KR20210133728A - 일회용 배양 공정 시스템을 이용한 인플루엔자 바이러스 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일회용 배양 공정 시스템을 이용한 인플루엔자 바이러스 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 일회용 생물반응기, 일회용 백 및 연속식 저속원심분리기를 이용하여 세포를 배양하고 바이러스를 증식시키는 인플루엔자 바이러스 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 인플루엔자 바이러스 생산 방법에 따르면, 일회용 백을 이용하여 세포를 배양하고, 바이러스 감염 단계에서 일회용 백을 이용한 연속식 저속원심분리기를 사용하여 배지를 교환한 후 바이러스를 감염시킴으로써 오염발생 가능성을 최소화하고 생산 기간 단축 및 생산 비용 절감을 최대화할 수 있는 배양 공정을 제공할 수 있다. 배양액을 전량 회수 후 용기에 소분하여 원심분리를 진행하는 일반적인 방식과 달리, 일회용 백을 이용한 연속식 저속원심분리기를 사용할 경우 배지교환을 밀폐 시스템으로 진행할 수 있어 오염발생의 가능성을 크게 낮출 수 있다.

Description

일회용 배양 공정 시스템을 이용한 인플루엔자 바이러스 생산 방법{Method for producing influenza virus using single-use cultivation process system}

본 발명은 일회용 배양 공정 시스템을 이용한 인플루엔자 바이러스 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 일회용 생물반응기, 일회용 백 및 연속식 저속원심분리기를 이용하여 세포를 배양하고 바이러스를 증식시키는 인플루엔자 바이러스 생산 방법에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 80~120nm 크기의 Orthomyxoviridae과에 속하는 막을 가진 RNA 바이러스로 A, B, C 등의 세 가지 형태가 존재하며, A형의 경우 돼지, 말, 사람, 조류 등에 모두 감염성이 있는 반면, 나머지 B와 C형은 사람에게만 감염된다. A형 바이러스는 18 종류의 헤마글루티닌(Hemagglutinin, HA)과 11 종류의 뉴라미니데이즈(Neuraminidase, NA)의 조합으로 더 세분화된 아형(subtype)들이 존재하며, B형과 C형에 있어서는 아형은 알려져 있지 않다.

인플루엔자 백신은 지난 50 년간 유정란을 이용하여 제조되어왔다. 그러나 이 제조 방법은 1 회 접종량의 백신 제조에 약 한 개의 유정란을 필요로 하여 제조에 장기간이 소요되고 제조 공정이 복잡하다. 또한 백신제조를 위하여 품질관리된 SPF(Specific pathogen free) 유정란을 사용하도록 되어 있는데 공급량이 제한적이고 사전에 계획되어 있지 않은 경우 갑작스러운 수요가 발생했을 때 공급량을 늘리기가 어렵다. 게다가 유정란을 사용한 백신에는 미량의 계란 유래 단백질이 포함되어 있기 때문에 이 단백질에 감수성이 있는 사람에게는 알레르기 반응을 일으킬 가능성이 높다. 또한, 인플루엔자 바이러스는 유정란에서 배양할 때 항원성 변이가 일어나는 경우도 있고, 일부 바이러스의 경우 오히려 유정란 배양이 불가능하거나 또는 닭에 대해 치사성을 나타내는 경우도 있다. 이러한 단점은 인플루엔자 바이러스의 세계적인 대유행(Pandemic)이 발생했을 경우에 충분한 백신을 공급하는데 있어서 큰 문제가 될 수 있다. 이러한 단점을 극복하고자 약 15년 전부터 동물세포 배양을 이용하여 인플루엔자 바이러스를 배양하는 기술이 개발되기 시작했다.

한편, 산업적 규모의 바이러스 생산을 위한 세포 배양은 스테인리스 스틸 발효기 설비로 이루어지는 것이 일반적이나, 이러한 설비를 이용하면 사용 전 발효기를 세척 및 멸균하는 과정이 필요하여 공정 준비시간이 길고, 외부물질에 오염이 될 가능성이 높다. 또한, 사용 후 세척 과정에서 로트 또는 바이러스 strain 간의 교차오염이 발생할 수 있는데, 특히, 인플루엔자 백신은 3가 또는 4가 백신으로 3가지 또는 4가지의 다른 바이러스를 배양해야 하므로 strain간의 교차오염 발생가능성이 높아 이러한 문제점들이 해결된 새로운 바이러스 생산 공정이 필요한 실정이다.

한국 등록특허 제10-1464783호에서는 MDCK 세포를 일회용 생물반응기에서 배양하는 방법이 개시되어 있으나, 상기 문헌이 제공하는 방법은 세포 배양이 미세담체 존재 하에 진행되어 미세담체를 제거하는 공정이 추가되어 절차가 번거롭고 오염 가능성이 높다.

이에, 본 발명자는 인플루엔자 바이러스 증식을 위한 세포 배양에 있어서 공정 준비시간이 단축되고 오염에 대한 우려가 매우 낮은 세포 배양 시스템을 개발하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 일회용 백을 사용하는 일회용 세포 배양기에서 세포를 배양한 후, 일회용 백을 이용한 연속식 저속원심분리기를 이용하여 바이러스 감염 전 배지 교환을 수행하면 이와 같은 목적이 달성이 된다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 (a) 세포를 일회용 생물반응기(single-use bioreactor; SUB)에서 배양하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 세포 배양액에서 일회용 백을 이용한 연속식 저속원심분리기를 이용하여 배지의 일부를 신선한 배지로 교환하는 단계; (c) 상기 증식된 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키고, 인플루엔자 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 배양물에서 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인플루엔자 항원을 포함하는 백신 제조 방법에 있어서, 백신 제조 기간이 단축된 것을 특징으로 하는, 하기 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것이다:

(a) 세포를 일회용 생물반응기(single-use bioreactor; SUB)에서 배양하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 세포 배양액에서 연속식 저속원심분리기를 이용하여 배지의 일부를 신선한 배지로 교환하는 단계; (c) 상기 증식된 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키고, 인플루엔자 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 배양물에서 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계.

전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 세포를 일회용 생물반응기(single-use bioreactor; SUB)에서 배양하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 세포 배양액에서 일회용 백을 이용한 연속식 저속원심분리기를 이용하여 배지의 일부를 신선한 배지로 교환하는 단계; (c) 상기 증식된 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키고, 인플루엔자 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 배양물에서 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 인플루엔자 항원을 포함하는 백신 제조 방법에 있어서, 백신 제조 기간이 단축된 것을 특징으로 하는, 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다:

(a) 세포를 일회용 생물반응기(single-use bioreactor; SUB)에서 배양하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 세포 배양액에서 연속식 저속원심분리기를 이용하여 배지의 일부를 신선한 배지로 교환하는 단계; (c) 상기 증식된 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키고, 인플루엔자 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 배양물에서 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 (a) 세포를 일회용 생물반응기(single-use bioreactor; SUB)에서 배양하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 세포 배양액에서 일회용 백을 이용한 연속식 저속원심분리기를 이용하여 배지의 일부를 신선한 배지로 교환하는 단계; (c) 상기 증식된 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키고, 인플루엔자 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 배양물에서 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다.

(a) 세포를 일회용 생물반응기(single-use bioreactor; SUB)에서 배양하는 단계;

본 발명에서 상기 (a) 단계는 바이러스를 감염시켜 증식하기 위한 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 일회용 생물반응기에서 세포를 배양하는 것을 특징으로 한다. 일 양태에서, 상기 (a) 단계는 세포 배양을 위한 가요성 플라스틱 백과 같은 일회용 부재를 포함하는 생물반응기 시스템이 사용된다. 이러한 생물반응기 시스템은 당업계에 공지되어 있으며 시판중이다. 예를 들어, 국제특허공보 WO 05/108546; WO 05/104706; 및 WO 05/10849 및 하기 섹션 8.12를 참조한다. 일회용 부재를 포함하는 생물반응기 시스템(본원에서 "일회용 생물반응기(single use bioreactor)" 또는 약어 "SUB"로 지칭됨)은 미리 멸균될 수 있으며, 배양 또는 생산 시스템에서 회분간(batch to batch) 또는 생성물간(product to product) 전환을 위한 스팀 멸균 장치(steam-in-place, SIP) 또는 내부 세척 장치(clean-in-place, CIP)가 필요치 않다. SUB는 회분간 오염이 전무함을 확인할 수 있어 조절적 방제의 필요성이 덜하므로 사용 전에 최소한의 준비만으로 또는 준비를 별도로 하지 않고도 신속하게 배치하여 세포 배양물로부터 다량의 백신 물질의 생산을 촉진시킬 수 있다. 따라서 비용 및 시간 면에서 상당한 우위를 점하면서 작동될 수 있다. 다른 일 양태에서, 상기 일회용 생물반응기 시스템은 영양분, O₂ 및 pH의 보다 효율적인 조절이 가능한 세포 배양물의 혼합을 위한 유체 역학적 환경을 제공할 수 있는 교반형 탱크 반응기 시스템일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 세포는 바이러스를 감염시켜 배양함으로써 바이러스 증식의 목적을 달성할 수 있는 세포라면 제한 없이 본 발명에서 사용이 될 수 있다. 특히, 인플루엔자 바이러스를 성장시키기 위해 사용되는 적합한 세포는 전형적으로 포유동물 기원의 것일 수 있다. 적합한 동물 세포는 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있고, 햄스터, 소, 영장류(사람 및 원숭이 포함) 및 개 기원의 세포주를 포함할 수 있다. 상기 세포주의 비제한적인 예시로서, 포유동물 세포는 Vero, PerC6, BHK, 293, COS, PCK, MRC-5, MDCK, MDBK, WI-38, 및 이들의 무혈청 적응 세포 등이 포함될 수 있다. 바람직하게 상기 세포주는 MDCK 세포일 수 있다.

상기 MDCK 세포는, 예를 들어, ATCC CCL-34 세포주, ATCC PTA-7909 또는 PTA-7910에서 유래한 것을 사용할 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 대한민국 공개특허 제10-2012-0024464호에 개시되어 있는 ATCC CCL-34 유래의 MDCK Sky1023(DSM ACC3112), MDCK Sky10234(DSM ACC3114) 또는 MDCK Sky3851(DSM ACC3113) 세포주나 대한민국 등록특허 제10-1370512호에 개시되어 있는 MDCKS-MG 세포주(KCLRF-BP-00297)와 같은 MDCK 세포주를 사용할 수 있다. 특히 바람직하게는 세포 성장을 위하여 혈청을 필요로 하지 않으며 부착을 위한 별도의 담체가 필요 없이 부유 배양이 가능하며, 종양유발성이 낮은 상기 MDCK Sky3851 세포를 사용할 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 상기 세포를 배양하는 배지는 무혈청(serum-free) 배양 배지일 수 있다. 동물 혈청은 다른 병원성 물질을 함유할 수 있기 때문에, 세포 배양물로 제조된 백신에 의해 치료 또는 접종되는 인간 또는 동물에게 전달될 잠재적 위험성이 있으며, 특히 면역력이 약한 인간에게 치명적일 수 있다. 상기 무혈청 배양 배지는, 예를 들어 EMEM(Eagle's minimal essential media) 및 DMEM(Dulbecco's modifiedEagle's medium) 등의 MEM 배지와 같이 잘 알려져 있는 세포 배양 배지를 사용하거나, 이들 세포 배양 배지에서 유래하거나 이들 세포 배양 배지를 변형한 것일 수 있다. 예를 들어 Gibco BRL/Life Technology에서 제조되는 VP-SFM과 같이 상업적으로 이용 가능한 배양 배지를 사용할 수도 있다. 이들 배양 배지에서 유래된 배양 배지를 사용하여, 세포의 계대 배양을 유도할 수 있다.

상기 배지에는, 예를 들어, 옥수수, 완두, 대두, 맥아, 감자 및 소맥 중 하나 이상에서 얻어지는 식물 가수분해물; 콜레스테롤이나 포화 및/또는 불포화 지방산과 같은 지질 보충물; CuSO4·5H2O, ZnSO4·7H2O, 구연산철 등과 같은 미량 원소; 성장 인자와 같은 하나 이상의 호르몬; 푸트레신, 아미노산, 비타민, 불포화 지방산과 같은 지방산, 뉴클레오사이드, 중탄산나트륨, 글루코스와 같은 탄소원, 철분 결합 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 세포 배양 배지에 첨가될 수 있는 이들 성분들의 함유량은 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 세포는 1% 이상, 또는 2% 이상, 또는 3% 이상, 또는 4% 이상, 또는 5% 이상, 또는 6% 이상, 또는 7% 이상, 또는 8% 이상, 또는 9% 이상, 또는 10% 이상, 또는 20% 이상의 CO₂ 농도에서 배양될 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 일회용 생물반응기 내 용존 산소(DO) 농도(pO2 값)는 상기 세포의 배양시 유리하게 조절되며, 5% 내지 95% 범위이거나(공기 포화도 기준), 10% 내지 60% 사이이다. 특정 실시형태에서, 용존 산소(DO) 농도(pO2 값)는 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 50% 이상일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 세포를 배양하는데 사용되는 배양 배지의 pH는 배양시 조절되고, pH 6.4 내지 pH 8.0 범위, 또는 pH 6.8 내지 pH 7.6 범위일 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 배양 배지의 pH는 6.4 이상, 또는 6.6 이상, 또는 6.8 이상, 또는 7.0 이상, 또는 7.2 이상일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 세포는 25℃ 내지 39℃의 온도에서 배양될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 배양 온도는 30℃ 내지 38℃, 또는 35℃ 내지 38℃, 또는 36℃ 내지 38℃일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 세포는 교반형 탱크 SUB에서 온도, 교반 속도, pH, 용존 산소량(DO), O2 및 CO2의 유속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 파라미터가 모니터링 되고/되거나 제어되면서 배양될 수 있다. 한 실시양태에서, 온도는 약 3O℃ 내지 약 42℃, 또는 약 33℃ 내지 약 39℃, 또는 약 35℃ 내지 약 38℃로 유지된다. 특정 실시양태에서, 온도는 약 36℃ 내지 약 37℃로 유지된다. 한 실시양태에서, 교반 속도는 약 50 내지 150 rpm으로 유지된다. 구체적인 실시양태에서, 교반 속도는 약 60 내지 약 120 rpm, 또는 약 70 내지 약 100 rpm으로 유지된다. 교반 속도는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 조절된다. 또 다른 실시양태에서, 배양물의 pH는 약 6.0 내지 약 7.5로 유지된다. 구체적인 실시양태에서, 배양 개시 시점의 pH는 약 6.0 내지 약 7.5이고, 배양 중에는 배양물의 pH가 약 7.0 내지 약 7.5로 유지된다. 당업자라면 개시 pH는 상기 바람직한 범위보다 더 낮거나 높을 수 있으며, 이러한 pH는 바람직한 수준(예를 들어, 7.4)으로 높이거나 낮추어 그 수준에서 유지시키는 것도 가능하다. 이러한 pH는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 유지된다. 예컨대 pH는 필요에 따라 CO2의 살포 및/또는 산의 첨가(예를 들어, HCL) 또는 염기의 첨가(예를 들어, NaOH)에 의해 조절될 수 있다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 허용 가능한 DO 범위는 약 100% 내지 약 35%이다. 특정 실시양태에서, DO는 약 35% 내지 약 70%, 또는 약 50%로 유지된다. 또 다른 특정 실시양태에서, DO는 약 35% 미만으로 떨어져서는 안된다. 당업자라면, 초기의 DO가 100%일 수 있으며 이러한 DO는 미리 설정한 농도(예를 들어, 50%)로 떨어뜨려 이 수준에서 유지시키는 것도 가능하다. 이러한 DO는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, O2를 살포함으로써 유지될 수 있다.

(b) 상기 (a) 단계의 세포 배양액에서 일회용 백을 이용한 연속식 저속원심분리기를 이용하여 배지의 일부를 신선한 배지로 교환하는 단계;

상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 배양한 세포가 충분히 증식되어 바이러스를 감염시키기 전에 배지를 교환하는 단계이다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 (b) 단계의 배지교환은 일회용 백을 이용한 연속식 저속원심분리기를 이용하여 배양액의 회수 및 재투입 과정 없이 연속적으로 세포와 배지를 분리하여 일정량의 배지를 폐기하고 다시 새로운 배지를 일회용 백에 투입하는 방법으로 배지를 교환한다. 배양액을 전량 회수 후 용기에 소분하여 원심분리를 진행하는 일반적인 방식과 달리, 일회용 백을 이용한 연속식 저속원심분리기를 사용할 경우 배지교환을 밀폐된 시스템에서 진행할 수 있어 오염발생의 가능성을 크게 낮출 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 “배지의 일부”란 일회용 백에 존재하는 전체 배양액의 50% 내지 90%의 부피일 수 있다. 바람직하게는, 상기 배지의 일부란 일회용 백에 존재하는 전체 배양액의 60% 내지 80%의 부피, 가장 바람직하게는 70% 내지 80%의 부피일 수 있다.

한 실시양태에서, 배지는 동일한 부피 및 동일한 조성의 배지로 교환된다. 구체적으로, 연속식 저속원심분리기를 이용하여 세포가 침전되면 상부의 배지를 일부 회수하고, 회수된 배지와 동일한 부피의 배지를 보충하여 배지 교환을 실시한다. 또 다른 실시양태에서, 배지는 감소된 부피의 배지로 교환되어 세포를 효과적으로 농축시킨다. 배지는 동일하거나 상이한 조성을 갖는 배지로 교환될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 (a) 단계에서 세포의 증식을 위해 사용되는 성장 배지는 이하 (c) 단계에서 사용되는 감염 배지(즉, 감염 및 바이러스 복제시 사용되는 배지)로 교환될 수 있다. 선택적으로, 상기 성장 배지는 배지 교환이 필요 없도록 추가의 성분(예컨대, 글루코스, 미량의 미네랄, 아미노산 등)으로 보충되고/되거나 이러한 추가의 성분들을 포함한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 감염 배지는 세린 프로테아제(예를 들어, 트립신, TrypLE 등)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 배지가 교환되지 않은 곳에는, 세린 프로테아제(예를 들어, 트립신, TrypLE 등)를 감염 직전에, 감염 동안에 또는 감염 직후에 첨가한다. 특정 실시양태에서, 프로테아제는 세포를 바이러스로 감염시키기 전에 또는 감염시킴과 동시에 첨가된다.

(c) 상기 증식된 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키고, 인플루엔자 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계;

본 발명의 일 양태에서, 상기 인플루엔자 바이러스는 분자생물학적 특성에 따라 A, B 및 C 형을 포함한다. 바람직하게는, 상기 인플루엔자 바이러스는 A 또는 B형일 수 있다. 이 중에서 상기 A형 인플루엔자 바이러스는 표면 항원인 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다제(NA) 당단백질의 종류에 따라 다양한 아형으로 구분이 가능하다. 보다 구체적으로 A형 인플루엔자 바이러스의 표면 항원은 18종류의 헤마글루티닌 및 11종류의 뉴라미니다제가 공지되어 있기 때문에 산술적으로 총 198종의 A형 인플루엔자 바이러스 아형이 존재할 수 있으며, 이들 모두는 본 발명의 인플루엔자 바이러스에 포함이 되는 것으로 이해될 수 있다.

한편, 상기 주요 항원인 HA 및 NA가 기존에 공지된 것과 전혀 다른 새로운 아형으로 변화되는 항원 대변이(antigenic shift), 또는 상기 HA 및 NA 유전자 수준에서 점상 돌연변이(point mutation)가 축적되어 소수의 아미노산이 변화되는 항원 소변이(antigenic drift)를 포함하여, 현재까지 공지된 아형 뿐 아니라 장래에 밝혀질 새로운 아형의 인플루엔자 바이러스가 제한없이 본 발명의 상기 인플루엔자 바이러스에 포함이 될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 인플루엔자 바이러스는 A형 인플루엔자일 수 있으며, 이의 비제한적인 예시로 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7, H7N9, H6N1 등이 포함될 수 있다.

하나의 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스는 대략 0.00001 내지 0.01의 MOI(multiplicity of infection), 바람직하게는 0.0001 내지 0.002의 MOI 투입량으로 배양 배지에 투여될 수 있다. 이 정도의 투여량으로, 배양 배지에 접종된 세포를 충분히 감염시켜, 원하는 만큼의 인플루엔자 바이러스 증식을 기대할 수 있다.

한 실시양태에서, 감염 후, 세포는 22℃ 내지 40℃ 사이의 온도에서 배양된다. 특정 실시양태에서, 바이러스로 감염된 후, 세포는 39℃ 이하, 또는 38℃ 이하, 또는 37℃ 이하, 또는 36℃ 이하, 또는 35℃ 이하, 또는 34℃ 이하, 또는 33℃ 이하, 또는 32℃ 이하, 또는 30℃ 이하, 또는 28℃ 이하, 또는 26℃ 이하, 또는 24℃ 이하의 온도에서 배양된다. 특정 실시양태에서, 바이러스로 감염된 후, 세포는 33℃의 온도에서 배양된다. 또다른 실시양태에서, 바이러스로 감염된 후, 세포는 33℃ 이하의 온도에서 배양된다. 추가의 또다른 실시양태에서, 감염 후, 세포는 31℃의 온도에서 배양된다. 특정 실시양태에서, 세포 배양은 2일 내지 10일 동안 수행된다. 배양은 회분식(batch) 공정으로 수행될 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 (c) 단계의 배양은 적절한 수율로 바이러스를 생산하기에 충분한 기간, 예컨대, 감염 후 2일 내지 10일, 또는 선택적으로 3일 내지 7일이 경과한 후 수행한다. 본 발명의 일 양태에서, 상기 (c) 단계의 배양은 감염 후 2일, 또는 3일, 또는 4일, 또는 5일, 또는 6일, 또는 7일, 또는 8일, 또는 9일, 또는 10일 동안 수행된다.

(d) 상기 (c) 단계의 배양물에서 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계;

상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계에서 수득한 바이러스 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하고 분리하는 단계이다.

상기 바이러스의 정제는 바이러스 항원을 특이적으로 정제하기 위한 적합한 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 정제 방법은 예를 들면, 크로마토그래피 방법, 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 의사-친화성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 액체-액체 크로마토그래피 등이다. 한 실시형태에서, 바람직한 정제 방법은 친화성 크로마토그래피이며, 더 바람직한 정제 방법은 셀루핀 설페이트(cellufine sulfate, CS)를 담체로 사용한 친화성 크로마토그래피이다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 (c) 단계에서 배양물을 정제할 때 CS 친화성 크로마토그래피를 이용할 경우 칼럼 치수의 선택은 숙련 기술자에 의해 결정될 수 있다. 상기 CS 친화성 크로마토그래피에서, CS 칼럼은 인플루엔자 바이러스 여과액을 로딩하기 위해 평형용완충액을 사용하여 평형화될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, CS 칼럼은 평형용 완충액을 사용하여 평형화 하는데, 평형용 완충액은 10 내지 20mM 인산나트륨을 함유할 수 있고, pH는 7.0 내지 7.6 일 수 있다.

상기 정제과정에서 CS 칼럼에 부착된 인플루엔자 바이러스는 용출용 완충액으로 용출될 수 있다. 본 발명의 한 실시예에서, CS 칼럼에 부착된 인플루엔자 바이러스는 중성 pH에서 0.01 내지 1.0M 농도의 염화나트륨을 함유하는 용출용 완충액을 칼럼에 투입했을 때 칼럼에 결합된 인플루엔자 바이러스를 용출할 수 있었다. 용출용 완충액의 pH는 6.5내지 7.4일 수 있으며, 0.1 내지 6.0M 염화나트륨을 함유할 수 있다.

또한, 상기 정제 과정에서 CS 칼럼에 결합한 임의의 단백질을 세척 제거하기 위하여 1.0 내지 3.0 M 염화나트륨을 함유하는 용출용 완충액을 사용하여 세척할 수 있다. 사용이 완료된 CS 칼럼은 임의로 세척되고, 적절한 작용제 중에서 저장될 수 있으며, 임의로 재사용될 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 (d) 단계는 정제된 바이러스 배양물을 농축하는 단계가 추가로 수행될 수 있다. 상기 농축은 적합한 방법에 의해 달성될 수 있다. 상기 농축은 바이러스 배양물의 용적을 감소시키는 것을 유도한다. 상기 농축 단계는 인플루엔자 바이러스를 포함하는 배양물의 용적을 감소시켜 농축된 배양물을 얻는 것을 목표로 한다.

바람직한 양태에서, TFF 한외여과 또는 단일 단계로의 TFF 한외여과와 투석여과(TFF 한외여과/투석여과)를 적용함으로써 용적을 감소시킬 수 있고, 용적을 감소시키기 위해 초원심분리 또는 침전, 바람직하게는 TFF 한외여과를 사용할 수 있다. 이로써, 각각 적용된 농축 수단(TFF, TFF 한외여과/투석여과, 초원심분리 또는 침전)의 각각의 설정은 상기 나타낸 목적, 즉 용적 감소 및 인플루엔자 바이러스의 농축이 달성되는 방식으로 선택된다.

다른 실시형태에서, 초원심분리를 사용하여 용적을 감소시키는 경우, 초원심분리의 조건은 예를 들면, 10분 초과 동안 30,000g 내지 200,000g일 수 있다.

다른 실시형태에서, 침전을 적용함으로써 농축이 수행되는 경우, 적합한 화학물질은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있고, 예를 들면, 각각 적절한 농도로의 염, 메틸 및 에틸 알콜 및 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다. 적절한 농도로의 적합한 화학물질은 생성물, 예를 들면, 바이러스 항원 함유 입자를 침전시키지만, 상기 바이러스 항원에 대한 부정적인 효과는 없거나 최소이다. 화학물질은, 목적하는 항원, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스 표면 항원 단백질과 반응하지 않고 원하는 항원의 면역원성을 변경하지 않도록 선별된다.

일 실시양태에서, 상기 농축 단계에서 바이러스 배양물의 용적은 4배 이상, 바람직하게 5배 이상, 또는 9배 이상, 또한 바람직하게 12배 이상, 또한 바람직하게 13배 이상, 또는 15배 이상, 또한 바람직하게 20배 이상, 또는 25배 이상 감소할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 (d) 단계는 (d-1) 상기 (c) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하기 위하여, 서로 다른 조건에서 정제되어 수득된 인플루엔자 바이러스 샘플에 대한 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay)에 기반하여 정제 조건을 결정하는 단계; 및 (d-2) 상기 (d-1) 단계에서 결정된 조건에 따라 상기 (c) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수행이 될 수 있다.

상기 (d-1) 단계는 상기 인플루엔자 바이러스 배양물을 크로마토그래피 칼럼에 적용한 후, 서로 다른 조건에서 칼럼을 통과한 칼럼 통과액을 각각 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay)에 적용하여 헤마토글루티닌(HA) 역가가 가장 낮은 조건을 선정하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 적혈구 응집 반응법을 수행한 결과 칼럼을 통과한 바이러스 배양물의 HA 역가가 높다면 바이러스 배양물 내 바이러스가 칼럼에 결합하지 못하고 그대로 통과하는 조건으로 바람직하지 않다.

본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 (d-1) 단계는 상기 인플루엔자 바이러스 배양물을 서로 다른 조건에서 크로마토그래피 칼럼에 적용한 후 완충용액을 이용하여 칼럼과 결합된 인플루엔자 바이러스를 용출하고, 각 조건에 따른 용출액을 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합에 적용하여, HA 역가가 가장 높고 SDS-PAGE상에서 HA가 잘 관찰되는 조건을 선정하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 (d-1) 단계는 바이러스 배양물을 칼럼에 통과시켰을 때 바이러스가 레진과 가장 잘 결합하는 조건 및 레진에 결합한 바이러스를 용출하는 과정에서 바이러스를 가장 잘 용출할 수 있는 조건의 조합인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 바이러스가 레진과 가장 잘 결합하는 조건은 칼럼을 통과한 칼럼 통과액을 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합에 적용하여 선정할 수 있으며, 상기 레진에 결합한 바이러스를 용출하는 과정에서 바이러스를 가장 잘 용출할 수 있는 조건은 칼럼을 통과한 용출액을 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합에 적용하여 선정할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 (d-1) 단계는 서로 다른 조건에서 크로마토그래피 칼럼을 통과한 바이러스 배양물을 적혈구 응집 반응법 및 SDS-PAGE에 적용하여 인플루엔자 바이러스가 가장 적게 손실이 되는 조건을 선정하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 적혈구 응집 반응법은 WHO에서 작성하여 배포한 ‘Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza’에 기술되어 있는 프로토콜을 따라 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 정제 조건은 완충액의 종류, 완충액의 농도, 완충액의 pH 및 전도도로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 바람직하게는, 상기 조건은 완충액의 pH 또는 전도도일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 (d-1) 단계에 사용되는 완충액의 pH를 7.0~7.4로 유지하여 단백질의 안정성을 높이며, 전도도를 낮춰가면서 바이러스가 레진과 가장 잘 결합하는 조건을 탐색하였다. 인플루엔자 바이러스 배양 공정에서 확보된 인플루엔자 바이러스 배양물의 전도도는 약 10.0~15.0 mS/cm으로, 이를 전도도가 낮은 인산나트륨 완충액으로 희석하여 칼럼에 로딩할 시료의 전도도를 낮춰가면서 결합능을 확인하였다. 신속한 정제 조건 확인을 위하여 정제 조건 중 하나로 설정되는 pH를 제외하고 전도도만 조정하는 방식으로 정제 조건 확인에 필요한 시간과 변수를 줄였다.

일반적으로 전도도를 낮출수록 인플루엔자 바이러스는 레진에 잘 결합하는 것으로 알려졌으나, 전도도를 낮출 경우 투입되는 인산나트륨 완충액 용량과 크로마토그래피 공정 시간이 증가하게 되어 생산기간과 생산비용도 증가하므로 적절한 전도도를 확인하는 것이 중요하다. 이에, 본 발명의 일 실시예에서는 인산나트륨 완충액을 이용하여 바이러스 배양액을 0.5~4배 희석하는 방식으로 10.0 mS/cm 이하로 전도도를 낮춰가면서, 결합능이 적절한지 확인하기 위하여 칼럼을 통과하는 바이러스 배양물에 대해서 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합을 실시하였다. 적혈구 응집 반응법을 수행할 경우, 1시간 이내에 시험 결과를 확인할 수 있어 각 조건에 따른 정제 결과가 1일 이내에 확인이 되었다.

본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 레진에 결합된 인플루엔자 바이러스의 용출은 레진과 인플루엔자 바이러스의 결합을 분리할 수 있는 적절한 농도의 완충용액을 이용하여 최적의 전도도를 탐색하는 방식으로 진행될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 2~5 M 염화나트륨 완충액/linear gradient 조건으로 염농도를 높여 가며 완충액을 칼럼에 투입한 결과, 바이러스 및 단백질 등이 용출되면서 UV280 피크가 나타났으며, 상기 분획들을 회수 분석하여 바이러스가 포함되어 있는 분획의 전도도와 염농도를 확인하였다. 상기 2~5 M 염화나트륨 완충액과 평형용 완충액을 이용한 step gradient 조건으로 바이러스를 용출하여 해당 용출 농도에서 대부분의 인플루엔자 바이러스가 용출되는지 확인한 후 바이러스 용출 조건을 확립하였다. 바이러스가 고수율, 고순도로 용출되는지 확인하기 위하여 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay) 및/또는 SDS-PAGE를 수행하였다.

본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 (d-1) 단계는 정제 조건을 선정하기 위해 바이러스 배양물 내 헤마글루티닌(HA) 단백질의 양에 대하여 SRID(single radial immunodiffusion)에 의한 정량 과정이 필요하지 않은 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 방법은 (d-1) 단계 이전에, 바이러스 배양물에서 세포(cell) 및 세포 잔해물(cell debris)을 제거하는 청징화 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 청징화 단계는 바이러스 입자를 포함한 배양액에 대해 수행되지만, 침강되거나 그 이외의 펠렛화된 물질에 대해서는 수행되지 않는다. 본 발명에서, 이러한 청징화 단계의 목적은 배양액으로부터 입자상 물질, 예를 들면, 세포, 세포 잔해물, 단백질 불순물 등을 제거하는 것이다. 청징화를 위해, 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 임의의 적합한 수단 또는 방법이 사용될 수 있다. 특히, 여과(예를 들어, 접선 유동 여과(TFF), 심층 여과), 투석, 또는 원심분리를 적용할 수 있다. 이로써, 각각 적용된 청징화 수단(예를 들어, 여과, 투석, 또는 원심분리)의 각각의 설정은, 상기 나타내어진 목적이 도달되도록 하는 방식으로 선택된다. 일반적으로, 이러한 목적이 주어지는 경우, 각각의 수단에 대한 각각의 상기 설정은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있다.

본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 (d-1) 단계는 서로 다른 조건에서 크로마토그래피 칼럼을 통과한 바이러스 배양물을 적혈구 응집 반응법 및 SDS-PAGE에 적용하여 인플루엔자 바이러스가 가장 적게 손실이 되는 조건을 선정하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 방법은 상기 (d) 단계 이후에 한외여과 및 정용여과로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 방법에 의한 추가의 정제 과정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 방법은 상기 (d) 단계 이후에 DNA 절단 효소 처리 과정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 인플루엔자 바이러스 배양에 사용된 세포 유래의 DNA가 상기 바이러스 배양물에 혼입되어 있을 가능성이 있기 때문에, DNA 절단 효소를 처리함으로써 DNA를 100bp 이하의 크기로 절단하여 제거하는 과정이 추가될 수 있다. 본 발명에서 상기 DNA 절단 효소는 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 벤조네이즈(Benzonase),엑소뉴크레아제(Exonuclease), 리보자임(Ribozyme), 또는 이의 혼합물일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 (d) 단계 이후에 바이러스 정제 및/또는 농축된 바이러스 배양물은 불활성화 될 수 있다. 불활성화는 바이러스의 감염성 제거를 초래하고, 전형적으로는 바이러스를 하기 화학적 수단 중 하나 이상의 유효량으로 처리함으로써 수행될 수 있다: 계면활성제(detergent), 포름알데하이드, β-프로피오락톤, 메틸렌 블루, 프소랄렌, 카복시풀러렌(C60), 2급 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민 또는 이들의 조합. 또한, 불활성화 방법은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있고, 예를 들면, 바이러스를 물리적 수단, 예를 들면, 감마 조사 및/또는 UV 광으로 처리함을 포함한다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 방법은 (d) 단계 이후에 (e) 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

인플루엔자 바이러스의 비리온(virion) 구조는 가장 바깥쪽에 이중 지방층으로 이루어진 외피(envelop)가 있고, 여기에 2 개의 표면 당단백질(glycoprotein)이 돌출되어 있는 데 하나는 기둥 모양의 혈구응집소인 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)이고, 다른 하나는 버섯 모양의 뉴라민 분해효소인 뉴라미니다제(neuraminidase, NA)이다. 본 발명의 상기 (e) 단계에서는 인플루엔자 바이러스의 표면 항원을 바이러스 코어(core)로부터 분리하는 단계이다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 (e) 단계는 바이러스 배양물에 계면활성제 처리한 후 원심분리하여 상등액을 회수하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 상기 “계면활성제”는 “세제”와 상호 교환가능하게 사용되며, 상기 계면활성제는 당업계에서 바이러스의 표면 항원을 분리, 정제하기 위해 사용되는 것이라면 그 종류가 제한되지 않으며, 예를 들어 비-이온성 또는 이온성(예를 들어, 양이온성) 계면활성제가 포함될 수 있다. 상기 계면활성제의 비제한적인 예시로는 알킬글리코시드, 알킬티오글리코시드, 아실, 당, 술포베타인, 베타인, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, N,N-디알킬-글루카미드, 헤카메그(Hecameg), 알킬페녹시-폴리에톡시에탄올, 4차 암모늄 화합물, 사르코실, CTAB(브롬화 세틸 트리메틸 암모늄), 트리-N-부틸 포스페이트, 세타블론(Cetavlon), 미리스틸트리메틸암모늄 염, 리포펙틴, 리포펙타민, 및 DOTMA, 옥틸- 또는 노닐-페녹시 폴리옥시에탄올 (예를 들어, Triton X-1OO 또는 Triton N101과 같은 Triton 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(Tween 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스테르가 포함될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 계면활성제는 양이온성 계면활성제일 수 있다.

본 발명의 더욱 바람직한 일 양태에서, 상기 계면활성제는 CTAB일 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 (e) 단계는 하기 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다:

(e-1) 상기 (d) 단계에서 정제된 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원을 정제하기 위하여, 표면항원 단백질 정제 시의 계면활성제 처리량을 인플루엔자 바이러스 샘플에 대한 전체 단백질 정량법(Total protein quantification assay)에 기반하여 결정하는 단계;

(e-2) 상기 (e-1) 단계에서 결정된 조건에 따라 계면활성제를 처리하여 상기 (d) 단계의 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 단계.

본 발명에서 상기 (e-1) 단계는, 계면활성제를 처리하여 인플루엔자 바이러스의 표면 항원인 상기 헤마글루티닌과 뉴라미니다제를 분리하여 정제하는 방법에 있어서, 인플루엔자 바이러스의 표면 항원을 바이러스 코어(core)로부터 분리하는데 사용되는 계면활성제의 최적 처리량을 빠르게 산출하여 인플루엔자 바이러스 표면 항원 정제 조건을 단기간에 확립할 수 있도록 하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 (e-1) 단계는 상기 (d) 단계에서 분리된 인플루엔자 바이러스의 단위 용량 당 전체 단백질 정량값(total protein quantification value, TPQV)을 구한 후 하기 식 1에 대입하여 수득된 값으로 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스에 처리되는 계면활성제 처리량이 결정되는 것을 특징으로 할 수 있다:

[식 1]

계면활성제 처리량 = [{(a*TPQV(μg/mL))/(b μg/mL)}/c]* d

(상기 식에서,

a는 0.005~0.100(v/v%) 이고,

b는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900으로, 상기 TPQV와 가장 가까운 값이 선택되며,

c는 처리되는 계면활성제 스탁(stock)의 농도(v/v%)이고,

d는 계면활성제를 처리할 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 용량(부피)이다.)

바이러스 표면항원 백신은 부작용이 적고 순도가 높은 고품질의 백신으로 적절한 계면활성제 처리량 설정이 매우 중요하다. 과량의 계면활성제를 처리할 경우 바이러스 전체가 파쇄되어 불순물인 바이러스 코어 내부 단백질이 외부로 노출되어 순도가 떨어지며, 계면활성제의 처리량이 부족할 경우 대부분의 표면항원이 가용화되지 않아 표면항원의 수율이 떨어진다.

따라서, 본 발명의 일 양태에서, 상기 식에 따라 산출된 계면활성제 처리량은 바이러스 코어(core) 비파괴 상태 또는 바이러스 코어의 파괴가 최소화된 상태로, 인플루엔자 바이러스의 표면 항원만을 선택적으로 가용화하기 위한 농도인 것을 특징으로 한다.

한편, 바이러스 표면 항원의 가용화를 위해 적절한 계면활성제 처리량을 빠른 시간 내에 확인하는 것이 인플루엔자 백신 생산 과정에서 중요한 요소이다. 현재, 인플루엔자 백신의 표면 항원 함량을 측정하기 위해 유럽약전과 세계보건기구(WHO)에서 추천하는 단일방사면역확산법(SRID, single radial immunodifussion)이 국내외에서 공통적으로 사용되고 있으나, 상기 SRID법은 결과를 산출하기까지 소요되는 시간이 지나치게 길다는 한계가 있다.

따라서, 본 발명은 상기 바이러스 배양물 내 헤마글루티닌(HA) 단백질 양에 대한 SRID에 의한 정량 과정이 필요하지 않고, 바이러스 배양물 단위 용량 당 전체 단백질 정량값에 기초하여 첨가하는 계면활성제의 처리량을 결정하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 방법에서 바이러스 배양물 단위 용량 당 전체 단백질 정량값(TPQV)은 당업계에서 단백질 함량을 산출하기 위해 사용되는 임의의 방법에 따라 결정될 수 있으며, 이의 비제한적인 예시로서 BCA assay, lowry assay 또는 Bradford assay가 포함될 수 있다.

본 발명의 상기 식 1에서 a값은 단백함량을 기준으로 한 계면활성제 처리농도(%)를 의미하는 것으로서, 바이러스의 strain, 바이러스 특성 등에 따라 최적의 계면활성제 처리농도가 상이할 수 있으므로, 0.005~0.100(v/v%) 범위 내 임의의 값에 대하여 SDS-PAGE를 수행하여 바이러스에 따른 적절한 계면활성제 처리농도(%)를 확인할 수 있다. 구체적으로는, 바이러스 용액을 소량씩 소분하여 상기 수치범위 내 임의의 값에 대하여 계면활성제를 처리한 후, 초고속원심분리를 수행하여 표면항원 단백질은 상등액으로 회수되고, 바이러스 코어 단백질은 침전물로 분리되는 최적의 계면활성제 처리농도를 확인함으로써 결정될 수 있다.

본 발명에서 상기 b값은 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900으로, 상기 TPQV와 가장 가까운 값이 선택된다. 예를 들어, 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 TPQV가 220 μg/mL이라면 상기 수치 중 가장 가까운 값인 200이 상기 b값이 되며, TPQV가 370 μg/mL이라면 상기 수치 중 가장 가까운 값인 400이 상기 b값이 될 수 있다.

본 발명에서 상기 TPQV는 전술한 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 농축 정도에 따라서 달라질 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 식 1에 따라 최적의 계면활성제 처리량을 결정하기 위해서는 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 TPQV가 50 내지 950 μg/mL 일 수 있도록 농축된 인플루엔자 바이러스 배양물을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 인플루엔자 표면 항원의 신속 정제 방법은 상기 (e) 단계 이후에 DNA와 같은 불순물 제거를 위한 추가의 크로마토그래피 수행 과정을 포함할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 의사-친화성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 액체-액체 크로마토그래피 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피, 가장 바람직하게는 TMAE 음이온 교환 크로마토그래피일 수 있다. DNA는 음이온을 띄고 있으므로 음이온 교환 레진에 결합하는 특성을 이용하여 용이하게 분리, 제거가 가능할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 TAME 칼럼은 평형용 인산나트륨 완충액을 사용하여 평형화 할 수 있으며, 평형용 완충액은 1 내지 20mM 인산나트륨을 함유할 수 있고, pH는 6.8 내지 7.6 일 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에서 상기 인플루엔자 표면항원의 신속 정제 방법은, 상기 불순물 제거를 위한 크로마토그래피 이후에 한외여과 및 정용여과로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 방법에 의한 추가의 정제 과정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 인플루엔자 바이러스 생산 방법에 따르면, 일회용 백을 이용하여 세포를 배양하고, 바이러스 감염 단계에서 일회용 백을 이용한 연속식 저속원심분리기를 사용하여 배지를 교환한 후 바이러스를 감염시킴으로써 오염발생 가능성을 최소화하고 생산 기간 단축 및 생산 비용 절감을 최대화할 수 있는 배양 공정을 제공할 수 있다. 배양액을 전량 회수 후 용기에 소분하여 원심분리를 진행하는 일반적인 방식과 달리, 일회용 백을 이용한 연속식 저속원심분리기를 사용할 경우 배지교환을 밀폐 시스템으로 진행할 수 있어 오염발생의 가능성을 크게 낮출 수 있다.

도 1은 본 발명의 방법에 따라 단백함량을 기준으로 바이러스(B/Maryland/15/2016)에 대한 CTAB 처리량을 결정하고, 이를 불활화 바이러스 배양액에 처리한 후 초고속원심분리 한 상등액 또는 불활화 바이러스액에 포함된 단백을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다(HA: Hemagglutinin, NP: Nucleoprotein, M: Matrix protein).
도 2는 CS 칼럼 레진에 대한 바이러스 결합의 최적 조건을 결정하기 위하여 linear gradient 정제 공정 수행 후 SDS-PAGE 및 HA assay를 수행하여 칼럼 통과액으로 헤마글루티닌이 손실을 최소화하는 전도도 조건을 확인한 결과이다(IVR-190 virus, linear gradient purification - 크로마토그램).
도 3은 CS 칼럼 레진에 대한 바이러스 결합의 최적 조건을 결정하기 위하여 linear gradient 정제 공정 수행 후 SDS-PAGE 및 HA assay를 수행하여 칼럼 통과액으로 헤마글루티닌이 손실을 최소화하는 전도도 조건을 확인한 결과이다(IVR-190 virus, linear gradient - 크로마토그램 (Eluate 분획 확대)).
도 4는 CS 칼럼 레진에 대한 바이러스 결합의 최적 조건을 결정하기 위하여 linear gradient 정제 공정 수행 후 SDS-PAGE 및 HA assay를 수행하여 칼럼 통과액으로 헤마글루티닌이 손실을 최소화하는 전도도 조건을 확인한 결과이다(IVR-190 virus, linear gradient purification - SDS-PAGE 결과).
도 5는 본 발명의 방법에 사용되는 HA assay, SDS-PAGE를 수행하여 각 조건에서의 바이러스 용출액을 분석한 결과이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 본 발명 특유의 일회용 백 및 연속식 저속원심분리기를 이용한 인플루엔자 바이러스 배양 공정 신규 전략 수립

1) MDCK 세포 배양

본 발명의 배양 방법은 일회용 백을 사용하는 일회용 세포 배양기를 이용하여 MDCK Sky-3851 세포를 효율적으로 배양하는 방법을 제공한다.

본 발명의 한 양태는 37℃, 5% CO2배양기에서 스피너플라스크를 이용하여 MDCK 세포를 배양하는 단계를 포함하는 배양 방법이다. 125mL 스피너플라스크에서는 교반 속도 40~150rpm, 500mL 및 1L의 스피너플라스크의 교반 속도는 80~150rpm으로 설정되어야 한다. 배양에 사용되는 배지는 화학적으로 정의된 무혈청 배지를 사용하며, 세포 성장에 필요한 영양분으로 L-glutamine을 3~6mM 농도로 첨가해준다. 스피너플라스크를 이용한 배양은 1L 이하의 부피에서 실시한다.

본 발명의 추가 양태는 플라스크 배양에 이은 일회용 백을 이용한 세포 배양기를 통한 배양으로, 10L, 50L, 200L, 2000L 규모의 세포 배양기를 이용하여 배양액 규모를 증대시킬 수 있다. 세포배양을 유리한 조건에서 수행하고 대량 배양이 가능하도록 용존산소량, pH와 같은 배양 조건을 조절 및 유지하며 배양을 진행한다. 용존산소량과 pH는 배양에 필요한 가스(공기, 산소, 이산화탄소, 질소) 및 base(Sodium bicarbonate)를 이용하여 조절한다. 특정측면에서, 배양 단계 동안 온도와 용존산소의 농도 및 pH는 각각 37±3℃, DO 50±10%, pH 7.2±0.2 조건으로 유지되며, 본배양에서의 배지는 L-glutamine을 3~6mM을 포함한다.

2) 바이러스 감염

본 발명은 상기 본배양 공정에서 확보한 세포 배양액에 인플루엔자 바이러스를 감염시켜 바이러스 배양액을 얻기 위한 것이다. 본배양을 통하여 충분한 수의 세포가 확보되면 바이러스를 감염시키기 전에 배양 배지를 교환한다.

바이러스 감염 전 배지교환은 일회용 백을 이용한 연속식 저속원심분리기를 이용하여 배양액의 회수 및 재투입 과정 없이 연속적으로 세포와 배지를 분리하여 일정량(70%~80%)의 배지를 폐기하고 다시 새로운 배지를 세포 배양기에 투입하는 방법으로 배지를 교환한다. 배양액을 전량 회수 후 용기에 소분하여 원심분리를 진행하는 일반적인 방식과 달리, 일회용 백을 이용한 연속식 저속원심분리기를 사용할 경우 배지교환을 closed system으로 진행할 수 있어 오염발생의 가능성을 크게 낮출 수 있다. 해당 공정단계에서 발생된 오염은 배양단계에서 사용된 배지 낭비와 공정기간 연장으로 이어져 시간적, 경제적 손실이 발생하게 된다.

본 발명에서는 일회용 백을 이용하여 세포를 배양하고 바이러스 감염 단계에서 연속식 저속원심분리기를 사용하여 배지 교환 후 바이러스를 감염함으로써 오염발생 가능성을 최소화하고 생산 기간 단축 및 생산 비용 절감을 최대화할 수 있는 배양 공정을 정립하였으며, 이러한 방식의 세포배양 및 바이러스 감염 공정을 ‘일회용 백 및 연속식 저속원심분리기를 이용한 바이러스 배양 공정(약칭: SBCC 공정(Virus cultivation process using Single-use Bioreactor and low speed Continuous Centrifuge)’이라 지칭한다.

배지교환 및 바이러스 감염 단계는 본배양 중에 영양분이 소모된 배지를 제거하고 외부에서 새로운 배지 및 바이러스를 투입하는 단계로 오염의 위험성이 가장 높은 단계이다. 만약, 배지교환 단계에서 오염이 발생할 경우 생산기간에 대해서 손해가 발생하는데 동결 보관 중인 백신생산용 MDCK-Sky3851 세포주를 녹이는 cell thawing 단계에서부터 10L 세포 배양기 단계에서 바이러스 감염을 진행할 경우 배지 교환까지 13일 가량 소요된다. 2000L 상업생산의 경우 바이러스 감염을 위한 배지교환 단계까지 24일 정도 소요된다. 더불어 배지 및 일회용 백 추가 구매에 따른 생산 비용도 증가하게 된다.

SBCC 공정을 이용한 배지 교환 후 제조용 바이러스주를 준비하고 정해진 감염다중도(MOI)로 계산된 만큼의 바이러스와 2.5 내지 20 μg/mL 농도의 트립신을 세포 배양기에 무균적으로 투입하여 세포를 감염시키고 약2~4일간 배양하며 바이러스 역가와 세포수 및 생존율이 적정수준에 이르면 바이러스 배양을 종료하고 배양액을 회수한다. 본 발명의 한 실시예에서, 3x10⁶개 세포/㎖ 이상의 세포수가 확보된 MDCK 세포에 0.0001 내지 0.01 MOI로 계산된 만큼의 바이러스와 1 내지 20 μg/mL 농도의 트립신을 처리하여 약 3일간 배양했다.

실시예 2: 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 정제 공정 시, 정제 조건 신속 탐색 전략 신규 수립

인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 정제 공정 시 인플루엔자 바이러스에 계면활성제(이온성 또는 비이온성)를 첨가하여 원심분리 등의 분획수단을 통해 표면항원 단백질을 분리 정제할 수 있으며, 이때 일례로 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB)과 같은 이온성 계면활성제를 사용하는 것이 일반적이다.

인플루엔자 바이러스에 처리하는 계면활성제 처리량 기준은 바이러스 표면항원인 헤마글루티닌 함량에 따라 처리량을 결정하는 것이 바람직하나, 현재 일반적으로 사용되고 있는 표준 HA 함량 시험법인 SRID(단일방사면역확산법)은 약 2~3일 정도의 시간이 소요되므로 공정 중 확인시험으로서 적합하지 않은 측면이 있고, 특히 NIBSC 등에서 SRID 표준품 공급이 이뤄지지 않거나 늦어질 경우 시험을 수행할 수 없다는 단점이 있다.

한편, 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 정제 공정 시 바이러스 코어(core)는 파쇄하지 않고 표면항원인 헤마글루티닌과 뉴라미니데이즈만 선택적으로 분리할 수 있는 계면활성제 처리량은 각 바이러스마다 상이하다. 표면항원 백신은 부작용이 적고 순도가 높은 고품질의 백신으로 적절한 계면활성제 처리량 설정이 매우 중요하다. 과량의 계면활성제 처리는 바이러스 전체가 파쇄되어 불순물인 바이러스 코어 내부 단백질이 외부로 노출되기 때문에 정제 결과물 내의 표면항원 순도가 떨어지며, 계면활성제 처리량이 부족할 경우 대부분의 표면항원이 펠렛(pellet)에 존재하게 되어 표면항원의 수율이 떨어진다. 또한, 적절한 계면활성제 처리량을 빠른 시간 내에 확인하는 것이 인플루엔자 백신 생산 과정에서 중요한 요소가 된다.

본 발명자들은 다양한 분석 기법들을 이용하여 여러 가지 비교 실험 끝에 후술하는 본 발명의 방법을 최초로 발명하여, SRID 방법에 의존하지 않고도 신속하게 표면항원 분리에 적합한 계면활성제 처리 조건 설정이 가능할 뿐만 아니라 실질적으로 기존 표준시험법인 SRID에 기반한 방법과도 유의미한 관계성이 있으며 신뢰성 및 재현성이 뒷받침되는 것을 확인하였다. 이하의 실시예들은 본 발명 특유의 방법에 따른 효과가 기존의 통상적인 공정들로 부터는 예측하기 어려운 특별한 효과임을 뒷받침한다. 이하의 실시예는 대표적으로 계면활성제로서 CTAB를 사용한 일례를 보여주며, 이를 CTCCT(CTAB treatment concentration confirmation test; CTAB 처리량 확인 시험)으로 약칭한다.

2-1. SRID 비의존 표면항원 정제 공정 조건 설정 방법 신규 수립

본 발명자들은 불활화된 인플루엔자 바이러스 농축물로부터 샘플링(sampling)된 인플루엔자 바이러스의 단위 용량 당 전체 단백질 정량값(total protein quantification value, TPQV)을 이용하여 표면항원 정제 시 최적화된 계면활성제(여기에서 일례로 CTAB) 처리량을 산정하기 위한 알고리즘을 구현함으로써, 하기 식 1과 같은 계산식 관계를 도출하였다. 상기 전체 단백질 정량값(전체 단백질 함량값) 측정은, BCA assay (또는 lowry assay, Bradford assay 등)를 수행하여 1시간 이내로 확인할 수 있었다. 기준이 되는 전체 단백질 정량값은 바이러스의 strain에 따라 다를 수 있으나 본 연구에서 실험에 사용한 불활화 바이러스 농축물의 단백함량을 분석한 결과 200~600 μg/mL로 확인되었으며, 불활화 바이러스액의 단백함량을 측정 후 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900 μg/mL의 수치 중 TPQV 측정값의 근사치에 해당하는 수치를 CTAB 처리를 위한 단백함량의 기준치로 설정하였다. CTAB 처리량은 하기 식 1에 따라 구했으며, 불활화 바이러스액의 단백함량 대비 CTAB 처리농도(%)는 0.005%~0.100%(v/v) 내에서 결정되었다.

[식 1]

계면활성제 처리량 = [{(a*TPQV(μg/mL))/(b μg/mL)}/c]* d

(상기 식에서,

a는 0.005~0.100(v/v%) 이고,

b는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900으로, 상기 TPQV와 가장 가까운 값이 선택되며,

c는 처리되는 계면활성제 스탁(stock)의 농도(v/v%)이고,

d는 계면활성제를 처리할 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 용량(부피)이다.)

단백함량을 기준으로 한 CTAB 처리농도(%)는 strain, 바이러스 특성에 따라 상이하므로 임의의 범위에 대하여 SDS-PAGE를 수행하여 적절한 CTAB 처리농도(%)를 확인하여 결정하였다. 즉, 불활화 바이러스액을 소량씩 소분하여 임의의 범위에 대하여 CTAB을 처리 후, 스카이셀플루 제조공정에 따라 30,000rpm 이상 조건에서 초고속원심분리를 수행하여 표면항원 단백질은 상등액으로 회수되고, 바이러스 코어 단백질은 침전물로 분리되는 최적의 CTAB 처리농도를 확인하였다.

확인된 최적의 CTAB 처리농도를 이용하여 제조공정에 적용하였다. 전술한 공정을 수행하여 얻은 샘플을 이용하여 SDS-PAGE를 수행한 결과, 도 1과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 0.01%~0.10% 농도로 CTAB을 처리하였을 때 nucleoprotein, matrix protein 등의 불활화 바이러스액에서 확인되는 헤마글루티닌 외의 불순물이 CTAB 처리 후 초고속원심분리 공정을 진행하였을 때 제거되고 헤마글루티닌만 초고속원심분리 상등액으로 회수되는 것을 확인할 수 있었다.

2-2. 본 발명에 의한 표면항원 정제 공정 조건 설정 방법의 신뢰성 및 재현성 확인 _ 기존 SRID 방법에 기반한 방법과의 상관관계

상기 표 1은 2,000L scale 상업생산 data를 정리한 것으로서 상기 식 1에 따라 계면활성제 처리량을 단백함량을 기준으로 구하고, CTAB 처리 공정을 수행하였다.

더불어 불활화 바이러스액의 HA함량과 불활화 바이러스액에 CTAB 처리 후 초고속원심분리 공정을 수행하여 획득한 초고속원심분리 상등액의 HA함량을 구하여 비교한 결과, 초고속원심분리 상등액의 HA함량이 불활화 바이러스액의 HA 함량 대비 70%~80% 수준으로 충분한 상업성을 확인하였다. HA 회수율을 높이기 위하여 과도하게 CTAB을 처리할 경우, 생산하고자 하는 서브유닛(subunit) 백신이 아닌 분할 백신(split vaccine) 형태로 제조가 될 수 있으므로 적절한 CTAB 처리 농도를 구하는 것이 매우 중요하다.

따라서, 본 발명에서 확립한 상기 식 1에 따른 계면활성제 처리량 산출 방식이 인플루엔자 바이러스의 표면항원을 정제 과정에서 필요한 CTAB 처리량을 신속하고 정확하게 확인할 수 있는 방식이라는 것이 확인되었다.

2-3. 기존 SRID 방법(비교예 1)에 기반한 정제 조건 설정과, 본 발명에 의한 정제조건 설정 수행시간 비교

상기 실시예 2-2에서 수행된 바와 같이 기존 SRID(방사면역확산법)에 의한 표면항원 정제 조건 설정과, 본 발명의 정제 조건 설정 방법(실시예 2-1 및 실시예 2-2 참조)에 의한 공정 수행시간을 비교한 결과, 하기 표 2에서처럼, 본 발명 방법에 의한 수행시간이 기존 방사면역확산법 보다 훨씬 짧아 인플루엔자 표면항원 정제 조건을 확인하는 데 더 효율적임을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 바이러스 배양 이후, 인플루엔자 바이러스 항원 정제 조건 신속 확인 시험 세트(Rapid influenza virus antigen purification condition test set; 약칭 RIVPCT)의 수립

인플루엔자 표면항원을 포함하는 서브유닛(subunit) 백신 생산 공정 중에서 정제 과정은, 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 세포 배양물로부터 인플루엔자 바이러스의 정제 공정 및 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질의 분리 공정의 크게 2개 공정 단계가 필요로 된다. 기존 백신 생산 공정은 상기 2개 공정 단계에서 표준시험법인 단일방사면역확산법(SRID)을 이용하여 공정 조건을 최적화 할 수 있으나, 전술한 바와 같이 SRID는 백신 생산에 있어서 여러 가지 단점이 존재한다. 이에 본 발명자들은 단일방사면역확산법(SRID) 없이 적합한 공정 조건을 설정할 수 있는 신규한 방법을 모색하여 하기 제1 정제 조건 결정법 및 제2 정제 조건 결정법(실시예 1에서 수립된 새로운 전략에 기반)을 세트로 포함하는 인플루엔자 바이러스 항원 정제 조건 신속 확인 시험 세트를 개발하였다. 본 발명에서 제1 정제 조건 결정법 및 제2 정제 조건 결정법의 세트를 본 명세서에서 RIVPCT로 칭한다.

3-1. 제1 정제 조건 결정법 _ 인플루엔자 바이러스 배양물로부터 인플루엔자 바이러스의 분리/정제/농축 시

인플루엔자 바이러스 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계에서 사용되는 정제 조건 설정에 있어서, SRID 측정 없이 바이러스 별로 신속하게 최적 조건을 설정하기 위한 결정법/판별법을 제공한다. 구체적으로, 서로 다른 조건에서 정제되어 수득된 인플루엔자 바이러스 샘플들에 대해 후술하는 본 발명 특유의 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 및 판별기준에 기반하여, 상기 인플루엔자 바이러스 정제 시의 조건을 결정하는 시험법/판단법을 제공한다.

이하의 실시예에서는 대표적으로 바이러스 정제 수단으로서, 크로마토그래피를 사용한 일례를 보여준다. 바이러스 배양액을 크로마토그래피 칼럼에 투입하기 전에, 바이러스 배양액에서 세포 및 세포 잔해물(cell debris)이 1차적으로 제거되는 전처리가 수행될 수 있으며, 이러한 전처리에는 일례로 원심분리, 투석, 여과 등의 방법으로 수행될 수 있다.

크로마토그래피 공정을 진행하기 위하여 인플루엔자 바이러스마다 서로 다르게 조건을 설정할 필요가 있는데 매년 백신 생산 권고주가 변경되는 인플루엔자 바이러스의 특성상, 바이러스주 별로 신속하게 정제 조건을 확인할 필요가 있다. 크로마토그래피 정제 조건을 설정하기 위하여 인플루엔자 바이러스가 레진에 가장 잘 결합할 수 있는 조건을 확인 후, 최적의 수율과 순도로 결합된 바이러스를 분리 정제할 수 있는 용출조건에 대한 시험을 실시한다. 이하에서는 대표적 일례로 Cellufine sulfate(CS) 크로마토그래피 이용 시의 인플루엔자 바이러스 정제 조건(CS 크로마토그래피 컬럼 레진에 대한 목적물의 결합조건 및 용출조건) 결정법을 보여주며, 이를 CSPCT(CS chromatography purification condition test)로 약칭한다.

바이러스가 크로마토그래피 컬럼의 레진에 결합하는 원리는, 인플루엔자 바이러스의 표면단백질과 레진의 sulfate group간의 친화력에 의한 이온결합이며, 일반적으로 전도도와 pH에 따라서 결합능이 결정된다. 본 실시예는 공정에 사용되는 완충액의 pH를 7.0~7.4로 중성을 유지하여 단백질의 안정성을 높이며, 전도도를 낮춰가면서 바이러스가 최대한 결합 가능한 조건을 찾는 것을 예시적으로 보여준다. 일반적으로 수득되는 인플루엔자 바이러스 배양물(액)의 전도도는 약 10.0~15.0 mS/cm으로, 여기에 전도도가 낮은 인산나트륨 완충액으로 희석하여 칼럼에 로딩할 시료의 전도도를 낮춰가면서 결합능을 확인한다. 본 실시예에서는 신속한 공정 조건 확인을 위하여, 일반적으로 정제 조건 중 하나로 설정되는 pH를 제외하고 전도도만 조정하는 간단한 방식으로 정제 조건 확인에 필요한 시간과 변수를 줄이는 것을 예시적으로 보여준다.

일반적으로 전도도를 낮출수록 인플루엔자 바이러스는 CS 레진에 잘 결합하는 것으로 알려졌으나, 전도도를 낮추기 위해 투입되는 인산나트륨 완충액 용량과 CS 크로마토그래피 공정 시간이 증가하게 되어 생산기간과 생산비용도 증가하므로 적절한 전도도를 확인하는 것이 중요하다. 이에, 인산나트륨 완충액을 이용하여 바이러스 배양액을 0.5~4배 희석하는 방식으로 10.0 mS/cm 이하로 전도도를 낮춰가면서, 결합능이 적절한지 확인하기 위하여 칼럼 통과액에 대해서 헤마글루티닌 확인 시험(HA assay)을 실시하였다.

구체적으로, HA assay는 WHO에서 작성하여 배포한 ‘Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza’에 기술되어 있는 protocol을 따라서 수행했다. 상기 방법에 따라 칼럼 통과액의 HA titer 감소 경향을 토대로 로딩시료의 적정 전도도를 확인하였으며, SDS-PAGE도 동시에 수행하여 인플루엔자 바이러스가 칼럼 통과액으로 손실되는지 여부를 각 조건별로 확인하였다.

상기한 바와 같이 CS 컬럼 레진에 대한 바이러스 결합의 최적 조건을 결정한 후에는, 바이러스 용출에 적합한 조건을 찾는다. 레진에 결합된 인플루엔자 바이러스의 용출은 레진과의 결합을 분리할 수 있는 적절한 농도의 염화나트륨을 포함한 완충용액을 이용하여 최적의 전도도를 탐색하는 방식으로 진행하였다. 2~5M 염화나트륨 완충액으로 linear gradient 조건으로 염농도를 높여 가면서 칼럼에 투입하면 바이러스 및 단백질 등이 용출되면서 UV 피크가 나타나는데 이 분획들을 회수하여 바이러스가 포함되어 있는 분획의 전도도와 염농도를 HA assay 및 SDS-PAGE를 수행하여 확인했다. 여기서 확인된 바이러스 용출 조건과, 앞서 확인한 바 있는 바이러스 결합능이 적절할 것으로 판단되는 전도도 조건에 기반하여, 2~5 M 염화나트륨 완충액과 인산나트륨 완충액을 이용한 step gradient 조건으로 바이러스를 용출하여 해당 용출 농도에서 대부분의 인플루엔자 바이러스가 용출되는지 확인 후 바이러스 용출 조건을 확립했다. 바이러스가 고수율, 고순도로 용출되는지 확인하기 위하여 전술한 바와 동일한 방법 및 기준에 의하여 HA assay를 수행하여 확인했다. 상기 확인에는 SDS-PAGE를 동반하여 수행했다.

상기 기술한 바와 같은 일련의 과정으로 수행되는, 회수된 바이러스 배양액으로부터 바이러스를 정제하기 위한 CS 크로마토그래피 공정 조건 시험(CSPCT)은 약 6~12시간 내로 완료될 수 있으며, 매년 백신 생산용 strain이 변경되는 인플루엔자 백신의 특성상 이와 같은 시간 단축은 전체 생산기간 단축과도 연관된다.

크로마토그래피 조건 설정 시에 표준 시험법인 단일방사면역확산법(Single Radial Immunodiffusion technique, 이하 SRID)을 수행하여 칼럼 통과액에서 헤마글루티닌 함량을 확인하는 방식이 가장 정확한 방식이나, 1가지 정제 조건 확인을 위하여 2~3일 정도 소요되어 조건 시험 기간이 상당히 증가하게 되며 NIBSC(National Institute for Biological Standards and Control), TGA(Therapeutic Goods Administration) 등에서 SRID 표준품 공급이 이뤄지지 않거나 늦어질 경우 시험을 수행할 수 없다는 단점이 있다. 본 발명에 따라 HA assay와 SDS-PAGE를 수행할 경우, 3시간 이내에 시험 결과를 확인할 수 있어 각 바이러스에 대한 정제 조건 시험이 1일 이내에 이뤄지므로 매우 신속하며, 표준품 공급 등의 이슈가 없어서 시험 수행에 대한 제약사항이 거의 없다고 볼 수 있다. 전도도를 적절하게 낮추어 인플루엔자 바이러스의 결합능을 확인하고 고수율, 고순도로 바이러스를 용출하는 조건을 12시간 이내로 신속하게 확인하는 방식이 전술한 CSPCT의 특장점이라고 할 수 있으며, 원리와 절차는 전술한 바와 같다.

3-2. 제2 정제 조건 결정법_ 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 분리 정제

인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 분리 정제를 위하여, 대표적으로 본 실시예에서는 계면활성제로서 CTAB를 사용한 일례를 제시한다. CTAB 처리량은 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 RIVPCT 중 CTCCT를 수행하여 신속하게 확인하였다.

3-3 제1 정제 조건 결정법 및 제2 정제조건 결정법에 따른 표면항원 단백질의 정제 효과

SRID를 수행하여 확인한 HA함량을 기반으로 백신 생산에 필요한 정제 공정들에 있어서 필요한 조건을 구할 경우 보다 정확한 정제 조건을 설정할 수 있으나, 본 발명의 RIVPCT에 의하면 백신 생산에 필요한 정제 공정들에 있어서 필요한 조건들을 보다 신속하게 규명할 수 있다는 장점이 있다. SRID를 이용한 방식을 수행 시, 표준품 보유 여부 및 입고 기간을 제외하더라도 2일 이상 소요되므로, 이 소요시간을 단축하고자 SDS-PAGE, HA assay 등을 이용하는 RIVPCT 방식을 발명하게 되었다.

실시예 4: 생산 기간이 단축된, 인플루엔자 서브유닛 백신 생산 공정

4-1. 세포에 인플루엔자 바이러스의 감염 및 배양

1) 세포 배양

동결 보관 중인 백신생산용 MDCK-Sky3851 세포주 1 바이알을 37℃ 항온수조에서 해동하고 배양 배지를 넣어 희석하였다. 다음에, 희석된 세포를 원심분리하여 배지로부터 세포를 분리한 다음, 다시 신선한 배지로 세포 펠렛을 풀어 주고 샘플을 취하여 세포수 및 생존율을 측정했다. 1x10⁵ 내지 5x10⁵개 세포/㎖의 접종 농도로 125mL 스피너플라스크에 세포를 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 80rpm으로 교반하며 3~4일 동안 배양했다.

상기 125mL 스피너플라스크에서 배양 중인 MDCK 세포의 세포수 및 생존율을 측정하고, 500mL 스피너플라스크에서 250mL 규모로 배양을 시작할 수 있을 만큼 세포 배양액을 접종하고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 100rpm으로 교반하며 3~4일 동안 1차 종배양을 진행했다. 세포를 뱃치 과정에서 배양하였고, 세포 배양 배지로서 화학적으로 정의된 배지를 사용하였으며 L-glutamine을 3 내지 6mM/L 농도로 첨가하였다. 1차 종배양 후, 세포수 및 생존율을 측정한 후, 2개의 1L 스피너플라스크에 500mL 규모로 배양을 시작할 수 있을 만큼 세포를 접종하고 1차 종배양과 같은 조건으로 3~4일 동안 배양했다.

상기 500mL 배양 중인 1L 스피너플라스크에서 샘플을 취하여 세포수 및 생존율을 측정한 후, 10L 일회용 세포 배양기에서 5L 규모로 배양을 시작할 수 있을 만큼 1L 스피너플라스크의 배양액을 무균적으로 세포 배양기에 세포를 접종하고 3~4일 동안 배양했다. 스피너플라스크의 세포 배양액을 세포 배양기에 접종하기 위해 필요한 기구와 pH 및 DO probe를 미리 멸균하여 준비하며, pH와 DO probe를 장착하고 배양배지를 투입한 후 온도를 37±1℃로 설정하고 DO값을 보정하여 세포를 접종할 수 있도록 준비했다.

이와 동일한 방법으로, 순차적으로 50L 규모, 100L 규모, 500L 규모 및 2000L 규모까지 순차적으로 세포 배양을 진행하였다.

2) 바이러스 감염

상기 2000L 규모로 배양 중인 세포 배양기의 배양액을 취하여 세포수와 생존율을 측정하고 1x10⁶ 내지 3x10⁶개 세포/㎖ 이상의 세포수가 확보되면 존재하는 배양배지를 신선한 배지로 교체하였다. 세포배양용 일회용 백에 연속식 저속원심분리기를 사용하여 세포 배양액 기준 70 내지 90%의 배지를 제거하고 신선한 배지를 다시 투입하는 방법으로 배양배지를 교환했다.

배지 교환 및 바이러스 감염 공정 중 세포 배양기는 내부는 밀폐된 환경이 유지되며, 배지교환에 사용되는 자재는 멸균된 상태의 일회용 백으로 오염발생 가능성이 매우 낮아진다. 해당 공정에 소요되는 공정시간은 10L 규모로 공정 수행 시 3~4시간, 2000L 규모의 상업생산의 경우 7~12시간 정도 소요되었다.

바이러스 감염 및 증식은 DO 50±10%, pH 7.2±0.2 조건에서 실시되었으며, 제조하고자 하는 인플루엔자 바이러스의 제조용 바이러스주를 녹여 0.0001~0.002 MOI로 계산된 만큼의 바이러스와 2.5 내지 20μg/mL 농도의 트립신을 세포 배양기에 무균적으로 투입하여 세포를 감염시키고, 약 3~4일간 배양하였으며 바이러스 역가와 세포수 및 생존율이 적정 수준에 이르면 배양을 종료하고 배양액을 회수했다.

상기 세포 배양 및 바이러스 감염 방법에서는 미세담체가 사용되지 않으며, 특히, 관류 시스템이 아닌 뱃치 세포 배양 시스템(batch cell culture system)으로 세포가 배양되고 바이러스가 증식되었다. 인플루엔자 바이러스는 상기 MDCK-Sky3851에 감염이 된 이후 세포 내에서 증식하여 세포를 터뜨리며 외부로 분출되는 양상을 나타내므로, 관류 시스템으로 세포를 배양할 경우 세포 수가 점점 감소하기 때문에 본 발명의 시스템에 적합하지 않았다.

4-2. 바이러스 배양물로부터 인플루엔자 바이러스 정제를 위한 조건 설정 및 바이러스 정제

1) 원심분리 및 여과

세포배양기 내의 바이러스 배양이 완료되면, 바이러스 배양액을 연속식 저속원심분리기를 이용하여 8,000 내지 20,000rpm 속도로 원심분리하여 상등액을 회수하는 방법으로 세포 및 세포 잔해물을 제거하였다. 회수한 상등액은 1.0/0.5μm 프리필터로 여과 후 0.45μm 크기의 필터로 다시 여과하여 일정한 크기 이상의 큰 입자를 제거하였다.

2) 정제 조건 설정 및 Cellufine sulfate(CS) 친화성 레진을 이용한 인플루엔자 바이러스 정제

여과된 바이러스 배양액은 인플루엔자 바이러스에 친화성이 있는 레진(cellufine sulfate)을 이용하여 1차 크로마토그래피 공정을 진행했다. 평형용 인산나트륨 완충액을 이용하여 칼럼을 평형화 한 후 바이러스 여과액을 투입하였다. 상기 실시예 3-1에 기술한 것과 같은 CSPCT 방법으로 신속하게 정제 조건을 설정하였다. IVR-190(A/Brisbane/02/2018(H1N1) pdm09-like virus)을 이용하여 정제 조건 설정 시험을 수행하였으며, CSPCT 방법과 SRID를 이용한 방법 간의 결과를 비교 분석하였다.

먼저, CS 칼럼 레진에 대한 바이러스 결합의 최적 조건을 결정하기 위하여 linear gradient 정제 공정 수행 후 SDS-PAGE 및 HA assay를 수행하여 칼럼 통과액으로 헤마글루티닌이 손실을 최소화하는 전도도 조건을 확인하였다(도 2 내지 도 4, 표 4).

IVR-190 바이러스 배양액과 평형용 인산나트륨 완충액을 1:1로 희석하여 전도도를 13.03 mS/cm에서 7.54 mS/cm로 낮춰서 linear gradient 정제 조건 시험을 진행하였다. SDS-PAGE 상에서 칼럼 통과액으로 손실되는 HA는 없었으며, HA를 제외한 불순물이 용출되는 것을 확인할 수 있었다. 0.5% chicken RBC를 이용한 HA assay 결과도 모든 칼럼 통과액 분획에서 0 HAU/50μL 가 확인되어 시험에 사용된 로딩 시료의 전도도가 1차 크로마토그래피 정제에 적합함을 확인하였다.

바이러스 용출 농도 확인과 관련하여, 염화나트륨을 포함한 용출용 인산나트륨 완충액과 인산나트륨 완충액을 적절한 비율로 희석해서 투입하여 UV280 peak를 확인하며 용출된 바이러스 분획액을 수집한 결과, 0.1 M∼0.2 M NaCl 농도 조건에서 크로마토그램상 가장 높은 피크(UV280 value)와 HA titer가 확인되는 동시에 0.3 M NaCl 농도 조건까지 피크와 HA titer가 서서히 감소하는 것이 확인되어 수율을 높이기 위해서 바이러스 용출 농도로 0.4 M NaCl이 적당한 것으로 확인되었다. 시험 결과를 종합해보면 CS 칼럼에 로딩할 시료의 전도도로 7.54 mS/cm 수준이면 적당한 것으로 판단되었으며, 바이러스 용출 농도로 0.4 M NaCl이 적당한 것으로 판단되었다.

상기 기술된 CSPCT 방법에 따라 로딩 시료의 전도도 조건을 설정한 후, SRID를 기반으로 한 방법과 비교하기 위하여 바이러스 용출 농도를 0.3 M, 0.35 M, 0.4 M NaCl로 설정하여 step gradient 정제 공정 수행 후 각 batch의 바이러스 용출액의 HA 함량을 비교하였다. 더불어 SDS-PAGE와 HA assay를 수행하여 본 발명의 CSPCT 방법으로 도출되는 결과와 SRID를 이용한 방법 간의 상관관계를 확인하였다.

SRID 수행 결과, 0.4 M NaCl 농도로 바이러스를 용출했을 때 수율과 순도가 가장 좋은 것을 확인할 수 있었다(표 5).

SRID에 사용된 샘플을 사용하여 CSPCT 방법에 사용되는 HA assay, SDS-PAGE를 수행하여 각 조건의 바이러스 용출액을 분석하였다.

도 5의 SDS-PAGE 결과를 참고하면, 바이러스 용출 농도가 증가할수록 HA 밴드가 두꺼워지는 것이 확인되며 이를 통하여 바이러스 용출액에 포함되어 있는 HA가 증가하고 있음을 알 수 있었다. 바이러스 용출액의 HA titer의 경우, 0.3 M, 0.35 M NaCl 농도 조건일 때 1,024 HAU/50μL로 동일하나 0.4 M 조건일 때 2,048 HAU/50μL로 증가하였다. 이와 같이 CSPCT 방법으로 확인된 바이러스 용출 조건 역시 SRID 방법과 동일하게 바이러스 용출 농도가 0.4 M NaCl 임을 확인할 수 있어서 두 방법 간의 상관관계를 확인할 수 있었다(표 6).

한편, 정제과정에 사용되는 평형용 완충액의 pH는 7.0~7.4로 중성을 유지하며, 바이러스 여과액을 평형용 완충액으로 희석하여 바이러스가 최대한 결합 가능한 전도도까지 낮춰준다. 바이러스 배양 종료 시, 바이러스 배양액의 전도도는 약 10.0~15.0 mS/cm으로 여기에 전도도가 낮은 평형용 완충액으로 희석하여 전도도를 낮춰가면서 레진과의 결합능을 확인한 결과, 인플루엔자 바이러스 종류에 따라 차이가 있으나 약 4.0~10.0 mS/cm 조건에서 적절한 수준의 결합능을 보였다.

평형용 완충액으로 희석된 바이러스 여과액을 CS 칼럼에 투입 후, 칼럼에 결합하지 않고 흘러나온 칼럼 통과액은 샘플링 후 폐기하고, 평형용 완충액을 2~3CV 투입하여 칼럼을 충분히 세척한 후 염화나트륨을 포함한 용출용 인산나트륨 완충액과 인산나트륨 완충액을 적절한 비율로 희석해서 투입하여 UV280 peak를 확인하며 용출된 바이러스 분획액을 수집하였다. 인플루엔자 바이러스의 용출은 RIVPCT 중 CSPCT(실시예 3-1 참조)를 수행하여 바이러스와 레진의 결합을 분리할 수 있는 적절한 농도의 염화나트륨을 포함한 용출용 완충액을 확인하여 조건을 확립하였으며, 대부분의 바이러스는 1M 이하의 염화나트륨 농도에서 용출되었다.

4-3. 바이러스 농축 및 탈염

바이러스 용출액을 농축하고 PBS 완충액으로 교환하기 위하여 1차 한외여과를 실시한다. 300 kDa 내지 800 kDa 크기의 한외여과 필터를 사용하여 세포 배양액 부피 기준으로 10% 이하로 농축하고, 농축 부피의 8배 이상의 부피에 해당하는 PBS 완충액으로, PBS 완충액의 전도도와 동일하게 될 때까지 정용여과를 실시하였다.

4-4. 바이러스 농축액 내의 MDCK 세포 유래 DNA 제거

회수된 바이러스 농축액에서 세포주 유래 DNA를 제거하기 위하여 DNA 절단효소인 벤조네이즈(Merck 社)를 0.5 내지 50 U/mL로 처리하고 상온에서 30분~24시간 동안 천천히 교반하면서 반응시켰다. 벤조네이즈의 보조인자로 0.5 내지 5 mM 염화마그네슘육수화물을 첨가하여 벤조네이즈의 활성을 높여주었다.

4-5. 바이러스 불활화

벤조네이즈 반응이 완료된 인플루엔자 바이러스 농축액을 불활성화시켜서 감염성을 제거하였다. 바이러스를 불활화 시키는 화학적 수단은 공지된 수단이라면 무엇이든지 사용가능하며 예를들어 세척제, 포름알데히드, 베타프로피오락톤, 메틸렌 블루, 프소랄렌, 카르복시플러렌(C60) 등이 있으며, 본 실시예에서는 포름알데히드 용액을 0.01~0.1% 수준으로 처리하여 바이러스를 불활화하였다.

4-6. Detergent를 이용한 표면항원 분리

인플루엔자 바이러스에 계면활성제(이온성 또는 비이온성) 또는 용매를 처리함으로써 표면항원 단백질을 분리 정제할 수 있으며, 대표적 일례로서 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB)과 같은 이온성 계면활성제를 사용하는 것이 일반적이다.

본 실시예에서도 불활화 바이러스 농축액의 단백함량을 기준으로 CTAB을 처리하였으며, CTAB 처리량은 상기 실시예 3-2에서와 같이 RIVPCT 중 CTCCT를 수행하여 확인하였다. 상온에서 1시간 이상 반응시킨 후 연속식 초고속원심분리기를 이용하여 30,000rpm 이상 조건에서 원심분리 후 상등액을 회수하여 표면항원 단백질만 분리한다.

초고속원심분리 상등액 내의 CTAB을 제거하기 위하여 흡착용 레진(Amberlite XAD-4)을 상등액에 첨가하여 CTAB을 제거하였다. 그 다음 흡착용 레진은 필터로 여과하여 제거하였다.

4-7. TMAE 음이온교환레진을 이용한 잔류 DNA 제거

숙주제포 유래 DNA을 추가로 제거하기 위하여 음이온 교환 크로마토그래피 레진을 이용하여 2차 크로마토그래피 공정을 진행하였다. 평형용 인산나트륨 완충액을 이용하여 칼럼을 평형화 한 후, 바이러스 표면항원 회수 여과액을 투입한다. 이때 전도도가 높은 1 내지 6 M 염화나트륨이 포함된 인산나트륨 완충액으로 희석하여 표면항원은 레진에 결합하지 않고 DNA는 레진에 결합하는 전도도로 크로마토그래피 공정을 실시하며, 레진에 결합하지 않은 칼럼통과액을 표면항원 분획액으로 회수한다.

4-8. 표면항원 분획액의 농축 및 탈염

표면항원 분획액을 30 내지 50 kDa 크기의 한외여과 필터를 이용하여 농축을 실시하였다. 농축 공정이 완료되면 PBS 완충액을 이용하여 PBS 완충액의 전도도와 동일하게 될 때까지 버퍼교환을 실시하고 농축액을 회수하였다. 회수된 농축액을 0.5/0.2um 필터로 제균여과하여 원액을 생산하고 2~8℃에서 보관하였다.

본 발명의 인플루엔자 바이러스 생산 방법에 따르면, 일회용 백을 이용하여 세포를 배양하고, 바이러스 감염 단계에서 일회용 백을 이용한 연속식 저속원심분리기를 사용하여 배지를 교환한 후 바이러스를 감염시킴으로써 오염발생 가능성을 최소화하고 생산 기간 단축 및 생산 비용 절감을 최대화할 수 있는 배양 공정을 제공할 수 있다. 배양액을 전량 회수 후 용기에 소분하여 원심분리를 진행하는 일반적인 방식과 달리, 일회용 백을 이용한 연속식 저속원심분리기를 사용할 경우 배지교환을 밀폐 시스템으로 진행할 수 있어 오염발생의 가능성을 크게 낮출 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.

Claims (21)

1. (a) 세포를 일회용 생물반응기(single-use bioreactor; SUB)에서 배양하는 단계;
   (b) 상기 (a) 단계의 세포 배양액에서 일회용 백을 이용한 연속식 저속원심분리기를 이용하여 배지의 일부를 신선한 배지로 교환하는 단계;
   (c) 상기 증식된 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키고, 인플루엔자 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및
   (d) 상기 (c) 단계의 배양물에서 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계를
   포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 세포는 MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 배양액의 전량 회수 및 재투입 과정 없이 연속식 저속원심분리기를 이용하여 연속적으로 세포와 배지를 분리하여 배지의 일부를 폐기하고 새로운 배지를 세포 배양기에 투입하는 방법으로 배지를 교환하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 배지의 일부는 전체 배양액의 50% 내지 80%인 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 인플루엔자 항원을 포함하는 백신 제조 방법에 있어서, 백신 제조 기간이 단축된 것을 특징으로 하는, 하기 단계를 포함하는 방법:
   (a) 세포를 일회용 생물반응기(single-use bioreactor; SUB)에서 배양하는 단계;
   (b) 상기 (a) 단계의 세포 배양액에서 연속식 저속원심분리기를 이용하여 배지의 일부를 신선한 배지로 교환하는 단계;
   (c) 상기 증식된 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키고, 인플루엔자 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및
   (d) 상기 (c) 단계의 배양물에서 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 (d) 단계는 하기 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
   (d-1) 상기 (c) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하기 위하여, 서로 다른 조건에서 정제되어 수득된 인플루엔자 바이러스 샘플에 대한 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay)에 기반하여 정제 조건을 결정하는 단계; 및
   (d-2) 상기 (d-1) 단계에서 결정된 조건에 따라 상기 (c) 단계의 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 정제하는 단계.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 방법은 (d-1) 단계 이전에,
   바이러스 배양물에서 세포(cell) 및 세포 잔해물(cell debris)을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 바이러스 배양물에서 세포(cell) 및 세포 잔해물(cell debris)의 제거는,
   여과, 투석 및 원심분리로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 수행되는 것인 방법.
   
9. 제6항에 있어서, 상기 (d-1)은
   인플루엔자 바이러스 배양물 샘플을 서로 다른 조건에서 정제시킨 것들을 각각 적혈구 응집 반응법(Hemagglutination assay), SDS-PAGE 또는 이의 조합을 수행하여 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
10. 제6항에 있어서, 상기 방법은 (d-2) 단계 이후에 한외여과 및 정용여과로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 방법에 의한 추가의 정제 과정을 포함하는 것인 방법.
    
11. 제5항에 있어서, 상기 방법은 (d) 단계 이후에 벤조네이즈(Benzonase), 엑소뉴크레아제(Exonuclease), 리보자임(Ribozyme), 또는 이의 혼합물 처리 과정을 추가로 포함하는 방법.
    
12. 제5항에 있어서, 상기 방법은 (d) 단계 이후에 바이러스 불활성화 과정을 추가로 포함하는 방법.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 바이러스 불활성화는 계면활성제(detergent), 포름알데하이드, β-프로피오락톤, 메틸렌블루, 프소랄렌, 카복시풀러렌(C60), 2급 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민 또는 이들의 조합을 처리함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
14. 제5항에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (e) 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 분리하는 단계.
    
15. 제14항에 있어서, 상기 (e) 단계는 계면활성제 처리 후 원심분리하여 상등액을 회수하는 방법으로 표면항원 단백질을 분리하는 것인 방법.
    
16. 제14항에 있어서, 상기 (e) 단계는 하기 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (e-1) 상기 (d) 단계에서 정제된 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원을 정제하기 위하여, 표면항원 단백질 정제 시의 계면활성제 처리량을 인플루엔자 바이러스 샘플에 대한 전체 단백질 정량법(Total protein quantification assay)에 기반하여 결정하는 단계;
    (e-2) 상기 (e-1) 단계에서 결정된 조건에 따라 계면활성제를 처리하여 상기 (d) 단계의 인플루엔자 바이러스로부터 표면항원 단백질을 정제하는 단계.
    
17. 제15항에 있어서, 상기 방법은 (e) 단계 이후에 계면활성제 제거 과정을 추가로 포함하는 방법.
    
18. 제16항에 있어서, 상기 (e-1) 단계는
    상기 (d) 단계에서 분리된 인플루엔자 바이러스의 단위 용량 당 전체 단백질 정량값(total protein quantification value, TPQV)을 구한 후 하기 식 1에 대입하여 수득된 값으로 계면활성제 처리량이 결정되는 것을 특징으로 하는 방법:
    [식 1]
    계면활성제 처리량 = [{(a*TPQV(μg/mL))/(b μg/mL)}/c]* d
    (상기 식에서,
    a는 0.005~0.100(v/v%) 이고,
    b는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900으로, 상기 TPQV와 가장 가까운 값이 선택되며,
    c는 처리되는 계면활성제 스탁(stock)의 농도(v/v%)이고,
    d는 계면활성제를 처리할 상기 샘플링한 인플루엔자 바이러스의 용량이다.)
    
19. 제14항에 있어서, 상기 방법은 (e) 단계 이후에
    불순물 제거를 위한 추가의 크로마토그래피 수행 과정을 포함하는 방법.
    
20. 제19항에 있어서, 상기 크로마토그래피는 TMAE(트리메틸아미노에틸) 음이온 교환 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
    
21. 제19항에 있어서, 상기 방법은, 크로마토그래피 이후에 한외여과 및 정용여과로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 방법에 의한 추가의 정제 과정을 포함하는 것인 방법.

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