JP2016073322A - 空キャプシドを実質的に含まない組換えａａｖビリオン調製物を生成するための方法 - Google Patents

空キャプシドを実質的に含まない組換えａａｖビリオン調製物を生成するための方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2016073322A
JP2016073322A JP2016020659A JP2016020659A JP2016073322A JP 2016073322 A JP2016073322 A JP 2016073322A JP 2016020659 A JP2016020659 A JP 2016020659A JP 2016020659 A JP2016020659 A JP 2016020659A JP 2016073322 A JP2016073322 A JP 2016073322A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
aav
column
vector particles
aav vector
empty
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2016020659A
Other languages
English (en)
Inventor
クワン チー
Guang Qu
クワン チー
フレーザー ライト ジョン
John Fraser Wright
フレーザー ライト ジョン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genzyme Corp
Original Assignee
Genzyme Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=33544272&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2016073322(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genzyme Corp filed Critical Genzyme Corp
Publication of JP2016073322A publication Critical patent/JP2016073322A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16651—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16051—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

【課題】ＡＡＶベクター粒子ストックから空キャプシドを除去するかまたは空キャプシド数を減少させて、製造能力を増強する新規な方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、空キャプシドの量が減少したｒＡＡＶビリオンストックを調製するための、効率的かつ商業的に実現可能な方法を開発したことに基づく。本発明者らは、本明細書において、空キャプシドが、カラムクロマトグラフィー技術を使用することによって、遺伝物質を含むｒＡＡＶビリオン（「ＡＡＶベクター粒子」）から分離され得ることを見出した。ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとの混合物からＡＡＶの空キャプシドを分離するための方法が、記載される。この方法は、カラムクロマトグラフィー技術を使用し、商業的に実現可能なレベルの組換えＡＡＶビリオンを提供する。
【選択図】なし

Description

（技術分野）
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを精製するための方法に関する。より具体的には、本発明は、パッケージングされたゲノムを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンを、パッケージングされたｒＡＡＶビリオンとそのパッケージングされたゲノムを欠くＡＡＶの空キャプシドとの両方を含むＡＡＶビリオン混合物から精製するための方法に関する。
（背景）
治療上有効な量の遺伝子産物を安全かつ持続的に患者へと送達する遺伝子治療方法が、現在開発中である。これらの方法を使用して、核酸分子が、患者へと直接導入され得る（インビボ遺伝子治療）か、または患者もしくはドナーから単離された細胞中へと導入され得、その後、その細胞は上記患者へと戻される（エキソビボ遺伝子治療）。その後、導入された核酸は、その患者自身の細胞または移植細胞が望ましい治療産物を産生するように仕向ける。遺伝子治療はまた、臨床家が、治療のために特定の器官または細胞標的（例えば、筋肉、血球、脳細胞など）を選択するのを可能にする。
核酸は、いくつかの方法で患者の細胞中へと導入され得る。その方法としては、ウイルス媒介性遺伝子送達、裸ＤＮＡ送達、およびトランスフェクション法が挙げられる。ウイルス媒介性遺伝子送達は、大部分の遺伝子治療試験において使用されている（Ｃ．Ｐ．Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９５）１３：２２２〜２２５）。最も一般的に使用される組換えウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を基にしている。
組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、ヒト遺伝子治療のための遺伝子送達ベクターとしての見込みを保持していた。しかし、そのようなベクターを薬物として使用するための１つの重要な障害は、商業的に実現可能なレベルでそのベクターを生成および精製するための、真に拡張可能なプロセスの開発である。商業的使用のためにＡＡＶベクター生成を拡張することに関与する難問の概説について、ＱｕおよびＷｒｉｇｈｔ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐ．（２０００）３：７５０〜７５５を参照のこと。最近、ｒＡＡＶビリオンを精製するための拡張可能性のあるいくつかのカラムクロマトグラフィー技術が、開発された。これらのカラムクロマトグラフィーベースの精製方法は、ｒＡＡＶビリオンが、大規模精製され得ることを実証したが、カラムクロマトグラフィーを使用して精製ビリオンを調製すると、かなりの量のＡＡＶの空キャプシドを含む。空キャプシドと、目的とする異種遺伝子を含むビリオン（「ＡＡＶベクター粒子」）との代表的な比率は、約１０以上である。すなわち、回収されたベクターのうちの約９０％は、空キャプシドである。
大量の空キャプシドの存在は、例えば、そのキャプシドタンパク質に対する望ましくない免疫応答を惹起することによって、または標的細胞表面結合部位について競合することによって、臨床的適用を妨害し得る。結果として、ｒＡＡＶビリオン調製物から上記空キャプシドを除去する技術が、開発されている。これらの技術は、代表的には、超遠心分離（例えば、塩化セシウムまたはイオジキサノール中で勾配遠心分離）に依存する。そのような遠心分離技術は、労働集約的であり、代表的には、低ベクター収率を生じ、かつ拡張可能ではない。Ｋａｌｕｄｏｖら（２００２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１２３５〜１２４３は、アニオン交換カラムを使用して、ｒＡＡＶ−２ベクター、ｒＡＡＶ−４ベクター、およびｒＡＡＶ−５ベクターを精製する方法を記載する。しかし、その実験は、溶出物をプールして画分を濃縮した後でさえ、パッケージされたゲノムとしてそれぞれ、２％、０．６％、および６．３％しか回収可能ではなかった。
従って、ＡＡＶベクター粒子ストックから空キャプシドを除去するかまたは空キャプシド数を減少させて、製造能力を増強する新規な方法についての必要性が、存在する。
（発明の要旨）
本発明は、空キャプシドの量が減少したｒＡＡＶビリオンストックを調製するための、効率的かつ商業的に実現可能な方法を開発したことに基づく。本発明者らは、本明細書において、空キャプシドが、カラムクロマトグラフィー技術を使用することによって、遺伝物質を含むｒＡＡＶビリオン（「ＡＡＶベクター粒子」）から分離され得ることを見出した。この結果は、驚くべきものである。なぜなら、空キャプシドと、パッケージングされたキャプシドとは、同一の表面特性を有すると、以前には考えられていたからである。本発明者らが知る限りでは、これは、ウイルス粒子の電荷および／または電荷密度が、空キャプシドと完全粒子との間では異なることについての最初の証明である。本明細書中に記載される技術は、ＡＡＶの空キャプシドをＡＡＶベクター粒子から分離するための効率的かつ拡張可能な方法を提供する。
従って、一実施形態において、本発明は、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物からＡＡＶベクター粒子を精製して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供するための方法に関する。上記方法は、
（ａ）ＡＡＶベクター粒子を含む宿主細胞を提供する工程；
（ｂ）上記宿主細胞を溶解して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含む粗細胞溶解物を得る工程；
（ｃ）上記粗細胞溶解物を、第一のカチオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドが上記カラムに結合する条件下で適用する工程；
（ｄ）上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドを、非分離条件下で溶出して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物を提供する工程；
（ｅ）上記工程（ｄ）からのＡＡＶ調製物を、第二のカチオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドが上記カラムに結合する条件下で適用する工程；
（ｆ）低塩緩衝液を、上記工程（ｅ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出されＡＡＶの空キャプシドが上記カラムに結合したままである条件下で添加する工程；ならびに
（ｇ）ＡＡＶベクター粒子を含む上記工程（ｆ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
を包含する。
さらなる実施形態において、上記方法は、
（ｈ）上記工程（ｇ）からの画分を、アニオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドが存在する場合には上記カラムに結合する条件下で、適用する工程；
（ｉ）低塩緩衝液を、上記工程（ｈ）からのカラムに対して、ＡＡＶの空キャプシドが溶出されＡＡＶベクター粒子が上記カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｊ）高塩緩衝液を、上記工程（ｉ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出される条件下で添加する工程；
（ｋ）ＡＡＶベクター粒子を含む上記工程（ｉ）からの画分を収集して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
をさらに包含する。
なおさらなる実施形態において、本発明は、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物からＡＡＶベクター粒子を精製して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供するための方法に関する。上記方法は、
（ａ）ＡＡＶベクター粒子を含む宿主細胞を提供する工程；
（ｂ）上記宿主細胞を溶解して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含む粗細胞溶解物を得る工程；
（ｃ）上記粗細胞溶解物を清澄化して、清澄化した細胞溶解物を提供する工程；
（ｄ）上記清澄化した細胞溶解物を、機能的リガンドＲ−ＳＯ３−を有するマトリックスを含む第一のカチオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドが上記カラムに結合する条件下で適用する工程；
（ｅ）上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドを、非分離条件下で溶出して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物を提供する工程；
（ｆ）上記工程（ｅ）からのＡＡＶ調製物を、第二のカチオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドが上記カラムに結合する条件下で適用する工程；
（ｇ）低塩緩衝液を、上記工程（ｆ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出されＡＡＶの空キャプシドが上記カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｈ）ＡＡＶベクター粒子を含む工程（ｇ）からの溶出画分を収集する工程；
（ｉ）上記工程（ｈ）からの画分を、アニオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドが存在する場合には上記カラムに結合する条件下で、適用する工程；
（ｊ）低塩緩衝液を、上記工程（ｉ）からのカラムに対して、ＡＡＶの空キャプシドが溶出されＡＡＶベクター粒子が上記カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｋ）高塩緩衝液を、上記工程（ｊ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出される条件下で添加する工程；ならびに
（ｌ）ＡＡＶベクター粒子を含む上記工程（ｋ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
を包含する。
別の実施形態において、本発明は、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物からＡＡＶベクター粒子を精製して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供するための方法に関する。上記方法は、
（ａ）ＡＡＶベクター粒子を含む宿主細胞を提供する工程；
（ｂ）上記宿主細胞を溶解して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含む粗細胞溶解物を得る工程；
（ｃ）上記粗細胞溶解物を、カチオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドが上記カラムに結合する条件下で適用する工程；
（ｄ）上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドを、非分離条件下で溶出して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物を提供する工程；
（ｅ）上記工程（ｄ）からのＡＡＶ調製物を、アニオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドが上記カラムに結合する条件下で適用する工程；
（ｆ）低塩緩衝液を、上記工程（ｅ）からのカラムに対して、ＡＡＶの空キャプシドが溶出されＡＡＶベクター粒子が上記カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｇ）高塩緩衝液を、上記工程（ｆ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出される条件下で添加する工程；
（ｈ）ＡＡＶベクター粒子を含む工程（ｇ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
を包含する。
さらなる実施形態において、上記方法は、
（ｉ）上記工程（ｈ）からのＡＡＶ調製物を、第二のアニオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドが存在する場合には上記カラムに結合する条件下で、適用する工程；
（ｊ）低塩緩衝液を、上記工程（ｉ）からのカラムに対して、ＡＡＶの空キャプシドが溶出されＡＡＶベクター粒子が上記カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｋ）高塩緩衝液を、上記工程（ｊ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出される条件下で添加する工程；
（ｌ）ＡＡＶベクター粒子を含む上記工程（ｋ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
をさらに包含する。
代替的な実施形態において、上記方法は、
（ｉ）上記工程（ｈ）からのＡＡＶ調製物を、第二のカチオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、上記ＡＡＶベクター粒子および上記ＡＡＶの空キャプシドが上記カラムに結合する条件下で、適用する工程；
（ｊ）低塩緩衝液を、上記工程（ｉ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出されＡＡＶの空キャプシドが上記カラムに結合したままである条件下で添加する工程；ならびに
（ｋ）ＡＡＶベクター粒子を含む上記工程（ｊ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
をさらに包含する。
上記の方法すべての特定の実施形態において、上記第一のカチオン交換カラムおよび／または第二のカチオン交換カラムは、カルボキシメチル化マトリックスまたはスルホン化マトリックス（例えば、機能的リガンドＲ−ＳＯ３−を含むマトリックス）を含む。
上記の方法すべてのさらなる実施形態において、上記ＡＡＶベクター粒子は、上記ＡＡＶ生成物中に少なくとも５０％の量（例えば少なくとも７５％の量、例えば少なくとも８５％または少なくとも９０％の量）で存在する。
上記の方法すべてのなおさらなる実施形態において、上記ＡＡＶベクター粒子は、ＡＡＶ−２またはＡＡＶ−５に由来する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物からＡＡＶベクター粒子を精製して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供するための方法であって、該方法は、
（ａ）ＡＡＶベクター粒子を含む宿主細胞を提供する工程；
（ｂ）該宿主細胞を溶解して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含む粗細胞溶解物を得る工程；
（ｃ）該粗細胞溶解物を、第一のカチオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、該ＡＡＶベクター粒子および該ＡＡＶの空キャプシドが該カラムに結合する条件下で適用する工程；
（ｄ）該ＡＡＶベクター粒子および該ＡＡＶの空キャプシドを、非分離条件下で溶出して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物を提供する工程；
（ｅ）該工程（ｄ）からのＡＡＶ調製物を、第二のカチオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、該ＡＡＶベクター粒子および該ＡＡＶの空キャプシドが該カラムに結合する条件下で適用する工程；
（ｆ）低塩緩衝液を、該工程（ｅ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出されＡＡＶの空キャプシドが該カラムに結合したままである条件下で添加する工程；ならびに
（ｇ）ＡＡＶベクター粒子を含む該工程（ｆ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
項目１に記載の方法であって、前記第一のカチオン交換カラムは、カルボキシメチル化マトリックスまたはスルホン化マトリックスを含む、方法。
（項目３）
項目２に記載の方法であって、前記マトリックスは、機能的リガンドＲ−ＳＯ３−を含む、方法。
（項目４）
項目１に記載の方法であって、前記第二のカチオン交換カラムは、カルボキシメチル化マトリックスまたはスルホン化マトリックスを含む、方法。
（項目５）
項目４に記載の方法であって、前記マトリックスは、機能的リガンドＲ−ＳＯ３−を含む、方法。
（項目６）
項目１に記載の方法であって、
（ｈ）前記工程（ｇ）からの画分を、アニオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、前記ＡＡＶベクター粒子および前記ＡＡＶの空キャプシドが存在する場合には該カラムに結合する条件下で、適用する工程；
（ｉ）低塩緩衝液を、該工程（ｈ）からのカラムに対して、ＡＡＶの空キャプシドが溶出されＡＡＶベクター粒子が該カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｊ）高塩緩衝液を、該工程（ｉ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出される条件下で添加する工程；
（ｋ）ＡＡＶベクター粒子を含む該工程（ｊ）からの画分を収集して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
をさらに包含する、方法。
（項目７）
ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物からＡＡＶベクター粒子を精製して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供するための方法であって、該方法は、
（ａ）ＡＡＶベクター粒子を含む宿主細胞を提供する工程；
（ｂ）該宿主細胞を溶解して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含む粗細胞溶解物を得る工程；
（ｃ）該粗細胞溶解物を清澄化して、清澄化した細胞溶解物を提供する工程；
（ｄ）該清澄化した細胞溶解物を、機能的リガンドＲ−ＳＯ３−を有するマトリックスを含む第一のカチオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、該ＡＡＶベクター粒子および該ＡＡＶの空キャプシドが該カラムに結合する条件下で適用する工程；
（ｅ）該ＡＡＶベクター粒子および該ＡＡＶの空キャプシドを、非分離条件下で溶出して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物を提供する工程；
（ｆ）該工程（ｅ）からのＡＡＶ調製物を、第二のカチオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、該ＡＡＶベクター粒子および該ＡＡＶの空キャプシドが該カラムに結合する条件下で適用する工程；
（ｇ）低塩緩衝液を、該工程（ｆ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出されＡＡＶの空キャプシドが該カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｈ）ＡＡＶベクター粒子を含む工程（ｇ）からの溶出画分を収集する工程；
（ｉ）該工程（ｈ）からの画分を、アニオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、該ＡＡＶベクター粒子および該ＡＡＶの空キャプシドが存在する場合には該カラムに結合する条件下で、適用する工程；
（ｊ）低塩緩衝液を、該工程（ｉ）からのカラムに対して、ＡＡＶの空キャプシドが溶出されＡＡＶベクター粒子が該カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｋ）高塩緩衝液を、該工程（ｊ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出される条件下で添加する工程；ならびに
（ｌ）ＡＡＶベクター粒子を含む該工程（ｋ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
を包含する、方法。
（項目８）
ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物からＡＡＶベクター粒子を精製して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供するための方法であって、該方法は、
（ａ）ＡＡＶベクター粒子を含む宿主細胞を提供する工程；
（ｂ）該宿主細胞を溶解して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含む粗細胞溶解物を得る工程；
（ｃ）該粗細胞溶解物を、カチオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、該ＡＡＶベクター粒子および該ＡＡＶの空キャプシドが該カラムに結合する条件下で適用する工程；
（ｄ）該ＡＡＶベクター粒子および該ＡＡＶの空キャプシドを、非分離条件下で溶出して、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとを含むＡＡＶ調製物を提供する工程；
（ｅ）該工程（ｄ）からのＡＡＶ調製物を、アニオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、該ＡＡＶベクター粒子および該ＡＡＶの空キャプシドが該カラムに結合する条件下で適用する工程；
（ｆ）低塩緩衝液を、該工程（ｅ）からのカラムに対して、ＡＡＶの空キャプシドが溶出されＡＡＶベクター粒子が該カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｇ）高塩緩衝液を、該工程（ｆ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出される条件下で添加する工程；
（ｈ）ＡＡＶベクター粒子を含む工程（ｇ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
を包含する、方法。
（項目９）
項目８に記載の方法であって、
（ｉ）前記工程（ｈ）からのＡＡＶ調製物を、第二のアニオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、前記ＡＡＶベクター粒子および前記ＡＡＶの空キャプシドが存在する場合には該カラムに結合する条件下で、適用する工程；
（ｊ）低塩緩衝液を、該工程（ｉ）からのカラムに対して、ＡＡＶの空キャプシドが溶出されＡＡＶベクター粒子が該カラムに結合したままである条件下で添加する工程；
（ｋ）高塩緩衝液を、該工程（ｊ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出される条件下で添加する工程；
（ｌ）ＡＡＶベクター粒子を含む該工程（ｋ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
をさらに包含する、方法。
（項目１０）
項目８に記載の方法であって、
（ｉ）前記工程（ｈ）からのＡＡＶ調製物を、第二のカチオン交換クロマトグラフィーカラムに対して、前記ＡＡＶベクター粒子および前記ＡＡＶの空キャプシドが該カラムに結合する条件下で、適用する工程；
（ｊ）低塩緩衝液を、該工程（ｉ）からのカラムに対して、ＡＡＶベクター粒子が溶出されＡＡＶの空キャプシドが該カラムに結合したままである条件下で添加する工程；ならびに
（ｋ）ＡＡＶベクターを含む該工程（ｊ）からの溶出画分を収集して、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供する工程、
をさらに包含する、方法。
（項目１１）
項目１〜１０のうちのいずれか１項に記載の方法であって、ＡＡＶベクター粒子は、前記ＡＡＶ生成物中に少なくとも７５％の量で存在する、方法。
（項目１２）
項目１〜１０のうちのいずれか１項に記載の方法であって、ＡＡＶベクター粒子は、前記ＡＡＶ生成物中に少なくとも８５％の量で存在する、方法。
（項目１３）
項目１〜１０のうちのいずれか１項に記載の方法であって、ＡＡＶベクター粒子は、前記ＡＡＶ生成物中に少なくとも９０％の量で存在する、方法。
（項目１４）
項目１〜１０のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ＡＡＶベクター粒子は、ＡＡＶ−２に由来する、方法。
（項目１５）
項目１〜１０のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ＡＡＶベクター粒子は、ＡＡＶ−５に由来する、方法。
本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、本明細書中の開示を考慮すると当業者には容易に思い浮かぶ。
図１Ａおよび１Ｂは、ＡＡＶベクター粒子およびＡＡＶ空キャプシドの両方を含む粗溶解物の結合特徴を示す。図１Ａにおいて、試験した樹脂は、以下の通りであった：レーン１：コントロール；レーン２および３：ＭＡＣＲＯ ＰＲＥＰ Ｑ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡから入手可能な強アニオン交換体）；レーン４および５：ＵＮＯＳＰＨＥＲＥ Ｑ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡから入手可能な強アニオン交換体）；レーン６および７：ＰＯＲＯＳ ５０ＨＱ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能な強アニオン交換体）；レーン８および９：ＰＯＲＯＳ ５０Ｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能な弱アニオン交換体）。図１Ｂにおいて、試験した樹脂は、以下の通りであった：レーン１：コントロール；レーン２および３：ＰＯＲＯＳ ５０ＰＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能な弱アニオン交換体）；レーン４および５：ＳＯＵＲＣＥ ３０Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能な強アニオン交換体）；レーン６および７：ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能な弱アニオン交換体）；レーン８および９：Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能な強アニオン交換体）。図１Ａおよび１Ｂの両方について、レーン２、４、６および８は、低塩（５０ｍＭ ＮａＣｌ）洗浄画分を使用し；レーン３、５、７および９は、高塩（１Ｍ ＮａＣｌ）洗浄画分を使用した。 図２は、実施例において記載されるように、アニオン交換クロマトグラフィーを使用して分離する前および分離した後の、ＡＡＶ空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子（Ｖｇｓ）の分析を示す。 図３は、実施例において記載されるように、アニオン交換カラムからの画分の銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１：ＡＡＶベクター粒子；レーン２〜５：ベクター溶出画分；レーン６：タンパク質分子量標準物質。 図４は、実施例に記載されるように、カチオン交換カラムからの溶出画分（レーン１２〜２１）を示す銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。 図５は、カチオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて、ＡＡＶベクター粒子からＡＡＶ空粒子を分離することを示す、銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１：出発物質；レーン２〜４：カチオン交換カラムから溶出したベクターの３つの独立したサンプル。
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、別段記載されなければ、ウイルス学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用し、これらの方法は、当該分野の技術範囲内である。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（最新版）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．（Ｎ．Ｇａｉｔ，編，最新版）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，編，最新版）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，編、最新版）；ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，編）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，編）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，第３版）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌら（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ）を参照のこと。
（１．定義）
本発明を記載するにあたって、以下の用語が使用され、以下に示されるように定義されると解釈される。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のことを示さなければ、複数形の指示対象を包含することに注意しなければならない。従って、例えば、「（１つの）パッケージされたキャプシド」への言及は、２つ以上のこのようなキャプシドの混合物などを包含する。
「ベクター」とは、任意の遺伝的エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなど）を意味し、これらは、適切な制御エレメントと会合した場合に複製し得、細胞間で遺伝子配列を運び得る。従って、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含する。
「ＡＡＶベクター」とは、以下の（しかし、それらの限定されない）アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを意味する：ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７およびＡＡＶ−８。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ野生型遺伝子のうちの１つ以上（好ましくはｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子）が、全てまたは一部欠失されているが、機能的隣接ＩＴＲ配列を保持している。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングに必要である。従って、ＡＡＶベクターは、ウイルスの複製およびパッケージングに、シスで必要とされる少なくともそれらの配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を含むことが、本明細書で規定される。このＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、その配列が、機能的レスキュー、複製およびパッケージングを提供する限りにおいて、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失もしくは置換によって改変されていてもよい。
「ＡＡＶヘルパー機能」とは、ＡＡＶ遺伝子生成物（これは、次に、生産的なＡＡＶ複製のためにトランスで機能する）を提供するように発現され得るＡＡＶ由来のコード配列をいう。従って、ＡＡＶヘルパー機能は、主要ＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ｒｅｐおよびｃａｐをともに含む。このＲｅｐ発現生成物は、多くの機能（とりわけ、以下が挙げられる：ＡＡＶ ＤＮＡ複製起点の認識、結合およびニック形成；ＤＮＡヘリカーゼ活性；ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節）を有することが示された。このＣａｐ発現生成物は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターから失われているトランスでのＡＡＶ機能を補完するために、本明細書で用いられる。
用語「ＡＡＶヘルパー構築物」は、一般に、ＡＡＶベクター（これは、目的のヌクレオチド配列を送達するための導入ベクターを生成するために使用される）から欠失されたＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子をいう。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子の一過性の発現を提供して、失われている、ＡＡＶ複製に必須のＡＡＶ機能を補完するために一般に使用される；しかし、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ ＩＴＲを欠いており、それら自体では、複製もパッケージングもすることができない。ＡＡＶヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンの形態であり得る。多くのＡＡＶヘルパー構築物（例えば、一般的に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９＋４５）が記載されており、これらは、Ｒｅｐ発現生成物およびＣａｐ発現生成物の両方をコードする。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；およびＭｃＣａｒｔｙら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６−２９４５を参照のこと。多くの他のベクターが記載されており、これらは、Ｒｅｐ発現生成物および／またはＣａｐ発現生成物をコードする。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号および同第６，３７６，２３７号を参照のこと。
用語「補助機能」とは、ＡＡＶが、その複製に関して依存性である、非ＡＡＶ由来のウイルス機能および／または細胞機能をいう。従って、この用語は、ＡＡＶ複製に必要とされるタンパク質およびＲＮＡ（ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現生成物の合成ならびにＡＡＶキャプシドアセンブリに関与する部分を含む）を表す。ウイルスベースの補助機能は、既知のヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）およびワクシニアウイルス）のいずれかに由来し得る。
用語「補助機能ベクター」とは、一般に、補助機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子をいう。補助機能ベクターは、適切な宿主細胞にトランスフェクトされ得る。ここで、このベクターは、次いで、この宿主細胞におけるＡＡＶビリオン生成を支援し得る。この用語から明示的に除外されるのは、天然に存在するままの感染性ウイルス粒子（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルスの粒子である。従って、補助機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、またはコスミドの形態であり得る。特に、アデノウイルス遺伝子の完全な補完が、補助ヘルパー機能に必ずしも必須でないことが実証された。例えば、ＤＮＡ複製および後期遺伝子合成ができないアデノウイルス変異体は、ＡＡＶ複製に許容されることが示された。Ｉｔｏら，（１９７０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９：２４３；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら（１９７１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：３１７。同様に、Ｅ２Ｂ領域およびＥ３領域内の変異は、ＡＡＶ複製を支援することが示され、このことは、このＥ２Ｂ領域およびＥ３領域が、補助機能を提供することにおそらく関与しないことを示す。Ｃａｒｔｅｒら（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５。しかし、Ｅ１領域を欠いたアデノウイルスまたはＥ４領域が欠失したアデノウイルスは、ＡＡＶ複製を支援することができない。従って、Ｅ１Ａ領域またはＥ４領域は、直接的にせよ間接的にせよ、ＡＡＶ複製に必要とされるようである。Ｌａｕｇｈｌｉｍら（１９８２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１：８６８；Ｊａｎｉｋら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８；１９２５；Ｃａｒｔｅｒら（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５。他の特徴づけられたＡｄ変異体は、以下を含む：Ｅ１Ｂ（Ｌａｕｇｈｌｉｍら（１９８２）前出；Ｊａｎｉｋら（１９８１）前出；Ｏｓｔｒｏｖｅら（１９８０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１０４：５０２）；Ｅ２Ａ（Ｈａｎｄａら（１９７５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２９：２３９；Ｓｔｒａｕｓｓら（１９７６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７：１４０；Ｍｙｅｒｓら（１９８０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６６５；Ｊａｙら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２９２７；Ｍｙｅｒｓら（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：５６７）；Ｅ２Ｂ（Ｃａｒｔｅｒ，Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｉ ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編、１９９０））；Ｅ３（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３）前出）；Ｅ４（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３）前出；Ｃａｒｔｅｒ（１９９５））。Ｅ１Ｂコード領域に変異を有するアデノウイルスによって提供される補助機能の研究により、矛盾する結果がもたらされたが、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２０６−２１０は、近年、Ｅ１Ｂ５５ｋが、ＡＡＶビリオン生成に必須である一方で、Ｅ１Ｂ１９ｋは必須でないことを報告した。さらに、国際公開ＷＯ９７／１７４５８およびＭａｔｓｈｕｓｈｉｔａら（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：９３８−９４５は、種々のＡｄ遺伝子をコードする補助機能ベクターを記載する。
特に好ましい補助機能ベクターは、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡコード領域、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ ７２ｋＤコード領域、アデノウイルスＥ１Ａコード領域、およびインタクトなＥ１Ｂ５５ｋコード領域を欠くアデノウイルスＥ１Ｂ領域を含む。このようなベクターは、国際公開番号ＷＯ０１／８３７９７に記載される。
「組換えウイルス」とは、例えば、異種核酸構築物を付加するかまたはこの構築物を粒子に挿入することによって遺伝的に改変されたウイルスを意味する。
「ＡＡＶビリオン」とは、完全なウイルス粒子（例えば、野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子（ＡＡＶキャプシドタンパク質コードと会合した直鎖状の一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む））を意味する。この点に関して、いずれかの相補的センス（例えば、「センス」鎖または「アンチセンス」鎖）の一本鎖ＡＡＶ核酸分子は、いずれか１つのＡＡＶビリオンにパッケージングされ得、両方の鎖は、等しく感染性である。
用語「組換えＡＡＶビリオン」、「ｒＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶベクター粒子」、「完全キャプシド」、「完全体」または「完全粒子」とは、ＡＡＶ ＩＴＲが両側に隣接している、目的の異種ヌクレオチド配列をキャプシドに包んでいる、ＡＡＶタンパク質殻を含む感染性の複製欠損ウイルスとして本明細書中に規定される。ｒＡＡＶビリオンは、そこに導入されるＡＡＶベクターを特定する配列、ＡＡＶヘルパー機能および補助機能を有している適切な宿主細胞において生成される。このようにして、この宿主細胞は、その後の遺伝子送達のための感染性組換えビリオン粒子へのＡＡＶベクター（目的の組換えヌクレオチド配列を含む）のパッケージングに必要とされるＡＡＶポリペプチドをコードできるようにされる。
用語「空キャプシド」、「空粒子」、および「空」とは、ＡＶＶタンパク質の殻を含むが、ＡＡＶ ＩＴＲが両側に隣接した目的の異種ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド構築物の全体または一部を欠く、ＡＡＶビリオンをいう。従って、この空キャプシドは、目的の遺伝子を宿主細胞へと移入するためには機能しない。
用語「宿主細胞」は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶベクタープラスミド、補助機能ベクター、または他の移入ＤＮＡのレシピエントとして用いられ得るかまたは用いられた、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を示す。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を包含する。従って、「宿主細胞」は、本明細書中で用いられる場合、一般に、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞をいう。単一の親細胞の子孫が、自然変異、偶発変異または意図的変異に起因して、元の親と形態またはゲノムＤＮＡ相補体もしくはＤＮＡ相補体全体において必ずしも完全に同一というわけではないことが理解される。
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを言及するために用いられ、そして細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されている場合、「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が当該分野で一般に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｌｏｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照のこと。このような技術を用いて、１以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞へと導入し得る。
本明細書中で用いられる場合、用語「細胞株」とは、連続増殖または長期増殖および分裂をインビトロで行い得る細胞集団をいう。しばしば、細胞株は、単一の子孫細胞に由来するクローン集団である。このようなクローン集団の保存または継代の間の核型における自然変化または誘導された変化が生じ得ることがさらに当該分野で公知である。それゆえ、言及される細胞株に由来する細胞は、先祖細胞または先祖培養物と正確には同一ではないかもしれず、そして言及される細胞株は、このような改変体を包含する。
ＡＡＶベクター粒子（パッケージングされたゲノム）を含むｒＡＡＶビリオンのストックまたは調製物は、ストック中に存在するビリオンのうちの少なくとも約５０％〜９９％以上が、パッケージングされたゲノムを含むｒＡＡＶビリオン（すなわち、ＡＡＶベクター粒子）である場合、ＡＡＶの空キャプシドを「実質的に含まない」。好ましくは、このＡＡＶベクター粒子は、ストック中に存在するビリオンのうちの、少なくとも約７５％〜８５％、より好ましくは約９０％を構成し、さらにより好ましくは少なくとも約９５重量％、またはさらにはストック中に存在するビリオンのうちの９９重量％以上、またはこれらの範囲の間の任意の整数を構成する。従って、ストックは、得られるストックの約４０％〜約１％以下、好ましくは約２５％〜約１５％以下、さらに好ましくは約１０％以下、さらにより好ましくは約５％〜約１％以下が空キャプシドを含む場合、ＡＡＶの空キャプシドを実質的に含まない。
「核酸」配列とは、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をいう。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログ（例えば、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プロイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｂウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリンであるがこれらに限定されない）のいずれかを含む配列を含む。
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コード」する配列は、適切な制御配列の制御下においた場合に、インビボで、（ＤＮＡの場合）転写される、および（ｍＲＮＡの場合）ポリペプチドへと翻訳される、核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端における翻訳停止コドンによって決定される。転写終結配列は、コード配列の３’側に配置され得る。
用語ＤＮＡ「制御配列」とは、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写および翻訳をまとまって提供する、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどをまとめていう。選択されたコード配列が、適切な宿主細胞において複製され得、転写され得、そして翻訳され得る限り、これらの制御配列の全てがいつも存在する必要があるわけではない。
用語「プロモーター」は、本明細書中で、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を言及するために、その元々の意味で用いられ、ここで、この調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し得かつ下流の（３’方向の）コード配列の転写を開始し得る遺伝子に由来する。転写プロモーターは、「誘導性プロモーター」（ここで、このプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、「抑制性プロモーター」（ここで、このプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）および「構成性プロモーター」を包含し得る。
「作動可能に連結される」とは、そのように記載される成分がそれらの通常の機能を果たすように構成された構成要素の再配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現をもたらしえる。この制御配列は、その発現を導くように機能する限り、コード配列と連続する必要はない。従って、例えば、介在する、転写されるが翻訳されない配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてプロモーター配列は、なおも、コード配列に「作動可能に連結され」ていると考えられる。
本出願全体で特定の核酸分子中でのヌクレオチド配列の相対位置を記載する目的で、例えば、特定のヌクレオチド配列が別の配列に対して「上流」、「下流」、「３’」、または「５’」に位置することが記載されている場合、これは、当該分野で慣習的であるように言及されるＤＮＡ分子の「センス」鎖または「コーディング」鎖におけるこの配列の位置であると理解されるべきである。
用語「異種」とは、核酸配列（例えば、コード配列および制御配列）に関する場合、通常は一緒に連結していない配列、および／または特定の細胞に通常は関連していない配列を示す。従って、核酸構築物またはベクターのうちの「異種」領域は、他の分子とは天然で関連して見出されない別の核酸分子内のまたは別の核酸分子に結合した核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物のうちの異種領域は、コード配列と天然では関連して見出されない配列が隣接したコード配列を含み得る。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が天然には見出されない構築物である（例えば、ネイティブ遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。同様に、細胞中に通常は存在しない構築物で形質転換された細胞は、本発明の目的では異種であると考えられる。対立遺伝子改変体または天然に存在する変異事象は、本明細書中で用いられる場合、異種ＤＮＡを生じない。
「単離された」によって、ヌクレオチド配列を言及する場合、同一の分子が同じ型の他の生物学的高分子が実質的に存在せずに、存在することを意味する。従って、「特定のポリペプチドをコードする単離された核酸分子」とは、対象のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子をいう；しかし、この分子は、その組成物の基本的特徴に有害な影響を与えない、いくつかのさらなる塩基または部分を含み得る。
（２．発明を実施する形態）
本発明を詳細に記載する前に、特定の処方または特定のプロセスのパラメーターももちろん変化し得るので、本発明が特定の処方にも特定のプロセスのパラメーターにも限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語は、単に本発明の特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、限定することを意図していないこともまた理解されるべきである。
本明細書中に記載される方法および材料と類似するかまたは等価な多数の方法および材料が本発明の実施において用いられ得るが、好ましい材料および方法は、本明細書中に記載される。
本発明は、ＡＡＶビリオンの精製ストック中に含まれるＡＡＶの空キャプシドの数を、その中に含まれるＡＡＶベクター粒子の損失を最少にしながらも、減らすかまたは除去することを包含する。本発明の方法は、ｒＡＡＶビリオンが精製されるプロセスと関係なく用いられ得る。
ｒＡＡＶビリオンを生成するために当該分野で周知のいくつかの方法が存在する；例えば、ＡＡＶヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス）のうちの１つとの同時感染を伴う、ベクターおよびＡＡＶヘルパー配列を用いたトランスフェクション、または組換えＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパーベクター、および補助機能ベクターを用いたトランスフェクション。ｒＡＡＶビリオンを生成するための方法の詳細な記載については、米国特許第６，００１，６５０号および同第６，００４，７９７号を参照のこと。
例えば、野生型ＡＡＶウイルスおよびヘルパーウイルスは、ｒＡＡＶビリオンを生成するための必要な複製機能を提供するために用いられ得る（例えば、米国特許第５．１３９，９４１号を参照のこと）。あるいは、周知のヘルパーウイルスのうちの１つによる感染に伴ったヘルパー機能遺伝子を含むプラスミドは、複製機能の供給源として用いられ得る（例えば、米国特許第５，６２２，８５６号および同第５，１３９，９４１号を参照のこと）。同様に、補助機能遺伝子を含むプラスミドは、野生型ＡＡＶによる感染と組み合わせて用いられて必要な複製機能を提供し得る。これらの３つのアプローチは、ｒＡＡＶベクターと関連して組み合わされた場合、各々、ｒＡＡＶビリオンを生成するために充分である。他のアプローチは、当該分野で周知であり、そしてまた、ｒＡＡＶビリオンを生成するために当業者に用いられ得る。
本発明の好ましい実施形態では、三重トランスフェクション法（米国特許第６，００１，６５０号に詳細に記載される）を用いて、ｒＡＡＶビリオンが生成される。なぜなら、この方法は、感染性ヘルパーウイルスの使用を必要とせずに、ｒＡＡＶビリオンが、検出可能なヘルパーウイルスが全く存在せずに生成されるのを可能にするからである。これは、ｒＡＡＶビリオン生成のための３つのベクター（ＡＡＶヘルパー機能ベクター、補助機能ベクター、およびｒＡＡＶ発現ベクター）の使用によって達成される。しかし、当業者は、これらのベクターによってコードされる核酸配列が種々の組合せの２以上のベクター上で提供され得ることを理解する。
本明細書中に説明したように、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、生産的ＡＡＶ複製およびキャプシド形成のためにトランスで機能する「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードする。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、検出可能なｗｔＡＡＶビリオンを全く生成することなく、効率的なＡＡＶベクター（すなわち、機能的なｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶビリオン）生成を支持する。このようなベクターの一例であるｐＨＬＰ１９は、米国特許第６，００１，６５０号に記載される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、上記で説明したように、公知のＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。例えば、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、ＡＡＶ−２由来のｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ−６由来のｃａｐ遺伝子を有し得る；当業者は、他のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の組合せが可能であり、定義する特徴がｒＡＡＶビリオン生成を支持する能力であることを認識する。
補助機能ベクターは、ＡＡＶが複製を依存する非ＡＡＶ由来ウイルス機能および／または細胞機能（すなわち、補助機能）についてのヌクレオチド配列をコードする。補助機能は、ＡＡＶ複製に必要とされる機能（ＡＡＶ遺伝子の転写、段階特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶキャプシドアセンブリの活性化に関与する部分が挙げられるがこれらに限定されない）を包含する。ウイルスベースの補助機能は、周知のヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（１型単純疱疹ウイルス以外）、およびワクシニアウイルス）のいずれかに由来し得る。好ましい実施形態では、補助機能プラスミドｐＬａｄｅｎｏ５が用いられる（ｐＬａｄｅｎｏ５に関する詳細は、米国特許第６，００４，７９７号に記載される）。このプラスミドは、ＡＡＶベクター生成についてのアデノウイルス補助機能の完全なセットを提供するが、複製能力があるアデノウイルスを形成するために必要な成分を欠いている。
一旦ＡＡＶビリオンのストックが生成されると、多数の方法（以下に詳述される）を用いて、感染性力価が決定され得、そしてＡＡＶの空キャプシドからＡＡＶベクター粒子が精製され得る。
本発明をさらに理解するために、より詳細な考察を、組換えＡＡＶ発現ベクター、ＡＡＶヘルパーおよび補助機能、ＡＡＶビリオンを含む組成物、ならびにビリオンの送達に関して以下に提供する。
（組換えＡＡＶ発現ベクター）
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）発現ベクターは、制御エレメント（転写開始領域を含む）、目的のポリヌクレオチド、および転写末端領域を転写の方向に作動可能に連結した成分として提供するように、公知の技術を使用して構築される。この制御エレメントは、目的の宿主細胞において機能的であるように選択される。作動可能に連結した成分を含む、結果の構築物は、機能性ＡＡＶ ＩＴＲ配列と結合される（５’および３’）。
ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は公知である。たとえば、ＡＡＶ−２配列については、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版，（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ（編））を参照のこと。本発明のベクターで使用されるＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって変化され得る。加えて、ＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ抗原型（ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、およびＡＡＶ−８などが挙げられるが、これらに限定されない）のいずれかに由来し得る。さらに、５’および３’のＩＴＲは、ＡＡＶ発現ベクター中の選択されたヌクレオチド配列に隣接し、それらが意図されるように機能する限り（すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの所定の配列の切断およびレスキューを可能にし、そして、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が受容細胞に存在する場合、受容細胞ゲノム中にＤＮＡ分子を組込むことを可能にする）、必ずしも同一である必要はなく、同一のＡＡＶ抗原型または単離物に由来する必要もない。
ＡＡＶベクターに使用するために適切なポリヌクレオチド分子は、約５キロベース（ｋｂ）未満の大きさである。選択されるポリヌクレオチド配列は、インビボで被験体におけるそれらの転写または発現を方向付ける制御エレメントに作動可能に連結される。このような制御エレメントは、通常、選択遺伝子に関連する制御配列を含み得る。あるいは、異種制御配列が、使用され得る。一般的に、有用な異種制御配列は、哺乳動物遺伝子またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来する制御配列を含む。例としては、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ））、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、非ウイルス遺伝子由来の配列（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子）もまた、本明細書中で使用を見出す。このようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されている。
上記ＡＡＶ発現ベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲによって結合される目的のポリヌクレオチド分子を含み、ＡＡＶゲノムから切断される主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を有するＡＡＶゲノム中に選択配列を直接挿入することによって、構築され得る。ＡＡＶゲノムの他の部分はまた、複製およびパッケージング機能を可能にするようにＩＴＲの十分な部分が残る場合に限り、削除され得る。このような構築物は、当該分野で周知の技術を使用して設計され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）およびＷＯ ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
あるいは、ＡＡＶ ＩＴＲは、ウイルスゲノムからか、または別のベクター中に存在する、選択核酸構築物の同一で融合された５’および３’を含むＡＡＶベクターから、標準的なライゲーション技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出に記載される）を使用して切断され得る。例えば、ライゲーションは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０℃における４０μＭ ＡＴＰ、０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（「付着末端」ライゲーション用）か、または１４℃における１ｍＭ ＡＴＰ、０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）単位 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（「平滑末端」ライゲーション用）において達成され得る。分子内の「付着末端」ライゲーションは、通常、３０〜１００μｇ／ｍｌの総ＤＮＡ濃度（総最終濃度５〜１００ｎＭ）において実行される。ＩＴＲを含むＡＡＶベクターは、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号に記載されている。特に、いくつかのＡＡＶベクターが上記特許明細書中に記載され、アメリカン タイプ カルチャー コレクション（「ＡＴＣＣ」）から入手可能である（受託番号５３２２２、５３２２３、５３２２４、５３２２５および５３２２６）。
本発明の目的のために、ＡＡＶ発現ベクターからｒＡＡＶビリオンを生成するために適切な宿主細胞としては、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。これらの細胞は、異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして使用され得るかもしくは使用されており、例えば、浮遊培養物、バイオリアクターなどで増殖し得る。この用語は、トランスフェクトされたもとの細胞の子孫を含む。従って、本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」は、一般的に、外因性ＤＮＡ配列によってトランスフェクトされた細胞をいう。安定なヒト細胞株である２９３（例えば、アメリカン タイプ カルチャー コレクション（受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）を通じて容易に入手可能）由来の細胞が、本発明の実施において好ましい。特に、ヒト細胞株２９３は、アデノウイルス５型のＤＮＡフラグメントでトランスフェクトされたヒト胚性腎細胞株であり（Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）、アデノウイルスのＥ１ａ遺伝子およびＥ１ｂ遺伝子を発現する（Ａｉｅｌｌｏら（１９７９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９４：４６０）。上記２９３細胞株は、容易にトランスフェフェクトされ、ｒＡＡＶビリオンを生成する特に都合のよいプラットフォームを提供する。
（ＡＡＶヘルパー機能）
上記ＡＡＶ発現ベクターを含む宿主細胞は、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接して、ｒＡＡＶビリオンを生成するためのヌクレオチド配列を複製し、そしてキャプシド形成するために、ＡＡＶヘルパー機能を提供し得なければならない。ＡＡＶヘルパー機能は、一般に、ＡＡＶに由来するコード配列である。この配列は、順生産的なＡＡＶ複製のためにトランスで機能するＡＡＶ遺伝子産物を提供するように発現され得る。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書中で、ＡＡＶ発現ベクターから失われる必須のＡＡＶ機能を補完するために使用される。従って、ＡＡＶヘルパー機能は、主要なＡＡＶ ＯＲＦ（すなわち、ｒｅｐコード領域およびｃａｐコード領域）の１つもしくは両方、またはそれらの機能的ホモログを含む。
「ＡＡＶ ｒｅｐコード領域」によって、複製タンパク質のＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムのａｒｔ認識（ａｒｔ−ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ）領域が意味される。これらのＲｅｐ発現産物は、多くの機能（ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合、およびニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む）を有することが示されている。このＲｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムを複製するために集合的に必要とされる。ＡＡＶのｒｅｐコード領域の記載については、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；およびＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１を参照のこと。ＡＡＶのｒｅｐコード領域の適切なホモログとしては、ＡＡＶ−２のＤＮＡ複製を媒介することもまた公知であるヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子が挙げられる（Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０４：３０４−３１１）。
「ＡＡＶ ｃａｐコード領域」によって、キャプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードするＡＡＶゲノムのａｒｔ認識領域、またはそれらの機能的ホモログが意味される。これらのＣａｐ発現産物は、ウイルスゲノムのパッケージングのために集合的に必要とされるパッケージング機能を与える。ＡＡＶ ｃａｐコード領域の記載については、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．およびＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（前出）を参照のこと。
ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターのトランスフェクションの前か、または同時に、ＡＡＶヘルパー構築物を用いて宿主細胞をトランスフェクトすることによって、宿主細胞中に導入される。従って、ＡＡＶヘルパー構築物が使用され、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子の、少なくとも一過性の発現を提供し、生産的なＡＡＶ感染のために必須の失われたＡＡＶ機能を補完する。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ ＩＴＲを欠き、それ自体を複製もパッケージングもし得ない。
これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンの形態であり得る。多くのＡＡＶヘルパー構築物（例えば、共通に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびＲｅｐとＣａｐとの両方の発現産物をコードするｐＩＭ２９＋４５）が記載されている。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；およびＭｃＣａｒｔｙら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６−２９４５を参照のこと。Ｒｅｐおよび／またはＣａｐの発現産物をコードする多くの他のベクターが、記載されている。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号を参照のこと。
（ＡＡＶ補助機能）
宿主細胞（またはパッケージング細胞）はまた、ｒＡＡＶビリオンを生成するために、非ＡＡＶの機能、または「補助機能（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」を提供され得なければならない。補助機能は、ＡＡＶがその複製のために依存する、非ＡＡＶ由来のウイルス機能および／または細胞機能である。従って、補助機能としては、ＡＡＶ複製（ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的なＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成およびＡＡＶキャプシド集合に関係する機能を含む）の際に必要とされる、少なくともこれらの非ＡＡＶタンパク質およびＲＮＡが挙げられる。ウイルスベースの補助機能は、任意の公知のヘルパーウイルスに由来し得る。特に、補助機能は、当業者に公知の方法を使用して宿主細胞に導入され得、次いで宿主細胞中で発現される。代表的には、補助機能は、宿主細胞を関連のないヘルパーウイルスに感染させることによって提供される。多くの適切なヘルパーウイルスが公知である。これらとしては、アデノウイルス；ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型）；およびワクシニアウイルスが挙げられる。非ウイルス性の補助機能（例えば、種々の公知の薬剤のいずれかを使用する細胞の同期化（ｃｅｌｌ ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ）によって提供される機能）もまた、本明細書中で使用を見出される。例えば、Ｂｕｌｌｅｒら（１９８１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４０：２４１−２４７；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９８５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４７：２１７−２２２；Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒら（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５２：１１０−１１７を参照のこと。あるいは、補助機能は、上に記載されるような補助機能ベクターを使用して提供され得る。例えば、米国特許第６，００４，７９７号および国際公開番号ＷＯ ０１／８３７９７を参照のこと。
補助機能を提供する核酸配列は、天然の供給源（例えば、アデノウイルス粒子のゲノムから）から得られ得か、または当該分野で公知の組換え方法もしくは合成方法を使用して構築され得る。上に説明したように、アデノウイルス遺伝子の完全な相補体が、補助ヘルパー機能のために必要とされるわけではないことが示されている。特に、ＤＮＡ複製および後期遺伝子の合成が不可能なアデノウイルス変異体が、ＡＡＶ複製に許容性であることが示されている。Ｉｔｏら，（１９７０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９：２４３；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら，（１９７１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：３１７。同様に、Ｅ２Ｂ領域およびＥ３領域内の変異体は、ＡＡＶ複製を支持することが示されており、このことは、上記Ｅ２Ｂ領域およびＥ３領域は、おそらく補助機能の提供に関与していないことを示している。Ｃａｒｔｅｒら，（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５。しかしながら、Ｅ１領域に欠陥のあるアデノウイルス、またはＥ４領域を欠くアデノウイルスは、ＡＡＶ複製を支持し得ない。従って、Ｅ１Ａ領域およびＥ４領域は、直接的または間接的にＡＡＶ複製に必要とされる可能性が高い。Ｌａｕｇｈｌｉｎら，（１９８２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１：８６８；Ｊａｎｉｋら，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１９２５；Ｃａｒｔｅｒら，（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５。他の特徴付けられたＡｄ変異体としては、以下が挙げられる：Ｅ１Ｂ（Ｌａｕｇｈｌｉｎら（１９８２），前出；Ｊａｎｉｋら（１９８１），前出；Ｏｓｔｒｏｖｅら，（１９８０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０４：５０２）；Ｅ２Ａ（Ｈａｎｄａら，（１９７５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２９：２３９；Ｓｔｒａｕｓｓら，（１９７６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１７：１４０；Ｍｙｅｒｓら，（１９８０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６６５；Ｊａｙら，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２９２７；Ｍｙｅｒｓら，（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：５６７）；Ｅ２Ｂ（Ｃａｒｔｅｒ，Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｉ ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ（編），１９９０））；Ｅ３（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３），前出）；およびＥ４（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３），前出；Ｃａｒｔｅｒ（１９９５））。Ｅ１Ｂコード領域に変異を有するアデノウイルスによって提供された補助機能の研究が相反する結果を示しているにもかかわらず、Ｅ１Ｂ５５ｋが、ＡＡＶビリオン生成に必要とされる一方、Ｅ１Ｂ１９ｋは必要とされないことが、最近報告された（Ｓａｍｕｌｓｋｉら，（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２０６−２１０）。加えて、国際公開ＷＯ ９７／１７４５８およびＭａｔｓｈｕｓｈｉｔａら，（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：９３８−９４５は、種々のＡｄ遺伝子をコードする補助機能ベクターを記載する。特に好ましい補助機能ベクターは、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡコード領域、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ ７２ｋＤコード領域、アデノウイルスＥ１Ａコード領域、およびインタクトなＥ１Ｂ５５ｋコード領域を欠くアデノウイルスＥ１Ｂ領域を含む。このようなベクターは、国際公開番号ＷＯ ０１／８３７９７に記載される。
宿主細胞をヘルパーウイルスに感染させるか、または宿主細胞を補助機能ベクターを用いてトランスフェクションすることの結果として、ＡＡＶヘルパー構築物をトランス活性化する補助機能が発現され、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質および／またはＣａｐタンパク質を産生する。このＲｅｐ発現産物は、ＡＡＶ発現ベクターから組換えＤＮＡ（目的のＤＮＡを含む）を切断する。Ｒｅｐタンパク質はまた、ＡＡＶゲノムを二重にするために役割を果たす。この発現されたＣａｐタンパク質は、キャプシド中に集合し、組換えＡＡＶゲノムはキャプシド中にパッケージングされる。従って、生産性のＡＡＶ複製が後に続き、ＤＮＡは、ｒＡＡＶビリオン中にパッケージングされる。
（ｒＡＡＶビリオンの精製）
組換えＡＡＶ複製に続いて、ｒＡＡＶビリオンは、種々の慣用的な精製方法（例えば、カラムクロマトグラフィー、ＣｓＣｌ勾配など）を使用して、宿主細胞から精製され得る。例えば、多くのカラム精製の工程（例えば、アニオン交換カラム、アフィニティーカラムおよび／またはカチオン交換カラムによる精製）が、使用され得る。例えば、国際公開番号ＷＯ ０２／１２４５５を参照のこと。さらに、感染が適用されて補助機能が発現される場合、残りのヘルパーウイルスは、公知の方法を使用して不活化され得る。例えば、アデノウイルスは、約６０℃の温度まで、例えば２０分間以上加熱することによって不活化され得る。この処理は、ヘルパーウイルスのみを効果的に不活化する。なぜならば、ＡＡＶが非常に熱安定性である一方、ヘルパーアデノウイルスは熱不安定性だからである。
任意の数のレポーター遺伝子を含む組換えＡＡＶベクターが、感染性力価を決定するために使用され得る。例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、緑色蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼが、使用され得る。トランスフェクトされた宿主細胞を収集した後、大きなスケールの生成物のために適切な技術を使用して（例えば、微流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ））、トランスフェクトされた宿主細胞を破壊することによって、溶解物が形成される。次いで、この溶解物はフィルター処理され（例えば、０．４５μｍフィルターを通して）、そして、本明細書中に記載されるようなカラムクロマトグラフィー方法を使用して精製される。任意のＡＡＶベクターの感染性力価を決定するための他の技術もまた、報告されている。例えば、Ｚｈｅｎら，「Ａｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｅｖｅｎｔｓ．」Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００４）Ｉｎ，Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
次いで、精製されたＡＡＶストックが処理され、カラムクロマトグラフィー技術を使用して空キャプシドを除去する。本発明の特に好ましい方法において、ｒＡＡＶ調製物は、トランスフェクトされた細胞を溶解し、粗細胞溶解物を得ることによって得られる。次いで、この粗細胞溶解物は清澄化され、当該分野で周知の技術（例えば、フィルター処理、遠心分離など）によって細胞の破片を除去して清澄化細胞溶解物にされ得る。粗細胞溶解物または清澄化細胞溶解物は、ＡＡＶベクター粒子とＡＡＶの空キャプシドとの両方を含み、次いで、非分離条件下で第一のカチオン交換カラムに対して適用される。上記第一のカチオン交換カラムは、細胞溶解物の調製物中に存在する細胞成分および他の成分から、ＡＡＶベクター粒子およびＡＡＶの空キャプシドをさらに分離するために機能する。細胞溶解物の最初の精製を行うための方法は、公知である。１つの代表的な方法が、米国特許第６，５９３，１２３号に記載される。第一のカチオン交換カラムから回収された画分は、次いで、ＡＡＶの空キャプシドをＡＡＶベクター粒子から分離する異なる溶出条件を使用して、第二のイオン交換体（すなわち、第二のカチオン交換カラムおよび／またはアニオン交換カラム）に対して、適用される。
第一のカチオン交換カラムと第二のカチオン交換カラムとの両方に適切なカチオン交換体が使用される場合、当該分野で公知の多種多様な材料を含む。特に好ましいのは、広範なｐＨ範囲にわたってｒＡＡＶビリオンを結合し得る強力なカチオン交換体である。例えば、カルボキシメチル化カチオン交換マトリックスおよびスルホン化カチオン交換マトリックスが、本明細書中の用途のために特に有用である。有用なマトリックス材料としては、セルロースマトリックス（例えば、繊維性マトリックス、微粒子性マトリックス、およびビーズマトリックス）；アガロースマトリックス、デキストランマトリックス、ポリアクリレートマトリックス、ポリビニルマトリックス、ポリスチレンマトリックス、シリカマトリックス、およびポリエーテルマトリックス；ならびに合成物が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で特に好ましいのは、機能的リガンドＲ−ＳＯ３ −（好ましくは、スルホプロピル樹脂またはスルホエチル樹脂）を含むマトリックスである。代表的なマトリックスとしては、ＰＯＲＯＳ ＨＳ、ＰＯＲＯＳ ＳＰ、ＰＯＲＯＳ Ｓ（すべてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能な強力なカチオン交換体）、ＰＯＲＯＳ ＣＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能な弱いカチオン交換体）、ＴＯＳＯＨＡＡＳ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ５５０ＣおよびＭＥＲＣＫ ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ ＥＭＤ ＳＯ３ −−６５０（ｍ）、ならびにＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ、ＳＯＵＲＣＥ ３０Ｓ、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＳＰ ＦＦ、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＳＰ ＸＬ（すべてＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。
下に与えられるすべてのカラムクロマトグラフィープロトコルについて、カラムは、当該分野で公知の標準的プロトコルを使用して、適切な緩衝液溶液で調製され得る。次いで、サンプルがロードされる。使用される第一のカチオン交換カラムについて、条件は、空キャプシドとＡＡＶベクター粒子との両方がカラム樹脂に結合し、続いて一緒に溶出されるが、細胞溶解物中に存在する他の細胞成分および細胞の破片から分離されるような条件である。例えば、空キャプシドおよび完全キャプシドは、適切なイオン強度の緩衝液を使用して溶出される。適切な緩衝液としては、例えば、１０〜５０ｍＭリン酸ナトリウム、好ましくは、１５〜４０（例えば、１５、２０、２５、３０、３５、４０など）ｍＭリン酸ナトリウムが挙げられ、このリン酸ナトリウムは、塩（例えば、ＮａＣｌまたはＫＣｌ）を例えば、１００〜７００ｍＭの濃度（例えば、２００〜４００ｍＭ（例えば、２００、３００、３２５、３５０、３７０、３８０、４００など、またはこれらの範囲内の任意の濃度））で含む。緩衝液のｐＨは、約３〜約９．５であり得、例えば、４〜８であり、例えば、ｐＨ４、４．５、５、５．５、６など、またはこれらの範囲内の任意のｐＨであり得る。これらの画分は回収され、次いで、分離条件化でアニオン交換カラムおよび／または第二のカチオン交換カラムのどちらかに適用され得る。
続いて空のＡＡＶキャプシドをＡＡＶベクター粒子から分離するための工程において、第二のカチオン交換カラムが使用される場合、２種の溶出緩衝液が使用される。１つは低塩緩衝液であり、１つは高塩緩衝液である。特に、空キャプシドは、ＡＡＶベクター粒子から、約ｐＨ６〜ｐＨ１２のｐＨにおける適切な緩衝液を使用して分離される。このｐＨは、好ましくは、ｐＨ７〜ｐＨ１０であり、さらにより好ましくはｐＨ７．５〜ｐＨ９．５であり、例えば、ｐＨ７．５、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、または示された範囲の間の任意のｐＨである。適切な緩衝液は、当該分野で周知であり、以下の緩衝液イオンを含む緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない：酢酸；マロン酸；ＭＥＳ：リン酸；ＨＥＰＥＳ、ＢＩＣＩＮＥなど。サンプルを溶出するために、開始緩衝液のイオン強度は、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸アンモニアまたは硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、クエン酸塩および／もしくはリン酸塩を含む任意の他の塩）を使用することによって増加される。本発明の一実施形態において、カラムはまず低塩濃度で処理される。この濃度は、例えば、１０〜２００ｍＭの酢酸アンモニウムであり、例えば、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、１００ｍＭまたはこれらの範囲内の任意の濃度である。この処理は、ＡＡＶベクター粒子のカラム樹脂からの溶出を生じる。続いて、このカラムは、ＡＡＶの空キャプシドを溶出するために、より高塩濃度で処理される。第二の緩衝液としての使用についての１つの例は、１００〜８００ｍＭの濃度、好ましくは、５００〜７００ｍＭであり、例えば、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００ｍＭ、またはこれらの示された範囲内の任意の濃度の酢酸アンモニウムである。これら条件を使用して、ＡＡＶベクター粒子を早い画分に溶出し、空粒子を遅い画分に溶出する。
上に説明されるように、本発明の代替的方法において、第一のカチオン交換カラムからの調製物は、第二のカチオン交換カラムの代わりにか、または第二のカチオン交換カラムに加えてのいずれかで、アニオン交換カラムに対して適用される。アニオン交換カラムが第二のカチオン交換カラムに加えて使用される場合、アニオン交換カラムは、第二のカチオン交換カラムの前か、または第二のカチオン交換カラムに続いて使用され得る。さらに、第二のアニオン交換カラムは、第一のアニオン交換カラムの後に使用され得る。本発明での使用についての多くの適切なアニオン交換体が公知であり、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＭＡＣＲＯ ＰＲＥＰ Ｑ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡから入手可能な強力なアニオン交換体）；ＵＮＯＳＰＨＥＲＥ Ｑ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡから入手可能な強力なアニオン交換体）；ＰＯＲＯＳ ５０ＨＱ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能な強力なアニオン交換体）；ＰＯＲＯＳ ５０Ｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能な弱いアニオン交換体）；ＰＯＲＯＳ ５０ＰＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能な弱いアニオン交換体）；ＳＯＵＲＣＥ ３０Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能な強力なアニオン交換体）；ＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能な弱いアニオン交換体）；Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能な強力なアニオン交換体）。
上記アニオン交換カラムはまず、標準的な緩衝液を使用して、製造者の仕様書に従って平衡化される。例えば、カラムは、例えば、５〜５０ｍＭ（好ましくは、７〜２０ｍＭ、例えば、１０ｍＭ）のリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化され得る。次いでサンプルがロードされ、そして２種の溶出緩衝液が使用される。１つは低塩緩衝液であり、１つは高塩緩衝液である。低塩洗浄および高塩洗浄のそれぞれに続いて、画分が回収され、そして画分中のタンパク質が、標準的技術（例えば、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度のモニタリング）を使用して検出される。アニオン交換体を使用して、低塩溶出からのタンパク質ピークは、ＡＡＶの空キャプシドを含み、そして高塩画分は、ＡＡＶベクター粒子を含む。
特に、アニオン交換カラムに関して、空キャプシドは、約ｐＨ５〜ｐＨ１２のｐＨにおける適切な緩衝液を使用してＡＡＶベクター粒子から分離され得る。このｐＨは、好ましくは、ｐＨ６〜ｐＨ１０であり、さらにより好ましくはｐＨ７〜ｐＨ９．５であり、例えば、ｐＨ７．１、７．２、７．３、７．４、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、または示された範囲の間の任意のｐＨである。アニオン交換カラムでの使用に適切な緩衝液は、当該分野で周知であり、一般的に本質的に陽イオン性であるか、または両性イオン性である。このような緩衝液としては、以下の緩衝液イオンを含む緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ−メチルピペラジン；ピペラジン；ビス−Ｔｒｉｓ；ビス−Ｔｒｉｓプロパン；トリエタノールアミン；Ｔｒｉｓ；Ｎ−メチルジエタノールアミン；１，３−ジアミノプロパン；エタノールアミン；酢酸など。サンプルを溶出するために、開始緩衝液のイオン強度は、塩（例えば、ＮａＣｌ塩、ＫＣｌ塩、硫酸塩、フマル酸塩または酢酸塩）を使用して、適切なｐＨにおいて増加される。
本発明の一実施形態において、アニオン交換カラムは、まず、低塩濃度で処理される。その濃度は例えば、１０〜１００ｍＭのＮａＣｌであり、例えば、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、１００ｍＭ、またはこれらの範囲内の任意の濃度である。最初の処理に続いて、次いでカラムは、空キャプシドを溶出するために、高塩濃度（たとえば、より高いＮａＣｌ濃度、またはより強力なイオン強度を有する別の緩衝液で）で処理される。第二の緩衝液としての使用についての１つの例は、酢酸ナトリウム緩衝液、または１００〜３００ｍＭの濃度を有するＴｒｉｓベースの緩衝液である。この濃度は、好ましくは、１２５〜２００ｍＭであり、例えば、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ｍＭ、またはこれらの示された範囲内の任意の濃度である。空キャプシドがカラムから溶出された後、ＡＡＶベクター粒子は、高濃度の塩を使用して回収され得る。溶出緩衝液としての使用についての１つの例は、酢酸ナトリウムを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液である。酢酸ナトリウムの濃度は１００〜５００ｍＭの範囲であり、好ましくは、１３０〜３００ｍＭであり、例えば、１００、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｍＭ、またはこれら示された範囲内の任意の濃度である。
上に記載される技術を使用して、９０％以上のＡＡＶの空キャプシドが、ＡＡＶベクター粒子から分離され得る。さらに、ＡＡＶベクター粒子の高い回収は、容易に達成される。すなわち、１０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは５０％以上、例えば、６０％以上のＡＡＶベクター粒子が回収され得る。
空キャプシドおよびパッケージされたゲノムを有するＡＡＶベクター粒子をアッセイするための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｇｒｉｍｍら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２−１３３０；Ｓｏｍｍｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２−１２８を参照のこと。変性キャプシドの試験のために、その方法は、処理されたＡＡＶストックを上記３つのキャプシドタンパク質を分離可能な任意のゲル（例えば、緩衝液中に３〜８％トリス−酢酸を含む勾配ゲル）からなるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供する工程、次いでサンプル物質が分離されるまでそのゲルを泳動する工程、およびそのゲルをナイロンまたはニトロセルロース膜（好ましくはナイロン）にブロットする工程を包含する。抗ＡＡＶキャプシド抗体（好ましくは抗ＡＡＶキャプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは上記Ｂ１抗ＡＡＶ−２モノクローナル抗体）が次いで、変性キャプシドタンパク質に結合する一次抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１−９２９３）。次いで二次抗体が使用される。これは、その一次抗体に結合しその一次抗体との結合を検出するための手段を含有するもの、より好ましくは、自身に共有結合された検出分子を含有する抗ＩｇＧ抗体であり、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合されたヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体である。結合を検出するための方法は、その一次抗体とその二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために使用され、好ましくは検出方法が放射性同位元素放射、電磁放射線または比色変化を検出可能であり、最も好ましくは化学発光検出キットである。
感染力価の試験のための、その方法は、約１００，０００の宿主細胞（好ましくはヒト由来、最も好ましくはＨｅＬａ細胞）を、組織培養処理プレート（好ましくは２４ウェル組織培養処理プレート）に播種し、そしてアデノウイルス（好ましくはアデノウイルス−２血清型）および処理されたｒＡＡＶストックをその宿主細胞に加えてから約２４時間インキュベートする工程を包含する。その宿主細胞、アデノウイルスおよびｒＡＡＶストックは、２４時間インキュベートされ、その後その宿主細胞は好ましくはホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドで固定され、そしてｒＡＡＶ発現導入遺伝子を検出する適切な薬剤で染色される（例えば、ｒＡＡＶ−ＬａｃＺ、Ｘ−ｇａｌが染色剤として企図される）。他のレポーター遺伝子に対する他の薬剤は、当該分野において周知である。任意の導入遺伝子を含有するベクターの感染力価を決定するためのより一般的な方法もまた、当該分野において公知である。例えば、Ｚｈｅｎら、「Ａｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｅｖｅｎｔｓ」Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００４）（印刷中）を参照のこと。
（３．実験）
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。この例は、例示目的のみのために提供され、任意の方法において本発明の範囲を制限することを意図されない。
使用された数字（例えば量、温度など）に関して精度を保証するための努力はなされたが、それに対するいくつかの実験誤差または偏差は、当然許容されるべきである。
（材料および方法）
（ｒＡＡＶ産生および精製）
ヒトＩＸ因子（ｒＡＡＶ−ｈＦＩＸ）をコードする遺伝子を含有する組み換えＡＡＶビリオンを、米国特許第６，００１，６５０号および同第６，００４，７９７号に記載されるトリプルトランスフェクション（ｔｒｉｐｌｅ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）法により産生した。使用したプラスミドは、補助機能プラスミド「ｐｌａｄｅｎｏ５」、ＡＡＶヘルパー機能プラスミド「ｐＨＬＰ１９」、および組み換えＡＡＶプラスミド「ｐｈＦＩＸ−１６」であった。ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を、ｒＡＡＶビリオンの産生のために宿主細胞として使用した。
トランスフェクションされた２９３細胞を、トランスフェクション後約７２時間で回収し、ＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒＴＭ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）を使用した微細流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）により破砕し、そしてその粗製溶解物を収集し、連絡的フィルタを通して細胞細片を除去して、清澄な細胞溶解物を作製した。パッケージされたキャプシドおよび空キャプシドを含有するその清澄な細胞溶解物を、次いで、他の細胞成分からＡＡＶベクター粒子およびＡＡＶの空キャプシドを精製するために、ＰＯＲＯＳ ５０ＨＳカラムにロードした。このＡＡＶベクター粒子および空キャプシドを、このＰＯＲＯＳ ５０ＨＳカラムから、２０ｍＭリン酸ナトリウム、３７０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）を含有する緩衝液を使用して溶出した。ＡＡＶベクター粒子および空キャプシドの両方を含有するこのＡＡＶ調製物を、その塩濃度を減少させるために２倍希釈し、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥカラムを通してさらに精製し、流れて通過したＡＡＶベクター粒子および空キャプシドを収集し、そして濃度および緩衝液の交換を限外濾過および透析濾過（ｄｉａｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）技術を使用して行った。
最終的なＰＯＲＯＳ ５０ＨＳカラム精製産物は、ＡＡＶ空キャプシドおよび組み換えベクターゲノムを含有するＡＡＶベクター粒子の両方を含有した。各々に対するコントロールサンプルを生成するために、塩化セシウムを攪拌しながら１．４１ｇ／ｍｌの密度までＰＯＲＯＳ ５０ＨＳカラム精製物質に加え、次いでＴｉ７０ローターを使用して４５，０００ｒｐｍで２３時間超遠心分離へ供した。この可視の空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子のバンドを、シリンジを使用して別々に汲み出した。この精製された空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子を、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ ＮａＣｌおよび５％ソルビタール（ｓｏｒｂｉｔａｌ）からなる緩衝液に対して、透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用し、４℃での、３回の緩衝液交換によって、別々に透析した。
（樹脂およびカラムクロマトグラフィー）
アニオン交換樹脂、カチオン交換樹脂、等電点樹脂および疎水的相互作用（ＨＩＣ）樹脂を含む種々の型のクロマトグラフィー樹脂を、ＡＡＶ空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子を分離するための、その能力について試験した。ハイスループットの多岐管を、樹脂のスクリーニングのために使用した。樹脂を、多岐管に設置された層高３ｃｍの使い捨ての空のカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に充填した。このカラムを、１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含有する緩衝液を使用して平衡化した。次いで０．２μｍで濾過された清澄なＨＥＫ２９３細胞溶解物のＡＡＶベクターおよび空キャプシドを、５０ｍＭの濃度のＮａＣｌ（塩）のカラム平衡緩衝液中に希釈し、次いでそのカラムにロードした。このカラムを、最初に平衡緩衝液で洗浄し、次いで１０ｍＭリン酸ナトリウムおよび４０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を含有する緩衝液でさらに洗浄し（低塩洗浄）、非結合物質を洗い出した。カラムを、次いで、１０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１Ｍ ＮａＣｌを含有する溶出緩衝液で処理した（高塩洗浄）。低塩洗浄を使用して洗い出された物質を１つの画分として収集し、高塩洗浄を使用して洗い出された物質を別の画分として収集した。
使い捨てカラムを使用した初期スクリーニングに引き続き、より大きなスケールのカラムクロマトグラフィー（ＢＩＯＣＡＤ７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で行われる）を使用し、有望な樹脂および条件をさらに調べた。ＸＫ１６ガラスカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、線速度１５０ｃｍ／時間の定流量パッキング法を使用して、種々の樹脂で充填した。クロマトグラフィーパラメーターを、種々の方法（詳細は各実験結果を参照のこと）を使用してプログラムした。一般的に、そのプログラムは、カラム平衡化工程、サンプルローディング工程、低塩洗浄工程、線形勾配工程または段階的勾配工程、そして高塩洗浄工程の機能的なブロックを包含する。種々の画分において溶出したＡＡＶベクター粒子および空キャプシドをモニターし、以下に記載された技術を使用して分析した。
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング）
カラム画分からのサンプルを取り、還元剤（ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液中で加熱し、そしてキャプシドタンパク質をプレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で分解した。銀染色を、ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を使用して、製造者の説明書に従って実施した。同様に、ウエスタンブロット分析を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離されたタンパク質のニトロセルロース膜への移送に引き続いて行った。モノクローナル抗体（Ｂ１、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＭＡ）を、ウエスタンブロットによりＡＡＶキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）を検出するための一次抗体として使用した。ヒツジ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ結合体（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）を二次抗体として使用し、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）により検出した。
（定量リアルタイムＰＣＲ）
カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）濃度を、定量リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により測定した。サンプルを希釈し、ＤＮａｓｅ Ｉで消化して、外来性ＤＮＡを除去した。ＤＮａｓｅの不活化後、サンプルをさらに希釈し、プライマーおよびそのプライマー間のＤＮＡ配列に対して特異的なＴａｑＭａｎＴＭ蛍光発生プローブを使用して増幅した。規定されたレベルの蛍光に達するのに必要なサイクル数（閾値サイクル、Ｃｔ）を、各サンプルに対して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍで測定した。ＡＡＶベクターに含まれる配列と同一な配列を含有するプラスミドＤＮＡを、そのＱ−ＰＣＲ反応における標準曲線を作成するために利用した。上記サンプルから得られるＣｔ値を使用して、そのプラスミドの標準曲線のＣｔ値に対して正規化することによりベクターゲノムの力価を決定した。
（実施例１）
（空キャプシドおよびパッケージされたゲノムを有するＡＡＶベクター粒子の結合特性）
ＡＡＶベクター粒子がアニオン交換カラムへ結合するか否か試験するために、複数の樹脂を、ハイスループット多岐管技術を使用してスクリーニングした。ＡＡＶベクター粒子および空キャプシドを含有する２９３細胞培養液の細胞溶解物を、ＮａＣｌ濃度を約５０ｍＭまで減少させるために２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を使用して希釈し、そして各カラムにロードした。このカラムを次いで洗浄し、上記された手順に従って溶出した。その収集されたサンプルをウエスタンブロットに供し、画分中の上記ＡＡＶ粒子の分布を検出した。図１Ａおよび図１Ｂに示されるように、そのＡＡＶキャプシドタンパク質特異的モノクローナル抗体は、高塩（１Ｍ ＮａＣｌ）溶出画分のみ（図１、３レーン、５レーン、７レーンおよび９レーン）においてタンパク質を検出した。このデータは明らかに、ＡＡＶベクター粒子および空キャプシドの両方が、スクリーニングされた全てのアニオン交換樹脂（弱交換体および強交換体の両方）に結合することを示す。
（実施例２）
（空キャプシドとＡＡＶベクター粒子との間の電荷の差異）
ＡＡＶ空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子を、ＣｓＣｌ勾配遠心分離を使用して分離した。上記空キャプシドは、より低塩密度（約１．３ｇｍ／ｃｃ）で可視バンドとして生じ、上記ＡＡＶベクター粒子は、より高塩密度（約１．３８〜１．４１ｇｍ／ｃｃ）で可視バンドとして分布した。この空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子を、上に記載されたように調製し、そしてカラムに別々にロードした。Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ、ＰＯＲＯＳ ５０ＨＱおよびＵＮＯＳＰＨＥＲＥ Ｑの３つの樹脂を、空粒子と完全（ｆｕｌｌ）粒子との間の溶出プロファイルを比較するために、同じプログラムを使用して行ったカラムクロマトグラフィー泳動のために使用した。ＡＡＶ空キャプシドは、ＡＡＶベクター粒子（より後の画分に溶出する）と比較して、より低塩濃度で溶出（より先の画分に溶出）し；この現象は、全ての３つの試験されたアニオン樹脂に対して観察された。ＵＮＯＳＰＨＥＲＥ Ｑ樹脂の場合、空キャプシドは、０〜５００ｍＭ ＮａＣｌの塩勾配における画分１０に溶出するが、ＡＡＶベクター粒子は、画分１１に溶出し；Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥカラムの場合、空キャプシドは画分１１、画分１２および画分１３に溶出するが、ＡＡＶベクター粒子は画分１３、画分１４および画分１５に溶出した。酢酸ナトリウムのより浅い勾配を使用した場合、同様の現象がＰＯＲＯＳ ５０ＨＱカラムで観察され；空キャプシドは画分３０〜画分３６で溶出したが、ＡＡＶベクター粒子は画分３６〜画分４０で溶出した。これらのデータは、明らかに、ＡＡＶ空キャプシドとＡＡＶベクター粒子との間に基礎的な電荷の差異が存在すること、そしてこの２つの集団がカラムクロマトグラフィー技術により、これらの特性を使用して分離され得ることを示す。これらの樹脂による空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子の分離を確認したところ、２６０／２８０ｎｍでのＵＶ吸収の比が溶出画分において次第に増加し、これは差次的な溶出と一致する（ＤＮＡを欠くより低い２６０／２８０比を有する空キャプシドが先に溶出する）。
（実施例３）
（空キャプシドとＡＡＶベクター粒子との間の溶出効率および分解能における樹脂および塩の効果）
このプロセスにおいてスクリーニングされる樹脂は、全てアニオン交換樹脂であるが、差異（電荷密度、ビーズサイズおよび組成など）を示した。空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子の結合および分離の効率は、樹脂により変動した。この空キャプシドは、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥカラム内で１１０ｍＭのＮａＣｌを使用して溶出した。対照的に、約６５ｍＭのＮａＣｌが、ＵＮＯＳＰＨＥＲＥカラムを使用して空キャプシドを溶出するために、十分であった。そしてＰＯＲＯＳ ＨＱカラムの場合は、約１３０ｍＭのＮａＣｌが、この空キャプシドを溶出するために十分であった。
複数の異なる塩もまた、溶出プロファイルの研究のために使用した。塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウムおよびクエン酸ナトリウムを、並行比較（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）に供した。上記のカラムクロマトグラフィー泳動を行うための同じプログラムを使用すると、塩化ナトリウムと比較して酢酸ナトリウムまたは酢酸アンモニウムを使用した場合、空キャプシド溶出は複数の画分にわたって遅延した。これは、異なる塩はアニオン性カラムクロマトグラフィーにおいて異なる特性を有し、そしてこれらの特性は上記ＡＡＶベクター粒子からの空キャプシドの分離における分解能を強化するために使用され得ることを示唆する。
（実施例４）
（空キャプシドに対する溶出条件を定義する）
上で議論された実験データに基づいて、ＰＯＲＯＳ ５０ＨＱ樹脂を使用して、ＡＡＶベクター粒子から空キャプシドを分離するための、カラムクロマトグラフィーベースの技術を開発した。上で記載されたようなＣｓＣｌ遠心分離を使用して調製された空キャプシドを、ＰＯＲＯＳ ５０ＨＱ樹脂を詰めたカラムに充填した。低塩（５０ｍＭ ＮａＣｌ）の初期洗浄工程に引き続く分離泳動において、このカラムを、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１６０ｍＭ酢酸ナトリウムまたは１７０ｍＭ酢酸ナトリウムのいずれかで洗浄した。この空キャプシドは、１７０ｍＭ ＮａＡｃを使用した場合に最も効率的に溶出した。この同じ塩の溶出プロフィールを使用した分離クロマトグラフィー泳動において、精製されたＡＡＶベクター粒子はカラム内に残り、次いで高い濃度の塩化ナトリウムを使用した線形の塩濃度を加えたとき、溶出した。
（実施例５）
（アニオン交換クロマトグラフィーを使用したＡＡＶベクター粒子からの空キャプシドの分離）
空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子がカラムクロマトグラフィー技術を使用して分離され得ることを実証するために、精製された空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子を一緒に混合し、空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子の両方を含有するサンプルを生成した。９Ｅ＋１３粒子／ｍｌの濃度の３ｍｌの空キャプシドを、７Ｅ＋１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍｌの濃度の２ｍｌの完全粒子と混合した。その物質を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を使用して、さらに３倍に希釈した。１４ｍｌのこの希釈物質を、２０ｍＬのベッド容量（ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ）で、ＰＯＲＯＳ ５０ＨＱカラムに充填した。上に記載されたカラムクロマトグラフィー溶出プロファイルを使用し、そしてそのデータは、その空キャプシドが１７０ｍＭ酢酸ナトリウムの塩条件で溶出するがそのＡＡＶベクター粒子はカラム内に残り、次いでＮａＣｌ塩の線形勾配を使用して溶出することを示した。その分離の過程にわたってそのカラムから溶出される物質のＵＶ吸収パターン（２６０：２８０ｎｍ比）は、そのＡＡＶベクター粒子からのその空キャプシドの効率的な分離と完全に一致し、そしてさらにそれを実証した。そのカラムから溶出される種々の画分を、キャプシドＥＬＩＳＡ、Ｑ−ＰＣＲ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＯＤ分析を使用してさらに分析した。得られた全てのデータは、ＡＡＶベクター粒子からの空キャプシドの分離が完全であり、そのＡＡＶベクター粒子中のベクターゲノムに対する粒子の比は１：１であることを示した。このようにして、（そのカラムに充填された）出発物質がベクター粒子より約１６倍多い空キャプシドを含んだとしても、このＡＡＶベクター粒子はその空キャプシドから完全に分離された（図２）。
（実施例６）
（アニオン交換クロマトグラフィーを使用したＡＡＶベクター粒子からの空キャプシドの分離におけるｐＨの効果）
空キャプシドを除去するための完全なカラムベースの精製プロセスを開発するために、空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子の両方を含有するカチオン交換カラム（ＰＯＲＯＳ ＨＳ）から回収したビリオンを、そのＰＯＲＯＳ ５０ＨＱカラムに加えた。ＣｓＣｌ精製サンプルから空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子を分離するための類似の方法を使用した場合、ＣｓＣｌ勾配の前精製および混合したサンプルに対して観察されたような明確な分離は確認されなかったが、その２つの粒子の型は識別可能なままであった。すなわち、空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子の、部分的には分離するが不完全な分離を観察した。カラムクロマトグラフィーの分解能に影響し得る複数のパラメーターを、その分離効率を最適化するために試験した。試験されたパラメーターの中で、ｐＨがその分離分解能を有意に強化することが見出された。ｐＨ７．４、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５およびｐＨ９．０の緩衝液を試験した。空ＡＡＶキャプシドは、高いｐＨ（例えばｐＨ９．０）がそのプロセスにおいて使用された場合、そのカラムから早期の画分中に選択的に取り出されたが、ＡＡＶベクター粒子は後期の画分中に、より高い塩濃度において溶出した。ｐＨ９．０を使用して、その空キャプシドを、より高いＵＶ２８０シグナルおよびより低いＵＶ２６０シグナルのＵＶ吸収シグネチャーパターンの単一ピークとして取り出した。対照的に、第二のピークはＡＡＶベクター粒子を含み、ＤＮＡを含有する完全ＡＡＶベクター粒子に対して予想されたものと反対のＵＶ吸収パターン（ＵＶ２６０がＵＶ２８０より優位を占める）を示した。この知見は、Ｑ−ＰＣＲおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイによりさらに確認され、その第二のピークがＡＡＶベクター粒子を含み、第一のピークが空キャプシドを含むことを示した。
（実施例７）
（アニオン交換カラムクロマトグラフィーを使用したＡＡＶベクター粒子からのＡＡＶ空キャプシド分離の手順）
上に記載された知見に基づいて、ＸＫ−１６ガラスカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）において、トリスベースの緩衝液（ｐＨ８．５）およびＰＯＲＯＳ ５０ＨＱカラム樹脂を使用して、上記ＡＡＶベクター粒子からＡＡＶ空キャプシドを分離するために、手順を設計した。ＵＶ吸収パターンにより示されたように、早期のセグメントに溶出された物質は空キャプシドを含有し、後期のセグメントはＡＡＶベクター粒子を含有した。これはＱ−ＰＣＲ分析によりさらに確認された。より高い塩濃度で溶出したベクターを、純度を決定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ベクターゲノムはＱ−ＰＣＲにより決定し、複製されたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに充填し、そして銀染色により染色した。コントロールとして利用するために、ＡＡＶベクター粒子のみを含有するｒＡＡＶビリオンを、ＣｓＣｌ遠心分離技術を使用して精製し、そして同じベクターゲノムをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した。
これらの技術を使用して、ベクターの約６０％を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色分析に基づくと、回収されたベクターには、基本的に空キャプシドが存在しなかった（１０未満の粒子が空キャプシドであった）（図３）。図３に示されるように、全てのレーンに等しい数のベクターゲノムを充填した場合、空キャプシドを含まないベクターのコントロール（レーン１）とカラムから溶出された画分に含まれるベクター（レーン２〜５）との間には、バンドの濃さ（総タンパク質に対応する）において有意な差はなかった。
（実施例８）
（カチオン交換カラムクロマトグラフィーを使用したＡＡＶベクター粒子からの空キャプシドの分離）
カチオン交換カラムクロマトグラフィーについてもまた、ＡＡＶベクター粒子から空キャプシドを分離するその能力を調査した。空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子の両方を含む第一のカチオン交換カラムからのＡＡＶ調製物（材料および方法の節に記載される）を、ＰＯＲＯＳ ＨＳ樹脂に加えた。そのカラムを最初に、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した。第一のカチオン交換カラムから得られたＡＡＶベクター粒子および空キャプシドの両方を含有するＡＡＶ調製物を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を使用して希釈し、塩濃度を約２００ｍＭ ＮａＣｌまで減少させた。この物質を次いで、ＰＯＲＯＳ ＨＳカラムに充填した。次いでｐＨ８．５の１０ｍＭトリスを含む５００ｍＭ〜７００ｍＭ酢酸アンモニウム勾配を、そのカラムに適用した。この勾配溶出プロトコールを使用して、上記ＡＡＶベクター粒子を最初に溶出し、空キャプシドから効率的に分離し、この空キャプシドを続いてより高い酢酸アンモニウム濃度で溶出した。この分離に対する対照性は、空キャプシドがＡＡＶベクターと比較してより低い塩濃度で溶出したアニオン交換樹脂（上記の実施例７）を使用しても観察された。
そのカチオン交換カラムにおける空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子の相対的な結合パターンおよび溶出パターンに関するさらなる情報は、このカラム溶出液のＵＶ吸収により提供された。例えば、カチオン交換カラムをｐＨ８．５で泳動した場合、そのクロマトグラフは、早期の画分において２６０ｎｍ吸収が優位なＵＶ吸収パターン（ＡＡＶベクター粒子に対応する）、および後期の溶出画分において２８０ｎｍ吸収が優位なＵＶ吸収パターン（空キャプシドに対応する）を示した。図４に示されるように、同じベクターゲノムをＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色分析に供する場合、タンパク質の量は早期の画分から後期の画分に向かって有意に増加し、これは早期の画分がほとんど空キャプシドを含まないことを示す。
これらの知見に基づいて、カチオン交換クロマトグラフィーを使用したＡＡＶベクター（ＤＮＡ含有）粒子からの空ＡＡＶキャプシドの分離は達成され得る。図５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが実証する分離を示す。カチオン交換カラムから溶出された空キャプシドおよびＡＡＶベクター粒子の両方を含むＡＡＶベクター調製物（分離を達成するために必要とされる条件は使用されていなかった）を、次いでカチオン交換カラムに充填し、そして酢酸アンモニウムを使用した段階勾配で溶出した。ベクターゲノムを含む画分をＱ−ＰＣＲを使用して同定し、これらの画分のアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色分析に供した。溶出された画分におけるタンパク質のシグナルが、その第二のカラムに充填された物質に対して、ｖｇインプット当たりのタンパク質シグナルをほとんど含有しなかったことが明らかである。これは空キャプシドがそのＡＡＶベクター粒子から除去されたことを示している。レーン２〜レーン４で示されるのは、３つの独立した実験から溶出されたベクターであり、この知見の一貫性および再現性を示している。
このように、ＡＡＶベクター粒子からの空キャプシドの分離のための方法が記載される。本発明の好ましい実施形態がいくらか詳細に記載されたが、添付された特許請求の範囲により定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、明らかな改変がなされ得ることが理解される。

Claims (1)

  1. 本明細書中に記載の発明。
JP2016020659A 2003-05-21 2016-02-05 空キャプシドを実質的に含まない組換えａａｖビリオン調製物を生成するための方法 Withdrawn JP2016073322A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US47238403P 2003-05-21 2003-05-21
US60/472,384 2003-05-21
US54975604P 2004-03-02 2004-03-02
US60/549,756 2004-03-02

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012170066A Division JP2012235788A (ja) 2003-05-21 2012-07-31 空キャプシドを実質的に含まない組換えａａｖビリオン調製物を生成するための方法

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018018391A Division JP2018082721A (ja) 2003-05-21 2018-02-05 空キャプシドを実質的に含まない組換えａａｖビリオン調製物を生成するための方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2016073322A true JP2016073322A (ja) 2016-05-12

Family

ID=33544272

Family Applications (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006533274A Expired - Lifetime JP4559429B2 (ja) 2003-05-21 2004-05-21 空キャプシドを実質的に含まない組換えａａｖビリオン調製物を生成するための方法
JP2010089074A Expired - Lifetime JP5166477B2 (ja) 2003-05-21 2010-04-07 空キャプシドを実質的に含まない組換えａａｖビリオン調製物を生成するための方法
JP2012170066A Withdrawn JP2012235788A (ja) 2003-05-21 2012-07-31 空キャプシドを実質的に含まない組換えａａｖビリオン調製物を生成するための方法
JP2016020659A Withdrawn JP2016073322A (ja) 2003-05-21 2016-02-05 空キャプシドを実質的に含まない組換えａａｖビリオン調製物を生成するための方法
JP2018018391A Withdrawn JP2018082721A (ja) 2003-05-21 2018-02-05 空キャプシドを実質的に含まない組換えａａｖビリオン調製物を生成するための方法
JP2020000279A Pending JP2020048586A (ja) 2003-05-21 2020-01-06 空キャプシドを実質的に含まない組換えａａｖビリオン調製物を生成するための方法

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006533274A Expired - Lifetime JP4559429B2 (ja) 2003-05-21 2004-05-21 空キャプシドを実質的に含まない組換えａａｖビリオン調製物を生成するための方法
JP2010089074A Expired - Lifetime JP5166477B2 (ja) 2003-05-21 2010-04-07 空キャプシドを実質的に含まない組換えａａｖビリオン調製物を生成するための方法
JP2012170066A Withdrawn JP2012235788A (ja) 2003-05-21 2012-07-31 空キャプシドを実質的に含まない組換えａａｖビリオン調製物を生成するための方法

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018018391A Withdrawn JP2018082721A (ja) 2003-05-21 2018-02-05 空キャプシドを実質的に含まない組換えａａｖビリオン調製物を生成するための方法
JP2020000279A Pending JP2020048586A (ja) 2003-05-21 2020-01-06 空キャプシドを実質的に含まない組換えａａｖビリオン調製物を生成するための方法

Country Status (12)

Country Link
US (7) US7261544B2 (ja)
EP (4) EP1625210B1 (ja)
JP (6) JP4559429B2 (ja)
AT (1) ATE490307T1 (ja)
CY (1) CY1115788T1 (ja)
DE (1) DE602004030327D1 (ja)
DK (1) DK2277996T3 (ja)
ES (1) ES2521682T3 (ja)
PL (2) PL1625210T3 (ja)
PT (2) PT2277996E (ja)
SI (1) SI2277996T1 (ja)
WO (1) WO2004113494A2 (ja)

Families Citing this family (143)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7261544B2 (en) * 2003-05-21 2007-08-28 Genzyme Corporation Methods for producing preparations of recombinant AAV virions substantially free of empty capsids
CN101528916B (zh) 2006-04-28 2013-09-04 宾夕法尼亚大学托管会 规模可调的aav生产方法
DK2337849T3 (en) * 2008-09-15 2018-10-01 Uniqure Biopharma B V FACTOR IX POLYPEPTIME MUTANT, APPLICATIONS THEREOF AND METHOD OF PRODUCING THEREOF
CA2787827C (en) 2010-01-28 2020-11-10 The Children's Hospital Of Philadelphia A scalable manufacturing platform for viral vector purification and viral vectors so purified for use in gene therapy
US10640771B2 (en) 2013-04-17 2020-05-05 Genzyme Corporation Compositions and methods for treating and preventing macular degeneration
ES2690643T3 (es) 2013-11-26 2018-11-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Vectores virales adeno-asociados para el tratamiento de enfermedad de almacenamiento de glucógeno
GB201401707D0 (en) 2014-01-31 2014-03-19 Sec Dep For Health The Adeno-associated viral vectors
CN106163573A (zh) 2014-02-06 2016-11-23 建新公司 用于治疗和预防黄斑变性的组合物及方法
WO2015160977A1 (en) * 2014-04-15 2015-10-22 Kiromic, Llc Compositions and methods for treating cardiovascular diseases using smad3
PE20170260A1 (es) 2014-05-02 2017-04-12 Genzyme Corp Vectores de aav para la terapia genica de la retina y el snc
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
WO2016004319A1 (en) * 2014-07-02 2016-01-07 University Of Florida Research Foundation, Inc. Compositions and methods for purifying recombinant adeno-associated virus
RU2716991C2 (ru) 2014-11-05 2020-03-17 Вояджер Терапьютикс, Инк. Полинуклеотиды aadc для лечения болезни паркинсона
IL292999A (en) 2014-11-14 2022-07-01 Voyager Therapeutics Inc Preparations and methods for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis
JP6863891B2 (ja) 2014-11-14 2021-04-21 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 調節性ポリヌクレオチド
WO2016094783A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
ES2824829T3 (es) 2014-12-23 2021-05-13 Us Health Vectores de virus adenoasociado que codifican G6PC modificada y usos de estos
IL310375A (en) 2015-01-20 2024-03-01 Genzyme Corp Analytical ultracentrifugation for characterization of recombinant viral particles
SG10201907399RA (en) 2015-02-10 2019-09-27 Genzyme Corp Enhanced delivery of viral particles to the striatum and cortex
TWI707951B (zh) 2015-04-08 2020-10-21 美商健臻公司 過大腺相關載體之製造
WO2016168728A2 (en) 2015-04-16 2016-10-20 Emory University Recombinant promoters and vectors for protein expression in liver and use thereof
AU2016252887B2 (en) 2015-04-23 2021-08-12 Baker Heart and Diabetes Institute Smad7 gene delivery as a therapeutic
IL296365A (en) 2015-05-16 2022-11-01 Genzyme Corp Genetic editing of deep intronic mutations
DK3307878T3 (da) 2015-06-10 2021-10-11 Us Health Fremgangsmåder til fremstilling og oprensning af nukleinsyreholdige sammensætninger
AU2016341983B8 (en) 2015-10-21 2022-10-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Codon-optimized reduced-size ATP7A cDNA and uses for treatment of copper transport disorders
WO2017075335A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
WO2017100674A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for aav1
WO2017160360A2 (en) * 2015-12-11 2017-09-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for aav9
EP3387117B1 (en) * 2015-12-11 2022-11-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for aav8
US11028372B2 (en) 2015-12-11 2021-06-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for AAVRH10
AU2016372035B2 (en) 2015-12-15 2023-03-30 Genzyme Corporation Adeno-associated viral vectors for treating mucolipidosis type ii
US20190038777A1 (en) 2016-02-05 2019-02-07 Emory University Injection of single-stranded or self-complementary adeno-associated virus 9 into the cerebrospinal fluid
JP6645279B2 (ja) * 2016-03-11 2020-02-14 セイコーエプソン株式会社 撮影装置
PT3436051T (pt) 2016-03-31 2021-11-02 Spark Therapeutics Inc Processo de fabrico de raav com base em coluna totalmente escalável
US11326182B2 (en) 2016-04-29 2022-05-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
GB201608046D0 (en) 2016-05-09 2016-06-22 Cambridge Entpr Ltd And Syndey Children S Hospitals Network Randwick And Westmead Incorporating The Treatment of complement-mediated disorders
IL302748A (en) 2016-05-18 2023-07-01 Voyager Therapeutics Inc modulatory polynucleotides
BR112018073472A2 (pt) 2016-05-18 2019-08-27 Voyager Therapeutics Inc composições e métodos de tratamento da doença de huntington
GB201612248D0 (en) * 2016-07-14 2016-08-31 Puridify Ltd New process
BR112019002934A2 (pt) 2016-08-15 2019-05-14 Genzyme Corporation métodos para detecção de aav
CA3034527A1 (en) 2016-08-23 2018-03-01 Emmanuel John Simons Compositions and methods for treating non-age-associated hearing impairment in a human subject
CA3035522A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
AU2017391164B2 (en) * 2016-11-04 2024-01-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Adeno-associated virus purification methods
US10294452B2 (en) * 2016-11-22 2019-05-21 Dao-Yao He Lysis, extraction and purification of adeno-associated virus and adenovirus from host cells
US10898585B2 (en) 2017-04-14 2021-01-26 Ptc Therapeutics .Inc. Gene therapy for AADC deficiency
AU2018261790A1 (en) 2017-05-05 2019-11-28 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
CN111108198A (zh) 2017-05-05 2020-05-05 沃雅戈治疗公司 治疗亨廷顿病的组合物和方法
EP3622065A1 (en) 2017-05-09 2020-03-18 Emory University Clotting factor variants and their use
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
EP3658250A4 (en) * 2017-06-30 2021-10-27 Spark Therapeutics, Inc. AAV VECTOR COLUMN CLEANING PROCEDURE
US11497576B2 (en) 2017-07-17 2022-11-15 Voyager Therapeutics, Inc. Trajectory array guide system
JP7221275B2 (ja) 2017-08-03 2023-02-13 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド Ａａｖを送達するための組成物および方法
US20200237799A1 (en) 2017-10-16 2020-07-30 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
WO2019079240A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
CA3091810A1 (en) 2018-03-02 2019-09-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Use of il-34 to treat retinal inflammation and neurodegeneration
WO2019173434A1 (en) 2018-03-06 2019-09-12 Voyager Therapeutics, Inc. Insect cell manufactured partial self-complementary aav genomes
CN112313331A (zh) 2018-04-27 2021-02-02 沃雅戈治疗公司 用于测量aadc病毒载体效力的方法
TW202015742A (zh) 2018-05-15 2020-05-01 美商航海家醫療公司 投遞腺相關病毒（ａａｖ）之組成物和方法
MA52631A (fr) 2018-05-15 2021-03-24 Voyager Therapeutics Inc Compositions et méthodes pour le traitement de la maladie de parkinson
US20210214749A1 (en) 2018-05-16 2021-07-15 Voyager Therapeutics, Inc. Directed evolution
US20210207167A1 (en) 2018-05-16 2021-07-08 Voyager Therapeutics, Inc. Aav serotypes for brain specific payload delivery
WO2020010042A1 (en) 2018-07-02 2020-01-09 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord
JP2021530548A (ja) 2018-07-24 2021-11-11 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドVoyager Therapeutics, Inc. 遺伝子治療製剤を生産するための系および方法
JP2021534809A (ja) 2018-10-02 2021-12-16 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドVoyager Therapeutics, Inc. Ａａｖカプシドの向性の再指向化
US20210348242A1 (en) 2018-10-04 2021-11-11 Voyager Therapeutics, Inc. Methods for measuring the titer and potency of viral vector particles
WO2020077165A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
MX2021004213A (es) 2018-10-12 2021-07-16 Genzyme Corp Generacion de pah humana mejorada para el tratamiento de pku grave mediante terapia de sustitucion de genes dirigida al higado.
US20210369870A1 (en) 2018-11-16 2021-12-02 Encoded Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating wilson's disease
CA3123841A1 (en) 2018-12-18 2020-06-25 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Methods and compositions for treating glycogen storage diseases
KR20210112339A (ko) 2019-01-04 2021-09-14 울트라제닉스 파마수티컬 인코포레이티드 윌슨병을 치료하기 위한 유전자 요법 구축물
US20220064671A1 (en) 2019-01-18 2022-03-03 Voyager Therapeutics, Inc. Methods and systems for producing aav particles
US20220243224A1 (en) * 2019-04-15 2022-08-04 Children's Hospital Medical Center Viral vector manufacturing methods
US20220280655A1 (en) 2019-04-23 2022-09-08 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale New Adeno-Associated Virus (AAV) Variants and Uses Thereof for Gene Therapy
TW202106879A (zh) 2019-04-29 2021-02-16 美商航海家醫療公司 於生物反應器中生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(biic)之系統及方法
US20240124889A1 (en) 2019-05-07 2024-04-18 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the vectored augmentation of protein destruction, expression and/or regulation
WO2021030125A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
TW202122582A (zh) 2019-08-26 2021-06-16 美商航海家醫療公司 病毒蛋白之控制表現
US20220333133A1 (en) 2019-09-03 2022-10-20 Voyager Therapeutics, Inc. Vectorized editing of nucleic acids to correct overt mutations
WO2021062012A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Emory University Use of klk10 and engineered derivatizations thereof
US20230013253A1 (en) 2019-12-19 2023-01-19 Pfizer Inc. Compostions and methods for nucleic acid transfection using cationic polymers and stabilizers
CA3165922A1 (en) 2020-01-17 2021-07-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Gene therapy for treatment of crx-autosomal dominant retinopathies
EP4097121A1 (en) 2020-01-29 2022-12-07 Genzyme Corporation Modified adeno-associated viral capsid proteins for ocular gene therapy and methods of use thereof
MX2022009982A (es) 2020-02-14 2022-09-12 Ultragenyx Pharmaceutical Inc Terapia genica para el tratamiento de transtorno por deficiencia de cdkl5.
EP3868886A1 (en) * 2020-02-21 2021-08-25 Bia Separations D.O.O. A method for separation or depletion of empty aav capsids from full aav capsids
CN116096905A (zh) 2020-02-21 2023-05-09 阿库斯股份有限公司 用于治疗人受试者的非年龄相关性听力损伤的组合物和方法
WO2021202651A1 (en) 2020-04-01 2021-10-07 Voyager Therapeutics, Inc. Redirection of tropism of aav capsids
BR112022020753A2 (pt) 2020-04-15 2022-12-20 Voyager Therapeutics Inc Compostos de ligação a tau
GB202005732D0 (en) 2020-04-20 2020-06-03 Synpromics Ltd Regulatory nucleic acid sequences
BR112022023106A2 (pt) 2020-05-13 2023-01-17 Voyager Therapeutics Inc Redirecionamento de tropismo de capsídeos de aav
US20220033782A1 (en) * 2020-07-29 2022-02-03 Pall Corporation Adenovirus-associated viruses separation method
US20230295656A1 (en) 2020-08-06 2023-09-21 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
CN116261483A (zh) * 2020-08-18 2023-06-13 赛多利斯比亚分离有限责任公司 多模式金属亲和加工衣壳
SI3957378T1 (sl) * 2020-08-18 2023-07-31 Sartorius BIA Separations D.O.O Večmodalna obdelava kapsid aav s kovinsko afiniteto
WO2022045055A1 (ja) * 2020-08-24 2022-03-03 タカラバイオ株式会社 ｐＨの違いによる非エンベロープウイルスベクター粒子の調製方法
GB202013940D0 (en) 2020-09-04 2020-10-21 Synpromics Ltd Regulatory nucleic acid sequences
US20230383278A1 (en) 2020-09-18 2023-11-30 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Novel adeno-associated viral (aav) vectors to treat hereditary methylmalonic acidemia (mma) caused by methylmalonyl-coa mutase (mmut) deficiency
EP4222251A1 (en) 2020-10-01 2023-08-09 Genzyme Corporation Human pah expression cassette for treatment of pku by liver-directed gene replacement therapy
AR123777A1 (es) 2020-10-15 2023-01-11 Hoffmann La Roche Constructos de ácido nucleico para transcripción de arn va
AU2021363098A1 (en) 2020-10-15 2023-05-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleic acid constructs for simultaneous gene activation
IL302128A (en) 2020-11-02 2023-06-01 Biomarin Pharm Inc A process for the enrichment of adeno-associated virus
MX2023005218A (es) * 2020-11-03 2023-05-16 Pfizer Metodos de purificacion de vectores de aav mediante cromatografia de intercambio anionico.
US11821000B2 (en) 2020-11-10 2023-11-21 Dionex Corporation Method of separating viral vectors
US20240141377A1 (en) 2021-03-03 2024-05-02 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
US20240141378A1 (en) 2021-03-03 2024-05-02 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
CN117460832A (zh) 2021-03-22 2024-01-26 建新公司 空aav衣壳和完整aav衣壳的尺寸排阻色谱分析
AU2022256479A1 (en) 2021-04-16 2023-11-30 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Rational polyploid aav virions that cross the blood brain barrier and elicit reduced humoral response
WO2022261663A1 (en) * 2021-06-11 2022-12-15 Spark Therapeutics, Inc. Aav vector column purification methods
GB202110014D0 (en) * 2021-07-12 2021-08-25 Cytiva Bioprocess R & D Ab A method for separating adeno-associated virus capsids, compositions obtained by said method and uses thereof
WO2023012514A1 (en) * 2021-08-04 2023-02-09 Takeda Pharmaceutical Company, Limited Adeno-associated virus separation on a cation exchanger
WO2023034996A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Biomarin Pharmaceutical Inc. Aav capsid compositions and methods for delivery
WO2023034997A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Biomarin Pharmaceutical Inc. Aav capsid compositions and methods for delivery
WO2023034980A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Bomarin Pharmaceutical Inc. Aav capsid compositions and methods for delivery
WO2023034989A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Biomarin Pharmaceutical Inc. Aav capsid compositions and methods for delivery
WO2023034990A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Biomarin Pharmaceutical Inc. Aav capsid compositions and methods for delivery
WO2023034994A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Biomarin Pharmaceutical Inc. Aav capsid compositions and methods for delivery
WO2023044483A2 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
CA3235632A1 (en) 2021-11-02 2023-05-11 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2023091948A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2023111580A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 University Of Dundee Targeted degradation of alpha-synuclein
WO2023147374A2 (en) 2022-01-25 2023-08-03 Voyager Therapeutics, Inc. Baculovirus expression system
TW202346599A (zh) 2022-02-08 2023-12-01 美商航海家醫療公司 Ａａｖ衣殼變異體及其用途
GB202201713D0 (en) 2022-02-10 2022-03-30 Univ Dundee An affinity directed phosphatase system for targeted protein dephosphorylation
WO2023174974A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Merck Patent Gmbh Methods and compositions for purifying adeno associated virus particles
WO2023196898A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Beta globin mimetic peptides and their use
US20230405014A1 (en) 2022-04-12 2023-12-21 Genzyme Corporation Use of an irak4 modulator for gene therapy
WO2023201273A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 Genzyme Corporation Dendritic cell assay for innate immunogenicity to gene therapy agents
US20230405151A1 (en) 2022-04-12 2023-12-21 Genzyme Corporation Use of irak4 modulators for gene therapy
WO2023198685A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for determining aav genomes
WO2023225481A1 (en) 2022-05-16 2023-11-23 Genzyme Corporation Methods of treating metachromatic leukodystrophy
WO2023227438A1 (en) 2022-05-23 2023-11-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Raman-based method for the differentiation of aav particle serotype and aav particle loading status
WO2023235791A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2023232922A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing recombinant aav particles
WO2023240062A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Adverum Biotechnologies, Inc. Melanopsin variants for vision restoration
WO2024006741A1 (en) 2022-06-28 2024-01-04 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2024011112A1 (en) 2022-07-06 2024-01-11 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2024013239A1 (en) 2022-07-14 2024-01-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing recombinant aav particles
WO2024038365A1 (en) 2022-08-16 2024-02-22 Pfizer Inc. Methods for purification of aav vectors by anion exchange chromatography
WO2024054983A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
WO2024056561A1 (en) 2022-09-12 2024-03-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for separating full and empty aav particles
WO2024059739A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
WO2024064863A2 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Biomarin Pharmaceutical Inc. Treatment of arrhythmogenic cardiomyopathy with aav gene therapy vectors
WO2024064856A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Biomarin Pharmaceutical Inc. Treatment of cardiomyopathy with aav gene therapy vectors

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
AU8200191A (en) 1990-07-09 1992-02-04 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The High efficiency packaging of mutant adeno-associated virus using amber suppressions
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
JP3534749B2 (ja) 1991-08-20 2004-06-07 アメリカ合衆国 アデノウイルスが介在する胃腸管への遺伝子の輸送
FR2736930B1 (fr) 1995-07-17 1997-09-19 Biocem Procede de production, par des cellules vegetales, de proteines heminiques, proteines ainsi obtenues et produits contenant ces proteines
US5622856A (en) 1995-08-03 1997-04-22 Avigen High efficiency helper system for AAV vector production
US6001650A (en) 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
US6143548A (en) * 1995-08-30 2000-11-07 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adeno-associated virus (AAV)
US6004797A (en) 1995-11-09 1999-12-21 Avigen, Inc. Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production
ES2221168T3 (es) * 1997-03-12 2004-12-16 Siemens Aktiengesellschaft Dispositivo de entrada para terminales de comunicaciones accionados por radio.
US6566118B1 (en) * 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
US6995006B2 (en) * 1997-09-05 2006-02-07 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
CA2302992C (en) * 1997-09-05 2011-11-01 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of recombinant aav vectors
CN1195057C (zh) 1998-12-31 2005-03-30 森泰莱昂公司 分离病毒颗粒的方法
AU2001257611A1 (en) 2000-04-28 2001-11-12 Avigen, Inc. Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production
US6593123B1 (en) 2000-08-07 2003-07-15 Avigen, Inc. Large-scale recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification
FR2823221B1 (fr) 2001-04-06 2004-04-02 Univ Pasteur Sequences associees a la degenerescence retinienne et applications
US20030134404A1 (en) * 2001-11-26 2003-07-17 Lochrie Michael A. Methods for producing stocks of recombinant AAV virions
EP1476581A4 (en) 2002-02-04 2006-06-21 Novartis Ag GENERIC TRANSFER SYSTEM BASED ON RECOMBINANT IMPLANT IMMUNE VIRUS
US7419817B2 (en) * 2002-05-17 2008-09-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, Nih. Scalable purification of AAV2, AAV4 or AAV5 using ion-exchange chromatography
US7261544B2 (en) 2003-05-21 2007-08-28 Genzyme Corporation Methods for producing preparations of recombinant AAV virions substantially free of empty capsids
WO2004108760A2 (en) 2003-06-10 2004-12-16 Nsgene A/S Improved secretion of neublastin
US7355018B2 (en) 2003-09-30 2008-04-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified IGF1 polypeptides with increased stability and potency
US20050107318A1 (en) 2003-11-17 2005-05-19 Samuel Wadsworth Methods of treating diabetes and other blood sugar disorders
FR2870241B1 (fr) 2004-05-13 2015-02-27 Novartis Ag Facteur de viabilite des cones derive des batonnets ou rdcvf et applications
RU2008123518A (ru) 2005-11-10 2009-12-20 Ресептор Байолоджикс, Инк. (Us) Способы получения изоформ рецепторов и лигандов
EP2027889A1 (en) 2007-06-05 2009-02-25 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) New neuronal viability factor and use thereof
KR100995340B1 (ko) 2007-11-19 2010-11-19 재단법인서울대학교산학협력재단 자연 살해 ｔ 세포의 리간드와 항원을 적재한 단핵구 또는미분화 골수성 세포를 포함하는 백신

Also Published As

Publication number Publication date
US20070243615A1 (en) 2007-10-18
PL1625210T3 (pl) 2011-05-31
EP2281877A3 (en) 2011-06-01
US9528126B2 (en) 2016-12-27
US20050042740A1 (en) 2005-02-24
JP2010155868A (ja) 2010-07-15
JP2006528886A (ja) 2006-12-28
ATE490307T1 (de) 2010-12-15
EP1625210B1 (en) 2010-12-01
SI2277996T1 (sl) 2014-12-31
WO2004113494A3 (en) 2006-01-26
US20220364111A1 (en) 2022-11-17
PT2277996E (pt) 2014-12-16
US20120135515A1 (en) 2012-05-31
US7261544B2 (en) 2007-08-28
EP1625210A4 (en) 2006-07-12
US20200157566A1 (en) 2020-05-21
US20170260545A1 (en) 2017-09-14
JP2020048586A (ja) 2020-04-02
DE602004030327D1 (de) 2011-01-13
JP2012235788A (ja) 2012-12-06
EP2277996A2 (en) 2011-01-26
JP4559429B2 (ja) 2010-10-06
JP5166477B2 (ja) 2013-03-21
CY1115788T1 (el) 2017-01-25
EP2277996B1 (en) 2014-09-03
PT1625210E (pt) 2011-03-15
US20190032081A1 (en) 2019-01-31
EP2281877A2 (en) 2011-02-09
WO2004113494A2 (en) 2004-12-29
EP2277996A3 (en) 2011-06-01
US8137948B2 (en) 2012-03-20
ES2521682T3 (es) 2014-11-13
US11261463B2 (en) 2022-03-01
JP2018082721A (ja) 2018-05-31
EP1625210A2 (en) 2006-02-15
DK2277996T3 (da) 2014-10-20
EP2781596A1 (en) 2014-09-24
PL2277996T3 (pl) 2015-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11261463B2 (en) Methods for producing preparations of recombinant AAV virions substantially free of empty capsids
Robert et al. Manufacturing of recombinant adeno‐associated viruses using mammalian expression platforms
Ayuso et al. Production, purification and characterization of adeno-associated vectors
JP6165752B2 (ja) アデノ随伴ウイルスの産生のための細胞株
US11702639B2 (en) Column-based fully scalable rAAV manufacturing process
Smith et al. Serum-free production and column purification of adeno-associated virus type 5
JP2018518164A (ja) 多段階陰イオン交換クロマトグラフィーによる組換えアデノ随伴ウイルス粒子の精製
CA2787827A1 (en) A scalable manufacturing platform for viral vector purification and viral vectors so purified for use in gene therapy
US20030134404A1 (en) Methods for producing stocks of recombinant AAV virions
JP2023525119A (ja) アデノ随伴ウイルス粒子またはアデノウイルスを精製するための方法および組成物
WO2022045055A1 (ja) ｐＨの違いによる非エンベロープウイルスベクター粒子の調製方法
ES2357131T3 (es) Procedimientos para producir preparaciones de viriones de aav recombinantes sustancialmente exentas de cápsidas vacías.
WO2024119031A1 (en) Adeno-associated virus production platform
JP2024511409A (ja) 空および完全ａａｖキャプシドのサイズ排除クロマトグラフィー解析
WO2024056561A1 (en) Method for separating full and empty aav particles

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20160205

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20161202

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20170301

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20170428

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20171003

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180205

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20180213

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20180215