하는 것, 완전 입자를 함유하는 분획을 수집하는 것, 용리 속도 등에 대한 입력 파라미터에 관한 상세사항을 포함하여, 수행된 UC 단계에 관한 추가적인 상세사항이 하기 표 9에서 제공된다.
<표 9>
결과가 도 17에서 제시되고, 여기서 빈 캡시드 (분획 15)가 완전 캡시드 (분획 11)로부터 분할된다.
도 18은 도 17에 나타난 각각의 분획 상에서 4개의 상이한 검정법을 착수하는 것의 결과를 나타낸다. qPCR은 AAV8의 ITR의 정량적 PCR (ITR-qPCR)을 지칭한다. AAV8:AG는 AAV8 항원에 대한 ELISA를 지칭한다. WAX%는 약한 음이온 교환에 의해 정량된 바와 같은 완전 캡시드의 백분율을 지칭한다. DNA/AAV 비 (때때로 본원에서 특이적 활성으로 지칭됨)는 총 벡터 게놈 (ITR-qPCR) 대 rAAV8 입자의 총량의 비 (AAV8:AG)를 지칭하고, 이는 DNA-함유 캡시드, 뿐만 아니라 완전 캡시드의 비율에 관한 지표를 제공한다. 더 높은 DNA/AAV 비는 더 높은 양의 완전 캡시드와 상호관련된다. 완전 캡시드로부터 빈 캡시드로의 전이가 분획 13에서 분획 15으로의 특이적 활성의 급격한 하락에 의해 나타난다. 각각의 검정법에 대한 값은, Y축에 지시된 바와 같이, 서로에 대해 정규화되었다.
<표 10>
실시예 7
이러한 실시예는 수크로스 구배를 사용하여 초원심분리를 통해 빈 AAV 입자를 완전 AAV 입자로부터 분리하는 예시적인 방법을 실연한다. 이러한 단계는 숙주 세포 단백질 (예를 들어, HSP70)을 추가적으로 제거한다. "빈 캡시드"와 같은 제품과 관련된 불순물 (상기 정의된 바와 같음) 또한 이러한 단계를 통해 제거되었다.
실시예 5의 TFF2를 통해 수득된 B-도메인이 결실된 인간 응고 인자 VIII를 코딩하는 단일 가닥 DNA를 포함하는 벡터 DNA를 함유하는 농축된 분획을 초원심분리기 (UC) 내로 로딩한 후, 수크로스 농도 면에서 다른 3개의 상이한 수크로스 용액을 로딩하였다. 최초로 UC 내로 로딩된 수크로스 용액은 수크로스 농도가 50%였다. 제1 수크로스 용액 직후에 UC 내로 로딩된 수크로스 용액은 수크로스 농도가 55%였고, 마지막으로 UC 내로 로딩된 수크로스 용액은 수크로스 농도가 60%였다.
2.42 g의 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (트로메타몰)을 8.00 g 염화나트륨 및 500.00 g 수크로스와 혼합함으로써 수크로스 농도가 50%인 완충된 수크로스 용액 1 킬로그램이 제조되었다. 필요하다면 1 M NaOH 및 25% HCl을 사용하여 pH를 조정하면서 WFI를 거의 1 kg까지 첨가하였다. 그 후, WFI를 1 kg까지 첨가하였다.
2.42 g의 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (트로메타몰)을 8.00 g 염화나트륨 및 550.00 g 수크로스와 혼합함으로써 수크로스 농도가 55%인 완충된 수크로스 용액 1 킬로그램이 제조되었다. 필요하다면 1 M NaOH 및 25% HCl을 사용하여 pH를 조정하면서 WFI를 거의 1 kg까지 첨가하였다. 그 후, WFI를 1 kg까지 첨가하였다.
2.42 g의 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (트로메타몰)을 8.00 g 염화나트륨 및 600.00 g 수크로스와 혼합함으로써 수크로스 농도가 60%인 완충된 수크로스 용액 1 킬로그램이 제조되었다. 필요하다면 1 M NaOH 및 25% HCl을 사용하여 pH를 조정하면서 WFI를 거의 1 kg까지 첨가하였다. 그 후, WFI를 1 kg까지 첨가하였다.
회전 속도가 4,000 rpm으로 설정되고 온도가 2-10℃에서 유지된 밀도 구배가 1차 UC 단계 동안 형성된다. 제1 단계 후, 회전 속도가 35,000 rpm으로 증가되었고, 온도가 22 ℃로 증가되었다. 더 높은 속도 및 온도에서의 이러한 제2 단계 동안, 완전 AAV 입자가 빈 캡시드로부터 분리되었다. 약 5시간 후, 초원심분리기를 정지시키고, 완전 AAV 입자의 대부분을 함유하는 분획들을 수집하였다. 구배를 구축하는 것, 완전 입자를 함유하는 분획을 수집하는 것, 용리 속도 등에 대한 입력 파라미터에 관한 상세사항을 포함하여, 수행된 UC 단계에 관한 추가적인 상세사항이 하기 표 11 및 12에서 제공된다.
<표 11>
<표 12>
용리 패턴이 도 8에 제시되고, 로드 및 단일 분획의 은 염색 및 웨스턴 블롯이 도 9에서 제시된다. 표 12에 나타난 바와 같이, 피크 풀 내의 입자의 82%가 완전 입자로 간주된다.
은 염색에 대한 설명
NuPAGE 4-12% 비스-트리스 미디 겔 1.0 mm. 20웰 카탈로그 번호. WG1402BX10
MES SDS 런닝 완충제. 인비트로젠. 카탈로그 번호 NP0002
70℃에서 SB+DTT 인큐베이션 10분, 10분 냉각, JAA 처리
웨스턴 블롯에 대한 설명
NuPAGE 4-12% 비스-트리스 미디 겔 1.0 mm. 20웰 카탈로그 번호 WG1402BX10
MES SDS 런닝 완충제. 인비트로젠. 카탈로그 번호 NP0002
70℃에서 SB+DTT 인큐베이션 10분, 10분 냉각, JAA 처리
1차 항체 : AAV (아데노-연관 바이러스)의 VP1. VP2 및 VP3에 대한 Mab
단백질 A 친화력 크로마토그래피
PROGEN61058
2차 항체 : 염소 항-마우스 ALP
시그마 A4656 1:2000 1시간
실시예 8
이러한 실시예는 지질 외피 바이러스를 불활성화시키는 예시적인 방법 및 연마 단계를 실연한다.
실시예 7의 UC 단계에서 수득된 AAV8-함유 분획을 풀링하고, 평형화 완충제 (50 mM 트리스; pH 8.5±0.2)로 1:2.5 희석하였다. 용매 세제 (0.3% 트리-n-부틸포스페이트; 1.0% 트리톤 ×100; 0.3% 폴리소르베이트80) 처리를 수행하였다. 이어서 용매의 전도도를 추가의 1:2 희석으로 3.6±0.2 mS/cm로 조정하였다. 생성된 용액을 프락토겔® EMD TMAE (M) (머크-밀리포어(Merck-Millipore) 카탈로그: 116881)을 함유하는 크로마토그래피 칼럼 (ID 22 mm, 층 높이 57 mm (머크-밀리포어 밴티지(Vantage) VL 22x250.카탈로그 번호: 96220250) 상에 로딩한 후, 평형화 완충제 (50 mM 트리스 pH 8.5±0.2)로 세정하였다. 완충제 (8.09 mM Na2HPO4; 1.47 mM KH2PO4; 2.68 mM KCl; 5% 소르비톨)로 2차 세정 단계를 수행하였다. 12 칼럼 부피의 NaCl 구배에 의해 칼럼 용리를 수행하였다 - 8.09 mM Na2HPO4; 1.47 mM KH2PO4; 2.68 mM KCl; 5% 소르비톨을 포함하는 제1 용리 완충제부터 8.09 mM Na2HPO4 1.47 mM KH2PO4; 2.68 mM KCl; 5% 소르비톨 + 600 mM NaCl을 포함하는 최종 용리 완충제까지. AAV8의 주된 양이 뚜렷한 예리한 피크로서 용리되고, E2 (용리물2)로서 수집되었으며, 이는 정제된 AAV8 제품을 나타낸다. 마지막으로 칼럼을 2 M 염화나트륨으로 스트리핑한 후 재생 절차가 이어졌다. 표 13 및 14는 이러한 단계 및 이러한 단계를 수행한 후에 수득된 수율을 상술한다. 도 10은 프락토겔 TMAE 상에서의 AAV8의 최종 연마이다.
<표 13>
<표 14>
실시예 9
이러한 실시예는 밀도 구배가 형성되는 초원심분리 단계를 포함하는 미정제 분획으로부터 AAV를 정제하는 예시적인 방법을 실연한다.
도 11은 예시적인 방법에서 수행되는 단계의 개략도이다. 3.2 L 부피 (1.6 L 제품 + 1.6 L 구배 / TBS 완충제)에 대한 용량의 코어를 사용하여 초원심분리 단계를 수행하였다.
UC를 정지 상태로 하여, 1.6 L 출발 물질 (이전 공정 단계 = UFB로부터의 중간체 생성물)을 6 L/시의 일정한 유속으로 로터 내로 로딩한 후, 밀도가 다른 3개의 수크로스 용액을 로딩하였다. 하기의 순서로 1.5 L/시의 일정한 유속으로 수크로스 용액을 로딩하였다: 800 mL의 50% 수크로스, 400 mL의 55% 수크로스 및 400 mL의 60% 수크로스.
구역 모드를 달성하여 밀도가 증가하는 수크로스 구배를 구축하기 위해, 채워진 로터를 0에서 4000 rpm으로 가속한 후, 4000에서 35000 rpm으로 2차 가속하였다. UC를 5시간 동안 35000 rpm (약 90000 g-포스)에서 러닝시켰다. 최종 속도가 달성되었으면, 온도를 +4℃에서 +22℃로 변화시켰다. 출발 물질 내에 함유된 AAV8 입자가 이의 밀도가 주위 구배의 밀도에 부합하는 지점에 도달할 때까지 수크로스 구배 내로 이동한다. 완전 캡시드 및 빈 캡시드가 밀도 면에서 상이하기 때문에, 이러한 특색이 완전 바이러스 캡시드를 빈 바이러스 캡시드로부터 분리하는데 사용된다. 원심분리 단계가 종료되기 1시간 전에, 온도를 수동으로 +22℃에서 +4℃로 변화시켰다. UC를 35,000에서 0 rpm으로 정지시키는 것은 2 단계로 수행되었다: 감속에 의해 35,000에서 4,000 rpm으로, 그리고 로터가 감쇠되게 함으로써 4,000 rpm에서 0 rpm으로.
용리가 끝났을 때 25 mL 분획, 뿐만 아니라 폐기물 분획을 수집함으로써 6 L/시의 유속으로 생성물을 회수하였다.
각각 25 mL의 분획의 수집이 분획 7로 시작되고, 폐기물 피크가 시작할 때 종료된다. 더 높은 수크로스 밀도에서의 도 12의 제1 피크가 "완전 캡시드"를 나타낸다. 제2 피크는 "대부분 빈 캡시드"를 나타낸다.
분획 F10 내지 F14를 풀링하고, 다른 AAV8 함유 분획과 동일한 방식으로 표준 AAV8 "완전 캡시드"로서 프락토겔® EMD TMAE (M) 상에서 추가로 정제하였다. 표 15는 TMAE 크로마토그래피 단계의 상세사항을 기술하고, 표 16은 사용된 완충제를 상술한다.
<표 15>
<표 16>
평형화 완충제 50 mM 트리스, pH 8.5 ± 0.2로 1:2.5 희석함으로써 약 25 ml의 단일 초원심분리 분획을 별도로 4 ml TMAE 칼럼에 적용하였다. 0.3% 트리-n-부틸포스페이트, 1% 트리톤 X-100 및 0.3% 폴리소르베이트 80의 존재 하에서의 용매 세제 처리 후, 추가의 1:2 희석으로 전도도를 3.6 ± 0.2 mS/cm로 조정하고, AAV8 함유 용액을 프락토겔® EMD TMAE (M) (머크-밀리포어 카탈로그: 116881)을 함유하는 크로마토그래피 칼럼 (ID 10 mm, 층 높이 50 mm ± 5 mm (머크-밀리포어 밴티지 VL 10 x250 또는 유사물) 상에 적용한 후, 평형화 완충제 50 mM 트리스, pH 8.5 ± 0.2로의 1차 세정 단계 및 8.09 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4, 2.68 mM KCl, 5% 소르비톨, pH 7.4로의 2차 세정 단계가 이어졌다. 8.09 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4, 2.68 mM KCl, 5% 소르비톨, pH 7.4에서 8.09 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4, 2.68 mM KCl, 5% 소르비톨 + 600 mM NaCl, pH 7.4까지의 12 칼럼 부피의 구배에 의해 용리가 수행된다. AAV8의 주된 양이 뚜렷한 예리한 피크로서 용리되고, E2 (용리물2)로서 수집되었으며, 이는 정제된 AAV8 제품을 나타낸다. 수득된 AAV8 함유 용리물 E2 (용리물2)를 8.09 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4, 2.68 mM KCl, 5% 소르비톨 + 600 mM NaCl pH 7.4로 1:2 희석하여, 제형 완충제 (8.09 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4, 2.68 mM KCl, 5% 소르비톨 + 350 mM NaCl, pH 7.4)의 매트릭스로 조정하였다. 마지막으로 칼럼을 2 M 염화나트륨으로 스트리핑한 후 재생 절차가 이어졌다. 크로마토그래피 시스템을 +18℃ 내지 +25℃의 주위 온도에 놓았다.
분획 10 내지 21을 분석용 초원심분리 (AUC)로 분석하고, AAV8-벡터 (인자 IX 파두아 이중 가닥 (4.8kb)을 함유함)의 DNA-분석을 음성 아가로스 겔 전기영동 및 알칼리성 아가로스 겔 전기영동에 의해 수행하였다. 도 13-16은 TMAE 상에서의 연마 후에 UC에 의해 수득된 단일 분획의 분석 데이터를 나타낸다. 도 14는 아가로스 1% 음성의 사진이고, 도 15는 아가로스 0.8% 알칼리성의 사진이다. 도 15에 나타난 바와 같이, 초원심분리에서 더 높은 수크로스 밀도에서 수득된 UV 피크의 풀링된 분획 X10 내지 X14가 벡터 DNA의 더 작은 DNA 변이체에 대한 어떠한 추가 힌트도 없이 고도로 순수한 단일 DNA 밴드를 함유하였다.
분석용 UC의 데이터가 표 17에서 제공된다.
<표 17>
표 17에 나타난 바와 같이, 분획 10-15가 가장 높은 양의 채워진 AAV 캡시드를 함유하였다. 실질적인 양의 완전 캡시드가 분획 16 및 17에서 발견된 한편, 분획 10-15에 비교하여, 이러한 양은 약간 더 적고, 빈 캡시드의 양이 상승한다. 완전 캡시드의 양의 추가 감소 및 빈 캡시드의 추가 증가가 분획 19 및 20에서 관찰되었다.
도 16은 지시된 UC 분획으로부터의 단일 BDS에 대한 데이터를 나타낸다. 이러한 결과는 AUC 및 아가로스 겔 전기영동에서 불완전한 벡터 DNA 함량이 검출되지 않으면서 UC 분획 10 내지 15로부터의 균질한 AAV8 제품을 나타낸다. 불완전한 벡터 DNA가 분획 17로부터 나타나고, "대부분 빈 캡시드" 구역의 이후 분획에서 검출되었다. 불완전한 벡터의 검출은 뜻밖이었는데, 이같은 광범위한 분할이 있을 것으로 예상하지 않았기 때문이다. 따라서, 개발된 분리 방법은 완전히 빈 캡시드 (즉, DNA가 없음)를 "완전" 캡시드를 포함하는 것으로부터 분할하는 것에 제한되는 것이 아니라, 뜻밖에도 서로 분할될 수 없는 다양한 길이의 벡터 DNA의 분리를 또한 허용한다. 이는 "빈 캡시드" 집단 내의 DNA의 길이에 관계 없이 "빈 캡시드"로부터의 "완전 캡시드"의 의미있는 분리가 있다는 것을 또한 가리킨다. 달리 말하면, 이러한 방법은 완전 AAV 캡시드의 함량이 높은 AAV를 수득하기 위한 빈 벡터 (말단절단 및 불완전 DNA를 포함함)의 고갈을 허용한다.
실시예 10
이러한 방법은 AAV보다 더 크고 적용된 나노필터의 세공 크기보다 더 큰 바이러스의 제거를 위한 나노여과의 예시적인 방법을 기술한다.
35 nm +/- 2 nm의 좁은 세공 크기 범위의 천연 소수성 구리암모늄 재생 셀룰로스로 구축된 미세세공성 중공-섬유 다발을 함유하는 아사히(Asahi) PLANOVA 35 nm 필터를 필터에 핀홀 또는 대형 결손이 없다는 것을 확증하기 위해 통합성 누출 테스트로 테스트하고, 제형 완충제로 예비-세정한다. 그 후, 음이온 교환 용리물을 취하고, 나노필터를 통해 데드-엔드 모드로 0.1 MPa를 초과하지 않는 일정한 압력 하에 여과한다. 대안적으로, 필터를 접선 유동 방법으로 또한 러닝시킬 수 있다. 바이러스 입자의 농도를 조정하기 위해 음이온 교환 용리물을 용리 완충제 (PBS + 600 mM NaCl)로 예비-희석할 수 있다. 모든 바이러스 입자를 제거하기 위해, 나노필터를 완충제 (예를 들어 제형 완충제)로 사후-세정한다. 나노필터 세공 크기 분포가 변화되지 않았다는 것과 나노필터가 여과 동안 이의 통합성을 유지하였다는 것을 증명하기 위해 누출 테스트 및 금 입자 테스트로 나노필터의 사후-통합성 테스트를 수행한다. 더 높은 샘플 로드는 더 높은 수율을 초래한다. 따라서, 전형적으로 ㎡ 필터 면적 당 50 L를 초과하는 용액이 적용된다.
실시예 11
이러한 방법은 AAV보다 더 크고 적용된 나노필터의 세공 크기보다 더 큰 바이러스의 제거를 위한 나노여과의 예시적인 방법을 기술한다.
35 nm +/- 2 nm의 좁은 세공 크기 범위의 천연 소수성 구리암모늄 재생 셀룰로스로 구축된 미세세공성 중공-섬유 다발을 함유하는 아사히 PLANOVA 35 nm 필터를 필터에 핀홀 또는 대형 결손이 없다는 것을 확증하기 위해 통합성 누출 테스트로 테스트하고, 제형 완충제로 예비-세정한다. 그 후, 2870.98 ㎍/ml AAV-8 (ELISA에 의해 결정된 농도)을 포함하는 4.05 ml의 풀링된 분획을 pH 7.4의 1.47 mM KH2PO4, 2.68 mM KCl, 8.09 mM Na2HPO4, 600 mM NaCl 및 5% 소르비톨의 완충제 4.05에 1차로 희석하였다. 희석 배율은 1:2였다. 그 후, 로드 완충제가 산출되도록 8.10 그램의 1차 희석물을 pH 7.4의 1.47 mM KH2PO4, 2.68 mM KCl, 8.09 mM Na2HPO4, 350 mM NaCl 및 5% 소르비톨의 완충제 61.57 그램에 희석하였다. 로드 완충제의 희석 배율은 1차 희석물에 비교하여 1:8.6이었고, 풀링된 분획에 비교하여 1:17.2였다.
나노필터를 pH 7.4의 1.47 mM KH2PO4, 2.68 mM KCl, 8.09 mM Na2HPO4, 350 mM NaCl 및 5% 소르비톨을 포함하는 완충제 25 ml로 컨디셔닝하였다. 컨디셔닝 동안, 압력을 적용하지 않고 잔류물 출구를 열어 놓으면서, 10 ml의 완충제를 사용하여 필터를 정화하였다. 그 후, 0.9 바의 일정한 압력을 적용하고 잔류물 출구를 닫으면서, 약 15 ml의 완충제를 중공 섬유를 통해 여과시켰다.
그 후, 9 ml의 플러싱 완충제를 0.9 바의 일정한 압력 하에 저장소 탱크에 적용하였다. 플러싱 완충제는 pH 7.4의 1.47 mM KH2PO4, 2.68 mM KCl, 8.09 mM Na2HPO4, 350 mM NaCl 및 5% 소르비톨을 포함하였다. 그 후, 플러싱 후에 샘플을 취하였다. 샘플을 취한 후, 60 그램의 상기 로드 완충제를 나노필터를 통해 데드-엔드 모드로 0.9 바의 일정한 압력 하에 여과하였다.
여과로부터의 데이터가 하기 표 18에서 제시된다. 여과로부터의 AAV의 수율은 적어도 77%이다.
<표 18>
실시예 12
하기 실시예는 AAV8 제품의 생물효력을 테스트하는 예시적인 방법을 기술한다.
시험관-내 생물효력 검정법에서, 바이러스 벡터 AAV8-FIX로 간 표적 세포주를 형질감염시키고, 이어서 이는 기능성의 측정가능한 FIX 단백질을 배지 내로 분비한다.
제1 단계에서, HepG2 표적 세포에 AAV8-FIX를 형질도입한다. 인큐베이션 시간 동안, FIX가 세포 상청액 내로 방출된다. 제2 단계에서, 세포 배양 상청액의 인자 IX-활성을 FIX 발색 검정법에 의해 직접적으로 측정한다. 기준 물질에 비교된 백분율로서 AAV8-FIX 샘플의 치수가 제공된다. 이러한 방법은 AAV8-FIX 유전자 요법 벡터의 생물학적 기능의 정량적 평가를 허용한다.
실시예 13
이러한 실시예는 AAV-특이적 ELISA를 실연한다.
상기 실시예에서, 본 개시내용의 방법의 단계 후 AAV-특이적 ELISA를 수행하여, AAV-함유 분획을 확인하고, ㎍ AAV8에 대한 qPCR의 비에 의해 표시되는 AAV의 DNA/AAV 비 또는 "특이적 활성"을 계산하였다. DNA/AAV 비는 AAV 입자 내에 캡슐화된 벡터 DNA를 반영한다.
TECAN 로버터(Roboter) 시스템 상에서 AAV-8 적정 ELISA 키트 (물품 번호 PRAAV8; 프로젠(Progen) (독일 하이델베르그))로 AAV8 ELISA를 수행하였다. 간략하게, 어셈블리된 AAV8 캡시드 상의 입체형상 에피토프 (ADK8)에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 미량역가 스트립 상에 코팅하고, AAV 분획으로부터 AAV8 입자를 포착하는데 사용하였다. 포착 AAV8 입자를 2개의 단계에 의해 검출하였다. 제1 단계에서, ADK8 항체에 대해 특이적인 비오틴-접합 모노클로날 항체가 면역 복합체 (ADK8 및 ADK8 항체의 복합체)에 결합하였다. 스트렙타비딘 퍼옥시다제 접합체를 비오틴-접합 모노클로날 항체에 결합된 면역 복합체에 첨가하였고, 스트렙타비딘 퍼옥시다제 접합체가 비오틴과 반응하였다. 퍼옥시다제 기질 용액을 첨가하였고, 결합된 AAV 입자의 양에 비례하는 색상 반응이 발생한다. 450 nm에서 광도계로 색상 반응을 측정한다.
테스트된 분획 내에 존재하는 AAV8 입자의 양을 ELISA로 결정한다.
실시예 14
이러한 실시예는 50% 에틸렌 글리콜 완충 로딩 용액 및 50% 수크로스 구배 (즉, 1:1 비)를 사용하여 초원심분리를 통해 빈 AAV 입자를 완전 AAV 입자로부터 분리하는 예시적인 방법을 실연한다. "빈 캡시드"와 같은 제품 관련 불순물 및 숙주 세포 단백질 예컨대 HSP70 및 LDH가 이러한 단계를 통해 제거된다.
인간 응고 인자 VIII (전장 ~4.8 kb)와 함께 AAV8을 포함하는 트리스HCl / NaCl 내의 완충된 에틸렌 글리콜 용액 (50% (w/w)을 초원심분리기 (UC) 내로 로딩한 후, 수크로스 농도 면에서 다른 2개의 상이한 수크로스 용액으로 형성된 수크로스 구배를 로딩하였다. 로딩된 샘플 대 수크로스 구배의 비는 1:1이다. 최초로 UC 내로 로딩된 수크로스 용액은 수크로스 농도가 55%였다. 제1 수크로스 용액 직후에 UC 내로 로딩된 수크로스 용액은 수크로스 농도가 60%였다.
2.42 g의 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (트로메타몰)을 8.00 g 염화나트륨 및 550.00 g 수크로스와 혼합함으로써 수크로스 농도가 55%인 완충된 수크로스 용액 1 킬로그램이 제조되었다. 필요하다면 1 M NaOH 및 25% HCl을 사용하여 pH를 조정하면서 WFI를 거의 1 kg까지 첨가하였다. 그 후, WFI를 1 kg까지 첨가하였다.
2.42 g의 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (트로메타몰)을 8.00 g 염화나트륨 및 600.00 g 수크로스와 혼합함으로써 수크로스 농도가 60%인 완충된 수크로스 용액 1 킬로그램이 제조되었다. 필요하다면 1 M NaOH 및 25% HCl을 사용하여 pH를 조정하면서 WFI를 거의 1 kg까지 첨가하였다. 그 후, WFI를 1 kg까지 첨가하였다.
이러한 예에서, 3,200 ml 코어를 사용하였고, 여기서 AAV8을 함유하는 50% 에틸렌 글리콜 완충 용액이 1,600 ml였고, 55% (w/w) 수크로스 용액이 800 ml였으며, 60% (w/w) 수크로스 용액이 800 ml였다.
회전 속도가 4,000 rpm으로 설정되고 온도가 2-10℃에서 유지된 밀도 구배가 1차 UC 단계 동안 형성된다. 제1 단계 후, 회전 속도가 35,000 rpm으로 증가되었고, 온도가 22 ℃로 증가되었다. 더 높은 속도 및 온도에서의 이러한 제2 단계 동안, 완전 AAV 입자가 빈 캡시드로부터 분리되었다. 20시간 후, 초원심분리기를 정지시키고, 완전 AAV 입자의 대부분을 함유하는 분획들을 수집하였다.
결과가 도 19에 제시되고, 여기서 완전 캡시드 (분획 1-6)가 빈 캡시드 (분획 8-17)로부터 분할된다.
도 20은 하위종 (즉, 불완전한 벡터 DNA) 분리를 실연하는 분획 8-10으로부터의 침강 계수 그래프의 오버레이이다. 화살표는 UC-구배에서 밀도가 더 높은 분획에서 더 낮은 밀도로 중량이 더 낮은 AAV8를 향한 이동을 가리킨다 (즉, 밀도: 분획 8 > 분획 9 > 분획 10). 이는 벡터 DNA가 이러한 프로토콜로 적합하게 분할되어 크기를 기초로 분리될 수 있다는 것이 추가로 실연한다. 또한, 표 19를 참조한다.
<표 19>
실시예 15
이러한 실시예는 50-55-60 수크로스 용액 방법을 사용하는, 수크로스 구배를 사용하는 초원심분리를 실연한다. AAV8 입자가 인간 응고 인자 IX 파두아의 단일 가닥 벡터 DNA (2.6 kB)를 함유한 것을 제외하고는, 실시예 7에 지시된 것과 방법이 동일하다. 도 21에 지시된 바와 같이, 완전 캡시드 대 빈 캡시드 사이의 분리가 ITR pPCR 및 AAV ELISA의 오버랩에 의해 지시되는 만큼 분할되지 않는다.
실시예 16
이러한 실시예는 총 7,700 ml의 코어 부피를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 6에 기술된 바와 같은 55-60 수크로스 용액 방법을 사용하여, 수크로스 구배를 사용하는 초원심분리를 실연한다. 따라서, 로드 부피는 50% 에틸렌 글리콜 트리스HCl 완충 용액 내의 6,100 ml였고, 55% 수크로스 용액 부피는 800 ml였으며, 60% 수크로스 용액 또한 800 ml였다. 초원심분리 용리 프로파일이 도 22에서 도시된다. 여기에서, AAV가 고도로 정제되기 때문에 "폐기물 피크"가 없다. 완전 AAV8이 분획 1 - 8 (각각 50 ml)로부터 수집된다. "빈" AAV가 분획 9 - 15 (각각 50 ml)로부터 수집된다. 추가 분획인 15 - 21 또한 수집된다 (각각 100 ml). 더 높은 수크로스 밀도에서의 도 22의 제1 피크는 "완전 캡시드"를 나타낸다. 제2 피크는 "빈 캡시드"를 나타낸다.
본원에서 인용된, 간행물, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참조문헌은 이에 의해 각각의 참고문헌이 참조로 포함되는 것으로 개별적으로, 그리고 구체적으로 지시되고 이의 전문이 본원에 기재된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다.
개시내용을 기술하는 맥락 (특히 하기 청구범위의 맥락)에서 단수형태 및 유사한 지시물을 사용하는 것은, 본원에서 달리 지시되거나 또는 맥락적으로 명백하게 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 양쪽 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는(comprising)", "있는/갖는", "포함하는(including)" 및 "함유하는"은 달리 언급되지 않는 한 개방형 용어 (즉, "~을 포함하지만 이에 제한되지 않음"을 의미함)인 것으로 해석되어야 한다.
본원에서 값의 범위를 열거하는 것은, 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 범위 내에 속하는 각각의 별개의 값 및 각각의 종점을 개별적으로 언급하는 것의 약기 방법으로서의 역할을 하도록 의도될 뿐이고, 각각의 별개의 값 및 종점은 개별적으로 본원에 열거된 것처럼 명세서 내로 포함된다.
본원에 기술된 모든 방법은 본원에서 달리 지시되거나 또는 맥락에 의해 달리 명확하게 모순되지 않는 한 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의의 모든 예, 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 개시내용을 더 양호하게 해명하도록 의도될 뿐이고, 달리 청구되지 않는 한 개시내용의 범주에 제한을 두지 않는다. 명세서 내의 언어는 임의의 청구되지 않은 요소를 개시내용의 실행에 필수적인 것으로 지시하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 개시내용을 수행하기 위해 본 발명가들에게 공지된 최선의 방식을 포함하여 본 개시내용의 바람직한 실시양태가 본원에 기술된다. 이러한 바람직한 실시양태의 변형이 전술된 설명의 판독 시 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백해질 수 있다. 본 발명가들은 숙련된 기술자가 적합하다면 이같은 변형을 사용할 것으로 예상하고, 본 발명가들은 개시내용이 본원에서 구체적으로 기술된 것과 다르게 실행되는 것을 의도한다. 따라서, 본 개시내용은 적용가능한 법에 의해 허용되는 바와 같이 여기에 첨부된 청구범위에서 열거된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 또한, 본원에서 달리 지시되거나 또는 다르게는 맥락에 의해 명백하게 모순되지 않는 한 상기 기술된 요소들의 이의 모든 가능한 변형으로의 임의의 조합이 개시내용에 의해 포함된다.
Claims (65)
- 빈 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 및 완전(full) AAV 캡시드를 포함하는 농축된 AAV 분획으로부터 완전 AAV 캡시드를 정제하는 방법이며,
(i) 구역 로터 내로 a) 농축된 AAV 분획 및 b) 적어도 2개의 당 용액을 로딩하는 단계(여기서, 각각의 당 용액은 당 농도가 상이하고, 각각 45% (w/w) 내지 65% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함함),
(ii) 구역 로터를 포함하는 초원심분리기를 배치 모드로 작동시키고, 그 결과 당 구배가 형성되는 것인 단계,
(iii) 당 구배의 분획을 수득하여, AAV 분획 내의 AAV 입자의 적어도 60% 또는 60%가 완전 AAV 캡시드인 AAV 분획을 수득하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, (A) 당 용액의 부피가 구역 로터의 부피의 50% 이상이거나, (B) 구역 로터 내로 로딩된 당 용액 및 농축된 AAV 분획의 총 부피가 구역 로터의 부피 이하이거나, (C) 구역 로터 내로 로딩된 당 용액의 부피 대 농축된 AAV 분획의 부피의 비가 1 이하이거나, 또는 (D) 이들의 조합인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 당 용액이 50% (w/w) 내지 60% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 당 용액이 55% (w/w) 내지 60% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나의 당 용액이 52% (w/w) 내지 58% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하고, 제2 당 용액이 57% (w/w) 내지 63% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 제3 당 용액이 47% (w/w) 내지 53% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 2개의 당 용액이 구역 로터 내로 로딩되는 방법.
- ◈청구항 8은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 3개의 당 용액이 구역 로터 내로 로딩되는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 3개의 당 용액이 구역 로터 내로 로딩되는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (i)에서, 농축된 AAV 분획이 52% (w/w) 내지 58% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액 전에 로딩되고, 52% (w/w) 내지 58% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액이 57% (w/w) 내지 63% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액 전에 로딩되는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (i)에서, 농축된 AAV 분획이 47% (w/w) 내지 53% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액 전에 로딩되고, 47% (w/w) 내지 53% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액이 52% (w/w) 내지 58% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액 전에 로딩되며, 52% (w/w) 내지 58% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액이 57% (w/w) 내지 63% (w/w) 수크로스 범위의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 당 용액 전에 로딩되는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 당 용액 중 어느 하나가:
(i) 동일한 부피로 구역 로터 내에 로딩되거나;
(ii) 구역 로터 내의 다른 당 용액 중 적어도 하나의 부피의 2배인 부피에서 최소 당 농도로 로딩되거나;
(iii) 적어도 구역 로터에서 조합되는 모든 다른 당 용액의 부피인 부피에서 최소 당 농도로 로딩되거나;
(iv) 최대 당 농도의 당 용액의 부피의 적어도 2배인 부피에서 최소 당 농도로 로딩되거나;
(v) 중간 당 농도의 당 용액의 부피와 동일한 최대 당 농도로 로딩되거나;
(vi) 구역 로터 내의 적어도 하나의 다른 당 용액의 부피의 적어도 2배인 부피에서 최소 당 농도로 로딩되거나; 또는
(vii) 구역 로터 내의 적어도 하나의 다른 당 용액과 동일한 부피인 부피에서 최소 당 농도로 로딩되는 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 최소 당 농도의 당 용액이 농축된 AAV 분획의 부피의 절반인 부피로 구역 로터 내에 로딩되는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 구역 로터 내에 로딩되는 총 당 구배의 부피 대 농축된 AAV 분획의 부피의 비가 1:1 내지 1:5인 방법.
- ◈청구항 15은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈제1항 또는 제2항에 있어서, 구역 로터 내에 로딩되는 농축된 AAV 분획이 AAV 완충 용액을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 당 용액이,
(i) 이당류 또는 삼당류;
(ii) 수크로스, 말토스, 락토스, 및 이들의 조합물; 또는
(iii) 수크로스
를 포함하는 것인 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 당 용액, 농축된 AAV 분획 또는 둘 모두가,
(i) 10 내지 100 mM 농도의 트리스HCl 및 100 mM 내지 1 M 농도의 NaCl을 포함하거나;
(ii) 7.0 내지 9.0의 pH를 갖거나; 또는
(iii) 상기 (i) 및 (ii) 둘 다에 해당하는 것인 방법. - 제17항에 있어서, 트리스HCl이 20 mM 내지 50 mM의 농도인 방법.
- 제17항에 있어서, NaCl이 150 mM 내지 750 mM 또는 150 mM 내지 500 mM의 농도인 방법.
- 제17항에 있어서, pH가 7.4 내지 8.5인 방법.
- 제17항에 있어서, 농축된 AAV 분획이 45-55% (w/w) 에틸렌 글리콜을 포함하는 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 농축된 AAV 분획이 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 또는 60% (w/w) 에틸렌 글리콜을 포함하는 것인 방법.
- ◈청구항 23은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈제15항에 있어서, 완충 용액이 45-55% (w/w) 에틸렌 글리콜을 포함하는 것인 방법.
- ◈청구항 24은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈제15항에 있어서, 완충 용액이 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 또는 60% (w/w) 에틸렌 글리콜을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
(i) 초원심분리기를 15분 내지 25분 이내에 달성되는 3,000 rpm 내지 10,000 rpm의 제1 회전 속도에서, 그리고 30,000 내지 40,000 rpm 범위 내의 제2 회전 속도에서 적어도 4시간 동안 작동시키는 단계; 또는
(ii) 초원심분리기를 15분 내지 25분 이내에 달성되는 3,000 rpm 내지 10,000 rpm의 제1 회전 속도에서, 그리고 30,000 내지 40,000 rpm 범위 내의 제2 회전 속도에서 적어도 12시간 동안 작동시키는 단계를 포함하는 방법. - 제25항에 있어서, 초원심분리기를 제1 회전 속도로부터 제2 회전 속도로 가속시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 가속은 5분 내지 60분의 지속기간 동안 유지되는 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 초원심분리기를 제2 회전 속도로부터 제1 회전 속도로 감속시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 감속은 5분 내지 90분의 지속기간 동안 유지되는 것인 방법.
- 제27항에 있어서,
초원심분리기를 적어도 30분의 지속기간 동안 8℃ 이하의 온도에서 유지하는 단계; 및
30분 후에 초원심분리기를 정지시키는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제25항에 있어서, 초원심분리기가 2℃ 내지 10℃ 사이의 온도를 유지하기 위해 제1 회전 속도로 작동되는 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 초원심분리기가 20℃ 내지 25℃ 사이의 온도를 유지하기 위해 제2 회전 속도로 작동되는 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 제1 회전 속도가 3,000 rpm 내지 6,000 rpm인 방법.
- 제31항에 있어서, 제1 회전 속도가 15 내지 25분 동안 유지되는 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 제1 회전 속도가 4,000 rpm인 방법.
- 제25항에 있어서, 제2 회전 속도가 35,000 rpm인 방법.
- 제25항에 있어서, 제2 회전 속도가 4시간 내지 6시간 동안, 적어도 16시간 또는 적어도 20시간 동안 유지되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 구역 로터 내로 로딩된 농축된 AAV 분획이 적어도 1×1012개의 AAV 캡시드/mL를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
(a) 농축된 AAV 분획을 한외/투석여과 시스템을 사용하여 농축시키는 단계;
(b) AAV 분획의 지질 외피 바이러스를 용매, 세제, 또는 둘 다로 불활성화시키는 단계;
(c) AAV 분획을 나노여과하여 35 nm 초과의 바이러스를 제거하는 단계;
(d) 촉수성 겔을 포함하는 칼럼으로 AEX 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 연마 단계를 수행하는 단계;
(e) 삼중 플라스미드 시스템으로 형질감염된 HEK293 세포를 포함하는 세포 배양물로부터 상청액을 수확하는 단계; 또는
(f) (a) 내지 (e) 단계의 조합
을 추가로 포함하는 방법. - (i) 숙주 세포를 관심 유전자 또는 cDNA로 형질감염시키는 단계, (ii) 형질감염된 숙주 세포를 포함하는 세포 배양물의 상청액을 수집하는 단계, 및 (iii) 제1항 또는 제2항에 따른 방법을 수행하는 단계를 포함하는, AAV 제품을 생산하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 55%의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 제1 당 용액, 60%의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 제2 당 용액을 포함하는 것인 방법.
- 제39항에 있어서, 50%의 수크로스 농도와 등가인 농도로 당을 포함하는 제3 당 용액을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, AAV가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, 또는 AAV10인 방법.
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