CN101128598A - 生产流感疫苗组合物的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了用于在蛋和宿主细胞中优化和生产适合作为流感疫苗的流感病毒，例如ca乙型流感病毒株的方法和组合物。
Description
发明背景
[0001]无论从社会健康的立场还是商业立场上看，抗流感的各种病毒株和演变病毒株的疫苗都是至关重要的，因为每年有许多个体感染不同病毒株和不同类型的流感病毒。婴儿、老年人、那些卫生保健不足和免疫受损的人尤其面临因这种感染而死亡的风险。流感感染问题因新型流感病毒株易于演变而愈加复杂，因此需要不断制造新型疫苗。
[0002]过去50年间生产了许多对不同流感病毒能产生特异性免疫保护应答的疫苗，包括，例如全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、表面抗原疫苗和减毒活病毒疫苗。然而，尽管任何这些疫苗类型的合适制剂能产生全身性免疫应答，但减毒活病毒疫苗具有能刺激呼吸道局部粘膜免疫力的优点。含减毒活病毒的疫苗还具有制备快速而经济、易于储存和运输的优点，因此是十分适宜的疫苗。同样理想的是提高这种病毒的产量，从而提高这种病毒疫苗产量，尤其是已被证实用传统方法难以制造和/或大规模商业生产的病毒株的疫苗的产量的方法。
[0003]迄今为止，在美国可商业购得的所有流感疫苗是在含胚鸡蛋中增殖。虽然流感病毒株在鸡蛋中生长良好，但疫苗的产量取决于这种鸡蛋的可利用量。因为必须组织这种鸡蛋的供应，并在下一流感爆发季前数月选择可用于疫苗生产的病毒株，所以此方法的灵活性有限，并且常导致生产和销售滞后和短缺。同时，一些流感病毒株在蛋中的生长不及其它流感病毒毒株(例如，不以高效价产生)。因此急需找到提高产量，例如这种病毒所需毒株的产量以及疫苗产量的方法。
[0004]近年来也开发了在细胞培养物中制备流感疫苗的系统(参见，例如Furminger，“疫苗生产”(Vaccine Production)，刊于Nicholson等编，《流感教材》(Textbook of Influenza)，第324-332页；Merten等，(1996)，“在用于疫苗制备的细胞培养物中生产流感疫苗”(Production of influenza virus in cell cultures for vaccinepreparation)，刊于Cohen和Shafferman编，《疫苗设计和生产的新方案》(NovelStrategies in Design and Production of Vaccines)，第141-151页)。然而，这些系统也可能遇到蛋中生产或放大的问题，并因此也可能遇到生产能力问题，尤其是涉及特定毒株时。因此，任何提高这些系统中的病毒/疫苗产量的方法也是急需的。
[0005]本发明的发明人及其同事在生产用于疫苗制备的流感病毒方面作了大量的工作，参见，例如，PCT申请WO 03/091401、WO 05/014862以及2005年5月20日提交的PCT专利申请PCT/US05/017734和2005年10月4日提交的PCT/US05/035614。本发明提供了提高用于疫苗组合物生产的流感病毒和病毒组合物产量方法。本发明的一些方面适用于传统的用鸡蛋制备疫苗的模式和包括在鸡蛋中病毒生长步骤的新的细胞培养物疫苗产生模式(以及组合系统)，并包括许多其它益处，这些益处通过以下描述是显而易见的。
发明概述
[0006]本发明包括生产流感病毒颗粒的方法，该方法包括：将众多含有或编码流感病毒基因组或部分基因组的载体(例如，质粒、病毒等，见下文)引入一个或多个宿主蛋或其它宿主细胞(例如，MDCK和Vero)，并在低于33℃的温度下孵育所述宿主蛋或其它宿主细胞(例如，MDCK和Vero)；并从所述宿主蛋或其它宿主细胞(例如，MDCK和Vero)回收所述流感病毒颗粒。本发明还包括提高流感病毒颗粒产量的方法，所述方法包括在低于33℃的温度(例如，31℃)下孵育所述宿主细胞(例如，MDCK或Vero细胞的连续细胞培养物)或含胚蛋中的所述病毒颗粒。在某些实施方案中，在低于33℃的温度下生产的病毒颗粒的log10TCID50/mL滴度大于在33℃生产的相同病毒颗粒的滴度。在其它实施方案中，本发明的方法包括将流感病毒(例如，重配病毒)引入一个或多个能够支持流感病毒复制的含胚蛋，从而感染所述含胚蛋。再在其它实施方案中，本发明的方法包括将流感病毒(例如，重配病毒)引入能够支持流感病毒复制的宿主细胞(例如，MDCK和Vero)从而感染所述宿主细胞。所产生的病毒可以是乙型流感病毒株的病毒、减毒的流感病毒、冷适应流感病毒、温敏流感病毒、减毒的冷适应温敏流感病毒或其任意组合。一些实施方案中，所述病毒包含PR8骨架，而在其它实施方案中，所述病毒包含Ann Arbor B株流感病毒骨架、B/Leningrad/14/17/55骨架、B/14/5/1、B/USSR/60/69骨架、B/Leningrad/179/86骨架、B/Leningrad/14/55骨架或B/England/2608/76骨架。一些实施方案中，所述病毒是caB/Jilin/20/03。某些实施方案中，所述蛋是SPF鸡蛋。一些实施方案中，所述宿主细胞是MDCK细胞。同时，某些实施方案中，在低于33℃孵育包括在29-33℃之间、或在31-33℃之间、或在31-32℃之间、或在31℃孵育所述蛋或其它宿主细胞(例如，MDCK和Vero)。
[0007]本发明的其它方面包括通过上述方法生产的流感病毒以及含有这种病毒的组合物和含有这种病毒的流感疫苗(例如，液态的减毒鼻内活疫苗)。这种可通过本发明生产的病毒可任选包括，例如，CAIV(冷适应流感病毒，例如，在三价制剂中)、诸如PCT公开WO 05/014862中描述的那些病毒、诸如在例如PCT公开WO01/183794、WO 00/60050、USPN 6,544,785及USPN 6,649,372中描述的那些病毒、以及其它类似的或有关的病毒和病毒类型。
[0008]通过阅读下面的详细描述并结合附图和权利要求就可以更全面地理解本发明的这些目的和特征以及其他目的和特征。
附图说明
[0009]图1展示的表显示了作为二次(secondary)孵育温度函数的caB毒株的病毒产量(TCID50/mL)。
[0010]图2显示了作为二次孵育温度函数的caB毒株的产量(TCID50/mL)的图。
[0011]图3展示的表显示了作为二次孵育温度函数的caB/Jilin/20/03的病毒产量(TCID50/mL)。
[0012]图4展示的表显示了当在29-33℃之间的温度下孵育的蛋中生长时，表达特征性ca和ts表型的各种ca乙型流感病毒株的表型。
[0013]图5展示的表显示了在不同温度下孵育并在感染72小时后收获的感染的蛋尿囊液的HA滴度。
[0014]图6展示的表显示了在不同温度下孵育的感染的蛋尿囊液的HA病毒RNA量。
[0015]图7展示的表显示了通过将拷贝数减去感染性颗粒数量(log10TCID50)测定的基因组拷贝与感染性病毒的比例。
[0016]图8展示的表显示了当在31℃和33℃生长时caB/Jilin/20/03和caB/AnnArbor/1/94感染性颗粒的百分数。
[0017]图9展示的表显示了在33℃生长的caB/Jilin/20/03(1批)和在31℃生长的caB/Jilin/20/03(2批)的核酸序列与相应的MVS的比较。
[0018]图10展示的表将在两个温度下生长的病毒对用wtB/Jilin/20/03生产的抗血清的HAI滴度进行了比较。
[0019]图11展示的图显示了用生长于31℃或33℃的caB/Jilin/20/03病毒鼻内接种后病毒在雪貂中的复制。
[0020]图12展示的表比较了用生长于31℃或33℃的caB/Jilin/20/03免疫雪貂14天后血清的HAI滴度。
[0021]图13展示的图显示了不同二次孵育温度下在31℃和33℃生长的caB/Jilin/20/03在SPF蛋中的二次传代。
发明详述
[0022]本发明包括提高病毒产量的方法，更具体说是提高适合生产疫苗(包括但不限于FluMist)的冷适应乙型流感病毒株产量的方法。所包括的方法是，例如，在接种后在蛋(例如，在蛋中二次孵育)或其它宿主细胞(例如，MDCK和Vero)中孵育过程中使病毒株在较低温度下生长。其它特征如文中更详细的描述。
[0023]精通本领域的技术人员应该了解，这里的典型实施方案也包括本领域已知的步骤/方法/组合物，例如对蛋的透光检验、用病毒接种蛋等。因此，精通本领域的技术人员能够确定这种已知的生产合适的病毒、病毒溶液、组合物的步骤的适当条件、子步骤、步骤细节等等。下面将更加详细地描述各个步骤。
[0024]精通本领域的技术人员还应了解，这里所述的制造病毒/疫苗的各个步骤在相同的制造过程中不要求都要被执行或存在。因此，尽管在一些实施方案中执行或存在这里描述或提到的所有的步骤和/或组合物，在其它实施方案中，一个或多个步骤可任选地例如被省略、改变(范围、顺序、位置等)等等。
生产冷适应乙型流感病毒株
[0025]当按照目前认可的制造条件在33℃二次孵育生长时，在疫苗剂型中使用的某些冷适应(ca)乙型流感病毒株，如B/Jilin/20/03毒株的总产量有时不足以提供所需数量流感疫苗剂量的足够产量。本发明包括在低于33℃的温度下，如31℃(或任选约29-32℃之间的任何温度)而非33℃孵育蛋或其它宿主细胞(例如，MDCK和Vero)的方法，该方法提高了这种毒株的产量并因此能够提高用来制造疫苗的病毒的产量。这种蛋或其它宿主细胞(例如，MDCK和Vero)的孵育在这里可任选描述成“二次”孵育，以区别于在37℃时进行的对蛋的一次孵育，一次孵育用来使蛋或宿主细胞的胚胎在较高温度下发育以在感染前增殖细胞。这里的实施例比较了在31℃和33℃生长的B/Jilin/20/03毒株和其它ca乙型流感病毒株的特征，并显示，在31℃生长的病毒与在33℃生长的病毒共有不能区别的生物学特征。
[0026]这里的实施例中的数据证明，在低于33℃的温度下(例如31℃)caB/Jilin/20/03的更高产量不是B/Jilin/20/03毒株特有的。测试的所有其它ca乙型流感病毒株在低于33℃的温度下都更加有效地复制，其中包括在疫苗的中试中已显示出可证明的功效的caB/Ann Arbor/1/94。此外，这里的实施例显示了从在31℃和33℃生长的病毒得到的caB/Jilin/20/03疫苗的详细特征，这些特征强调，两种疫苗在所检测的特征上相互是相同的。实际上，在低于33℃，例如31℃生长的ca乙型病毒疫苗毒株的物理和生物特征与已经用于人类或在人类中测试的在33℃生长的其它ca乙型流感病毒株的物理和生物特征相同。见下文。
[0027]这里的实施例中描述的可比性结果和特征显示，当在低于33℃的温度下(最佳温度通常为29-32℃)生长时，caB/Jilin/20/03和7种其它ca乙型流感病毒株在蛋中的生长曲线都产生较高病毒滴度。同时，在较低温度生长不会不利地改变疫苗的标志性生物性状。因此，无论最初在29℃、31℃或33℃生长，包括caB/Jilin/20/03在内的不同ca乙型流感疫苗毒株都表达特征性ca和温敏(ts)表型。此外，包括caB/Jilin/20/03在内的不同毒株中总颗粒与感染性颗粒的整体比例在31℃和33℃之间是相等的。总颗粒的量通过用定量RT-PCR测定基因组拷贝数检测。此外，还通过透射电子显微术测量了caB/Jilin/20/03的总颗粒。这里的实施例还显示，通过测序，在31℃或33℃生长的caB/Jilin/20/03的基因组相互相同，并与主病毒种子(MVS)相同，且血凝抑制试验(HAI)显示，在31℃或33℃生长的caB/Jilin/20/03的抗原性基本上相同。这里的实施例还证明，就时间和最佳温度而言，在31℃或33℃生长的caB/Jilin/20/03在蛋中的复制相等，且在31℃或33℃生长的caB/Jilin/20/03在雪貂鼻咽中的复制也相等。这里的实施例还显示，无论在31℃或33℃生长，caB/Jilin/20/03的免疫原性相等。例如，用这两种制品免疫两组雪貂并在免疫14天后测定动物的HAI滴度。这两组动物的平均血清HAI滴度相等。
[0028]这种组合的数据证明，无论在低于33℃(如31℃)或在33℃生长病毒，caB/Jilin/20/03的生物特征是可比的。所述疫苗毒株具有相同的生物物理学特征(例如，抗原性、总颗粒与感染性颗粒之比以及序列)及体外和体内生物学性质。此外，caB/Jilin/20/03在低于33℃的温度下(例如，31℃)生长得更好，这对于其它ca乙型流感病毒株也适用。因此，本发明包括在低于33℃的温度下(例如，31℃)生长这种病毒株，例如ca B/Jilin/20/03毒株，或其它ca乙型流感病毒株，以用于制造FluMist等疫苗。
[0029]因此，某些实施方案中，本发明包括一种生产流感病毒颗粒的方法，该方法包括将至少一种含有流感病毒基因组或部分基因组(例如，含有1、2、3、4、5、6或7个(即少于所有vRNA区段数)vRNA区段)的载体(例如，B株流感病毒如6∶2重配病毒，其中可任选含有PR8、Ann Arbor B株流感病毒、B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/US SR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55、B/England/2608/76或caB/Jilin/20/03，或者一个或多个质粒)引入至少一个能够支持流感病毒复制的宿主蛋或其它宿主细胞(例如，MDCK和Vero)；在低于33℃的温度下孵育所述宿主蛋或其它宿主细胞(例如，MDCK和Vero)；和从所述宿主蛋或其它宿主细胞(例如，MDCK和Vero)回收所述流感病毒颗粒。在其它实施方案中，本发明提供了提高流感病毒颗粒产量的方法，所述方法包括在低于33℃的温度下(例如，31℃)孵育所述病毒颗粒。在一具体实施方案中，本发明包括一种提高流感病毒颗粒产量的方法，该方法包括将至少一种含有流感病毒基因组或部分基因组的载体引入至少一个宿主蛋或其它宿主细胞(例如，MDCK和Vero)；在低于33℃的温度下孵育所述宿主蛋或其它宿主细胞；其中，在低于33℃的温度下生产的流感病毒颗粒的产量大于在33℃生产的相同病毒颗粒的产量。在某些实施方案中，在低于33℃的温度下生产的病毒颗粒的log10TCID50/mL滴度大于在33℃制造的相同病毒颗粒的效价。某些实施方案中，在低于33℃的温度下制造的病毒的log10TCID50/mL滴度为至少约7.0、或至少约7.2、或至少约7.4、或至少约7.6、或至少约7.8、或至少约8.0、或至少约8.2、或至少约8.4、或至少约8.6、或至少约8.8、或至少约9.0、或至少约9.2、或至少约9.4、或至少约9.6、或至少约9.8。在其它实施方案中，本发明的方法包括将流感病毒(例如，重配病毒)引入一个或多个能够支持流感病毒复制的含胚蛋从而感染所述含胚蛋。再在其它实施方案中，本发明的方法包括将流感病毒(例如，重配病毒)引入能够支持流感病毒复制的宿主细胞(例如，MDCK和Vero)从而感染所述宿主细胞。所述病毒可任选包括：减毒的流感病毒、冷适应流感病毒、温敏流感病毒、减毒的冷适应温敏流感病毒或其任意组合。还考虑过所述病毒是6∶2重配病毒。在一个实施方案中，所述病毒是6∶2重配的B毒株流感病毒。可用于本发明方法的B毒株流感病毒包括但不限于：PR8、Ann Arbor B株流感病毒(例如，B/Ann Arbor/1/94、B/Ann Arbor/1/66)、B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/US SR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55、B/England/2608/76或caB/Jilin/20/03。另一实施方案中，所述病毒含有Ann Arbor B株流感病毒或选自下组的乙型病毒的至少一个区段：B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55、B/England/2608/76和caB/Jilin/20/03。
[0030]在某些方面，所述宿主蛋是SPF含胚鸡蛋。在某些其它方面，所述宿主细胞是动物细胞。用于生产流感病毒的动物细胞是本领域已知的，其中包括但不限于：MDCK细胞(参见，例如，美国专利4,500,413和6,455,298)、Vero细胞(参见，例如，6,146,873)和PerC6细胞(参见，例如，PCT公开WO 01/38362和WO 02/40665)。一个实施方案中，所述宿主细胞是MDCK细胞。同时，在某些方面，所述孵育在约29-33℃之间、约31-33℃之间、或约31-32℃之间、或在31℃发生。在其它方面，所述孵育在29-33℃之间、或31-33℃之间、或31-32℃之间、或在31℃发生。本发明还包括用这里所述方法生产的流感病毒以及含有这种病毒的组合物与疫苗(例如，液态的减毒鼻内活疫苗，如FluMist)。
[0031]在具体的方面，这里所述方法包括的实施方案中，从在低于33℃孵育的蛋或其它宿主细胞(例如，MDCK和Vero)得到的滴度(log10TCID50/mL)大于或等于在33℃或更高温度孵育相同病毒颗粒(即，相同的病毒类型/毒株等)得到的滴度。这种比较可任选在31℃孵育和33℃孵育之间进行。在各种实施方案中，在31℃孵育得到的log10TCID50/mL滴度比在33℃孵育得到的log10TCID50/mL滴度高至少约1.01-1.10倍、高至少约1.025-1.05、或高至少约1.03-1.04倍。在其它实施方案中，在31℃孵育得到的log10TCID50/mL滴度比在33℃孵育得到的log10TCID50/mL滴度高至少1.01-1.10倍、高至少1.025-1.05倍、或高至少1.03-1.04倍。
[0032]再在其它方面，这里所述方法包括的实施方案中，当在低于33℃(例如，31℃)或在33℃或以上(例如，在33℃)孵育病毒时，病毒颗粒的ca和/或ts表型实质上是类似的。同时，在具体方面中，这里所述方法包括的实施方案中，在低于33℃(例如，31℃)孵育得到的病毒颗粒的病毒产量大于或等于在33℃(例如，在33℃)或更高温度孵育的相同病毒颗粒的病毒产量。在这些方面，病毒产量可任选通过采用测量用33℃以下孵育的病毒颗粒感染的宿主蛋尿囊液中感染性病毒体的半数组织培养物感染剂量(TCID50)试验和测量用33℃或以上孵育的病毒颗粒感染的宿主蛋尿囊液中感染性病毒体的半数组织培养物感染剂量(TCID50)试验来量化。或者，病毒产量可任选通过采用被33℃以下孵育的病毒颗粒感染的宿主蛋尿囊液的血凝滴度和被33℃或以上孵育的病毒颗粒感染的宿主蛋尿囊液的血凝滴度来量化。病毒产量还可任选通过比较被33℃以下孵育的病毒颗粒感染的宿主蛋尿囊液中病毒RNA的量和被33℃或以上孵育的病毒颗粒感染的宿主蛋尿囊液中病毒RNA的量来量化。病毒产量还可任选通过比较被33℃以下孵育的病毒颗粒感染的宿主蛋尿囊液中感染性颗粒的百分比和被33℃或以上孵育的病毒颗粒感染的宿主蛋尿囊液中感染性颗粒的百分比来量化。病毒产量可任选通过采用测量被33℃以下孵育的病毒颗粒感染的宿主细胞上清液尿囊液中感染性病毒体的半数组织培养物感染剂量(TCID50)试验和测量被33℃或以上孵育的病毒颗粒感染的宿主细胞上清液中感染性病毒体的半数组织培养物感染剂量(TCID50)试验来量化。或者，病毒产量可任选通过采用被33℃以下孵育的病毒颗粒感染的宿主细胞上清液的血凝滴度和被33℃或以上孵育的病毒颗粒感染的宿主细胞上清液的血凝滴度来量化。病毒产量还可任选通过比较被33℃以下孵育的病毒颗粒感染的宿主细胞上清液中病毒RNA的量和被33℃或以上孵育的病毒颗粒感染的宿主细胞上清液中病毒RNA的量来量化。病毒产量还可任选通过比较被33℃以下孵育的病毒颗粒感染的宿主细胞上清液中感染性颗粒的百分比和被33℃或以上孵育的病毒颗粒感染的宿主细胞上清液中感染性颗粒的百分比来量化。
[0033]在某些其它方面，本发明的方法包括，在33℃以下孵育的感染性病毒颗粒的核酸序列与在33℃或以上孵育的感染性病毒颗粒的核酸序列相同。在某些其它方面，本发明的方法包括，在33℃以下孵育的病毒颗粒的抗原性与在33℃或以上孵育的相同病毒颗粒(即，相同的病毒类型等)的抗原性充分相同。这种抗原性可任选通过HAI试验测量。在某些其它方面，本发明的方法包括，病毒颗粒在对象(例如，雪貂、人、非人灵长类、哺乳动物)中激发的免疫应答与通过在33℃或以上孵育产生的相同类型病毒颗粒在相同对象(或对象类型)中激发的免疫应答实质上相同或类似。
实施例：在31℃和33℃生长的B/JILIN/20/03和其它乙型病毒的定性/比较
caB/Jilin/20/03和其它ca乙型流感病毒株的生长曲线
[0034]从该实施例可见，在30-32℃孵育无特异性病原体(SPF)的含胚鸡蛋后，ca乙型流感病毒株的最佳产量最高。用各种不同ca乙型流感病毒株以约2.1log10TCID50/蛋接种SPF含胚蛋，并在28-35℃之间的不同温度下孵育60-72小时。孵育后收获被感染的蛋的尿囊液并测定滴度。如图1中的表和图2中的图所示，最佳孵育温度低于33℃，且通常为31-32℃。可以看出，所有测试毒株有类似的温度曲线，其中包括对wt乙型流感有显著临床功效的caB/Ann Arbor/1/94(参见，例如，Belshe等，Phil.Trans.R.Soc.Lond.B，2001，356：1947-1951，和Belshe等，Pediatrics，2001，108：24+)和对于最近的流感季特别重要的毒株caB/Jilin/20/03。见图2和3。
[0035]通过对经各毒株的数据点的最佳适配多项式曲线(best-fit polynomial line)的插值处理确定了各毒株的最佳孵育温度。在不同温度孵育7种ca乙型流感病毒株，其中包括Yamagata系(B/Ann Arbor/1/94、B/Victoria/504/2000和B/Johannesburg/5/99)和Victoria系(B/Yamanashi/166/98，B/Brisbane/32/2002和B/Beijing/243/97)的代表毒株，并在感染60-72小时后收获。最佳温度为低于33℃，且通常为31-32℃。见图2。图3显示了caB/Jilin/20/03温度曲线的3次独立重复结果。由图可见，caB/Jilin/20/03的最佳孵育温度约为31℃。
冷适应(ca)和温敏(ts)表型试验-25℃、33℃和37℃下对原代鸡肾细胞的病毒滴度
[0036]已知在29-33℃之间在SPF含胚蛋中生长的冷适应乙型流感病毒株表达特征性ca和ts表型。为证实孵育条件应对所得疫苗的生物学特征没有影响，评价在不同温度生长的材料是否具有特征性ca和ts表型。所有毒株具有这些特征性性状，因此说明蛋的孵育温度应对疫苗毒株没有影响。见图4。
通过血凝(HA)滴度、病毒RNA的量和感染件颗粒的百分比测量病毒产量
[0037]病毒产量的其它测量结果与感染性病毒的产量一致。测定在不同温度收获的病毒样品的HA活性并通过定量反转录PCR(QRT-PCR)量化病毒RNA的量。图5和6所示的结果与TCID50结果一致。在曾在31℃孵育的蛋中观察到最高HA活性和vRNA量。
[0038]图6提供了在不同温度孵育并在感染72小时后收获的感染的蛋的尿囊液中HA基因区段病毒RNA的量。
[0039]在这里的实施例中还评价了通过基因组拷贝数或透射电子显微术(TEM)测得的总颗粒与感染性颗粒的比率。拷贝数与TCID50的比率(图7)显示，在31℃或33℃孵育的样品之间，基因拷贝数与TCID50有恒定比率。
[0040]在该实施例中，TEM被用来评价所选择样品的病毒颗粒与TCID50之比。与基因组：TCID50之比类似，该分析证实，在31℃生长的B/Jilin/20/03总颗粒的约3.3％具有感染性。见图8。在31℃生长的B/Jilin/20/03的感染性颗粒的百分比与在33℃所获得的值具有可比性，并类似于对在31℃或33℃生长的B/AnnArbor/01/94所获得的值。这些比值也在之前报道的其它ca乙型流感疫苗毒株的那些值的范围之内。
在31℃或33℃生长的B/Jilin/20/03病毒的基因组序列分析
[0041]如这里的实施例所述，从在31℃和33℃生长的病毒中提取病毒RNA(vRNA)并测序。在不同温度生长的这些病毒的基因组序列相互之间相同，并与MVS相同。见图9。
在31℃或33℃生长的caB/Jilin/20/03通过HAI所显示的抗原性
[0042]对所述实施例中的病毒进行检测以确定它们的抗原性特征是否具有可比性。相对参照B/Jilin/20/03抗血清对在31℃和33℃生长的caB/Jilin/20/03的HAI滴度进行了评价。其相互之间的HAI滴度相差2倍之内，说明它们的抗原性是相同的。见图10。
在31℃或33℃生长的病毒的体内特征
[0043]为评价在这两种温度下生长的疫苗的性能，用7.0log10TCID50的在31℃或33℃生长的病毒鼻内接种每组5只雪貂(血清阴性)。通过测量免疫后不同时间点鼻洗液标本中的病毒滴度确定疫苗在这些动物鼻咽内的复制。两组之间的疫苗的病毒复制量和持续时间都相同。见图11。此外，免疫14天后采集动物血液并通过HAI确定血清中针对wtB/Jilin/20/03的抗体滴度。这两组动物间对免疫的抗体应答相同，因此证明在31℃或33℃生长的疫苗有相同的免疫原性。见图11。
[0044]为证明caB/Jilin/20/03在31℃生长对其在类似于人鼻咽的温度下的生长能力没有影响，将在31℃和33℃生长的疫苗接种到SPF蛋中并在30-33℃之间孵育。如图13所示，两种疫苗以相同的温度曲线复制并在约31℃时产生最高滴度(预计该温度是人上呼吸道的温度)。
[0045]这里的实施例中的数据证明，在31℃或33℃生长的caB/Jilin/20/03的生物学和生物物理学特征是可比的。在这两种温度下生长的疫苗毒株有相同的生物物理学特征(抗原性、总颗粒与感染性颗粒之比以及序列)和相同的体外和体内生物学特性，其中包括ca和ts表型的表达、在动物中的复制和免疫原性、以及不同温度下在蛋中的复制。然而，与33℃生长的病毒不同，在31℃生长的病毒显示出更高的病毒产量。此外，这里也显示caB/Jilin/20/03在31℃生长得较好，对于测试的其它ca乙型流感病毒株也是如此。因此，这里的实施例支持了本发明的权利要求，在低于33℃的温度下，例如31℃(或者约29-约32℃之间的任意温度)，而非33℃，在蛋或其它宿主细胞(例如，MDCK和Vero)中生长caB/Jilin/20/03毒株(及其它ca乙型流感病毒株)，例如，以用于制造诸如FluMist的疫苗或其它疫苗。
实施例：材料和方法
表型测定-ca和ts
[0046]在从3天大的鸡制备的原代鸡肾(PCK)细胞上进行表型测定。测定样品的ca及ts表型。简言之，用无血清培养基(PAM)洗涤PCK细胞并用于滴定样品。用适量病毒接种经过洗涤的细胞层并在所示温度下孵育。然后检测细胞层以了解由于病毒复制导致细胞死亡而造成的对细胞的细胞病变效应。表型表示为：ca-33℃和25℃之间的TCID50平均滴度差异为2log或更少；和ts-37℃或39℃与33℃之间的TCID50平均滴度差异为2log或更多。在25℃、33℃和37℃一式两份检测样品。将平板孵育6天(ts表型)或10天(ca表型)并在孵育结束时读取CPE读数。该实施例中报道的滴度为平均TCID50/mL±SD。
HA和HAI试验
[0047]用在PBS中制备的0.5％的鸡RBC进行血凝(HA)试验。以50μL的体积在96孔板中将样品连续对倍稀释。在连续稀释的样品中加入50μL 0.5％的鸡RBC并混合，孵育平板至少30分钟，然后读取HA活性。各样品一式两份测试，报道的HA滴度为两份的平均值。
[0048]在HAI试验中，对血清样品进行处理并以25μL的体积从1∶4稀释开始连续对倍稀释。加入25微升病毒(相当于4HA单位)并混合，将样品在室温下孵育半小时。在孵育结束时加入50μL 0.5％的鸡RBC并混合，将平板孵育至少30分钟，然后读取HAI活性。
在雪貂中的复制和免疫原性
[0049]获得雪貂(7周龄)并在受控装置中检疫2周。通过用1x SPG将流感病毒原液稀释成最终剂量为7.05log10TCID50新鲜制备一定体积的足以给予5只雪貂每只1mL的接种物。
[0050]采集动物血液以获得免疫前血清样品，然后用1mL(每个鼻孔0.5ml)已经在31℃或33℃生长的caB/Jilin/20/03鼻内免疫。接种之后，在免疫后8-168小时内以规定的间隔用1mL无菌的磷酸缓冲盐水洗涤鼻道从而收集各雪貂的鼻样品。回收的鼻洗液样品被立即冷冻并储存于-80℃直到用于病毒滴定。在第0、14、21和28天收集血清以确定HAI应答。
[0051]为测量鼻洗液样品中病毒的滴度，将MDCK细胞接种到96孔平底组织培养平板并在37℃和5％CO2下生长至100％融合。在测定鼻洗液样品之前才除去各孔中的细胞生长培养基，细胞用不含TPCK-胰蛋白酶的不完全病毒生长培养基(VGM)洗涤2次，然后用完全VGM(0.18mL)洗涤，在每孔中加入TPCK-胰蛋白酶。同时将鼻洗液样品解冻并用完全VGM连续稀释。然后将试样量(0.02mL)的稀释病毒或仅培养基(阴性对照)加到三复板的8个孔中。平板在33℃和5％CO2下放置6天，然后通过显微镜对每孔中病毒的细胞病变效应(CPE)的存在情况评分。用Karber法将每板中CPE-阳性孔的数目转化为半数感染剂量(TCID50/mL)的值。
在蛋中复制
[0052]为生产含有不同caB毒株病毒的尿囊液，收到后将无特异性病原体(SPF)的蛋在14±2℃储存7天以下，并在37.5±1℃和70±10％相对湿度下孵育264±12小时。孵育之后将蛋取出进行透光检验，用约2.1log10TCLD50/蛋的病毒接种可接受的蛋并在28-35℃孵育48、60、72或84小时。然后对蛋进行透光检验并在5±3℃冷却12-24小时，然后收获。通过喷洒70％v/v乙醇对蛋表面进行卫生处理，转移到生物安全室(BSC)并空气干燥。用蛋穿孔器刺穿蛋的顶部以准备对BSC中的蛋进行收获。用无菌不锈钢刮铲除去穿孔的蛋壳，随后用10mL移液管收获尿囊液。收集在各收获时间点收获的尿囊液，并将样品分成试样量并在滴定前于-60℃或-60℃以下保存。
TCID50试验
[0053]TCID50试验按照以下方法进行。当然应该知道也可采用其它类似的试验。该试验采用培养了4天并100％融合的Madin Darby狗肾(MDCK)细胞的96孔平板。使用SkatronTM细胞清洗器用病毒生长培养基(VGM)将细胞培养平板洗涤2次。在各平板的每孔中加入180μl含胰蛋白酶的完全VGM并将平板置于33℃和5％CO2下直到接种。同时将测试病毒和对照病毒样品解冻，并在96孔预稀释块(block)中用含胰蛋白酶的VGM预稀释。用SerialMate移液站(pipetting station)将样品连续10倍稀释至10-3到10-4。然后将病毒样品从预稀释块转移到新鲜制备的稀释块的含VGM(含胰蛋白酶)的第1列和第12列中。用SerialMate移液站将样品进一步连续稀释至10-5到10-10。从培养箱中取出含VGM(含胰蛋白酶)的MDCK细胞培养平板并通过SerialMate移液站用稀释的病毒样品接种。将平板在33℃和5％CO2下放置6天。在组织培养平板中加入甲基噻唑四唑盐(MTT)染料以检测细胞病变效应(CPE)。然后用分光光度计阅读平板以确定组织培养平板中CPE斑的数目。基于CPE斑的总数计算样品的TCID50滴度。
序列分析
[0054]通过测序分析三种病毒材料。使两种病毒扩展物(expansion)，Z0015PD04-04-16，DQ NB 773和Z0015PD 04-04-16，DQ NB 773，分别在33℃和31℃生长。本研究还包括生长于31℃的制造商批号为600054C的材料。使用批号为0141900073的B/Jilin/20/03MVS作为参比。
[0055]为进行测序，用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen，Venlo，荷兰)分离病毒RNA，并作为模板通过RT-PCR扩增cDNA。按照制造商的说明，用一组特异性序列引物和各扩增的cDNA模板通过ABI PRISMTM BigDye Terminator CycleSequencing Ready Reaction Kit(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行测序。用ABI Genetic Analyzer 3730(Applied Biosystems，Foster City，CA)通过毛细管电泳纯化并分析序列延伸产物。用DNA序列分析仪(Applied Biosystems)和测序仪(GeneCodes Corp.)分析测序结果。
用Q RT-PCR确定基因组拷贝数
[0056]为确定基因组拷贝数，用Qiagen QIAamp Viral RNA迷你试剂盒一式两份或一式三份提取RNA。用High Capacity cDNA Archive Kit(Applied Biosystems，FosterCity，CA)一式两份反转录RNA。在ABI Prism 7700 Sequence Detection System(AppliedBiosystems)上采用TaqMan Universal Master Mix(Applied Biosystems)用乙型流感病毒HA基因的特异性引物和探针通过Q-PCR逐个分析cDNA。用Sequence DetectionSoftware，Version 1.9(Applied Biosystems)分析结果并在Microsoft Excel中将值转化成每毫升的拷贝数。
[0057]用连续稀释含B/Yamanashi HA基因的质粒产生的标准曲线确定病毒RNA的量。将质粒从10皮克(pg)稀释到1法克(fg)每次反应。将每次反应HA RNA的法克数乘以4,000,000(提取前时以1∶10稀释病毒，RT步骤中以1∶10稀释RNA，分析的5μL cDNA中每法克HA质粒大约含有200个病毒RNA分子)，从而将每次反应的量转化成每毫升的病毒数。这些计算假设所有步骤的效率为100％且不存在额外的病毒RNA。
用透射电子显微术进行总颗粒计数
[0058]通过透射电子显微术确定总颗粒数由Advanced Biotechnologies，Inc.(Columbia，MD)进行。涡漩搅拌每份制品并充分重悬。在各个微离心试管中将18微升各样品与等体积的含有乳胶球的标准溶液混合(直径110 nM的乳胶球；每毫升1.5×1010个颗粒；Structure Probe Inc.，West Chester，PA)。在各个微离心试管中用超纯水按1∶10稀释病毒颗粒/乳胶球混合物，涡漩振荡并充分重悬。为准备网格，紧紧夹住涂有聚乙烯醇缩甲醛和碳的300目铜网并用镊子固定。各网格用0.01％牛血清白蛋白冲洗，用滤纸吸干过量溶液。用超纯水以1∶3到1∶15的不同稀释度稀释各样品。将2.5微升试样量的各稀释样品置于单独的网格上并空气干燥约5分钟。5分钟后用滤纸吸干网格上的任何过量材料。各网格完全空气干燥后将样品固定，在各网格上加上20微升2.0％的磷钨酸水溶液并孵育30秒钟以将样品染色。用滤纸除去任何过量的染色剂。用Hitachi HU-12A电子透射显微镜检测各样品的强度并计数总的病毒颗粒。
疫苗制备中通用步骤的描述
[0059]为便于讨论和描述，一般认为疫苗组合物生产的各步骤包括或属于四个大组。第一组包括诸如共感染、重配、重配体选择和重配体克隆等方面。第二组包括诸如重配体的纯化和扩展等方面。第三组包括在蛋或其它宿主细胞(例如，MDCK和Vero)中进一步扩展重配体、以及收集和纯化这种收集的病毒溶液。第四组包括所收集病毒溶液的稳定化，以及病毒溶液的效力/无菌性试验。然而，应该知道将本发明各方面分为上述四个通用类别只是出于说明/组织目的，而不能作出这些步骤相互依赖等等的推论。也应该知道使用本发明的方法可以任选使用其它步骤(相似和不同的)(例如，如在31℃二次蛋孵育的孵育方法)。
[0060]如上所述，为便于讨论和描述，可认为疫苗生产中各步骤包括四个大组。第一组包括诸如共感染、重配、重配体选择和重配体克隆等方面。
组1
[0061]在本文概括归类为属于组1的疫苗组合物生产的各方面包括与以下有关的方法和组合物：细胞系共感染的优化，例如用一种主供体病毒(master donor virus)和一种或多种野生型病毒共感染以特异性产生所需的重配病毒；选择合适的重配病毒；克隆所选择的重配病毒。流感病毒毒株的重配是精通本领域的技术人员所熟知的。在细胞培养中和蛋中已使用甲型流感病毒和乙型流感病毒的重配以产生重配的病毒毒株。参见，例如Tannock等，《源自A/Leningrad/134/17/57供体病毒株的减毒冷适应的甲型流感病毒重配体的制备和特征鉴定》(Preparation and characterisation ofattenuated cold-adapted influenza A reassortants derived from the A/Leningrad/134/17/57donor strain)，Vaccine，(2002)，20：2082-2090。利用质粒构建物也显示了流感病毒毒株的重配。参见，例如，上述PCT公开WO 03/091401。
[0062]简言之，重配通常包括混合(例如，在蛋或细胞培养物中)不同病毒的基因区段。例如，乙型流感病毒毒株的典型8个区段可以在例如含有感兴趣表位的野生型病毒株和“供体”病毒株(如包含冷适应的病毒株)之间混合。除了其他结果，这两种病毒类型间重配可以产生含有野生型病毒株表位的一个区段和冷适应病毒株的其他区段的病毒。不幸的是，为产生所需重配体，有时需要进行大量重配。重配后也可以选择病毒(例如，以发现所需重配体)。然后可克隆所需的重配体(例如，扩展其数量)。
[0063]一般通过将病毒毒株共感染入细胞培养物(例如，CEK细胞)，然后用合适的抗体(例如针对亲代病毒之一成分的抗体)选择(通常在蛋中进行)，克隆或扩展病毒等(通常在细胞培养物中进行)进行乙型流感病毒所需重配体的常规优化、选择和克隆。然而，这种常规重配的缺陷在于需要数千次重配来产生所需的区段混合。当进行这种重配时，真正的随机重配(truly random reassortment)明显不是最终结果。换言之，该系统中存在导致该过程偏向的压力。然而对于甲型流感病毒株，这个过程没有表现出具有这样的偏向性。对于甲型病毒株，病毒株共感染(通常感染入细胞培养物，例如CEK细胞)后通常在细胞培养物中同时进行选择和克隆。
重配的优化
[0064]采用组1各步骤的各种实施方案可优化重配过程以减少所需的重配次数(从而提高疫苗生产过程的产量/稳定性)等。采用这种优化技术的步骤一般实施方案为乙型流感病毒毒株重配，所述步骤通常在细胞培养物(例如，CEK细胞)中进行。参见，例如，PCT公开WO 05/014862。
[0065]流感病毒重配的其它方法可任选混合主供体病毒(MDV)和野生型病毒的稀释液，例如各自的1∶5稀释液，而不论各溶液的浓度，然后将混合液在25℃和33℃培育24和48小时。尽管对于甲型流感病毒毒株这种方法通常可接受，但采用这种方法乙型流感病毒毒株通常不能得到阳性结果。例如，为实现正确的6∶2配比(即，MDV的6种基因与野生型病毒的NA和HA二种基因)通常必须进行数千次重配。
重配的选择和克隆
[0066]组1的步骤也包括选择重配的流感病毒。可在细胞培养物(例如，CEK细胞)或蛋中选择重配的甲型流感病毒毒株。然而，当在细胞培养物(例如，当在CEK细胞中选择时)中重配时，重配的乙型流感病毒毒株存在问题。据认为，CEK细胞可干扰乙型流感病毒毒株的M基因，从而降低总产量。疫苗组合物生产的各种方法(参见，例如PCT公开WO 05/014862)采用不同的病毒重配步骤(例如选择等等)，可任选采用各种这样的步骤来产生用于如这里所述的疫苗组合物等的病毒。
重配的特征鉴定
[0067]病毒/疫苗生产的其它方法还应用高通量单链构象多态性/毛细管电泳(SSCP/CE)试验来测定本文所用流感病毒的基因格局(gene constellation)。流感病毒含有8个基因区段，如上所述，用两种不同流感病毒毒株共感染一个细胞可产生具有不同于任一亲代的新型基因构象的重配体病毒。因此，一些方法可采用SSCP/CE试验来快速测定大量流感病毒样品中的基因区段格局。可利用这8个区段各自的特异性荧光标记引物通过RT-PCR任选扩增流感病毒的基因区段。也可参见Arvin等，(2000)，J.Clin. Micro.，38(2)：839-845。
防止细菌污染
[0068]病毒/疫苗生产的一些方法可包括检测和/或防止/检测用于生产流感病毒的蛋或其它宿主细胞的微生物污染步骤。本发明的微生物检测方法可用于快速/高通量的微生物检测，因此与许多其它步骤一样可用于提高通量和病毒/疫苗生产中的产量的提高。
[0069]本发明任选可采用的许多目前流感疫苗生产方法将在无特定病原体的含胚鸡蛋中扩增流感病毒的常规方法作为组成部分。在鸡蛋中生产病毒的几个时点上可能发生微生物污染。不幸的是，鸡蛋壳外可能有一些微生物组成它们天然菌群的一部分。在鸡胚胎发育期间，蛋壳内也可能含有微生物。受精的鸡蛋于37℃在高湿度中孵育以使胚胎发育，这也构成了许多类型微生物污染物的最佳培育条件。刺穿蛋壳以接种鸡蛋是发生微生物污染另一可能的时间。即使在病毒接种前经常用酒精喷洒鸡蛋，微生物也仍可能进入鸡蛋。
[0070]病毒在鸡蛋中扩增2-3天后，通常除去蛋壳顶部以手工收获鸡蛋中含有病毒的尿囊液。参见上文。这一收获是可能引起微生物污染的另一时点。不幸的是，含有这种污染性生物负载(bioburden)的鸡蛋可能逃过检测，而必须合并成多瓶以尽可能降低因MPA检验失败而弃去整批的可能性。由于疫苗生产中通常使用3种流感病毒毒株，对于最终的散装液需要混合这3种病毒株。应在例如用于混合和充填之前的病毒收集过程中进行在线MPA(微生物纯度试验)检验以确保产品不含微生物。
[0071]孵育后，采用“常规”透光检验方法来鉴定未受精和因天然原因或微生物污染而死亡的死蛋(即，病毒的感染性和/或微生物扩增可能引发死蛋，对这两种情况均需检测并除去这种蛋)。透光检验包括，例如在暗室中将鸡蛋握持在光源前从而能目测观察胚胎发育的方法。排除死蛋不进行病毒接种。
[0072]此外，微生物污染可发生于在细胞培养物中生产病毒的若干点上，例如，在开始培养宿主细胞之前原料宿主细胞可被微生物感染。主细胞库(MCB)的制备是在用于疫苗材料的病毒的生产中使用的基础。MCB被充分检测以确保没有微生物痕迹，可任选检测MCB的致肿瘤性和/或致瘤性。或者，在需要打开用来培养宿主细胞的生长容器(例如发酵罐)的任何步骤中都可能引入微生物。可能需要打开生长容器的步骤包括，例如，任何向培养物中加入蛋白酶或其它添加物过程中以及用病毒感染宿主细胞的过程中。使用无菌培养基和设备以及开发使打开生长容器的机率最小化的工艺是使污染的风险最小化的基础。
[0073]从上述时间点可以看出，流感疫苗生产期间有多个步骤需要检测微生物污染。需要消除或减少禽类和环境微生物，需要消除或减少引入的环境和人类的微生物。目前检测微生物污染的方法包括，例如药典规定的(compendial)方法(MPA和生物负载)。目前的方法可以包括，例如接种前/后鸡蛋透光检验(通常以约500枚蛋/小时/人的速度手工进行)；MPA和生物负载检验，通常手工进行，对于MPA需要约14天，对于生物负载需要约3天(在MCB制备和病毒收集期间进行)；支原体检验，通常手工进行，需要约28天(在病毒收集期间进行)；和分枝杆菌检验，通常手工进行，需要约56天(在病毒收集期间进行)。对于本发明能采用的各种技术的描述也可参见例如PCT公开WO 05/014862。
组2
[0074]属于组2的病毒/疫苗生产的方面包括进一步的纯化和病毒扩增等。经正确的重配和重配体(例如6∶2病毒)克隆过程后，进一步纯化含胚鸡蛋中的这种重配病毒颗粒，并大量扩增正确的克隆(还是通过在鸡蛋中培养)以产生主病毒毒株(MVS)或主病毒种子，其进一步扩增以产生主工作病毒毒株(MWVS)或生产商的工作病毒种子。从鸡蛋纯化病毒颗粒和利用这种纯化的病毒来接种更多鸡蛋以扩增大量病毒颗粒的许多方面是精通本领域的技术人员所熟知的。许多这些技术是目前病毒颗粒生产中常用的，已至少使用了40年。参见，例如Reimer等，《采用区带超离心纯化流感病毒》(Influenza virus purification with the zonalultracentrifuge)，Science，1966，152：1379-81。纯化方法可包括，例如蔗糖梯度超离心(例如，10-40％蔗糖)等。如本文所述，组2中也可任选包括其它组所列工艺等，例如防止微生物污染等。
组3
[0075]属于组3的病毒/疫苗生产方面包括，例如确定孵育含胚蛋或其它宿主细胞的条件(如，涉及孵育病毒感染的含胚蛋或其它宿主细胞的特定处理和环境条件)和从鸡蛋尿囊液或宿主细胞培养上清中收集并净化流感病毒。
[0076]例如，确定条件、洗涤、透光检验和孵育含有用于疫苗的重配病毒的蛋；接种、密封这种蛋等；透光检验这种蛋；收集蛋中的病毒溶液(如，尿囊液)；培养和接种宿主细胞；收集宿主细胞中的病毒溶液(如细胞培养物上清液)；和净化病毒溶液均属于这种范畴。也应注意适用于组2步骤的几种技术同样适用于组3的步骤(例如，透光检验)。包括组3的病毒/疫苗生产的几个方面是精通本领域的技术人员所熟知的。病毒生产中透光验蛋以及用病毒接种蛋和这种蛋的洗涤、孵育等各方面是用蛋生产病毒/疫苗的熟知技术。当然，应该知道这种熟知技术可与本发明独特且创新的方面联用。PCT公开WO 05/014862中给出的也可与本发明方法和组合物联用的其它步骤，如摆动(rocking)等。其它类似的步骤可包括组合物的特殊过滤和升温步骤，也参见PCT公开WO 05/014862。
过滤和升温
[0077]此外，PCT公开WO 05/014862中还给出了可任选与本发明方法和组合物联用的其它过滤和升温步骤。如(本文)所述，FluMistTM生产方法可利用含胚鸡蛋来产生主病毒种子(MVS)、生产商工作病毒种子(MWVS)和病毒收获物(VH)。这些种子和病毒收获物可能含有生物负载(通常是细菌污染)，可能导致疫苗生产过程中弃去该种子或散装病毒产品批次。当然，应该知道，除非另有明确表述，不应将所用具体产品的类型、大小等的具体列表或描述认为是对本发明的限制。
组4
[0078]疫苗生产的组4的方面包括，例如主要与稳定化有关的步骤(例如，通过加入组分，改变缓冲液/NAF比值等)和含病毒溶液的效力/无菌性试验。在一些实施方案中，本发明的最终病毒溶液/疫苗可以含有在液体形式中稳定足够时间从而能在整个流感疫苗季节(例如，在北半球通常大概从9月到3月)“现场”储存(例如，在2-8℃、4℃、5℃等冷藏时销售和商品化)的活病毒。因此，需要这种病毒/疫苗组合物在储存期间保持其效力或其丧失效力的速度可以接受。在其它实施方案中，液体形式的这种溶液/疫苗在约2-8℃(例如冷藏温度)下稳定。因此，经本发明和本发明的方法生产的病毒/疫苗可以通过这样的步骤和/或与这样的步骤联用加以生产。同样可见PCT公开WO 05/014862。
病毒收获物的浓缩/渗滤
[0079]在疫苗组合物生产的一些方法中，使用合适的柱任选浓缩病毒收获物。参见PCT公开WO 05/014862。
稳定剂/缓冲液
[0080]疫苗组合物生产也可任选包括含有感兴趣病毒和诸如蔗糖、精氨酸、明胶、EDTA等混合物的NAF(通常是未分馏的NAF)的各种稀释液。不同疫苗剂型中可能的各种组合物的例子可参见，例如PCT公开WO 05/014862。在某些实施方案中，这种方法和组合物在所需温度(例如，通常在4℃、5℃、8℃，约2-8℃之间或高于2℃等)下、在所选择的时期(通常至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少15个月、至少18个月、至少24个月等)内稳定(即不显示不可接受的效力丧失)。
[0081]在一些剂型中，组合物可含有与明胶或明胶相关和/或衍生产品(例如明胶水解物)相混合或替代其的稳定剂，例如精氨酸(pH约7.0-约7.2)。同样可参见PCT公开WO 05/014862。许多病毒溶液/疫苗溶液中任选采用SPG基础溶液(蔗糖、磷酸钾和谷氨酸单钠)。
[0082]同样，PCT公开WO 05/014862给出了稳定病毒/疫苗组合物的其它方法，例如操控NAF水平等。
定义
[0083]除非另有定义，所有科技术语应理解为具有和其所属领域常规使用相同的意义。出于本发明的目的，下文定义了以下术语。
[0084]术语“核酸”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核酸序列”指单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，或其嵌合物或类似物。本文所用的该术语任选包括具有天然核苷酸基本性质的天然产生的核苷酸类似物的聚合物，其中它们以类似于天然产生的核苷酸的方式与单链核酸杂交(例如，肽核酸)。除非另有指明，除了明确指出的序列以外，具体核酸序列任选含有互补的序列。
[0085]术语“基因”广泛用于指与生物学功能相关的任何核酸。因此，基因包含它们表达所需的编码序列和/或调节序列。术语“基因”适用于特定的基因组序列以及该基因组序列所编码的cDNA或mRNA。
[0086]基因也包含不表达的核酸区段，例如所述区段形成其它蛋白质的识别序列。不表达的调节序列包括能与诸如转录因子的调节蛋白结合从而导致毗连或毗邻序列转录的“启动子”和“增强子”。“组织特异性”启动子或增强子是能在一种或多种特定组织类型或细胞类型中调节转录的启动子或增强子。
[0087]术语“载体”指能在生物、细胞或细胞组分之间扩增和/或转运核酸的工具。载体包括能自主复制或能整合入宿主细胞染色体中的质粒、病毒、噬菌体、原病毒、噬菌粒、转座子和人工染色体等。载体也可是不能自主复制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一链中由DNA和RNA构成的多核苷酸、聚-赖氨酸-偶联的DNA或RNA、肽-偶联的DNA或RNA、脂质体-偶联的DNA等。
[0088]“表达载体”是能促进掺入其中的核酸表达以及复制的载体，如质粒。待表达的核酸通常“操作性连接于”启动子和/或增强子，并受启动子和/或增强子的转录调节控制。
[0089]“双向表达载体”的特征是两个交替的启动子(alternative promoter)的朝向相对于它们之间的核酸呈相反方向，从而可以两个方向启动表达，进而导致，例如同时转录正(+)链或正义链和负链(-)或反义链RNA。
[0090]在本文中，术语“分离的”指基本上不含在其天然产生环境中通常与其正常相伴或相互作用的成分的生物材料，例如核酸或蛋白质。分离的材料任选含有在其天然环境(例如细胞)中未发现的与其相伴的物质。例如，如果该材料处于其天然环境，例如细胞中，则该材料在细胞中被置于该环境中所发现的材料的非天然位置上(例如，基因组或遗传元件)。例如，如果通过非天然方式将天然产生的核酸(例如，编码序列、启动子、增强子等)引入对该核酸是非天然的基因组位点中(例如，载体，如质粒或病毒载体或扩增子)，则该核酸成为分离的。这种核酸也称为“异源”核酸。
[0091]术语“重组体”表示经人工或合成(非天然)方法改变的物质(例如，核酸或蛋白质)。可对处于其天然环境或状态中，或对从其天然环境或状态中除去的物质进行改变。具体地说，当指病毒(例如流感病毒)时，当其通过重组核酸的表达产生时，所述病毒是重组体。
[0092]当术语“重配体”指病毒时，其表示该病毒包含衍生自多个亲代病毒毒株或来源的遗传成分和/或多肽成分。例如，7∶1重配体包含衍生自第一个亲代病毒的7个病毒基因组区段(或基因区段)和衍生自第二个亲代病毒的一个单一互补病毒基因组区段，例如编码血凝素或神经氨酸酶的基因组区段。6∶2重配体包含来自第一个亲代病毒的6个基因组区段(最常见是6个内部基因)和来自另一个不同的亲代病毒的两个互补区段，例如(编码)血凝素或神经氨酸酶的区段。
[0093]当术语“引入”指异源或分离的核酸时，其指将某核酸掺入真核或原核细胞中，其中该核酸可以掺入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转变为自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。该术语包括诸如“感染”、“转染”、“转化”和“转导”等方法。在本发明内容中，可采用各种方法将核酸引入原核细胞中，包括电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质介导的转染(脂转染)等。
[0094]术语“宿主细胞”表示含有异源核酸(例如载体)并能支持该核酸复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌，或真核细胞，例如酵母、昆虫(细胞)、两栖类(细胞)、禽类(细胞)或包括人细胞在内的哺乳动物细胞。本发明内容中的示范性宿主细胞包括Vero(非洲绿猴肾)细胞、BHK(幼仓鼠肾)细胞、原代雏鸡肾(PCK)细胞、Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞、Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞、293细胞(例如，293T细胞)和COS细胞(例如，COS1、COS7细胞)。
流感病毒
[0095]本文的组合物和方法主要涉及用于疫苗的流感病毒的生产。流感病毒由含有分节段的单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心及具有基质蛋白衬里的脂蛋白外包膜构成。甲型流感病毒和乙型流感病毒各自含有8个区段的单链负链RNA。甲型流感病毒基因组编码11种多肽。区段1-3编码构成RNA依赖性RNA聚合酶的3种多肽。区段1编码聚合酶复合物蛋白PB2。其余的聚合酶蛋白PB1和PA分别由区段2和区段3编码。此外，一些流感病毒毒株的区段1编码由PB1编码区内选择性读框产生的小蛋白PB1-F2。区段4编码参与感染期间细胞黏附和进入的血凝素(HA)表面糖蛋白。区段5编码核衣壳核蛋白(NP)多肽，这是与病毒RNA结合的主要结构组分。区段6编码神经氨酸酶(NA)包膜糖蛋白。区段7编码由不同剪接方式的mRNA翻译的两种基质蛋白，称为M1和M2。区段8编码由不同剪接方式的mRNA翻译的两种非结构蛋白NS1和NS2。
[0096]乙型流感病毒的8个基因组区段编码11种蛋白质。3个最大的基因编码RNA聚合酶的组分PB1、PB2和PA。区段4编码HA蛋白。区段5编码NP。区段6编码NA蛋白和NB蛋白。蛋白NB和NA均由双顺反子mRNA的重叠读框翻译。乙型流感病毒的区段7也编码两种蛋白质：M1和M2。最小的区段编码两种蛋白质：由全长RNA翻译的NS1和由mRNA剪接体翻译的NS2。
流感病毒疫苗
[0097]历史上，主要利用根据相关病毒株的经验性预测选出的病毒毒株在含胚鸡蛋中生产流感病毒疫苗。近年来，将选择的血凝素和神经氨酸酶抗原掺入已批准的减毒的温度敏感主病毒株中制备了重配体病毒。通过在鸡蛋中传代多次培养病毒后，回收流感病毒并任选灭活，例如用甲醛和/或β丙内酯灭活(或者用于减毒活疫苗)。
[0098]然而，以此方式生产流感疫苗有几个明显的问题。例如，鸡蛋中残留的污染物可以是高度抗原性和/或热源性的，并在给药后常可导致明显的副作用。因此，另一方法包括用不含动物(成分)的培养基替换一定百分比的鸡蛋组分。更重要的是，通常必须在下一次流感季节前数月选择和分发为疫苗生产所指定的病毒毒株，从而有时间生产和灭活流感疫苗。因此在储存期间的稳定性和/或在更方便的温度(例如，约2-8℃的冷藏温度)下储存方面的任何提高也是非常需要的。
[0099]批准用于疫苗生产的一些病毒株在标准细胞培养条件下不能充分生长阻碍了在细胞培养物中生产重组和重配疫苗的尝试。因此，本发明人及同事先前的工作提供了在培养物中生产重组和重配病毒的载体系统和方法，从而能快速生产对应于一种或多种选择的抗原性病毒株的疫苗。参见，例如上述PCT公开WO 03/091401。当然，任选在鸡蛋中进一步扩增这样的重配(体)。通常在受控的湿度和CO2条件下，利用温度调节器，例如恒温箱以确保温度不超过35℃的恒定温度下将培养物维持在诸如细胞培养箱的系统中。通过全部或部分利用本发明可进一步优化这种前驱性工作以及其它疫苗生产工作。
[0100]通过引入对应于主流感病毒基因组区段的载体亚组联同衍生自感兴趣病毒株(例如，感兴趣的抗原性变体)的互补区段不难获得重配流感病毒。通常根据与疫苗给予相关的所需特性来选择主病毒株。例如，为疫苗生产，如为生产减毒的活疫苗，可选择减毒表型、冷适应和/或温度敏感的主供体病毒毒株。
FluMist
[0101]如上所述，流感疫苗有许多实例和类型。示范性流感疫苗FluMist是一种保护儿童和成年人免患流感疾病的减毒活疫苗(Belshe等，(1998)，《减毒的、冷适应的、三价、鼻内流感病毒活疫苗在儿童中的效力》(The efficacy of live attenuated，cold-adapted，trivalent，intranasal influenza virus vaccine in children)，N.Engl.J.Med.，338：1405-12；Nichol等，(1999)，《减毒的鼻内流感病毒活疫苗在健康工作成人中的效力：一项随机对照试验》(Effectiveness of live，attenuated intranasal influenza virusvaccine in healthy，working adults：a randomized controlled trial)，JAMA，282：137-44)。在典型的实施方案中，本发明方法和组合物宜适用于生产FluMist疫苗或与之联用。然而，精通本领域的技术人员应知道本文的步骤/组合物也适用于生产相似，或者甚至不同的病毒疫苗及其组合物。
[0102]FluMisTM疫苗病毒株含有，例如衍生自该疫苗所属野生型病毒株的HA和NA基因区段联同常规主供体病毒(MDV)的6个基因区段，PB1、PB2、PA、NP、M和NS。通过在连续降温条件下在原代雏鸡肾组织培养物中连续传代野生型A/AnnArbor/6/60(A/AA/6/60)病毒株制备了FluMist的甲型流感病毒毒株的MDV(MDV-A)(Maassab，(1967)，《25℃时流感病毒的适应性和生长特性》(Adaptation and growthcharacteristics of influenza virus at 25 degrees C)，Nature，213：612-4)。MDV-A在25℃有效复制(ca，冷适应的)，但其生长在38和39℃受限(ts，温度敏感的)。此外，该病毒在受感染雪貂的肺中不能复制(att，减毒的)。据信，ts表型可通过限制疫苗在除最冷区域以外的所有呼吸道中复制从而导致其在人中减毒。动物模型和临床研究证明了此特性的稳定性。与通过化学诱变产生的流感病毒毒株的ts表型不同，经受感染的仓鼠或在儿童的蜕皮分离物中传代后MDV-A的此ts特性不回复(最近的综述可参见Murphy和Coelingh，(2002)，《减毒的冷适应甲型流感病毒和乙型流感病毒活疫苗的开发原理和应用》(Principles underlying the development and use of live attenuatedcold-adapted influenza A and B virus vaccines)，Viral Immunol.，15：295-323)。
[0103]在20,000以上的成人和儿童中进行的涉及12种不同6∶2重配病毒株的临床研究显示这些疫苗是减毒、安全而有效的(Belshe等，(1998)，《减毒的、冷适应的、三价、鼻内流感病毒活疫苗在儿童中的效力》(The efficacy of live attenuated，cold-adapted，trivalent，intranasal influenza virus vaccine in children)，N.Engl.J.Med.，338：1405-12；Boyce等，(2000)，《鼻内给予健康成人的加佐剂和未加佐剂亚单位流感疫苗的安全性和免疫原性》(Safety and immunogenicity of adjuvanted andunadjuvanted subunit influenza vaccines administered intranasally to healthy adults)，Vaccine，19：217-26；Edwards等，(1994)，《用于预防甲型流感疾病的冷适应和灭活疫苗的随机对照试验》(A randomized controlled trial of cold adapted and inactivatedvaccines for the prevention of influenza A disease)，J.Infect.Dis.，169：68-76；Nichol等，(1999)，《减毒的鼻内流感病毒活疫苗在健康作成人中的效力：一项随机对照试验》(Effectiveness of live，attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy，workingadults：a randomized controlled trial)，JAMA，282：137-44)。携带MDV-A的6个内部基因和野生型病毒的两个HA和NA基因区段的重配体(即，6∶2重配体)始终保留了ca、ts和att表型(Maassab等，(1982)，《在雪貂中评估低温重组流感病毒疫苗》(Evaluation of a cold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets)，J.Infect.Dis.，146：780-900)。然而，利用乙型流感病毒毒株制备这种重配病毒更困难。
[0104]近年来的工作公开了用于完全由克隆的cPNA制备乙型流感病毒的一种8质粒系统，以及适用于疫苗剂型(例如用于鼻内给予的活病毒疫苗剂型)的减毒活甲型流感病毒和乙型流感病毒的制备方法(参见例如上述PCT公开WO 03/091401)。本发明还提供了生产乙型毒株的改进方法。
[0105]上述系统和方法可用于快速生产重组和重配甲型流感病毒和乙型流感病毒，包括适合用作疫苗的病毒，包括减毒活疫苗(例如适用于鼻内给予的疫苗，如FluMist)的病毒。本发明方法任选与先前涉及例如用于疫苗生产的重配流感病毒的工作联用或组合从而以更稳定、均一和多产的方式生产用于疫苗的病毒。
细胞培养中的病毒复制
[0106]如上所述，流感病毒可任选在细胞培养物中生长。一般在常规培养宿主细胞的培养基组合物中实现病毒增殖。用于流感病毒复制的合适宿主细胞包括，例如Vero细胞、BHK细胞、MDCK细胞、293细胞和COS细胞，包括293T细胞、COS7细胞。通常利用例如1∶1比例的包括两种上述细胞系，例如MDCK细胞和293T或COS细胞的共同培养物来提高复制效率。细胞一般在适合于维持缓冲液中性pH(例如，介于7.0-7.2间的pH)的受控湿度和CO2下，在标准商品化培养基，例如补加血清(例如，0.5-10％胎牛血清)的Dulbecco改进Eagle培养基、或不含血清的培养基(例如Iscove′s培养基、ultra CHO培养基(BioWhittaker)，EX-CELL(JRH Biosciences))、或不含动物蛋白的培养基(例如PF-CHO(JRH Biosciences))中培养。培养基任选含有防止细菌生长的抗生素(例如青霉素、链霉素等)和/或其它营养素(例如L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸)、促进有利的生长特征的其它补充物质(例如胰蛋白酶、β-巯基乙醇等)。
[0107]在培养基中维持哺乳动物细胞的方法已有大量报道且为精通本领域的技术人员所熟知。通用方法可见，例如Freshney，(1983)，《动物细胞培养：基础技术 手册》(Culture of Animal Cells：Manual of Basic Technique)，Alan R.Liss，纽约；Paul，(1975)，《细胞和组织培养》(Cell and Tissue Culture)，第五版，Livingston编，爱丁堡；Adams，(1980)，《生物化学和分子生物学中的实验室技术-针对生物化学家的细胞培 养》(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists)，Work和Burdon编，Elsevier，阿姆斯特丹。关于流感病毒体外生产中特别感兴趣的组织培养方法的其它细节描述包括，例如Merten等，(1996)，“在细胞培养物中生产用于疫苗制备的流感病毒”(Production of influenza virus in cell culturesfor vaccine preparation)，刊于Cohen和Shafferman编，《疫苗设计和生产的新方法》 (Novel Strategies in Design and Production of Vaccines)。此外，通过常规实验不难确定适应于本发明的这些方法中的改变，这样的改变对于精通本领域的技术人员应是熟悉的。
[0108]可在含有血清或不含血清或不含动物蛋白的培养基中培养用于生产流感病毒的细胞。在一些情况中，例如为制备纯化的病毒，通常需要在不含血清或不含动物蛋白的条件下培养宿主细胞。可以以基质(例如微载体)上的贴壁细胞的形式或不黏附于任何基质的细胞悬液的形式培养细胞。可以小规模(例如在少于25ml培养基中)、在培养试管或培养瓶中、或在带搅拌的大瓶中、摇瓶中、或在烧瓶、瓶或反应器培养液中的微载体珠上(例如，DEAE-Dextran微载体珠，如Dormacell，Pfeifer& Langen；Superbead，Flow Laboratories；苯乙烯共聚物-三-甲胺珠，例如Hillex，SoIoHill，Ann Arbor)培养细胞。微载体是为每份细胞培养液体积的黏附细胞生长提供大表面积的小球体(直径为100-200微米)。例如，1升培养基可含有两千万以上的微载体珠，这些微载体珠能提供8000平方厘米以上的生长表面。对于病毒的商品化生产，例如对于疫苗生产，往往需要在生物反应器或发酵罐中培养细胞。可用的生物反应器的容积从1升以下到100升以上，例如Cyto3生物反应器(Osmonics，Minnetonka，MN)；NBS生物反应器(New Brunswick Scientific，Edison，新泽西)；B.Braun Biotech International的实验室和工业化规模的生物反应器(B.BraunBiotech，Melsungen，德国)。
[0109]无论培养液的体积，在许多希望的方面，重要的是将培养液维持在合适温度从而通过使用温度依赖性多质粒系统(参见，例如，上述PCT公开WO 03/091401)、用于过滤的病毒溶液加热等确保病毒复制和/或重组和/或重配流感病毒的回收。通常利用调节器(例如恒温箱或感测和维持细胞培养系统和/或其它溶液温度的其它装置)来确保合适时期(例如，病毒复制期等)内的温度处于正确水平。
[0110]在一些方法中(例如，其中要从载体上的区段制备重配病毒)，根据本领域熟知的将异源核酸引入真核细胞的方法将含有流感(病毒)基因组区段的载体引入(转染)宿主细胞，所述方法包括，例如磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂转染和利用聚胺转染试剂转染。例如，可根据生产商的使用说明书利用聚胺转染试剂TransIT-LT1(Minis)将载体(如质粒)转染入宿主细胞，例如COS细胞、293T细胞或COS或293T细胞和MDCK细胞的混合物中，从而产生重配病毒等。待引入宿主细胞群的约1μg各载体与约2μl TransIT-LT1用160μl培养基(优选不含血清的培养基)稀释，终体积200μl。DNA：转染试剂混合物在室温培育45分钟，然后加入800μl培养基。向宿主细胞中加入此转染混合物，如上所述或通过精通本领域的技术人员所熟知的其它方法培养细胞。因此，为在细胞培养物中制备重组或重配病毒，将掺有8个基因组各个区段(PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HA和NA)的载体与约20μlTransIT-LT1混合，转染入宿主细胞中。转染前任选用不含血清的培养基，例如Opti-MEM I替换含血清的培养基，并培育4-6小时。
[0111]或者，可采用电穿孔将掺有流感(病毒)基因组区段的这种载体引入宿主细胞中。参见PCT公开WO 05/062820。例如，优选根据以下方法用电穿孔将掺有甲型流感病毒或乙型流感病毒的质粒载体引入Vero细胞中。简言之，例如将生长在补加10％胎牛血清(FBS)的改进Eagle培养基(MEM)中的约5×106个Vero细胞重悬于0.4ml OptiMEM中，置于电穿孔小杯中。向该小杯细胞中加入体积为25μl以下的20微克DNA，然后轻扣混合。根据生产商的使用说明书(例如，与Capacitance ExtenderPlus相连的BioRad Gene Pulser II)以300伏、950微法和28-33毫秒的时间常数进行电穿孔。轻扣重新混合细胞，电穿孔后约1-2分钟直接在小杯中加入0.7ml含10％FBS的MEM。然后将细胞转入含有2ml MEM，10％FBS的标准6孔组织培养皿的两个孔中。洗涤小杯以回收任何剩余的细胞，洗涤悬液分入所述两个孔中。终体积约3.5mL。然后在允许病毒生长的条件下(例如对于冷适应病毒株约33℃)培育细胞。
[0112]在一些方法中(例如，其中用宿主细胞来制造病毒以生产疫苗的方法)，按照本领域熟知的方法培养宿主细胞并用病毒感染。例如，优选当细胞已经达到最佳细胞密度(例如，取决于所采用的培养条件，每毫升约5×105到20×106个细胞)时进行所培养细胞的感染。以约0.001-10的感染复数(m.o.i.)(优选的m.o.i.约为0.002-0.5)感染宿主细胞。通常，病毒在动物细胞内的有效复制需要加入蛋白酶(例如，丝氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶)，可任选在感染前一会儿、感染时或感染后一会儿在培养物中加入蛋白酶。根据本发明，在病毒感染后继续培养被感染的细胞以在低于33℃的温度下如31℃(或任选在约29℃和约32℃之间)复制病毒，通常要培养到可检测到(例如，TCID50试验和Q RT-PCR试验)最大细胞病变效应或最大病毒量。任选地，将感染的细胞培养约2-10天。用来生产含有病毒的细胞上清液的具体方法是本领域已知的(参见，例如，美国专利4,500513、6,656,720、6,455,298和6,146,873)。应了解，其它步骤(类似步骤或不同步骤)可任选与本发明的方法一起使用。
试剂盒
[0113]为便于本发明方法和组合物的使用，可将任何疫苗组分和/或组合物(例如各种剂型的病毒等)和出于实验或治疗性疫苗目的可用于包装和流感病毒感染的其它组分(如缓冲液、细胞、培养基)包装成试剂盒形式。除了上述组分外，试剂盒通常含有其它材料，可以包括，例如执行本发明方法的使用说明书、包装材料和容器。
[0114]尽管出于清晰和理解的目的描述了上述发明的一些细节，但精通本领域的技术人员阅读本文内容后应明白可对形式和细节作出各种改变而不脱离本发明的真正范围。例如，上述所有技术和装置可以各种组合使用。本申请书中引用的所有出版物、专利、专利申请或其它文件通过参考出于所有目的完整地纳入本申请书中，其程度相当于单独每份出版物、专利、专利申请或其它文件单独地说明出于所有目的通过参考纳入本文。此外，出于所有目的，2004年12月8日提交的美国临时申请60/634,690通过引用完整地纳入本文。
Claims (24)
1.一种生产至少一种流感病毒颗粒的方法，所述方法包括：
a.将至少一种含有流感病毒基因组或部分基因组的载体引入至少一个宿主蛋；
b.在低于33℃的温度下孵育所述宿主蛋；和
c.从所述宿主蛋回收所述流感病毒颗粒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒包括乙型流感病毒株的病毒。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述基因组或部分基因组来自减毒的流感病毒、冷适应流感病毒、温敏流感病毒、减毒的冷适应流感病毒、或减毒的温敏流感病毒、或冷适应温敏流感病毒、或减毒的冷适应温敏流感病毒。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因组或部分基因组来自caB/Jilin/20/03、PR8、ca B/Ann Arbor/1/94、B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55或B/England/2608/76流感病毒株。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主蛋包括SPF含胚鸡蛋。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在31-33℃之间孵育所述宿主蛋。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在31-32℃之间孵育所述宿主蛋。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在31℃孵育所述宿主蛋。
9.一种用权利要求1所述方法生产的流感病毒。
10.一种含有权利要求9所述病毒的冷藏稳定的组合物。
11.一种含有权利要求9所述病毒的流感疫苗。
12.如权利要求11所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗含有液态的减毒鼻内活疫苗。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在33℃以下孵育得到的回收的病毒颗粒的产量大于或等于相同病毒颗粒在33℃或更高温度下孵育所得到的产量。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述在33℃以下孵育是在31℃孵育，所述在33℃或更高温度下孵育是在33℃孵育。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述产量通过测定用33℃以下孵育的病毒颗粒所感染的宿主蛋的尿囊液的log10 TCID50/mL滴度及通过测定用33℃孵育的病毒颗粒所感染的宿主蛋的尿囊液的log10 TCID50/mL滴度进行量化。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述得自31℃孵育的log10TCID50/mL滴度比33℃的log10 TCID50/mL滴度高至少约1.01-1.10倍、至少约1.025-1.05倍、或至少约1.03-1.04倍。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒颗粒在对象中引起免疫应答，该应答实质上类似于经33℃或以上孵育产生的病毒颗粒在对象中所引起的免疫应答。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述对象是雪貂。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述对象是人。
20.一种提高流感病毒颗粒产量的方法，所述方法包括在低于33℃的温度下孵育宿主内的所述流感病毒。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，宿主内的所述流感病毒在31-32℃孵育。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，宿主内的所述流感病毒在约31℃孵育。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述流感病毒是冷适应温敏减毒的流感病毒。
24.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述流感病毒含有至少一个AnnArbor B株流感病毒的vRNA基因组区段。
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