KR20090057444A - 높은 역가로 바이러스 증식을 지원하는 ｍｄｃｋ 세포주 및 이를 이용한 생물반응기 공정 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바이러스, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스를 세포 배양물에서 이전에 가능했던 것보다 더 높은 역가로 증식시킬 수 있는 신규한 MDCK 세포에 관한 것이다. 상기 MDCK 세포는 무혈청 배양 배지에 적응될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 MDCK 세포를 포함하는 세포 배양 조성물 및 상기 MDCK 세포를 성장시키는 배양 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 MDCK 세포를 이용하여 세포 배양물에서 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다.
Figure P1020097007751
MDCK 세포, 저온 적응성 및/또는 온도 감수성 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스

Description

높은 역가로 바이러스 증식을 지원하는 ＭＤＣＫ 세포주 및 이를 이용한 생물반응기 공정{MDCK CELL LINES SUPPORTING VIRAL GROWTH TO HIGH TITERS AND BIOREACTOR PROCESS USING THE SAME}
1. 연방 정부 지원 연구 및 개발 하에 이루어진 발명의 권리에 대한 진술
본원에 기술된 하나 이상의 발명은 보건복지부(Health and Human Services)가 심사해 체결된 계약 번호 HHS010020060001OC 호를 근거로 하여 정부 지원으로 완성되었다. 따라서, 정부는 이 발명에 대해 일정 권리를 갖는다.
2. 기술분야
본 발명은 세포 배양물에서 바이러스, 예를 들어 인플루엔자 바이러스, 특히 저온 적응성(cold-adapted) 및/또는 온도 감수성(temperature sensitive) 및/또는 약독화성(attenuated) 인플루엔자 바이러스를 높은 역가(titer)로 증식시키는데 사용될 수 있는 신규한 MDCK 세포에 관한 것이다. 상기 MDCK 세포는 무혈청 배양 배지에서 성장하도록 적응될 수 있거나 유전적으로 변형될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 MDCK 세포를 포함하는 세포 배양 조성물, 상기 MDCK 세포를 증식시키기 위한 배양 방법 및 이러한 세포들을 동정하는 방법에 대한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 MDCK 세포를 이용하여 세포 배양물에서 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 세포 배양물에서 바이러스(예를 들어 인플루엔 자 바이러스, 특히 저온 적응성 및/또는 온도 감수성 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스)를 높은 역가로 증식시키는데 사용될 수 있는 부착성(adherent) 세포(예를 들어, MDCK 세포)를 증식시키기 위한 신규한 생물반응기(bioreactor) 공정에 관한 것이다. 상기 생물반응기 공정은 무혈청 배양 배지를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 본 발명의 생물반응기 공정을 이용하여 제조된 백신 조성물에 대한 것이다.
3. 배경기술
해마다 인플루엔자 유행으로 유발되는 질환을 예방하기 위한 가장 중요한 공중 보건 방법이 백신접종(vaccination)이다. 백신의 유용성은, 안정적이며 배양하기 쉬운 공급원으로부터 다량의 백신 물질(예를 들어, 바이러스)을 신속하게 생산할 수 있는지의 여부에 달려있다. 신속한 백신 개발과 백신의 충분한 공급으로 그 이용성을 증대시키는 것이 인간과 동물의 수많은 질환을 퇴치시키는데 있어서 중요하다. 백신 생산의 지연과 그의 양적인 부족 때문에 급증하는 질환을 처리하는데 있어서 문제가 발생할 수 있기 때문이다. 예를 들어, 세계적으로 유행하는 인플루엔자에 대한 백신을 생산하기 위해 장기간의 소요시간(lead time)이 필요하다는 문제점이 있다고 최근 연구는 시사하고 있다. 예를 들면, 문헌 [Wood, J. M., 2001, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 356:1953]을 참조할 수 있다. 따라서, 최근의 백신 생산은 세포 배양물에서의 백신용 바이러스의 증식에 초점을 맞추고 있다.
마딘 다비 개과 신장(MDCK: Madin Darby Canine Kidney) 세포는 인플루엔자 바이러스 적정에 통상적으로 사용되어 왔다[Zambon M., Textbook of Influenza, ed Nicholson, Webster and Hay, ch 22, pg 291-313, Blackwell Science(1998)]. 이들 세포는 1958년에 정상적인 수컷 코카 스파니엘(cocker spaniel)의 신장으로부터 확립되었다. ATCC는 S. 마딘과 N.B. 다비에 의해 기탁된 MDCK(CCL 34) 계통을 목록에 등재하였다. 그러나, 기존의 MDCK 세포주는 종양형성성, 세포 배양물에서의 동물 혈청의 요건 및 백신용으로 적절한 인플루엔자 바이러스의 수율이 낮은 점을 비롯하여 여러 결함이 있다는 문제점이 있다. 따라서, 바람직하게는 무혈청 배지에서 높은 역가로 이러한 인플루엔자 균주를 증식시킬 수 있는 MDCK 세포주, 바람직하게는 비종양형성성 MDCK 세포주에 요구가 대두되고 있다. 이러한 요구 및 기타 요구들은 본 발명에 의해 충족된다.
4. 발명의 개요
본 발명은 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 저온 적응성 및/또는 온도 감수성 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스를 높은 역가로 증식시키는 것을 지원할 수 있는 MDCK 세포를 제공한다. 상기 MDCK 세포는 동물성 단백질이 없는(APF: animal protein-free) 조성물을 비롯하여 혈청을 함유하는 배지 조성물 또는 무혈청 배지 조성물에서 성장할 수 있으나, 바람직하게는 무혈청 및/또는 APF 배지 조성물에서 성장할 수 있다. 따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 마딘-다비 개과 신장(MDCK) 세포를 제공하는데, 여기서 다수의 상기 MDCK 세포를 포함하는 세포 배양 조성물은 저온 적응성 및/또는 온도 감수성 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스의 복제를 약 7.0 이상의 log10 TCID50/㎖(밀리리터 당 평균 조직 배양 감염 용량의 상용로그)까지 지원한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 부착성이다. 다른 실시양태에서, MDCK 세포는 비부착성(예를 들어, 비부착성 조건 하에 증식이 가능)이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 비종양형성성이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 상피 세포 형태를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 부착성이고 상피 세포 형태이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 비부착성 조건 하에 증식되도록 적응 또는 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 부착성이고 비종양형성성이다.
본 발명의 MDCK 세포에서 성장될 수 있는 바이러스로는, 이에 제한되지는 않지만, 인플루엔자, RSV, 1형, 2형 및 3형 파라인플루엔자 바이러스 및 인간 메타뉴모바이러스를 포함하는 (-)스트랜드 RNA 바이러스뿐 아니라, DNA 바이러스, 레트로바이러스, (+)스트랜드 RNA 바이러스, (-)스트랜드 RNA 바이러스, 이중 가닥 RNA 바이러스를 비롯한 기타 바이러스, 예컨대 이에 제한하진 않지만, 파포바바이러스(papovavirus), 수포성 구내염(vesicular stomatitis) 바이러스, 우두(vaccinia) 바이러스, 콕사키(Coxsackie) 바이러스, 레오바이러스(reovirus), 파보바이러스(parvovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 소아마비(poliomyelitis) 바이러스, 홍역 바이러스, 광견병 바이러스 및 헤르페스 바이러스를 포함한다.
또한, 본 발명은 인플루엔자, 예를 들어 저온 적응성 및/또는 온도 감수성 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스의 증식을 높은 역가로 지원할 수 있는 MDCK 세포의 유도, 증식 및 유지에 유용한 방법 및 배지 조성물을 제공한다. 본 발명의 MDCK 세포는 예를 들어, 바이러스 백신과 같은 백신 물질 생산에 특히 유용하다. 따라서, 또다른 양태에서, 본 발명은 MDCK 세포 및 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 세포 배양 조성물은 저온 적응성 및/또는 온도 감수성 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스의 복제를 약 7.0 이상의 log10 TCID50/㎖까지 지원한다.
본 발명의 다른 양태는 백신 물질의 생산을 허용하는 조건 하에 본 발명의 임의의 MDCK 세포를 적합한 배양 배지 중에서 배양하는 단계, 상기 백신 물질을 하나 이상의 숙주 세포로부터, 또는 그것이 배양된 배지로부터 분리시키는 단계에 의해 백신 물질(예를 들어, 바이러스)을 생산하는 방법을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 세포 배양 조성물을 인플루엔자 바이러스로 감염시키는 단계; 인플루엔자 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에 상기 세포 배양 조성물을 배양시키는 단계; 및 상기 세포 배양 조성물로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는, 세포 배양물에서 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 면역원성 조성물을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같이 생산된 백신 물질, 및 선택적으로 부형제, 예컨대 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 투여 성분을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
대상에게 유효량의 하나 이상의 상기 기술된 면역원성 조성물을 투여함으로써 대상에 있어서 면역원성 반응을 유도하는 방법도 본 발명에 포함된다. 추가로, 바이러스 감염에 대한 면역원성 반응을 일으키기에 유효한 양으로 하나 이상의 상기 기술된 면역원성 조성물을 투여함으로써 대상에게서 바이러스 감염(예를 들어, 바이러스성 인플루엔자)을 예방 또는 치료하는 방법도 본 발명의 일부이다. 그러한 치료를 위한 대상으로는 포유동물(예를 들어, 인간), 조류종(예를 들어, 가금류)를 포함할 수 있다. 추가로, 이러한 방법은 본 발명의 MDCK 세포에서 생산된 하나 이상의 바이러스 및 약제학적으로 허용가능한 부형제의 조성물을, 바이러스 감염을 예방학적으로 또는 치료학적으로 처리하기에 유효한 양으로 대상에게 투여하는 단계도 포함할 수 있다.
본 발명의 이러한 목적과 다른 목적, 그리고 특징은 이하의 상세한 설명을 첨부된 도면을 참조하여 이해하면 명백해질 것이다.
5. 도면의 간단한 설명
도 1은 MDCK 클론 1, 5, 36, 39, 40 및 55에 있어서 야생형 인플루엔자 바이러스 균주인 A/파나마, A/뉴 칼레도니아, 또는 B/길림 유래의 HA 및 NA 유전자 단편을 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스 균주의 수율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 MediV 105 무혈청 배지 중에서 MDCK 서브클론 1-A, 1-B 및 1-C의 세포 증식을 그래프로 도시한 것이다.
도 3은 MDCK 서브클론 1-A, 1-B 및 1-C에 있어서 야생형 인플루엔자 바이러스 균주인 A/뉴 칼레도니아/20/99, A/히로시마/52/05, B/말레이시아/2506/04, 또는 A/베트남/1203/2004 유래의 HA 및 NA 유전자 단편과, 저온 적응성, 온도 감수성, 약독화성 바이러스의 잔존 유전자 단편을 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스 균주의 감염후 3일째와 4일째(DPI: days post infection)의 수율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 OptiPro™ 배지 및 MediV 105 중의 MDCK 서브클론 1-A, 1-B, 1-C 및 1-D에 있어서, 야생형 인플루엔자 바이러스 균주인 A/뉴 칼레도니아/20/99, A/히로시마/52/05, B/말레이시아/2506/04, 또는 A/베트남/1203/2004 유래의 HA 및 NA 유전자 단편과, 저온 적응성, 온도 감수성, 약독화성 바이러스의 잔존 유전자 단편을 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스 균주의 감염후 3일째와 4일째(DPI)의 수율을 보여주는 표이다.
도 5는 MDCK 서브클론 1-B 무혈청 세포 은행(cell bank) 제조의 순서도를 나타낸 것이다. 패널 A는 혈청 함유 배지에서 수행된 선별 단계를 나타낸 것이다. 패널 B는 무혈청 배지에 적응을 위한 단계를 나타낸 것이다.
도 6은 MediV 105와 M18M 배지 중에서 서브클론 1-A의 성장을 나타낸 것이다.
도 7은 MediV 105와 M18M 배지 중에서 서브클론 1-A의 배가 시간(doubling time)을 나타낸 것이다.
도 8은 4개의 서로 다른 미세담체(microcarrier)를 포함하는 M18M 배지 중에서 접종 후 30분과 60분에서의 서브클론 1-A의 세포 밀도를 비교한 것이다.
도 9는 4개의 서로 다른 미세담체를 포함하는 M18M 배지 중에서 서브클론 1-A의 세포 수율을 비교한 것이다.
도 10은 백신 물질의 상업적 규모의 제조를 위해 사용될 수 있는 세포 배양 스케일업(scale up) 공정의 하나를 개괄한 것이다.
도 11은 세포 배양물로부터 백신 물질을 상업적 규모의 정제를 위해 사용될 수 있는 두 가지 정제 공정을 개괄한 것이다.
도 12는 벤조나아제(Benzonase) 처리 후의 셀루파인 설페이트(Cellufine Sulfate, CS) 크로마토그래피 또는 벤조나아제 처리와 조합된 셀루파인 설페이트 크로마토그래피의 결과를 나타낸 것이다. 패널 A) 셀루파인 설페이트를 이용한 칼럼 크로마토그래피의 OD 프로파일은 좌측부에 나타나 있으며, 화살표는 로딩, 세척 및 용출이 시작된 시간을 가리킨다. 아가로스 겔 전기영동(우측부)은 DNA 오염물이 출발 물질(2 레인)과 유통부(flow through)(3 레인)에서는 존재하지만, 칼럼에서 용출된 물질에서는 DNA 오염물이 존재하지 않음(4 레인)을 보여주고 있으며, 1 레인은 분자량 마커이다. 패널 B) 칼럼 상에서의 벤조나아제 처리를 이용한 MDCK dsDNA 분해의 개요를 나타낸 것이다.
도 13은 MDCK 서브클론 1-B 중에서 B/말레이시아/2506/04의 생산을 위한 3OL SUB 공정의 여러 곡선 그래프를 나타낸 것이다. 맨 위쪽의 그래프는 성장기 세포의 증식 곡선이다. 본 공정 가동에 있어서 글루코스(가운데, 실선), 락테이트(가운데, 점선), 글루타민(맨 아래, 실선) 및 암모늄 이온(맨 아래, 점선)의 대사 산물 프로파일을 바이오프로파일(Bioprofile)에 의해 측정되었다.
도 14는 SUB 공정에서 배지 교환 없이 수행한 실험적 연구의 결과를 나타낸 것이다. A) 0% 내지 100%의 배지 교환 비율에 대하여, 2와 3 dpi(각각 위와 아래)에서 수득된 바이러스 역가를 도시한 것. B) 0.04 내지 1의 유효 TrypLE 농도에 대하여 2와 3 dpi에서의 바이러스 역가의 피크를 도시한 것. C) B/말레이시아/2506/04(위) 및 A/베트남/1203/2004(아래)에 대해, 배지 교환을 수행한 것(삼각형) 또는 배지 교환을 수행하지 않은 것(사각형)에 있어서, 감염 후 시간의 경과에 따른 바이러스 역가를 도시한 것.
도 15는 서로 다르게 사용된 MOI에 있어서 시간의 경과(감염 후 시간)에 따른 A/솔로몬 아일랜드/3/06의 바이러스 역가를 도시한 것이다. 감염 후 20 내지 96시간째의 바이러스 수율을 박스로 묶어 우측에 그 부분을 확대 도시하였다. 2000 FFU/㎖에서 감염된 배양물의 바이러스 수확의 피크 부분은 원으로 표시되어 있다.
6. 발명의 상세한 설명
본 발명은 인플루엔자 바이러스, 특히 저온 적응성 및/또는 온도 감수성 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스의 복제를 높은 역가까지 지원할 수 있도록 클로닝된 MDCK 세포주가 수득될 수 있다는 발견에 일부 기초한다. 따라서, 본 발명은 한 양태에서, 무혈청 배지 조성물을 비롯한 다양한 세포 배양 조건에 적응된 MDCK 세포주로서, 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 저온 적응성 및/또는 온도 감수성 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스의 복제를 높은 역가까지 지원할 수 있는 MDCK 세포주를 제공한다. 본 발명의 MDCK 세포를 본원에서는 "본 발명의 세포"로 지칭한다.
추가로, 본 발명은 본 발명의 세포와, 이에 제한되는 것은 아니지만, 배지(예를 들어, 본원에서 개시된 배지), 배지 성분들, 완충액, 화학적 화합물, 추가 유형의 세포들, 바이러스 물질(예를 들어, 바이러스 게놈, 바이러스 입자) 및 이종성 단백질을 포함할 수 있는 다른 성분들을 포함하는 세포 배양 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 이에 제한하지는 않지만, 비종양형성성이고/이거나(예를 들어, 누드 마우스에서 결절을 형성하지 않음), 비종양원성이고/이거나, 부착성 세포로서 성장하고/하거나, 비부착성 세포로서 성장하고/하거나, 상피 세포와 유사한 형태를 갖고/갖거나, 이에 제한하지는 않지만, 오쏘믹소바이러스(orthomyxovirus), 파라믹소바이러스(Paramyxovirus), 랍도바이러스(rhabdovirus) 및 플라보바이러스(flavovirus)를 비롯한 다양한 바이러스의 복제를 지원하고/하거나, 저온 적응성 및/또는 온도 감수성 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 증식을 높은 역가로 지원하는 등의 하나 이상의 구체적인 특성을 갖는, MDCK 세포의 배양을 위해 유용한 방법 및 배지 조성물을 제공한다. 본 발명의 배양 조건은 혈청을 함유하는 배지 조성물 및 무혈청 배지 조성물 뿐만 아니라, 동물성 단백질이 없는(APF) 조성물을 포함한다.
추가로, 본 발명은 MDCK 세포에서 백신 물질(예를 들어, 인플루엔자 바이러스)을 생산하는 방법, MDCK 세포로부터 백신 물질을 제조하는 방법 및 MDCK 세포에서 생산된 백신 물질을 이용하여 인플루엔자 감염을 예방하는 방법도 제공한다. 본 발명의 세포는 다른 포유동물 세포주(예로서 Vero, PerC6
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, HEK-293, MRC-5 및 WI-38 세포)에서는 그만큼 유효하게 복제하지 못하는 저온 적응성/온도 감수성/약독화성(ca/ts/att) 인플루엔자 균주(예를 들어, FluMist
Figure 112009022767906-PCT00002
중의 인플루엔자 균주)를 생산하는데 특히 유용하다.
6.1 정의
본원에서 사용된 종양형성성(Tumorigenicity)이라는 것은 당업자에게 이 용어가 부여하는 통상적인 의미를 나타낸다. 종양형성성은 성숙한 누드 마우스 모델에서 측정된다(예를 들어, 문헌[Stiles et al., 1976, Cancer Res, 36:1353] 및 하기 실시예 5). 또한, 종양형성성은 다른 분석법, 예를 들면, 닭의 배아 내로의 주사 및/또는 융모요막으로의 국소 적용[Leighton et al., 1970, Cancer, 26:1024]에 의한 분석법으로 시험할 수도 있다.
"재조합체(recombinant)"라는 용어는 인간이 개입하여 인공적으로 또는 합성적으로(자연상태가 아닌) 변형된 물질(예를 들어, 핵산 또는 단백질)을 가리킨다. 상기 변형은 천연 환경 또는 천연 상태의 물질 상에서 수행되거나, 이러한 자연적 환경으로부터 분리된 물질 상에서 수행될 수 있다. 구체적으로, 바이러스, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스의 경우, 바이러스는 재조합 핵산의 발현에 의해 생성되는 재조합체이다.
바이러스에 있어서 "재조합체(reassortant)"라는 용어는 바이러스가 하나 이상의 바이러스 모균주 또는 공급원에서 유래한 유전적 성분 및/또는 폴리펩타이드 성분을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 7:1 재조합체는 제1 모 바이러스로부터 유래된 7개의 바이러스 게놈 단편(또는 유전자 단편)과, 예를 들어 제2 모 바이러스로부터 유래하는 헤마글루티닌(hemagglutinin) 또는 뉴라미니다아제(neuraminidase)를 코딩하는 단일 상보성 바이러스 게놈 단편(single complementary viral genomic segment)을 포함한다. 6:2 재조합체는 제1 모 바이러스 유래의 가장 흔한 6개의 내부 유전자인 6개의 유전체 단편과, 서로 다른 모 바이러스 유래의 두 상보성 단편, 예를 들어, 헤마글루티닌과 뉴라미니다아제를 포함한다.
본원에서 사용된 "약"이라는 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 이 용어에 의해 변화되는 값의 10%를 초과하거나 10% 미만의 값으로 미달되지 않는 값을 가리킨다. 예를 들어, "약 5 ㎍/kg"이라는 것은 4.5 ㎍/kg 내지 5.5 ㎍/kg의 범위를 의미한다. 다른 예를 들어, "약 1시간"이라는 것은 54분 내지 66분의 범위를 의미한다.
"온도 감수성(temperature sensitive)", "저온 적응성(cold adapted)" 및 "약독화성(attenuated)"이라는 용어는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, "온도 감수성"("ts")이라는 용어는, A형 인플루엔자 균주의 경우, 바이러스가 더 높은 온도에서 100배 이상의 역가 감소를 나타내고(예컨대, 33℃에 비하여 더 고온인 39℃에서 역가에 있어서 100배 이상 감소를 나타냄), B형 인플루엔자 균주의 경우, 바이러스가 더 높은 온도에서 100배 이상의 역가 감소를 나타내는(예컨대, 33℃에 비하여 더 고온인 37℃에서 역가에 있어서 100배 이상 감소를 나타냄) 것을 의미한다. 예를 들어, "저온 적응성"("ca")이라는 용어는 바이러스의 증식율이 더 낮은 온도에서 100배 이내가 되는 것(예컨대, 25℃에서의 바이러스 증식율이 이보다 더 높은 온도인 33℃에서보다 100배 이내가 되는 것)을 의미한다. 예를 들어, "약독화성"("att")이라는 용어는 바이러스가 흰족제비의 상부 기도에서는 복제를 하지만 폐 조직에서는 검출되지 않으며, 동물에서 인플루엔자 유사 질환을 유발하지 않는 것을 의미한다. 중간 표현형을 갖는 바이러스, 즉, 39℃(A형 균주 바이러스) 또는 37℃(B형 균주 바이러스)에서 100배 이하의 역가 감소를 나타내고, 33℃에서의 증식율에 비해 25℃에서 100배 이상(예를 들어, 200배, 500배, 1000배, 10,000배)의 증식율을 나타내며/내거나, 흰족제비의 상부 기도에 비하여 폐에서 감소된 증식율 및/또는 동물에 있어서 주춤하는 인플루엔자 유사 질환을 나타내는 바이러스도 본 발명에 포함되는 유용한 바이러스이다. 증식(growth)은 역가, 플라크 크기 또는 형태, 입자 밀도 또는 당업자에게 공지된 다른 방법에 의해 나타난 바이러스의 양을 의미한다.
6.2 세포 특성
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 세포는 척추동물 세포이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, 햄스터, 소, 원숭이 또는 개의 세포이며, 특히, 이들로부터 유래된 신장 세포 또는 세포주이다. 추가의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 세포는 MDCK 세포(예를 들어, ATCC CCL-34 MDCK로부터 직계 유도)이고, 특히 본원에서는 "본 발명의 MDCK 세포"로 지칭되며, "본 발명의 세포"라는 용어에 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 세포는 ATCC CCL-34 MDCK로부터 유도된다. 본 발명의 세포는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 CCL-34 MDCK 세포로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, CCL-34 MDCK 세포는 먼저 혈청을 함유하는 배지(예를 들어, 둘베코의 개량된 이글 배지(DMEM: Dulbecco's Modified Eagle 배지) + 10% 소태아 혈청(FBS: Fetal Bovine 혈청) + 4mM 글루타민 + 4.5g/L 글루코스, 또는 본원에 기술된 다른 배지)에서 정해진 횟수로 계대배양(계대배양수)한 후, 개개의 세포들을 클로닝하고 이 클론들의 특성에 따라 나눌 수 있다. 이에 제한하지는 않지만, 배가 시간, 종양형성성 프로파일 및 바이러스 생산성을 포함하는 우수한 생물학적 특성 및 생리학적 특성을 갖는 클론이 마스터 세포 은행(MCB: master cell bank)의 제작을 위해 선별될 수 있다.
제1 양태에서, 본 발명은 마딘-다비 개과 신장(MDCK) 세포를 제공하는데, 여기서 다수의 MDCK 세포를 포함하는 세포 배양 조성물은 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원한다. 특정 양태에서, MDCK 세포는 저온 적응성, 약독화성 및 온도 감수성의 특성 중 하나 이상의 특성을 갖는 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원한다. 특정 실시양태에서, 바이러스 복제를 지원하는 MDCK 세포의 능력은 감염된 세포 배양물으로부터 수득된 바이러스의 수율을 측정함[예를 들어, 평균 조직 배양 감염 용량(TCID50) 분석법 또는 형광 포커스 분석법(fluorescent focus assay, FFA)을 이용함]으로써 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, MDCK 세포는 인플루엔자 바이러스의 복제를 약 7.0 이상의 log10 TCID50/㎖(밀리리터 당 평균 조직 배양 감염 용량의 상용로그)까지 지원한다. 특정 실시양태에서, MDCK 세포는 인플루엔자 바이러스의 복제를 약 7.2 이상의 log10 TCID50/㎖까지 지원한다. 특정 실시양태에서, MDCK 세포는 인플루엔자 바이러스의 복제를 약 7.4 이상의 log10 TCID50/㎖까지 지원한다. 특정 실시양태에서, MDCK 세포는 인플루엔자 바이러스의 복제를 약 7.6 이상의 log10 TCID50/㎖까지 지원한다. 특정 실시양태에서, MDCK 세포는 인플루엔자 바이러스의 복제를 약 7.8 이상의 log10 TCID50/㎖까지 지원한다. 특정 실시양태에서, MDCK 세포는 인플루엔자 바이러스의 복제를 약 8.0 이상의 log10 TCID50/㎖까지 지원한다. 특정 실시양태에서, MDCK 세포는 인플루엔자 바이러스의 복제를 약 8.2 이상의 log10 TCID50/㎖까지 지원한다. 특정 실시양태에서, MDCK 세포는 인플루엔자 바이러스의 복제를 약 8.4 이상의 log10 TCID50/㎖까지 지원한다. 특정 실시양태에서, MDCK 세포는 인플루엔자 바이러스의 복제를 약 8.6 이상의 log10 TCID50/㎖까지 지원한다. 특정 실시양태에서, MDCK 세포는 인플루엔자 바이러스의 복제를 약 8.8 이상의 log10 TCID50/㎖까지 지원한다. 특정 실시양태에서, MDCK 세포는 인플루엔자 바이러스의 복제를 약 9.0 이상의 log10 TCID50/㎖까지 지원한다. 대안적으로 또는 선택적으로, 바이러스 수율은 형광 포커스 분석법에 따라 샘플에 존재하는 바이러스의 농도를 측정함으로써 정량될 수 있다(실시예 6에 기술되었고, 당업계에 공지되었음. 예를 들어, 문헌[Stokes et al., 1988, J Clin Microbiol. 26:1263-6] 및 미국공개특허 제20040265987호 참조). FFA 값은 흔히 log10 FFU/mL(밀리리터 당 형광 포커스 유닛, fluorescent focus units/mL)로서 기록된다. 따라서, 특정 실시양태에서, MDCK 세포는 인플루엔자 바이러스의 복제를 약 7.0 이상의 log10 FFU/mL(밀리리터 당 형광 포커스 유닛의 상용로그)까지, 약 7.2 이상의 log10 FFU/mL까지, 약 7.4 이상의 log10 FFU/mL까지, 약 7.6 이상의 log10 FFU/mL까지, 약 7.8 이상의 log10 FFU/mL까지, 약 8.0 이상의 log10 FFU/mL까지, 약 8.2 이상의 log10 FFU/mL까지, 약 8.4 이상의 log10 FFU/mL까지, 약 8.6 이상의 log10 FFU/mL까지, 약 8.8 이상의 log10 FFU/mL까지, 약 9.0 이상의 log10 FFU/mL까지 지원한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 세포는 배양물에서 증식되어 세포 배양 조성물(본원에서 "본 발명의 세포 배양 조성물"로 지칭되기도 함)을 생성한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 조성물은 유일한 숙주 세포형으로서 본 발명의 MDCK 세포를 포함하는데, 여기서 상기 세포 배양 조성물은 저온 적응성, 약독화성 및 온도 감수성의 특성 중 하나 이상의 특성을 갖는 인플루엔자 바이러스의 복제를 약 7.0 이상, 또는 약 7.2 이상, 또는 약 7.4 이상, 또는 약 7.6 이상, 또는 약 7.8 이상, 또는 약 8.0 이상, 또는 약 8.2 이상, 또는 약 8.4 이상, 또는 약 8.6 이상, 또는 약 8.8 이상, 또는 약 9.0 이상, 또는 약 9.2 이상, 또는 약 9.4 이상, 또는 약 9.6 이상, 또는 약 9.8 이상, 또는 약 10.0 이상, 또는 약 10.2 이상, 또는 약 10.4 이상, 또는 약 10.6 이상, 또는 약 10.8 이상 또는 약 11.0 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다.
한 양태에서, 본 발명의 세포는 정선된 배지(예를 들어, 무혈청 배지 또는 APF 배지, 예를 들어, 본원에 기술된 배지)에서 성장하도록 적응된다. 이러한 적응은 개개의 세포를 클로닝하기 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 세포는 하기 기술되는 바와 같은 MediV 101, MediV 102, MediV 103, MediV 104, MediV 105, M-32, MediV 107, M18M 또는 이들의 증식 최적화 유도체에서 성장하도록 적응된다. 따라서, 본 발명의 세포는 본원에 개시된 배지에서 증식되어 본 발명의 세포 배양 조성물을 생성할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 조성물은 유일한 숙주 세포형인 본 발명의 MDCK 세포를 포함하는데, 여기서 증식 배지는 무혈청 배지이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 세포는 이에 제한되지는 않지만, 미국 미생물 보존 센터(버지니아주 20110-2209 마나싸스 유니버시티 블러바드 10801 소재)에 2005년 1월 5일 기탁되고 ATCC 수탁번호가 PTA-6500, PTA-6501, PTA-6502, 및 PTA-6503으로 부여된 세포주 및 2006년 10월 5일에 기탁되고 ATCC 수탁번호가 PTA-7909와 PTA-7910로 각각 부여된 서브클론 1-A 및 1-B의 세포주를 포함하는 세포주의 세포이다. 이들 기탁은 특허절차상 미생물기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트조약(Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of patent procedure) 하에 보존될 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 인간에 사용하기 위한 것으로서 미국식품의약국으로부터 승인받기에 적합한 백신 물질 제조에 유용한 세포 은행을 제작하기 위해 사용된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 조성물은 ATCC 등록 번호 PTA-6500, PTA-6501, PTA-6502, PTA-6503, PTA-7909 또는 PTA-7910으로서 기탁된 MDCK 세포를 유일한 숙주 세포형으로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 조성물은 ATCC 등록 번호 PTA-7909로서 기탁된 MDCK 세포를 유일한 숙주 세포형으로 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 조성물은 ATCC 등록 번호 PTA-7910으로서 기탁된 MDCK 세포를 유일한 숙주 세포형으로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 이에 제한하지는 않지만, 혈청을 함유하는 배지 또는 무혈청 배지 또는 동물성 단백질이 없는 배지에서 부착성 세포로서 성장하는 특성, 혈청을 함유하는 배지 또는 무혈청 배지 또는 동물성 단백질이 없는 배지에서 비부착성 세포로서 성장하는 특성, 상피세포와 유사한 형태를 갖는 특성, 비종양형성성인 특성(예를 들어, 누드 마우스에서 결절을 형성하지 않음), 및/또는 비종양원성인 특성, 및/또는 이에 제한하지는 않지만, 오쏘믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 랍도바이러스 및 플라보바이러스와 같은 다양한 바이러스의 복제를 지원하는 등의 특성 중 하나 이상의 구체적인 특성과 관련하여 계대배양 및 선별하여 세포주 MDCK(CCL 34)로부터 유도된 MDCK 세포주를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 비종양형성성이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 조성물은 유일한 숙주 세포형으로서 비종양형성성인 본 발명의 MDCK 세포를 포함한다. 세포가 종양형성성인지를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고(예를 들어, 문헌[Leighton et al., 1970, Cancer, 26:1024] 및 [Stiles et al., 1976, Cancer Res, 36:1353]를 참조), 현재 미국식품의약국이 선호하는 방법은 하기 섹션 8.7에 상세히 기술된 누드 마우스 모델을 사용한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 성숙한 누드 마우스 모델에서 비종양형성성이다(문헌[Stiles et al., 상기와 동일] 및 하기 섹션 8.7 참조). 또다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 닭의 배아 내로 주사되는 경우 및/또는 융모요막에 국소 적용되는 경우 비종양형성성이다(문헌[Leighton et al., 상기와 동일] 참조). 추가의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 성숙한 누드 마우스 모델에서는 비종양형성성이지만, 닭의 배아 내로 주사되는 경우 및/또는 융모요막에 국소 적용되는 경우에는 비종양형성성이 아니다. 추가의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 성숙한 누드 마우스 모델의 경우와, 닭의 배아 내로 주사되는 경우 및/또는 융모요막에 국소 적용되는 경우에 비종양형성성이다. 추가의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 배지 중에서 20회 계대배양 후, 또는 30회 이상 계대배양 후, 또는 40회 이상 계대배양 후, 또는 50회 이상 계대배양 후, 또는 60회 이상 계대배양 후, 또는 70회 이상 계대배양 후, 또는 80회 이상 계대배양 후, 또는 90회 이상 계대배양 후, 또는 100회 이상 계대배양 후에도 비종양형성성이다. 추가의 또다른 특정 실시양태에서, 배지는 본원에 기술된 배지이다(예를 들어, MediV 105).
종양형성성은 당업자에게 공지된 여러가지 방법으로 정량될 수 있다. 통상 사용되는 한 방법은 "TD50" 값을 측정하는 것인데, 상기 값은 실험 동물의 50%에 암을 유발하기 위해서 요구되는 세포수로 정의된다(예를 들어, 문헌[Hill R. The TD50 assay for tumor cells. In: Potten C, Hendry J, editors. Cell clones. London: Churchill Livingstone; 1985. p.223] 참조). 한 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 약 1010개 내지 약 101개 사이, 또는 약 108개 내지 약 103개 사이, 또는 약 107개 내지 약 104개 사이의 TD50 값을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 약 1010개 이상, 또는 약 109개 이상, 또는 약 108개 이상, 또는 약 107개 이상, 또는 약 106개 이상, 또는 약 105개 이상, 또는 약 104개 이상, 또는 약 103개 이상, 또는 약 102개 이상, 또는 약 101개 이상의 TD50 값을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 비종양원성이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 조성물은 유일한 숙주 세포형으로서 비종양원성인 본 발명의 MDCK 세포를 포함한다. 세포가 종양원성인지를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이러한 방법은 일반적으로 세포 용해물 및/또는 DNA를 신생 설치류 종에 접종한 후 시간에 따라 종양 형성을 평가하는 것을 포함한다(예를 들어, 문헌[Nowinski and Hays, 1978, J. Virol, 27: 13-8]; [Peeper, et al, 2002, Nat Cell Biol, 4:148-53]; [Code of Federal Regulation(CFR), "Oncogenicity", Title 40, Vol. 8, Chapter 1, section 798.330, pp. 160-164]를 참조). 예를 들어, 보통 4일된 신생 설치류(예를 들어, 햄스터, 누드 마우스, 랫트)에 107개 이상의 세포 등가물의 세포 용해물 및/또는 DNA를 주사한 후 5개월 이상 동안 모니터링한다. 종양원성 분석은 상업적으로 실험을 수행하는 회사(예를 들어, BioReliance, 프로토콜 #001031 및 #001030 참조)에 의해 통상적으로 수행된다. 한 실시양태에서, 105개 이상, 106개 이상, 107개 이상의 본 발명의 MDCK 세포의 세포 용해물 및/또는 DNA는 신생 설치류 종에 주사될 경우 2개월 후, 또는 3개월 후, 또는 4개월 후, 또는 5개월 후, 또는 6개월 후, 또는 이보다 더 시간이 흐른 후에도 종양 형성을 유발하지 않는다. 또다른 실시양태에서, 0.01 mg, 또는 0.02 mg, 또는 0.03 mg, 또는 0.04 mg, 또는 0.05 mg, 또는 0.06 mg, 또는 0.07 mg, 또는 0.08 mg, 또는 0.09 mg, 또는 0.10 mg, 또는 그 이상의 양의 본 발명의 MDCK 세포의 DNA는 신생 설치류 종에 주사될 경우 2개월 후, 또는 3개월 후, 또는 4개월 후, 또는 5개월 후, 또는 6개월 후, 또는 이보다 더 시간이 흐른 후에도 종양 형성을 유발하지 않는다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 세포는 혈청을 함유하는 배지 또는 무혈청 배지 또는 동물성 단백질이 없는 배지 중에서 부착성 세포로서 성장한다. 추가의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 세포는 혈청을 함유하는 배지 또는 무혈청 배지 또는 동물성 단백질이 없는 배지 중에서 비부착성 세포(예를 들어, 비부착성 조건 하에 증식할 수 있는 세포)로서 성장한다. 추가의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 세포는 상피세포와 유사한 형태이다. 추가의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 본 발명의 MDCK 세포는 이에 제한되지는 않지만, 오쏘믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 랍도바이러스 및 플라보바이러스와 같은 다양한 바이러스의 복제를 지원한다. 본 발명의 MDCK 세포는 이에 제한되지는 않지만, 비종양형성성이고, 비종양원성이며, 부착성 세포로서 성장하고, 비부착성 세포로서 성장하며, 상피세포와 유사한 형태이고, 다양한 바이러스의 복제를 지원하며, 인플루엔자 바이러스의 증식을 높은 역가, 예를 들어 약 7.0 이상, 또는 약 7.2 이상, 또는 약 7.4 이상, 또는 약 7.6 이상, 또는 약 7.8 이상, 또는 약 8.0 이상, 또는 약 8.2 이상, 또는 약 8.4 이상, 또는 약 8.6 이상, 또는 약 8.8 이상, 또는 약 9.0 이상, 또는 약 9.2 이상, 또는 약 9.4 이상, 또는 약 9.6 이상, 또는 약 9.8 이상, 또는 약 10.0 이상, 또는 약 10.2 이상, 또는 약 10.4 이상, 또는 약 10.6 이상, 또는 약 10.8 또는 약 11.0 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 약 7.0 이상, 또는 약 7.2 이상, 또는 약 7.4 이상, 또는 약 7.6 이상, 또는 약 7.8 이상, 또는 약 8.0 이상, 또는 약 8.2 이상, 또는 약 8.4 이상, 또는 약 8.6 이상, 또는 약 8.8 이상, 또는 약 9.0 이상, 또는 약 9.2 이상, 또는 약 9.4 이상, 또는 약 9.6 이상, 또는 약 9.8 이상, 또는 약 10.0 이상, 또는 약 10.2 이상, 또는 약 10.4 이상, 또는 약 10.6 이상, 또는 약 10.8 또는 약 11.0 이상의 log10 FFU/mL까지 지원하는 등의 하나 이상의 구체적인 특징들을 임의로 조합하여 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 조성물은 유일한 숙주 세포형으로서 본 발명의 MDCK 세포를 포함하는데, 여기서 상기 본 발명의 MDCK 세포는 이에 제한하지는 않지만, 비종양형성성이고, 비종양원성이며, 부착성 세포로서 성장하고, 비부착성 세포로서 성장하며, 상피세포와 유사한 형태이고, 다양한 바이러스의 복제를 지원하며, 인플루엔자 바이러스의 증식을 높은 역가(예를 들어 약 7.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL)까지 지원하는 등의 하나 이상의 구체적인 특징들을 임의로 조합하여 가질 수 있다.
본 발명의 MDCK 세포의 각각의 모든 계대배양시의 정보를 상세히 기록하여 각 세포주의 전 계통을 이용하도록 할 수 있다. 매 계대배양마다 이러한 정보를 기록하는 것은 백신 물질 제조를 위한 본 발명의 MDCK 세포의 사용 여부에 대한 미국식품의약국 및 전 세계 각종 규제 기구로부터 승인을 얻어내는데 도움이 될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포에는 미생물 오염원(예컨대, 세균성, 바이러스성 및 진균성 오염원)이 없다. 세균성 및 진균성 오염원의 존재 여부를 검사하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 통상 상업적 공급업체(예를 들어, BioReliance®, 메릴랜드주 락빌 소재)에 의해 수행된다. 허용된 미생물 무균 시험 및 미코플라스마 시험은 하기 섹션 8.7에서 상세히 설명한다. 시험할 수 있는 미생물 제제의 구체적인 예는 표 4에 열거되어 있다.
추가의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 이에 이에 제한되지는 않지만, 오쏘믹소바이러스(A형 및/또는 B형 인플루엔자 균주 포함), 파라믹소바이러스(A형 및/또는 B형 RSV, 인간 메타뉴모바이러스 및 1형, 2형 및/또는 3형 파라인플루엔자), 랍도바이러스 및 플라보바이러스를 포함하는 바이러스의 복제를 지원한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 예를 들면, FluMist
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에서 발견되는 것과 같은 저온 적응성/온도 감수성(ca/ts) 인플루엔자 바이러스(문헌 [Belshe et al., 1998, N Engl J Med 338:1405]; [Nichol et al., 1999, JAMA 282:137]; [Jackson et al., 1999, Vaccine, 17:1905]), 및/또는 이러한 바이러스의 백본을 포함하거나, 저온 적응성, 약독화성 및 온도 감수성과 같은 특징 중 하나 이상의 특징을 갖는 인플루엔자 바이러스의 백본(또는 하나 이상의 vRNA 단편(들))을 포함하는 재조합체 바이러스의 복제를 지원한다. 세포가 바이러스의 복제를 지원할 수 있는 능력에 대한 하나의 척도는 감염된 세포 배양물로부터 수득되는 바이러스 수율이다. 바이러스 수율은 당업자에게 공지되어 있는 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 바이러스 수율은, 감염성 비리온을 측정하는 평균 조직 배양 감염 용량(TCID50) 분석법 또는 형광 포커스 분석법(FFA)에 따라 시료 중에 존재하는 바이러스의 농도를 측정함으로써 정량될 수 있다. TCID5O 값은 대개 log10 TCID50/mL로 기록되며, FFA 값은 대개 log10 FFL/mL(형광 포커스 유닛/mL)로 기록된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL까지 인플루엔자 바이러스(예컨대, ca/ts 균주)의 복제를 지원한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 약 6.0 이상, 또는 약 6.2 이상, 또는 약 6.4 이상, 또는 약 6.6 이상, 또는 약 6.8 이상, 또는 약 7.0 이상, 또는 약 7.2 이상, 또는 약 7.4 이상, 또는 약 7.6 이상, 또는 약 7.8 이상, 또는 약 8.0 이상, 또는 약 8.2 이상, 또는 약 8.4 이상, 또는 약 8.6 이상, 또는 약 8.8 이상, 또는 약 9.0 이상, 또는 약 9.2 이상, 또는 약 9.4 이상, 또는 약 9.6 이상, 또는 약 9.8 이상의 log10 TCID50/mL까지 인플루엔자 바이러스(예컨대, ca/ts 균주)의 복제를 지원한다. 추가의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 FFL/mL까지 인플루엔자 바이러스(예컨대, ca/ts 균주)의 복제를 지원한다. 추가의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 약 6.0 이상, 또는 약 6.2 이상, 또는 약 6.4 이상, 또는 약 6.6 이상, 또는 약 6.8 이상, 또는 약 7.0 이상, 또는 약 7.2 이상, 또는 약 7.4 이상, 또는 약 7.6 이상, 또는 약 7.8 이상, 또는 약 8.0 이상, 또는 약 8.2 이상, 또는 약 8.4 이상, 또는 약 8.6 이상, 또는 약 8.8 이상, 또는 약 9.0 이상, 또는 약 9.2 이상, 또는 약 9.4 이상, 또는 약 9.6 이상, 또는 약 9.8 이상의 log10 FFL/mL까지 인플루엔자 바이러스(예컨대, ca/ts 균주)의 복제를 지원한다.
해마다 유행성 인플루엔자에 대한 백신 접종을 위해 백신 균주의 제조에 사용되는 야생형 바이러스가 백신 및 관련생물제품자문위원회(Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee)에 의해 생물제제 평가 및 연구센터(Centers for Biologies Evaluation and Research, CBER) 또는 세계보건기구(WHO) 및 유럽의약품평가청(European Medicines Evaluation Agency, EMEA)으로 해마다 추천되어 FDA 또는 미국질병통제예방센터(Centers for Disease Control and Prevention, CDC)에 의해 제조업자에게 제공된다. 이후, 이러한 균주는 일반적으로 야생형 바이러스의 NA 및/또는 HA 유전자와, 원하는 특정 성질을 보유하게될 도너(donor) 바이러스(흔히 마스터 도너 바이러스 또는 MDV로도 지칭함)로부터 유래된 잔존 유전자 단편이 조합된 재조합체 백신 균주를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, MDV 균주는 저온 적응성 및/또는 온도 감수성 및/또는 약독화성일 수 있고/있거나, 높은 증식율을 가질 수 있다. 하기에 바로 제시될 실시양태들은 상이한 인플루엔자 균주(예를 들어, 하나 이상의 보건 기구에 의해 추천된 야생형 균주)의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형에 관한 것이다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 이러한 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스는 관심 균주의 HA 및 NA 유전자 단편과, FluMist®와 균주 A/앤 아버(Ann Arbor)/6/60 또는 B/앤아버/1/66에서 발견되는 저온 적응성, 온도 감수성, 약독화성 인플루엔자 바이러스와 같이 적절한 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 인플루엔자 균주(본원에서 "저온 적응성, 온도 감수성, 약독화성 백본"으로도 지칭함)의 잔존 유전자 단편을 포함하는 재조합 및/또는 재배열 인플루엔자 바이러스를 수득함으로써 용이하게 제조될 수 있다. 본원에서 사용된 바과 같이, 야생형 인플루엔자 바이러스 균주의 HA 및 NA 유전자 단편과, 저온 적응성, 온도 감수성, 약독화성 인플루엔자 바이러스의 잔존 유전자 단편을 포함하는 재조합 및/또는 재배열 인플루엔자 바이러스는 식별자 "ca"가 선행되는 야생형 균주 지정법에 의해서도 지칭되기도 하는데, 예컨대 A/뉴 칼레도니아/20/99의 HA 및 NA 유전자 단편과 저온 적응성, 온도 감수성, 약독화성 인플루엔자 바이러스를 포함하는 재조합 및/또는 재배열 인플루엔자 바이러스는 "ca A/뉴 칼레도니아/20/99"로 지정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 인플루엔자 바이러스는 A/앤 아버/6/60, B/앤 아버/1/66, A/레닌그라드/134/47/57, B/레닌그라드/14/17/55 또는 A/푸에르토 리코(Puerto Rico)/8/34의 유전자 단편을 하나 이상 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는, 이에 제한되지는 않지만, CBER, WHO, EMEA, FDA 및 CDC를 포함하는 하나 이상의 보건 기구에 의해 매년 추천되고/되거나 제공되는 하나 이상의 인플루엔자 균주(예를 들어, A형 인플루엔자 균주, B형 인플루엔자 균주)의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형(예를 들면, 재조합체)의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 조성물은 유일한 숙주 세포형으로서 본 발명의 MDCK 세포를 포함하는데, 여기서 상기 세포 배양 조성물은 이에 제한되지는 않지만, CBER, WHO, EMEA, FDA 및 CDC를 포함하는 하나 이상의 보건 기구에 의해 매년 추천되고/되거나 제공되는 하나 이상의 인플루엔자 균주(예를 들어, A형 인플루엔자 균주, B형 인플루엔자 균주)의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형(예를 들어, 재조합체)의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다.
다른 특정의 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 하나 이상의 A형 인플루엔자 균주의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 조성물은 유일한 숙주 세포형으로서 본 발명의 MDCK 세포를 포함하는데, 여기서 상기 본 발명의 세포 배양 조성물은 하나 이상의 A형 인플루엔자 균주의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다. A형 인플루엔자 균주는 임의의 아형(예를 들어, H1N1, H3N2, H7N7, H5N1, H9N2, H1N2, H2N2)일 수 있다. 현재, A형 인플루엔자 바이러스에서는 16개 이상의 서로 다른 HA 아형과 9개 이상의 서로 다른 NA 아형이 확인되었다. 따라서, A형 인플루엔자 균주는 현재 알려졌거나 앞으로 확인될 HA 및 NA 아형들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 하나 이상의 B형 인플루엔자 균주의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 조성물은 유일한 숙주 세포형으로서 본 발명의 MDCK 세포를 포함하는데, 여기서 상기 본 발명의 세포 배양 조성물은 하나 이상의 B형 인플루엔자 균주의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다. B형 인플루엔자 바이러스는 현재 이들의 헤마글루티닌과 뉴라미니다아제 단백질에 따라 아형들로 분류되진 않았으며, 그 계통만이 분류되었다. 현재, B형 인플루엔자 바이러스 균주는 다수의 하위 계통을 가진 B/야마가타(Yamagata) 및 B/빅토리아(Victoria) 계통의 두 가지로 분류되어 있다. 따라서, B형 인플루엔자 균주는 현재 알려졌거나 앞으로 확인될 계통 및/또는 하위 계통들의 임의의 조합으로부터 유도될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 인플루엔자 균주 A/뉴 칼레도니아의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형(즉, ca A/뉴 칼레도니아)의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 인플루엔자 균주 A/히로시마의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형(즉, ca A/히로시마)의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 인플루엔자 균주 B/말레이시아의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형(즉, ca B/말레이시아)의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 인플루엔자 균주 A/베트남의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형(즉, ca A/베트남)의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 인플루엔자 균주 A/위스콘신의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형(즉, ca A/위스콘신)의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 인플루엔자 균주 A/뉴 칼레도니아 및 A/히로시마 각각의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 인플루엔자 균주인 A/뉴 칼레도니아 및 B/말레이시아 각각의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 인플루엔자 균주 A/뉴 칼레도니아 및 A/베트남 각각의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 인플루엔자 균주 A/히로시마 및 B/말레이시아 각각의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 인플루엔자 균주인 A/히로시마 및 A/베트남 각각의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 인플루엔자 균주인 B/말레이시아 및 A/베트남 각각의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 인플루엔자 균주 A/뉴 칼레도니아, A/히로시마 및 B/말레이시아 각각의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 인플루엔자 균주 A/뉴 칼레도니아, A/히로시마 및 A/베트남 각각의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 인플루엔자 균주 A/뉴 칼레도니아, B/말레이시아 및 A/베트남 각각의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 인플루엔자 균주 B/말레이시아, A/히로시마 및 A/베트남 각각의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 인플루엔자 균주인 A/뉴 칼레도니아, A/히로시마, B/말레이시아 및 A/베트남 각각의 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 변형의 복제를 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원한다.
추가의 또다른 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스로 감염시키기 전에 MediV 105, M-32, MediV 107 또는 M18M, 또는 이들의 증식 최적화 유도체 배지 중에서 세포를 성장시킨 후, 감염 동안 또는 감염 후에 신선한 배지 또는 배지 성분(예를 들어, 글루코스, 아미노산, 지질)을 포함시키는 단계를 포함하여, 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스를 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상, 또는 10.0 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 증식시키는 방법을 제공한다. 추가의 또다른 양태에서, 본 발명은 무혈청 배지, 바람직하게는 동물성 단백질이 없는 배지 중에서 세포를 증식시키는 단계 및 인플루엔자 바이러스로 세포를 감염시키기 전에, 감염시키는 동안에, 또는 감염시킨 후에 프로테아제, 예를 들어, TrypLE(1:10 - 1:100)를 첨가하는 단계를 포함하여, 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스를 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상, 또는 10.0 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 증식시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스는 6.0 이상, 또는 6.2 이상, 또는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상, 또는 8.2 이상, 또는 8.4 이상, 또는 8.6 이상, 또는 8.8 이상, 또는 9.0 이상, 또는 9.2 이상, 또는 9.4 이상, 또는 9.6 이상, 또는 9.8 이상, 또는 10.0 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 성장한다. 특정 실시양태에서, 신선한 배지는 프로테아제, 예를 들어, TrypLE(1:10 - 1:100)이 보충된 MediV 105이다. 특정 실시양태에서, 신선한 배지는 프로테아제, 예를 들어, TrypLE(1:10 - 1:100)이 보충된 M-32이다. 특정 실시양태에서, 신선한 배지는 프로테아제, 예를 들어, TrypLE(1:10 - 1:100)이 보충된 MediV 107이다. 인플루엔자 단백질을 분해하는데 유용하다고 당업자에게 공지된 프로테아제라면 어느 것이라도 상기 방법에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 신선한 배지는 프로테아제, 예를 들어, TrypLE(1:10 - 1:100)이 보충된 M18M이다. 특정 실시양태에서, 신선한 배지는 4.5g/L의 글루코스, 4 mM의 글루타민 및 프로테아제, 예를 들어, TrypLE(1:10 - 1:100)이 보충된 DMEM/F12이다.
본 발명의 세포가 세포 배양 조성물의 일부로서 흔히 사용될 수 있다는 것을 당업자는 알 수 있을 것이다. 세포 배양 조성물의 성분들은 세포 및 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 배양 목적인 경우, 세포 배양 조성물은 본 발명의 세포와 세포 증식에 적합한 배지를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 세포와, 이에 제한되지는 않지만, 배지(예컨대, 본원에 개시된 배지), 배지 성분들, 완충액, 화학적 화합물, 추가의 세포형, 바이러스 물질(예컨대, 바이러스 게놈, 바이러스 입자) 및 이종성 단백질을 비롯한 다른 성분들을 포함하는 세포 배양 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 조성물은 본 발명의 세포와 배지 또는 그의 성분들을 포함한다. 세포 배양 조성물 중에 존재할 수 있는 배지는 무혈청 배지, 혈청을 함유하는 배지 및 동물성 단백질이 없는 배지를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 조성물은 무혈청 배지, 예컨대, MediV 101, MediV 102, MediV 103, MediV 104, MediV 105, M-32, MediV 107, 또는 M18M, 또는 이들의 성분들 또는 이들의 증식 최적화 유도체를 포함한다.
6.3 방법 및 배지 조성물
본 발명은 혈청을 함유하는 배지 중에서 높은 역가까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 MDCK 세포의 배양을 위한 방법 및 이를 위한 배지 조성물을 제공한다. 추가로, 본 발명은 동물성 단백질이 없는 배지 조성물을 비롯한 무혈청 배지 중에서 MDCK 세포를 적응시킨 후 이를 배양하는 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 양태에서, 배지는 이에 제한되지는 않지만, 본원에 기술된 바와 같이 비종양형성성이고, 비종양원성이며, 부착성 세포로서 성장하고, 비부착성 세로로서 성장하며, 상피세포와 유사한 형태이고, 배양시 다양한 바이러스의 복제를 지원하며, 본원에 기술된 바와 같이 높은 역가까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 등의 특징 중 하나 이상의 특징을 보유할 수 있도록 제조된다. 본원에 개시된 배지 조성물 또는 그의 성분들은 세포 배양 조성물에 존재할 수 있다.
혈청을 함유하는 배지 조성물은 당업계에 잘 알려져 있다. 혈청을 함유하는 배지 조성물은 이에 제한되지는 않지만, 둘베코의 개량된 이글 배지(DMEM) + 소태아 혈청(FBS) + 글루타민 + 글루코스를 포함한다. 한 실시양태에서, FBS은 약 1% 내지 약 20% 사이, 또는 약 5% 내지 약 15% 사이, 또는 약 5% 내지 약 10% 사이의 농도로 혈청을 함유하는 배지에 존재한다. 특정 실시양태에서, FBS는 10%의 농도로 혈청을 함유하는 배지에 존재한다. 또다른 실시양태에서, 글루타민은 약 0.5mM 내지 약 10mM 사이, 또는 약 1mM 내지 10mM 사이, 또는 약 2mM 내지 5mM 사이의 농도로 혈청을 함유하는 배지에 존재한다. 특정 실시양태에서, 글루타민은 4mM의 농도로 혈청을 함유하는 배지에 존재한다. 추가의 또다른 실시양태에서, 글루코스는 약 1g/L 내지 약 10g/L 사이, 또는 약 2g/L 내지 약 5g/L 사이의 농도로 혈청을 함유하는 배지에 존재한다. 특정 실시양태에서, 글루코스는 4.5g/L의 농도로 혈청을 함유하는 배지에 존재한다. 추가의 또다른 실시양태에서, 혈청을 함유하는 배지 조성물은 약 1% 내지 약 20% 사이의 농도의 FBS, 약 0.5mM 내지 약 10mM 사이의 농도의 글루타민과, 약 1g/L 내지 약 10g/L 사이의 농도의 글루코스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 혈청을 함유하는 배지 조성물은 둘베코의 개량된 이글 배지(DMEM) + 10% 소태아 혈청(FBS) + 4mM 글루타민 + 4.5g/L 글루코스를 포함한다. DMEM은 예를 들어, 기브코(Gibco)/BRL(카달로그 번호 11965-084)을 비롯한 다수의 상업적 공급원으로부터 용이하게 입수할 수 있다. FBS는 예를 들면, JRH Biosciences(카달로그 번호 12107-500M)를 비롯한 다수의 상업적 공급원으로부터 용이하게 입수할 수 있다. FBS는 동물 세포 배양 배지에서 가장 보편적으로 이용되는 보충물이지만, 갓 태어난 소, 말 및 인간을 비롯한 다른 혈청 공급원도 통상적으로 사용되며, 본 발명에 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 혈청 적응된 MDCK 세포는 미국 미생물 보존 센터로부터 입수한 마딘-다비 개과 신장(MDCK) 세포(ATCC CCL34)로부터 유도된 것으로서, 이는 혈청이 보충된 화학적으로 규명된 배지(chemically defined media)에서 상기 세포를 배양함으로써 수득된다. 특정 실시양태에서, MDCK 세포(ATCC CCL34)를 혈청이 보충된 화학적으로 규명된 배지에서 증식시켜 하기와 같이 혈청 적응된 MDCK 세포주를 생산한다: MDCK(ATCC CCL34) 세포를 소태아 혈청(10% v/v), 4mM 글루타민 및 4.5g/L 글루코스로 보충된 둘베코의 개량된 이글 배지(DMEM) 중에서 계대배양하여 충분한 수의 세포를 수득함으로써 동결(frozen) 프리마스터 세포 은행(PreMCB: preMaster Cell Bank)을 제작한다. 또다른 특정 실시양태에서, 세포는 하기 실시예 1과 2에서 상세히 설명하는 방법을 사용하여 배양된다. 특히, PreMCB의 바이알로부터 혈청 적응된 MDCK 세포를 추가로 20회 이상 계대배양하고, 성숙한 누드 마우스 모델에서 생체 내 종양형성성의 시험을 수행하고, 핵형 분석법으로 핵형 분석을 시험하는 방법이 고려될 수 있다. 특정 실시양태에서, 증식된 MDCK 세포는 성숙한 누드 마우스에 피하 주사될 경우 종양을 유발하지 않을 것이며, 염색체 개수의 범위는 약 60-88개, 또는 약 65-85개, 또는 약 65-80개, 또는 약 70-85개를 넘지 않을 것이고, 염색체 수의 최빈값은 78개가 될 것이다. 한 실시양태에서, MDCK-S 세포는 배지(예컨대, 본원에 기술된 배지) 중에서 20회 이상 계대배양 후, 또는 30회 이상 계대배양 후, 또는 40회 이상 계대배양 후, 또는 50회 이상 계대배양 후, 또는 60회 이상 계대배양 후, 또는 70회 이상 계대배양 후, 또는 80회 이상 계대배양 후, 또는 90회 이상 계대배양 후, 또는 100회 이상 계대배양 후에 비종양형성성이다.
조직 배양물용으로 혈청 또는 동물 추출물을 사용하는 것이 단점을 가질 수 있다는 것을 당업자라면 주지하고 있을 것이다(문헌[Lambert, KJ. et al., In: Animal Cell Biotechnology, Vol 1, Spier, R.E. et al., Eds., Academic Pres New York, pp.85-122(1985)]). 예를 들어, 이러한 보충물의 화학적 조성은 로트(lot) 간에도, 심지어는 단일 제조업자의 것이라도 달라질 수 있다. 추가로, 동물 또는 인간 유래의 보충물은 외래의 병원체(예컨대, 미코플라스마, 바이러스 및 프리온)로 오염될 수도 있다. 이렇게 오염된 보충물을 세포 배양 배지 조성물에서 사용하는 경우에는, 이들 병원체가 배양된 세포의 건강 상태를 심각하게 손상시킬 수 있다. 추가로, 외래의 병원체로 오염된 배양물에서 생성된 물질을 세포 요법 및 다른 임상 용으로 사용할 경우, 이들 병원체는 건강상의 위험성을 내포할 수 있다. 더 큰 우려는 포유동물에서는 해면상뇌증을 유발시키고 인간에서는 크로이츠펠트-야콥병을 유발시키는 프리온의 존재이다. 따라서, 본 발명은 추가로 본 발명의 MDCK 세포를 포함하는 무혈청 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 무혈청 배지 조성물은 이에 제한되지는 않지만, MediV 101(Taub 배지+식물 가수분해물), MediV 102(Taub 배지+지질), MediV 103(Taub 배지+지질+식물 가수분해물), MediV 104(Taub 배지+지질+식물 가수분해물+성장 인자), MediV 105(트랜스페린이 구연산 철 암모늄/트로폴론 또는 황산 제2철 암모늄/트로폴론으로 대체되는 점을 제외하고 MediV 104와 동일함)(예를 들어, 미국공개특허 제2006/0188977호 참조), M-32(미량 원소인 A, B 및 C로 보충된 MediV 105와 동일, 표 9 참조), MediV 107(표 10 참조) 및 M18M(표 11 참조)을 포함한다. 특히, Taub SF 배지(문헌[Taub and Livingston, 1981, Ann NY Acad Sci., 372:406])는 호르몬, 5㎍/mL 인슐린, 5㎍/mL 트랜스페린, 25ng/mL 프로스타글란딘 E1, 50nM 하이드로코르티손, 5pM 삼요오드타이로닌 및 10nM Na2SeO3, 4.5g/L 글루코스, 2.2g/L NaHCO3 및 4mM L-글루타민으로 보충된 함스(Ham's) F12과 DMEM의 50:50 혼합물일 수 있다. Taub SF 배지는 본원에서 Taub 배지로서, 또는 간단하게 "Taub"로서도 언급된다. 구체적인 배지 조성물과 이들의 제조 방법은 하기에 제공된다(예를 들어, 섹션 8.10 참조).
식물 가수분해물은 이에 제한되지는 않지만, 옥수수, 면실, 완두, 대두, 맥아, 감자 및 소맥 중 하나 이상의 가수분해물을 포함한다. 식물 가수분해물은 효소적 가수분해에 의해 생성될 수 있으며, 보통 펩타이드, 유리 아미노산 및 성장 인자의 혼합물을 포함한다. 식물 가수분해물은 예를 들어, 마르코르 디벨럽먼트(Marcor Development), 하이클론(Hyclone) 및 오르가노 테크니크(Organo Technie)를 비롯한 다수의 상업적 공급원으로부터 용이하게 입수할 수 있다. 식물 가수분해물을 대신에, 또는 식물 가수분해물과 함께 효모 가수분해물도 사용할 수 있다. 효모 가수분해물은 예를 들어, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), USB 코포레이션(USB Corp), 기브코/BRL 및 기타 공급처를 비롯한 다수의 상업적 공급원으로부터 용이하게 입수할 수 있다. 특정 실시양태에서, 식물 가수분해물 또는 효모 가수분해물을 대신하여, 또는 추가로 합성 가수분해물이 사용될 수 있다.
배양 배지를 보충하기 위하여 사용될 수 있는 지질은 이에 제한되지는 않지만, 동식물 유래의 화학적으로 규명된 지질 보충물 뿐만 아니라, 합성으로 유도된 지질을 포함한다. 지질 보충물에 존재할 수 있는 지질은 이에 제한되지는 않지만, 콜레스테롤, 포화 및/또는 불포화 지방산(예를 들어, 아라키돈산, 리놀레산, 리놀렌산, 미리스트산, 올레산, 팔미트산 및 스테아르산)을 포함한다. 콜레스테롤은 100X 지질 보충물 저장액 중에 0.10mg/ml 내지 0.40mg/ml 사이의 농도로 존재할 수 있다. 지방산은 100X 지질 보충물 저장액에 1㎍/ml 내지 20㎍/ml 사이의 농도로 존재할 수 있다. 배지 조성물에 적합한 지질은 예를 들면 하이클론, 기브코/BRL 및 시그마-알드리치를 비롯한 다수의 상업적 공급원으로부터 용이하게 입수할 수 있다.
한 실시양태에서, Taub 배지는 최종 농도가 0.5g/L 이상, 또는 1.0g/L 이상, 또는 1.5g/L 이상, 또는 2.0g/L 이상, 또는 2.5g/L 이상, 또는 3.0g/L 이상, 또는 5.0g/L 이상, 또는 10g/L 이상, 또는 20g/L 이상인 식물 가수분해물로 보충된다. 특정 실시양태에서, Taub 배지는 소맥 가수분해물로 보충된다. 또다른 특정 실시양태에서, Taub 배지는 최종 농도가 2.5g/L인 소맥 가수분해물로 보충된다. 본 발명은 최종 농도가 2.5g/L인 소맥 가수분해물로 보충된 Taub 배지를 포함하는 본원에서 MediV 101로 지칭되는 무혈청 배지를 제공한다(예를 들어, 섹션 8.10 참조).
또다른 실시양태에서, Taub 배지는 최종 농도가 제조업자의 권장 최종 농도의 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100% 이상, 또는 125% 이상, 또는 150% 이상, 또는 200% 이상, 또는 300% 이상인 지질 혼합물로 보충된다. 특정 실시양태에서, Taub 배지는 화학적으로 규명된 지질 혼합물로 보충된다. 또다른 특정 실시양태에서, Taub 배지는 최종 농도가 제조업자의 권장 최종 농도의 100%인 화학적으로 규명된 지질 혼합물로 보충된다(예컨대, 제조업자로부터 입수한 100X 저장액을 최종 농도 1X로 배지에 첨가). 본 발명은 최종 농도가 제조업자의 권장 최종 농도의 100%인 화학적으로 규명된 지질 혼합물로 보충된 Taub 배지를 포함하는 본원에서 MediV 102로서 언급되는 무혈청 배지를 제공한다(예를 들어, 섹션 8.10 참조).
추가의 또다른 실시양태에서, Taub 배지는 최종 농도가 0.5g/L 이상, 또는 1.0g/L 이상, 또는 1.5g/L 이상, 또는 2.0g/L 이상, 또는 2.5g/L 이상, 또는 3.0g/L 이상, 또는 5.0g/L 이상, 또는 10g/L 이상, 또는 20g/L 이상인 식물 가수분해물과, 최종 농도가 제조업자의 권장 최종 농도의 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100% 이상, 또는 125% 이상, 또는 150% 이상, 또는 175% 이상, 또는 200% 이상인 지질 혼합물로 보충된다. 특정 실시양태에서, Taub 배지는 소맥 가수분해물과 화학적으로 규명된 지질 혼합물로 보충된다. 또다른 특정 실시양태에서, Taub 배지는 최종 농도가 2.5g/L인 소맥 가수분해물과 최종 농도가 제조업자의 권장 최종 농도의 100%인 화학적으로 규명된 지질 혼합물로 보충된다. 본 발명은 최종 농도가 2.5g/L인 소맥 가수분해물과 최종 농도가 제조업자의 권장 최종 농도의 100%인 화학적으로 규명된 지질 혼합물로 보충된 Taub 배지를 포함하는 본원에서 MediV 103으로 언급되는 무혈청 배지를 제공한다(예를 들어, 섹션 8.10 참조).
추가의 또다른 실시양태에서, Taub 배지는 성장 호르몬으로 보충된다. 사용될 수 있는 성장 호르몬은 이에 제한되지는 않지만, 표피 성장인자(EGF: Epidermal Growth Factor), 인슐린 성장인자(IGF: Insulin Growth Factor), 형질전환 성장인자(TGF: Transforming Growth Factor) 및 섬유모세포 성장인자(FGF: Fibroblast Growth Factor)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 성장 호르몬은 표피 성장인자(EGF)이다. 한 실시양태에서, Taub 배지는 최종 농도가 약 0.1 내지 약 50.0ng/ml 사이, 또는 약 0.5 내지 약 25.0ng/ml 사이, 또는 약 1.0 내지 약 20ng/ml 사이, 또는 약 5.0 내지 약 15.0ng/ml 사이, 또는 약 8ng/ml 내지 약 12ng/ml 사이인 성장 인자로 보충된다. 특정 실시양태에서, Taub 배지는 최종 농도가 약 10ng/ml인 성장 인자로 보충된다. 추가의 다른 실시양태에서, Taub 배지는 최종 농도가 약 0.1 내지 약 50.0ng/ml 사이, 또는 약 0.5 내지 약 25.0ng/ml 사이, 또는 약 1.0 내지 약 20ng/ml 사이, 또는 약 5.0 내지 약 15.0ng/ml 사이, 또는 약 8ng/ml 내지 약 12ng/ml 사이인 성장 인자와, 최종 농도가 0.5g/L 이상, 또는 1.0g/L 이상, 또는 1.5g/L 이상, 또는 2.0g/L 이상, 또는 2.5g/L 이상, 또는 3.0g/L 이상, 또는 5.0g/L 이상, 또는 10g/L 이상, 또는 20g/L 이상인 식물 가수분해물과, 최종 농도가 제조업자의 권장 농도의 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100% 이상, 또는 125% 이상, 또는 150% 이상, 또는 175% 이상, 또는 200% 이상인 지질 혼합물로 보충된다. 또다른 특정 실시양태에서, Taub 배지는 최종 농도가 2.5g/L인 소맥 가수분해물과, 최종 농도가 제조업자의 권장 최종 농도의 100%인 화학적으로 규명된 지질 혼합물과, 최종 농도가 약 10ng/ml인 EGF로 보충된다. 본 발명은 최종 농도가 2.5g/L인 소맥 가수분해물과, 최종 농도가 제조업자의 권장 최종 농도의 100%인 화학적으로 규명된 지질 혼합물과, 최종 농도가 약 10ng/ml인 EGF로 보충된 Taub 배지를 포함하는 본원에서 MediV 104로 지칭되는 무혈청 배지를 제공한다(예를 들어, 섹션 8.10 참조).
동물성 단백질이 없는 배지 조성물이 백신 제조에 사용되는 바이러스 생산을 위해 바람직할 수 있다는 사실도 당업자라면 주지하고 있을 것이다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 무혈청 배지(예컨대, MediV 101, MediV 102, MediV 103, MediV 104, MediV 105, M-32, MediV 107, M18M) 중의 하나 이상 또는 모든 동물 유래의 성분들은 비동물성 유도체로 대체될 수 있다. 예를 들어, 비동물성 공급원으로부터 유래된 시판되는 재조합 인슐린[예를 들어, 바이오로지컬 인더스트리즈(Biological Industries) 카달로그 번호 01-818-1]이 동물 공급원으로부터 유래된 인슐린을 대신해 사용될 수 있다. 마찬가지로, 철이 결합된 물질(iron binding agnet)(예를 들어, 미국 특허 제5,045,454호; 제5,118,513호; 제6,593,140호; 및 PCT 공개번호 WO 01/16294 참조)이 동물 공급원으로부터 유래된 트랜스페린을 대신하여 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 무혈청 배지 조성물은 트랜스페린을 대신하여 트로폴론(2-하이드록시-2,4,6-사이클로헤파트리엔-1)과 철 공급원(예를 들어, 구연산 철 암모늄, 황산 제2철 암모늄)을 포함한다. 예를 들어, 트로폴론 또는 트로폴론 유도체는 약 2:1 내지 약 70:1, 또는 약 10:1 내지 약 70:1의 몰비로 배지 중에 존재하는 철에 대하여 과량의 몰농도로 존재할 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 최종 농도가 200㎍/L인 구연산 철 암모늄과 최종 농도가 250㎍/L인 트로폴론을 포함한다(예컨대, 섹션 8.10 참조). 따라서, 배지 중의 철 농도가 약 0.3μM일 때, 트로폴론 또는 그의 유도체는 약 1.5μM 내지 약 20μM, 예컨대, 약 3μM 내지 약 20μM의 농도로 사용될 수 있다. 철은 배지 중에서 예를 들어, 황산 제1철, 염화 제2철, 질산철, 또는 특히 구연산 철 암모늄과 같은 단순 철염 또는 복합 철염의 사용으로부터 얻어지는 제1철 이온 또는 제2철 이온으로서 존재할 수 있다. 본 발명은 최종 농도가 2.5g/L인 소맥 가수분해물과, 최종 농도가 제조업자의 권장 최종 농도의 100%인 화학적으로 규명된 지질 혼합물과, 최종 농도가 약 10ng/ml인 EGF와, 2:1 내지 70:1 사이의 비로 구연산 철 암모늄:트로폴론 또는 황산 제2철 암모늄:트로폴론이 보충된 트랜스페린이 없는 Taub 배지를 포함하는 본원에서 MediV 105로 지칭되는 무혈청 배지를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 최종 농도가 200㎍/L인 구연산 철 암모늄과 최종 농도가 250㎍/L인 트로폴론을 포함한다(예를 들어, 섹션 8.10 참조).
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 하나 이상의 배지는 미량 원소(예를 들어, 미량 원소 용액 A, B 및 C, 표 9 참조)로 보충된다. 사용가능한 미량 원소로서는 이에 제한하지는 않지만, CuSO4·5H2O, ZnSO4·7H2O, 아셀렌산염(Selenite)·2Na, 구연산철, MnSO4·H2O, Na2SiO3·9H2O, 몰리브덴산-암모늄염, NH4VO3, NiSO4·6H2O, SnCl2(무수), AlCl3·6H2O, AgNO3, Ba(C2H3O2)2, KBr, CdCl2, CoCl2·6H2O, CrCl3(무수), NaF, GeO2, KI, RbCl, ZrOCl2·8H2O을 포함한다. 미량 원소의 농축 저장액은 예를 들어, 셀 그로우(Cell Grow)(카달로그 번호 99-182, 99-175 및 99-176 참조)와 같은 다수의 상업적 공급원으로부터 바로 입수할 수 있다. 본 발명은 최종 농도가 2.5g/L인 소맥 가수분해물과, 최종 농도가 제조업자의 권장 최종 농도의 100%인 화학적으로 규명된 지질 혼합물과, 최종 농도가 약 10ng/ml인 EGF와, 미량 원소 용액 A, B 및 C(표 9)와, 2:1 내지 70:1 사이의 비로 구연산 철 암모늄:트로폴론 또는 황산 제2철 암모늄:트로폴론이 보충된 트랜스페린이 없는 Taub 배지를 포함하는 본원에서 M-32로 지칭되는 무혈청 배지를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 최종 농도가 200㎍/L인 구연산 철 암모늄과 최종 농도가 250㎍/L인 트로폴론을 포함한다(예를 들어, 섹션 8.10 참조). 본원에 개시된 하나 이상의 배지는 추가의 글루코스로 보충될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 무혈청 배지는 약 4.5 내지 약 10 g/L의 최종 글루코스 농도에서 1-5 g/L의 추가의 글루코스를 포함한다.
한 실시양태에서, MediV 101, MediV 102, MediV 103, MediV 104, MediV 105, M-32, MediV 107 또는 M18M 무혈청 배지에서의 증식을 위해 적응된 MDCK 세포는 미국 미생물 보존 센터로부터 입수한 마딘-다비 개과 신장(MDCK) 세포(ATCC CCL34)로부터 유도된 것으로서, 이는 1회 이상의 계대배양을 위해 혈청으로 보충한 화학적으로 규명된 배지에서 배양한 후, 이를 무혈청 배지, 예컨대, 상기 기술된 무혈청 배지에서 계대배양함으로써 수득된다. 특정 실시양태에서, MDCK 세포(ATCC CCL34)는 하기와 같이 무혈청 배지에 적응된다: MDCK(ATCC CCL34) 세포를 소태아 혈청(10% v/v), 4mM 글루타민 및 4.5g/L 글루코스 보충된 둘베코의 개량된 이글 배지(DMEM)에서 적어도 1회에 걸쳐 계대배양한 후, 무혈청 배지에서 계대배양한다. 이후, 필요에 따라 MDCK 세포를 무혈청 배지에서 계대배양하여 무혈청 배지 적응된 세포를 충분히 수득하여 동결 프리마스터 세포 은행(PreMCB)을 제작한다. 특정 실시양태에서, 혈청을 함유하는 배지(예컨대, 소태아 혈청(10% v/v), 4mM 글루타민 및 4.5g/L 글루코스로 보충된 둘베코의 개량된 이글 배지(DMEM))에서 1회 내지 5회 사이, 또는 4회 내지 10회 사이, 또는 9회 내지 20회 사이, 또는 20회 이상 세포를 계대배양한 후, 무혈청 배지(예를 들어, MediV 101, MediV 102, MediV 103, MediV 104, MediV 105, M-32, MediV 107 및 M18M, 예를 들어, 섹션 8.10 참조)에서 계대배양한다.
특히, PreMCB의 바이알로부터 무혈청 배지-적응된 MDCK 세포를 추가로 20회 이상 계대배양하고, 성숙한 누드 마우스 모델에서 생체 내 종양형성성 시험과 핵형 분석법으로 핵형 분석을 시험하는 것이 고려될 수 있다. 특정 실시양태에서, 증식시킨 무혈청 배지-적응된 MDCK 세포는 성숙한 누드 마우스에 피하 주사될 경우 결절을 유발하지 않을 것이고/이거나, 염색체 수의 최빈값은 78개일 것이다. 또다른 실시양태에서, 증식된 무혈청 배지-적응된 MDCK 세포는 약 60-88개, 또는 약 65-85개, 또는 약 65-80개, 또는 약 70-85개의 범위를 넘지 않는 염색체 개수를 가질 것이고, 염색체 수의 최빈값은 78개가 될 것이다. 한 실시양태에서, MDCK-SF 세포는 배지(예컨대, 본원에 기술된 배지) 중에서 20회 이상 계대배양 후, 또는 30회 이상 계대배양 후, 또는 40회 이상 계대배양 후, 또는 50회 이상 계대배양 후, 또는 60회 이상 계대배양 후, 또는 70회 이상 계대배양 후, 또는 80회 이상 계대배양 후, 또는 90회 이상 계대배양 후, 또는 100회 이상 계대배양 후에 비종양형성성이다.
한 실시양태에서, 무혈청 배지-적응된 MDCK 세포의 유도를 위해 사용되는 무혈청 배지는 MediV 101이다. 또다른 실시양태에서, 무혈청 배지-적응된 MDCK 세포의 유도를 위해 사용되는 무혈청 배지는 MediV 102이다. 추가의 또다른 실시양태에서, 무혈청 배지-적응된 MDCK 세포의 유도를 위해 사용되는 무혈청 배지는 MediV 103이다. 추가의 또다른 실시양태에서, 무혈청 배지-적응된 MDCK 세포의 유도를 위해 사용되는 무혈청 배지는 MediV 104이다. 또다른 실시양태에서, 무혈청 배지-적응된 MDCK 세포의 유도를 위해 사용되는 무혈청 배지는 MediV 105이다. 다른 실시양태에서, 무혈청 배지-적응된 MDCK 세포의 유도를 위해 사용되는 무혈청 배지는 M-32이다. 다른 실시양태에서, 무혈청 배지-적응된 MDCK 세포의 유도를 위해 사용되는 무혈청 배지는 MediV 107이다. 또다른 실시양태에서, 무혈청 배지-적응된 MDCK 세포의 유도를 위해 사용되는 무혈청 배지는 M18M이다. 추가의 또다른 실시양태에서, 무혈청 배지-적응된 MDCK 세포의 유도를 위해 사용되는 무혈청 배지는 APF 배지이다. 본원에 기술된 배지는 동물성 단백질이 제거되도록 제조될 수 있다. 예를 들면, 소 트랜스페린은 비동물성 공급원으로부터 유래된 재조합 트랜스페린으로 대체될 수 있다. 이들의 구체적인 배지 조성물과 제조 방법은 하기에 제공된다(예를 들어, 섹션 8.10 참조).
또다른 실시양태에서, 본 발명의 세포는 무혈청 배지에서의 성장을 위해 적응되지 않고, 적응없이 무혈청 배지 중에서 성장된다. 따라서, 한 실시양태에서, 세포는 MediV 101 중에서 성장한다. 또다른 실시양태에서, 세포는 MediV 102 중에서 성장한다. 추가의 또다른 실시양태에서, 세포는 MediV 103 중에서 성장한다. 추가의 또다른 실시양태에서, 세포는 MediV 104 중에서 성장한다. 또다른 실시양태에서, 세포는 MediV 105 중에서 성장한다. 또다른 실시양태에서, 세포는 M-32 중에서 성장한다. 또다른 실시양태에서, 세포는 MediV 107 중에서 성장한다. 또다른 실시양태에서, 세포는 M18M 중에서 성장한다. 추가의 또다른 실시양태에서, 세포는 APF 배지 중에서 성장한다. 본원에 기술된 배지는 동물성 단백질이 제거되도록 제조될 수 있다. 예를 들면, 소 트랜스페린은 비동물성 공급원으로부터 유래된 재조합 트랜스페린으로 대체될 수 있다.
6.4 배양 조건
본 발명은 상기 기술된 바와 같이 혈청을 함유하는 배지 조성물 및 무혈청 배지 조성물 중에서 본 발명의 MDCK 세포 및 다른 동물 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 특히, 추가적인 배양 조건은 비종양형성성이고, 비종양원성이며, 부착성 세포로서 성장하고, 비부착성 세포로서 성장하며, 상피세포와 유사한 형태이고, 다양한 바이러스의 복제를 지원하며, 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성, 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스)의 증식을 높은 역가, 예를 들어 약 7.4 이상, 또는 약 7.6 이상, 또는 약 7.8 이상, 또는 약 8.0 이상, 또는 약 9.0 이상의 log10 TCID50/mL 및/또는 log10 FFU/mL까지 지원하는 등의 본 발명의 MDCK 세포의 특성을 유지하는데 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 이들 배양 조건은 이에 제한되지는 않지만, 정선된 부착성 표면, 세포 밀도, 온도, CO2 농도, 배양 방법, 용존 산소량 및 pH를 포함한다.
특히, 당업계의 숙련자라면 다양한 방법으로 배양 조건을 적응시켜 본 발명의 MDCK 세포의 성장을 최적화할 수 있다. 그러한 적응화를 통해 예를 들어, 미국공개특허 제2005/0118698호에 기술된 것과 같이 바이러스 물질(예컨대, 바이러스)의 생성을 증가시킬 수도 있다. 대안으로, 당업자는 배양 조건을 적응시켜 세포 성장과 관계없이 본 발명의 MDCK 세포로부터 백신 물질의 생산을 최적화할 수 있다. 이들 배양 조건은 이에 제한되지는 않지만, 부착성 표면, 세포 밀도, 온도, CO2 농도, 배양 방법, 용존 산소량 및 pH를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 표면 상에 부착되는 부착성 세포로서 배양된다. 조직 배양 세포가 성장될 부착 표면은 당업계에 잘 공지되어 있다. 부착 표면은, 이에 제한되지는 않지만, 표면 개질된 폴리스티렌 플라스틱, 단백질 코팅된 표면(예를 들어, 피브로넥틴 및/또는 콜라겐 코팅된 유리/플라스틱) 뿐만 아니라, 매우 다양한 시판되는 미세담체[예를 들어, 도르마셀(Dorma세포), 파이퍼&란겐(Pfeifer&Langen)의 DEAE-덱스트란(Dextran) 미세담체 비드; 플로우 래버러토리즈(Flow Laboratories)의 수퍼비드(Superbead); 힐렉스(Hillex), 솔로힐(SoloHill), 앤아버의 스티렌 공중합체-트리메틸아민 비드; 지이 헬스케어 바이오사이언스(GE Healthcare Life Science)의 사이토덱스(Cytodex) 1 및 사이토덱스 3]를 포함한다. 미세담체 비드는 세포 배양물의 체적당 부착성 세포의 성장을 위해 큰 표면적을 제공하는 작은 구체이다(직경 100-200 미크론 범위). 예를 들어, 배지 1리터는 2천만개 이상의 미세담체 비드를 포함하여 8000㎠를 초과하는 성장 표면을 제공할 수 있다. 정선된 부착성 표면은 본 발명의 MDCK 세포 배양에 사용되는 방법에 의해 결정되며 당업자에 의해 결정될 수 있다. 당업자라면, 부착성 세포를 2차 배양하는 공정(즉, 세포를 증식시켜 세포 배양물을 증량시키는 것) 동안에 세포를 융합성 지지 표면(예컨대, 플라스크 표면, 미세담체 등)에서 새로운 지지 표면 상으로 이동시켜야 한다는 사실을 주지하고 있을 것이다. 이러한 세포 이동을 수행하기 위해 여러 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 트립신, TrypLE 및 콜라게나아제와 같은 프로테아제가 플라스크 또는 미세담체로부터 세포를 제거하는데 사용될 수 있으며, 이후 세포를 세척하고 희석시켜 보다 큰 플라스크 또는 증식을 위한 배지를 함유하는 더 큰 체적의 미세담체에 넣는다. 이를 위해, TrypLE(인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)와 같은 비동물성 유래의 프로테아제를 사용하는 것이 바람직하다. 대안으로, 미세담체 배양물에서 비드간 직접 이동법(direct bead to bead transfer method)도 이용할 수 있는데, 이 방법에서는 신선한 비드와 배지를 융합성 비드와 혼합시키고 새 비드로의 세포 이동을 촉진시키는 조건 하에 배양물을 배양시킨다. 특정 실시양태에서, 프로테아제 처리와 비드에서 비드로의 이동을 조합하는 방법이 사용된다. 특정 실시양태에서, 미세담체 상에서 부착성 세포로서 성장하는 본 발명의 MDCK 세포의 세포 배양물은 프로테아제(예를 들어, TrypLE)로 처리되며, 이후 상기 프로테아제가 불활성화된 후(예를 들어, 리마콩(lima bean) 트립신 저해제와 같은 프로테아제 저해제의 첨가에 의해), 신선한 배지 및 미세담체 비드가 상기 배양물에 첨가될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 증식 배지의 일부 또는 전부가 프로테아제 처리 이전에 제거된다. 또다른 실시양태에서, 상기 증식 배지의 일부 또는 전부가 프로테아제 처리 이전에 완충액으로 대체된다. 추가의 또다른 실시양태에서, 프로테아제 처리 이전에 또는 처리 중에 킬레이트제가 첨가된다. 일부 실시양태에서, 상기 프로테아제 처리된 배양물은 신선한 배지와 미세담체의 첨가 이전에, 첨가 중에 또는 첨가 후에 더 큰 배양 용기로 옮겨진다.
한 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 현탁액에서 비부착성(예를 들어, 비부착 조건에서 성장할 수 있는) 세포로서 배양된다. 본 발명에 따른 공정 과정에서 사용될 수 있는 적절한 배양 용기는 예를 들어, 스피너(spinner) 병, 롤러(roller) 병, 발효조 또는 생물반응기와 같이 당업자에게 공지된 모든 용기이다. 예를 들어, 백신 생산을 위한 바이러스의 상업적인 생산의 경우, 생물반응기 또는 발효조에서 세포를 배양하는 것이 대개 바람직하다. 생물반응기는 1리터 이하에서부터 10,000리터 초과 부피까지 이용가능하며, 예를 들면, Cyto3 생물반응기(오스모닉스(Osmonics), 미국 미네소타주 미네통카 소재); NBS 생물반응기(뉴브룬스위크 사이언티픽(New Brunswick Scientific), 미국 뉴욕주 에디슨 소재); B. 브라운 바이오테크 인터내셔널(Braun Biotech International)의 실험실 규모 및 상업적 규모의 생물반응기(B. 브라운 바이오테크, 독일 멜중엔 소재)를 그 예로 들 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 회분식(batch) 배양 시스템에서 부착성 세포로 배양된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는, 출발 배지가 고갈될 경우 추가의 영양분(예를 들어, 탄소 공급원, 아미노산 등)을 첨가하여 높은 세포 밀도로 증식을 촉진시키는 유가 배양(fed bacth culture) 시스템에서 부착성 세포로 배양된다. 추가의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 관류 배양 시스템에서 부착성 세포로서 배양된다. 특히, 본 발명의 MDCK 세포는 백신 물질(예를 들어, 바이러스)의 생산을 위해 관류 시스템(예를 들어, 원심분리, 여과, 스핀 여과기 등과 같이 당업자에게 공지되어 있는 세포 체류 시스템을 사용하는 교반형 발효조)에서 배양될 수 있다. 부착성 세포로서의 MDCK 세포의 배양과 관련된 추가적인 정보는, 예를 들어, 미국공개특허 제2003/0108860호 및 제2005/0118140호에서 찾을 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 회분식 또는 유가 배양 시스템에서 비부착성 세포로서 배양된다. 추가의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 관류 배양 시스템에서 비부착성 세포로서 배양된다.
특정 실시양태에서, 세포 배양을 위한 가요성 플라스틱 백과 같은 일회용 부재를 포함하는 반응기 시스템이 사용된다. 이러한 반응기 시스템은 당업계에 공지되어 있으며 시판된다. 예를 들어, 국제특허공보 WO 05/108546; WO 05/104706; 및 WO 05/10849 및 하기 섹션 8.12를 참조한다. 일회용 부재를 포함하는 반응기 시스템(본원에서 "일회용 생물반응기(single use bioreactor)" 또는 약어 "SUB"로 지칭됨)은 미리 멸균될 수 있으며, 배양 또는 생산 시스템에서 회분간(batch to batch) 또는 생성물간(product to product) 전환을 위한 스팀 멸균 장치(steam-in-place, SIP) 또는 내부 세척 장치(clean-in-place, CIP)가 필요치 않다. 사실, SUB는 회분간 오염이 전무함을 확인할 수 있어 조절적 방제(regulatory control)의 필요성이 덜하므로, 사용 전에 최소한의 준비만으로 또는 준비를 별도로 하지 않고도 비용 면에서 상당한 우위를 점하면서 작동될 수 있다. 추가로, SUB는 세척 또는 멸균 작업이 필요없기 때문에, 신속하게 배치하여 세포 배양물로부터 다량의 백신 물질(예컨대, 바이러스)의 생산을 촉진시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 일회용 반응기 시스템은 영양분, O2 및 pH의 보다 효율적인 조절이 가능한 세포 배양물의 혼합을 위한 유체 역학적 환경을 제공할 수 있는 교반형 탱크 반응기 시스템이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 1% 이상, 또는 2% 이상, 또는 3% 이상, 또는 4% 이상, 또는 5% 이상, 또는 6% 이상, 또는 7% 이상, 또는 8% 이상, 또는 9% 이상, 또는 10% 이상, 또는 20% 이상의 CO2 농도에서 배양된다.
한 실시양태에서, 용존 산소(DO) 농도(pO2 값)는 본 발명의 MDCK 세포의 배양시 유리하게 조절되며, 5% 내지 95% 범위이거나(공기 포화도 기준), 10% 내지 60% 사이이다. 특정 실시양태에서, 용존 산소(DO) 농도(pO2 값)는 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포를 배양하는데 사용되는 배양 배지의 pH는 배양시 조절되고, pH 6.4 내지 pH 8.0 범위, 또는 pH 6.8 내지 pH 7.4 범위이다. 특정 실시양태에서, 배양 배지의 pH는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상, 또는 7.4 이상, 또는 7.6 이상, 또는 7.8 이상, 또는 8.0 이상이다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 25℃ 내지 39℃의 온도에서 배양된다. 특히, 배양 온도는 원하는 공정 과정에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 MDCK 세포는 세포의 증식을 위해서는 37℃에서 배양될 수 있고, 백신 물질(예를 들어, 바이러스)의 생산을 위해 그보다 저온(예를 들어, 25℃ 내지 35℃)에서 배양될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 세포는 백신 물질의 생산을 위해 30℃ 미만, 또는 31℃ 미만, 또는 32℃ 미만, 또는 33℃ 미만, 또는 34℃ 미만의 온도에서 배양된다. 또다른 실시양태에서, 세포는 백신 물질의 생산을 위해 30℃, 또는 31 ℃, 또는 32℃, 또는 33℃, 또는 34℃의 온도에서 배양된다.
특히, 백신 물질(예를 들어, 바이러스)을 제조하기 위해서는 배지가 쉽게 교환될 수 있도록(예를 들어, 관류 시스템) 본 발명의 MDCK 세포를 배양할 수 있다는 점이 고려된다. 세포는 예를 들면, 1×106개 내지 25×106개 세포/mL 사이의 매우 높은 세포 밀도로 배양될 수 있다. 글루코스, 글루타민, 락테이트의 함량 뿐만 아니라, 배지의 pH와 pO2 값, 그리고 다른 파라미터, 예컨대, 교반 속도와 같은 당업자에게 공지되어 있는 것들은 세포 밀도 및/또는 바이러스 생산이 최적화되도록 본 발명의 MDCK 세포 배양시 용이하게 조작될 수 있다.
본 발명은 SUB에서 세포를 배양함으로써 배양물에서 세포(예컨대, 본 발명의 MDCK 세포)를 높은 세포 농도로 증식시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, MDCK 세포는 SUB 시스템에서 5×105개 이상 세포/mL, 7.5×105개 이상 세포/mL, 1×1O6개 이상 세포/mL, 2.5×106개 이상 세포/mL, 5×106개 이상 세포/mL, 7.5×106개 이상 세포/mL, 1O×1O6개 이상 세포/mL, 15×106개 이상 세포/mL, 2O×1O6개 이상 세포/mL, 또는 25×106개 이상 세포/mL의 세포 밀도로 배양된다. 특정 실시양태에서, MDCK 세포는 추가의 글루코스 보충된 하기 기술된 것(예를 들어, 섹션 8.10 참조)과 같은 무혈청 배지의 SUB에서 배양된다. 예를 들어, 추가의 4.5 g/L의 글루코스(글루코스 총 농도는 9.0 g/L)가 보충된 MediV-105가 이용될 수 있다. 추가의 또다른 특정 실시양태에서, MDCK 세포는 SUB에서 미세담체 상에 부착성 세포로서 배양된다. 한 실시양태에서, 상기 미세담체는 약 1 g/L 내지 약 4 g/L의 농도로 사용된다. 또다른 실시양태에서, 상기 미체담체는 약 2 g/L 내지 약 3 g/L의 농도로 사용된다. 특정 실시양태에서, SUB는 약 5 내지 약 15×104 개 세포/mL의 접종 농도(seeding density)로 배양될 MDCK 세포로 접종된다. 특정 실시양태에서, 접종 농도는 약 6 내지 약 14×104개 세포/mL, 또는 약 7 내지 약 13×104개 세포/mL, 또는 약 8 내지 약 12×104개 세포/mL, 또는 약 9 내지 약 11×104개 세포/mL이다. 당업자라면 상기 접종 농도가 미세담체를 기준으로 계산될 수도 있음을 주지하고 있을 것이다. 따라서, 특정 실시양태에서, SUB는 약 2 내지 약 30개 세포/미세담체, 또는 약 2 내지 약 25개 세포/미세담체, 또는 약 2 내지 약 20개 세포/미세담체, 또는 약 2 내지 약 15개 세포/미세담체, 또는 약 2 내지 약 10개 세포/미세담체, 또는 약 5 내지 약 30개 세포/미세담체, 또는 약 10 내지 약 30개 세포/미세담체, 또는 약 15 내지 약 30개 세포/미세담체, 또는 약 20 내지 약 30개 세포/미세담체, 또는 약 5 내지 약 30개 세포/미세담체, 또는 약 10 내지 약 25개 세포/미세담체, 또는 약 15 내지 약 20개 세포/미세담체의 접종 농도로 배양하고자 하는 MDCK 세포로 접종된다.
특정 실시양태에서, MDCK 세포는 교반형 탱크 SUB에서 온도, 교반 속도, pH, 용존 산소량(DO), O2 및 CO2의 유속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 파라미터가 모니터링되고/되거나 제어되면서 배양된다. 한 실시양태에서, 온도는 약 3O℃ 내지 약 42℃, 또는 약 33℃ 내지 약 39℃, 또는 약 35℃ 내지 약 38℃로 유지된다. 특정 실시양태에서, 온도는 약 36℃ 내지 약 37℃로 유지된다. 한 실시양태에서, 교반 속도는 약 50 내지 150 rpm으로 유지된다. 구체적인 실시양태에서, 교반 속도는 약 80 내지 약 120 rpm, 또는 약 90 내지 약 100 rpm으로 유지된다. 교반 속도는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 조절된다. 또다른 실시양태에서, 배양물의 pH는 약 6.0 내지 약 7.5로 유지된다. 구체적인 실시양태에서, 배양 개시 시점의 pH는 약 6.0 내지 약 7.5이고, 배양 중에는 배양물의 pH가 약 7.0 내지 약 7.5로 유지된다. 당업자라면 개시 pH는 상기 바람직한 범위보다 더 낮거나 높을 수 있으며, 이러한 pH는 바람직한 수준(예를 들어, 7.4)으로 높이거나 낮추어 그 수준에서 유지시키는 것도 가능하다. 이러한 pH는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 유지된다. 예컨대 pH는 필요에 따라 CO2의 살포 및/또는 산의 첨가(예를 들어, HCL) 또는 염기의 첨가(예를 들어, NaOH)에 의해 조절될 수 있다. 추가의 또다른 실시양태에서, 허용가능한 DO 범위는 약 100% 내지 약 35%이다. 특정 실시양태에서, DO는 약 35% 내지 약 50%, 또는 약 50%로 유지된다. 또다른 특정 실시양태에서, DO는 약 35% 미만으로 떨어져서는 안된다. 당업자라면, 초기의 DO가 100%일 수 있으며 이러한 DO는 미리 설정한 농도(예를 들어, 50%)로 떨어뜨려 이 수준에서 유지시키는 것도 가능하다. 이러한 DO는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, O2를 살포함으로써 유지된다. 특정 실시양태에서, O2의 유속은 약 2.0 L/분 이하로 유지된다. 특정 실시양태에서, CO2의 유속은 약 0.4 L/분 이하로 유지된다.
6.5 백신 물질(예컨대, 바이러스)의 제조
본 발명은 MDCK 세포가 바이러스의 제조를 위해 사용되는 세포 배양물 중에서 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다. 본 방법의 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 바이러스를 생산하기 위해 사용된다. 한 실시양태에서, 상기 방법은
(a) 본 발명의 MDCK 세포를 포함하는 세포 배양 조성물을 바이러스로 감염시키는 단계;
(b) 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에 상기 세포 배양 조성물을 배양하는 단계; 및
(c) 상기 세포 배양 조성물로부터 바이러스를 분리하는 단계
를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 단계 (a) 이전에 부착성 세포로서 증식된다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 단계 (a) 이전에 비부착성 세포로서 증식된다. 본 발명의 MDCK 세포는 이에 제한되지는 않지만, 상기 기술된 것을 비롯한 임의의 배지에서의 공정 과정에 따라 배양될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 무혈청 배지, 예를 들어, MediV-101, MediV-102, MediV-103, MediV-104, MediV-105, MediV-107, M18M 및 그의 APF 조성물에서의 공정 과정에 따라 배양될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 MDCK 세포는 글루코스 보충된 무혈청 배지에서 배양된다. 선택적으로, 본 발명의 MDCK 세포는 혈청을 함유하는 배지(예를 들어, DMEM + 10% FBS + 4mM 글루타민 + 4.5g/L 글루코스)에서의 공정 과정에 따라 배양될 수 있다. 추가의 배양 조건, 예를 들어, 온도, pH, pO2, CO2 농도 및 세포 밀도는 상기에 상세하게 기술되어 있다. 당업자라면 바이러스를 생산하기 위해서 본 발명의 MDCK 세포를 증식시키기 위한 배양 조건들을 조합하여 설정할 수 있다.
한 실시양태에서, 바이러스로 감염시키기 전에 세포 증식을 위한 온도는 22℃ 내지 40℃ 사이이다. 특정 실시양태에서, 바이러스로 감염시키기 전에 세포를 증식시키기 위한 온도는 39℃ 이하, 또는 38℃ 이하, 또는 37℃ 이하, 또는 36℃ 이하, 또는 35℃ 이하, 또는 34℃ 이하, 또는 33℃ 이하, 또는 32℃ 이하, 또는 30℃ 이하, 또는 28℃ 이하, 또는 26℃ 이하, 또는 24℃ 이하이다. 특정 실시양태에서, 바이러스로 감염시키기 전에 세포를 증식시키기 위한 온도는 약 33℃ 내지 약 39℃이다. 한 실시양태에서, 세포를 증식을 위한 배양은 관류 시스템, 예를 들면, 원심분리, 여과, 스핀 여과기, 미세담체 등과 같이 당업자에게 공지되어 있는 세포 체류 시스템을 이용한 교반형 발효조에서 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 증식을 위한 배양은 SUB 시스템에서 수행된다.
이러한 실시양태들에서, 세포는 예를 들면 1일 내지 20일, 또는 3일 내지 11일 동안 증식될 수 있다. 배지 교환은 본 방법에서 하루에 발효조 체적을 0에서부터 대략 1 내지 5로 증가시키면서 수행한다. 다르게는, 성장 배지는 배지 교환이 필요없도록 추가의 성분(예컨대, 글루코스, 미량의 미네랄, 아미노산 등)으로 보충되고/되거나 이러한 추가의 성분들을 포함한다. 세포는 이러한 방식으로 예를 들어, 적어도 1×106개 - 25×106개 세포/mL까지의 높은 세포 밀도로 증식된다. 관류 시스템에서의 배양시 관류 속도는 배지 중의 세포수, 글루코스, 글루타민 또는 락테이트의 함량과, 당업자에게 공지되어 있는 다른 파라미터를 통해 조절될 수 있다. 다르게는, 세포는 회분식 공정 또는 유가 배양 공정으로 배양된다.
본 발명에 따른 방법의 한 실시양태에서, 세포를 배양하기 위한 배양 배지의 pH, pO2 값, 글루코스 농도 및 다른 파라미터는 당업자에게 공지되어 있는 방법을 사용하여 상기 기술된 바와 같이 배양하는 동안 조절된다.
특정 실시양태에서, 배지의 일부가 단계 (a) 이전에 교환된다. 한 실시양태에서, 교환될 배지의 비율은 약 20% 내지 약 100%, 또는 약 30% 내지 약 80%, 또는 약 30% 내지 약 60%, 또는 약 66% 내지 약 80%이다. 한 실시양태에서, 배지는 동일한 부피의 배지로 교환된다. 또다른 실시양태에서, 배지는 감소된 부피의 배지로 교환되어 세포를 효과적으로 농축시킨다. 배지는 동일하거나 상이한 조성을 갖는 배지로 교환될 수 있다. 한 실시양태에서, MDCK 세포의 증식을 위해 사용되는 성장 배지는 감염 배지(즉, 감염 및 바이러스 복제시 사용되는 배지)로 교환된다. 특정 실시양태에서, MDCK 세포는 MediV-105, MediV-107 또는 M18M 중에서 증식되며, 감염 전에 배지의 일부가 감염 배지로 교환된다. 다르게는, 성장 배지는 배지 교환이 필요없도록 추가의 성분(예컨대, 글루코스, 미량의 미네랄, 아미노산 등)으로 보충되고/되거나 이러한 추가의 성분들을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 감염 배지는 세린 프로테아제(예를 들어, 트립신, TrypLE 등)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 배지가 교환되지 않은 곳에는, 세린 프로테아제(예를 들어, 트립신, TrypLE 등)를 감염 직전에, 감염 동안에 또는 감염 직후에 첨가한다.
특정 실시양태에서, 프로테아제는 세포를 바이러스로 감염시키기 전에 또는 감염시킴과 동시에 첨가된다.
일부 실시양태에서, 바이러스를 이용한 세포의 감염은 약 0.00001 내지 약 10, 또는 약 0.00001 내지 약 1, 또는 약 0.00001 내지 약 0.0003, 또는 약 0.00001 내지 약 0.0001, 또는 약 0.0001 내지 약 10, 또는 약 0.0005 내지 약 5, 또는 약 0.002 내지 약 0.5, 또는 약 0.001 내지 약 0.003의 m.o.i.(multiplicity of infection; 감염다중도)로 수행된다. 추가의 또다른 실시양태에서, 바이러스를 이용한 세포의 감염은 0.0001 내지 10, 또는 0.0005 내지 5, 또는 0.002 내지 0.5, 또는 0.001 내지 0.003의 m.o.i.(감염다중도)로 수행된다. 다르게는, 바이러스를 이용한 세포의 감염은 배양물 중의 바이러스의 최종 농도에 의해 결정된다. 예를 들어, 바이러스는 최종 농도가 약 0.001×103/mL 내지 약 0.2×103/mL, 또는 약 0.01×103/mL 내지 약 2×103/mL, 또는 약 0.1×103/mL 내지 약 20×103/mL, 또는 약 1×103/mL 내지 약 4×103/mL로 첨가될 수 있다. 감염 후, 상기 감염된 세포 배양물은 특히 최대 세포 변성 효과 또는 바이러스 항원의 최대량이 감지될 수 있을 만큼의 바이러스를 복제시키기 위해 추가로 배양된다. 한 실시양태에서, 감염 후, 세포는 22℃ 내지 40℃ 사이의 온도에서 배양된다. 특정 실시양태에서, 바이러스로 감염된 후, 세포는 39℃ 이하, 또는 38℃ 이하, 또는 37℃ 이하, 또는 36℃ 이하, 또는 35℃ 이하, 또는 34℃ 이하, 또는 33℃ 이하, 또는 32℃ 이하, 또는 30℃ 이하, 또는 28℃ 이하, 또는 26℃ 이하, 또는 24℃ 이하의 온도에서 배양된다. 특정 실시양태에서, 바이러스로 감염된 후, 세포는 33℃의 온도에서 배양된다. 또다른 실시양태에서, 바이러스로 감염된 후, 세포는 33℃ 이하의 온도에서 배양된다. 추가의 또다른 실시양태에서, 감염 후, 세포는 31℃의 온도에서 배양된다. 특정 실시양태에서, 세포 배양은 2일 내지 10일 동안 수행된다. 배양은 관류 시스템에서 수행될 수 있거나 또는 선택적으로 회분식 공정 또는 유가 배양 공정으로 수행될 수 있다.
이러한 실시양태들에 있어서, 세포는 예를 들어, pH와 pO2 값이 상기 기재된 바와 같이 유지되도록 바이러스로 감염시킨 후에 배양될 수 있다(단계 (b)). 단계 (a) 이전의 세포 배양시 및/또는 상기 방법의 단계 (b)에 따른 바이러스 복제시, 항원 수율을 최적화하기 위해 세포 배양 배지를 새로 제조된 배지, 배지 농축물로 대체하거나, 아미노산, 비타민, 지질 분획, 인산염 등과 같이 규명된 성분들로 대체할 수도 있다. 세포는 수일에 걸쳐 배지 또는 배지 농축물을 추가로 첨가함으로써 서서히 희석될 수 있거나, 배지 또는 배지 농축물과 함께 추가로 관류 배양될 수 있다. 이러한 경우 관류 속도는 결국 배지 중의 세포수, 글루코스, 글루타민, 락테이트 또는 락테이트 디하이드로게나아제 함량 또는 당업자에게 공지되어 있는 다른 파라미터를 통해 조절될 수 있다. 추가로 유가 배양 공정과 관류 시스템의 조합도 가능하다.
공정의 한 실시양태에서, 생산된 바이러스의 수거 및 분리(단계 (c))는 적절한 수율로 바이러스를 생산하기에 충분한 기간, 예컨대, 감염 후 2일 내지 10일, 또는 선택적으로 3일 내지 7일이 경과한 후 수행한다. 공정의 한 실시양태에서, 생산된 바이러스의 수거 및 분리(단계 (c))는 감염 후 2일, 또는 3일, 또는 4일, 또는 5일, 또는 6일, 또는 7일, 또는 8일, 또는 9일, 또는 10일이 경과한 후 수행한다.
본 발명의 MDCK 세포에서 생산될 수 있는 바이러스는, 이에 제한되지는 않지만, 오쏘믹소비리다에(orthomyxoviridae), 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae), 토가비리다에(Togaviridae), 헤르페스비리다에(Herpesviridae), 랍도비리다에(Rhabdoviridae), 레트로비리다에(Retroviridae), 레오비리다에(Reoviridae), 플라비비리다에(Flaviviridae), 아데노비리다에(Adenoviridae), 피코나비리다에(Picornaviridae), 아레나비리다에(Arenaviridae) 및 폭스비리다에(Poxviridae) 과를 비롯한 동물성 바이러스를 포함한다.
세포 배양물에서 인플루엔자 바이러스를 생산하기 위한 시스템도 최근 몇 년 사이에 개발되었다(예를 들어, 문헌[Furminger, Textbook of Influenza, ed Nicholson, Webster and Hay, pp. 324-332, Blackwell Science(1998)]; [Merten et al., Novel Strategies in The Design and Production of Vaccines, ed Cohen & Shafferman, pp. 141-151, Kluwer Academic(1996)] 참조). 통상, 이러한 방법은 적당한 숙주 세포를 선별된 바이러스 균주로 감염시키는 것을 포함한다. 산란계의 달걀에서의 백신 생산과 관련한 많은 어려움이 해소되었지만, 인플루엔자의 모든 병원성 균주가 잘 자라는 것은 아니며, 확실히 입증된 조직 배양법에 따라 생산될 수 있다. 추가로, 약독화성, 온도 감수성 및 저온 적응성과 같은 바람직한 특성을 보유하며 생 약독화성 백신 생산에 적합한 많은 균주들은 이미 확립된 방법으로는 조직 배양물에서 특히나 상업적 규모로는 성공적으로 성장시키지 못하였다.
본 발명은 배양시, 이에 제한하지는 않지만, 인플루엔자를 비롯한 바이러스의 복제를 지원할 수 있는 혈청을 함유하는 배지 또는 무혈청 배지에서 성장하도록 적응된 MDCK 세포주를 제공한다. 이러한 세포주는 세포 배양물 내에서 백신 물질로서 사용하기 위한 바이러스를 경제적으로 복제하는데 적합하다. 본 발명의 MDCK 세포는 확립된 다른 세포주를 사용할 경우에는 잘 성장하지 않는, 저온 적응성 및 온도 감수성(ca/ts) 인플루엔자 균주(예를 들어, FluMist®에서 발견되는 인플루엔자 균주)의 생산에 특히 유용하다. 추가로, 본 발명의 MDCK 세포는 발육란에서는 성장할 수 없는 인플루엔자, 예를 들어, 인간에서도 질환을 유발할 수 있는 조류 인플루엔자 바이러스의 균주(예를 들어, "전염성" 균주) 생산에 유용하다.
본 발명의 MDCK 세포에서 본 발명의 방법에 따라 생산될 수 있는 인플루엔자 바이러스는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 약독화, 온도 감수성, 저온 적응성(ca/ts/att)을 갖는 마스터 균주와 관련하여 선택된 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다아제 항원을 혼입시킨 재조합 바이러스를 포함한다. 예를 들어, 바이러스는 온도 감수성(ts), 저온 적응성(ca) 또는 약독화성(att) 중의 하나 이상인 마스터 균주(예를 들어, A/앤 아버/6/60, B/앤 아버/1/66, PR8, B/레닌그라드/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/레닌그라드/179/86, B/레닌그라드/14/55, B/잉글랜드/2608/76 등)의 백본(또는 하나 이상의 vRNA 단편)을 포함할 수 있다. 난(egg) 또는 세포주에서 재조합 인플루엔자 백신 균주를 생산하는 방법은 본 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Kilbourne, E.D. in Vaccines(2nd Edition), ed. Plotkin and Mortimer, WB Saunders Co.(1988)] 및 PCT 특허공보 WO 05/062820와 WO 03/091401, 그리고 미국특허 제6,951,754호, 제6,887,699호, 제6,649,372호, 제6,544,785호, 제6,001,634호, 제5,854,037호, 제5,824,536호, 제5,840,520호, 제5,820,871호, 제5,786,199호 및 제5,166,057호와, 미국공개특허 제20060019350호, 제20050158342호, 제20050037487호, 제20050266026호, 제20050186563호, 제20050221489호, 제20050032043호, 제20040142003호, 제20030035814호 및 제20020164770호에 개시된 방법들을 포함한다. 본 발명의 MDCK 세포에서 본 발명의 방법에 의해 생산될 수 있는 다른 인플루엔자 바이러스로서는 이종성 유전자 산물을 발현시킬 수 있는 재조합 인플루엔자 바이러스를 포함한다(예를 들면, 미국공개특허 제2004/0241139호 및 제2004/0253273호 참조).
한 실시양태에서, 세포는 증식된 후 인플루엔자 바이러스로 감염된다. 특정 실시양태에서, 감염은 0.0001 내지 10, 또는 0.0005 내지 5, 또는 0.002 내지 0.5, 또는 0.0001 내지 0.002, 또는 0.00001 내지 0.002의 m.o.i.(감염다중도)로 수행된다. 다른 실시양태에서, 감염은 약 0.0001 내지 약 10, 또는 약 0.0005 내지 약 5, 또는 약 0.002 내지 약 0.5, 또는 0.0001 내지 0.002, 또는 0.00001 내지 0.002의 m.o.i.(감염다중도)로 수행된다. 선택적으로, 헤마글루티닌의 전구체 단백질[HA0]을 분해시켜서 세포 상에 바이러스를 흡착시킬 수 있는 프로테아제를 첨가할 수 있다. 프로테아제의 첨가는 인플루엔자 바이러스로 세포를 감염시키는 단계 직전에, 그와 동시에, 또는 그 직후에 본 발명에 따라 수행될 수 있다. 감염과 동시에 첨가할 경우, 프로테아제는 감염시키려는 세포 배양물에 직접 첨가될 수 있거나, 또는 예를 들어, 바이러스 접종물과 함께 농축물로서 첨가될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 프로테아제는 세린 프로테아제, 또는 시스테인 프로테아제, 또는 아스파라긴 프로테아제이다. 한 실시양태에서, 트립신이 사용된다. 특정 실시양태에서, TPCK-처리된 트립신이 사용된다. 또다른 실시양태에서, 미국특허출원 제11/455,818호에 기술된 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)의 프로테아제가 사용된다. 트립신은 동물 공급원으로부터 유래할 수 있으며, 또는 보다 바람직하게는, 재조합체 공급원으로부터 유래할 수 있다.
한 실시양태에서, 트립신은 1 내지 5000mU/ml, 또는 5 내지 1000mU/ml, 또는 100 내지 500 mU/ml까지의 최종 농도로 세포 배양물에 첨가된다. 다른 실시양태에서, 트립신은 배양 배지 중의 1 내지 200㎍/ml, 또는 5 내지 50㎍/ml, 또는 5 내지 30㎍/ml 까지의 최종 농도로 세포 배양물에 첨가된다. 본 발명에 따른 방법의 단계 (iii)에 따라 감염된 세포 배양 조성물을 배양하는 동안, 회분식 공정 또는 유가 배양 공정의 경우에는 트립신을 새로 첨가함으로써, 관류 시스템의 경우에는 트립신 용액을 연속적으로 첨가하거나 간헐적으로 첨가함으로써 트립신을 재활성화시킬 수 있다.
감염 후, 상기 감염된 세포 배양물은 특히 최대 세포 변성 효과 또는 바이러스 및/또는 바이러스 항원의 최대량이 감지될 수 있을 만큼의 바이러스를 복제시키기 위해 추가로 배양된다. 특정 실시양태에서, 세포의 배양은 2일 내지 10일 동안 수행된다. 배양은 관류 시스템에서 수행될 수 있거나 또는 선택적으로 회분식 공정 또는 유가 배양 공정으로 번갈아 수행될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 세포는 인플루엔자 바이러스로 감염된 후 25℃ 내지 36℃, 또는 29℃ 내지 34℃의 온도에서 배양된다. 33℃ 미만의 온도, 그 중에서도 상기 지정된 온도 범위에서 상기 감염된 세포를 배양할 경우, 특정 인플루엔자 바이러스, 예컨대, B형 균주(예를 들어, 미국공개특허 제2006/0153872호 참조)를 보다 높은 수율로 생산할 수 있다. 추가로, 온도 감수성, 저온 적응성(ts/ca) 인플루엔자 바이러스를 생산하기 위해서는 35℃ 미만의 온도에서 감염된 세포를 배양할 수 있다는 점도 고려된다. ts/ca 바이러스는 약독화성(att)일 수도 있음도 고려된다. 또다른 실시양태에서, 세포는 ts/ca 인플루엔자 균주를 생산하기 위해 30℃ 이하, 또는 31℃ 이하 또는 32℃ 이하, 또는 33℃ 이하, 또는 34℃ 이하의 온도에서 배양된다. 특정 실시양태에서, 세포는 B형 인플루엔자 바이러스 균주를 생산하기 위해 31℃의 온도에서 배양된다.
인플루엔자 바이러스로 감염된 후의 세포 배양은(단계 (iii)) 예를 들어, 상기 기술된 바와 같이 순서대로 수행된다.
본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 생산된 바이러스의 수거 및 분리(단계 (iii))는 적절한 수율로 바이러스를 생산하기에 충분한 기간, 예컨대, 감염 후 2일 내지 10일, 또는 3일 내지 7일이 경과한 후에 수행한다. 바이러스는 통상 감염된 세포가 배양되었던 배양 배지로부터 회수된다. 보통, 인플루엔자 바이러스를 농축하기 이전에 원래의 배지(crude medium)를 정제시킨다. 통상적인 방법으로서는 여과, 한외여과, 황산 바륨 상에서의 흡착 및 용출, 그리고 원심분리를 포함한다. 예를 들어, 감염된 배양물의 원래의 배지는 먼저 세포의 잔해 및 다른 거대 과립 물질을 제거하기에 충분한 시간, 예로서 10분 내지 30분 동안, 예컨대 1000-2000×g에서 원심분리에 의해 정제될 수 있다. 다르게는, 배지는 손상되지 않고 온전한(intact) 세포와 다른 거대 과립 물질을 걸러내기 위해 0.8㎛ 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통해 여과된다. 선택적으로, 상기 정제된 배지 상등액은 이후 인플루엔자 바이러스를 펠릿화시키기 위하여 예컨대, 15,000×g에서, 대략 3-5시간 동안 원심분리된다. 적절한 완충액, 예를 들어, STE(0.01M Tris-HCl; 0.15M NaCl; 0.0001M EDTA) 또는 인산염 완충 식염수(PBS: Phosphate buffered saline)(pH 7.4) 중에 바이러스 펠릿을 재현탁시킨 후, 수크로스(60%-12%) 또는 포타슘 타르트레이트(50%-10%) 상에서의 밀도 구배 원심분리에 의해 바이러스를 농축시킬 수 있다. 연속 구배 또는 단계 구배, 예를 들어, 12% 내지 60% 사이의 4개의 12% 단계로 된 수크로스 구배가 적합하다. 상기 구배물을 회수를 위한 가시적인 밴드 내로 바이러스를 농축시키에 충분한 속도에서, 그리고 충분한 시간 동안 원심분리시킨다. 다르게는, 그리고, 가장 큰 규모의 상업적 이용을 위해서는, 연속식으로 작동하는 침강-원심분리 로터(zonal-centrifuge rotor)를 이용하여 밀도 구배로부터 바이러스를 현탁 분리한다. 조직 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법에 대하여 당업자에게 충분히 도움이 될 만한 추가적인 상세 정보는 예를 들어, 문헌 [Furminger, Textbook of Influenza pp. 324-332 Nicholson et al. (ed)]; [Merten et al., Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151 Cohen & Shafferman (ed)]과 미국등록특허 제5,690,937호에 제공된다. 필요하다면, 상기 회수된 바이러스를 수크로스-인산염-글루타메이트(SPG)와 같은 안정화제의 존재 하에 -80℃에서 저장할 수 있다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 바이러스는 벤조나아제
Figure 112009022767906-PCT00004
또는 다른 비특이적 엔도뉴클레아제로 처리된다. 선택적으로, 생산된 인플루엔자 바이러스의 수거 및 분리 단계 이전에 벤조나아제
Figure 112009022767906-PCT00005
처리를 실시한다. 본 방법의 다른 실시양태에서, 벤조나아제
Figure 112009022767906-PCT00006
처리 후 물질을 정제시킨다. 정제에 유용한 방법으로서 이에 제한되는 것은 아니지만, 직류식 여과법(DFF: direct flow filtration)을 포함한다. 생산된 인플루엔자 바이러스의 수거 및 분리((단계 (iii))를 위해 사용될 수 있는 추가적인 단계는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 접선 흐름식 여과(TFF: tangential flow filtration), 친화성 크로마토그래피 뿐만 아니라, 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 수산화인회석(hydroxyapatite) 크로마토그래피를 포함한다. 특정 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피가 본 방법에서 사용된다. 당업자라면, 예컨대 여러 바이러스와 바이러스성 단백질의 농축 및 정제를 위하여 유사한 분리 특성을 갖는 다양한 친화성 크로마토그래피 매질을 이용할 수 있다는 사실을 주지하고 있을 것이다. 특정 실시양태에서, 셀루파인™ 설페이트(키쏘 코포레이션(Chisso Corp.) 제조) 친화성 매질이 친화성 크로마토그래피에 사용된다. 또다른 실시양태에서, FluSelect(지이 헬스케어)가 친화성 크로마토그래피에 사용된다.한 실시양태에서, 바이러스는 친화성 크로마토그래피 공정과 동시에 벤조나아제
Figure 112009022767906-PCT00007
로 처리된다. 특정 실시양태에서, 막 크로마토그래피가 본 방법에서 사용된다. 특정 실시양태에서, 이온 교환 크로마토그래피가 본 방법에서 사용된다. 특정 실시양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피가 본 방법에서 사용된다. 특정 실시양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 높은 pH에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피가 본 방법에서 사용된다. 특정 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 낮은 pH에서 수행된다. 이온 교환 크로마토그래피에 유용한 음이온막으로서는, 이에 제한되지는 않지만, 음이온막 흡착제(예를 들어, Sartobind® Q15, D15) 및 양이온막 흡착제(예를 들어, Sartobind® S15 및 C15)를 포함한다. 다른 과정들은 하기 실시예 섹션에 예시되어 있다.
6.6 백신 조성물 및 사용법
본 발명은 추가로 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 바이러스(예컨대, 인플루엔자)에 관한 것이다. 이러한 바이러스는 인간 또는 동물에 투여하기 위한 백신을 제공하기 위해 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 바이러스는 손상되지 않고 온전한 바이러스 입자(예를 들어, 생 약독화성 바이러스)로서, 또는 불활성/붕괴(disintegrated) 바이러스(예를 들어, 포름알데히드 세정제로 처리된 것)로서 존재할 수 있다. 선택적으로, 규명된 바이러스 성분(예를 들어, 단백질)은 당업자에게 공지되어 있는 방법에 의해 바이러스로부터 분리되어 백신 제조에 사용될 수 있다. 백신 조성물용 불활성/붕괴 바이러스 입자의 생산 방법 및 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있어 지난 40년간 이용되어 왔다.
온전한 바이러스 입자(예를 들어, 생 약독화성 바이러스)의 제조 방법은 이에 제한되지는 않지만, 여과에 의한 최종 조제물로의 완충액 교환 단계와, 이후 멸균 단계를 비롯한 추가의 단계를 포함할 수 있다. 이러한 조제물에 유용한 완충액은 20OmM 수크로오스와, 아르기닌과 같은 다른 아미노산 부형제가 첨가된 pH 7.0-7.2의 인산염 완충액 또는 히스티딘 완충액을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 콜라겐 또는 젤라틴(예컨대, 돼지, 어류, 조류 젤라틴)과 같은 안정화 단백질 가수분해물이 첨가된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 최종 바이러스 용액/백신은 인플루엔자 백신 접종 시즌(예를 들어, 북반구에서 보통 대략 9월경부터 3월까지) 동안 "접종 현장"(예를 들어, 2-8℃, 4℃, 5℃ 등에서 냉장시켜 판매 및 상품화하는 현장)에서 저장하기에 충분한 시간 동안 액상 형태로 안정한 생 바이러스를 포함할 수 있다. 따라서, 바이러스/백신 조성물은 저장 기간 동안 그의 효능을 유지하거나, 허용가능한 정도로만 그의 효능이 퇴색될 것이 요구된다. 다른 실시양태에서, 그러한 용액/백신은 약 2℃ 내지 약 8℃, 예를 들어, 냉장 온도에서 액상 형태로 안정하다. 예를 들어, 냉장 온도에서 안정적인 약독화성 인플루엔자 백신을 제조하는 방법 및 조성물은 PCT 특허공보 WO 2006/041819에 기술되어 있으며, PCT 공보 WO 2005/014862도 참조할 수 있다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 1-5% 아르기닌; 1-4% 젤라틴; 5-10% 수크로스(선택적으로 인산염 완충액 중에); 0.01-0.1% 글루타민산(1나트륨, 1수화물); 10-150 mM 인산칼륨 및 80-150 mM 히스티딘 중의 하나 이상(하나 이상의 성분은 10% 이내에서 변동 가능)을 최종 조성물 중에 포함하는 냉장 온도에서 안정한 백신 조성물을 제공한다.
한 특정 실시양태에서, 백신 조성물은 1-2% 아르기닌; 2% 젤라틴; 7-10% 수크로스(선택적으로 인산염 완충액 중에); 및 100 mM 히스티딘 중의 하나 이상을 포함한다(하나 이상의 성분은 10% 이내에서 변동 가능). 또다른 특정 실시양태에서, 백신 조성물은 1-2% 아르기닌; 1% 젤라틴; 및 7-10% 수크로스 중의 하나 이상을 인산염 완충액 중에 포함한다(하나 이상의 성분은 10% 이내에서 변동 가능).
다른 특정의 실시양태에서, 본 발명은 수크로스 6-8% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1-2% w/v; 글루타민산, 1나트륨 1수화물 0.05-0.1% w/v; A형 돼지(또는 어류 또는 조류와 같은 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 0.5-2% w/v; 제2인산칼륨 1-2%; 및 제1인산칼륨 0.25-1% w/v 중의 하나 이상을 최종 조성물 중에 포함하는 냉장 온도에서 안정한 백신 조성물을 제공한다.
한 특정 실시양태에서, 백신 조성물은 수크로스: 6.84% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1.21% w/v; 글루타민산, 1나트륨 1수화물 0.094 w/v; A형 돼지(또는 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 1% w/v; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48% w/v 중의 하나 이상을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 백신 조성물은 수크로스: 6.84% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1.21% w/v; 글루타민산, 1나트륨 1수화물 0.094% w/v; A형 돼지(또는 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 1% w/v; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48% w/v를 모두 포함한다.
또다른 특정 실시양태에서, 백신 조성물은 수크로스 6.84% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1.21% w/v; 글루타민산, 1나트륨 1수화물 0.094% w/v; A형 돼지(또는 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 1% w/v; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48% w/v를 모두 포함한다(하나 이상의 성분은 10% 이내에서 변동 가능). 또다른 특정 실시양태에서, 백신 조성물은 수크로스 6.84% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1.21% w/v; A형 돼지(또는 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 1% w/v를 모두 포함한다(하나 이상의 성분은 10% 이내에서 변동 가능). 이러한 실시양태들에서, 조성물은 완충액(예를 들어, 인산칼륨 완충액(pH 7.0-7.2)) 중에 존재한다. 또다른 특정 실시양태에서, 백신 조성물은 수크로스 6.84% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1.21% w/v; 글루타민산, 1나트륨 1수화물 0.094% w/v; A형 돼지(또는 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 1% w/v; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48% w/v를 모두 포함한다(하나 이상의 성분은 20% 이내에서 변동 가능).
추가의 또다른 특정 실시양태에서, 백신 조성물은 수크로스 6.84% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1.21% w/v; 글루타민산, 1나트륨 1수화물 0.094% w/v; A형 돼지(또는 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 1% w/v; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48% w/v를 모두 포함한다(하나 이상의 성분은 30% 이내에서 변동 가능). 추가의 또다른 특정 실시양태에서, 백신 조성물은 수크로스 6.84% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1.21% w/v; 글루타민산, 1나트륨 1수화물 0.094% w/v; A형 돼지(또는 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 1% w/v; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48% w/v를 모두 포함한다(하나 이상의 성분은 40% 이내에서 변동 가능).
또다른 특정 실시양태에서, 백신 조성물은 수크로스 6.84% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1.21% w/v; 글루타민산, 1나트륨 1수화물 0.094% w/v; A형 돼지(또는 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 1% w/v; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48% w/v를 모두 포함한다(하나 이상의 성분은 1% 이내에서 변동 가능). 또다른 특정 실시양태에서, 백신 조성물은 수크로스 6.84% 중량/부피(w/v); 아르기닌 염산염 1.21% w/v; 글루타민산, 1나트륨 1수화물 0.094% w/v; A형 돼지(또는 다른 공급원)의 젤라틴 가수분해물 1% w/v; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48% w/v를 모두 포함한다(하나 이상의 성분은 3% 이내에서 변동 가능). 특정 실시양태에서, 백신 조성물은, 완충액으로 예를 들어, 인산칼륨(예를 들어, 50 mM 이상, 또는 100 mM 이상, 또는 200 mM 이상, 또는 250 mM 이상) 또는 대안으로, 히스티딘(예를 들어, 50 mM 이상, 또는 100 mM 이상, 또는 200 mM 이상, 또는 250 mM 이상)을 포함할 수 있다.
선택적으로, 상기 조성물의 액상 공급물이 건식 가열된 기체 스트림 하에서 미세한 액적으로 분사되는 분무 건조, 급속 건조 공정이 백신 제제의 저장 기간을 연장시키기 위하여 사용될 수 있다. 미세한 액적의 증발을 통해서, 용해되었던 용질로 구성된 건성 분말이 수득된다(예를 들어, 미국공개특허 제2004/0042972호 참조).
일반적으로, 바이러스 또는 바이러스 성분은 하나 이상의 바이러스 균주에 특이적인 면역 반응을 자극하기 위하여 적절한 담체 또는 부형제의 형태로 예방차원에서 투여될 수 있다. 보통, 담체 또는 부형제는 예컨대, 멸균수, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스 수용액, 글리세롤 수용액, 에탄올, 또는 이들의 혼합물과 같은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제이다. 멸균성, pH, 등장성 및 안정성을 확보한 이러한 용액의 제조는 당업계에 확립된 프로토콜에 따라 수행된다. 일반적으로, 담체 또는 부형제는 알레르기 반응 및 다른 부작용을 최소화하면서, 피하, 근육내, 비강내 등과 같은 특정 투여 경로에 맞도록 선택된다.
선택적으로, 바이러스, 또는 그의 성분들의 예방학적 투여를 위한 제제는 또한 인플루엔자 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기 위한 하나 이상의 애주번트를 함유한다. 적합한 애주번트는 사포닌, 미네랄 겔, 예컨대, 수산화알루미늄, 계면 활성 물질, 예컨대, 리솔레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중음이온(polyanion), 펩티드, 오일 또는 탄화수소 에멀젼, 바실 칼메테-구에린(BCG: bacille Calmette-Guerin), 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum) 및 합성 애주번트 QS-21과 MF59를 포함한다.
일반적으로, 백신 제제는 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 특이적인 면역 반응을 자극하기에 충분한 양으로 투여된다. 바람직하게는, 바이러스의 투여는 보호성 면역 반응을 유도한다. 하나 이상의 바이러스 균주에 대해 보호성 면역 반응을 유발하기 위한 투여량과 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 불활성화된 인플루엔자 바이러스는 약 1-1000 HID50(인간 감염 용량, human infectious dose)의 범위, 즉 투여량 당 약 105-108pfu(플라크 형성 단위, plaque forming units)로 제공된다. 다르게는, 약 10-50㎍, 예를 들면, 약 15㎍ HA가 애주번트없이 투여되며, 보다 적은 투여량은 애주번트와 함께 투여된다. 일반적으로, 투여량은 예를 들면, 나이, 신체 상태, 체중, 성별, 식이 요법, 투여 시간 및 다른 임상적 요인을 기초로 하여 상기 범위 내에서 조절될 것이다. 예방 백신 제제는 예를 들면, 주사 바늘과 주사기를 이용하여, 또는 주사 바늘이 없는 주사 장치를 이용하여 피하 또는 근육내 주사함으로써 전신 투여된다. 다르게는, 백신 제제는 액적, 큰 입자 에어로졸(약 10 미크론 초과)에 의해, 또는 상부 기도 내로의 분무에 의해 비강내 투여된다. 상기 전달 경로 중에서 어느 것이든 보호성 전신 면역 반응을 유도하지만, 비강내 투여는 인플루엔자 바이러스의 도입 부위에서 점막 면역성을 유발하는 추가적인 이점을 제공한다. 비강내 투여의 경우, 약독화성 생 바이러스 백신, 예를 들어, 약독화, 저온 적응성 및/또는 온도 감수성인 재조합 또는 재배열 인플루엔자 바이러스가 대개 바람직하다. 1회의 투여로 보호성 면역 반응을 자극시키는 것이 바람직하지만, 원하는 예방 효과를 달성하기 위해서는 추가의 용량을 동일하거나 상이한 경로로 투여할 수 있다. 이러한 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만, 오쏘믹소바이러스(A형 및 B형 인플루엔자 균주 포함), 파라믹소바이러스(RSV, 인간 메타뉴모바이러스 및 파라인플루엔자 포함), 랍도바이러스 및 플라보바이러스를 비롯한 임의의 바이러스에 대해서도 적응될 수 있다.
6.6.1 인플루엔자 바이러스
본원의 방법, 공정 및 조성물은 일차적으로 백신용 인플루엔자 바이러스의 제조에 관한 것이다. 인플루엔자 바이러스는 분절된 단일 가닥 RNA 게놈을 함유한 내부 리보핵산 단백질 코어와, 매트릭스 단백질에 의해 정렬된 외부 지질단백질 외피로 이루어진다. A형 및 B형 인플루엔자 바이러스 각각은 단일 가닥의 (-) 센스 RNA의 단편 8개를 함유한다. A형 인플루엔자 게놈은 11개의 폴리펩타이드를 코딩한다. 단편 1-3은 바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제를 구성하는 3개의 폴리펩타이드를 코딩한다. 단편 1은 폴리머라제 복합체 단백질 PB2를 코딩한다. 나머지 폴리머라제 단백질 PB1과 PA는 단편 2와 3에 의해 각각 코딩된다. 또한, 일부 인플루엔자 균주의 단편 1은, PB1 코딩 영역 내의 다른 리딩 프레임으로부터 생산되는 작은 단백질인 PB1-F2를 코딩한다. 단편 4는 감염시 세포 부착과 진입에 관여하는 헤마글루티닌(HA) 표면 당단백질을 코딩한다. 단편 5는 바이러스 RNA와 함께 주요 구조 성분인 뉴클레오캡시드 핵산단백질(NP) 폴리펩타이드를 코딩한다. 단편 6은 뉴라미니다아제(NA) 외피 당단백질을 코딩한다. 단편 7은 서로 다르게 스플라이싱된 mRNA들로부터 해독되는, M1과 M2로 명명되는 두 매트릭스 단백질을 코딩한다. 단편 8은 대체하여 스플라이싱된 mRNA 변이체들로부터 해독되는 두 비구조성 단백질인 NS1 과 NS2를 코딩한다.
B형 인플루엔자의 8개의 게놈 단편은 11개의 단백질을 코딩한다. 세 개의 가장 큰 유전자들이 RNA 폴리머라제의 성분인 PB1, PB2 및 PA를 코딩한다. 단편 4는 HA 단백질을 코딩한다. 단편 5는 NP를 코딩한다. 단편 6은 NA 단백질과 NB 단백질을 코딩한다. NB와 NA 두 단백질 모두 비스시스트로닉(biscistronic) mRNA의 중복된 리딩 프레임으로부터 해독된다. B형 인플루엔자의 단편 7은 두 단백질 M1과 M2도 코딩한다. 가장 작은 단편은 전장 RNA로부터 해독되는 NS1과, 스플라이싱된 mRNA 변이체로부터 해독되는 NS2의 두 생성물을 코딩한다.
재조합 바이러스는 마스터 도너 바이러스(MDV)로도 명명되는 인증된 마스터 균주와 관련하여 선택된 헤마글루티닌과 뉴라미니데아제 항원을 혼입시키기 위하여 제조된다. FluMist
Figure 112009022767906-PCT00008
는 승인된 저온 적응성, 약독화성 및 온도 감수성 MDV 균주(예로서, A/앤 아버/6/60 및 B/앤 아버/1/66)를 사용한다. 난을 기재로 하는(egg-based) 방법 및 보다 최근의 세포 배양 방법(예로서, PCT 공개번호 WO 03/091401; WO 05/062820과, 미국등록특허 제6,544,785호; 제 6,649,372호; 제6,951,754 및 미국특허출원 제11/455,818호, 제11/455,734호, 및 제11/501,067호 참조)을 비롯한 다수의 방법이 재조합 바이러스의 제조에 유용하다. 본 발명의 MDCK 세포, 배지 및 방법은, 이에 제한하지는 않지만, 본원에 개시된 인플루엔자 균주(예로서, A/앤 아버/6/60 및 B/앤 아버/1/66)를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 생산과, A/앤 아버/6/60, B/앤 아버/1/66, PR8의 유전자를 포함하는 재조합 바이러스를 비롯한 인플루엔자 바이러스의 생산을 위해 유용하다는 점도 고려된다. 추가로, 본 발명의 MDCK 세포, 배지 및 방법은 온도 감수성, 저온 적응성, 및 약독화성 표현형 중 하나 이상을 갖는 재조합 바이러스를 비롯한 인플루엔자 바이러스의 생산을 위해 유용하다는 점도 고려한다. 통상적인 재조합 기법, 예를 들면, 동시 감염(co-infection) 방법에 의해, 또는 선택적으로 플라스미드 레스큐(rescue) 기법에 의해 재조합체를 생성시킬 수 있다(예로서, PCT 공개번호 WO 03/091401; WO 05/062820와, 미국 특허번호 제6,544,785호; 제6,649,372호; 제6,951,754호; 제6,887,699호, 제6,001,634호, 제5,854,037호, 제5,824,536호, 제5,840,520호, 제5,820,871호, 제5,786,199호, 및 제5,166,057호; 미국공개특허 제20060019350호, 제20050158342호, 제20050037487호, 제20050266026호, 제20050186563호, 제20050221489호, 제20050032043호, 제20040142003호, 제 20030035814호 및 제20020164770호; 및 문헌 [Neumann et al. (1999) Generation of influenza A virus entirely from cloned cDNAs, Proc Natl Acad Sci USA 96:9345-9350]; [Fodor et al. (1999) Rescue of influenza A virus from recombinant DNA, J. Virol 73:9679-9682]; [Hoffmann et al. (2000) A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids, Proc Natl Acad Sci USA 97:6108-6113]; WO 01/83794; [Hoffmann and Webster (2000), Unidirectional RNA polymerase I-polymerase II transcription system for the generation of influenza A virus from eight plasmids, 81 :2843-2847]; 및 [Hoffmann et al. (2002), Rescue of influenza B viruses from 8 plasmids, 99(17): 11411-11416]를 참조할 수 있다).
따라서, 또다른 측면에서 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 하나 이상의 게놈 단편을 포함하는 MDCK를 제공한다. 특정 실시양태에서, 세포는 인플루엔자 바이러스의 게놈 단편 8개를 모두 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 8개의 게놈 단편은 각각 동일한 인플루엔자 바이러스에서 유래한다. 특정 실시양태에서, 상기 8개의 게놈 단편은 1개, 2개 또는 그 이상의 서로 다른 인플루엔자 바이러스들로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, 상기 8개의 게놈 단편은 당업자에게 공지된 비제한적인 임의의 인플루엔자 균주로부터 HA와 NA를 각각 코딩하는 두 단편과, 저온 적응성, 및/또는 온도 감수성 및/또는 약독화성 인플루엔자 바이러스로부터 나머지 게놈 단편을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포는 상기 기재된 임의의 간행물에 기술된 인플루엔자 게놈 단편이라면 어느 것이라도 포함한다.
7. 구체적인 실시양태
1. 마딘-다비 개과 신장(MCDK) 세포로서, 상기 MDCK 세포를 다수로 포함하는 세포 배양 조성물은 약독화성, 저온 적응성, 온도 감수성 인플루엔자 바이러스의 복제를 약 7.0 이상의 log10 TCID50/㎖(밀리리터 당 평균 조직 배양 감염 용량의 상용로그) 또는 약 7.0 이상의 log10 FFU/㎖(밀리리터 당 형광 포커스 유닛의 상용로그)까지 지원하는 것인 마딘-다비 개과 신장 세포.
2. 제1 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포는 약 7.2 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 7.2 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 MDCK 세포.
3. 제1 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포는 약 7.4 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 7.4 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 MDCK 세포.
4. 제1 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포는 약 7.6 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 7.6 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 MDCK 세포.
5. 제1 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포는 약 7.8 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 7.8 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 MDCK 세포.
6. 제1 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포는 약 8.0 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 8.0 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 MDCK 세포.
7. 제1 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포는 약 8.2 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 8.2 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 MDCK 세포.
8. 제1 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포는 약 8.4 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 8.4 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 MDCK 세포.
9. 제1 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포는 약 8.6 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 8.6 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 MDCK 세포.
10. 제1 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포는 약 8.8 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 8.8 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 MDCK 세포.
11. 제1 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포는 약 9.0 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 9.0 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 MDCK 세포.
12. 제1 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포는 무혈청 배지에서 증식시키는 것인 MDCK 세포.
13. 제1 실시양태에 있어서, 상기 무혈청 배지는 동물성 단백질을 함유하지 않는 배지인 것인 MDCK 세포.
14. 제1 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포는 부착성인 것인 MDCK 세포.
15. 제1 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포는 비부착성인 것인 MDCK 세포.
16. 제1 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포는 비종양형성성인 것인 MDCK 세포.
17. 제1 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포는 비종양원성인 것인 MDCK 세포.
18. 제1 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포는 미국 미생물 보존 센터(ATCC) 등록 번호 CCL34로 동정된 MDCK 세포주로부터 유래하는 것인 MDCK 세포.
19. 제1 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포는 상기 MDCK 세포는 미국 미생물 보존 센터(ATCC) 등록 번호 PTA-6500, PTA-6501, PTA-6502 또는 PTA-6503으로 동정된 MDCK 세포주로부터 유래하는 것인 MDCK 세포.
20. 제1 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포는 ATCC 등록 번호 PTA-7909 또는 PTA-7910으로 동정되는 것인 MDCK 세포.
21. 제1 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스인 것인 MDCK 세포.
22. 제1 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 B형 인플루엔자 바이러스인 것인 MDCK 세포.
23. 제1 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 저온 적응성 바이러스인 것인 MDCK 세포.
24. 제1 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 온도 감수성 바이러스인 것인 MDCK 세포.
25. 제1 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 약독화성 바이러스인 것인 MDCK 세포.
26. 제1 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 약독화성, 저온 적응성 및 온도 감수성 바이러스인 것인 MDCK 세포.
27. 제1 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 온도 감수성, 약독화성 및 저온 적응성 인플루엔자 바이러스의 유전자 단편을 하나 이상 포함하는 것인 MDCK 세포.
28. 제1 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 균주 A/앤 아버/6/60의 유전자 단편을 하나 이상 포함하는 것인 MDCK 세포.
29. 제1 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 B/앤 아버/1/66의 유전자 단편을 하나 이상 포함하는 것인 MDCK 세포.
30. 선행하는 실시양태들 중 어느 하나의 MDCK 세포를 SUB 시스템에서 약 1×106개 이상 세포/㎖의 세포 밀도로 증식시키는 방법으로서,
선행하는 실시양태들 중 어느 하나의 MDCK 세포를 이용하여 약 8×104개 내지 약 12×104개 세포/㎖의 접종 농도로 세포 배양 배지를 접종하는 단계와,
(a) 약 50 내지 150 rpm의 교반 속도;
(b) 약 6.0 내지 약 7.5의 pH;
(c) 약 35% 내지 약 100%의 용존 산소량(DO); 및
(d) 약 33℃ 내지 약 42℃의 온도
로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 배양 조건을 유지하면서 상기 세포를 배양시키는 단계
를 포함하는 방법.
31. 제30 실시양태에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 무혈청 배지인 것인 방법.
32. 제30 실시양태에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 동물성 단백질을 포함하지 않는 배지인 것인 방법.
33. 제30 실시양태에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 글루코스 보충된 MediV-105, 또는 M-32 또는 MediV-107인 것인 방법.
34. 제30 실시양태에 있어서, 상기 교반 속도는 약 90 내지 약 100 rpm인 것인 방법.
35. 제30 실시양태에 있어서, 상기 DO는 약 35% 내지 약 100%인 것인 방법.
36. 제30 실시양태에 있어서, 상기 온도는 약 36℃ 내지 약 38℃인 것인 방법.
37. 제30 실시양태에 있어서, 미세담체는 부착성 MDCK 세포를 배양하는데 사용되는 것인 방법.
38. 제37 실시양태에 있어서, 상기 미세담체 농도는 약 1 내지 약 4 g/L인 것인 방법.
39. 제30 내지 제38 실시양태들 중 어느 하나의 방법에 따라 제조된 세포 배양 조성물.
40. MCDK 세포 및 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양 조성물로서, 상기 배양 조성물은 약 7.0 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 7.0 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 세포 배양 조성물.
41. 제40 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포 배양 조성물은 약 7.2 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 7.2 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 세포 배양 조성물.
42. 제40 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포 배양 조성물은 약 7.4 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 7.4 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 세포 배양 조성물.
43. 제40 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포 배양 조성물은 약 7.6 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 7.6 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 세포 배양 조성물.
44. 제40 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포 배양 조성물은 약 7.8 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 7.8 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 세포 배양 조성물.
45. 제40 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포 배양 조성물은 약 8.0 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 8.0 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 세포 배양 조성물.
46. 제40 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포 배양 조성물은 약 8.2 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 8.2 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 세포 배양 조성물.
47. 제40 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포 배양 조성물은 약 8.4 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 8.4 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 세포 배양 조성물.
48. 제40 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포 배양 조성물은 약 8.6 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 8.6 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 세포 배양 조성물.
49. 제40 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포 배양 조성물은 약 8.8 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 8.8 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 세포 배양 조성물.
50. 제40 실시양태에 있어서, 상기 MDCK 세포 배양 조성물은 약 9.0 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 9.0 이상의 log10 FFU/㎖까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 것인 세포 배양 조성물.
51. 제40 실시양태에 있어서, 상기 세포 배양 조성물은 동물성 혈청을 포함하지 않는 것인 세포 배양 조성물.
52. 제40 실시양태에 있어서, 상기 세포 배양 조성물은 동물에서 정제된 단백질을 포함하지 않는 것인 세포 배양 조성물.
53. 제40 실시양태에 있어서, 상기 세포 배양 조성물은 재조합 발현 단백질을 포함하는 것인 세포 배양 조성물.
54. 제53 실시양태에 있어서, 상기 단백질은 하나 이상의 MDCK 세포에 의해 발현되는 것인 세포 배양 조성물.
55. 제53 실시양태에 있어서, 상기 단백질은 재조합 발현 시스템에서 발현된 후, 세포 배양 조성물에 첨가되는 것인 세포 배양 조성물.
56. 제53 실시양태에 있어서, 상기 재조합 발현 단백질은 인슐린 또는 트립신인 것인 세포 배양 조성물.
57. 제40 실시양태에 있어서, MDCK 세포의 적어도 일부는 부착성인 것인 세포 배양 조성물.
58. 제40 실시양태에 있어서, MDCK 세포는 부착성인 것인 세포 배양 조성물.
59. 제40 실시양태에 있어서, MDCK 세포의 적어도 일부는 비부착성인 것인 세포 배양 조성물.
60. 제40 실시양태에 있어서, MDCK 세포는 비부착성인 것인 세포 배양 조성물.
61. 제40 실시양태에 있어서, MDCK 세포는 비종양형성성인 것인 세포 배양 조성물.
62. 제40 실시양태에 있어서, MDCK 세포는 미국 미생물 보존센터(ATCC) 등록 번호 CCL34로 동정된 MDCK 세포주로부터 유도된 것인 세포 배양 조성물.
63. 제40 실시양태에 있어서, MDCK 세포는 미국 미생물 보존센터(ATCC) 등록 번호 PTA-6500, PTA-6501, PTA-6502 또는 PTA-6503으로 동정된 MDCK 세포주로부터 유도된 것인 세포 배양 조성물.
64. 제40 실시양태에 있어서, MDCK 세포는 ATCC 등록 번호 PTA-7909 또는 PTA-7910으로 동정되는 것인 세포 배양 조성물.
65. 제40 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스인 것인 세포 배양 조성물.
66. 제40 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 B형 인플루엔자 바이러스인 것인 세포 배양 조성물.
67. 제40 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 저온 적응성 바이러스인 것인 세포 배양 조성물.
68. 제40 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 약독화성 바이러스인 것인 세포 배양 조성물.
69. 제40 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 온도 감수성, 약독화성 및 저온 적응성 인플루엔자 바이러스의 유전자 단편을 하나 이상 포함하는 것인 세포 배양 조성물.
70. 제40 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 균주 A/앤 아버/6/60의 유전자 단편을 하나 이상 포함하는 것인 세포 배양 조성물.
71. 제40 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 B/앤 아버/1/66의 유전자 단편을 하나 이상 포함하는 것인 세포 배양 조성물.
72. 제40 실시양태에 있어서, MDCK 세포는 인플루엔자 바이러스를 복제하는 동안 약 25℃ 내지 약 33℃에서 배양되는 것인 세포 배양 조성물.
73. 제40 실시양태에 있어서, MDCK 세포는 검출가능한 종양성 DNA를 포함하지 않는 것인 세포 배양 조성물.
74. 제40 실시양태에 있어서, 상기 세포 배양 조성물은 검출가능한 미코플라스마를 포함하지 않는 것인 세포 배양 조성물.
75. 제40 실시양태에 있어서, 상기 세포 배양 조성물은 검출가능한 박테리아를 포함하지 않는 것인 세포 배양 조성물.
76. 제40 실시양태에 있어서, 상기 세포 배양 조성물은 인플루엔자 바이러스 이외의 검출가능한 바이러스를 포함하지 않는 것인 세포 배양 조성물.
77. 제40 실시양태에 있어서, 상기 검출가능한 바이러스는 개과 세포 또는 인간 세포를 감염시키는 바이러스인 것인 세포 배양 조성물.
78. 제40 실시양태에 있어서, MDCK 세포는 잠재적인 바이러스를 포함하지 않는 것인 세포 배양 조성물.
79. 제40 실시양태에 있어서, MDCK 세포는 레트로바이러스를 포함하지 않는 것인 세포 배양 조성물.
80. 제40 실시양태에 있어서, MDCK 세포는 약 1×105개 이상 세포/mL의 세포 밀도로 성장하는 것인 세포 배양 조성물.
81. 제40 실시양태에 있어서, MDCK 세포는 약 5×105개 이상 세포/mL의 세포 밀도로 성장하는 것인 세포 배양 조성물.
82. 제40 실시양태에 있어서, MDCK 세포는 약 1×106개 이상 세포/mL의 세포 밀도로 성장하는 것인 세포 배양 조성물.
83. 제40 실시양태에 있어서, MDCK 세포는 약 2.5×106개 이상 세포/mL의 세포 밀도로 성장하는 것인 세포 배양 조성물.
84. 제40 실시양태에 있어서, MDCK 세포는 약 5×106개 이상 세포/mL의 세포 밀도로 성장하는 것인 세포 배양 조성물.
85. (a) 제40 내지 제84 실시양태들 중의 어느 하나의 세포 배양 조성물을 인플루엔자 바이러스로 감염시키는 단계;
(b) 인플루엔자 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에 상기 세포 배양 조성물을 배양하는 단계; 및
(c) 상기 세포 배양 조성물로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계
를 포함하는, 세포 배양물에서 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법.
86. 제85 실시양태에 있어서, 단계 (a) 동안 또는 이전에는 세포 배양물에 신선한 배지 또는 추가의 배지 성분을 첨가하는 것인 방법.
87. 제85 실시양태에 있어서, 단계 (a) 동안 또는 이전에는 세포 배양 배지의 일부를 제거하여 신선한 배지로 대체하거나, 세포 배양 배지를 제거하는 일 없이 신선한 배지로 대체하는 것인 방법.
88. 제85 실시양태에 있어서, 단계 (a)는 약 0.00001 내지 약 0.00003 FFU/세포의 감염다중도(MOI)로 수행하는 것인 방법.
89. 제85 실시양태에 있어서, 단계 (a)는 약 0.0001 내지 약 0.0003 FFU/세포의 MOI로 수행하는 것인 방법.
90. 제85 실시양태에 있어서, 단계 (a)는 약 0.001 내지 약 0.003 FFU/세포의 MOI로 수행하는 것인 방법.
91. 제85 실시양태에 있어서, 상기 단계 (b)의 조건은
(a) 약 50 내지 150 rpm의 교반 속도;
(b) 약 6.0 내지 약 7.5의 pH;
(c) 약 35% 내지 약 100%의 용존 산소량(DO); 및
(d) 약 30℃ 내지 약 35℃의 온도
로 이루어진 군으로부터 선택하는 것인 방법.
92. 제85 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 약 7.0 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 7.0 이상의 log10 FFU/㎖까지 복제하는 것인 방법.
93. 제85 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 약 7.2 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 7.2 이상의 log10 FFU/㎖까지 복제하는 것인 방법.
94. 제85 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 약 7.4 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 7.4 이상의 log10 FFU/㎖까지 복제하는 것인 방법.
95. 제85 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 약 7.6 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 7.6 이상의 log10 FFU/㎖까지 복제하는 것인 방법.
96. 제85 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 약 7.8 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 7.8 이상의 log10 FFU/㎖까지 복제하는 것인 방법.
97. 제85 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 약 8.0 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 8.0 이상의 log10 FFU/㎖까지 복제하는 것인 방법.
98. 제85 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 약 8.2 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 8.2 이상의 log10 FFU/㎖까지 복제하는 것인 방법.
99. 제85 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 약 8.4 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 8.4 이상의 log10 FFU/㎖까지 복제하는 것인 방법.
100. 제85 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 약 8.6 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 8.6 이상의 log10 FFU/㎖까지 복제하는 것인 방법.
101. 제85 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 약 8.8 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 8.8 이상의 log10 FFU/㎖까지 복제하는 것인 방법.
102. 제85 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 약 9.0 이상의 log10 TCID50/㎖ 및/또는 약 9.0 이상의 log10 FFU/㎖까지 복제하는 것인 방법.
103. 제85 실시양태에 따라 제조된 인플루엔자 바이러스.
104. 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 중에 제103 실시양태의 인플루엔자 바이러스의 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물.
105. 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 중에 제103 실시양태의 인플루엔자 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물.
106. 제105 실시양태에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 냉장 온도에서 안정한 것인 면역원성 조성물.
107. (a) 친화성 크로마토그래피 매질 상에 DNA 오염물이 보유되지 않고, 바이러스 조제물에 존재하는 바이러스가 보유되도록 하는 조건 하에 상기 바이러스 조제물을 친화성 크로마토그래피 매질에 통과시키는 단계;
(b) 상기 친화성 크로마토그래피 매질을 세척하여 DNA 오염물을 제거하는 단계; 및
(c) 상기 친화성 크로마토그래피 매질로부터 바이러스 조제물에 존재하는 바이러스를 용출시키는 단계
를 포함하는, 바이러스 조제물로부터 DNA 오염물을 제거하는 방법.
108. 제107 실시양태에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피 매질은 셀루파인 설페이트 수지인 것인 방법.
109. 제107 실시양태에 있어서, 단계 (a)와 (b) 사이에서는 친화성 크로마토그래피 매질에 비특이적 엔도뉴클레아제 조제물을 통과시키는 것인 방법.
110. 제108 실시양태에 있어서, 상기 비특이적 엔도뉴클레아제는 pH가 약 7.2인 1X SP 완충액 중에 벤조나아제를 포함하는 벤조나아제 조제물인 것인 방법.
111. 제107 실시양태에 있어서, 상기 바이러스 조제물은 인플루엔자 바이러스 조제물인 것인 방법.
112. 제108 실시양태에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 조제물은 포유동물 세포로부터 제조되는 것인 방법.
113. 제112 실시양태에 있어서, 상기 포유동물 세포는 MDCK 세포 또는 Vero 세포, 또는 PerC6 세포인 것인 방법.
114. 제107 실시양태에 있어서, 단계 (a)에서 사용되는 조건은 pH가 약 7.2인 1X SP 완충액인 것인 방법.
115. 제107 실시양태에 있어서, 상기 바이러스 조제물에 존재하는 바이러스는 약 1M NaCl을 함유하는 pH 약 7.2인 1X SP 완충액에서 용출되는 것인 방법.
8. 실시예
이제 본 발명을 하기 실시예를 참고로 기술한다. 이들 실시예는 예시의 목적으로 제시되는 것일 뿐, 본 발명이 어떤 경우라도 이러한 실시예에 제한되는 것으로 해석되어서는 안될 것이며, 오히려 본원에 제공되는 교시의 결과로서 명백해지는 사실이 되는 그 어떤 변형이라도, 그리고 그 모든 변형도 본원에 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
8.1 실시예 1: 혈청을 함유하는 배지에서 높은 바이러스 복제율을 지원하는 MDCK 세포주의 동정
본 실시예는 MDCK 세포주가 10% 소태아혈청(FBS)을 포함하는 둘베코의 개량된 이글 배지(DMEM) 중에서 배양될 경우, 높은 역가까지 인플루엔자 바이러스의 복제를 지원하는 MDCK 세포주의 동정 및 선별 과정을 기술한다. 그 절차는 도 5A에 개괄되어 있다.
ATCC에서 입수한 MDCK 세포(ATCC 등록 번호 CCL-34; 로트번호 1805449; 계대배양수 54)의 바이알 1개를 해동시켜 L-글루타민과 10% 소태아혈청(FBS, 성분 규명됨)이 첨가된 둘베코의 개량된 이글 배지(DMEM) 10㎖를 함유하는 T-25 플라스크(코닝(Corning) 사 제조) 내로 접종하였다. 세포(계대배양수 55)를 37±1℃, 5±1% CO2 환경에서 3일 동안 배양하였다. 3일째 되는 날, 상기 세포를 T-225 플라스크로 계대배양시켰다(계대배양수 56). 접종한 후 3일째 되는날, 세포를 4×T-225 플라스크로 계대배양시켰다(계대배양수 57). T-25 또는 T-225 플라스크 중의 L-글루타민과 10% FBS가 첨가된 DMEM에서의 각각의 계대배양에 있어서, 그 절차는 하기와 같았다.
세포를 Ca2+과 Mg2+가 없는 둘베코의 인산염 완충 식염수(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS)로 세척하고, 1.5㎖(T-25용) 또는 7.5㎖(T-225용)의 트립신 0.25%를 상기 세포에 첨가하였다. 상기 세포 단층을 배양하여 15분 내지 20분간 놔두고, 이 때 L-글루타민과 10% FBS가 첨가된 DMEM 1.5㎖(T-75 플라스크용) 또는 7.5㎖(T-225 플라스크용)를 첨가하여 트립신을 중화시켰다. 이후 상기 세포를 혈구 계산기를 이용하여 계수하여 1㎖당 5×104개 세포를 접종하는데 필요한 양을 L-글루타민과 10% FBS가 첨가된 DMEM 100㎖를 함유하는 T-225 플라스크로 옮긴 후, 상기와 같이 3일간 배양하였다. 4×T-225 플라스크의 세포를 트립신 처리하고, 풀(pool)을 구성한 후, 혈청을 함유한 성장 배지를 상기와 같이 첨가하였다. 이후, 상기 세포를 혼합하고 계수하였다. 상기 세포 현탁액을 원심분리하고 세포 펠릿을 L-글루타민과 10% FBS가 첨가된 10㎖의 DMEM로 재현탁시켰다. 상기 현탁액을 다시 계수하였다. 10㎖의 2X동결 배지(L-글루타민이 첨가된 10% FBS DMEM 및 15% v/v 디메틸 설폭사이드)를 첨가하고, 세포를 완전히 혼합한 후, 20개의 냉동 바이알(cryovial)에 1㎖씩 분취하였다. 상기 세포를 날진 냉동기(Nalgene freezer container)에서 -80℃로 동결시킨 후, 액체 질소 증기 상에서의 저장을 위해 옮겼다. 상기 동결된 세포는 57번째 계대배양에서의 MDCK 세포에 해당하며 본원에서는 MDCK Pre-MCB 로트(lot) 1로 지정하였다.
다음으로, MDCK Pre-MCB 로트 1의 바이알 1개를 해동시켜 35㎖의 DMEM와 10% FBS를 포함하는 T-75 플라스크로 접종하였다. 세포(계대배양수 58)를 37℃, 5% CO2 환경에서 3일 동안 배양하였다. 3일째 되는 날, 상기 세포를 2×T-225 플라스크로 계대배양시켰다(계대배양수 59). 접종한 후 3일째 되는날, 세포를 4×T-225 플라스크로 계대배양시켰다(계대배양수 60). 접종한 후 3일째 되는 날, 배지를 전부 교환하였다. 접종한 후 4일째 되는 날, 세포를 25×T-225 플라스크로 계대배양하였다(계대배양수 61). T-75 또는 T-225 플라스크 중의 L-글루타민과 10% FBS가 첨가된 DMEM에서 각각의 계대배양에 있어서, 그 절차는 하기와 같았다.
세포를 Ca2+과 Mg2+가 없는 둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 세척하고, 3㎖(T-75용) 또는 7.5㎖(T-225용)의 트립신 0.25%를 상기 세포에 첨가하였다. 상기 세포 단층을 배양하여 15분 내지 20분간 놔두고, 이 때 L-글루타민과 10% FBS가 첨가된 DMEM 3㎖(T-75 플라스크용) 또는 7.5㎖(T-225 플라스크)를 첨가하여 트립신을 중화시켰다. 이후 상기 세포를 혈구 계산기를 이용하여 계수하여 1㎖당 5×104개 세포를 접종하는데 필요한 양을 L-글루타민과 10% FBS가 첨가된 DMEM 100㎖를 포함하는 T-225 플라스크로 옮긴 후, 상기와 같이 3일간 배양하였다. 24 또는 25×T-225 플라스크의 세포를 트립신 처리하고, 풀을 구성한 후, 혈청을 함유한 성장 배지를 첨가하였다. 상기 세포 현탁액을 원심분리하고 세포 펠릿을 L-글루타민과 10% FBS가 첨가된 50㎖의 DMEM로 재현탁시켰다.
이후 상기 현탁액을 계수하였다. 1×107개 세포/㎖의 세포 현탁액 60㎖를 제조하기 위해, 39.5㎖의 세포 현탁액을 20.5㎖의 10% FBS DMEM 배지와 혼합하였다. 60㎖의 2X동결 배지(L-글루타민이 첨가된 10% FBS DMEM 및 15% v/v 디메틸 설폭사이드)를 1×107개 세포/㎖의 세포 현탁액 60㎖에 첨가하고, 세포를 완전히 혼합한 후, 100개의 냉동 바이알에 1㎖씩 분취하였다. 상기 세포를 날진(Nalgene) 냉동기에서 -60℃로 동결시킨 후, 액체 질소에서 저장하기 위해 옮겼다. 상기 동결된 세포는 61번째 계대배양에서의 MDCK 세포에 해당한다. 이들 바이알은 MDCK Pre-MCB 로트 2로 지정하였다. 상기 은행을 ATCC에 기탁하였고, 이는 ATCC 등록 번호 PTA-6500으로 동정된다.
다음으로, MDCK Pre-MCB 로트 2(계대배양수 61)의 바이알 1개를 해동시켜 35㎖의 DMEM와 10% FBS를 포함하는 T75 플라스크로 접종하였다. 세포(계대배양수 62)를 37℃, 5% CO2 환경에서 3일 동안 배양하였다. 3일째 되는 날, 상기 세포를 2×T-75 플라스크로 계대배양시켰다(계대배양수 63). 새로운 T-75 플라스크로 3번의 추가 계대배양을 수행한 후 T-225 플라스크로 계대배양하였다(계대배양수 67).
다음으로, 상기 세포를 트립신 처리하고 희석법에 의해 클로닝하였다. 특히, 상기 세포를 96 웰 플레이트에서 0.5개 세포/웰/100μL로 접종하였다(신선한 배지와 기존의 배지는 1:1 비율). 다음날, 세포를 현미경으로 관찰하여 하나의 세포를 보유하고 있는 웰을 확인한 후, 플레이트를 다시 배양시켰다. 배양 후 7일째 되는 날, 상기 플레이트를 확인하여 세포 성장을 평가하여 추가의 100μL의 신선한 성장 배지를 각 웰에 첨가하였다. 3일 후, 완전한 배지 교환(웰 당 200 μL)을 수행하였다. 초기의 클로닝 접종 후 2주째 되는 날, 세포를 트립신 처리하여 이들이 100% 융합에 다다르는 경우, 24 웰 플레이트의 2세트로 계대배양시켰다. 세포가 100% 융합을 달성하지 못하는 경우, 신선한 성장 배지를 다시 공급하였다.
클론을 순차적으로 확대시키고(24 웰 플레이트 → T-25 플라스크 또는 6 웰 플레이트 → T-75 또는 T-225 플라스크), 하기 표 1에 나타난 바와 같이 총 54개의 클론을 선별하여 7.5% DMSO가 첨가된 10% FBS DMEM에서 클로닝 후 4번째 또는 5번째 계대배양에서 동결시켜 액체 질소에 보관하였다. 추가로, 클론 56, 57 및 58을 반드시 상기 기술된 바와 같이 수행한 2회째의 스크리닝으로부터 분리하였다.
54개의 혈청 MDCK 클론 목록(동결 순서)
클론 ID 클론 ID 클론 ID 클론 ID 클론 ID 클론 ID
1 10 19 28 37 46
2 11 20 29 38 47
3 12 21 30 39 48
4 13 22 31 40 49
5 14 23 32 41 50
6 15 24 33 42 51
7 16 25 34 43 52
8 17 26 35 44 53
9 18 27 36 45 54
상기 제조된 24 웰 플레이트의 세트 중 하나를 이용하여 클론의 바이러스 생산성에 대한 1차 스크리닝을 수행하였다. 이를 위해, 4 mM 글루타민이 첨가된 DMEM에서 3일간 배양된 세포를 인플루엔자 균주인 A/뉴 칼레도니아 재조합체를 이용하여 0.001의 MOI에서 감염시켰다. 500 mU/ml의 TPCK 트립신을 감염과 동시에 1회 첨가하였다. 바이러스 역가를 하기 실시예 5에 기술된 바와 같은 반자동화 TCID50 분석법(샘플 당 n=12)을 이용하여 측정하였다. 각 클론에서 수득된 바이러스 역가는 표 2에 나타난 바와 같은 분포인 7.0 내지 8.5였다.
10% FBS를 포함하는 DMEM 에서 성장한 54개의 클론의 바이러스 역가 분포
역가 범위(Log10 TCID50/mL) 클론의 수(총 54개)
7.0-7.5 6
7.6-8.0 35
8.1-8.5 12
>8.5 1
상기 바이러스 생산성 데이터에 기초하여, 6개의 클론(클론 1, 5, 36, 39, 40 및 55)을 추가의 분석을 위해 선별하였다. 상기 클론들을 T-플라스크에서 증식시키고, 감염 후 배지(바이러스 균주 당 2개의 플라스크)로서 DMEM + 4 mM 글루타민을 이용하여 MOI 0.001에서 A/뉴 칼레도니아, A/파나마 및 B/길림 재조합체로 세트 T-25(클론 당 8개의 플라스크)를 감염시켰다. 이들 플라스크를 감염 후 4일째에 수거하고 각 플라스크의 시료를 실시예 5의 반자동화 TCID50 분석법(플라스크 당 n=12, 바이러스 균주 당 n=24)을 이용하여 유효성에 대해 분석하였다. 이들 실험 결과를 도 1에 나타냈는데, 이 도면은 재조합체 A/뉴 칼레도니아에 대해 가장 높은 수율을 내는 생산자인 클론 1과 55가 A/파나마와 B/길림 재조합체에 대해서도 가장 높은 수율을 내는 생산자임을 보여준다. 따라서, 추가의 서브클로닝과 무혈청 배지에의 적응을 위해 클론 1을 선택하였다.
상기 기술된 바와 같이 수행된 추가적인 스크리닝 가동에서, 높은 역가의 A/뉴 칼레도니아를 생산하는 능력에 대하여 1000개 이상의 클론이 스크리닝되었다. 이들 클론들 중 높은 역가의 A/파나마와 B/길림 재조합체를 생산하는 능력에 대해 63개가 스크리닝 되었고, 클론 1보다 더 많은 바이러스를 생산하는 것은 없었다. 따라서, 추가의 연구에서 이들 클론을 선택하지 않았고, 이들 클론에 대한 데이터도 본원에 제공되어 있지 않다.
다음으로, 클론 1(P4/P71, 단일 클론으로부터 분리 이후에 4번의 계대배양, 총 계대배양수 71))을 해동하여 L-글루타민이 첨가된 둘베코의 개량된 이글 배지/Ham F12(DMEM/F12)와 10% FBS를 35㎖로 함유하는 T-75 플라스크에 접종하였다. 세포를 37℃, 5% CO2 환경에서 3일간 배양하였다. 3일째 되는 날, 상기 세포를 T-225 플라스크로 계대배양하였다. 이후 세포를 접종 후 매 3일 또는 4일 간격으로 T-75 또는 T-225 플라스크에서 8회 계대배양하였다. 이들 계대배양 후, 상기 세포(P13/P80)를 트립신 처리하고 하기와 같이 희석법에 의해 서브클로닝하였다.
상기 세포를 10×96 웰 플레이트(신선한 배지와 기존의 배지의 비율은 1:1)에서 0.5개 세포/웰/100μL로 접종하였다. 다음날, 세포(P1/P81, 서브클론 이후 P1, 총 계대배양수 P81)를 현미경으로 관찰하여 웰당 하나의 세포를 포함하고 있는 웰들을 표시하였다. 상기 세포들을 7일간 성장하게 놔둔 후, 플레이트에 표시된 웰이 성장하는 세포를 포함하고 있는지를 검사하였다. 동시에 세포에 100μL의 신선한 성장 배지를 공급한 후, 완전한 배지 교환(웰당 200μL)을 3일 후에 수행하였다. 1차 세포 접종 후 2주가 지났을 때, 단일 세포 클론을 트립신 처리하여 이들이 >50%의 융합을 달성하는 경우에 96 웰 플레이트에 계대배양시켰다. 50% 이하의 융합율을 보이는 세포들에게는 신선한 성장 배지를 공급하여 더 성장하도록 하였다. >50%의 융합율을 달성한 클론을 순차 확대(24 웰 플레이트 → 6 웰 플레이트 → T-75 플라스크)시켜 7.5% DMSO가 첨가된 10% FBS DMEM/F12에서의 1차 서브클로닝의 가동 이후 5번째 또는 6번째 계대배양시에 총 63개의 서브클론을 동결시켜 액체 질소에 보관하였다.
클론이 증식하는 동안, 0.001의 MOI에서 바이러스 감염(A/파나마 및 B/길림 재조합체)을 위해 3×96 웰 플레이트에도 클론을 세팅하였다. 세포를 4 mM 글루타민이 첨가된 DMEM/F12에서 성장시키고, 상기 세포를 감염 후 배지로서 4 mM 글루타민이 첨가된 DMEM/F12를 이용하여 접종 후 3일째 되는 날에 감염시킨 후, 바이러스를 감염 후 4일째에 수거하여 수크로스 인산염으로 안정화시켰다. A/파나마 바이러스 역가를 하기 실시예 4에 기술된 FFA 분석법을 이용하여 측정하였다. 각 서브클론에 의해 생성된 A/파나마 바이러스 역가는 하기 표 3에 보여진 바와 같은 7.0 내지 8.5의 분포를 보였다.
DMEM + 10% FBS에서 성장한 클론 1의 서브클론 63개의 바이러스 역가 분포
역가 범위(Log10 FFU/ml) 서브클론의 수(총 63개)
<6.1 28
6.2-6.9 18
7.0-7.5 13
≥7.6(8.0 이하) 4
63개의 클론 중에서, MDCK 서브클론 1-A(P6/P86), 서브클론 1-B(P5/P85) 및 서브클론 1-C(P6/P86)는 7.6 log10 FFU/ml의 바이러스 역가를 만들어 낸 반면, 서브클론 1-D는 7.8 log10 FFU/ml의 바이러스 역가를 나타냈다.
8.2 실시예 2: MDCK 세포 클론의 무혈청 배지에서의 성장 적응
본 실시예는 MDCK 클론 1, 55, 56, 57 및 58과 서브클론 1-A, 1-B(P5/P85), 1-C 및 1-D의 MediV 105 무혈청 배지에서의 성장 적응에 대해 기술한다. 클론 56, 57 및 58을 MDCK 세포(ATCC 등록 번호 CCL-34)로부터 유도시켜 실시예 1에 기술된 것과 유사한 방식으로 혈청을 함유하는 배지에서 성장하도록 적응시켰다. 그 절차가 도 5B에 개괄되어 있다.
먼저, MDCK 클론의 서브클론 1-D(서브클론 이후 5번째 계대배양시 동결시킴, 총 계대배양수 P85)의 바이알 1개를 해동시켜, L-글루타민과 10% 소태아혈청(FBS, 성분 규명됨)이 첨가된 둘베코의 개량된 이글 배지/Ham F12(DMEM/F12) 35㎖를 포함하는 T-75 플라스크에 접종하고, 37℃, 5% CO2 환경에서 3일간 배양하였다. 3일째 되는 날, 상기 세포를 T-225 플라스크에 계대배양시켰다(계대배양수 7/P87). 다음으로, 상기 MDCK 서브클론 D 세포를 5회의 계대배양 동안 무혈청 배지 MediV 105에 적응시켰다.
MediV 105에서 5회 계대배양시, 세포를 동결시켜 엑세스 세포 은행에 저장하였다. 추가로, MediV 105 무혈청 배지에서의 세포 안정성을 검사하기 위해 세포(클론 1-D)의 플라스크 하나를 세팅하였다. SF MDCK 서브클론 D 세포는 MediV 105 무혈청 배지에서 8번째 계대배양 이후 사멸하기 시작하였다.
추가로, 혈청 MDCK 클론 1, 55, 56, 57 및 58과 서브클론 1-A, 1-B (P5/P85) 및 C를 MediV 105 무혈청 배지에 적응시켰다. 먼저, 혈청 MDCK 클론 1, 55, 56, 57 및 58과 서브클론 1-A, 1-B (P5/P85) 및 C를 각각 바이알 1개씩 해동시켜 35㎖의 10 % FBS DMEDM/F12 배지를 포함하는 T-75 플라스크에 접종한 후, 37℃, 5% CO2 환경에서 3일간 배양하였다. 상기 세포를 트립신 처리하고 5×104개 세포/mL의 접종 농도로 새로운 T-225 플라스크에 접종하였다. 접종 후 3일째 되는 날, 세포를 혈청을 함유하는 배지의 T-75 플라스크에 계대배양시켰다.
T-75 또는 T-225 플라스크 중의 L-글루타민과 10% FBS가 첨가된 DMEM/F12에서 각각의 계대배양에 있어서, 그 절차는 하기와 같았다. 세포를 Ca2+과 Mg2+가 없는 둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 2회 세척하고, 3㎖(T-75용) 또는 7.5㎖(T-225용)의 TrypLE를 상기 세포에 첨가하였다. 상기 세포 단층을 배양하여 15분 내지 20분간 놔두고, 이 때 L-글루타민이 첨가된 10% FBS DMEM 3㎖(T-75 플라스크용) 또는 7.5㎖(T-225 플라스크용)를 첨가하여 TrypLE 활성을 중화시켰다. 이후 상기 세포를 Cedex 세포 계수기를 이용하여 계수하고, 1㎖당 5×104개 세포를 접종하는데 필요한 양을, L-글루타민이 첨가된 10% FBS DMEM 35㎖(T-75) 또는 100㎖(T-225)의 부피로 하기에 충분한 배지를 포함하는 T-75 또는 T-225 플라스크로 옮긴 후, 상기와 같이 3일간 또는 4일간 배양하였다.
다음으로, T-75 플라스크(해동 후 혈청 배지에서 3번의 계대배양을 수행) 중의 각각의 클론을 MediV 105 무혈청 배지에서 성장하도록 적응시켰다. T-75 플라스크의 세포를 35㎖의 MediV 105를 포함하는 T-75 플라스크에서 3번 계대배양시켰다. 4번째 계대배양에서, 상기 세포를 100㎖의 MediV 105를 포함하는 T-225 플라스크로 계대배양시켰다. T-225 플라스크의 세포를 5번째 계대배양에 있어서 세포 계수를 기준으로 2 또는 3×T-225 플라스크에 접종하였다. 접종 후 3일째 또는 4일째 되는 날에, 클론 1, 56 및 57과, 서브클론 1-A, 1-B, 1-C 및 1-D를 동결시켜 엑세스 세포 은행에 저장하였다. 세포를 기탁하기 전에 클론 55 및 58을 각각 무혈청 배지에서 추가로 계대배양하였다.
T-75 또는 T-225 플라스크 중 MediV 105 무혈청 배지에서의 각각의 계대배양에 있어서, MediV 105로의 제1 계대배양의 절차는 하기와 같다. 바이알 해동 후 계대배양수 3의 세포를 포함하는 T-75 플라스크의 사용된 배지를 제거, 상기 세포를 DPBS로 세척하고, 3㎖의 TrypLE을 첨가하여 세포를 배양해 15-20분간 놔두었다. 이후, 3㎖의 리마콩 트립신 저해제 용액(워딩톤(Worthington))을 첨가하여 TrypLE를 중화시키고, 상기 세포를 Cedex 세포 계수기로 계수하였다. 배지 ㎖당 5×104개 세포를 접종하는데 필요한 양의 세포를 35㎖의 MediV 105를 포함하는 T-75 플라스크로 옮겼다. 모든 플라스크를 37℃, 5% CO2 환경에서 3-4일간 배양하고, 이때, 2.5㎖(T-75용) 또는 5㎖(T-225)의 TrypLE을 사용하는 것을 제외하고는 상기 기술된 바와 같이 상기 세포를 다시 효소적으로 분리시킨 후, TrypLE 활성을 중지시키기 위해 2.5㎖(T-75용) 또는 5㎖(T-225)의 리마콩 트립신 저해제 용액을 사용하고, 세포 현탁액을 신선한 무혈청 배지가 첨가된 플라스크로 옮겼다. 모든 접종은 배지 ㎖당 5×104개 세포를 접종하도록 계산하였다.
각 클론/서브클론을 세포 은행에 저장하는 절차는 하기와 같다: 여러 플라스크의 세포들을 트립신 처리하고, 풀을 구성한 후, 트립신 중화 용액을 첨가하였다. 이후 상기 세포들을 혼합하여 계수하였다. 세포를 원심분리하고, 남겨놓은 폐배지에서 재현탁시켜 세포 현탁액 1㎖당 5×104개 세포를 포함하도록 제조하였다. 다음으로, 2×동결 배지(15% v/v 디메틸 설폭사이드가 첨가된 MediV 105, 폐배지와 동일부피)를 첨가하여 상기 세포를 완전히 혼합하고, 1㎖의 분취액을 2㎖ 크기의 냉동 바이알에 넣었다. 이들 바이알을 SF MDCK 엑세스 세포 은행으로 지정하였다. 상기 세포를 날진 냉동기에서 -60℃로 동결시킨 후, 액체 질소로 옮겨 보관하였다. 도 5는 클론 1과 서브클론 1-B에 대한 전반적인 선별과 적응 공정을 보여주는 순서도이다.
세포 은행에 저장함과 더불어, 무혈청 배지에서의 세포 성장 안정성과 바이러스 감염성 연구를 위해 각각의 무혈청 적응된 클론의 T-75 플라스크를 세팅하였다. 본 연구에서, 세포를 배지 1㎖당 5×104개 세포로 접종하여 접종 후 매 3일 또는 4일마다 계대배양하였다. 클론 56 및 57은 MediV 105에서 6번째 계대배양시 사멸하기 시작했다.
나머지 각각의 클론과 서브클론들을 MediV 105에서 계속하여 배양하였다. 계대배양수 9 또는 10에서, 각 클론에 대해 5×T75 플라스크를 바이러스 감염을 위해 세팅하였다. 감염 후 배지로서 4mM 글루타민 + 500 mU/ml TPCK 트립신이 첨가된 DMEM/F12를 이용하여, 0.001의 MOI에서 A/뉴 칼레도니아, A/히로시마, B/말레이시아 및 A/베트남의 재조합체로 상기 클론을 감염시겼다. 바이러스를 감염 후 3일 또는 4일째 되는 날에 수거하고 10×수크로스 인산염 완충액으로 안정화하였다. 실시예 4에서 하기 기술된 것과 같은 FFA 분석법에 의해 바이러스 역가를 측정하였다. 이들 실험의 결과(데이터를 나타내지는 않았음)는 시험된 다른 MDCK 클론보다 클론 1의 서브클론이 더 많은 바이러스를 생산해낸다는 것을 보여주었다. 따라서, MediV 105에서의 세포 성장 평가를 위한 추가의 실험을 위해 서브클론 1-A, 1-B 및 1-C를 선택하였다. 이 실험의 결과는 도 2에 나타낸 바와 같다. 도 2에 나타난 바와 같이, 서브클론 1-A, 1-B 및 1-C 각각은 근본적으로 서로 유사한 성장 특성을 나타내었다.
추가로, 계대배양수 12에서 바이러스 감염성에 대해 서브클론 1-A, 1-B 및 1-C를 다시 시험하였다. 상기에서 기술된 9번째 계대배양에서와 동일한 조건 하에 각 서브 클론의 9×T-75 플라스크를 인플루엔자 바이러스로 2개씩 감염시켰다(바이러스 균주마다 클론당 2×T-75 플라스크). 이 실험의 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에서 보여진 바와 같이, 각 서브클론은 시험된 바이러스의 성장을 상대적으로 높은 역가까지 지원하였고, 서로 다른 서브클론들은 그 어느 것도 각각의 시험된 바이러스 균주의 가장 높은 역가를 지원하지 않았다.
마지막으로, 바이러스 성장에 대한 MediV 105 배지의 효과를 평가하기 위하여, 바이러스 감염성 평가를 서브클론 1-A, 1-B 및 1-C는 MediV 105와 OptiPro™(GIBCO) 배지 모두에서 수행한 반면, 서브클론 1-D에 있어서는 상기 기술된 바대로 OptiPro™(GIBCO) 배지에서만 수행하였다. 이들 각각의 바이러스 감염성 실험의 결과표를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 바이러스 생산성에 있어서 두 배지 사이에 현저한 차이는 관찰되지 않았다.
8.3 실시예 3: MediV 105와 M18M에서의 MDCK 세포 성장의 비교
본 실시예는 MediV 105와 M18M 배지에서의 MDCK 세포의 상대적인 성장을 평가하기 위한 실험 결과를 기술한다. MediV 105와 M18M의 제조는 하기 실시예 10에 기술되어 있다.
이들 실험에서는, 무혈청 적응된 서브클론 1-A의 바이알 1개를 해동하여 MediV 105와 M18M를 각각 함유하는 T-75 플라스크로 접종하였다. 이후, 상기 T-75 플라스크를 5% CO2 환경이 제공된 37℃ 배양기에 놓고, 상기 세포들을 이러한 조건 하에 3일 내지 4일 동안 성장시켰다. T-75 플라스크의 세포를 트립신 처리하여 배양 종료시에 세포 성장 속도와 생존율을 모니터링한 후, Cedex 세포 계수기를 이용하여 총 세포수 및 생존 세포수를 계수하거나 Cedex 및/또는 NucleoCounter를 이용하여 차후 88시간이 지난 후에 총 세포수 및 생존 세포수를 계수하였다.
상기 실험 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 서브클론 1-A는 MediV 105와 M18M 모두에서 복제될 수 있었다. 그러나, 세포는 M18M에서 시간이 경과함에 따라 생존율이 감소하였던 반면, MediV 105에서의 세포 생존율은 상대적으로 일정하게 유지되었다. 추가로, MDCK 세포의 배가 시간을 산출하여 도 7에 나타내었다. 도 7로부터 MDCK 세포 서브클론 1-A의 배가 시간은 MediV 105에서 39시간이며, M18M에서 36시간임을 알 수 있다.
8.4 실시예 4: 서로 다른 미세담체에 대한 MDCK 세포 성장의 비교
본 실시예는 서로 다른 미세담체를 이용하여 M18M 배지에서 MDCK 세포의 성장을 평가하기 위해 고안된 실험의 결과를 기술한다. 특히, 미세담체 사이토덱스 1, 사이토덱스 3, 사이토포어 1 및 사이토포어 2(지이 헬스케어)에 있어서 MDCK 세포의 성장을 비교하였다.
본 실험에서는, MDCK 세포 서브클론 1-A를 M18M 배지를 포함하는 125㎖의 플라스크 내로 접종시켰다. 다음으로, 각 2g/L의 사이토덱스 1, 사이토덱스 3, 사이토포어 1, 또는 사이토포어 2를 각 플라스크에 첨가하였다. 도 8에 나타난 바와 같이 접종 후 30분과 60분에 비부착 MDCK 세포의 밀도를 측정하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, MDCK 세포는 각각의 서로 다른 미세담체에 신속히 부착하였으며, 결과적으로 사이토덱스 미세담체보다는 사이토포어 미세담체에 더 잘 부착하였다.
추가로, 상기 세포를 서로 다른 미세담체의 존재하에(125㎖의 배지 중에 30㎖ 미세담체 w/v, 120 RPM에서 흔듦) M18M에서 약 5일간 성장시키고, 트립신 처리후 Cedex 계수에 의해 매일 총 세포 밀도를 측정하였다. 실험 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이, 사이토덱스 미세담체는 사이토포어 미세담체에 비해 더 높은 세포 밀도를 나타냈다. 또한, 사이토덱스 3은 사이토덱스 1보다 높은 세포 밀도를 나타냈다.
8.5 실시예 5: MDCK 세포에서의 인플루엔자 바이러스의 복제
T-75 플라스크들을 5×104개 세포/mL(35mL의 DMEM + 10% FBS + 4mM 글루타민)로 접종하고, 37℃, 5% CO2로 유지되는 배양기에서 3일 동안 배양하였다. 이들 T-75 플라스크 중의 하나의 세포를 트립신 EDTA를 사용하여 트립신 처리하고 트립판 블루 배제법(Trypan-Blue Exclusion method)에 의해 세포 계수를 측정하였다. 이어서, 남아있는 T-플라스크를 하기와 같이 감염시켰다. 배양 배지를 빨아들여 제거하고, 플라스크당 10mL의 DPBS(Ca2+/Mg2+ 포함하지 않음)를 사용하여 세포를 2회에 걸쳐 세척하였다. 바람직한 감염다중도(MOI)(예를 들어, 0.01 내지 0.001)로 각각의 T-플라스크를 감염시키기 위한 바이러스의 양은 하기 식에 따라 결정하였다:
Figure 112009022767906-PCT00009
(여기에서, MOI는 첨가되는 세포수당 바이러스 입자의 개수로서 정의된다)
이어서, 필요량의 바이러스를 각 T-플라스크 중의 35mL의 감염 후 배지(DMEM + 4mM 글루타민 + 500 mU/mL TPCK 트립신)에 첨가하였다. 이어서, T-플라스크를 33℃, 5% CO2에서 항온배양하고, 6일 동안 매일 시료를 채취하였다. 시료 부피의 1/10 부피의 1OX SP를 안정화제로서 각 시료에 첨가하고, 감염성에 대하여 시험하기 이전에 시료를 <-70℃에서 저장하였다.
각 시료에 존재하는 바이러스의 농도는 감염성 비리온을 측정하는 평균 조직 배양 감염 용량(TCID50) 분석법에 따라 측정하였다. 간략하면, MDCK 세포를 96-웰 미량역가 플레이트(microtiter plate)에 융합성 단층으로 성장시키고, 연속적으로 ca/ts 인플루엔자 바이러스 시료 희석액을 첨가하였다. MDCK 세포 분석 플레이트 시료의 최종 희석도는 보통 10-4 내지 10-10이었다. 칼럼 1-5 및 8-12의 웰은 바이러스-희석된 시료를 함유하고, 칼럼 6-7의 웰은 단지 바이러스 희석제만을 함유시켜 세포 대조군으로서의 역할을 하였다. 이러한 설정은 플레이트당 각 시료 희석액에 대해 2개의 데이타 지점(n=2)을 형성하였다. MDCK 세포에서의 바이러스 복제를 통해 세포는 사멸하고, 세포 변성 효과(CPE)가 나타났다. 자손 바이러스도 배양 상등액 내로 방출되었다. 상기 자손 바이러스는 다른 세포를 감염시키고, 감염이 반복됨으로 인해 결과적으로는 단층이 파괴되었다. CO2 환경 하에 33±1℃에서 6일 동안 단층 세포의 감염을 지속시켰다. 이어서, 배양기로부터 플레이트를 빼내어 웰에 있던 배지를 버리고, 100㎕의 MEM/EBSS + 1X 비필수아미노산 + 2mM 글루타민 + 페니실린/스트렙토마이신 + MTT를 각각의 웰에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 3-4시간 동안 플레이트를 배양하고, 각 웰에서 형성된 색상을 육안으로 조사하여 CPE를 나타내는 웰의 수를 측정하였다(황색/오렌지색은 CPE 웰을 나타내고, 보라색 일색은 CPE가 없음을 나타낸다). 각 플레이트의 절반에서 CPE를 나타내는 웰의 개수를 이용하여, Reed-Muench 방법의 Karber 변형법에 기초해 역가(log10 TCID50/mL)을 산출하였다.
8.6 실시예 6: 바이러스 성장에 대한 형광 포커스 분석법
MDCK 세포를 96 웰 블랙 플레이트(DMEM/EBSS + 1X 비필수아미노산 + 2mM 글루타민 + PEN/Strep)에서 4일에 걸쳐 배양하였다. 이어서, 각 웰을 연속 희석된 바이러스 시료[예를 들어, ca/ts B형 인플루엔자-균주(B/홍콩/330/01 및 B/야마나시/166/98)]를 사용하여 감염시키고 CO2 환경 하에, 33±1℃에서 약 20시간 동안 배양시켰다. 상기 시료의 바이러스 역가를 측정하기 위해, 상기 바이러스로 감염된 플레이트를 하기와 같이 고정시키고 면역 염색시켰다. 바이러스를 함유하는 배지를 각 플레이트로부터 제거하고, 200㎕/웰의 DPBS(Ca2+/Mg2+없음)를 사용하여 플레이트를 1회 세척한 후, PBS중의 차가운 4%(v/v)의 포르말린을 200㎕/웰로 첨가하여 15분간 플레이트를 고정시켰다. 200㎕/웰의 DPBS(Ca2+/Mg2+없음)를 사용하여 플레이트를 2회 세척한 후, A형 균주 또는 B형 균주에 대해 특이적인 1차 항체와 함께 세포를 배양하였다. 상기 1차 항체를 PBS중의 0.1% 사포닌, 1% BSA의 바람직한 희석도로 희석시켰다. 1시간 동안 배양시킨 후, 1차 항체를 제거하고, 세포를 PBS중의 0.1% Tween 20으로 2회 세척하고, 상기 웰을 PBS중의 0.1% 사포닌, 1% BSA의 바람직한 희석도로 제조된 형광 염료가 결합된 2차 항체(예를 들어, FITC로 표지된 래빗의 항양(rabbit anti sheep) 2차 항체)과 함께 배양하였다. 상기와 같이 2회 세척하고 페이퍼 타월로 물기를 찍어내면서 건조(blot drying)시킨 후, 형광 염색된 웰들을 형광 현미경을 사용하여 매일 웰을 시각화하고, SPOT 프로그램을 사용하여 그 이미지를 매일 촬영하였다.
8.7 실시예 7: 핵학, 종양형성성 및 외래성 인자에 대한 MDCK 세포 시험 분석
본 실시예는 핵학, 종양형성성 및 외래성 인자에 대하여 MDCK 세포를 시험하는데 적절한 대표적인 방법을 기술한다.
8.7.1. 핵학 시험:
간략하면, 시험용 MDCK 세포를 T-225 플라스크에서 성장시킨 후 유지시켜 상기 기술된 것과 같이 계대배양시켰다. 세포가 충분한 유사분열 세포를 보유했다고 판단되는 경우, 유사분열 분석을 위해 세포를 수거하였다. 이어서, 세포를 37℃에서 150분 동안 콜세미드(0.02㎍/mL)로 처리하였다. 이어서, 세포를 트립신 처리에 의해 수거하고, 세포를 200×g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 빨아들여 버리고, 세포를 미리 가온시킨 저장액에 재현탁시킨 후, 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 원심분리에 의해 팽윤성 세포를 펠릿화시킨 후, 실온에서 40분 동안 카노이(carnoy) 용액(3:1의 메탄올:빙초산) 중에서 배양하여 고정시켰다. 세포를 다시 원심분리하고, 카노이 고정액을 사용하여 2회 이상 세척하였다. 마지막 원심분리 후, 세포를 1 내지 3㎖의 새로운 고정액에 재현탁시켜 유백색의 세포 현탁액을 제조하였다. 최종 세포 현탁액 몇 방울을 깨끗한 슬라이드 상에 놓고, 통풍 건조시켰다.
인산염 완충액 중의 라이트(Wright) 염색 용액을 슬라이드에 가하여 세포를 염색하고, 7-10분 동안 배양하였다. 이어서, 7-10분 후 슬라이드를 수돗물로 세척한 후, 통풍 건조시켰다. 저배율 대물렌즈(10X)를 사용하여 세포를 스캐닝해서 세포가 세포 분열 중기 단계에 있음을 확인하고, 중기에서의 세포 염색체를 고배율의 유침 렌즈(oil immersion lens)(100X)를 통해 분석하였다. 세포 분열 중기에 있는 약 100개 세포를 세포유전학적 이상 및 염색체 계수에 대하여 분석하였다. 약 1000개 세포를 스캐닝하여 다배체형의 빈도(polyploid frequency) 및 유사분열 지수(유사분열 중인 세포의 퍼센트)를 측정하였다.
8.7.2. 무균성 시험: 정균성 및 정진균성 및 배지 4개의 무균성
정균성 및 정진균성 시험은 시험 시료 중에서 대조군 유기체[바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 클러스트리디움 스포로지너스(Clostridium sporogenes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginonsa), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus Niger)]의 성장에 억제 효과가 있는지의 여부를 측정하는 것이다. 간략하면, 시험물(test article)을 TSB(대두-카제인 분해 배지) 튜브 3개, THIO(액체 티오글리콜레이트 배지) 튜브 4개, SAB(사브로우드 덱스트로스 아가) 튜브 2개 및 PYG(펩톤 효소 추출액: peptone yeast extract) 튜브 2개에 접종하였다. 이어서 100cfu 이하의 대조군 유기체를 포함하는 각각의 대조군 유기체를 적절한 종류의 배지 내에 접종하였다. 양성 대조군은 TSB와 THIO 중의 바실러스 서브틸리스, TSB와 SAB(20-25℃ 및 30-35℃에서)중의 칸디다 알비칸스, THIO와 PYG 중의 클러스트리디움 스포로지너스, THIO 및/또는 TSB 중의 슈도모나스 에어루기노사, 스타필로코커스 아우레우스 및 아스페르길루스 니게르로 구성될 수 있다. 음성 대조군은 멸균 PBS였다. 상기 배지를 3-5일 동안 배양하고, 유기체의 성장에 대하여 체크하였다.
시험 배양물이 USP 26, EP 및 21CFR610.12에 규정된 무균 조건을 충족하는지를 시험하기 위해, 상기 시험 배양물을 TSB(대두-카제인 분해 배지) 튜브 2개, THIO(액체 티오글리콜레이트 배지) 튜브 2개, SAB(사브로우드 덱스트로스 아가) 튜브 3개 및 PYG(펩톤 효소 추출액) 튜브 2개에 접종하였다. 상기 배지를 적절한 온도에서 배양하고(SAB 비탈(slant) 배지는 두 온도에서 배양하였다), 모든 튜브를 14일간에 걸쳐 관찰하는데, 시험 3/4일째 또는 5일째, 7일째 또는 8일째 및 14일째 튜브를 체크하였다. 혼탁하게 보이는, 임의의 시험물이 접종된 튜브를 플레이팅 아웃(plating out)시키고, 플레이트 상에서 그람 염색을 수행하여 시험 시료에 포함된 유기체의 그람 염색 유형을 결정하였다. 음성 대조군은 무균 PBS였다.
8.7.3 미코플라스마/미코플라스마 생장정지(mycoplasmastasis) 분석법
상기 설명된 바와 같이 T-플라스크에서 세포를 증식시켜 배양하였다. 5×105개 세포/mL 농도의 세포 용해물을 제조하고 -7O℃에서 냉동시켰다. 아가 배양물/플레이트 및/또는 VERO 세포에서 미코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae), 미코플라스마 오랄레(Mycoplasma orale) 및 미코플라스마 히오르히니스(Mycoplasma hyorhinis)의 성장을 저해하는 능력에 대하여 시험물을 시험하였다.
아가 분리 분석법을 위해, 시험물을 아가 플레이트 또는 배양액 병 위에 스파이크(spike) 또는 언스파이크(unspike)시켜 시험하였다. 시험물을 미코플라스마 뉴모니아에 및 마이코플라스마 오랄레로 스파이크시켜 10 내지 100cfu/0.2mL(아가 시험용) 및 10 내지 100cfu/10mL(반 배양액 분석법용)로 희석시켰다. 시험 시료의 일부는 스파이크시키지 않았다. 4개의 반고체 배양액 병에 스파이크된 것(병 2개) 또는 언스파이크된 것(병 2개) 각 10ml를 접종하였다. 스파이크된 것/언스파이크된 것의 각 병 1개를 적절한 온도하에 호기적 또는 혐기적 상태에서 배양하였다. 10개의 A형 아가 플레이트 및 10개의 B형 아가 플레이트에 각 스파이크된 시료 또는 언스파이크된 시료를 접종하였다. A형 아가 플레이트와 B형 아가 플레이트의 절반을 적절한 온도하의 호기적 또는 혐기적 상태에서 배양하였다. 접종되지 않은 미코플라스마 반고체 배양액은 접종되지 않은 음성 대조군으로서 역할을 하였다. 배양액 병 모두를 21일 동안 관찰하였다. 3일째, 7일째 및 14일째에 각각의 배양액 병(단, 접종되지 않은 음성 대조군은 제외)을 A형 아가 플레이트 또는 B형 아가 플레이트(각각 10개 플레이트, 0.2mL/플레이트)에 계대배양시키고, 적절한 병과 동일한 조건하에서 배양하였다. 이들을 21일 동안 하루에 한번 씩 검사하였다.
향상된 VERO 세포 배양물의 분석을 위해, 시험물을 스파이크 또는 언스파이크시켜 시험하였다. 시험물을 10-100cfu/0.2mL 농도의 M. 오랄레와 M. 히오르히니스로 스파이크시켰다. 스파이크된 시험물, 언스파이크된 시험물, 양성 대조군 및 음성 대조군 각각을 VERO 세포 배양물의 T-75 플라스크에 접종하였다. 접종 후 3-5일째 되는 날, 각 플라스크로부터 세포를 긁어내어 급속 냉동시켰다. 각 플라스크의 세포 용해물 1mL의 10분의 2를 VERO 세포를 함유하는 6 웰 플레이트의 각 웰에 접종하였다. 추가로, 양성 및 음성 대조군을 VERO 세포를 함유하는 6 웰 플레이트의 적절한 웰에 접종하였다. 3-5일 후, 세포를 고정시키고, DNA 결합 HOECHT 염료로 염색시킨 후, 미코플라스마의 존재에 대하여 평가하였다.
8.7.4 누드 마우스에서의 종양형성성 시험:
가슴샘이 없는 누드(nu/nu) 마우스에서의 종양 형성에 대한 평가를 하기와 같이 수행하였다. 간략하면, 가슴샘이 없는 마우스(4주령) 약 230마리를 각각 양성 대조군(HeLa 세포), 음성 대조군(인산염 완충 식염수, PBS) 또는 시험 세포(MDCK 세포) 0.2mL(1×107 개 세포/마우스)로 피하 주사하였다. 주사 전에 동물을 무작위로 추출하여, 같은 날에 22 게이지 바늘을 사용하여 마우스 모두에 주사하였다. 매 실험일마다 동물 모두를 관찰하고, 84일의 기간 동안 1주일에 2번씩 병변 진행에 대하여 주사 부위를 촉진(觸診)하였다. 각각의 병변을 검사하고, 육안으로 봤을 때 병변 크기가 증가하지 않는 한 동물을 최대 6개월간 그대로 두었다. 빈사 상태를 나타내는 동물은 안락사시켰다. 이들 동물과 6개월의 관찰 기간이 끝날 때까지 생존한 모든 마우스를 폐사시켜 부검하였다. 주사 부위, 폐, 견갑 림프절 및 모든 병변(gross lesion)을 조직생리학적 방법에 의해 분석하였다.
8.7.5. 추가적인 분석법
입수가능한 바이러스 병원체를 위한 다른 대표적인 PCR 및/또는 항체-특이성 시험은 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 수행된다.
추가적인 시험 절차
일반 시험 PCR * / Ab 특이성
무균성 1&2형 AAV
미코플라스마 HCMV
시험관내 외래성 인자(다중 세포주) EBV
생체내 외래성 인자 HSV
PERT A, B & C형 간염
동시 배양 6, 7 & 8형 HHV
핵학 1&2형 HIV
전자 현미경 HPV
온전한 세포를 이용한 종양형성성 I&II형 HTLV
세포 DNA를 이용한 종양성 폴리오마 바이러스(BK 및 JC 바이러스)
세포 용해물을 이용한 종양성 서코바이러스
9CFR당 소 바이러스 개 파르보바이러스
9CFR당 돼지 바이러스 개 디스템퍼
아데노바이러스
SV40
8.8 실시예 8: 백신 물질의 제조 공정 및 제조 방법
상기 실시예 4에 거론된 바와 같이 MDCK 세포에서의 인플루엔자 생산에 있어서, 현재 인가된 폴리오 백신을 생산하기 위해 사용되는 기법과 유사하게 고도로 확장가능한 미세담체 기법을 이용할 수 있다. 덱스트란으로 이루어진 구형 비드는 2 내지 1OL 생물반응기에서 MDCK 세포의 탁월한 성장을 지원한다. MediV 105 또는 OptiProTM 배지에서 성장한 모 MDCK 세포는 두 스피너 플라스크 모두에서 회분식 모드로 사이토덱스 3 미세담체 상에서 2×106개의 핵/ml의 밀도까지 성장할 수 있는 것으로 밝혀졌고, MDCK 세포는 10L 이하 규모의 생물반응기에서 > 2.5×106 개 세포/mL까지 성장하였다.
이들 MDCK 세포(또는 유사한 비부착 MDCK 세포)를 무혈청 공정에서 높은 역가로 백신 인플루엔자 균주를 생산할 수 있는지에 대해 시험하여 T-플라스크 중 혈청 배양된 세포를 사용하여 수득된 생산성과 비교하였다. 임상 제조에 있어서는, 인플루엔자 바이러스를 MDCK 세포에서 20L 또는 150L 규모로 생산되는 반면, 상업적 규모의 생산일 경우에는 약 2,500L 이하의 생물반응기를 이용한다. 도 10에는 상업적 생산 수준까지 확장가능한 규모의 세포 배양에 사용될 수 있는 하나의 공정 과정을 개괄하고 있다. 시험 세포 은행을 먼저 T-75 플라스크로부터 T-225 플라스크로, 다음에는 1리터의 스피너 플라스크로, 이후 20리터의 생물반응기로, 이어서 300리터의 생물반응기로, 최종적으로 2500리터의 생물반응기로 순차적으로 증식시켰다. 세포 밀도가 최적일 때, 배양물을 마스터 바이러스 균주로 접종하였다. 이어서, 배양물의 상등액으로부터 바이러스를 대량 수거하였다. 실시예 12는 백신 물질의 생산에 사용될 수 있는 높은 역가의 바이러스 물질 생산을 위한 일회용 생물반응기(SUB)의 작업을 상세히 기술하고 있다.
세포 배양물을 기초로 한 인플루엔자 백신의 정제 공정은 난(egg) 기초의 인플루엔자 백신 정제 공정(예로서, PCT 공보 WO 05/014862와, 2005년 10월 4일에 출원된 PCT 출원 PCT/US05/035614 참조)을 모델로 삼았다. 세포의 바이러스 백신 물질의 정제는 하기 공정, 즉 균질화, 정화, 원심분리, 한외여과, 황산바륨상에서의 흡착과 용출, 접선 흐름식 여과, 밀도 구배 한외원심분리, 크로마토그래피 및 멸균 여과 중에서 임의의 어느 하나 또는 모두를 포함할 수 있다. 다른 정제 단계도 포함될 수 있다. 예를 들어, 감염된 배양물 또는 바이러스 수거물의 원래의 배지는 먼저 세포 잔해물과 다른 거대 과립 물질을 제거하기에 충분한 시간, 예컨대 10분 내지 30분 동안, 예를 들어 1000-2000×g에서의 원심분리에 의해 정화될 수 있다. 다른 방법으로, 온전한 세포 및 다른 거대 과립 물질을 거르기 위해, 배지를 0.8㎛의 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통해 여과시킨다. 선택적으로, 이후에 인플루엔자 바이러스를 펠릿화시키기 위해 상기 정화된 배지 상등액은, 예를 들어, 15,000×g에서, 약 3-5시간 동안 원심분리된다. 적절한 완충액, 예컨대 STE(0.01M Tris-HCl; 0.15M NaCl; 0.0001M EDTA) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)(pH 7.4) 중에 바이러스 펠릿을 재현탁시킨 후, 수크로스(60%-12%) 또는 포타슘 타르트레이트(50%-10%) 상에서의 밀도 구배 원심분리에 의해 바이러스를 농축시킬 수 있다. 연속 구배 또는 단계 구배, 예를 들어, 12% 내지 60% 사이의 4개의 12% 단계로 된 수크로스 구배가 적합하다. 상기 구배물을, 회수를 위한 가시적인 밴드 내로 바이러스를 농축시키에 충분한 속도에서, 그리고 충분한 시간 동안 원심분리시킨다. 다르게는, 그리고 가장 큰 규모의 상업적 이용을 위해서는, 연속식으로 작동하는 침강-원심분리 로터를 이용하여 밀도 구배로부터 바이러스를 현탁 분리한다.
세포로부터 바이러스 백신 물질을 정제하는 과정에 있어서, 공정 초기에 비특이적 엔도뉴클레아제인, 벤조나아제
Figure 112009022767906-PCT00010
의 사용을 포함시킬 수 있다. 세포성 DNA의 종양원성을 평가하는 연구에 기초하면, MDCK 세포성 DNA는 종양원성 위험을 내포하지는 않으나, 벤조나아제
Figure 112009022767906-PCT00011
처리를 하게 되면 사실상 잠재적이거나 가상의 위험성이 제거될 수 있을 것이다. 한 정제 공정에 있어서, 벤조나아제
Figure 112009022767906-PCT00012
처리 후, 대량의 물질 내의 잔류하고 있는 포유동물의 손상되지 않은 세포도 제거할 수 있는 직류식 여과(DFF)에 의해 물질을 정화시킨다. 이어서, 여과된 대량의 물질은 추가의 정제 단계 이전에 접선 흐름식 여과에 의해 농축된다. 다른 바이러스 시스템에서도 효과가 좋은 친화성 크로마토그래피뿐만 아니라, 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 수산화인회석 크로마토그래피를 비롯한 정제 방법은 세포 배양물을 기반으로 한 인플루엔자 백신 생산에 유용하다. 이어서, 개발된 공정에 의해 수득한 고도로 정제된 상기 바이러스 물질을 백신 물질 생산에 사용한다. 예를 들어, 생 약독화성 백신 생산에 사용하기 위해서(예로서, FluMist®), 상기 바이러스 물질을 여과에 의해 완충액을 교환시켜 최종 조제물을 형성한 후 멸균 단계를 수행할 수 있다. 이러한 상기 조제물에 유용한 완충액은 20OmM 수크로스 및 아르기닌과 같은 다른 아미노산 부형제가 첨가된 pH 7.0-7.2의 인산염 또는 히스티딘 완충액을 함유할 수 있다. 안정화를 위해 필요하다면, 단백질 가수분해물, 예컨대 젤라틴(예, 돼지, 조류, 어류 젤라틴)도 첨가할 수 있다. 이상적으로는, 연장된 저장 기간에도 안정적인 백신 물질을 제조한다. 저장 기간을 연장시키기 위하여 사용될 수 있는 한 방법은, 건식 가열된 기체 스트림 하에서 조제물의 액상 공급물을 미세한 액적으로 분사시키는 급속 건조 공정인 분무 건조법이다. 상기 미세한 액적의 증발을 통해 용해되어 있던 용질로 구성된 건조 분말이 수득된다(예로서, 미국공개특허 제2004/0042972호 참조). 분무 건조법은 종래의 동결 건조 공정과 비교하여 확장의 용이성 및 제조 비용에 있어서의 이점을 제공한다. 다르게는, 백신 물질은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 냉장 온도에서 액상 조성물로서 안정하도록 제조된다. 예를 들어, 냉장 온도에서 안정적인 약독화성 인플루엔자 백신을 제조하기 위한 방법 및 조성물에 대해서는 2005년 10월 4일에 출원된 PCT 특허 출원 PCT/US2005/035614에 기술되어 있다.
공정특성 분석 단계가 정제 공정 설계도에 포함되어 생산 과정을 모니터한다. 이용가능한 공정특성 분석 단계는 이에 제한되지는 않지만, 바이러스 감염성을 측정하기 위해 단순 항체 결합과 형광 염색법을 이용하는 형광 포커스 분석법(실시예 6에 기술되었으며, 당업계에 공지됨. 예를 들어, 문헌 [Stokes et al., 1988, J Clin Microbiol. 26:1263-6] 참조)을 포함한다. 당업자에게 공지되어 있는 여러 가지 방법을 사용하여 수행할 수 있는 총 단백 및 DNA 측정법을 사용하여 초기에 남아있는 불순물의 퍼센트를 측정한다. 백신 일정량에 대해 바이러스의 감염성을 산출(예로서, 감염성/mg)함으로써 제제의 구체적인 활성을 측정할 수 있다.
사용가능한 하나의 정제 공정이 도 11A에 개괄되어 있다. 간략하면, 1가의 인플루엔자 바이러스 수거물은 적절한 완충액(예를 들어, 수크로스 인산염 완충액)으로 안정화된다. 이어서, 비특이적 엔도뉴클레아제인 벤조나아제가 상기 안정화된 바이러스 수확물에 첨가되어 DNA를 300개 이하의 염기쌍의 단편으로 분해한다. 벤조나아제 처리 후, 상기 바이러스 수거물을 여과하여 잔류하고 있는 손상되지 않은 MDCK 세포와 대부분의 세포 잔해물을 제거한다. 특히, 직류식 여과법을 이용할 수 있다. 다양한 크기의 세공, 막 조성 및 구조(예컨대 다중매질 또는 단일 필터)를 갖는 여러 가지 여과막과, 최대 유량 및 스케일업 인자를 비롯한 공정 파라미터는 용이하게 결정된다. 정화된 바이러스 수거물은 이어서 한외여과막을 이용한 접선 흐름식 여과법에 의해 농축된 후, 농축된 바이러스는 적절한 완충액(예를 들어, 수크로스 인산염 완충액)에 대해 정용여과시킨다(diafiltered). 이어서, 상기 정용여과된 농축된 수거물에 대해 칼럼 크로마토그래피 또는 막 크로마토그래피를 수행한다. 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피가 MDCK 세포 단백질 및 DNA를 추가로 제거하기 위해 사용될 수 있다. 상기 크로마토그래피 정제된 바이러스 수거물을 이어서 농축시키고 조제 완충액 내로 정용여과시키고, 최종적으로 멸균 여과를 수행한다. 친화성 크로마토그래피와 벤조나아제® 단계를 조합하여 사용가능한 대안적인 정제 공정이 도 11B에 개괄되어 있다. 이러한 공정을 이용하여 하향 공정 단계를 줄일 수 있다. 간략하면, 1가의 인플루엔자 바이러스 수거물은 적절한 완충액(예를 들어, 수크로스 인산염 완충액)으로 안정화된다. 이어서, 안정화된 바이러스는 1.2㎛ 및 0.45㎛ 필터를 이용한 직류식 여과법(DFF)에 의한 여과로 정화된다. 이어서, 정화된 바이러스는 한외여과막을 이용한 TFF로 영양화(conditioned)/농축되고, 이후 농축된 바이러스는 예를 들어 500 KD TFF(5X UF/5X DF)를 이용하여 적절한 완충액(예를 들어, 수크로스 인산염 완충액)에 대해 정용여과시킨다. 이어서, 상기 영양화시킨 바이러스는 칼럼 상에서(on column) 벤조나아제® 처리를 수행한 후, 정제된 바이러스 용출물을 농축시키고 난 뒤, 예컨대 500 KD TFF 및 8X DF를 이용하여 조제 완충액 내로 정용여과시킨다. 다음으로, 제조된 대량의 바이러스를 예컨대, 0.45㎛ 및 0.2㎛ 필터를 통해 멸균 여과시킨다.
8.8.1. 셀루파인 설페이트 크로마토그래피
MDCK DNA는 ~12kB의 벤조나아제® 저항성 단편을 포함하여, TFF 또는 수크로스 밀도 구배(데이터는 나타내지 않음)를 이용한 한외원심분리로 제거되지 않는 것이 사실이다. 상기 기술된 바와 같이, 크로마토그래피는 모든 오염물을 확실하게 제거하기 위해 이용된다. 셀루파인 설페이트 크로마토그래피 수지는 셀로바이오스(cellobiose)의 6번 위치에 공유 결합되어 셀룰로스 비드에 부착된 설페이트 에스테르로 구성된다. 이 수지는 헤파린 또는 덱스트란 설페이트의 친화성과 비슷하다. 셀루파인 설페이트(CS)를 이용한 칼럼 크로마토그래피를 시험하여 오염된 DNA 밴드를 효율적으로 제거할 수 있음이 증명되었다. 간략하면, 2.6×2cm(10 mL)의 칼럼을 완충액 A[1X SP(218mM 수크로스, 11mM 인산칼륨), pH 7.2]에서 평형을 유지시키고 TFF-정제된 바이러스(A/뉴 칼레도니아 재조합체)를 로딩하였다. 칼럼을 5개의 칼럼 부피의 완충액 A로 세척하고 0-100%의 농도 구배를 갖는 완충액 B(1X SP + 1M NaCl, pH 7.2)로 용출시켰다. 유속을 3mL/분으로 유지시켰다. OD 프로파일은 도 12A의 좌측부에 나타나 있다. 표 5에서는 CS 칼럼의 출발 물질, 유통부 물질 및 CS 칼럼에서 용출된 분획물의 DNA 함량, 총 HAU 및 FFA 감염성을 나타내었다.
셀루파인 설페이트 크로마토그래피
시료 총 DNA (㎍) 총 HAU( Log 10 / mL ) FFA 감염성( mL 당)
TFF/UF 물질 26.7 5.8 1.5×1010
유통부 (Flow through) 물질 12.7 (47%) 4.0 (1.6%) 6.5×107 (0.4%)
용출물 8.5 (32%) 5.75 (88%) 1.1×1010 (70%)
CS 칼럼의 출발 물질, 유통부 물질 및 CS 칼럼에서 용출된 분획물을 아가로스 겔 전기영동법에 의해 분석하였다(도 12 A, 우측부). DNA 오염물이 출발 물질(2 레인)과 유통부 물질(3 레인) 모두에서 존재하였으나, 칼럼으로부터 용출된 물질(4 레인)에서는 존재하지 않았다. 이러한 데이터는 배양 배지와 숙주 세포로부터 오염물을 제거하는데 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피 수지를 사용하는 것이 한외원심분리보다 더 효율적임을 나타내는 것이다.
8.8.2. 칼럼 상에서 벤조나아제® 처리
운용 단계를 줄이고 순도를 높이기 위해, 벤조나아제® 처리를 셀루파인 설페이트 크로마토그래피와 조합하여 수행할 수 있다. 칼럼 상에서 벤조나아제® 처리를 이용한 MDCK dDNA 분해의 개략도가 도 12B에 나타나 있다.
세부 공정은 하기와 같다: 전 공정은 22℃(실온)에서 수행하였다. 크로마토그래피를 수행하기 전에 TTF-정제된 바이러스를 필요한 만큼 22-24℃로 승온하였다. 칼럼 상에서의 로딩은 FFA 분석당 총 바이러스 감염성 단위를 기초로 한다. 칼럼 상에 목표 로딩값은 칼럼 부피 mL 당 9-9.5 log10 FFU이다. 평형, 로딩, 세척 및 용출을 위한 유속은 동일하게 유지(155cm/hr)하되, 벤조나아제®를 함유하는 1X SP 완충액을 이용하여 세척시에는 표 6에 나타난 바와 같이 유속을 감소시켰다. 칼럼(1×15cm)을 전도도 및 pH가 각각 2-3 mS/cm와 7.0±0.2에 도달할 때까지 1X SP(218 mM 수크로스 - 11 mM 인산칼륨, pH 7.0±0.2)로 평형을 맞추었다. 바이러스를 칼럼에 로딩시키고 유통부 물질을 수거하였다. 로딩이 완료된 후, 칼럼을 1 칼럼 부피(CV)의 1X SP로 세척하고(세척 #1), 세척물을 유통 분획물과 함께 수거하였다. 이어서, 칼럼을 다른 유속(동일한 바이러스 로딩 물질로 1-3단계를 반복하여 수행된 각 실험에 대해 0.33, 0.46, 0.65, 0.98 및 1.3 mL/분)에서 1X SP 1mL당 2 mM의 MgCl2와 50단위의 벤조나아제®를 포함하는 2.5 CV의 1X SP로 세척하였다(세척 #2). 2회의 세척 후, 칼럼을 또다른 2 CV의 1X SP로 세척하였다(세척 #3). 1M NaCl을 포함하는 1X SP를 사용하여 칼럼으로부터 바이러스를 용출시켰다. 용출된 물질을 A280nm 값이 5 mAU가 되자마자 수거하고, A280nm 흡광도 값이 5 mAU으로 복귀될 때까지 수거를 지속하였다. 칼럼을 5 CV의 0.1 NaOH로 세척하고 다시 사용할 때까지 염기 중에 놓아두었다. 크로마토그래피 가동 데이터를 본 프로토콜의 종료시에 데이터 시트에 기록하였다. 수행된 각 회의 크로마토그래피에 대해 데이터 시트를 여러장으로 만들 수도 있다.
1-5회에 있어서 벤조나아제 ®와 바이러스의 접촉시간 및 유속
회수# 세척 부피 (세척 #2) 유속 (mL/분) 벤조나아제와 바이러스의 접촉시간(분) 유속 (cm/hr)
1 2.5 CV 0.33 102 25
2 2.5 CV 0.46 73 35
3 2.5 CV 0.65 51 50
4 2.5 CV 0.98 34 75
5 2.5 CV 1.3 26 100
용출된 크로마토그래피 분획물 중에 남아있는 MDCK dsDNA를 인비트로겐(Invitrogen)사에 의해 지시된 내용으로 피코그린 정량분석 키트(PicoGreen quantitation assay kit)를 이용하여 정량하였다. 몰레큘라 디바이스(Molecular Devices)사의 Gemini EM 형광 플레이트 판독기(fluorescence plate reader)를 이용하여 형광량을 측정하였고, dsDNA의 분해량을 SoftMax Pro 프로그램(version 4.8)을 이용하여 산출하였다.
표 7은 비닐 봉지에서의 벤조나아제® 처리 및 칼럼 상에서의 벤조나아제® 처리 모두를 이용한 수회의 단계적 공정(developmental runs)에 대한 정제 수율을 요약한 것이다.
Figure 112009022767906-PCT00013
8.9 실시예 9: 임상전 동물 모델
흰족제비(ferret)는 약독화성 인플루엔자 백신 및 성분 백신 균주의 약독화성 및 면역원성을 평가하기 위하여 사용되는 건장한 동물 모델이다. MDCK 세포 배양물로부터 생산된 세포 유래의 인플루엔자 균주의 성능을 난에서 생산된 동일한 균주와 비교하였다. 대조 연구에서 이러한 물질들의 직접(head to head) 비교를 통해 이들 바이러스 산물이 매우 높은 수준으로 유사하다는 것을 확인할 수 있다.
흰족제비에서 2개의 백신의 감염시키는 능력 또는 "백신 접종" 달성 능력을 평가하기 위하여, 동물을 가볍게 마취시키고, 세포 또는 난에서 생산된 바이러스 조제물을 비강 내로 접종하였다. 동물의 상부 기도에서의 바이러스 복제의 역학과 그 정도를 평가하기 위해서, 접종 후 수 개의 다른 시기에 비강 세척물을 수거하고, 바이러스의 양은 수개의 이용가능한 방법 중 하나로 평가하였다. 실험은 다양한 투여량으로 수행하였고, 다수의 균주와 서로 다른 3가의 혼합물을 포함하도록 하여, 이로부터 난에서 생산된 균주에 대한 세포 배양물에서 배양된 균주의 상대적인 감염성을 일반화하였다. 또한, 이러한 동일한 연구는 감염을 개시하는 바이러스의 능력과 선천적으로 연관된 특성인 인플루엔자 균주의 면역원성을 평가하는데에도 사용하였다. 동물을 출혈시키고, 접종 후 다양한 시기(주 단위)에 비강 세척물을 수거하고; 이들 시험물을 감염에 대한 혈청 항체 반응 및 비강 IgA 반응을 평가하는데 사용하였다. 감염성, 혈청 항체 및 점막 항체 반응이라는 이들 데이터의 최고치를, 난에서 생산된 백신에 대한 세포에서 생산된 백신의 상대적인 감염성을 비교하여 평가하고자 사용할 것이다. 가장 그럴듯한 결과로, 세포 및 난에서 생산된 백신 균주가 유사한 감염성과 면역원성을 가질 것으로 예측되었다. 세포 유래의 백신이 난에서 유도된 산물보다 감염성이 우수하거나 면역원성이 우수한 경우에는, 보다 적은 양의 투여량의 가능성을 평가하는 추가의 연구를 수행하였다.
흰족제비 모델에서 다수의 면역원성 및 복제 연구를 수행하여, 인간에 대한 1회용의 투여량으로 세포 배양물에서 유도된 백신을 평가하였다. ca/ts/att 균주로 감염시켰을 때는 일반적으로 흰족제비에서 강하고 신속한 항체 반응이 유도되었다. 추가로, 개개의 ca/ts/att 균주를 통상적으로 시험하였더니, 이들 동물의 비인두(nasopharynx)에서는 상대적으로 고역가로 복제되나, 폐에서는 검출이 불가능한 수준으로 복제됨으로써 약독화성(att) 표현형을 발현하는 것으로 나타났다. 이러한 생물학적 형질에 대한 세포 배양 성장의 효과에 대해서도 평가하였다. 그러나, att 표현형도 이들 균주의 유전적 조성에 필수 부분이기 때문에 어떤 차이도 관찰될 가능성은 없었다. 이들 동물에서 단일 투여량으로 인간에게 투여한 후, 이들 균주의 성장 역학 및 교차반응성을 평가하였다. 난에서 유도된 물질로부터 제조된 생 약독화성 백신은 유전적 계통 내에서 다수의 균주와 교차반응하는 혈청 항체를 유도하였으며; 세포에서 유도된 백신도 동일한 능력을 가질 것이라고 예측되었다.
이러한 유사성 평가가 1차 바이러스 산물의 잠재적인 생화학적 및/또는 생물리학적 특징에 대한 유의성 있는 통찰력을 제공하여, 인간 세포 또는 동물 연구에서 이러한 후성적(epigenetic) 특징이 바이러스를 1차 계대배양하여 측정된 ca/ts/att 균주의 성능에 대해 미치는 효과를 입증했어야 했다. 그러나, 현재까지의 서열 정보에 기초하여 볼 때, MDCK 세포에서 생산된 ca/ts/att 균주의 면역원성 성능에 대한 기대되는 효과는 없었다.
흰족제비는 인플루엔자에 대해서는 기록에 의해 충분히 입증된 동물 모델이며, ca/ts/att 균주의 약독화성, 표현형 및 면역원성을 평가하기 위해 통상 사용된다. 일반적으로, 8-10주령의 동물을 사용하여 약독화성을 평가하고; 보통 연구는 시험물 또는 대조군당 3-5마리(n=3-5)의 동물을 평가하도록 고안된다. 8주령 내지 6월령 동물에서 면역원성 연구에 대해 평가하고, 일반적으로는 시험물 또는 대조군당 3-5마리(n=3-5)의 동물이 필요하였다. 이러한 동물의 개체수는 상기 동물군들 사이에 통계학적으로 유효하거나 관측상 의미 있는 비교치를 수득하기 위한 충분한 정보를 제공하였다. 대부분의 연구에서는 인플루엔자 유사 징후가 발견될 수도 있지만, 가능성은 없다. 흰족제비는 식욕 감퇴 또는 체중 감소, 코 또는 눈 분비물과 같은 징후를 보이지 않았고; 인플루엔자 유사 질병의 징후를 관찰하는 것이 본 연구의 필수 부분이고, 진통제와 같은 개입은 하지 않았다. 개방성 미란(open sore) 또는 현저한 체중 감소와 같은 다른 불편한 징후들도 동물에 있어서는 적절한 소인의 결과였고, 이는 이후 주치 수의사와 함께 논의하였다.
8.10 실시예 10: 세포 배양을 위한 무혈청 배지의 제조
본 실시예는 본 발명의 세포 배양을 위해 적절한 수개의 무혈청 배지 조성물을 기술한다. 이러한 배지의 일부를 이미 상기에 기술했지만, 사용의 숙달과 용이함을 위해, 각각을 하기에 충분히 기술한다.
Taub의 무혈청 배지 제조: Taub 배지[Taub and Livingston, 1981, Ann NY Acad Sci., 372:406]는 기초 배지 조성물로서 4.5g/L 글루코스와 4mM 글루타민을 함유하는 DMEM/HAM F12(1:1)로 구성된 무혈청 배지 조성물이며, 여기에 표 8에 나타난 바와 같이 호르몬/성장 인자를 첨가한다.
무혈청 배지 조성물에 첨가되는 호르몬 및 성장 인자
성분 명칭 최종 농도
인슐린 5㎍/mL
트랜스페린 5㎍/mL
삼요오드타이로닌(T3) 5×10-12M
하이드로코르티손 5×10-8M
프로스타글란딘 E1 25ng/ml
아셀렌산나트륨(sodium selenite) 10-8M
Taub SFM은 계대배양시 새로 제조하거나, SF DMEM/Ham F12 배지 + 4mM 글루타민 + 4.5g/L 글루코스 + 10-8M 아셀렌산나트륨에 호르몬 보충물의 저장액을 첨가함으로써 재공급하였다. 100㎕의 인슐린 저장액(5mg/ml), 100㎕ 트랜스페린 저장액(5mg/ml), 100㎕ 삼요오드타이로닌(T3) 저장액(5×10-9M), 5㎕의 하이드로코르티손 저장액(10-3M) 및 50㎕의 프로스타글란딘 E1 저장액(50㎍/mL)을 기초 배지인 DMEM/Ham F12 배지 + 4mM 글루타민 + 4.5g/L 글루코스 + 10-8M 아셀렌산나트륨에 첨가하여 100mL의 Taub 배지를 제조하였다. 모든 저장액은 하기와 같이 제조하였다:
인슐린 저장액 - 0.01 N HCl에 적절량의 인슐린을 용해시켜 5mg/ml 저장액을 제조하였다. 0.2 미크론의 멸균 등급 필터를 통해 용액을 통과시키고, 날진 냉동 바이알에 분취시켜 4-20℃에서 저장하였다.
트랜스페린 저장액 - MilliQ 수에 적절량의 트랜스페린을 용해시켜 5mg/ml 저장액을 제조하였다. 멸균 등급 필터를 통해 용액을 통과시킨 후, 날진 냉동 바이알에 분취시켜 < -20℃에서 저장하였다.
삼요오드타이로닌(T 3 ) 저장액 - 0.02N NaOH에 적절량의 T3을 용해시켜 10-4M 용액을 수득함으로써 저장액을 제조하였다. 이 저장액은 추가로 0.02N NaOH를 사용하여 5×10-9M 농도의 저장액으로 희석시키고, 멸균 등급 필터를 통해 용액을 통과시킨 후, 날진 냉동 바이알에 분취시켜 < -20℃에서 저장하였다.
하이드로코르티손 저장액 - 100% 에틸 알콜에 적절량의 하이드로코르티손을 용해시켜 10-3M 저장액을 제조하고, 날진 냉동 바이알에 분취시켰다. 상기 바이알을 4℃에서 3-4개월간 저장하였다.
프로스타글란딘 E 1 저장액 - 100% 멸균 에틸 알콜에 적절량의 PGE1을 용해시켜 50㎍/mL 저장액을 제조하고, 날진 냉동 바이알에 분취시켜 < -20℃에서 저장하였다.
Na 2 SeO 3 저장액 - WFI 수 또는 MilliQ 수에 적절량의 셀렌화나트륨을 용해시켜 10-2M 저장액을 제조하였다. 이를 추가로 최종 농도 10-5M가 되도록 물에 희석시키고 멸균 등급 필터를 통해 용액을 통과시킨 후, 4℃에서 저장하였다.
구연산철암모늄(FAC) 저장액 - WFI 수 또는 MilliQ 수에 적절량의 구연산철암모늄을 용해시켜 200 mg/L 저장액을 제조하고, 멸균 등급 필터를 통해 용액을 통과시킨 후, 4℃에서 저장하였다.
트로폴론 저장액 - WFI 수 또는 MilliQ 수에 적절량의 트로폴론을 용해시켜 250 mg/L 저장액을 제조하고, 멸균 등급 필터를 통해 용액을 통과시킨 후, 4℃에서 저장하였다.
MediV 무혈청 배지(MediV 101. 102, 103, 104 및 105)의 제조 : 각각의 MediV 무혈청 배지 조성물은 기초 배지로서 Taub 배지를 사용하였고, 하기와 같은 보충물이 첨가되었다:
MediV 101: Taub + 2.5g/L 소맥 펩톤 E1(오르가노 테크니크로부터 입수)(카달로그 번호 19559). 소맥 펩톤 E1은 멸균 250g/L 저장액으로서 물에 저장한다.
MediV 102: Taub + 최종 농도 1X로 첨가된 100 X 화학적으로 규명된 지질 농축물(기브코 BRL로부터 입수)(카달로그 번호 11905)
MediV 103: Taub + 최종 농도 1X의 지질 농축물(기브코로부터 입수) + 2.5g/L 소맥 펩톤 E1(오르가노 테크니크로부터 입수)
MediV 104: Taub + 최종 농도 1X의 지질 농축물(기브코로부터 입수) + 2.5g/L 소맥 펩톤 E1(오르가노 테크니크로부터 입수) + 5㎍/L EGF(다수의 공급처).
MediV 105: 트랜스페린을 포함하지 않는 Taub + 최종 농도 1X의 지질 농축물(기브코로부터 입수) + 2.5g/L 소맥 펩톤 E1(오르가노 테크니크로부터 입수) + 5㎍/L EGF + 0.2mg/L 구연산 철 암모늄 + 0.25mg/L 트로폴론.
M-32: 4 g/L 내지 4.5 g/L의 글루코스 농도를 갖는 MediV 105 + 최종 농도 1X의 미량 원소 용액 A, B 및 C(표 9). 선택적으로, M-32는 4 g/L 내지 4.5 g/L의 글루코스로 추가 보충된다(M-32+G).
MediV 107: 특정 미량 원소를 포함하는 MediV 105에 기초한 또다른 무혈청 배지. MediV 107의 최종 조성물은 표 10에 나타나 있다.
M18M 배지의 제조 : 추가로, M18M은 본 발명의 세포를 배양하는데 사용될 수 있는 또다른 무혈청 배지이다. M18M은 하기 표 11에 기재된 것과 같은 보충물을 포함하는 DMNSO-7 분말을 기초로 한 무혈청 배지이다.
Figure 112009022767906-PCT00014
Figure 112009022767906-PCT00015
Figure 112009022767906-PCT00016
Figure 112009022767906-PCT00017
Figure 112009022767906-PCT00018
Figure 112009022767906-PCT00019
8.11 실시예 11: 인플루엔자 바이러스의 고역가 성장
본 실시예는 온도 감수성, 저온 적응성 및 약독화성 인플루엔자 바이러스가 매우 높은 역가로 성장되는 것을 보여주는 실험 결과를 기술한다. 특히, 이 실험은 4개의 이러한 바이러스에 있어서 9 log10 TCID50/㎖의 바이러스 역가를 나타내었다.
MDCK 서브클론 1-A 또는 1-B를 MediV 105 또는 M18M 중에서 접종 후 3일간 배양한 후, 감염 직전에 성장 배지를 제거하고, 4.5 g/L 글루코스, 4mM 글루타민 및 TrypLE(1:100)(인비트로겐)가 보충된 MediV 105; M18M 또는 DMEM/F12 배지와 같은 신선한 배지를 첨가하였다. 이어서, FluMist™ 백본(예를 들어, HA 및 NA 단백질을 코팅하는 것을 제외한 모든 유전자 단편)과, A/뉴 칼레도니아, A/위스콘신, A/베트남, 또는 B/말레이시아의 HA 및 NA 단백질을 포함하는, 온도 감수성, 저온 적응성 및 약독화성 인플루엔자 바이러스 재조합체로 세포를 감염시켰다.
한 실험의 결과를 표 12에 나타내었다. 표 12는 8.2 log10 TCID50/㎖ 이상의 바이러스 역가를 유도할 수 있으며, 높게는 감염 후 2일, 3일, 4일 및 5일째에 9.1 log10 TCID50/㎖를 나타내었다. 이러한 데이터는 감염 전 또는 감염시 배지를 교환해주거나 고갈된 영양분을 보충해주는 것이 바이러스 수율을 증대시키는 결과를 가져온다는 것을 의미한다.
Figure 112009022767906-PCT00020
8.12 실시예 12: 일회용 생물반응기 공정
백신 물질의 생산을 위해 통상적으로 사용되는 표준 생물반응기 또는 발효조(즉, 스테인리스강 또는 유리 반응기)는 각각 사용 전에 청결할 것, 멸균 상태일 것 그리고 검증된 유효성이 요구된다. 이러한 청결성과 유효성에 대한 요구를 잠재우기 위해서, 일회용 생물반응기 기법을 이용하여 일회용 세포 배양법을 개발하였다. 이 방법으로 공정 시간을 단축시키는 것이 가능해져, 현저한 비용 절감이 이루어졌으며 백신 물질의 생산에 필요한 기반 시설을 감축할 수 있었다. 이 방법은 일회용 생물반응기(SUB)를 이용한다. 다양한 SUB 시스템이 시판되며 본 공정에서 이용될 수 있다. 간략하면, SUB 공정은 성장 배지 중의 미세담체 상에서 ~4일간 SF MDCK 세포를 성장시킨 후, 감염 배지로 성장 배지를 대체하는 배지 교환을 수행한 후에 인플루엔자 바이러스로 세포를 감염시키는 단계를 포함한다. 다르게는, 인플루엔자 바이러스로 세포를 감염시키는 단계는 배지 교환 없이 직접 진행시킬 수 있다. SUB를 접종하기 위한 세포는 부착성일 수 있으며, 롤러병으로부터 수득될 수 있거나 또는 부착 세포의 증식에 사용되는 용이하게 확장가능한 다른 배양법으로부터 수득가능하다.
50-100 rpm의 교반 속도가 세포 성장을 지원하지만, 90-100 rpm의 속도는 세포 성장을 향상시킬 수 있음이 실험적 연구로부터 입증되었다. 이보다 더 높은 교반 속도에 대해서는 이들 연구에서는 시험하지 않았다. 또한, 약 2-3 g/L의 미세담체 농도 및 ~9.O×1O4개 세포/mL(~10-15개 세포/MC에 해당함)의 세포 접종 농도역시 세포 성장과 바이러스 수율을 향상시켰음도 실험적 연구로부터 입증되었다. 추가로, 글루코스 보충된 배지를 사용하는 것 역시 세포 성장과 바이러스 수율을 개선시켰다. 이러한 실험적 연구와 다른 실험적 연구들에 기초하여, 감염 전 배지 교환을 수행한 SUB 방법과 배지 교환이 없는 SUB 방법을 개발하였다.
8.12.1. 재료
하이클론 SUB(Hyclone, 제품 번호 SH30715.01, SH30720.01 및 SH3B1744.01)를 본 실험을 위해 사용하였다. SUB는 3개의 주요 구성요소로 구성된다:
1. 콘트롤 유닛과 전기 히터 자켓으로 완전하게 작동하는 혼합기를 구비한 외부 지지 용기;
2. 일회용 생물반응기 생물공정 용기(BioProcess Container)(BPC) - 혼합기, 살포기, 벤트 필터 입구 및 출구 포트 이외에 센서 프로브의 집적을 위한 포트; 및
3. 혼합 드라이브 모터를 통해 생물반응기 BPC 내로 삽입되어 일회용 교반기 어셈블리 내로 고정되는 혼합기 샤프트 로드(Shaft Rod).
SUB의 하나 이상의 구성요소에 다양한 통상적인 변형을 가할 수 있는데, 예컨대 출구 포트를 확장시켜 물질 수거와 배지 교환을 촉진시킬 수 있으며, 유사하게 인라인 미세담체 필터도 물질 수거와 배지 교환을 촉진시킬 수 있다.
MediV 105(섹션 8.10 참고) 또는 4.5 g/L 글루코스가 추가된 MediV 105(최종 농도는 9.0 g/L, "MediV 105+G"로도 지칭됨)를 성장 배지로 이용하였다. MediV 105를 이용하는 경우, 글루코스가 고갈되는 것을 방지하기 위해 접종 후 2-3일째에 2OmM의 글루코스를 상기 배양물에 첨가할 수 있다. MediV+G의 글루코스 초기 농도를 보다 높게 설정하면 글루코스 보충에 대한 필요성은 사라질 것이다.
감염 배지는 DMEM/F12, 글루코스, 글루타민 및 정선된 TrypLE로 이루어진다. 표 13은 감염 배지 중의 각 성분들과 그 농도를 나타낸다.
감염배지
성분 최종 농도 DMEM /F12 1리터당 첨가량
DMEM/F12 1L/L 1000mL
글루코스 4.5g/L 10mL
L-글루타민 4mM 20mL
정선된 TrypLE 1:33 내지 1:100 20mL
8.12.2. 배지 교환을 이용한 방법
완충액 중에서 미세담체를 팽윤시킨 후 완충액을 세척하고 멸균시켜 미세담체 저장액을 제조하였다. 사용 전에, 완충액을 제거하고 적절한 배지를 첨가하였다. 예를 들어, 6Og의 사이토덱스 3 미세담체(SUB 중에서 총 수용 부피는 2g/L)를 5L 유리 공급병 중 pH 7.4의 PBS(Ca2+ 및 Mg2+ 없음, 50 mL/g 사이토덱스 3) 3.0L에 실온에서 3시간 이상 동안 담가 놓았다. 이어서, 상등액을 빨아들여 버리고 1.5L의 신선한 PBS(Ca2+ 및 Mg2+ 없음, pH 7.4)로 대체하였다. 이후, 상기 공급병을 121℃에서 30분간 오토클레이빙하여 미세담체를 멸균시켰다. 접종 직전에 PBS 용액을 흡인시켜서 버린 후, 4.0 L의 DMEM/F12 배지를 첨가하고 상기 멸균된 미세담체를 멸균 조건 하에 SUB에 첨가하였다. 다르게는, 사이토덱스 3 미세담체는 γ-방사선을 이용하여 현장에서(즉, SUB 봉지 내) 멸균될 수 있다.
SUB 접종을 위한 클론 1-B 세포는 1개의 냉동 바이알로부터 스케일링업하여 수득된다. 세포를 MediV 105 또는 MediV 105+G에서 성장시켜 하기와 같이 스케일링업할 수 있다: 1일째 1개의 해동된 바이알을 T-75 플라스크에 넣고; 3일째 되는날, 분열된 세포를 T-225 플라스크에 넣고(접종 농도
Figure 112009022767906-PCT00021
5×104개 세포/mL); 7일째 되는 날, 분열된 세포를 롤러병에 넣고(접종 농도
Figure 112009022767906-PCT00022
6.7×104개 세포/mL); 10일째 되는 날, 분열된 세포를 추가의 롤러병에 넣고(접종 농도
Figure 112009022767906-PCT00023
6.7×104개 세포/mL); 14일째 되는 날, ~30-36개의 롤러병의 세포를 트립신 처리하여 SUB 생물반응기를 접종하기 위해 사용하였다. 접종 파라미터는 표 14에 나타나 있다. 롤러병으로부터 수거한 트립신 처리된 풀의 세포를 정량송액펌프(peristaltic pump)를 사용하여 BPC의 추가 접종라인을 통해 30L의 SFMV 105 배지 중에 사이토덱스 3 미세담체를 포함하고 있는 SUB로 옮겼다. 배양물에는 글루코스 고갈을 예방하기 위해 접종 후 3일째 되는 날에 20mM의 글루코스를 보충할 수 있다.
표 15에 제시된 성장 파라미터 조건 하에 세포를 4일간 성장시켰다. pH를 애플리콘(Applikon) 콘트롤러를 이용하여, 처음에는 CO2를 살포하다가 이후의 배양 단계에서는 염기(NaOH, 1M)를 첨가하여 pH를 조절하였다. DO는 O2를 살포하여 애플리콘 콘트롤러를 이용해 ≥50%으로 조절하였다. 세포가 성장하는 동안에는 DO가 100%까지 올라가거나 35%까지 내려가도 상관없다. 온도는 하이클론 콘트롤러로 적절한 정도로 조절된다. 교반 속도는 하이클론 콘트롤러로 100rpm으로 조절된다.
접종 파라미터
수용 부피 30±1L
미세담체(MC) 농도 2 내지 3±0.2g/L
미세담체의 양 60 내지 90±1g
세포/MC(계산값) 15±5
접종 농도(세포수/mL) 9.0±1.5×104
성장 파라미터
교반 속도 100±10 rpm
온도 37(±0.5)℃
pH 7.4(±0.1)
용존 산소량(OD) [공기 포화도] ≥35% [50%로 조절됨]
O2 유속 [최대값] (L/분) 1.0±0.2
CO2 유속 [최대값] (L/분) 0.20±0.04
감염 후 4±0.5 일째에 감염을 완료하였다. 감염 전에, 핵 계수를 수행할 수 있다. 이때, 세포는 0.5-2.0×106개 세포/mL의 농도가 될 것이고 ~1.0×106개 세포/mL의 세포 농도에 도달할 것으로 일반적으로 예측되었다. 핵 계수 후에, 필요하다면, 모든 제어 루프를 중단시키고 미세담체 비드를 ~45분간 정치시켰다. 이어서, SUB의 배지 교환 포트를 통하여 성장 배지를 펌핑하여 배지 교환을 수행한 후, 감염 배지를 배지 첨가 포트를 통해 30L의 최종 부피로 첨가하였다. 약 20-24 L를 제거하고 동량의 신선한 배지를 첨가하였다. 이는 대략 66-80%의 배지 교환에 해당하였다. 감염에 대한 파라미터는 표 16에 나타나 있다.
감염 파라미터
수용 부피 30L
교반 속도 100±10 rpm
온도 33(±0.5)℃
pH 7.4(±0.1)
용존 산소량(OD) [공기 포화도] ≥35% [50%로 조절됨]
O2 유속 [최대값] (L/분) 1.0±0.2
CO2 유속 [최대값] (L/분) 0.20±0.04
~0.001-0.003 FFU/세포의 MOI(감염다중도)로 감염을 수행할 수 있다(하기 식 참조).
SUB에 첨가된 바이러스의 양(μL)
= SUB 중의 총 세포 × MOI(FFU/세포)/10바이러스 FFA 역가(FFU/mL) × 1000
다르게는, 공정 단계를 최소화하기 위하여, 2×103 FFU/mL의 바이러스를 첨가할 수 있다. 이는 ~0.001-0.003 FFU/세포의 MOI에 해당하는 것이다. 이러한 조건 하에 SUB에 첨가된 바이러스의 양(μL)은,
= 반응기의 부피(mL) × 2×103 FFU/mL/10바이러스 FFA 역가(FFU/mL) × 1000
모니터링을 위해 샘플링 공정 절차를 여러 단계에서 이용할 수 있다. 핵 계수, 사진 촬영 및 pH와 대사 산물(글루코스, 글루타민, 락테이트, NH4 +) 분석을 위해, 접종 후 접종 당일부터 4일째 되는 날까지 매일 2×10㎖의 감염전 세포 현탁액을 수거하였다(감염 전). 2×5mL의 감염후 시료를 감염 후 2일째와 3일째에 채취하였다(감염 후). 상기 시료를 수크로스 인산염(수크로스 인산염:바이러스 상등액 = 1:9)으로 안정화하였다. 상기 시료를 바로 동결시켜 -80℃에서 저장하여 바이러스 역가를 측정하는 사용할 수 있도록 하였다.
감염 후 3일째(+/-12h) 되는 날에 바이러스 수거물을 수득하였다. SUB와 애플리콘 상의 콘트롤러를 중지시키고 미세담체를 45분 이상 정치시켰다. 이어서, 상등액을 멸균 일회용 봉지로 옮겨서 1:9 비율(V/V)의 수크로스 인산염(수크로스 인산염:바이러스 수거물 = 1:9)으로 안정화하였다. 수크로스 인산염은 중량이 아닌 부피로 칭량하여 첨가해야 한다.
8.12.3. 배지 교환의 결과
본 섹션에서는 서로 다른 배지, 섹션 8.12.2에 기술된 접종 파라미터와 감염 파라미터를 시험하는 다수의 SUB 생산 가동의 결과를 요약하였다. 표 18에 나타난 바와 같이, 시험된 모든 변수로부터 8.0 log10 FFU/mL 이상의 바이러스 역가의 피크를 유도해 내었는데, 이는 배지 교환을 수행한 SUB 공정이 확고한 방법이라는 것을 입증한 것이다.
하나의 B/말레이시아 생산 공정(SUB 공정 A)에 있어서, 미세담체(MC)의 농도는 3 g/L(수용 부피, 30L)이었고, 세포 접종 농도는 10개 세포/MC 또는 ~9.O×104개 세포/mL였다. 배양물에 글루코스 고갈을 방지하기 위해 접종 후 3일째 되는 날에 2OmM의 글루코스를 보충하였다. MDCK 서브클론 1-B를 사용하여 접종 후 4일째 되는 날에는 세포 농도가 ~1.3×lO6개 세포/mL에 달하였다. 표 15에 기재된 남아있는 성장 파라미터들도 전 성장 단계에 걸쳐 기술된 바와 같이 유지시켰다. 표 17은 B/말레이시아 생산 공정에 대한 세포 성장 데이터와 배가 시간을 나타낸 것이다. 세포 성장 곡선은 도 13에 도시하였고, 또한 B/말레이시아 생산 공정에 있어서 바이오프로파일에 의해 측정된 글루코스와 락테이트, 글루타민과 암모늄 이온 농도의 대사 산물 분석도 그래프로 도시하였다.
세포 성장
시간(h) 총 세포 밀도 ×106 세포/mL 배가 시간(h)
0.15 0.09
21.67 0.10 141.55
46.00 0.30 15.35
65.33 0.60 19.57
70.00 0.69 21.84
88.83 1.30 20.61
배가 시간은 대수기(exponential phase) 동안에 약 20시간이다. 접종 후 4일째 되는 날, ~67%의 배지를 최종 농도 1:100으로 TrypLE를 포함하는 감염 배지(상기 참조)로 교환하였다. 이어서, 세포를 0.001 FFU/세포의 MOI에서 B/말레이시아/2506/04로 감염시켰다. 표 16에 나타난 감염 파라미터를 감염기 내내 유지하였다. 감염 후(dpi) 2일째와 3일째 되는 날에 채취한 시료를 형광 포커스 분석법(FFA)를 이용하여 분석해 바이러스 감염성을 측정하였다. 바이러스 역가는 ~2dpi에서 약 8.0 log10 FFU/mL로 피크에 달하는 것으로 나타났다. 본 가동 공정과 다른 가동 공정에서 최종 농도 1:100의 TrypLE를 이용하여 수득된 바이러스 역가의 피크는 8.0 log10 FFU/mL 이상이었던 반면에, 이보다 더 낮은 역가는 흔히 볼 수 있어(데이터는 도시하지 않음), 더 높은 TrypLE 농도(1:33 내지 1:50)를 일반적으로 사용하였다.
2g/L의 미세담체와, 성장 배지로서 글루코스를 추가로 보충하지 않은 MediV 105+G를 이용하여 2개의 SUB 공정을 수행하였다. MDCK 서브클론 1-B를 ~9.0×104개 세포/mL(~15개 세포/MC에 해당함)의 접종 농도로 사용하였다. 감염 전에 ~80%의 배지를 교환하고 정선된 TrypLE를 최종 농도 1:100(SUB 공정 B) 또는 1:10(SUB 공정 C)으로 첨가하였다. 세포를 2×103 FFU/mL의 바이러스 농도로 감염시켰다. 이들 가동 공정에 대한 바이러스 역가의 피크는 8.4 log10 FFU/mL[A/위스콘신](SUB 공정 B)와 8.7 log10 FFU/mL[A/뉴 칼레도니아](SUB 공정 C)였다.
2g/L의 미세담체와, 성장 배지로서 글루코스를 추가로 보충하지 않은 MediV 105+G를 이용하여 6개의 추가의 생산 가동 공정(SUB 공정 D - I)을 수행하였다. 전과 같이, MDCK 서브클론 1-B를 ~9.0×104개 세포/mL(~15개 세포/MC에 해당함)의 접종 농도로 사용하였다. 남은 성장 파라미터는 표 15에 기술된 대로 유지시켰다. 접종 후 4±0.5일째 되는 날에, ~66%의 성장 배지(MediV 105+G)를 제거하고 1:33의 최종 농도로 TrypLE를 포함하는 동량의 감염 배지(표 13 참조)를 첨가하였다. 이어서, 세포를 2×103 FFU/mL의 바이러스 농도로 A/뉴 칼레도니아/20/99; A/위스콘신/67/05; 또는 B/말레이시아/2506/04를 이용하여 감염시키고, 감염 파라미터를 감염기 내내 표 16에 나타난 바와 같이 유지시켰다. SUB 공정에 대한 바이러스 역가의 피크는 표 18에 나타나 있으며 8.55-8.75 log10 FFU/mL 범위였다. 세포 성장, 글루코스, 락테이트, 글루타민 및 암모늄 이온 프로파일은 SUB 공정 A에서 나타난 프로파일에 견줄만하였다(도 13을 참조하며, 데이터는 도시하지 않았음).
SUB 공정에 대한 바이러스 역가의 피크값
SUB 가동 피크 역가 (log10 FFU/mL) 바이러스 SUB 가동 피크 역가 (log10 FFU/mL) 바이러스
A 8.0 B/말레이시아 F 8.7 A/뉴 칼레도니아
B 8.4 A/위스콘신 G 8.8 A/뉴 칼레도니아
C 8.7 A/뉴 칼레도니아 H 8.6 A/위스콘신
D 8.6 B/말레이시아 I 8.6 A/위스콘신
E 8.7 B/말레이시아
8.12.4. 배지 교환을 하지 않은 결과
배지 교환 단계를 없애면 비용을 절감할 수 있고 공정 효율을 개선할 수 있을 것이다. 1:100(~0.01x)의 TrypLE 희석액에서 초기 시험은, 영양화 성장 배지가 TrypLE의 작용을 저해하는 하나 이상의 성분을 포함하여 바이러스 성장을 저해할 수 있음을 시사하였다(데이터는 도시하지 않았음). TrypLE의 농도를 다양하게 하여 실험적 연구를 수행하였다. 간략하면, 표준 조건 하에 2L의 생물반응기에서 4일간 MDCK 세포를 성장시켰다(모 배양물). 이어서, A/뉴 칼레도니아로 감염시키기 직전에, 모 배양물을 사용하여 서로 다른 농도의 배지 교환과 서로 다른 TrypLE 농도를 갖는 세이크(shake) 플라스크를 접종시켰다. 4개의 서로 다른 희석도/농도의 TrypLE[1:100(~0.01x); 1:50(~0.02x); 1:33(~0.03x); 및 1:25(~0.04x)]를 사용하였다. 2dpi와 3dpi에서 플라스크로부터 바이러스 역가를 위한 시료를 채취하였다. 2dpi와 3dpi에서 각 배지 교환 비율에 대해 수득된 바이러스 역가를 도 14A에 도시하였다. 이들 데이터는 배지 교환을 하지 않고도, 1:25-1:33으로 TrypLE를 첨가하면 8 log10 FFU/mL에 근접한 역가를 만들어 낼 수 있음을 보여준다. 이들 데이터에 기초하면, 1:16의 희석도의 TrypLE는 배지 교환 없이도 높은 역가를 나타낼 수 있을 것이다. 보다 높은 TrypLE 농도에서 유사한 실험을 수행하였다. 간략하면, 모 배양물을 상기 기술된 바와 같이 제조하고 A/뉴 칼레도니아로 감염시키기 직전에, 모 배양물을 배지 교환 없이 1:1-1:25(0.5x-0.04x TrypLE 농도에 해당함)로 사용하여 세이크 플라스크를 접종시켰다. 2dpi와 3dpi에서의 바이러스 역가의 피크를 측정하여 도 14B에 도시하였다. 여기에서, 배지 교환을 하지 않고 처음으로 8 초과의 바이러스 역가를 수득하였다. 이러한 데이터로부터 최적의 TrypLE 농도는 1:25-1:12.5 희석도이며, 보다 높은 농도의 TrypLE는 바이러스 수율을 개선시키지 못함을 알 수 있다. 이러한 결과에 기초하여, 배지를 교환한 경우와 배지를 교환하지 않은 경우(각각 1:33 및 1:12.5 희석도의 TrypLE를 사용)에 있어서, 2개의 추가 바이러스 균주인, B/말레이시아/2506/04 및 A/베트남/1203/2004의 생산성에 대해 검사하였다. 시간의 경과에 따른 바이러스 역가를 도 14C에 도시하였다. B/말레이시아/2506/04에 대한 바이러스 역가의 피크는 8.9와 8.7 log10 FFU/mL(각각 배지를 교환한 경우와 배지를 교환하지 않은 경우)였다. 유사하게, A/베트남/1203/2004에 대한 바이러스 역가의 피크는 8.6과 8.0 log10 FFU/mL(각각 배지를 교환한 경우와 배지를 교환하지 않은 경우)였다. 따라서, TrypLE의 양을 1:12.5 희석도(0.08x에 해당함)로 증가시키는 것은, 배지 교환 없이도 8 log10 FFU/mL 이상의 바이러스 역가의 피크를 유도해낼 수 있었던 영양화 배지의 효과를 보상할 수 있는 것이다.
8.13 실시예 13: MOI의 최적화
다른 인플루엔자 균주의 잇따른 출현(또는 재현)으로 인해, 이러한 유행하는 인플루엔자 균주에 기초하여 매 시즌마다 새로운 인플루엔자가 생산된다. 불행히도, 일부 인플루엔자 백신 균주(예를 들어, 저온 적응성, 온도 감수성 재조합된 백신 균주)는 높은 역가로 증식시키기가 더 어렵다. 생물반응기의 역가는 생산 용량을 규정해줄 뿐 아니라 생산물 제조 비용에도 영향을 주기 때문에, 바이러스 역가(즉, 바이러스 역가의 피크값)를 개선시키는 것이 바람직하다. 상기 언급된 바와 같이, 백신 균주의 생산성을 최적화하기 위해 여러 파라미터들을 검사하였다. 여기에 수개의 균주에 대해 생산성(즉, 바이러스 역가)을 증대시키기 위한 연구들의 결과를 요약하였다. 이들 연구는 수율을 최적화하고 신속한 스케일업 및 주기적이며 유행성인 백신 균주의 생산이 가능하게 할 수 있도록 쉽게 시험하여 조절할 수 있는 파라미터로서 MOI(MDCK 세포 당 감염을 위해 사용되는 바이러스 입자)를 확인하였다.
이러한 연구는 생물반응기에서 MDCK 서브클론 1-B 세포를 증식시킨 후 세이크 플라스크 중의 상기 세포를 서로 다른 양의 바이러스로 감염시키는 단계에 의해 수행되었다. 연구의 상세한 사항은 다음과 같다: 3L의 생물반응기 용기 중에서 2 g/L의 사이토덱스 3 미세담체를 포함하는 M-32+G를 ~15개 세포/미세담체로 MDCK 서브클론 1-B 세포를 이용하여 접종시켰다. 세포를 37℃, 90 rpm, pH 7.4 및 50% DO(O2와 CO2 살포에 의해 조절됨)의 조건에서 성장시켰다. 접종 후 ~4일째(dps)에, 생물 반응기 중의 66%의 성장 배지를 감염 배지[DMEM/F12 + 4.5g/L D-글루코스 + 4mM L-글루타민 + 정선된 1XTrypLE(최종 농도 1:33)]로 교환하였다. 동량의 배양물(30㎖)을 서로 다른 125㎖의 세이크 플라스크로 옮겼다. 이들 세이크 플라스크를 서로 다른 양의 특정 바이러스 균주로 감염시켰다(즉, 2, 20, 200, 2000 및 20000 FFU/㎖, 이는 각각 대략 1×10-6, 1×10-5, 1×10-4, 1×10-3 및 1×10-2 FFU/세포에 해당함). 감염 후, 상기 플라스크를 330℃, 100rpm으로 배양시켰다. 살아있는 세포의 밀도, 대사 산물의 농도(감염 전과 후 모두) 및 감염 후 다양한 시기의 바이러스 역가(예컨대, 감염 후 1일째, 2일째, 3일째 및 4일째(dpi))를 비롯한 다수의 파라미터를 모니터링하였다. 본 연구에서 시험된 4개의 균주에 대한 바이러스 역가의 피크 결과값을 표 19에 나타내었다. 시험된 각 균주에 있어서, 바이러스 역가의 피크값은 MOI가 ~1×10-3 FFU/세포(상기 섹션 8.12에 기술된 SUB 공정에서 사용된 MOI)에서 ~1×10-4 FFU/세포로 감소될 때 증가한 것으로 나타났다. 관찰된 바이러스 역가 피크의 증가분은 0.3 log10 FFU/㎖ 내지 1.3 log10 FFU/㎖ 범위였다. 일부 경우에 있어서 바이러스 역가의 피크값은 감염 후 경과일이 서로 다른 시점에 수득된다는 점을 주지하여야 한다(즉, 2dpi 또는 3dpi). 이는 1×10-3 FFU/세포의 MOI와 비교해 더 낮은 1×10-4 FFU/세포의 MOI에서의 바이러스 증폭 역학(viral amplification kinetics)의 차이 때문인 것으로 보이며, 이러한 경향은 생물반응기 생산 공정에서 바이러스 수거 시간을 이에 따라 조절해야 한다는 것을 보여주고 있다.
세이크 플라스크 결과를 확인하기 위해 생물반응기 연구를 수행하였다. 본 연구를 위해, 상기 기술된 바와 같은 3L의 생물반응기 중에서 5개의 유사한 마스터 세포 배양물을 제조하였다. 살아있는 세포의 밀도 및 글루타민, NH4 +, 글루코스와 락테이트의 세포 대사 산물의 프로파일은 모든 생물반응기에서 유사하였다(데이터는 도시하지 않음). 접종 후 ~4일째(dps)에, 생물 반응기 중의 66%의 성장 배지를 감염 배지[DMEM/F12 + 4.5g/L D-글루코스 + 4mM L-글루타민 + 정선된 10XTrypLE(최종 농도 1:330)]로 교환하였다. 서로 다른 양인, 2, 20, 200, 2000 또는 20000 FFU/㎖(이는 각각 대략 1×10-6, 1×10-5, 1×10-4, 1×10-3 및 1×10-2 FFU/세포의 MOI에 해당함)의 A/솔로몬 아일랜드/3/06를 이용하여 상기 5개의 배양물을 감염시킨 후 33℃에서 배양하였다. 다른 모든 감염후 성장 파라미터는 감염전 마스터 세포 배양물의 성장에 대해서와 동일하였다. 도 15는 서로 다른 MOI를 이용하여 수득된 시간의 경과(감염 후 시간)에 따른 바이러스 역가를 도시하고 있다. 박스로 묶은 영역(우측에 확대시킴)은 감염 후 3일째 되는 날에 2000 FFU/mL으로 감염된 배양물이 8.3 log10 FFU/mL의 바이러스 역가의 피크값을 갖는 반면, 20 FFU/mL으로 감염된 배양물은 8.5 log10 FFU/mL의 바이러스 역가의 피크값을 나타내는 것을 보여준다(0.2 log10 FFU/mL 개선됨). 유사하게, 감염 후 4일째 되는날에 2 FFU/mL으로 감염된 배양물도 8.5 log10 FFU/mL의 역가 피크값을 달성하고 있다. 더불어, 이러한 연구는 MOI를 감소시키면 바이러스 역가의 증대를 가져올 수 있다는 것을 시사하며, 이러한 방법은 특정 백신 균주의 생산 수율을 증가시키는데 유용함을 입증하는 것이다. 상기 연구는 최적의 수거 시간은 사용된 MOI를 기초로 결정되어야 함을 추가로 지적하고 있다.
세이크 플라스크에서 MOI의 최적화
바이러스 균주 MOI(FFU/mL)에서 바이러스 역가의 피크값 역가의 개선 정도
0.001-0.003* 0.0001**
A/위스콘신/67/05 8.7 9 0.3 Log10FFU/mL
A/솔로몬 아일랜드/3/06 8.3 9.2 0.9 Log10FFU/mL
A/캘리포니아/07/2004 7.1 7.9 0.8 Log10FFU/mL
A/홍콩/491 H5+486 N1/1997 7.9 9.2*** 1.3 Log10FFU/mL
주: *SUB 유사 공정에 대한 MOI = 2000 FFU/mL **MOI는 200 FFU/mL에 해당함 ***1.0×10-6 FFU/세포의 MOI에서 관찰된 바이러스 역가의 피크값
8.14 실시예 14: 비드간 이동(Bead to Bead Transfer)
세포의 대규모 배양은 배양물 중에서 세포수를 스케일업시키는 것이 필요하다. 부착 세포가 사용되는 경우, 이러한 스케일업 공정은 일반적으로 플라스크 또는 미세담체의 세포를, 예컨대 프로테아제 처리에 의해 순차적으로 해리시키는 작업, 상기 해리된 세포를 보다 큰 플라스크 또는 보다 많은 수의 미세담체에 희석시키는 작업을 포함한다. 상기 스케일업 공정 동안에 세척 및/또는 배지 교환 단계 횟수를 최소화시키면 효율성을 향상시킬 수 있고 오염 가능성을 감소시킬 수 있다. 상기 기술된 SUB 방법은 30개 내지 36개의 별개의 롤러병으로부터 수확된 세포를 사용해야만 하고, 이들 각각은 트립신 처리를 해야하고 개별적으로 수거해야 한다. 하기 기술된 방법은 3L의 용기에서 20L의 용기로 스케일업하는데 사용되는 취급 단계의 수를 감소시키는데 이용될 수 있는 한 방법이다. 상기 기술된 30L의 SUB 공정과 같은 더 큰 생물반응기 공정에서 사용을 위해서도 이와 유사한 전략법을 수행할 수 있다.
3L 생물반응기 제조 : 1. 4g의 사이토덱스 3을 3L의 생물반응기에 첨가한다. 500㎖의 DPBS(Ca, Mg이 없는 PBS)를 첨가하여 미세담체를 4-6시간 동안 수화시킨다.
2. 바닥의 미세담체를 건드리지 않고 300㎖의 DPBS를 제거하기 위하여 딥튜브(dip tube)를 사용한다. 300㎖의 신선한 DPBS를 첨가하고 용기를 121℃에서 30분간 오토클레이브한다.
3. 반응기를 냉각시킨 후, 300㎖의 DPBS를 제거하고 300㎖의 배지(M-32)를 용기에 첨가한다. 반응기 내용물을 완전히 혼합하고 용기 바닥으로부터 모든 미세담체를 떼어내기 위해, 용기 내용물을 200rpm에서 10분간 교반한다.
4. 교반을 중지하고 모든 미세담체가 가라앉은 후 300㎖의 배지를 제거한다.
5. 1.6 L의 신선한 기초 배지를 반응기에 넣고 파라미터들을 밤새 안정화시킨다. 본 공정의 파라미터들은 pH 7.2, 온도 37℃, 교반속도 120 rpm, 공기 살포속도 50 mL/분이다.
20L 생물반응기 제조 : 1. 28g의 사이토덱스 3을 5L의 병에 첨가한다. 3L의 DPBS(Ca, Mg이 없는 PBS)를 첨가하여 미세담체를 4-6시간 동안 수화시킨다. 바닥의 미세담체를 건드리지 말고 2L의 DPBS를 제거한다. 2L의 신선한 DPBS를 첨가하고 용기를 121℃에서 30분간 오토클레이브한다.
2. 2L의 DPBS를 제거하고 2L의 배지를 병에 첨가한다. 병을 세게 흔들어 미세담체가 현탁액 중에 존재하는지를 확인한다. 2L의 배지를 제거하기 전에 미세담체가 가라앉도록 놔둔다. 신선한 배지를 미세담체에 첨가하여 미세담체 용액의 총 부피가 3L가 되도록 한다.
3. 신선한 배지와 미세담체 용액을 첨가하여 생물반응기 중의 총 부피가 14L가 되도록 확인하고 공정 파라미터들을 밤새 안정화시킨다. 본 공정의 파라미터들은 pH 7.2, 온도 37℃, 교반속도 120 rpm, 공기 살포속도 400 mL/분이다.
3L 생물반응기 성장기 작동 : 1. 샘플링 및 NOVA 바이오프로파일을 이용한 분석 후에 pH와 용존 산소량 기록을 영점 조정한다.
2. 세포 공장으로부터 수거된 배양물을 첨가하여 9E4 세포/mL(미세담체 비드 당 15개 세포)의 목표 세포 밀도에서 생물반응기를 접종한다. 배지를 첨가하여 최종 수용 부피를 2L로 한다.
3. 50%의 설정치로 D.O. 조절을 시작한다.
4. NOVA를 이용한 분석, 핵 계수기 및 현미경 이미지 촬영을 위해 매일 시료를 채취한다.
비드간 이동 프로토콜 : 1. 3L 용기에서 세포가 성장한지 96시간 후에, 교반기, 기체 흐름 및 DO와 온도 조절을 중지시킨다. 미세담체가 가라앉도록 놔둔다.
2. 용기 바닥의 미세담체를 건드리지 말고 배지를 딥튜브를 이용해 제거(>80%)한다.
3. DPBS(Ca, Mg이 없는 PBS)를 첨가하여 원래의 수용 부피까지 부피를 증가시킨다.
4. 교반 속도 설정치를 180rpm으로 높인다. 교반기를 10분간 작동시켜 남아있는 배지의 미세담체를 세척한다.
5. 교반기를 중지시키고 미세담체가 바닥에 가라앉도록 놔둔다.
6. 딥튜브를 통해 생물반응기 중의 ~50%의 액체를 제거한다. 제거 후 온도 프로브와 교반기가 완전히 침지되어 있는지 확인한다(남아있는 부피는 대략 1L임).
7. 교반기를 작동시키고 온도를 조절한다. 반응기의 온도가 37℃가 될 때까지 기다린다.
8. 생물반응기에 5X TrypLE(남아있는 부피의 5-7%)를 첨가한다.
9. 1M 탄산나트륨을 첨가하여 반응기 내용물의 pH를 7.9±0.1로 조절한다.
10. 50±10분간 트립신 처리하면서 간헐적으로 시료를 채취하여 현미경으로 세포가 분리되었는지를 확인한다.
11. 5X 리마콩 트립신 저해제(LBTI)를 TrypLE와 정확히 동일한 부피로 첨가한다.
12. 신선한 배지를 첨가하여 원래의 수용 부피(2L)로 부피를 증대시킨다.
13. 모든 반응기 내용물을 2OL의 생물반응기로 옮긴다(1:8 분할).
감염 파라미터 : 여기에서 사용된 비드간 이동 조건 하에서, 감염을 하루 지연(~5일째 감염)시키는 비드간 이동 후에 세포는 롤러병에서의 이동(~4일째 감염)과 비교하여 약간 더 느린 성장을 나타냈다. 감염은 근본적으로 SUB 공정에서 기술된 바와 같이(상기 섹션 8.12 참조) 세포 밀도가 ~1×106개 세포/mL에 도달하게 될 때에 수행하였다. 감염이 하루 지연되었지만, 비드간 이동을 이용한 바이러스 역가의 피크값은 상기 섹션 8.12에 기술된 방법과 유사한 이동 조건을 이용하여 수득된 피크값과 유사하였다(표 20 참조). 따라서, 비드간 이동법을 사용하면 바이러스 수율을 줄이지 않으면서 조작 횟수를 줄일 수 있다.
바이러스 역가의 피크값
바이러스 균주 비드간 이동 롤러병간 이동
B/말레이시아/2506/04 8.8 8.5
A/위스콘신/67/05 8.5 8.5
A/솔로몬 아일랜드/3/06 8.1 8.2
본 발명을 구체적인 실시양태를 참조로 개시하였지만, 본 발명의 본질적인 개념과 범위를 벗어나지 않고 당업계의 숙련자에 의해 본 발명의 다른 실시양태와 변형들도 고안될 수 있음은 명백하다. 첨부된 청구범위는 이러한 모든 실시양태들과 균등한 변형 양태들도 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 예를 들어, 상기 기술된 모든 기법과 장치들은 다양하게 조합하여 사용될 수 있다. 개개의 간행물, 특허, 특허 출원 또는 기타 문헌이 개별적으로 여하의 모든 목적을 위해 참고로 포함된다고 기재하고 있듯이, 이와 동일하게, 본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 또는 기타 문헌은 그 전체 내용이 여하의 모든 목적을 위해 참고로서 포함된다. 또한, 미국 가출원 제60/845,121호(2006년 9월 15일 출원); 제60/871,721호(2006년 12월 22일 출원); 제60/917,008호(2007년 5월 9일 출원); 및 제60/951,813호(2007년 7월 25일 출원)는 여하의 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 본원에 참고로서 포함된다. 본원에서 참고문헌을 인용하거나 거론하는 것은 이러한 문헌이 본 발명에 대하여 선행 기술임을 인정하는 것으로 해석되어서는 안되며, 특허 문헌의 인용은 그 확실성을 인정하는 것으로 이해되어서는 안된다.

Claims (25)

  1. 마딘-다비 개과 신장(Madin-Darby Canine Kidney, MCDK) 세포로서, 상기 MDCK 세포를 다수로 포함하는 세포 배양 조성물은 저온 적응된 인플루엔자 바이러스의 복제를 약 7.8 이상의 log10 TCID50/㎖(밀리리터 당 평균 조직 배양 감염 용량의 상용로그) 또는 약 7.8 이상의 log10 FFU/㎖(밀리리터 당 형광 포커스 유닛의 상용로그)까지 지원하는 것인 마딘-다비 개과 신장 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포 배양 조성물은 혈청을 함유하지 않는 것인 MDCK 세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 MDCK 세포는 부착성인 것인 MDCK 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 MDCK 세포는 비종양형성성 및/또는 비종양원성인 것인 MDCK 세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 MDCK 세포는 ATCC 등록 번호 PTA-7909 또는 PTA-7910으로 동정되는 것인 MDCK 세포.
  6. 제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 또한 약독화성 및 온도 감수성인 것인 MDCK 세포.
  7. 제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 균주 A/앤 아버/6/60 또는 B/앤 아버/1/66의 유전자 단편을 하나 이상 포함하는 것인 MDCK 세포.
  8. 일회용 생물반응기(SUB) 시스템에서 제1항의 MDCK 세포를 약 1×106개 이상 세포/㎖의 세포 밀도로 증식시키는 방법으로서,
    제1항의 MDCK 세포를 이용하여 약 1×104개 내지 약 12×104개 세포/㎖의 접종 농도로 무혈청 세포 배양 배지를 접종하는 단계와,
    (a) 약 50 내지 150 rpm의 교반 속도;
    (b) 약 6.0 내지 약 7.5의 pH;
    (c) 약 35% 내지 약 100%의 용존 산소량(DO); 및
    (d) 약 33℃ 내지 약 42℃의 온도
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 배양 조건을 유지하면서 상기 세포를 배양시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 MediV-105, 글루코스 보충된 MediV- 105, M-32, 글루코스 보충된 M-32, MediV-107 및 글루코스 보충된 MediV-107로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 MDCK 세포는 부착성 MDCK 세포이며, 미세담체가 상기 세포를 배양하는데 사용되는 것인 방법.
  11. 세포 배양물에서 저온 적응된 인플루엔자 바이러스를 약 7.8 이상의 log10 TCID50/㎖로 생산하는 방법으로서,
    (a) 제1항의 MDCK 세포를 이용하여 약 1×104개 내지 약 12×104개 세포/㎖의 접종 농도로 동물성 단백질이 없는 세포 배양 배지를 접종하는 단계와, 약 50 내지 150 rpm의 교반 속도, 약 6.0 내지 약 7.5의 pH 및 약 35% 내지 약 100%의 용존 산소량(DO)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 배양 조건을 유지하면서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 일회용 생물반응기(SUB) 시스템에서 제1항의 MDCK 세포를 약 1×106개 이상 세포/㎖의 세포 밀도로 증식시키는 단계;
    (b) 상기 증식된 MDCK 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키는 단계;
    (c) 인플루엔자 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에 상기 감염된 증식 MDCK 세포를 배양하는 단계; 및
    (d) 세포 배양 조성물로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계
    를 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 단계 (a) 동안에는 상기 세포 배양물에 신선한 배지 또는 추가 배지 성분을 첨가하는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 단계 (b) 동안 또는 이전에는 세포 배양 배지의 일부를 제거하여 신선한 배지로 대체하거나, 세포 배양 배지를 제거하는 일 없이 신선한 배지로 대체하는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 MediV-105, 글루코스 보충된 MediV-105, M-32, 글루코스 보충된 M-32, MediV-107 및 글루코스 보충된 MediV-107로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 MDCK 세포는 부착성 MDCK 세포이고, 미세담체는 상기 세포를 배양하는데 사용되는 것인 방법.
  16. 제11항에 있어서, 단계 (b)는 약 0.00001 내지 약 0.003 FFU/세포의 감염다중도(MOI)로 수행하는 것인 방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 단계 (c)의 조건은 약 50 내지 150 rpm의 교반 속도, 약 6.0 내지 약 7.5의 pH, 약 35% 내지 약 100%의 용존 산소량(DO) 및 약 30℃ 내지 약 35℃의 온도로 이루어진 군으로부터 선택하는 것인 방법.
  18. 제11항에 있어서, 상기 MDCK 세포는 ATCC 등록 번호 PTA-7909 또는 PTA-7910으로 동정되는 것인 방법.
  19. 제11항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 또한 약독화성 및 온도 감수성인 것인 방법.
  20. 제11항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 균주 A/앤 아버/6/60 또는 B/앤 아버/1/66의 유전자 단편을 하나 이상 포함하는 것인 방법.
  21. 바이러스 조제물로부터 DNA 오염물을 제거하는 방법으로서,
    (a) 친화성 크로마토그래피 매질 상에 DNA 오염물이 보유되지 않고, 바이러스 조제물에 존재하는 바이러스가 보유되도록 하는 조건 하에 상기 바이러스 조제물을 친화성 크로마토그래피 매질에 통과시키는 단계;
    (b) 상기 친화성 크로마토그래피 매질을 세척하여 DNA 오염물을 제거하는 단계; 및
    (c) 상기 친화성 크로마토그래피 매질로부터 바이러스 조제물에 존재하는 바이러스를 용출시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 단계 (a)와 (b) 사이에서는 친화성 크로마토그래피 매질에 비특이적 엔도뉴클레아제 조제물을 통과시키는 것인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 바이러스 조제물은 인플루엔자 바이러스 조제물인 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 조제물은 포유동물 세포로부터 제조되는 것인 방법.
  25. 제21항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피 매질은 셀루파인TM 설페이트 수지이고, 단계 (a)에서 사용되는 조건은 pH가 약 7.2인 1X SP 완충액이며, 상기 바이러스는 약 1M NaCl을 함유하는 pH 약 7.2의 1X SP 완충액에서 용출되는 것인 방법.
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