JP2023510186A - Ｃｒｘ常染色体優性網膜症の処置のための遺伝子治療 - Google Patents

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Abstract

Figure 2023510186000001
対象におけるコーンロッドホメオボックス転写因子（CRX）常染色体優性網膜症を処置するための方法が開示される。これらの方法は、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む有効量の核酸分子を、対象へ投与する工程を含む。対象におけるCRX常染色体優性網膜症の処置において使用するための、CRXをコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む有効量の核酸分子を含む組成物が開示される。SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列を含む網膜特異的プロモーターが開示される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、参照により本明細書に組み入れられる、2020年1月17日に出願された米国仮出願第62/962,732号の恩典を主張するものである。
政府の支援に関する記述
本発明は、National Institutes of Health,National Eye Institute Intramural Research Programによるプロジェクト番号：ZIAEY000474、ZIAEY000450、およびZIAEY000546の下で政府の支援を受けて作成された。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
開示の分野
本願は、コーンロッドホメオボックス（cone rod homeobox）転写因子（CRX）常染色体優性網膜症の領域に関し、具体的には、これらの網膜症の処置のための、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む核酸分子の使用に関する。
背景
遺伝性網膜疾患（IRD）は、世界中で登録されている、大部分が治癒不能な失明の主な原因である。300もの遺伝子の変異が、IRDを引き起こす可能性があり、およそ70の遺伝子が、最も一般的な状態、網膜色素変性症（RP）の原因として同定されている（インターネット上で入手可能な情報、例えば、sph.uth.edu/retnet/を参照すること）。IRDは、現在、記載されているヒトの遺伝性疾患の中で最も多様である。レーバー先天黒内障（LCA）は、RP遺伝子と重複している少なくとも25の原因遺伝子による、（幼児における）早期発症型失明性疾患の群を構成する。典型的には、IRDは、光検出能力の低下をもたらし、最終的に、失明をもたらす、眼の後ろの網膜における光を感知する光受容細胞の漸進的な喪失を特徴とする。最も一般的な遺伝モードは、常染色体劣性、常染色体優性、およびX連鎖であるが、2遺伝子性およびミトコンドリア性の病因も観察されている。同じ遺伝子に異なる変異を有する患者のみならず、全く同じ変異を有する患者も、多岐にわたる臨床表現型を示すことが多く、それが、患者カウンセリングおよび疾患管理を困難にしている。多くの病理学的変異が、網膜内の光受容体特異的機能に影響する遺伝子に見出される（den Hollander et al.,Prog Retin Eye Res,27,391-419（非特許文献1）；Wright et al.,Nat Rev Genet,11,273-284（非特許文献2））。常染色体優性網膜症を処置するために使用され得る遺伝子治療方法が、必要とされている。
den Hollander et al.,Prog Retin Eye Res,27,391-419 Wright et al.,Nat Rev Genet,11,273-284
開示の概要
対象におけるCRX常染色体優性網膜症を処置する方法が、開示される。これらの方法は、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む有効量の核酸分子を、対象へ投与することを含み、それによって、対象におけるCRX常染色体優性網膜症を処置する。
付加的な態様において、対象におけるCRX常染色体優性網膜症の処置において使用するための、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む有効量の核酸分子を含む組成物が、開示される。
さらなる態様において、SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列を含むプロモーターが、開示される。このプロモーターは、開示された方法において使用され得る。
本発明の上記および他の特色および利点は、添付の図面を参照しながら進む、いくつかの態様の以下の詳細な説明から、より明らかになるであろう。
図1A～1L．c.413delT（p.I138fs48）変異を有するCRX-LCA網膜オルガノイドにおける光受容体成熟の障害。（A～B）CRXドメイン構造および病理学的変異の効果の概略図（A）ならびに網膜オルガノイド分化プロトコル（B）。（C）125日目のリカバリン、Sオプシン、およびロドプシンについての免疫染色。スケールバー50μm。（D）オルガノイド面積当たりのSオプシン+細胞の数の定量化。（E）個々の細胞における平均Sオプシン蛍光強度の定量化。（F）（E）における試料についての最大蛍光強度値のヒストグラム。（G）ロドプシン蛍光強度値の定量化。（H）識別可能なロドプシン免疫染色を示すオルガノイドのパーセンテージ。125日目の（D～H）の全てのオルガノイド。（I）230日目の対照オルガノイドまたはCRX-I138fs患者オルガノイドにおけるロドプシンおよびL/Mオプシンの全組織標本免疫染色。核はDAPIで対比染色されている。スケールバー200μm。（J）d200におけるペリフェリン2およびCTBP2（リブアイ（Ribeye））についての免疫染色。スケールバー20μm。（K～L）ペリフェリン2斑点（K）およびCTBP2蛍光強度（L、n=3）の定量化。スチューデントt検定によって決定された統計的有意性。 図1-1の説明を参照のこと。 図1-1の説明を参照のこと。 図1-1の説明を参照のこと。 図1-1の説明を参照のこと。 図1-1の説明を参照のこと。 図2A～2D．ヒト網膜オルガノイド組織における発現のためのヒトCRXプロモーター要素の試験。（A～C）120日目に、網膜オルガノイドを形質導入するため、GFPレポーターの上流にCMVプロモーター（A）または631bpヒトCRXプロモーター要素（B、C）をコードするAAVベクターを使用した。低用量の5×1010ウイルスゲノム/オルガノイド（B）または高用量の1011vg/オルガノイド（C）は、220日目に、光受容細胞が存在する外側オルガノイド層の類似の形質導入をもたらした。（D）外側光受容細胞層における広範なGFPレポーター発現を示す、220日目の後期オルガノイド。スケールバー100μm。 図2-1の説明を参照のこと。 図3A～3H．処置の4週間後のロドプシンおよびMオプシンのレスキュー（CRX c.413delT（p.I138fs48）変異を有する1人目の対象）。フレームシフトCRX変異患者c.413delT（p.I138fs48）に由来する網膜オルガノイドを、120日目に、AAV-CRXベクターによって形質導入し、4週間後の150日目に、免疫組織化学によって分析した。ロドプシン染色は、対照には存在したが（A）、CRX-I138fs患者試料には存在しなかった（B）。処置されたオルガノイドは、レスキューされた発現を有する細胞の画分を示した（C）。同様に、L/Mオプシンは、対照（D）に存在し、患者（E）には存在せず、処置後に部分的に回復された（F）。ロドプシン（G）またはL/Mオプシン（H）についての免疫染色を示すCRX陽性細胞のパーセンテージの定量化。各群3オルガノイド、スチューデントt検定、示されたp値。 図3-1の説明を参照のこと。 AAV処置は、c.413delT（p.I138fs48）患者網膜オルガノイドにおけるロドプシンの頂端蓄積をレスキューする。150日目にAAV-CRXベクターによって処置され、処置の4週間後に収集され、分析され、ロドプシンおよびOTX2について免疫染色された網膜オルガノイド。頂端突起におけるロドプシン蓄積が、ロドプシンのレスキューされた発現を有する細胞に認められる。 図5A～5D．AAV-CRX処置の8週間後のc.413delT（p.I138fs48）CRX-LCA網膜オルガノイドにおけるロドプシン発現の有意な回復。（A）処置タイムラインの概要。（B～D）網膜オルガノイドを凍結切片化し、ロドプシンについて免疫染色し、核をDAPIによって対比染色した。未処置のCRX-I138fs患者オルガノイド（B）は、ロドプシン免疫染色を欠くが、低用量（1×1011vg/オルガノイド；C）および高用量（3×1011vg/オルガノイド；D）のAAV-CRXによって処置されたオルガノイドは、d180にロドプシン染色の回復を示す。 図6A～6C．c.413delT（p.I138fs48）患者網膜オルガノイドのAAV-CRX処置後のロドプシン発現レスキューの定量化。（A）処置のタイムライン。（B）罹患していない家族内対照のオルガノイドならびに未処置の患者オルガノイドおよびAAV-CRXによって処置された患者オルガノイドにおけるロドプシンの免疫染色。（C）家族内対照試料に対するロドプシン蛍光強度の定量化。各群少なくとも3オルガノイド、スチューデントt検定、示されたp値。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図7A～7G．c.413delT（p.I138fs48）患者網膜オルガノイドのAAV-CRX処置後のL/Mオプシン発現の回復。（A）処置のタイムライン。（B～G）未処置（B、E）、低用量AAV（1×1011；C、F）、および高用量（3×1011；D、G）におけるL/Mオプシンについての免疫染色。核はDAPIによる対比染色によって可視化された。（H）家族内対照試料に対するL/Mオプシン蛍光強度の定量化。各群少なくとも3オルガノイド、スチューデントt検定、示されたp値。 c.G264T（p.K88N）CRX-LCA患者（2人目の対象）のオルガノイドの処置。AAV-CRX処置前後の、2人目のCRX-LCA患者に由来するオルガノイドを、（図4～8に示される）1人目の対象の場合と同様に、ロドプシン（RHO）、青オプシン（OPN1S）、赤緑オプシン（OPN1ML）、および桿体アレスチン（SAG）を含むマーカーのパネルについて染色した。スケールバー20μm。核はDAPIによって対比染色された。 図9A～9I．d200のCRX-I138fs48患者網膜オルガノイドの錐体および桿体の光受容体サブタイプにおける遺伝子発現パターンの変更およびAAV処置効果。（A）上パネル:（既知の細胞型マーカー遺伝子を使用して注釈が付けられた）主な細胞型を表示する単一細胞RNA-seqデータセット（n＝40,712トランスクリプトーム）のUMAP表示。下パネル:対照オルガノイド試料（n＝2生物学的反復、各4オルガノイド）および未処置オルガノイド試料およびAAV-CRXオルガノイド試料（n＝2生物学的反復、各3オルガノイド）の細胞の分布を示すUMAPプロット。（B）光受容細胞型特異的マーカー（CRX、RCVRN）およびサブタイプ特異的マーカー（桿体：GNGT1、GNAT1；錐体：ARR3、PDE6H）の発現。（C）桿体および錐体におけるCRX発現レベルのバイオリンプロットプロファイル。AAV-CRX遺伝子増大による発現の増加に注意すること。桿体（D～F）および錐体（G～I）の光受容体サブタイプにおける処置効果。（D、G）試料起源別の桿体細胞および錐体細胞の分布を示すUMAPプロット。（E、H）細胞起源の同一性を図示する六角形ビンプロット。患者区域と対照区域（濃灰色の陰影）との間にAAV-CRX処置試料（薄灰色）が位置することに注意すること。（F、I）処置後の患者由来試料における発現の増加を視覚化する、異なる試料におけるオプシン転写物リード。転写物リードが検出された各起源の細胞のパーセンテージが示される。 図9Aの説明を参照のこと。 図9Aの説明を参照のこと。 図9Aの説明を参照のこと。 図9Aの説明を参照のこと。 図9Aの説明を参照のこと。 図9Aの説明を参照のこと。 図9Aの説明を参照のこと。 図9Aの説明を参照のこと。 図10A～10G．単一細胞トランスクリプトミクスによって明らかにされたCRX-LCA網膜オルガノイドにおける細胞型多様性および遺伝子増大効果。（A）d200の対照（12496細胞）、未処置（12126細胞）、およびAAV処置CRX-I138fs（15550細胞）オルガノイドから得られた単一細胞トランスクリプトームプロファイルの数。（B）様々な条件における細胞型分布。 図10A～10G．単一細胞トランスクリプトミクスによって明らかにされたCRX-LCA網膜オルガノイドにおける細胞型多様性および遺伝子増大効果。（C）統合データセットにおける割り当てられた各細胞クラスにおいて最も有意に濃縮されていた上位3つの転写物のヒートマップ。分子マーカーが、実験条件において細胞型を定義するために使用された。 図10A～10G．単一細胞トランスクリプトミクスによって明らかにされたCRX-LCA網膜オルガノイドにおける細胞型多様性および遺伝子増大効果。（D）桿体光受容体においてAAV処置によってレスキューされた具体的な転写物発現の例。全ての遺伝子について、調整済みp値＜0.05、ボンフェローニ補正ウィルコクソン順位和検定；最小発現パーセント（min.percent expressed）＝10％細胞、最小対数倍率変化（min.log fold change）＝0.25。（E）AAV処置によってレスキューされた錐体転写物の例。 図10A～10G．単一細胞トランスクリプトミクスによって明らかにされたCRX-LCA網膜オルガノイドにおける細胞型多様性および遺伝子増大効果。（F、G）AAV処置後に、より高い発現の傾向を示した、桿体（F）および錐体（G）の光受容体における、CRXの網膜疾患に関連した直接転写標的であるCABP4の発現。 図11A～11E．CRX-K88N患者iPSCに由来する網膜オルガノイドの分化。（A）対照およびCRX-K88N iPSC株の代表的なカリオグラム。（B）対照およびCRX-K88N iPSCコロニーにおける多能性マーカーおよび増殖マーカーを使用した免疫染色。（C）d90のオルガノイド網膜上皮の明視野像。スケールバー、200μm。（D）分化のd70の対照およびCRX-K88N網膜オルガノイドにおけるOTX2、CRX、およびリカバリンについての免疫染色。3つのマーカーは、全て、2つの遺伝子型の間で類似の染色を示した。（E）対照およびCRX-K88N網膜オルガノイドにおけるSオプシンおよびカルビンジンについての免疫染色。d200の患者オルガノイドにおけるカルビンジン染色の増加に注意すること。B、D、Eのスケールバー、100μm。 図11-1の説明を参照のこと。 図11-1の説明を参照のこと。 図12A～12G．CRX-K88N患者網膜オルガノイドの疾患表現型および遺伝子増大治療。（A）低下した外節（OS）頂端「刷子」層（矢じり）を示す対照およびCRX-K88N患者オルガノイドの明視野像。（B）外節様層の厚さの定量化；n＝各群6オルガノイド、各3切片；平均値±SD、一元配置分散分析からのp値。（C）CRX、リカバリン、ならびにオプシンタンパク質、ロドプシンおよびL/Mオプシンについてのd200のオルガノイドの免疫染色。患者由来のオルガノイドにおけるロドプシンおよびL/Mオプシンの染色の減少に注意すること。（D）d120およびd200のオルガノイドの遺伝子（バルクRNA-seq）の発現を比較したヒートマップ。多くの光受容体特異的転写物の発現が、CRX-K88N患者試料において、遅延しているか、または低下している。ノーマライズされたlog2（CPM+1）値がプロットされた。TF－転写因子、OS－外節。（E）免疫染色によるAAV処置の査定。ロドプシンおよびL/Mオプシンの両方に対する免疫反応性が、AAV処置後に部分的に回復する。全てのスケールバー100μm。（F）AAVによって処置された網膜オルガノイドにおけるロドプシン蛍光強度の定量化。対照n＝6、未処置n＝5、およびAAV処置n＝6オルガノイド；各3切片。平均値±SD、一元配置分散分析からのp値。（G）AAVによって処置された網膜オルガノイドにおけるL/Mオプシン+錐体のパーセンテージの定量化。対照n＝7、未処置n＝7、およびAAV処置n＝8オルガノイド；各3切片。平均値±SD、一元配置分散分析からのp値。 図12Aの説明を参照のこと。 図12Aの説明を参照のこと。 図12Aの説明を参照のこと。 図12Aの説明を参照のこと。 図12Aの説明を参照のこと。 図12Aの説明を参照のこと。 図13A～13B．CRX-K88N網膜オルガノイドのAAV処置。（A）d200の対照、未処置、およびAAV処置オルガノイドにおけるCRXタンパク質のイムノブロット分析。αチューブリンを負荷対照として使用した。CRXの分子量は左側に示されている。（B）対照、未処置、およびAAV処置CRX-K88Nオルガノイドにおける網膜マーカー、Sオプシン、SAG（桿体視覚アレスチン）、ならびにシナプスタンパク質、CTBP2（リブアイ）およびバスーン（Bassoon）（BSN）の免疫染色。異常に高いSオプシン染色は、AAV処置後に低下する。各群において調査されたn＝4オルガノイドは、一貫したパターンを示した。患者のオルガノイドにおいて検出不能であるSAG発現が、中程度にレスキューされ、シナプス区域は、CRX増大後に、質的に、より顕著な染色を示す。
配列表
添付の配列表に列挙される核酸配列およびアミノ酸配列は、37 C.F.R.1.822において定義されているヌクレオチド塩基のための標準的な略語、およびアミノ酸のための3文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、表示された鎖の参照によって、相補鎖も含まれると理解される。配列表は、参照により本明細書に組み入れられるASCIIテキストファイル［Sequence_Listing、2021年1月15日、3.90KB］として提出される。添付の配列表において：
SEQ ID NO:1は、組換えヒトCRXプロモーターの核酸配列である。
SEQ ID NO:2は、ヒトCRXタンパク質のアミノ酸配列である。
いくつかの態様の詳細な説明
CRX遺伝子は、網膜光受容体の発達および機能に必須である転写制御タンパク質をコードする。CRXの変異は、光受容体の機能障害を引き起こし、明確な網膜疾患表現型をもたらす。CRXにおける特定の優性変異は、先天性失明をもたらし得、劣性変異は、後に発症する光受容体機能障害をもたらす。全長ヒトCRXタンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結された組換えCRXプロモーターを含む核酸分子を、常染色体優性CRX網膜症を矯正するために使用した。2つの異なる優性CRX変異を有する患者に由来する誘導多能性幹細胞から分化させたヒト網膜オルガノイド組織を使用して、この構築物の治療可能性を試験した。核酸分子は、ヒト幹細胞由来網膜組織をインビトロで形質導入することができ、その投与は、常染色体優性CRX網膜症を有する患者において、患者の光受容体を回復させ、例えば、ヒト網膜における光の検出のために必要とされる2つのタンパク質、ロドプシンおよびM/Lオプシンの発現を部分的にレスキューした。
患者生検試料に由来する細胞を、誘導多能性幹細胞（iPSC）へ初期化した。CRX変異を有する患者および家族内の健常対照から得られたiPSCを、網膜オルガノイドへ分化させた。これらのオルガノイドは、天然ヒト網膜の重要な特徴、例えば、分子マーカーの発現および細胞型組成および組織構造を示す系を表す。異なる常染色体優性CRX変異を有する患者は、変動する重症度を有する、ある範囲の臨床表現型を提示し、それらは、本開示の方法を使用して処置され得た。
用語
用語および方法の以下の説明は、本開示をよりよく説明し、本開示の実施において当業者を案内するために提供される。単数形「a」、「an」、および「the」は、前後関係が明らかに他のことを指示をしない限り、1または複数をさす。例えば、「細胞を含む（comprising a cell）」という用語は、単一の細胞または複数の細胞を含み、「少なくとも1つの細胞を含む（comprising at least one cell）」という語句と等価であると見なされる。「または」という用語は、前後関係が明らかに他のことを指示をしない限り、記述された代替的な要素のうちの単一の要素、または2つ以上の要素の組み合わせをさす。従って、「AまたはBを含む」とは、付加的な要素を除外することなく、「Aを含むか、Bを含むか、またはAおよびBを含む」を意味する。本明細書において使用されるように、「含む（comprises）」は、「含む（includes）」を意味する。他に示されない限り、「約」は、5％以内を意味する。本明細書において言及されるGENBANK（登録商標）アクセッション番号の日付は、少なくとも2019年12月31日時点で入手可能な配列である。本明細書において引用された参考文献、特許出願および刊行物、ならびにGENBANK（登録商標）アクセッション番号は、全て、参照により組み入れられる。本開示の様々な態様の概説を容易にするため、特定の用語の説明を以下に提供する：
アデノ随伴ウイルス（AAV）：AAVは、ヒトおよび他のいくつかの霊長類種を感染させる小さいウイルスである。AAVは、現在、疾患を引き起こさないことが公知であり、従って、ウイルスは、極めて軽度の免疫反応を引き起こす。AAVは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させることができ、宿主細胞において、主に、エピソーム形態として存在する。AAVゲノムは、約4.7キロ塩基（kb）長であるプラス鎖またはマイナス鎖のいずれかの一本鎖デオキシリボ核酸（ssDNA）から構築されている。ゲノムは、DNA鎖の両端にある末端逆位配列（ITR）と、2つのオープンリーディングフレーム（ORF）（repおよびcap）とを含む。Repは、AAV生活環のために必要とされるRepタンパク質をコードする、4つのオーバーラップする遺伝子から構成され、Capは、共に相互作用して二十面体対称のカプシドを形成するカプシドタンパク質、VP1、VP2、およびVP3のオーバーラップするヌクレオチド配列を含有する。遺伝子治療のため、治療用遺伝子の隣にシスに必要とされる配列は、ITRのみであると考えられ：構造遺伝子（cap）およびパッケージング遺伝子（rep）は、トランスに送達され得る。
常染色体優性：疾患に罹患した個体が、一対の常染色体上に、変異遺伝子1コピーおよび正常遺伝子1コピーを有する遺伝のパターン。対照的に、常染色体劣性疾患は、個体が疾患の影響を受けるためには、個体が変異遺伝子を2コピー有することを必要とする。
細胞培養物：調節された条件の下で成長させられた細胞。初代細胞培養物とは、生物から直接採取された、最初の継代培養の前の、細胞、組織、または器官の培養物である。細胞は、細胞の成長および/または分裂を容易にする条件の下で成長培地中に置かれた時、培養中に増大し、より大きい細胞集団をもたらす。「オルガノイド」とは、例えば、iPSCから、インビトロで作製される器官である。
錐体桿体ジストロフィー：小児期にしばしば起こる錐体桿体ジストロフィーの最初の徴候および症状は、一般的に、視覚の鮮明さ（視力）の減少、および光に対する感受性の増加（羞明）である。これらの特色の後に、典型的には、色覚障害（色覚異常）、視野の中心における盲点（暗点）、および部分的な外側（周辺）視覚喪失が起こる。時間が経つにつれて、影響を受けた個体は、自由な移動を制限し得る、夜盲症および周辺視覚の悪化を発症する。錐体ジストロフィーは、明順応系の進行性の機能障害を特徴とし、暗順応機能は保存される。異常な桿体機能は、初期症候の一部であり得るが、桿体の関与は、より軽度であるか、または錐体機能障害より後に起こり得る。錐体桿体ジストロフィーには30を超える型が存在し、それらは、遺伝的原因ならびに遺伝パターン（常染色体劣性、常染色体優性、およびX連鎖）によって区別される。30を超える遺伝子の変異が、錐体桿体ジストロフィーを引き起こすことが公知である。これらの遺伝子のうちのおよそ20は、常染色体劣性パターンで遺伝する錐体桿体ジストロフィーの型に関連している。GUCY2D遺伝子およびCRX遺伝子の変異は、この疾患の常染色体優性型の約半分を説明する。
コーンロッドホメオボックス転写因子（CRX）網膜症：CRX遺伝子の変異に起因する網膜症。これらの変異は、重症早期発症レーバー先天黒内障（LCA、LCA7、MIM＃613829）から、成人発症錐体桿体ジストロフィー（CORD2、MIM＃120970）、網膜色素変性症（RP、MIM＃268000）、軽度遅発性黄斑ジストロフィーまでの範囲のジストロフィーにおいて同定されている。CRX網膜症を引き起こす可能性の高いおよそ50の病理学的変異が記載されており、これらの半分は疾患表現型と同時分離する。報告された変異は、39％がミスセンス、4％がナンセンス、37％が欠失、16％が挿入、4％が挿入欠失（挿入および欠失）の配列変化である。CRX網膜症は、常染色体優性、常染色体劣性、またはX連鎖であり得る。CRXの変異に関連する3つの主要な遺伝性網膜ジストロフィーは、レーバー先天黒内障（LCA）、網膜色素変性症（RP）、および錐体桿体ジストロフィー（CORD）である。CRX網膜症における一般的な特色は、黄斑萎縮である。
デンドリマー：性質および機能性を容易に調節し、変動させることができる、単純な分岐単量体単位から段階的に調製される合成三次元高分子。デンドリマーは、多官能性コアへのビルディングブロックの反復的な付加から合成されるか（ディバージェント（divergent）型合成アプローチ）、または多官能性コアに向けて合成され（コンバージェント（convergent）型合成アプローチ）、ビルディングブロックの三次元シェルの各付加は、より高次のデンドリマーの形成をもたらす。デンドリマーは、核酸分子の送達のために使用され得る。
下流：ポリヌクレオチド上の相対的な位置であって、「下流」位置は、ポリヌクレオチドの3'末端に、基準点より近い。二本鎖ポリヌクレオチドの場合、5'末端および3'末端の方向は、アンチセンス鎖と反対の、センス鎖に基づく。
有効量：その薬剤によって処置された対象または細胞において所望の効果を達成するために十分な、特定の薬学的薬剤または治療用薬剤の量。薬剤、例えば、核酸分子の有効量は、処置される対象または細胞、および治療用組成物の投与の様式を含むが、これらに限定されるわけではない、いくつかの因子に依存するであろう。有効量は、網膜症を有する対象を処置するために十分な量であり得る。
発現調節配列：機能的に連結されている異種核酸配列の発現を制御する核酸配列。発現調節配列が、核酸配列の転写を調節し、制御し、適宜、翻訳も調節し、制御する時、その発現調節配列は、その核酸配列に機能的に連結されている。従って、発現調節配列には、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（即ち、ATG）、イントロンのためのスプライシングシグナル、mRNAの適切な翻訳を可能にするためのその遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、および終止コドンが含まれ得る。「調節配列」という用語には、少なくとも、その存在が発現に影響を与え得る成分が含まれるものとし、その存在が有利である付加的な成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含まれ得る。発現調節配列には、プロモーターが含まれ得る。
異種：異種配列は、通常（野生型配列において）第2の配列に隣接して見出されない配列である。1つの態様において、配列は、第2の配列とは異なる遺伝子起源、例えば、ウイルスまたは生物に由来する。もう1つの態様において、異種配列は、野生型配列の隣に通常存在しない組換え配列である。
疾患を阻害すること、または処置すること：疾患、例えば、常染色体優性網膜症、例えば、限定されるわけではないが、常染色体優性CRX網膜症、例えば、限定されるわけではないが、LCAのリスクを有する対象において、疾患または状態の完全な発症を阻害すること。「処置」とは、疾患または病理学的状態が発症し始めた後に、その徴候または症状を寛解させる治療的介入をさす。「寛解させること」という用語は、疾患または病理学的状態に関して、処置の任意の観察可能な有益な効果をさす。有益な効果は、例えば、感受性の対象における疾患の臨床症状の発症の遅延、疾患のいくつかまたは全ての臨床症状の重症度の低下、疾患のより遅い進行、対象の全体的な健康もしくは福祉の改善、または特定の疾患に特異的である当技術分野において周知の他のパラメータ、例えば、視覚の改善によって証拠付けられ得る。処置は、身体検査、神経学的検査、または視覚検査の結果を含むが、これらに限定されるわけではない、客観的または主観的なパラメータによって査定され得る。「予防的」処置とは、疾患の徴候を示さないか、または初期の徴候のみを示す対象へ、病態を発症するリスクを減少させる目的で投与される処置である。
眼内投与：局所的に、眼内に直接、例えば、硝子体もしくは前房への送達によって、または網膜下に、薬剤を投与すること。（例えば、角膜を通した拡散による）間接的な眼内送達は、眼への直接投与ではない。
硝子体内投与：薬剤を硝子体腔内に投与すること。硝子体腔とは、水晶体およびその懸垂装置（毛様小体）を前縁とし、網膜およびそのコーティングを周縁とする、眼のコアの体積の大部分を占める空間である。硝子体内投与は、注射、ポンプ、または移植片によって達成され得る。
単離された：「単離された」生物学的成分は、その成分が天然に存在する生物の細胞の他の生物学的成分、例えば、他の染色体および染色体外のDNAおよびRNA、ならびにタンパク質から実質的に分離されているか、別に作製されているか、または精製されている。従って、「単離」されている核酸、ペプチド、およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語には、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸、ペプチド、およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸も包含される。
レーバー先天黒内障（LCA）：出生時または生後初期（乳児期もしくは幼児期）に現れ、主に網膜に影響を与える希少な遺伝性眼疾患。複数の遺伝子に関連しているため、その症候は変動し得る。しかしながら、それは、眼振、羞明、瞳孔反応の緩慢または欠如、および重度の視覚喪失または失明を特徴とする。遺伝の一般的なモードは、常染色体劣性および常染色体優性である。
瞳孔は、通常、眼に入る光の量に反応して拡大し、収縮するが、それが、光に正常に反応しなくなる。その代わり、通常より遅く拡大し、収縮するか、または光に全く反応しない場合もある。さらに、眼の前面の透明な被膜（角膜）が、円錐形になり、異常に薄くなる場合があり、この状態は円錐角膜として公知である。
フランチェスケッティの眼球手指徴候（Franceschetti's oculo-digital sign）と呼ばれる特定の行動は、レーバー先天黒内障の特徴である。この徴候は、指関節または指で眼を突いたり、押したり、こすったりすることからなる。
ナノ粒子：包囲界面層を有する1～100ナノメートル（nm）のサイズの粒子。界面層は、ナノスケール物体の不可欠な部分であり、基本的にその特性の全てに影響を与える。界面層は、典型的には、イオン、無機分子、および/または有機分子からなる。
核酸：ホスホジエステル結合、関連する天然に存在する構造バリアント、およびそれらの合成の天然に存在しない類似体を介して連結されたヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、関連する天然に存在する構造バリアント、およびそれらの合成の天然に存在しない類似体）から構成されたポリマー。従って、この用語には、ヌクレオチド、およびそれらの間の連結が、天然に存在しない合成類似体、例えば、限定されるわけではないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル-メチルホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）等を含むヌクレオチドポリマーが含まれる。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、自動DNA合成機を使用して合成され得る。「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には、短い、一般に、約50ヌクレオチド以下のポリヌクレオチドをさす。ヌクレオチド配列がDNA配列（即ち、A、T、G、C）によって表される時、これには、「T」が「U」に置き換わったRNA配列（即ち、A、U、G、C）も含まれることが理解されるであろう。
ヌクレオチド配列を記載するため、従来の表記法が本明細書において使用される：一本鎖ヌクレオチド配列の左側の末端は、5'末端であり；二本鎖ヌクレオチド配列の左側の方向は、5'方向と呼ばれる。新生RNA転写物へのヌクレオチドの付加の5'から3'への方向は、転写方向と呼ばれる。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖は、「コード鎖」と呼ばれ、そのDNAから転写されたmRNAと同じ配列を有し、RNA転写物の5'末端の5'側に位置するDNA鎖上の配列は、「上流配列」と呼ばれ、RNAと同じ配列を有し、コードRNA転写物の3'末端の3'側にあるDNA鎖上の配列は、「下流配列」と呼ばれる。
「cDNA」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、mRNAと相補的または同一であるDNAをさす。
「コードする」とは、明確なヌクレオチド配列（即ち、rRNA、tRNA、およびmRNA）、または明確なアミノ酸配列、ならびにそれらに起因する生物学的特性のいずれかを有する、生物学的過程における他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として機能する、ポリヌクレオチド、例えば、遺伝子、cDNA、またはmRNAの特定のヌクレオチド配列の固有の特性をさす。従って、遺伝子によって産生されるmRNAの転写および翻訳が、細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合、その遺伝子は、そのタンパク質をコードする。遺伝子またはcDNAの、ヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、一般的に、配列表に提供されるコード鎖、および転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方が、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードすると呼ばれ得る。他に特記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、相互の縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質およびRNAをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。
「組換え核酸」とは、天然には共に接合されていないヌクレオチド配列を有する核酸をさす。これには、適当な宿主細胞を形質転換するために使用され得る、増幅された、または組み立てられた核酸を含む核酸ベクターが含まれる。組換え核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれる。次いで、遺伝子は、例えば、「組換えポリペプチド」を産生するため、組換え宿主細胞において発現される。組換え核酸は、非コード機能も果たし得る（例えば、プロモーター、複製開始点、リボソーム結合部位）。
第1の配列である配列を有するポリヌクレオチドが、第2の配列である配列を有するポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする場合、その第1の配列は、その第2の配列に対して「アンチセンス」である。
2つ以上のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の配列関係を記載するために使用される用語には、「参照配列」、「より選択される」、「比較ウィンドウ」、「同一」、「配列同一性のパーセンテージ」、「実質的に同一」、「相補的」、および「実質的に相補的」が含まれる。
核酸配列の配列比較のため、典型的には、1つの配列が参照配列として働き、試験配列がそれと比較される。配列比較アルゴリズムを使用する時には、試験配列および参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトのプログラムパラメータが使用される。比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981のローカルホモロジーアルゴリズム、Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson & Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444,1988の類似性検索法（search for similarity method）、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group（575 Science Dr.,Madison,WI）のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）、または手動アライメントおよび目視検査（例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds 1995 supplement)を参照すること）によって実施され得る。
有用なアルゴリズムの一例は、PILEUPである。PILEUPは、Feng & Doolittle,J.Mol.Evol.35:351-360,1987のプログレッシブ（progressive）アライメント法の単純化を使用する。使用される方法は、Higgins & Sharp,CABIOS 5:151-153,1989に記載された方法と類似している。PILEUPを使用して、以下のパラメータ：デフォルトのギャップウェイト（gap weight）（3.00）、デフォルトのギャップレングスウェイト（gap length weight）（0.10）、および重み付きエンドギャップ（weighted end gaps）を使用して、配列同一性関係のパーセンテージを決定するため、参照配列が他の試験配列と比較される。PILEUPは、GCG配列分析ソフトウェアパッケージ、例えば、バージョン7.0から入手され得る（Devereaux et al.,Nuc.Acids Res.12:387-395,1984）。
配列同一性および配列類似性のパーセンテージを決定するために適当であるアルゴリズムのもう1つの例は、Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990およびAltschul et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1977に記載されている、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通して公に入手可能である。（ヌクレオチド配列用の）BLASTNプログラムは、デフォルトとして、11のワードレングス（word length）（W）、50のアライメント（B）、10の期待値（E）、M＝5、N＝-4、および両方の鎖の比較を使用する。（アミノ酸配列用の）BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワードレングス（W）、および10の期待値（E）、およびBLOSUM62スコアリングマトリックスを使用する（Henikoff & Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915,1989を参照すること）。
機能的に連結された：第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的な関係に置かれている時、その第1の核酸配列は、その第2の核酸配列と機能的に連結されている。例えば、プロモーターが、コード配列の転写または発現に影響する場合、そのプロモーターは、そのコード配列に機能的に連結されている。一般に、機能的に連結されたDNA配列は、連続しており、2つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合には、同じリーディングフレーム内にある。
薬学的に許容される担体：本発明において有用な薬学的に許容される担体は、従来のものである。Remington’s Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,15th Edition(1975)は、本明細書に開示された融合タンパク質の薬学的送達のために適当な組成物および製剤を記載している。
一般に、担体の性質は、利用される特定の投与モードに依存するであろう。例えば、非経口製剤は、一般的に、薬学的かつ生理学的に許容される液体、例えば、水、生理学的生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロール等を媒体として含む注射可能な液体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤、またはカプセルの形態）のための従来の非毒性固体担体には、例えば、薬学的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、微量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤等、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有することができる。
薬学的薬剤：対象または細胞へ適切に投与された時に所望の治療的または予防的な効果を誘導することができる、例えば、核酸分子を含む、化学的化合物または組成物。「インキュベートすること」は、薬物が細胞と相互作用するために十分な量の時間を含む。「接触させること」は、固体または液体の形態の薬物を細胞と共にインキュベートすることを含む。
タンパク質：3つ以上の共有結合したアミノ酸。この用語には、ポリペプチド、タンパク質断片、およびタンパク質ドメインが包含される。「DNA結合」ポリペプチドとは、DNAと特異的に結合する能力を有するポリペプチドである。
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語には、具体的には、天然に存在するタンパク質、および組換えまたは合成によって作製されたものが内含されるものとする。「タンパク質の機能性断片」および「ポリペプチドの機能性断片」という用語は、ポリペプチドの活性を保持するポリペプチドの全ての断片をさす。生物学的に機能性の断片は、例えば、抗体分子と結合することができるエピトープのように小さいポリペプチド断片から、細胞内の表現型変化の特徴的な誘導または初期化に関与することができる大きいポリペプチドまで、変動するサイズを有し得る。「エピトープ」は、抗原との接触に反応して生成される免疫グロブリンと結合することができるポリペプチドの領域である。従って、インスリンの生物学的活性を含有する、より小さいペプチド、またはインスリンの保存的バリアントが、従って、有用であるものとして含まれる。
保存的置換とは、サイズ、疎水性等が類似しているアミノ酸同士を交換するものである。保存的置換の例を以下に示す：
Figure 2023510186000002
アミノ酸変化をもたらすcDNA配列の変動は、保存的であるか否かに関わらず、コードされるタンパク質の機能的同一性および免疫学的同一性を保存するため、最小限に抑えられるべきである。タンパク質の免疫学的同一性は、それが抗体によって認識されるか否かを決定することによって査定され得；そのような抗体によって認識されるバリアントは、免疫学的に保存されている。cDNA配列バリアントは、好ましくは、20個以下、好ましくは、10個未満のアミノ酸置換を、コードされたポリペプチドに導入するであろう。バリアントアミノ酸配列は、例えば、天然アミノ酸配列と80％、90％、またはさらには95％もしくは98％同一であり得る。
プロモーター：プロモーターは、核酸の転写を指図する核酸調節配列のアレイである。プロモーターは、転写の開始部位付近に必要な核酸配列、例えば、ポリメラーゼII型プロモーターのケースにおいては、TATA要素を含む。プロモーターは、任意で、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置し得る遠位のエンハンサー要素またはリプレッサー要素も含む。
プロモーターは、構成的に活性なプロモーター（即ち、構成的に活性/「オン」状態にあるプロモーター）、誘導性プロモーター（即ち、その状態、活性/「オン」であるか不活性/「オフ」であるかが、外部刺激、例えば、特定の温度、化合物、もしくはタンパク質の存在によって調節されるプロモーター）、空間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター等）であってもよいし、または時間的に制限されたプロモーター（即ち、プロモーターは、胚発生の特定の段階もしくは生物学的過程の特定の段階において「オン」状態もしくは「オフ」状態にある）であってもよい。「網膜特異的」プロモーターは、異なる組織の細胞と比較して、網膜の細胞において、機能的に連結された核酸の転写を指図する。誘導性プロモーターは、ドキシサイクリン；RNAポリメラーゼ、例えば、T7 RNAポリメラーゼ；エストロゲン受容体；エストロゲン受容体融合物；等を含むが、これらに限定されるわけではない分子によって制御され得る。
精製された：「精製された」という用語は、絶対的な純度を必要とせず；むしろ、相対的な用語であるものとする。従って、例えば、精製されたタンパク質調製物とは、言及されたタンパク質が、細胞内のその天然環境におけるタンパク質より純粋であるものである。例えば、タンパク質の調製物は、タンパク質が調製物の全タンパク質含量の少なくとも50％を表すよう精製される。同様に、精製された核酸分子調製物とは、核酸分子が、複雑な混合物を含む環境より純粋であるものである。核酸またはタンパク質の精製された集団は、約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％純粋であるか、または、それぞれ、他の核酸もしくはタンパク質を含まない。
組換え：組換え核酸は、天然に存在しない配列を有するか、またはそうでなければ分離されている2つの配列セグメントの人工的な組み合わせによって作製された配列を有するものである。この人工的な組み合わせは、しばしば、化学合成によって、またはより一般的には、核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子工学的技術によって達成される。同様に、組換えタンパク質は、組換え核酸分子によってコードされるものである。
網膜：光のための光受容体（錐体および桿体）を含有する、眼の光（光子）感受性部分。桿体および錐体は、光感受性色素の使用を通して光知覚を行う。光感受性色素は、オプシンと呼ばれるタンパク質と、ビタミンAのバリアントであるレチネンと呼ばれる発色団とから作られている。桿体はロドプシンを含有し、錐体はヨードプシンを含有する。桿体および錐体は、網膜の出力細胞および神経節細胞において神経放電を誘発する連続ニューロンを通してシグナルを伝達する。視覚シグナルは視神経によって外側膝状体に伝達され、そこから、視覚野（後頭葉）に視覚シグナルが渡され、視覚刺激として登録される。「桿体細胞」または「桿体」は、他の型の視覚光受容体である錐体細胞より、低強度の光において機能することができる、眼の網膜内の光受容細胞である。桿体は、網膜の外縁に集中し、周辺視野において使用される。桿体は、錐体よりわずかに長く細いが、同じ構造的基礎を有する。オプシンまたは色素は、網膜色素上皮上の外側にあり、細胞のホメオスタシスを完成させる。この上皮端は、多くの積み重ねられたディスクを含有する。桿体は、視覚色素のための高い面積を有し、従って、光吸収の実質的な効率を有する。錐体と同様に、桿体細胞は、シナプス終末、内節、および外節を有する。シナプス終末は、もう1つのニューロン、例えば、双極性細胞とシナプスを形成する。内節および外節は、遠位セグメントを裏打ちする繊毛によって接続されている。内節は、細胞小器官および細胞の核を含有し、眼の後ろ側に向いている桿体外節は、光吸収材料を含有する。光によって光色素が活性化されると、桿体細胞の過分極によるシグナルが送られ、桿体細胞が神経伝達物質を送らないようになり、次いで、双極性細胞が双極神経節シナプスにおいて伝達物質を放出し、シナプスを励起させるようになる。「錐体細胞」または「錐体」は、色覚を担い、比較的明るい光の中で最もよく機能する。錐体細胞は、極めて細い錐体が密集している、直径0.3mmの、桿体を含まない区域、中心窩に密集しており、網膜の周辺に向かって急速に数が低下する。ヒトの眼には約600万から700万の錐体が存在し、黄斑に最も集中している。錐体は、（低い光レベルでの視覚を支持する）網膜の桿体細胞より、光感受性が低いが、色の知覚を可能にする。それらは、刺激に対する反応時間が桿体のそれより速いため、より詳細な、より急速な変化を知覚することもできる。ヒトにおいて、錐体は、通常、各々異なる色素を含む3つの型、即ち、S錐体、M錐体、およびL錐体のうちの1つである。従って、各錐体は、短波長、中波長、および長波長の光に相当する可視波長の光に感受性である。3つの型は、個体に依って、それぞれ、420～440nm、534～545nm、564～580nm付近にピーク波長を有する。
網膜色素上皮：基礎となる脈絡膜に付着している神経感覚網膜の直ぐ外側にある、哺乳動物にインビボで存在する六角形細胞の色素層。これらの細胞には、色素顆粒が密集しており、入射光から網膜を遮蔽する。網膜色素上皮は、脈絡膜血液由来物質に対する強固な障壁を維持しながら、低分子、例えば、アミノ酸、アスコルビン酸、およびD-グルコースを供給することによって、網膜環境を維持する限定輸送因子（limiting transport factor）としても機能する。
網膜色素変性症（RP）：網膜における桿体光受容細胞の進行性の変性によって重度の視力障害を引き起こす遺伝性変性眼疾患。この型の網膜ジストロフィーは、年齢とは無関係に初期症状を呈する。網膜色素変性症の初期網膜変性症状は、夜間視覚の減少（夜盲症）および中心周辺視野の喪失を特徴とする。低光視覚を担い、網膜周辺に方向付けられている桿体光受容細胞は、この疾患の非症候型において最初に影響を受ける網膜過程である。視覚機能低下は、遠周辺視野へ比較的急速に進行し、トンネル状視野が増加するにつれて、最終的には中心視野にまで及ぶ。中心視野における色覚、視力、および視界を担う錐体光受容細胞の付随的な異常によって、視力および色覚が損なわれ得る。疾患症状の進行は対称的に起こり、左右両方の眼が、類似した速度で症状を経験する。変異した時に網膜色素変性症表現型を引き起こし得る複数の遺伝子が存在する。RPの遺伝パターンは、常染色体優性、常染色体劣性、X連鎖、および母性（ミトコンドリア性）として同定されており、親世代に存在する特定のRP遺伝子変異に依存する。
配列同一性：アミノ酸配列の間の類似性は、配列同一性とも呼ばれる、配列の間の類似性によって表される。配列同一性は、同一性（または類似性または相同性）のパーセンテージによって測定される場合が多く、そのパーセンテージが高いほど、2つの配列はより類似している。FGFポリペプチドのホモログまたはバリアントは、標準的な方法を使用して整列化された時、比較的高度の配列同一性を保有するであろう。
比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野において周知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが、Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988；Higgins and Sharp,Gene 73:237,1988；Higgins and Sharp,CABIOS 5:151,1989；Corpet et al.,Nucleic Acids Research 16:10881,1988；およびPearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988に記載されている。Altschul,et al.,Nature Genet.,6:119,1994は、配列アライメント方法および相同性計算の詳細な考察を提示する。
NCBI Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）（Altschul,et al.,J.Mol.Biol.215:403,1990）は、配列分析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn、およびtblastxと共に使用するため、いくつかの供給元、例えば、National Center for Biotechnology Information（NCBI,Bethesda,MD）から、そしてインターネット上で入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、インターネット上のNCBIウェブサイトで入手可能である。
ポリペプチドのホモログおよびバリアントは、典型的には、デフォルトパラメータに設定されたNCBI Blast 2.0、gapped blastpを使用して、因子のアミノ酸配列との全長アライメントにおいて計数された、少なくとも約75％、例えば、少なくとも約80％の配列同一性の保有を特徴とする。約30アミノ酸より大きいアミノ酸配列の比較のためには、デフォルトパラメータ（ギャップイグジステンスコスト（gap existence cost）11、および残基当たりギャップコスト（per residue gap cost）1）に設定されたデフォルトのBLOSUM62マトリックスを使用して、Blast 2配列機能が利用される。短い（およそ30アミノ酸未満の）ペプチドを整列化する時、アライメントは、デフォルトパラメータ（オープンギャップ（open gap）9、エクステンションギャップ（extension gap）1ペナルティ）に設定されたPAM30マトリックスを使用して、Blast 2配列機能を使用して実施されるべきである。参照配列とのさらに大きい類似性を有するタンパク質は、この方法によって査定される時、同一性の増加するパーセンテージ、例えば、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を示すであろう。非全長配列が配列同一性について比較される時、ホモログおよびバリアントは、典型的には、10～20アミノ酸の短いウィンドウにおいて少なくとも80％の配列同一性を保有し、参照配列との類似性に依って、少なくとも85％または少なくとも90％もしくは95％の配列同一性を保有し得る。そのような短いウィンドウにおいて配列同一性を決定する方法は、インターネット上のNCBIウェブサイトにおいて入手可能である。これらの配列同一性の範囲は、案内のために提供されているに過ぎず、提供された範囲に含まれない強く有意なホモログを得ることも全く可能であることを、当業者は理解するであろう。
対象：ヒトおよび非ヒト動物、例えば、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類。記載された方法の多くの態様において、対象はヒトである。
トランス活性化因子：プロモーターからの遺伝子発現を増加させるよう作用する因子。トランス活性化因子遺伝子は、1つまたは複数の特定のプロモーター領域と、直接、またはもう1つのタンパク質との相互作用を通して結合する転写制御タンパク質（一般に、転写因子）を発現する。プロモーター領域との結合によって、転写制御因子は、プロモーターに機能的に連結された配列の発現を増強する。全てが特定のプロモーター領域に機能的に連結されている限り、1つのトランス活性化因子の発現が、いくつかのタンパク質の発現を活性化することもできる。
トランスジーン：外来性遺伝子。
上流：ポリヌクレオチド上の相対位置であって、「上流」位置は、ポリヌクレオチドの5'末端に、基準点より近い。二本鎖ポリヌクレオチドの場合、5'末端および3'末端の方向は、アンチセンス鎖と反対の、センス鎖に基づく。
ベクター：宿主細胞に導入され、それによって、形質転換宿主細胞を産生する核酸分子。ベクターは、宿主細胞内で複製することを可能にする核酸配列、例えば、複製開始点を含み得る。ベクターは、1つまたは複数の治療用遺伝子および/または選択可能マーカー遺伝子ならびに当技術分野において公知の他の遺伝子要素も含み得る。ベクターは、細胞を形質導入するか、形質転換するか、または感染させ、それによって、その細胞に天然のもの以外の核酸および/またはタンパク質を細胞に発現させることができる。ベクターは、任意で、核酸の細胞内への進入の達成を助ける材料、例えば、ウイルス粒子、リポソーム、タンパク質コーティング等を含む。
ウイルス：生細胞の内部で繁殖する微視的な感染性生物。ウイルスは、タンパク質コートに囲まれた単一の核酸のコアから本質的になり、生細胞の内部でのみ複製する能力を有する。「ウイルス複製」とは、少なくとも1つのウイルス生活環の発生による付加的なウイルスの産生である。ウイルスベクターは、当技術分野において公知であり、例えば、アデノウイルス、AAV、レンチウイルス、およびヘルペスウイルスを含む。
他に説明されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または等価な方法および材料が、本開示の実施または試行において使用され得るが、適当な方法および材料が以下に記載される。材料、方法、および実施例は、例示なものに過ぎず、限定するためのものではない。
概要
驚くべきことに、CRXタンパク質をコードする遺伝子の網膜細胞への送達が、CRX常染色体優性網膜症を処置するために使用され得ることが、本明細書に開示される。本明細書に開示される方法は、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む有効量の核酸分子を、対象へ投与し、それによって、CRX常染色体優性網膜症を処置することを含む。対象はヒトであり得る。
いくつかの態様において、CRX常染色体優性網膜症は、レーバー先天黒内障（LCA）、網膜色素変性症、または錐体桿体ジストロフィーである。1つの非限定的な例において、CRX常染色体優性網膜症はLCAである。
付加的な態様において、方法は、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含むウイルスベクターを、対象へ投与することを含み得る。いくつかの非限定的な例において、ベクターは、レンチウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、例えば、AAV2ウイルスベクター、AAV5ウイルスベクター、もしくはAAV8ウイルスベクターであり得る。さらなる態様において、方法は、核酸分子を含むナノ粒子またはデンドリマーを、対象へ投与することを含む。
さらなる態様において、プロモーターは、ヒトCRXプロモーターである。具体的な非限定的な例において、ヒトCRXプロモーターは、SEQ ID NO:1を含む。
さらに他の態様において、CRXタンパク質は、SEQ ID NO:2と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む。具体的な非限定的な例において、CRXタンパク質は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様において、核酸分子は、対象の網膜下または網膜に投与される。
付加的な態様において、方法は、対象の網膜におけるロドプシン発現を増加させる。開示された方法は、関心対象の対象、例えば、CRX常染色体優性網膜症を有する対象を選択することを含み得る。
開示された方法において使用するための組成物が提供される。SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列を含む、またはSEQ ID NO:1のヌクレオチド配列からなるプロモーターも開示される。プロモーターは、ポリペプチドをコードする異種核酸配列に機能的に連結され得る。プロモーターを含むベクター、例えば、限定されるわけではないが、ウイルスベクターも開示される。具体的な非限定的な例において、ウイルスベクターはAAVベクターである。
CRXポリペプチド、CRXをコードするポリヌクレオチド、およびCRXプロモーター
CRXは、網膜光受容細胞の適切な発達のために必要とされるOTXファミリーホメオドメイン転写因子である（Chen et al.,Neuron,19,1017-1030 Furakawa et al.,Cell,91,531-541）。インビボで、CRXは、網膜および松果体において特異的に発現される。その機能は、主に、適切な視覚のために必要な網膜光受容細胞、および概日リズムに関与する松果体細胞における、遺伝子発現の制御に関係している。マウスにおけるCRXの喪失によって、光受容体が、必要な光伝達遺伝子を発現しなくなり、視覚色素オプシンおよび光伝達関連タンパク質を含有する特殊な細胞小器官である外節を産生しなくなるため、視覚機能の喪失がもたらされる（Furakawa et al.,Nature genetics,23,466-470）。
ヒトにおいて、インビボのCRX遺伝子（参照により本明細書に組み入れられる、遺伝子ID：1406；Ensembl：ENSG00000105392；MIM＃602225、2019年12月31日）は、染色体19q13.33上に位置しており、299アミノ酸のDNA結合タンパク質をコードする。ヒトCRXの例示的なアミノ酸配列は、以下に提供される（参照により本明細書に組み入れられる、2019年12月31日に入手可能な、UniProtKB No.O43186を参照すること）：
Figure 2023510186000003
いくつかの態様において、CRXタンパク質は、SEQ ID NO:2として示されるアミノ酸配列を含む。他の態様において、CRXタンパク質は、SEQ ID NO:2と少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの非限定的な例において、CRXタンパク質は、SEQ ID NO:2と少なくとも95％同一である。CRXタンパク質は、トランス活性化因子として機能することができる。
CRXは、桿体および錐体の多数の光受容体遺伝子の発現を制御する転写因子である。CRXによるトランス活性化は、（GFPもしくは他のレポーター遺伝子の発現を駆動するよう、CRXによって制御されるプロモーターを使用して）インビトロで試験され得、またはモデル（例えば、Crx-koマウス）を使用してインビボで試験され得る。この転写活性化機能は、光受容体の発達および機能のために必要とされる。
SEQ ID NO:2は、299アミノ酸長である。タンパク質のDNA結合ドメインは、N末端にあり、残基39～108を含み、転写活性化ドメインは、C末端に向かって位置している（残基113～284）。いくつかの態様において、有用なCRXタンパク質は、SEQ ID NO:2と少なくとも約95％、96％、97％、98％、または99％同一であり、SEQ ID NO:2の残基39～108を含む。他の態様において、有用なCRXタンパク質は、SEQ ID NO:2と少なくとも約95％、96％、97％、98％、または99％同一であり、SEQ ID NO:2のアミノ酸および残基113～284を含む。さらなる態様において、有用なCRXタンパク質は、SEQ ID NO:2と少なくとも約95％同一であり、SEQ ID NO:2の残基39～108および残基113～284を含む。さらなる態様において、有用なCRXタンパク質は、SEQ ID NO:2と少なくとも約96％、97％、98％、または99％同一であり、SEQ ID NO:2の残基39～108および残基113～284を含む。このCRXタンパク質は、トランス活性化因子として機能することができる。
いくつかの態様において、CRXタンパク質は、SEQ ID NO:2の残基284～299、OTXテールを含む。他の態様において、有用なCRXタンパク質は、SEQ ID NO:2と少なくとも約95％、96％、97％、98％、または99％同一であり、SEQ ID NO:2の残基284～299を含む。さらなる態様において、有用なCRXタンパク質は、SEQ ID NO:2と少なくとも約95％同一であり、SEQ ID NO:2の残基39～108、残基113～284、およびSEQ ID NO:2の残基284～299を含む。さらなる態様において、有用なCRXタンパク質は、SEQ ID NO:2と少なくとも約96％、97％、98％、または99％同一であり、SEQ ID NO:2の残基39～108、残基113～284、および残基284～299を含む。このCRXタンパク質は、トランス活性化因子として機能することができる。
CRXタンパク質は、霊長類（チンパンジー99％、カニクイザル100％、ゴリラ100％、マーモセット98％）およびモデル生物（ネコ93％、ニワトリ57％、イヌ97％、マウス89％、ラット97％、ゼブラフィッシュ57％）において高い配列相同性を示す。従って、いくつかの態様において、CRXタンパク質は、もう1つの種のCRXタンパク質に由来する対応アミノ酸を含むことができる。このCRXタンパク質は、トランス活性化因子として機能することができる。
CRXタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、開示された方法において有用である。これらのポリヌクレオチドには、CRXタンパク質をコードするDNA、cDNA、およびRNAの配列が含まれる。コード配列におけるサイレント変異は、複数のコドンが同じアミノ酸残基をコードすることができる、遺伝暗号の縮重（即ち、冗長）に起因する。従って、例えば、ロイシンは、CTT、CTC、CTA、CTG、TTA、またはTTGによってコードされ得；セリンは、TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、またはAGCによってコードされ得；アスパラギンは、AATまたはAACによってコードされ得；アスパラギン酸は、GATまたはGACによってコードされ得；システインは、TGTまたはTGCによってコードされ得；アラニンは、GCT、GCC、GCA、またはGCGによってコードされ得；グルタミンは、CAAまたはCAGによってコードされ得；チロシンは、TATまたはTACによってコードされ得；イソロイシンは、ATT、ATC、またはATAによってコードされ得る。標準的な遺伝暗号を示す表は、様々な供給源に見出され得る（例えば、L.Stryer,1988,Biochemistry,3.sup.rd Edition,W.H.5 Freeman and Co.,NY）。縮重バリアントも、本明細書に開示される方法において有用である。
CRXタンパク質をコードする核酸分子は、本明細書に提供されるアミノ酸配列および遺伝暗号を使用して、当業者によって容易に作製され得る。CRXタンパク質をコードする核酸配列は、任意の適当な方法によって、例えば、適切な配列のクローニングによって、またはNarang et al.,Meth.Enzymol.68:90-99,1979のホスホトリエステル法；Brown et al.,Meth.Enzymol.68:109-151,1979のホスホジエスエル法；Beaucage et al.,Tetra.Lett.22:1859-1862,1981のジエチルホスホラミダイト法；例えば、Needham-VanDevanter et al.,Nucl.Acids Res.12:6159-6168,1984に記載されている自動合成装置を、例えば、使用した、Beaucage & Caruthers,Tetra.Letts.22(20):1859-1862,1981によって記載された固相ホスホラミダイトトリエステル法、および米国特許第4,458,066号の固相法などの方法による直接化学合成によって、調製され得る。化学合成によって、一本鎖（ss）オリゴヌクレオチドを作製し、それを、相補配列とのハイブリダイゼーションによって、または一本鎖を鋳型として使用したDNAポリメラーゼによる重合によって、二本鎖（ds）DNAに変換することができる。CRXタンパク質をコードする配列を含む例示的な核酸は、クローニング技術によって調製され得る。
CRXタンパク質をコードする核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、転写ベースの増幅系（TAS）、自家持続配列複製系（3SR）、およびQβレプリカーぜ増幅系（QB）などのインビトロの方法によって、クローニングされるか、または増幅され得る。例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、分子のDNA配列に基づくプライマーを使用したcDNAのポリメラーゼ連鎖反応によって単離され得る。多様なクローニングおよびインビトロ増幅方法論が、当業者に周知である。PCR法は、例えば、米国特許第4,683,195号；Mullis et al.,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51:263,1987；およびErlich,ed.,PCR Technology,(Stockton Press,NY,1989)に記載されている。ポリヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で、所望のポリヌクレオチドの配列から選択されるプローブによって、ゲノムライブラリまたはcDNAライブラリをスクリーニングすることによって単離されてもよい。
典型的には、CRXタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、転写調節配列、例えば、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルに機能的に連結される。転写の開始に関与する宿主細胞の転写機構（または導入された合成機構）によって認識されるポリヌクレオチド配列である任意のプロモーターが使用され得る。ポリアデニル化シグナルは、転写物の適切なプロセシング、および翻訳のための核から細胞質への輸送のため、mRNA転写物の末端への一連のヌクレオチドの付加を指図するポリヌクレオチド配列である。
例示的なプロモーターには、ウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（「CMV」）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（「tk」）、SV40初期転写単位、ポリオーマ、レトロウイルス、パピローマウイルス、B型肝炎ウイルス、ならびにヒトおよびサルの免疫不全ウイルスが含まれる。他のプロモーターには、哺乳動物遺伝子、例えば、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、T細胞受容体、HLA DQαおよびDQβ、βインターフェロン、インターロイキン2、インターロイキン2受容体、MHCクラスII、HLA-DRα、βアクチン、筋クレアチンキナーゼ、プレアルブミン（トランスサイレチン）、エラスターゼI、メタロチオネイン、コラゲナーゼ、アルブミン、フェトプロテイン、βグロビン、c-fos、c-HA-ras、神経細胞接着分子（NCAM）、α1-アンチトリプシン、H2B（TH2B）ヒストン、I型コラーゲン、グルコース制御タンパク質（GRP94およびGRP78）、ラット成長ホルモン、ヒト血清アミロイドA（SAA）、トロポニンI（TNI）、血小板由来増殖因子、およびジストロフィンから単離されたプロモーター、ならびに網膜細胞に特異的なプロモーターが含まれる。
プロモーターは、誘導性または構成性のいずれかであり得る。誘導性プロモーターは、誘導物質の非存在下では、不活性であるか、または低い活性を示すプロモーターである。プロモーターの付加的な例には、MT II、MMTV、コラゲナーゼ、ストロメライシン、SV40、マウスMX遺伝子、α2-マクログロブリン、MHCクラスI遺伝子h-2kb、HSP70、プロリフェリン、テトラサイクリン誘導性、腫瘍壊死因子、または甲状腺刺激ホルモン遺伝子のプロモーターが含まれるが、これらに限定されるわけではない。誘導性プロモーターの一例は、インターフェロン誘導性ISG54プロモーターである（参照により本明細書に組み入れられる、Bluyssen et al.,Proc.Natl Acad.Sci.92:5645-5649,1995）。いくつかの態様において、プロモーターは、付加的な因子の非存在下で、宿主細胞に導入された時に高レベルの転写をもたらす構成性プロモーターである。
いくつかの態様において、プロモーターは、網膜特異的プロモーターである。例示的な網膜光受容体特異的プロモーターは、ロドプシンキナーゼ、NRL、IRBP、錐体オプシン、またはロドプシンのプロモーター、およびCRXプロモーターである。
いくつかの態様において、プロモーターはCRXプロモーターである。本明細書に開示されるCRXプロモーターは、網膜におけるタンパク質の発現を得るため、任意のタンパク質をコードするヌクレオチド分子に機能的に連結され得る。いくつかの態様において、CRXプロモーターは、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結される。
ヒトCRXのCRX 5'非翻訳領域は、参照により本明細書に組み入れられる、2019年12月31日に入手可能な、NCBIリファレンス配列NG_008605.1に提供される。
いくつかの態様において、
Figure 2023510186000004
を含む、またはこれからなるCRXプロモーターが提供される。
桿体および錐体の光受容体においてレポーター遺伝子を特異的に発現する631塩基対長のプロモーター要素を作製するため、ヒトCRX 5'非翻訳領域（NCBI：NG_008605.1）に由来する3つの断片を、ヒトゲノムDNAから増幅し、組み合わせた。SEQ ID NO:1において、189ヌクレオチドは、NCBIリファレンス配列NG_008605.1の3085～3274位に相当し；69は、NCBIリファレンス配列NG_008605.1の3323～3392に相当し、361は、NCBIリファレンス配列NG_008605.1の4808～5169に相当する。2020年1月27日に入手可能なNCBIリファレンス配列は、参照により本明細書に組み入れられる。4999～5169はエクソン1であり、従って、このヒトCRXプロモーター要素は、ヒトCRX遺伝子の第1エクソンを含有することに注意すること。
他の態様において、プロモーターは、SEQ ID NO:1と少なくとも約95％、96％、97％、98％、または99％同一であり得、ここで、プロモーターは、網膜の細胞において発現を提供する。
SEQ ID NO:1は、以下のような、CRXと結合する5つのCRX結合部位を含む：
Figure 2023510186000005
いくつかの態様において、CRXプロモーターは、SEQ ID NO:1と少なくとも約95％、96％、97％、98％、または99％同一であり、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ全てのCRX結合部位を含む。さらなる態様において、CRXプロモーターは、SEQ ID NO:1と少なくとも約95％、96％、97％、98％、または99％同一であり、5つ全てのCRX結合部位を含む。いくつかの具体的な非限定的な例において、CRXプロモーターは、SEQ ID NO:1と少なくとも約95％、96％、97％、98％、または99％同一であり、SEQ ID NO:1のヌクレオチド96～104、388～403、および467～482を含む。
開示されたプロモーターは、AP-2β、FOXO1、NRF2、PBX3、およびZIC1の結合部位を含む。従って、いくつかの態様において、プロモーターは、SEQ ID NO:1と少なくとも約95％、96％、97％、98％、または99％同一であり、AP-2β、FOXO1、NRF2、PBX3、および/またはZIC1の結合部位を保持する。いくつかの態様において、プロモーターは、これらの結合部位の全てを保持する。
単独の最小プロモーターについて観察されるものより、転写を増加させる、1つまたは複数の転写因子のための結合認識部位であり、CRXプロモーターをコードするポリヌクレオチドおよび/またはCRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結される1つまたは複数のエンハンサー要素を、転写調節配列は任意で含む。CRXタンパク質をコードする核酸分子に関して、mRNAの安定化および発現の増加を助けるイントロンが含まれていてもよい。
本明細書に記載された組成物および方法のいくつかの態様において、CRXタンパク質をコードする核酸配列は、確立された分子生物学の手法を使用して、宿主細胞内で発現可能なベクターに組み込まれる。例えば、CRXタンパク質をコードする核酸、例えば、cDNAは、標準的な手法、例えば、制限酵素消化、DNAポリメラーゼによるフィルイン、エキソヌクレアーゼによる欠失、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼによる伸長、合成もしくはクローニングされたDNA配列のライゲーション、一本鎖バクテリオファージ中間体を介した部位特異的配列変更、またはPCRもしくは他のインビトロ増幅と組み合わせた特異的オリゴヌクレオチドの使用によって操作され得る。これらのベクターは、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結されたCRXプロモーターを含み得る。
CRXプロモーターを含む宿主細胞において発現可能なベクターの作製を通した、当業者を案内するために十分な例示的な手法、および/またはCRXタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989；Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3d ed.,Cold Spring Harbor Press,2001；Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,1992(and Supplements to 2003)；およびAusubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,4th ed.,Wiley & Sons,1999に見出され得る。
遺伝子転写物の適切な終結およびポリアデニル化をもたらすポリアデニル化シグナルを含めることが望ましい場合がある。例示的なポリアデニル化シグナルは、βグロビン、ウシ成長ホルモン、SV40、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼの遺伝子から単離されている。
開示された核酸分子は、ナノ分散系に含まれてもよい（例えば、米国特許第6,780,324号；米国特許公開第2009/0175953号を参照すること）。例えば、ナノ分散系は、生物学的活性を有する薬剤および分散剤（例えば、ポリマー、コポリマー、または低分子量界面活性剤）を含む。例示的なポリマーまたはコポリマーには、ポリビニルピロリドン（PVP）、ポリ（D,L-乳酸）（PLA）、D,L-乳酸グリコール酸コポリマー（PLGA）、ポリ(エチレングリコール)が含まれる。例示的な低分子量界面活性剤には、ドデシル硫酸ナトリウム、ヘキサデシルピリジニウムクロリド、ポリソルベート、ソルビタン、ポリ(オキシエチレン)アルキルエーテル、ポリ(オキシエチレン)アルキルエステル、およびこれらの組み合わせが含まれる。一例において、ナノ分散系は、PVPおよびODPまたはそれらのバリアント（例えば、80/20w/w）を含む。いくつかの例において、ナノ分散物は、溶媒蒸発法を使用して調製される（例えば、Kanaze et al.,Drug Dev.Indus.Pharm.36:292-301,2010；Kanaze et al.,J.Appl.Polymer Sci.102:460-471,2006を参照すること）。
デンドリマーは、性質および機能性を容易に調節し、変動させることができる、単純な分岐単量体単位から段階的に調製される合成三次元高分子である。デンドリマーは、分岐高分子複合体を形成する、コアに接ぎ木された選択されたポリマーの層によって囲まれた開始コアからなる。デンドリマーは、典型的には、ポリ(アミドアミン)またはポリ(L-リジン)などのポリマーを使用して作製される。デンドリマーは、多官能性コアへのビルディングブロックの反復的な付加から合成されもよいし（ディバージェント合成アプローチ）、または多官能性コアに向けて合成されてもよく（コンバージェント合成アプローチ）、ビルディングブロックの三次元シェルの各付加は、より高次のデンドリマーの形成をもたらす。ポリプロピレンイミンデンドリマーは、100％のプロトン化可能（protonable）窒素および64個までの末端アミノ基を含有する。プロトン化可能基は、一般的に、中性pHでプロトンを受容することができるアミン基である。核酸分子のためのデンドリマーは、アミン/アミドの混合物またはN-P(O2)Sを共役単位として含むポリアミドアミンおよびリン含有化合物から形成され得る。核酸分子の送達のために有用なデンドリマーは、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、PCT公開第2003/033027号に開示されている。
CRXプロモーター、および/またはCRXタンパク質をコードするポリヌクレオチドには、自律複製性のプラスミドもしくはウイルスのベクターに組み込まれるか、もしくは原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれるか、または他の配列と無関係の別の分子（例えば、cDNA）として存在する組換えDNAが含まれる。CRXプロモーターおよび/またはCRXタンパク質を含むウイルスベクターも調製され得る。多数のウイルスベクター、例えば、ポリオーマ；SV40（Madzak et al.,1992,J.Gen.Virol.,73:15331536）；アデノウイルス（Berkner,1992,Cur.Top.Microbiol.Immunol.,158:39-6；Berliner et al.,1988,Bio Techniques,6:616-629；Gorziglia et al.,1992,J.Virol.,66:4407-4412；Quantin et al.,1992,Proc.Nad.Acad.Sci.USA,89:2581-2584；Rosenfeld et al.,1992,Cell,68:143-155；Wilkinson et al.,1992,Nucl.Acids Res.,20:2233-2239；Stratford-Perricaudet et al.,1990,Hum.Gene Ther.,1:241-256）；ワクシニアウイルス（Mackett et al.,1992,Biotechnology,24:495-499）；アデノ随伴ウイルス（Muzyczka,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:91-123；On et al.,1990,Gene,89:279-282）；ヘルペスウイルス、例えば、HSVおよびEBV（Margolskee,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:67-90；Johnson et al.,1992,J.Virol.,66:29522965；Fink et al.,1992,Hum.Gene Ther.3:11-19；Breakfield et al.,1987,Mol.Neurobiol.,1:337-371；Fresse et al.,1990,Biochem.Pharmacol.,40:2189-2199）；シンドビスウイルス（H.Herweijer et al.,1995,Human Gene Therapy 6:1161-1167；米国特許第5,091,309号および第5,2217,879号）；アルファウイルス（S.Schlesinger,1993,Trends Biotechnol.11:18-22；I.Frolov et al.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11371-11377）；ならびにトリ（Brandyopadhyay et al.,1984,Mol.Cell Biol.,4:749-754；Petropouplos et al.,1992,J.Virol.,66:3391-3397）、マウス（Miller,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:1-24；Miller et al.,1985,Mol.Cell Biol.,5:431-437；Sorge et al.,1984,Mol.Cell Biol.,4:1730-1737；Mann et al.,1985,J.Virol.,54:401-407）、およびヒト（Page et al.,1990,J.Virol.,64:5370-5276；Buchschalcher et al.,1992,J.Virol.,66:2731-2739）起源のレトロウイルスが、当技術分野において公知である。バキュロウイルス（オートグラファ・カリフォルニカ多核体病ウイルス（Autographa californica multinuclear polyhedrosis virus）；AcMNPV）ベクターも、当技術分野において公知であり、商業的供給元（例えば、PharMingen,San Diego,Calif.；Protein Sciences Corp.,Meriden,Conn.；Stratagene,La Jolla,Calif.）より入手され得る。
従って、1つの態様において、CRXプロモーター、および/またはCRXタンパク質をコードする核酸分子は、ウイルスベクターに含まれる。適当なベクターには、レトロウイルスベクター、オルソポックスベクター、アビポックス（avipox）ベクター、鶏痘ベクター、カプリポックスベクター、スイポックスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびポリオウイルスベクターが含まれる。具体的な例示的なベクターは、ポックスウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、および高度弱毒化ワクシニアウイルス（MVA）、アデノウイルス、バキュロウイルス、酵母等である。アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）は、以下にさらに詳細に開示され、開示された方法において有用である。
AAVベクター
任意で、CRXタンパク質を含む核酸分子に機能的に連結されている、CRXプロモーターを含む、1つまたは複数のベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターもしくはアデノウイルスベクター、またはAAVベクターを含み、利用する、方法および組成物が、本明細書に開示される。ウイルス遺伝子を完全にまたはほぼ完全に欠く欠陥ウイルスが使用され得る。欠陥ウイルスベクターの使用は、ベクターが他の細胞を感染させる心配なしに、特定の細胞への投与を可能にする。有用なアデノウイルスベクターには、複製可能型、複製欠損型、ガットレス型が含まれる。有用なAAVベクターは複製欠損型である。理論によって拘束されるものではないが、アデノウイルスベクターは、インビトロでの強い発現、優れた力価、ならびにインビボで分裂細胞および非分裂細胞を形質導入する能力を示すことが公知である（Hitt et al.,Adv in Virus Res 55:479-505,2000）。インビボで使用された時、これらのベクターは、ベクター骨格に対して誘発される免疫反応のため、強力であるが一過性の遺伝子発現をもたらす。いくつかの非限定的な例において、有用なベクターは、弱毒化アデノウイルスベクター、例えば、Stratford-Perricaudetらによって記載されたベクター（J.Clin.Invest.,90:626-630 1992；La Salle et al.,Science 259:988-990,1993）；または欠陥AAVベクター（Samulski et al.,J.Virol.,61:3096-3101,1987；Samulski et al.,J.Virol.,63:3822-3828,1989；Lebkowski et al.,Mol.Cell.Biol.,8:3988-3996,1988）である。
組換えAAVベクターは、標的にされた細胞において、選択されたトランスジェニック産物の発現および産生を指図し得ることを特徴とする。従って、組換えベクターは、標的細胞の感染のための、カプシド形成および物理的構造のために必須のAAVの配列の全てを少なくとも含む。
AAVは、パルボウイルス科ディペンドウイルス属に属する。AAVは、直鎖型の一本鎖DNAゲノムをパッケージングする、エンベロープのない小型ウイルスである。AAV DNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方が、等しい頻度でAAVカプシドにパッケージングされる。いくつかの態様において、AAV DNAは、CRXタンパク質、例えば、ヒトCRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された、本明細書に開示される組換えCRXプロモーターを含む核酸を含む。本明細書に開示された核酸分子を含む組換えベクター、例えば、組換えアデノウイルスベクターおよび組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ベクターが、さらに提供される。いくつかの態様において、AAVは、rAAV8および/またはAAV2である。しかしながら、AAV血清型は、任意の他の適当なAAV血清型、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV10、AAV11、もしくはAAV12、または2つ以上のAAV血清型のハイブリッドであってもよい。
AAVゲノムは、2つのオープンリーディングフレーム（ORF）に隣接する2つの末端逆位配列（ITR）を特徴とする。AAV2ゲノムにおいて、例えば、ITRの最初の125ヌクレオチドは、塩基対形成が最大になるよう単独で折り畳まれ、T字型ヘアピン構造を形成する回文構造である。D配列と呼ばれるITRの他の20塩基は、塩基対形成しないままである。ITRは、AAV DNA複製のために重要なシス作用性の配列であり；ITRは、複製開始点であり、DNAポリメラーゼによる第二鎖合成のためのプライマーとして機能する。この合成中に形成された二本鎖DNAは、複製型単量体と呼ばれ、2回目の複製の自己プライミングのために使用され、複製型二量体を形成する。これらの二本鎖中間体は、鎖置換機序を介してプロセシングされ、パッケージングのために使用される一本鎖DNAおよび転写のために使用される二本鎖DNAをもたらす。ITR内には、Rep結合要素および末端分離部位（terminal resolution site）（TRS）が位置している。これらの特色は、二本鎖中間体をプロセシングするため、AAV複製中にウイルス制御タンパク質Repによって使用される。AAV複製における役割に加えて、ITRは、AAVゲノムパッケージング、転写、非許容条件下での負の制御、および部位特異的組み込みのためにも必須である（Daya and Berns,Clin Microbiol Rev 21(4):583-593,2008）。いくつかの態様において、これらの要素は、AAVベクターに含まれる。
AAVの左ORFは、4つのタンパク質、Rep78、Rep68、Rep52、およびRep40をコードするRep遺伝子を含有する。右ORFは、3つのウイルスカプシドタンパク質（VP1、VP2、およびVP3）を産生するCap遺伝子を含有する。AAVカプシドは、二十面体対称に配置された60のウイルスカプシドタンパク質を含有する。VP1、VP2、およびVP3は、1:1:10のモル比で存在する（Daya and Berns,Clin Microbiol Rev 21(4):583-593,2008）。いくつかの態様において、これらの要素は、AAVベクターに含まれる。
AAVベクターは、遺伝子治療のために使用され得る。例示的な有用なAAVは、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、およびAAV9である。アデノウイルス、AAV2およびAAV8は、網膜内の細胞を形質導入することができる。従って、rAAV2ベクターまたはrAAV8ベクターのいずれかが、本明細書に開示される方法において使用され得る。しかしながら、rAAV6およびrAAV9ベクターも有用である。
AAVは、ヒトおよび他のいくつかの霊長類種を感染させるが、疾患を引き起こさないことが公知であり、極めて軽度の免疫反応を誘発する。AAVを利用する遺伝子治療ベクターは、分裂細胞および静止細胞の両方を感染させ、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく染色体外状態で持続することができる。AAV2はヒト網膜の細胞を優先的に感染させる。AAVの有利な特色のため、本開示は、本明細書に開示される方法のためのrAAVの使用を企図する。
AAVは、治療のためのいくつかの付加的な望ましい特色、例えば、標的細胞に結合し、侵入し、核に侵入する能力、長期間にわたって核内で発現される能力、および低い毒性を保有する。AAVは、細胞をトランスフェクトするために使用され得、適当なベクターは、当技術分野において公知である（例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国公開特許出願第2014/0037585号を参照すること）。遺伝子治療のために適当なrAAVを作製する方法は、当技術分野において周知であり（例えば、米国公開特許出願第2012/0100606号；第2012/0135515号；第2011/0229971号；および第2013/0072548号；ならびにGhosh et al.,Gene Ther 13(4):321-329,2006を参照すること）、本明細書に開示される方法において利用され得る。
いくつかの態様において、ベクターは、rAAV8ベクター、rAAV2ベクター、rAAV9ベクターである。具体的な非限定的な例において、ベクターはAAV8ベクターである。AAV8ベクターは、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,692,332号に開示されている。カプシド、rep68/78、rep40/52、VP1、VP2、およびVP3の位置および配列は、この米国特許第8,692,332号に開示されている。AAV8の位置および超可変領域も提供されている。いくつかの態様において、ベクターは、AAV2バリアントベクター、例えば、AAV7m8である。
本明細書に開示される方法において有用なベクターは、単一のAAV血清型（例えば、AAV2、AAV6、AAV8、またはAAV9）に由来し得る完全AAVカプシドをコードする核酸配列を含有し得る。米国特許第8,692,332号に開示されるように、有用なベクターは、組換えであってもよく、従って、異種AAVもしくは非AAVカプシドタンパク質（またはそれらの断片）と融合したAAV8カプシドの1つまたは複数の断片を含有する人工カプシドをコードする配列を含有してもよい。これらの人工カプシドタンパク質は、AAV2、AAV6、AAV8、もしくはAAV9のカプシドの非連続部分から、または他のAAV血清型のカプシドから選択される。例えば、rAAVベクターは、VP2および/もしくはVP3、またはVP1から選択されるAAV8カプシド領域のうちの1つまたは複数を含むカプシドタンパク質、または米国特許第8,692,332号においてSEQ ID NO:2として提示されるAAV8カプシドのアミノ酸1～184、アミノ酸199～259；アミノ酸274～446；アミノ酸603～659；アミノ酸670～706；アミノ酸724～738より選択されるそれらの断片を有し得る。もう1つの例において、VP3タンパク質の開始コドンをGTGに変更することが望ましい場合がある。あるいは、rAAVは、AAV血清型8カプシドタンパク質超可変領域のうちの1つまたは複数、例えば、米国特許第8,692,332号においてSEQ ID NO:2として提示されているAAV8カプシドのaa185～198；aa260～273；aa447～477；aa495～602；aa660～669；およびaa707～723を含有してもよい。
いくつかの態様において、AAV血清型2カプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）が生成される。ベクターを作製するため、本明細書において定義されるAAV血清型2カプシドタンパク質またはその断片をコードする核酸配列；機能性のrep遺伝子；AAV末端逆位配列（ITR）、および、任意で、CRXプロモーターに機能的に連結された、例えば、CRXタンパク質をコードするトランスジーンから少なくとも構成されるミニ遺伝子；およびAAV2カプシドタンパク質へのパッケージングを可能にするために十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することができる。AAVミニ遺伝子をAAVカプシドにパッケージングするため、宿主細胞において培養されることが必要とされる成分は、トランスで宿主細胞に提供されてもよい。あるいは、必要とされる成分のいずれか1つまたは複数（例えば、ミニ遺伝子、rep配列、cap配列、および/またはヘルパー機能）は、当業者に公知の方法を使用して、必要とされる成分のうちの1つまたは複数を含有するよう改変された安定宿主細胞によって提供されてもよい。いくつかの態様において、安定宿主細胞は、誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーターの調節下で、必要とされる成分を含有するであろう。rAAV2、rAAV8、またはrAAV9のベクターおよび/またはビリオンを生成するため、類似した方法を使用することができる。
網膜特異的プロモーターがAAVベクターに含まれ得る。いくつかの態様において、プロモーターは、ロドプシンキナーゼ（RK）プロモーターである。ロドプシンキナーゼプロモーターは、桿体細胞および錐体細胞における発現を指図する。このプロモーターは、発現のために最適化されている（参照により本明細書に組み入れられる、Khani et al.,Invest.Opthamol.Vis.Science,48:3954-3961,2007を参照すること）。このプロモーターの配列は、この参考文献の図1に提供される。付加的なプロモーターには、NRL、CRX、IRBP、またはロドプシンのプロモーターが含まれるが、これらに限定されるわけではない。具体的な非限定的な例において、CRXプロモーターは、上記に開示されるように、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結され、AAVベクターに含まれる。
他の態様において、成分、例えば、CRXタンパク質をコードするトランスジーンは、構成性プロモーターの調節下にあってもよい。適当な構成性プロモーターの非限定的な例は、サイトメガロウイルスプロモーターである。付加的な非限定的な例は、ユビキチンまたはニワトリβアクチンのプロモーターである。有用なプロモーターは、上記のセクションにも開示されている。付加的なプロモーターは、上記に開示されている。
さらにもう1つの別の態様において、選択された安定宿主細胞は、例えば、パッケージング宿主細胞におけるrAAVの産生のため、構成性プロモーターの調節下にある選択された成分と、1つまたは複数の誘導性プロモーターの調節下にある他の選択された成分とを含有してもよい。例えば、（構成性プロモーターの調節下にあるE1ヘルパー機能を含有する）293細胞に由来するが、誘導性プロモーターの調節下にあるrepおよび/またはcapタンパク質を含有する安定宿主細胞が生成され得る。さらに他の安定宿主細胞は、当業者によって生成され得る。
rAAVを産生するために必要とされるミニ遺伝子、rep配列、cap配列、およびヘルパー機能は、保持されている配列を転写する任意の遺伝子要素の形態で、パッケージング宿主細胞へ送達され得る。選択された遺伝子要素は、任意の適当な方法、例えば、本明細書に記載されたものによって送達され得る。ベクターを構築するために使用される方法は、核酸操作の技術を有する者に公知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術を含む。例えば、Sambrook et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.を参照すること。同様に、rAAVビリオンを生成する方法も周知であり、適当な方法の選択は、本発明を限定するものではない。例えば、K.Fisher et al,J.Virol.,70:520-532(1993)および米国特許第5,478,745号を参照すること。いくつかの態様において、選択されたAAV成分は、AAV8を含むAAV血清型から、当業者に利用可能な技術を使用して容易に単離され得る。そのようなAAVは、学術的な、商業的な、または公の供給元（例えば、American Type Culture Collection,Manassas,Va.）から単離されるか、または入手され得る。あるいは、AAV配列は、例えば、文献またはデータベース、例えば、GENBANK（登録商標）において入手可能な、公開された配列を参照することによって、合成または他の適当な手段を通して入手されてもよい。
薬学的組成物および処置の方法
対象におけるCRX常染色体優性網膜症を処置するための方法が、本明細書に開示される。これらの方法は、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された、網膜特異的プロモーター、例えば、CRXプロモーターを含む有効量の核酸分子を、対象へ投与することを含む。いくつかの態様において、CRX常染色体優性網膜症は、レーバー先天黒内障（LCA）、網膜色素変性症、または錐体桿体ジストロフィーである。具体的な非限定的な例において、CRX常染色体優性網膜症はLCAである。方法は、CRX常染色体優性網膜症を有する対象、例えば、LCA、網膜色素変性症、または錐体桿体ジストロフィーを有する対象を選択することを含み得る。具体的な非限定的な例において、方法は、LCAを有する対象を選択し、処置することを含む。いくつかの態様において、方法は、CRX常染色体劣性網膜症および/またはCRX X連鎖網膜症を有しない対象を選択することを含み得る。態様のいずれかにおいて、網膜特異的プロモーターは、上記に開示されるCRXプロモーターであり得る。いくつかの態様において、開示された方法は、対象の網膜におけるロドプシンおよび錐体L/Mオプシンの発現を増加させる。
CRX遺伝子の変異は、重症早期発症LCA（LCA7、MIM＃613829）から、成人発症錐体桿体ジストロフィー（CORD2、MIM＃120970）、網膜色素変性症（RP、MIM＃268000）、軽度遅発性黄斑ジストロフィー（Swain et al.,1997,Neuron,19,1329-1336、Freund et al.,1997,Cell,91,543-553；Freund et al.,1998,Nature genetics,18,311-312；Huang et al.,2012,Biochem Biophys Res Commun,426,498-503）までの範囲の網膜ジストロフィーを有する患者において同定された。CRXは、LCA、RPおよびCORDの3つ全てに関連する唯一の遺伝子である。変異の大半は、新規に発生し、ヘテロ接合型で存在し、従って、常染色体優性遺伝を示す。およそ50の可能性の高い病理学的変異が現在までに記載されており、これらの半分は疾患表現型と同時分離する。報告された変異は、39％がミスセンス、4％がナンセンス、37％が欠失、16％が挿入、および4％が挿入欠失（挿入および欠失）の配列変化である。変異のクラスは、以下の表に要約される：
Figure 2023510186000006
任意の常染色体優性変異、例えば、変異クラスI～IVのものが、本明細書に開示される方法を使用して処置され得る。従って、クラスI～IVのうちの1つからの常染色体優性CRX変異を有する対象が選択され得る。
網膜変性について、診断は、眼底を検査し、かつ/または視野を評価する検査を利用することができる。これらには、網膜電図、蛍光眼底造影、および視覚検査が含まれる。眼底検査は、網膜の状態を評価し、網膜表面上の特徴的な色素斑点の存在について評価することを目的とする。視野検査は、光刺激に対する網膜の様々な部分の感受性を評価することを可能にする。特定の光刺激に反応した網膜の電気活動を記録し、2つの異なる型の光受容体（即ち、錐体細胞および桿体細胞）の機能性の別々の評価を可能にする網膜電図（ERG）が使用され得る。
投与後、対象は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して、反応について評価され得る。これらには、検眼鏡検査、視野測定、ゴニオスコピー、角膜厚測定、または神経線維分析が含まれるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、網膜神経節細胞の数および/または生存率が査定され得る。当業者は、開示された方法が有効であることを容易に決定することができる。例えば、それは、陥凹乳頭径比が安定しているか否かによって決定され得る。走査レーザー旋光分析または光干渉断層撮影は、例えば、網膜神経線維層分析を実施するために使用され得る。視野検査は、緑内障の進行をモニタリングするために使用され得る。開示された方法のいずれかについて、視覚欠損の処置における治療有効性は、個体の視覚の変更としてであり得る。
治療有効性の尺度は、修飾される特定の疾患に適用可能であり、治療有効性を測定するために使用する適切な検出方法を認識するであろう。例えば、治療有効性は、眼底写真またはERG反応の評価によって観察され得る。方法は、本発明の組成物の投与後の検査結果を、本発明の組成物の投与前の検査結果と比較することを含み得る。もう1つの例として、進行性錐体機能障害の処置における治療有効性は、錐体機能障害の進行の速度の低下として、錐体機能障害の進行の停止として、または錐体機能の改善として観察され得、これらの効果は、例えば、ERGおよび/もしくはcERG；色覚検査；機能的補償光学；および/または視力検査によって、例えば、本発明の組成物の投与後の検査結果を、本発明の組成物の投与前の検査結果と比較し、錐体の生存率および/または機能の変化を検出することによって観察され得る。もう1つの例として、視覚欠損の処置における治療有効性は、例えば、赤色波長の知覚、緑色波長の知覚、青色波長の知覚における、個体の視覚の変更としてであり得、これらの効果は、cERGおよび色覚検査によって、例えば、本発明の組成物の投与後の検査結果を、本発明の組成物の投与前の検査結果と比較し、錐体および桿体の生存率および/または機能を検出することによって観察され得る。いくつかの態様において、方法は、形態学および構造の保存ならびに/またはERGの評価を含む。
CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーター、例えば、CRXプロモーターを含む核酸分子を含む薬学的組成物が、本明細書に提供される。いくつかの態様において、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む核酸分子は、ウイルスベクター、例えば、限定されるわけではないが、AAVベクターの中に提供される。適当なプロモーター、CRXタンパク質をコードする核酸分子、およびベクターは、上記に開示される。薬学的組成物は、処置すべき疾患の型に依って、多様な方式で製剤化され、投与され得る（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、薬学的組成物およびそのような組成物の投与を開示している米国公開出願第2005/0054567号を参照すること）。薬学的組成物は、ナノ粒子またはデンドリマーを含み得る。これらの薬学的組成物は、本明細書に開示される方法において有用である。
眼への局所送達のために製剤化される薬学的組成物が提供される。本開示は、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む核酸分子を含む薬学的組成物を、その範囲内に含む。薬学的組成物は、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された、本明細書に開示される網膜特異的プロモーター、例えば、CRXプロモーターを含む核酸分子を含むウイルスベクター、例えば、AAVベクターを含み得る。
CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む核酸分子は、エクスビボで（例えば、眼に移植される幹細胞へ）投与されてもよいし、またはインビボで対象へ眼内投与されてもよく、例えば、限定されるわけではないが、網膜下または硝子体内に投与され得る。一般に、意図された適用のために適切な薬学的組成物として、組成物を調製することが望ましい。従って、上記の核酸分子またはベクターを含有する医薬または薬学的組成物を作製する方法が、本明細書に含まれる。典型的には、薬学的組成物（医薬）の調製は、発熱物質、ならびにヒトまたは動物にとって有害であり得る任意の他の不純物を本質的に含まない薬学的組成物を調製することを必要とする。典型的には、薬学的組成物は、組成物の成分を安定化し、標的細胞による核酸またはウイルスの取り込みを可能にするため、適切な塩および緩衝剤を含有する。
治療用組成物は、注射のため、例えば、硝子体内または網膜下への投与のために製剤化され得る。そのような組成物は、一般に、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、または乳濁液）の、所望の純度の開示された治療剤を、薬学的に許容される担体、例えば、利用される投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、製剤の他の成分と適合性であるものと混合することによって製剤化される。薬学的組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤の中に分散した（例えば、溶解した、または懸濁した）有効量の核酸分子を含み得る。薬学的に許容される担体および/または薬学的に許容される賦形剤は、当技術分野において公知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,19th Edition(1995)に記載されている。担体の性質は、利用される特定の投与モードに依存するであろう。例えば、製剤は、一般的に、媒体として、薬学的にかつ生理学的に許容される液体、例えば、水、生理学的生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロール等を含む注射可能な液体を含有する。さらに、投与される薬学的組成物は、微量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、pH緩衝剤等、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有し得る。開示された治療剤は、水性担体、例えば、約3.0～約8.5、例えば、約4.0～約8.0、約6.5～約8.5、または約7.4のpHの等張性または低張性の緩衝溶液に懸濁させられ得る。有用な緩衝液には、リン酸緩衝生理食塩水またはイオン性ホウ酸緩衝液が含まれる。活性成分は、任意で、賦形剤と共に、凍結乾燥物の形態で存在してもよく、適当な溶媒の添加によって、投与前に溶液にされ得る。
薬学的に許容される担体には、任意の全ての溶媒、分散媒、コーティング、等張剤、および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的活性を有する物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と非適合性でない限り、薬学的組成物において使用されることが企図される。補足的な活性成分が、組成物に組み込まれてもよい。例えば、ある種の薬学的組成物は、適当な界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと混合された水の中にベクターまたはウイルスを含むことができる。分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物、ならびに油において調製され得る。保管および使用の通常の条件の下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存剤を含有する。薬学的に許容される塩、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等；および有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等が、その中に含まれ得る。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質等が、そのような媒体の中に存在し得る。
いくつかの態様において、賦形剤は、製剤化の手法、包装、保管、輸送等に起因するAAVビリオンおよび形質導入可能性の喪失が最小限に抑えられるよう、核酸分子を含むウイルス、例えば、AAVビリオンに保護効果を付与する。従って、これらの賦形剤組成物は、標準的なアッセイを使用して測定されるように、保護されていない対応物より高いAAVビリオン力価および高い形質導入可能性のレベルを提供するという意味で「ビリオン安定化（virion-stabilizing）」と見なされる（例えば、参照により本明細書に組み入れられる公開米国出願第2012/0219528号を参照すること）。従って、これらの組成物は、本明細書に記載された特定の賦形剤を欠く組成物と比較して「増強された形質導入可能性レベル」を示し、従って、保護されていない対応物より安定している。
活性分解条件からAAVビリオンを保護するために使用され得る例示的な賦形剤には、界面活性剤、タンパク質、例えば、卵白アルブミンおよびウシ血清アルブミン、アミノ酸、例えば、グリシン、多価アルコールおよび二価アルコール、例えば、限定されるわけではないが、様々な分子量のポリエチレングリコール（PEG）、例えば、PEG-200、PEG-400、PEG-600、PEG-1000、PEG-1450、PEG-3350、PEG-6000、PEG-8000、およびこれらの値の間の任意の分子量（1500～6000の分子量が好ましい）、プロピレングリコール（PG）、糖アルコール、例えば、炭水化物、好ましくは、ソルビトールが含まれるが、これらに限定されるわけではない。界面活性剤は、存在する時、陰イオン性、陽イオン性、両性、または非イオン性の界面活性剤であり得る。例示的な界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。非イオン性界面活性剤の1つの適当な型は、ソルビタンエステル、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（TWEEN（登録商標）-20）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（TWEEN（登録商標）-40）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（TWEEN（登録商標）-60）、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート（TWEEN（登録商標）-65）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（TWEEN（登録商標）-80）、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート（TWEEN（登録商標）-85）、例えば、TWEEN（登録商標）-20および/またはTWEEN（登録商標）-80である。これらの賦形剤は、多数の供給元、例えば、Sigma（St.Louis,Mo）から市販されている。
AAVを含む開示された組成物のいずれかにおける様々な賦形剤の量は、変動し、当業者によって容易に決定される。例えば、タンパク質賦形剤、例えば、BSAは、存在する場合、1.0重量（wt.）％～約20wt％、好ましくは、10wt％の濃度で存在し得る。アミノ酸、例えば、グリシンが製剤中に使用される場合、それは、約1重量％～約5重量％の濃度で存在することができる。炭水化物、例えば、ソルビトールは、存在する場合、約0.1重量％～約10重量％、例えば、約0.5重量％～約15重量％、または約1重量％～約5重量％の濃度で存在することができる。ポリエチレングリコールが存在する場合、それは、一般に、およそ、約2重量％～約40重量％、例えば、約10重量％～約25重量％で存在することができる。プロピレングリコールが本発明の製剤において使用される場合、それは、典型的には、約2重量％～約60重量％、例えば、約5重量％～約30重量％の濃度で存在するであろう。界面活性剤、例えば、ソルビタンエステル（TWEEN（登録商標））が存在する場合、それは、約0.05重量％～約5重量％、例えば、約0.1重量％～約1重量％の濃度で存在することができる（参照により本明細書に組み入れられる米国公開特許出願第2012/0219528号を参照すること）。一例において、水性ビリオン安定化製剤は、炭水化物、例えば、ソルビトールを、0.1重量％～約10重量％、例えば、約1重量％～約5重量％の濃度で含み、界面活性剤、例えば、ソルビタンエステル（TWEEN（登録商標））を、約0.05重量％～約5重量％、例えば、約0.1重量％～約1重量％の濃度で含む。ビリオンは、一般に、上記において定義されたように、1回または複数回で与えられた時に治療効果を提供するために十分な量で組成物中に存在する。
CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む核酸分子、例えば、ウイルスベクターを含む薬学的組成物は、いくつかの態様において、正確な投与量の個々の投与のために適当な単位剤形で製剤化される。投与される活性化合物の量は、処置される対象、罹患の重症度、および投与の様式に依存し、処方する医師の判断に最も委ねられる。これらの範囲内で、投与される製剤は、処置される対象において所望の効果を達成するために有効な量の活性成分を含有するであろう。
CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む核酸分子、例えば、ウイルスベクターは、眼への局所適用または注射のいずれかのため、不活性マトリックスに含まれていてもよい。不活性マトリックスの一例として、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、例えば、卵ホスファチジルコリン（PC）から、リポソームを調製することができる。リポソーム、例えば、陽イオン性リポソームおよび陰イオン性リポソームは、当業者に公知の標準的な手法を使用して作製され得る。いくつかの適用のため、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む核酸分子を含むリポソームは、眼内注射され得る。眼内注射用の製剤において、リポソームカプセルは、細胞消化（cellular digestion）によって分解される。理論によって拘束されるものではないが、これらの製剤は、徐放性薬物送達系の利点を提供し、例えば、ウイルスベクター中の、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む核酸分子に、経時的に実質的に一定な濃度で、対象を曝す。一例において、例えば、ウイルスベクター中の、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む核酸分子は、以前に記載されたように、有機溶媒、例えば、DMSOまたはアルコールに溶解していてよく、ポリ無水物、ポリ(グリコール)酸、ポリ(乳)酸、またはポリカプロラクトンポリマーを含有する。
例えば、ウイルスベクター、例えば、AAVベクターの中の、核酸分子は、特定の期間にわたる放出を可能にするよう製剤化され得る。放出系は、生分解性材料、または組み込まれた成分を拡散によって放出する材料のマトリックスを含み得る。成分は、放出系内に均一にまたは不均一に分布していてよい。多様な放出系が有用であり得るが、適切な系の選択は、特定の適用によって必要とされる放出の速度に依存するであろう。非分解性放出系および分解性放出系の両方が使用され得る。適当な放出系には、ポリマーおよびポリマーマトリックス、非ポリマーマトリックス、または無機および有機の賦形剤および希釈剤、例えば、限定されるわけではないが、炭酸カルシウムおよび糖（例えば、トレハロース）が含まれる。放出系は、天然または合成であり得る。しかしながら、合成放出系は、一般に、より信頼性が高く、より再現性が高く、より明確な放出プロファイルを生じるため、好ましい。放出系材料は、異なる分子量を有する成分が、拡散によって、または材料の分解を通して、放出されるよう、選択され得る。
代表的な合成生分解性ポリマーには、例えば、ポリアミド、例えば、ポリ(アミノ酸)およびポリ(ペプチド)；ポリエステル、例えば、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、乳酸グリコール酸コポリマー、およびポリ(カプロラクトン)；ポリ(無水物)；ポリオルトエステル；ポリカーボネート；ならびにそれらの化学的誘導体（置換、化学基、例えば、アルキル、アルキレンの付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者によってルーチンになされる他の修飾）、それらのコポリマーおよび混合物が含まれる。代表的な合成非分解性ポリマーには、ポリエーテル、例えば、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(エチレングリコール)、およびポリ(テトラメチレンオキシド)；ビニルポリマー-ポリアクリレート、およびポリメタクリレート、例えば、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、他のアルキルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリル酸およびメタクリル酸、ならびにその他、例えば、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、およびポリ(酢酸ビニル)；ポリ(ウレタン)；セルロースおよびその誘導体、例えば、アルキル、ヒドロキシアルキル、エーテル、エステル、ニトロセルロース、および様々なセルロースアセテート；ポリシロキサン；ならびにそれらの任意の化学的誘導体（置換、化学基、例えば、アルキル、アルキレンの付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者によってルーチンになされる他の修飾）、それらのコポリマーおよび混合物が含まれる。
乳酸グリコール酸コポリマーマイクロスフェアも、眼内注射のために使用され得る。典型的には、マイクロスフェアは、中空スフェアを形成するよう構造化された、乳酸およびグリコール酸のポリマーから構成される。スフェアは、直径約15～30ミクロンであってよく、本明細書に記載される成分を負荷され得る。
例えば、ウイルスベクター中の、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む核酸分子は、移植片のサイズ、形状、および製剤、ならびに移植手法の型に依って、眼内の様々な部位に移植され得る送達系に含まれてもよい。CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む核酸分子は、単独で使用され得る。しかしながら、もう1つの態様において、少なくとも1つの付加的な薬剤、例えば、以下に開示される少なくとも1つの薬剤が、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む核酸分子と共に、移植片に含まれてもよい。次いで、移植片は、眼に導入される。適当な部位には、前房、前眼部、後房、後眼部、および硝子体腔が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
移植片は、強膜または他の適当な部位を切開（例えば、2～3mmの切開）した後に、多様な方法、例えば、鉗子またはトロカールによる設置によって、眼に挿入され得る。いくつかのケースにおいて、移植片は、分割切開を行うことなく、トロカールによって眼に直接孔を作ることによって、トロカールによって設置され得る。設置の方法は、放出動力学に影響を与え得る。例えば、トロカールによる硝子体または後房へのデバイスの移植は、鉗子による設置より、硝子体内の深い位置へのデバイスの設置をもたらすことができ、その結果、移植片が硝子体の縁により近くなり得る。移植されたデバイスの位置は、例えば、ウイルスベクター中の、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む核酸分子の、デバイス周囲における濃度勾配に影響し得、従って、放出速度に影響を与え得る（例えば、硝子体の縁により近く設置されたデバイスは、より遅い放出速度をもたらし得る、米国特許第5,869,079号および米国特許第6,699,493号を参照すること）。
眼における移植片の使用は、当技術分野において周知である（米国特許第6,699,493号および米国特許第5,869,079号を参照すること）。1つの態様において、移植片は、生体侵食性ポリマーマトリックスと会合した、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む核酸分子によって製剤化される。他の送達方法、例えば、ナノ粒子も、使用され得る。
一般に、移植片が使用される時、ポリマーマトリックス中の不均等な分布のために、放出速度の有害な変動が起こらないよう十分に均等に分布するよう、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む核酸分子は、ポリマーマトリックス中に均一に分布する。利用されるポリマー組成物の選択は、所望の放出動力学、移植片の位置、患者の耐容能、および移植手技の性質によって変動する。ポリマーは、移植片の少なくとも約10重量％として含まれ得る。一例において、ポリマーは、移植片の少なくとも約20重量％として含まれる。もう1つの態様において、移植片は、複数のポリマーを含む。これらの因子は、米国特許第6,699,493号に詳細に記載されている。ポリマーの特徴には、一般に、移植の部位における生分解性、関心対象の薬剤との適合性、封入の容易さ、および水不溶性が、とりわけ、含まれる。一般に、ポリマーマトリックスは、薬物負荷が放出されるまで完全には分解されない。適当なポリマーの化学組成は、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第6,699,493号を参照すること）。CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む核酸分子は、本明細書に開示されるように、他の担体および溶媒と共に移植可能な形態に製剤化され得る。例えば、緩衝剤および保存剤が利用され得る。移植片のサイズおよび形状も、眼の特定の領域における使用のため、変動させられ得る（米国特許第5,869,079号を参照すること）。いくつかの態様において、ナノ粒子またはデンドリマーが使用される。
局所投与モードには、例として、眼内、眼窩内、硝子体内、および網膜下の経路が含まれる。一態様において、局所（例えば、硝子体内）投与される時には、全身（例えば、静脈内）投与される時と比較して、（全身アプローチと比較して）有意に少ない量の成分が、効果を発揮し得る。局所投与モードは、可能性のある副作用の発生率を低下させるか、または排除することができる。1つの態様において、本明細書に記載された成分は、例えば、網膜下注射によって、網膜下送達される。網膜下注射は、黄斑に直接なされてもよい（例えば、黄斑下注射）。例示的な方法には、眼内注射（例えば、眼球後、網膜下、黄斑下、硝子体内、および脈絡膜内）、イオントフォレシス、点眼、ならびに眼内移植（例えば、硝子体内、テノン嚢下、および結膜下）が含まれる。1つの態様において、本明細書に開示される組成物は、硝子体内注射によって送達される。硝子体内注射は、網膜剥離の比較的低いリスクを有する。眼への薬剤の投与の方法は、医学分野において公知であり、本明細書に記載された成分を投与するために使用され得る。
投与は、単回投与として提供されてもよいし、周期的ボーラス（例えば、網膜下もしくは硝子体内）として提供されてもよいし、または体内リザーバからの（例えば、眼内もしくは眼外の位置に配置された移植片からの（米国特許第5,443,505号および第5,766,242号を参照のこと））、もしくは体外リザーバからの（例えば、静脈内バッグからの）連続注入として提供されてもよい。治療剤の硝子体内注射または網膜下注射は、1回実施されてもよいし、または、例えば、1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、もしくは10回、反復的に実施されてもよい。投与は、週2回、毎週、隔週、毎月、または2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、もしくは6ヶ月毎に実施され得る。
個々の用量は、典型的には、対象に対して測定可能な効果を生じるために必要とされる量以上であり、本発明の組成物またはその副生成物の薬物動態および薬理学に基づき、従って、対象における組成物の配置に基づき、決定され得る。これには、（主に、局所効果のため、作用が望まれる場所に直接適用される）網膜下適用、（汎網膜効果のため、硝子体に適用される）硝子体内適用のため、調整され得る、投与経路および投薬量の考慮が含まれる。有効量の用量および/または投与計画は、前臨床アッセイ、安全性および漸増および用量範囲の試験、個々の医師と患者との関係、ならびにインビトロおよびインビボのアッセイから経験的に容易に決定され得る。
核酸分子は、微量注入、電気穿孔、脂質によって媒介されるトランスフェクション、ペプチドによって媒介される送達、ナノ粒子によって媒介される送達、デンドリマーによって媒介される送達、または当技術分野において公知の他の方法によって送達され得る。適切な用量は、処置される対象（例えば、ヒトもしくは非ヒト霊長類または他の哺乳動物）、処置される対象の年齢および全身状態、処置される状態の重症度、ベクター/ビリオンの投与モードに、とりわけ、依存する。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。従って、「治療的に有効な量」は、臨床試験を通して決定され得る比較的広い範囲に含まれるであろう。
成分は、眼の内壁に固定化された徐放性薬物送達デバイスからの特定の期間にわたる連続放出によって、または脈絡膜を標的にした経強膜の調節された放出を介して、投与され得る（例えば、PCT出願第PCT/US00/00207号、第PCT/US02/14279号、Ambati et al.(2000)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.41:1181-1185、およびAmbati et al.(2000)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.41:1186-1191を参照すること）。眼の内部に局所的に成分を投与するために適当な多様なデバイスが、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第6,251,090号；第6,299,895号；第6,416,777号、および第6,413,540号を参照すること。
いくつかの態様において、インビボ注射、即ち、対象への直接注射のため、治療的に有効な用量は、およそ、約105～1016 AAVビリオン、例えば、108～1014 AAVビリオンであろう。用量は、当然、形質導入の効率、プロモーター強度、メッセージおよびそれによってコードされるタンパク質の安定性、ならびに臨床的因子に依存する。有効投薬量は、用量反応曲線を確立するルーチンの試験を通して、当業者によって容易に確立され得る。
いくつかの態様において、核酸分子がAAVベクターに含まれる場合、変化を達成するために有効な量は、約1×108ベクターゲノム以上、いくつかのケースにおいて、約1×109、約1×1010、約1×1011、約1×1012、もしくは約1×1013ベクターゲノム、またはそれ以上、ある種の場合において、約1×1014ベクターゲノム以上、一般的には、約1×1015ベクターゲノム以下である。いくつかの態様において、送達されるベクターの量は、約1×1014ベクター以下、例えば、約1×1013、約1×1012、約1×1011、約1×1010、もしくは約1×109ベクター、またはそれ以下、ある種の場合において、約1×108ベクター、典型的には、1×108ベクター以上である。いくつかの非限定的な例において、送達されるベクターゲノムの量は、約1×1010～約1×1011ベクターである。付加的な非限定的な例において、送達されるベクターの量は、約1×1010～約1×1012ベクターゲノムである。
いくつかの態様において、投与される薬学的組成物の量は、感染多重度（MOI）を使用して測定され得る。いくつかの態様において、MOIとは、核酸が送達され得る細胞に対する、ベクターもしくはウイルスゲノムの比率または倍率をさす。いくつかの態様において、MOIは、約1×106であり得る。いくつかのケースにおいて、MOIは、約1×105～約1×107であり得る。いくつかのケースにおいて、MOIは、約1×104～約1×108であり得る。いくつかのケースにおいて、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約1×101、約1×102、約1×103、約1×104、約1×105、約1×106、約1×107、約1×108、約1×109、約1×1010、約1×1011、約1×1012、約1×1013、約1×1014、約1×1015、約1×1016、約1×1017、および約1×1018 MOIである。いくつかのケースにおいて、本開示の組換えウイルスは、約1×108～1×1014 MOIである。
いくつかにおいて、送達される薬学的組成物の量は、約1×108～約1×1015組換えウイルス粒子、約1×109～約1×1014組換えウイルス粒子、約1×1010～約1×1013組換えウイルス粒子、または約1×1011～約1×10.s12組換えウイルス粒子を含む（参照により本明細書に組み入れられる米国公開特許出願第2015/0259395号を参照すること）。
投薬処置は、上記の量を最終的に送達するための単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。さらに、対象は、適切な回数、投与を受け得る。従って、例えば、105～1016AAVビリオンが、単回で対象に与えられてもよいし、または、例えば、105～1016AAVビリオンの送達を集合的にもたらす、2回、4回、5回、6回、またはそれ以上の投与によって与えられてもよい。当業者は、適切な投与回数を容易に決定することができる。
いくつかの態様において、AAVは、約1×1011～約1×1014ウイルス粒子（vp）/kgの用量で投与される。いくつかの例において、AAVは、約1×1012～約8×1013vp/kgの用量で投与される。他の例において、AAVは、約1×1013～約6×1013vp/kgの用量で投与される。具体的な非限定的な例において、AAVは、少なくとも約1×1011、少なくとも約5×1011、少なくとも約1×1012、少なくとも約5×1012、少なくとも約1×1013、少なくとも約5×1013、または少なくとも約1×1014vp/kgの用量で投与される。他の非限定的な例において、rAAVは、約5×1011以下、約1×1012以下、約5×1012以下、約1×1013以下、約5×1013以下、または約1×1014vp/kg以下の用量で投与される。1つの非限定的な例において、AAVは、約1×1012vp/kgの用量で投与される。AAVは、所望の治療結果のため、必要に応じて、単回投与されてもよいし、または複数回（例えば、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、もしくは10回）投与されてもよい。
硝子体内注射の一般的な方法は、以下の簡単な概要によって例示され得る。この例は、方法のある種の特色を例示するためのものに過ぎず、決して、限定的なものではない。硝子体内注射のための手技は、当技術分野において公知である（例えば、Peyman,et al.(2009)Retina 29(7):875-912およびFagan and Al-Qureshi,(2013)Clin.Experiment.Ophthalmol.41(5):500-7を参照すること）。眼内投与の他の方法は、当技術分野において公知であり、網膜下投与を含む。
簡単に説明すると、硝子体内注射のための対象は、瞳孔散大、眼の滅菌、および麻酔薬の投与によって、この手技のために準備され得る。当技術分野において公知の任意の適当な散瞳剤が、瞳孔散大のために使用され得る。適切な瞳孔散大が、処置前に確認され得る。滅菌は、眼の滅菌処置、例えば、ヨウ化物含有溶液、例えば、ポビドンヨード（BETADINE（登録商標））を適用することによって達成され得る。類似の溶液が、眼瞼、睫毛、および任意の他の近くの組織（例えば、皮膚）を清浄化するためにも使用され得る。任意の適当な麻酔薬、例えば、リドカインまたはプロパラカインが、任意の適当な濃度で使用され得る。麻酔薬は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、限定されるわけではないが、麻酔薬の滴剤、ゲル剤、またはゼリー剤の局所適用、および結膜下適用によって投与され得る。
注射前に、その区域から睫毛を除去するため、滅菌された眼瞼鏡を使用することができる。注射の部位は、注射器によってマーキングされ得る。注射の部位は、患者の水晶体に基づき選択され得る。例えば、注射部位は、偽水晶体または無水晶体の患者においては縁から3～3.5mm、有水晶体患者においては縁から3.5～4mmであり得る。患者は、注射部位と反対の方向を見ていてよい。注射中、針は強膜に対して垂直に挿入され、眼の中心に向けられ得る。針は、先端が、網膜下腔ではなく、硝子体で終わるよう、挿入され得る。注射のための当技術分野において公知の任意の適当な体積が使用され得る。注射後、眼を滅菌剤、例えば、抗生物質で処置することができる。過剰の滅菌剤を除去するため、眼を濯ぐこともできる。
付加的な治療剤を対象に投与することができる。対象へ投与され得る付加的な薬剤には、抗菌性および抗真菌性の抗生物質、ならびに感染および炎症のリスクを低下させるための非ステロイド性抗炎症剤が含まれる。付加的な薬剤は、任意の経路によって投与され得る。付加的な薬剤は、別に製剤化されてもよいし、または同じ組成物に製剤化されてもよい。
有用な薬剤には、抗生物質、例えば、アミノグリコシド系（例えば、アミカシン、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ジヒドロストレプトマイシン、フォーチミシン、ゲンタマイシン、イセパマイシン、カナマイシン、ミクロノマイシン、ネオマイシン、ウンデシレン酸ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、トロスペクトマイシン（trospectomycin））、アンフェニコール系（例えば、アジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、チアンフェニコール）、アンサマイシン系（例えば、リファミド、リファンピン、リファマイシンsv、リファペンチン、リファキシミン）、βラクタム系（例えば、カルバセフェム系（例えば、ロラカルベフ）、カルバペネム系（例えば、ビアペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム）、セファロスポリン系（例えば、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セファゾリン、セフカペンピボキシル、セフクリジン（cefclidin）、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフェタメト、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォチアム、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、セフピロム、セフポドキシムプロキセチル、セフプロジル、セフロキサジン、セフスロジン、セフタジジム、セフテラム、セフテゾール、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セフゾナム、セファセトリルナトリウム、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロスポリン、セファロチン、セファピリンナトリウム、セフラジン、ピブセファレキシン（pivcefalexin））、セファマイシン系（例えば、セフブペラゾン、セフメタゾール、セフィニノクス（cefininox）、セフォテタン、セフォキシチン）、モノバクタム系（例えば、アズトレオナム、カルモナム、チゲモナム（tigemonam））、オキサセフェム系、フロモキセフ、モキサラクタム）、ペニシリン系（例えば、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、アンピシリン、アパルシリン（apalcillin）、アスポキシシリン、アジドシリン、アズロシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン（benzylpenicillinic）酸、ベンジルペニシリンナトリウム、カルベニシリン、カリンダシリン、クロメトシリン、クロキサシリン、シクラシリン、ジクロキサシリン、エピシリン、フェンベニシリン（fenbenicillin）、フロキサシリン、ヘタシリン、レナンピシリン、メタンピシリン、メチシリンナトリウム、メズロシリン、ナフシリンナトリウム、オキサシリン、ペナメシリン、ペネタマートヨウ化水素酸塩（penethamate hydriodide）、ペニシリンGベネタミン（benethamine）、ペニシリンgベンザチン、ペニシリンgベンズヒドリルアミン、ペニシリンGカルシウム、ペニシリンGヒドラバミン（hydrabamine）、ペニシリンGカリウム、ペニシリンGプロカイン、ペニシリンN、ペニシリンO、ペニシリンV、ペニシリンVベンザチン、ペニシリンVヒドラバミン、ペニメピサイクリン、フェネチシリンカリウム、ピペラシリン、ピバンピシリン、プロピシリン、キナシリン（quinacillin）、スルベニシリン、スルタミシリン、タランピシリン、テモシリン、チカルシリン）、その他（例えば、リチペネム（ritipenem））、リンコサミド系（例えば、クリンダマイシン、リンコマイシン）、マクロライド系（例えば、アジスロマイシン、カルボマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、エリスロマイシンアシストレート（acistrate）、エリスロマイシンエストレート、エリスロマイシングルコヘプトネート（glucoheptonate）、エリスロマイシンラクトビオン酸塩、エリスロマイシンプロピオネート、エリスロマイシンステアリン酸塩、ジョサマイシン、ロイコマイシン、ミデカマイシン、ミオカマイシン、オレアンドマイシン、プリマイシン（primycin）、ロキタマイシン、ロサラマイシン（rosaramicin）、ロキシスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマイシン）、ポリペプチド系（例えば、アンホマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンデュラシジン（enduracidin）、エンビオマイシン、フサファンギン、グラミシジンs、グラミシジン、ミカマイシン、ポリミキシン、プリスチナマイシン、リストセチン、テイコプラニン、チオストレプトン、ツベラクチノマイシン（tuberactinomycin）、チロシジン、チロスリシン、バンコマイシン、ビオマイシン、バージニアマイシン（virginiamycin）、亜鉛バシトラシン（zinc bacitracin））、テトラサイクリン系（例えば、アピサイクリン（apicycline）、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、グアメサイクリン（guamecycline）、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、ペニメピサイクリン、ピパサイクリン（pipacycline）、ロリテトラサイクリン、サンサイクリン（sancycline）、テトラサイクリン）、ならびにその他（例えば、シクロセリン、ムピロシン、ツベリン）が含まれる。有用な薬剤には、合成抗菌薬、例えば、2,4-ジアミノピリミジン系（例えば、ブロジモプリム、テトロキソプリム（tetroxoprim）、トリメトプリム）、ニトロフラン系（例えば、フラルタドン（furaltadone）、塩化フラゾリウム（furazolium chloride）、ニフラデン（nifuradene）、ニフラテル、ニフルフォリン（nifurfoline）、ニフルピリノール（nifurpirinol）、ニフルプラジン（nifurprazine）、ニフルトイノール、ニトロフラントイン）、キノロン系および類似体（例えば、シノキサシン、シプロフロキサシン、クリナフロキサシン、ジフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、フルメキン、グレパフロキサシン、ロメフロキサシン、ミロキサシン（miloxacin）、ナジフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキソリニン酸、パズフロキサシン、ペフロキサシン、ピペミド酸、ピロミド酸、ロソキサシン（rosoxacin）、ルフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、トロバフロキサシン）、スルホンアミド系（例えば、アセチルスルファメトキシピラジン、ベンジルスルファミド、クロラミンb、クロラミンt、ジクロラミンt、マフェニド、4'-(メチルスルファモイル）スルファニルアニリド、ノプリルスルファミド（noprylsulfamide）、フタリルスルフアセトアミド（phthalylsulfacetamide）、フタリルスルファチアゾール、サラゾスルファジミジン（salazosulfadimidine）、スクシニルスルファチアゾール、スルファベンズアミド、スルフアセトアミド、スルファクロルピリダジン、スルファクリソイジン（sulfachrysoidine）、スルファシチン（sulfacytine）、スルファジアジン、スルファジクラミド、スルファジメトキシン、スルファドキシン、スルファエチドール（sulfaethidole）、スルファグアニジン、スルファグアノール、スルファレン、スルファロキシン（sulfaloxic）酸、スルファメラジン、スルファメータ、スルファメタジン、スルファメチゾール、スルファメトミジン、スルファメトキサゾール、スルファメトキシピリダジン、スルファメトロール（sulfametrole）、スルファミドクリソイジン（sulfamidocchrysoidine）、スルファモキソール、スルファニルアミド、スルファニリル尿素、n-スルファニリル-3,4-キシルアミド、スルファニトラン（sulfanitran）、スルファペリン、スルファフェナゾール、スルファプロキシリン（sulfaproxyline）、スルファピラジン、スルファピリジン、スルファソミゾール（sulfasomizole）、スルファシマジン（sulfasymazine）、スルファチアゾール、スルファチオ尿素、スルファトラミド、スルフィソミジン（sulfisomidine）、スルフィソキサゾール（sulfisoxazole））、スルホン系（例えば、アセダプソン、アセジアスルホン（acediasulfone）、アセトスルホンナトリウム、ダプソン、ジアチモスルホン（diathymosulfone）、グルコスルホンナトリウム、ソラスルホン（solasulfone）、サクシスルホン（succisulfone）、スルファニル酸、p-スルファニルベンジルアミン、スルホキソンナトリウム、チアゾールスルホン）、ならびにその他（例えば、クロホクトール、ヘキセジン、メテナミン、メテナミンアンヒドロメチレンシトレート（methenamine anhydromethylene-citrate）、メテナミン馬尿酸塩、メテナミンマンデル酸塩、メテナミンスルホサリチル酸塩、ニトロキソリン、タウロリジン、キシボルノール）も含まれる。
付加的な有用な薬剤には、ポリエン系（例えば、アンホテリシンB、カンジシジン、デンノスタチン（dennostatin）、フィリピン、ファンギクロミン（fungichromin）、ハチマイシン、ハマイシン（hamycin）、ルセンソマイシン、メパルトリシン、ナタマイシン、ナイスタチン、ペシロシン（pecilocin）、ペリマイシン（perimycin））、その他（例えば、アザセリン、グリセオフルビン、オリゴマイシン、ネオマイシンウンデシレン酸、ピロルニトリン（pyrrolnitrin）、シッカニン、ツベルシジン、ビリジン（viridin））、アリルアミン系（例えば、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン）、イミダゾール系（例えば、ビフォナゾール、ブトコナゾール、クロルダントイン（chlordantoin）、クロルミイダゾール（chlormiidazole）、クロコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、エニルコナゾール（enilconazole）、フェンチコナゾール、フルトリマゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ラノコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール硝酸塩、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール）、チオカルバメート系（例えば、トルシクレート（tolciclate）、トリンデート（tolindate）、トルナフテート）、トリアゾール系（例えば、フルコナゾール、イトラコナゾール、サペルコナゾール（saperconazole）、テルコナゾール）、その他（例えば、アクリソルシン（acrisorcin）、アモロルフィン、ビフェナミン（biphenamine）、ブロモサリチルクロルアニリド（bromosalicylchloranilide）、ブクロサミド（buclosamide）、プロピオン酸カルシウム、クロルフェネシン、シクロピロックス、クロキシキン（cloxyquin）、コパラフィネート（coparaffinate）、ジアムタゾール二塩酸塩、エクサラミド（exalamide）、フルシトシン、ハレタゾール（halethazole）、ヘキセチジン、ロフルカルバン（loflucarban）、ニフラテル、ヨウ化カリウム、プロピオン酸、ピリチオン、サリチルアニリド、プロピオン酸ナトリウム、スルベンチン、テノニトロゾール、トリアセチン、ウジョチオン（ujothion）、ウンデシレン酸、プロピオン酸亜鉛）が含まれる。抗悪性腫瘍剤、例えば、（1）抗生物質および類似体（例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン、カルジノフィリン、クロモマイシン系、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、メノガリル、マイトマイシン系、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン系、ペプロマイシン、ピラルビシン、プリカマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ジノスタチン、ゾルビシン）、（2）代謝拮抗薬、例えば、葉酸類似体（例えば、デノプテリン、エダトレキセート、メトトレキセート、ピリトレキシム、プテロプテリン、トリメトレキセート）、（3）プリン類似体（例えば、クラドリビン、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン）、（4）ピリミジン類似体（例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ドキシフルリジン、エミテフール（emitefur）、エノシタビン、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、タガフール）も、有用であり得る。
ステロイド系抗炎症剤、例えば、21-アセトキシプレグネノロン、アルクロメタゾン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、シクロスポリン、デフラザコート、デソニド、デオキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルアザコルト（fluazacort）、フルクロロニド（flucloronide）、フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオロメトロン、酢酸フルペロロン、酢酸フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルランドレノリド、プロピオン酸フルチカゾン、ホルモコルタル（formocortal）、ハルシノニド、ハロベタゾールプロピオン酸エステル、ハロメタゾン、ハロプレドン酢酸エステル、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、ロテプレドノールエタボン酸エステル、マジプレドン（mazipredone）、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、モメタゾンフロ酸エステル、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、プレドニゾロン25-ジエチルアミノアセテート、プレドニゾロンリン酸エステルナトリウム、プレドニゾン、プレドニバル（prednival）、プレドニリデン、リメキソロン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニド（benetonide）、およびトリアムシノロンヘキサセトニドも、使用され得る。
さらに、非ステロイド性抗炎症剤が使用され得る。これらには、アミノアリールカルボン酸誘導体（例えば、エンフェナム（enfenamic）酸、エトフェナメート、フルフェナム酸、イソニキシン（isonixin）、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルミン酸、タルニフルメート（talniflumate）、テロフェナメート（terofenamate）、トルフェナム酸）、アリール酢酸誘導体（例えば、アセクロフェナク、アセメタシン、アルクロフェナク、アンフェナク、アムトルメチングアシル（amtolmetin guacil）、ブロムフェナク、ブフェキサマック、シンメタシン（cinmetacin）、クロピラク、ジクロフェナクナトリウム、エトドラク、フェルビナク、フェンクロジン（fenclozic）酸、フェンチアザック、グルカメタシン（glucametacin）、イブフェナク、インドメタシン、イソフェゾラク（isofezolac）、イソキセパック（isoxepac）、ロナゾラク、メチアジン酸、モフェゾラク、オキサメタシン、ピラゾラク（pirazolac）、プログルメタシン、スリンダク、チアラミド、トルメチン、トロペシン（tropesin）、ゾメピラック）、アリール酪酸誘導体（例えば、ブマジゾン、ブチブフェン（butibufen）、フェンブフェン、キセンブシン（xenbucin））、アリールカルボン酸（例えば、クリダナク、ケトロラク、チノリジン）、アリールプロピオン酸誘導体（例えば、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ベルモプロフェン（bermoprofen）、ブクロキシ（bucloxic）酸、カルプロフェン（carprofen）、フェノプロフェン、フルノキサプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、イブプロキサム、インドプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピケトプロレン（piketoprolen）、ピルプロフェン、プラノプロフェン（pranoprofen）、プロチジン酸、スプロフェン、チアプロフェン酸、キシモプロフェン（ximoprofen）、ザルトプロフェン）、ピラゾール系（例えば、ジフェナミゾール（difenamizole）、エピリゾール）、ピラゾロン系（例えば、アパゾン、ベンズピペリロン（benzpiperylon）、フェプラゾン、モフェブタゾン、モラゾン（morazone）、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピペブゾン（pipebuzone）、プロピフェナゾン、ラミフェナゾン（ramifenazone）、スキシブゾン、チアゾリノブタゾン）、サリチル酸誘導体（例えば、アセトアミノサロール（acetaminosalol）、アスピリン、ベノリレート（benorylate）、ブロモサリゲニン（bromosaligenin）、アセチルサリチル酸カルシウム、ジフルニサル、エテルサレート（etersalate）、フェンドサル（fendosal）、ゲンチジン酸、サリチル酸グリコール、サリチル酸イミダゾール、アセチルサリチル酸リジン、メサラミン、サリチル酸モルホリン、サリチル酸1-ナフチル、オルサラジン、パルサルミド（parsalmide）、アセチルサリチル酸フェニル、サリチル酸フェニル、サラセタミド（salacetamide）、サリチルアミドo-酢酸、サリチル硫酸、サルサレート（salsalate）、スルファサラジン）、チアジンカルボキサミド系（例えば、アンピロキシカム、ドロキシカム、イソキシカム、ロルノキシカム、ピロキシカム、テノキシカム）、εアセトアミドカプロン酸、s-アデノシルメチオニン、3-アミノ-4-ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（amixetrine）、ベンダザック、ベンジダミン、αビサボロール、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモルファゾン、フェプラジノール（fepradinol）、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オキサセプロール、パラニリン（paranyline）、ペリソキサール、プロカゾン、スーパーオキシドジスムターゼ、テニダップ、およびジロートンが含まれる。
本開示は、以下の非限定的な実施例によって例示される。
網膜遺伝子治療について特に困難な分野は、常染色体優性変異の処置である。網膜色素変性症例の最大30％は、常染色体優性変異によって引き起こされる可能性がある。最も高頻度に検出されるのは、ロドプシン遺伝子（RHO）の変異であり、P23H変異およびP347S変異が一般的である。変異対立遺伝子のみ（Lewin et al.,Nat Med,4,967-971；Tessitore et al.,Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy,14,692-699）または両方の対立遺伝子（Chadderton et al.,Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy,17,593-599；O'Reilly et al.,American journal of human genetics,81,127-135）を標的にすることを目的としたアプローチは、開発されているが、大きい限界を示している。優性ロドプシン変異に対する病原性対立遺伝子特異的アプローチについては、特異性および効率が重要な課題であり、この桿体構造タンパク質の高度の発現を提供することが、抑制および置換の戦略において必要であろう。
以下に提示される研究は、優性変異対立遺伝子を除去することなく、正常遺伝子の高度の発現を提供することによる、優性CRX-LCAの処置についての最初の直接的な概念実証を提供する。
実施例1
方法
細胞培養：
IPSCの維持および網膜分化。IPSCを、マトリゲルによってコーティングされたプレートにおいてE8培地中で維持した。EDTAを使用した非酵素的継代を実施した。分化のため、細胞をEDTAを使用して浮遊させ、胚様体を形成させるため、超低接着ディッシュに移した。分化は、以前に記載されたもの（Zhong et al.,Nat Commun,5,4047；Kaya et al.,Molecular vision,25,663-678）をわずかに変更して、即ち、眼ドメイン（optic domains）の剥離後に20ng/ml IGF-1を補足し、90日目からオールトランスレチノイン酸の代わりに9-シスレチンアルデヒドを使用して、実施された。
網膜オルガノイド分化プロトコル：
網膜分化のために使用された培地のリストおよびその組成を、以下に提示する：
1:1神経誘導培地（1:1 NIM）
Figure 2023510186000007
3:1神経誘導培地（3:1 NIM）
Figure 2023510186000008
可溶性因子：
ROCK阻害剤（Y-27632二塩酸塩、Tocris）ストック10mM、最終濃度10μM、1:1000希釈。
タウリン（Sigma-Aldrich）ストック100mM、最終濃度100μM、1:1000希釈。
9-シスレチンアルデヒド（Sigma-Aldrich）ストック溶液1mM、最終1μMまたは500nM、1:1000または1:2000希釈。
IGF-1（Gibco）ストック10μg/ml、最終20ng/ml、1:500希釈。
分化プロトコル：
Figure 2023510186000009
免疫組織化学および顕微鏡法：
網膜オルガノイドを、ワイドボアピペットチップを使用して収集し、PBSで洗浄し、次いで、4％PFA（Neuro Technologies）で少なくとも1時間固定した。次いで、オルガノイドをPBSで3回洗浄し、チューブの底に沈むまで、15％ショ糖（w/v）溶液に移した。次いで、組織を30％ショ糖溶液（w/v）に移した。これらの脱水工程の後、オルガノイドをM1包埋マトリックス中に置き、エタノール/ドライアイス浴中で急速凍結させた。塊をSuperfrost Plus（Fisher Scientific）ガラススライドにおいて18μmに凍結切片化した。Thermo Scientific MICROM HM550クライオスタット（Thermo Fisher Scientific）。切片を乾燥させた後、-20℃で保管した。染色のため、スライドをPBS中で15分間再水和し、次いで、PBS中の5％ロバ血清、1％BSA（Sigma-Aldrich）、0.1％Triton X-100（Sigma-Aldrich）の溶液で少なくとも1時間ブロッキングした。一次抗体および二次抗体の両方を、PBS中の1％BSA（Sigma-Aldrich）、0.1％Triton X-100（Sigma-Aldrich）の溶液に添加した。切片を一次抗体と共に一晩インキュベートした。スライドをPBSで5回洗浄した後、二次抗体を2時間添加した。スライドをPBSで3回洗浄し、次いで、DAPIと共にインキュベートした後、Fluoromount-G封入剤（SouthernBiotech）を添加し、顕微鏡カバーガラス（VWR）で覆った。試料をZeiss 700共焦点顕微鏡（Zeiss）またはLeica SP-8共焦点顕微鏡（Leica Microsystems）で画像化した。ZENブラック、ZENブルー（Zeiss）、LAS X（Leica Microsystems）、およびImageJソフトウェアによって、画像を処理した。ImageJソフトウェアを使用して、定量化および蛍光強度測定を実施した。3つの独立したオルガノイドに由来する少なくとも3つの切片を、定量化のために使用した。
使用された一次抗体のリスト：
Figure 2023510186000010
AAVベクターの調製：
ヒトCRXプロモーターのクローニング：
ヒトCRX 5'非翻訳領域に由来する配列（NCBIリファレンス配列：NG_008605.1）を、ヒトゲノムDNAから増幅し、631塩基対のプロモーターを作製するため、組み合わせた。具体的には、最初の189ヌクレオチドは、参照配列の3085～3274位に相当し；次の69は、参照の3323～3392に相当し、次の361は、参照配列の4808～5169に相当する。4999～5169はエクソン1であり、従って、このヒトCRXプロモーター要素は、ヒトCRX遺伝子の第1エクソンを含有することに注意すること。
AAV作製の簡単な概要
HEK293細胞を、CaCl2法を使用して、ベクタープラスミドならびにヘルパープラスミドpHLP19-AAV2およびpLAdeno5によってトランスフェクトした。AAV粒子を放出させるため、細胞ペレットをマイクロフルイダイザーによってホモジナイズした。細胞片を遠心分離によって排除し、遊離DNAを1時間の100U/mlベゾナーゼ処理によって除去した。次いで、AAV粒子を氷上で8％PEG中で2時間沈殿させた。AAV粒子ペレットを遠心分離によって収集し、37℃で30分間、RNaseAによって処理した。その後、CsCl密度勾配での一連の超遠心分離工程および透析を使用して、AAVの精製を実施した。滴定をqPCRによって実施した。
詳細なプロトコル：
Figure 2023510186000011
Figure 2023510186000012
統計分析：
データをプロットし、統計分析を実施するため、GraphPad Prismバージョン8.0ソフトウェアを使用した。二群比較のため（両側）、タイプ3のスチューデントt検定を使用した。多群については、ダネットまたはテューキーのいずれかの事後検定と共に分散分析を使用した。
実施例2
結果
CRX-LCAに関連する疾患機序を調査するため、CRXコード配列におけるc.413delT（p.I138fs48）フレームシフト変異（図1A）をヘテロ接合型で保持する以前に記載された小児LCA患者、および非罹患家族内対照の皮膚生検から、誘導多能性幹細胞（iPSC）を得た。iPSC株は正常な核型であり、多能性幹細胞の典型的な特色を示した。これらの株を、以前に公開されたプロトコルの修飾を使用して、網膜オルガノイドへ分化させた（図1B）。簡単に説明すると、胚様体（EB）を形成させるため、iPSCコロニーをEDTAを使用して浮遊させた。神経誘導を浮遊EBに対して7日間実施し、その後、マトリゲルに播種した。接着培養からおよそ4週間後に、眼領域/眼胞ドメインを手動で剥離し、その後、網膜オルガノイドとして懸濁培養した。患者および対照の両方の細胞株が、形態学的に類似した網膜神経上皮を形成した。
光受容体は、網膜内の主なCRX発現細胞である。この細胞型への分化を査定するため、9週目の網膜オルガノイドを、光受容体指定経路のCRXの上流の光受容体前駆体のマーカー、OTX2によって染色した。OTX2を発現する細胞の割合は、患者オルガノイドおよび対照オルガノイドの両方において同等であった。同様に、この段階ではCRX発現細胞の割合に有意差がなかった。10週目から、リカバリン+光受容体前駆体が、オルガノイドの頂端面に蓄積し始めた。13週目には、2～3列のリカバリン+細胞が、予定光受容細胞層に存在した。オルガノイドからのタンパク質抽出物のイムノブロッティングによる分析は、患者試料中の短縮型CRXの存在を示した。タンパク質バンドの定量化は、変異対立遺伝子が有意な割合で寄与する、患者試料中のCRXの全体的なレベルの増加を示した。総合すると、これらの観察は、光受容体運命への初期コミットメントがCRX-LCAにおいて起こり、患者由来のオルガノイドにおいては変異型タンパク質が発現されることを示している。
光受容体成熟の開始を調査するため、発生中に発現される最初のオプシンであるSオプシンについて、d125にオルガノイドを染色した。d125までに、対照オルガノイドにおいては、Sオプシンがロバストに発現されたが、CRX-LCAオルガノイドは、はるかに弱い染色を示した（図1C）。Sオプシン+細胞、および個々の細胞における平均蛍光強度の定量化は、患者試料における両方の尺度の有意な低下を明らかにした（図1D、E）。さらに、個々のSオプシン発現錐体細胞における最大蛍光強度のヒストグラムのプロットは、CRX-LCA株における、家族内対照と比較して、より低い最大強度値への明らかなシフトを示した（図1F）。網膜発達中に発現される第2のオプシンは、桿体細胞視覚色素ロドプシンである。d125に、対照オルガノイドの予定桿体光受容体のパッチにおいて、ロドプシンが発現されるようになった（図1C）。対照的に、CRX-LCA網膜オルガノイドは、オルガノイド切片上の蛍光強度によって測定されるロバストなロドプシン免疫反応性を欠いた（図1G）。ロドプシンの喪失は、調査された10のオルガノイドにおいて一貫していた（図1H）。定性的には、患者由来オルガノイドにおいては、光受容体層の分離が、比較的進行していなかった（図1C）。錐体細胞L/Mオプシンは、ヒトにおいて発現される最後のオプシンである。d230の網膜オルガノイドのフラットマウントは、患者試料においてL/Mオプシン染色が重度に低下し、この段階でも未だロドプシンが存在しないことを明らかに示した（図1I）。オプシンタンパク質は、光受容体の頂端外節構造に蓄積する。外節新生に関与するタンパク質、ペリフェリン2についての染色を調査した。対照オルガノイドにおいては、ペリフェリン2の明るい斑点が組織の頂端縁に局在したが、患者オルガノイドは、染色の減少を示した（図1J、K）。基本的に、発達中の光受容体は、介在ニューロンと連絡するために軸索を伸長する。シナプスマーカーCTBP2（リブアイ）についての染色は、対照オルガノイドおよび患者オルガノイドの両方において類似のパターンを示した（図1J、L）。集合的に、成熟中の網膜オルガノイドの組織学的分析は、CRXにおける病理学的c.413delT（p.I138fs48）フレームシフト変異が、光受容体最終分化の特定の局面を損なうことを示唆している。
CRX変異は、様々な重症度を有するいくつかの型の網膜症をもたらす（den Hollander et al.,Prog Retin Eye Res,27,391-419；Hull et al.,Investigative Ophthalmology & visual science,55,6934-6944）。動物モデルは、変異の性質に依る複数の疾患機序を示す（Tran et al.,PLoS Genet,10,e1004111；Roger et al.,J Clin Invest,124,631-643）。しかしながら、ヒト対象においては、変異の型または遺伝子の機能ドメイン内のその位置と、表現型の重症度または顕在化との間に、明らかな相関が認められない（Hull et al.,Investigative Ophthalmology & visual science,55,6934-6944）。これは、ヒト遺伝子多様性によって疾患表現型を予測することが困難であること、そして必然的に異なるゲノム環境に変異が置かれる動物モデルを使用することが困難であることを強調している。患者特異的iPSCに由来するヒト網膜オルガノイドの使用は、病理学的変異が作用する天然ヒトゲノム構造をはるかによく表すため、動物モデルによって提示される限界のいくつかを回避し得る。ヒト対象における疾患顕在化の範囲を考慮すると（Hull et al.,Investigative Ophthalmology & visual science,55,6934-6944）、単一の遺伝子治療アプローチが全ての患者のために適当であるか否かも、未解決の疑問である。それ自体の天然プロモーターの要素によって駆動され、AAVベクターで送達されるCRXの正しい対立遺伝子の過剰発現を使用する遺伝子治療パラダイムを試験した。AAVによって処置されたCRX-LCA網膜オルガノイドにおけるロドプシン発現の顕著なレスキューは、このアプローチを処置戦略として同定する。網膜オルガノイドは、CRX-LCA網膜ジストロフィーを有する患者における遺伝子治療を査定するためのプラットフォームとして使用され、この実験戦略は、網膜の他の常染色体優性状態にも適用され得る。患者iPSC由来オルガノイドは、RP2の変異によって引き起こされる劣性X連鎖網膜色素変性症の、AAVによって媒介される遺伝子治療の概念実証を提供するため、使用されている（Lane et al.,Stem Cell Reports,2020）。
形質導入は、GFPレポーターを駆動するCMVプロモーターを有する、2つの一般的に使用されるアデノ随伴ウイルスベクター（AAV）カプシド血清型AAV2およびAAV8を使用して試験された。AAV2カプシドは、d140におけるベクター添加の10日後、d150に、オルガノイド中の、GFPおよびCRXの両方を発現する細胞のはるかに高い割合を示した。次いで、ヒトCRXプロモーター配列を、CRX遺伝子を通常発現する網膜細胞における転写の駆動について試験した。
実施例3
複合CRXプロモーターのクローニングおよび試験
ヒトCRX遺伝子の上流領域に由来する異なる配列領域（NCBIリファレンス配列：NG_008605.1）をヒトゲノムDNAを使用して増幅し、631塩基対長のプロモーター要素を作製するため、組み立てた。このプロモーターにおいて、189ヌクレオチドは、参照の3085～3274位に相当し、69は、3323～3392に相当し、361は、4808～5169に相当する。このプロモーター要素は、ヒトCRX遺伝子の第1エクソン（ヌクレオチド4999～5169）を含有する。これらの配列は、ヒト網膜の発達中に発現されるいくつかの転写因子の結合部位に基づき、含まれた。理論によって拘束されるものではないが、これらの部位は、CRX遺伝子の制御における可能性のある関連性のために含まれ、特に重要であるのは、下流遺伝子のロバストな発現を確実にする、CRXまたはOTX2に結合することができる5つの配列要素である。631ヌクレオチド（nt）の複合プロモーターを、AAVベクター構築物中のGFPレポーターの上流にクローニングした。このベクターを、分化のd190の網膜オルガノイドの形質導入のため、CMVプロモーターベクターと共に使用した。ベクター添加の4週間後（d220）、オルガノイドを収集し、凍結切片化し、GFPについて染色した（図2A～2D）。CMVプロモーターベクターによるレポーター発現は、オルガノイドの全体に存在した（図2A）。対照的に、CRX複合プロモーターは、オルガノイドの頂端領域の明確な細胞層への局在を示し、それは光受容体の位置と一致した（図2B～2D）。1オルガノイド当たり5×1010ウイルスゲノム（vg）という用量は、光受容層の有意な形質導入のために十分であり（図2B）、形質導入は1オルガノイド当たり1011vgの用量でオルガノイド全体に広がった（図2D）。
実施例4
AAV-CRX遺伝子治療処置によるCRX-LCA患者オルガノイドにおけるオプシン発現のレスキュー
処置のためのCRXコード配列の発現を誘導する631nt CRX複合プロモーターを含有する遺伝子治療ベクターを、分化の120日目の網膜オルガノイドにおいて使用した。オルガノイドを150日目（4週間後）に採集し、組織学によって分析した（図3A～3H）。抗ロドプシン抗体を使用した免疫染色（図3A～C）は、健常対照オルガノイドにおいてロバストな染色を明らかにした（図3A）。AAV-CRX遺伝子治療処置群の患者由来オルガノイドにおいては、より少数の細胞が、ロドプシンを発現し（図3C）、それは、ロドプシン免疫染色を全く示さなかった未処置の患者オルガノイド（図3B）とは対照的であった。ロドプシンを発現したCRX陽性細胞の定量化は、その発現の控えめではあるが有意な回復を明らかにした（図3G）。同様に、L/Mオプシンは、4週間後の150日目に健常対照オルガノイドにおいて高度に発現されたが（図3D）、その発現は、患者由来オルガノイドにおいては検出不能であった（図3E）。ロドプシンと同様に、AAV-CRX遺伝子治療処置は、患者オルガノイドにおいて、光受容体の一部におけるL/Mオプシン発現を回復させた（図3F、Hで定量化）。適切なロドプシン発現の重要な特徴は、光受容細胞の頂端外節構造における高濃度での局在である。従って、AAV-CRX遺伝子治療による処置が、この頂端濃縮をレスキューし得るか否かを調査した。重要なことに、処置された患者オルガノイドにおけるロドプシン免疫染色は、光受容細胞の頂端構造に高濃度に存在し、そのことから、発現のレスキューが示された（図4）。
ロドプシン発現のレスキューを、120日目に実施されたAAV形質導入の2ヶ月後、180日目に調査した（図5A）。この段階において、ロドプシン発現は、患者オルガノイドにおいてはやはり検出されなかったが（図5B）、AAV-CRX遺伝子治療ベクターの1オルガノイド当たり1×1011vgの低用量（図5C）および1オルガノイド当たり3×1011vgの高用量（図5D）の両方で、複数の処置されたオルガノイドにおいて認められた。ロドプシン免疫染色の強度を、これらの試料において定量化した（図6A、6B）。未処置の患者オルガノイドは、極めて低いバックグラウンドレベルのシグナルを有したが、AAV-CRXによって処置された試料における蛍光強度は、ベクターの低用量1×1011/オルガノイドおよび高用量3×1011/オルガノイドの両方で、健常家族内対照オルガノイドのレベルの約半分に達した（図6C）。さらに、L/Mオプシン発現も、両方のベクター用量で、180日目に著しくレスキューされた（図7）。
さらに、DNA結合の喪失をもたらすと予測されるDNA結合ドメイン内のK88N変異を保持する、もう1人のCRX-LCA患者から、iPSCを分化させた。この患者に由来するオルガノイドも、ロドプシンおよびL/Mオプシンを正しく発現せず（図8）、2人の患者における基礎分子病理の一致が示唆された。フレームシフト変異と同様に、オルガノイドにおいて、AAV-CRX遺伝子治療によって、ロドプシンおよびL/Mオプシンの発現がレスキューされ得た（図8）。
網膜オルガノイド内の特定の細胞型に対するCRX I138fs変異の影響を解明し、検証するため、10X Genomicsプラットフォームを使用して単一細胞RNAシーケンシング（scRNA-seq）を実施した。対照の未処置のCRX-I138fsオルガノイドおよびAAVによって処置されたオルガノイドを、d200に、パパインベースの方法（Fadl et al.,Molecular Vision 26,705-717,2020）を使用して解離させ、40,712の単一細胞転写プロファイルを得た。Seuratパッケージを使用したデータ処理によって、細胞クラスターを同定し、それを既知の網膜細胞型に割り当て、UMAP次元削減を使用して可視化した（図9A；図10A～C）。この表示において、主な網膜細胞クラス（神経節細胞を除く）は、中央に位置する未分化細胞から発生する（図9A）。細胞型分布は、3つの試料起源の間で類似していた（図9A；図10B）。桿体および錐体は、このマニフォールドにおいて明確な分化軌道を形成し、共通マーカー（CRX、RCVRN）およびサブタイプ特異的マーカー（桿体：GNGT1、GNAT1；錐体：ARR3、PDE6H；図9B）の両方の発現によって同定された。予測された通り、CRX転写物はAAV-CRX形質導入後に光受容体において増加した（図9C）。桿体および錐体の発現プロファイルは、起源が対照試料であるか患者試料であるかに基づき明らかに分離され得、AAVによって処置された細胞は、その間の空間を占めた（図9D、9E、9G、9H）。このシフトは、細胞の大半の起源を六角形ビンにプロットすることによって、特に明白であった（図9E、9H）。ScRNA-seqは、AAV処置後に部分的にレスキューされたオプシン（RHO、OPN1MW3、図9F、I；OPN1MW3は、3つの中波長オプシン遺伝子OPN1MW1～3の中で最も有意に異常制御された）ならびに他の桿体および錐体に特異的な転写物（図10D、10E；各遺伝子について、調整済みp値＜0.05、ボンフェローニ補正によるノンパラメトリックウィルコクソン順位和検定；最小発現パーセント＝10％細胞、最小対数倍率変化＝0.25）の発現を検出した。網膜疾患遺伝子であり、CRXの直接転写標的であるCABP4（Assawachananont et al.,2018）は、類似の傾向を示した（図10F、10G）。従って、単一細胞分析は、AAVによって媒介される正常CRX過剰発現の処置効果を確認した。
観察された表現型およびレスキューが、変異特異的であるか、それとも優性CRX-LCAの他の症例にも一般化され得るかを決定するため、CRX K88N変異を有するオルガノイドを調査した。フレームシフト変異と同様に、オルガノイド分化のステージ1または2において、形態学および重要網膜マーカーの発現の差は認められなかった（図11C～11E）。しかしながら、対照と比較して、患者幹細胞由来オルガノイドにおいては、ステージ3において、外節様構造が発達しなかった（図12A、12B）。免疫染色は、CRX-K88Nオルガノイドにおいて、CRXおよびリカバリンは存在するが、ロドプシンおよびL/Mオプシンの染色が重度に減少していることを示した（図12C）。d120およびd200におけるトランスクリプトーム分析は、多くの光受容体特異的遺伝子のアップレギュレーションの遅延を明らかにし（図12D）、ロドプシンおよびL/Mオプシンの発現の喪失を確認した（RHO、OPN1MW2；図12D）。免疫染色に基づき、AAV-CRXベクターによるCRX-K88Nオルガノイドの処置は、ロドプシンおよびL/Mオプシンの発現を部分的にレスキューし（図12E～12G）、異常なSオプシンのレベルを低下させ（図13B）、桿体視覚アレスチンの中程度の誘導を媒介した（SAG；図13B）。従って、CRX-K88Nオルガノイドは、CRX-I138fsと類似の表現型を示し、AAV遺伝子治療は、CRX標的遺伝子の発現を回復させることができた。
実施例5
動物モデル
開示された処置方法は、常染色体ドメイン網膜症の動物モデルにおいて試験され得る。CRXの高度の保存のため、ヒトにおける役割を解明する手段として、モデル生物を研究した。ショウジョウバエ（Drosophila）においては、単一のホモログotdが、ハエ光受容体の発達においてOTX2およびCRXと同様に機能する。OTX2の発現も、CRXの発現も、otd変異ハエにおける特定の欠陥をレスキューすることができ、そのことは、ハエ遺伝子産物のオーバーラップしているが異なる補償を示唆している。重要なことに、NIHにおいて同定されたCRX変異体（Nichols et al.,Hum Mutat,31,E1472-1483）は、変異表現型をレスキューせず（Terrell et al.,Dev Dyn,241,215-228）、代わりに、ハエ光受容体発達に対して強い有害効果を示し、そのことから、この変異CRXタンパク質の保存された反形質活性が証明された。CRX網膜症のいくつかのマウスモデルおよび1つのネコモデルが開発され、特徴決定されている。第1のモデルは、CrxノックアウトマウスにおけるCrxコード配列の欠失であった。これらの動物は、CRX発現を完全に欠き、従って、網膜におけるCRX機能の喪失のモデルとなる。組織学的分析は、視覚色素および関連する光伝達タンパク質を含有する特殊な構造である光受容細胞外節の喪失、および光受容体シナプスの発達における障害を明らかにした（Furukawaet al.,Cell,91,531-541；Morrow et al.,BMC Neurosci,6,5；Assawachananont et al.,Human molecular genetics,27,3555-3567）。組織学的欠陥と一致して、網膜電図によって測定される光受容体の電気的活動は、重度に低下している。さらに、Crxノックアウトマウスにおける光受容体は、成体期までに著しい光受容体喪失をもたらす変性を受ける（Furukawa et al.,Nature genetics,23,466-470）。光受容体機能の欠如のため、このマウスモデルは、失われた光受容体活性を回復することを目的とした可能性のある治療アプローチの調査において有用であった。2kbのマウスCrxプロモーター要素によって駆動されるCrxのAAV5ベクターによって媒介される発現は、組織学的異常を改善し、錐体光受容体について測定される光誘発視覚反応を部分的に回復させた（Watanabe et al.,PloS one,8,e54146）。幹細胞由来の発達中の光受容体の移植が、このモデルにおいて試験され、いくつかの陽性の結果が得られたが、このアプローチによるレスキューの程度は比較的小さかった（Homma et al.,Stem Cells,31,1149-1159；Lamba et al.,Cell Stem Cell,4,73-79）。Crxノックアウトマウスは、Crx機能の喪失についてのモデルを提供するが、Crxコード配列の完全な喪失をもたらす変異は、ヒト疾患と共に分離することは報告されていない。従って、ヒト疾患における重要な違いは、光受容体の発達および機能において有害である、CRXの1つの正しいコピーおよび変異対立遺伝子の存在である（Tran and Chen,Dev Dyn,243,1153-1166）。ヒトにおいて観察されるように、ヘテロ接合型でも表現型を示す変異を保有するいくつかのマウスモデルが生成された。CRXにおけるR90W変異は、ホモ接合型のLCA患者において見出されており、他の家族メンバーの眼科的査定は、ヘテロ接合型における軽度の異常を明らかにした。分子的分析は、細胞株におけるDNA結合およびロドプシンプロモーター活性化の低下を証明した（Swaroop et al.,Human molecular genetics,8,299-305）。あるマウスモデルは、ヒト変異を保有するように改変されている。これらのR90Wノックインマウスは、CRX変異によって引き起こされる稀な劣性LCAおよび軽度の錐体ジストロフィーについてのモデルを表す。ヒト病態と一致して、ヘテロ接合性マウスR90W/+は、軽度の錐体機能欠陥を示すが、ホモ接合性変異体R90W/R90Wは、出生時から完全に盲目であり、肉眼的光受容体異常を示す（Tran et al.,PLoS Genet,10,e1004111）。ヘテロ接合型における軽度の表現型は、実際、これが、主に機能喪失型の対立遺伝子であることを示唆している。軽度網膜症のもう1つのマウスモデルは、OTXテールドメインを除去してタンパク質を短縮する、CRXのL253X変異を含有するtvrm65マウス系統である（Ruzycki et al.,Investigative Ophthalmology & visual science,58,4644-4653）。R90W/+とは対照的に、L253Xマウスにおいては桿体および錐体の両方の機能が影響を受ける。しかしながら、全体的な表現型は、やはり軽度である。常染色体優性CRX-LCAについて、2つのマウスモデルが利用可能である。E168d2マウスノックインは、CRXトランス活性化ドメインの短縮をもたらす2塩基対欠失を含有する（Tran et al.,PLoS Genet,10,e1004111）。ヘテロ接合性E168d2マウスは、機能障害を示し、1ヶ月齢において錐体光受容体の数の有意な低下を示す。桿体変性がその後に起こり、これらの細胞の大半が6ヶ月齢までに失われる。遺伝子発現分析は、光伝達に関連する遺伝子の発現パターンの有意な変更を明らかにした。重症常染色体優性CRX-LCAのもう1つのモデルは、CrxRipマウス変異体である（Roger et al.,J Clin Invest,124,631-643）。このマウス系統は、タンパク質のC末端に133アミノ酸の非相同の残基のストレッチをもたらすフレームシフト欠失G255d1を保持する。CrxRipタンパク質は、DNAに結合せず、Otx2によるNrl発現の活性化を妨害する。結果として、CrxRip変異マウスには大きい遺伝子発現変化が存在し、その発達表現型は、Crxノックアウトマウスより重症である。CrxRipヘテロ接合マウスにおいては、網膜電図によって測定されるように、視覚機能が出生時から存在せず、ヒト常染色体優性CRX-LCA臨床表現型を模倣する。CrxRipマウスにおいては、シナプス発達も影響を受け、そのことは、網膜における二次ニューロンへのシグナル伝達の欠陥を強調する（Assawachananont et al.,Human molecular genetics,27,3555-3567）。最後に、CRX網膜症のより大きい動物モデルも、Rdyネコの形態で入手可能である（Occelli et al.,Investigative Ophthalmology & visual science,57,3780-3792）。この自然発生モデルは、短縮型タンパク質をもたらすフレームシフト変異A182d1を保持する。2つの常染色体優性マウスモデルと同様に、ERGによって測定される網膜機能の障害が初期に認められ、網膜変性が後の段階において起こる。R90Wマウス系統、E168d2マウス系統、およびCrxRipマウス系統における遺伝子発現プロファイルの比較は、調査されたモデルにおける重要な光伝達関連遺伝子のダウンレギュレーションの程度に依存する表現型の重症度を示唆した（Ruzycki et al.,Genome Biology,16,171）。ダウンレギュレートされた遺伝子は、Crx結合部位について濃縮され、光受容体発達中にエピジェネティック状態の発達的制御を受けることが示された。この研究の興味深い所見は、遺伝子の比較的小さいサブセットのディファレンシャルな異常制御が、大きい表現型修飾効果を有し得るということである。結論として、CRX網膜症の動物モデルは、ヒト疾患において観察される範囲と一致する表現型の範囲を示し、個々の変異についての多岐にわたる分子機序を示す。動物モデルは、さらなる研究において使用され得る。
本発明の原理が適用され得る多くの可能な態様を考慮すれば、例示された態様は本発明の一例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではないことが、認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。従って、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および本旨に含まれる全てのものを、本発明として主張する。

Claims (34)

  1. 対象におけるコーンロッドホメオボックス（cone rod homeobox）転写因子（CRX）常染色体優性網膜症を処置する方法であって、
    CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む有効量の核酸分子を、対象へ投与する工程
    を含み、それによって、対象におけるCRX常染色体優性網膜症を処置する、前記方法。
  2. CRX常染色体優性網膜症がレーバー先天黒内障（LCA）、網膜色素変性症、または錐体桿体ジストロフィーである、請求項1記載の方法。
  3. CRX常染色体優性網膜症がLCAである、請求項2記載の方法。
  4. CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含むウイルスベクターを、対象へ投与する工程を含む、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
  5. ウイルスベクターがレンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、請求項4記載の方法。
  6. ウイルスベクターがAAVベクターであり、AAVベクターがAAV2ウイルスベクター、AAV5ウイルスベクター、またはAAV8ウイルスベクターである、請求項5記載の方法。
  7. 前記核酸分子を含むナノ粒子またはデンドリマーを、対象へ投与する工程を含む、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
  8. 前記プロモーターがヒトCRXプロモーターである、請求項1～7のいずれか一項記載の方法。
  9. ヒトCRXプロモーターがSEQ ID NO:1を含む、請求項8記載の方法。
  10. CRXタンパク質をコードする核酸分子が、SEQ ID NO:2と少なくとも95％同一のアミノ酸配列をコードする、請求項1～9のいずれか一項記載の方法。
  11. CRXタンパク質がSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む、請求項10記載の方法。
  12. 前記核酸分子が、対象の硝子体内、網膜下、または網膜に投与される、請求項1～11のいずれか一項記載の方法。
  13. 対象がヒトである、請求項1～12のいずれか一項記載の方法。
  14. 対象の網膜におけるロドプシンおよび/または錐体オプシンの発現を増加させる、請求項1～13のいずれか一項記載の方法。
  15. CRX常染色体優性網膜症を有する対象を選択する工程を含む、請求項1～14のいずれか一項記載の方法。
  16. 対象におけるコーンロッドホメオボックス転写因子（CRX）常染色体優性網膜症の処置において使用するための、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む有効量の核酸分子を含む、組成物。
  17. CRX常染色体優性網膜症がレーバー先天黒内障（LCA）、網膜色素変性症、または錐体桿体ジストロフィーである、請求項16記載の組成物。
  18. CRX常染色体優性網膜症がLCAである、請求項17記載の組成物。
  19. ウイルスベクターを含み、該ウイルスベクターが、CRXタンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結された網膜特異的プロモーターを含む、請求項16～18のいずれか一項記載の組成物。
  20. ウイルスベクターがレンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、請求項19記載の組成物。
  21. ウイルスベクターがAAVベクターであり、AAVベクターがAAV2ウイルスベクター、AAV5ウイルスベクター、またはAAV8ウイルスベクターである、請求項20記載の組成物。
  22. ナノ粒子またはデンドリマーを含み、該ナノ粒子またはデンドリマーが核酸分子を含む、請求項16～18のいずれか一項記載の組成物。
  23. 前記プロモーターがヒトCRXプロモーターである、請求項16～22のいずれか一項記載の組成物。
  24. ヒトCRXプロモーターがSEQ ID NO:1を含む、請求項23記載の組成物。
  25. CRXタンパク質が、SEQ ID NO:2と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を含む、請求項16～24のいずれか一項記載の組成物。
  26. CRXタンパク質がSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む、請求項25記載の組成物。
  27. 網膜投与または網膜下投与のために製剤化された、請求項16～26のいずれか一項記載の組成物。
  28. 対象がヒトである、請求項16～27のいずれか一項記載の組成物。
  29. CRX常染色体優性網膜症の処置が、対象の網膜におけるロドプシン発現の増加を含む、請求項16～28のいずれか一項記載の組成物。
  30. SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列を含むプロモーター。
  31. ポリペプチドをコードする異種核酸に機能的に連結された、請求項30記載のプロモーター。
  32. 請求項30または31記載のプロモーターを含むベクター。
  33. ウイルスベクターである、請求項32記載のベクター。
  34. AAVベクターである、請求項33記載のウイルスベクター。
JP2022540642A 2020-01-17 2021-01-15 Ｃｒｘ常染色体優性網膜症の処置のための遺伝子治療 Pending JP2023510186A (ja)

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