KR100281676B1 - 신규한독감생백신바이러스 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 독감에 대한 백신으로 사용될 수 있는 신규한 저온적응 독감 바이러스에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 수정란에서 생육이 왕성한 독감 바이러스(Influenza virus)를 모균주로 하여 24℃의 저온에서 수회 계대배양하여 얻은 저온적응 독감 바이러스, 그의 제조방법 및 이를 유행하는 독감 바이러스와 동일한 숙주세포에 동시감염시켜 얻은 재조합 독감 바이러스 그리고 이들을 독감 생백신(live vaccine)으로 사용하는 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 저온적응 독감 바이러스는 온도 감수성, 수정란에서의 우수한 성장 능력, 생체 독성의 현저한 감소를 보이는 독감 바이러스로 독감의 효과적인 생백신으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

신규한 독감 생백신 바이러스
본 발명은 독감에 대한 백신으로 사용될 수 있는 신규한 저온적응 독감 바이러스에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 수정란에서 생육이 왕성한 독감 바이러스(Influenza virus)를 모균주로 하여 24℃의 저온에서 수회 계대배양하여 얻은 저온적응 독감 바이러스, 그의 제조방법 및 이를 유행하는 독감 바이러스와 동일한 숙주세포에 동시감염시켜 얻은 재조합 독감 바이러스 그리고 이들을 독감 생백신(live vaccine)으로 사용하는 용도에 관한 것이다.
독감 바이러스는 사람뿐만 아니라 새, 돼지, 말, 바다표범, 고래, 밍크 등 가축과 여러 동물들에 널리 퍼져 있는 호흡기 감염 질환 바이러스로서 경우에 따라서는 엄청난 피해를 줄 수 있는 전염성 바이러스이다. 독감 바이러스는 주로 호흡기 계통 상부에 감염되나 폐에 까지 침투되어 치명적인 질병을 유발시킬 수도 있다.
1918년 스페인 인플루엔자에 의한 유행성 독감이 전세계적으로 발생했을(pandemic) 때에는 200만명 이상이 사망하였으며(Epidemic and Peace 1918, Greenwood press, 145-170, 1976), 1957년 아시아 바이러스(H2N2), 1968년 홍콩 바이러스(H3N2), 1977년 러시아 바이러스(H1N1) 등에 의해 전세계적으로 유행한 독감으로는 수십만명이 사망하였다. 10년 주기의 이러한 전세계적으로 유행하는 독감이외에도 거의 매년 지엽적으로 발생하는(epidemic) 독감으로 인해 그 때마다 만명 이상의 환자가 사망하는 것으로 알려져 있다(Mobid Mortal Wkly. Rep. 36, 273, 1987).
한편 독감으로 인해 전사회적으로 손실되는 비용 또한 엄청나다. 예를 들면 미국에서 한번의 유행성 독감에 의해서 손실되는 비용은 30-50억 달러로 추정되는데(Diseases of importance in the United States,Natl. Acad. press, 342, 1985;Am. J. Med.82, 26, 1987), 따라서 백신접종으로 80% 정도의 예방이 가능하다면 약 25억 달러 정도의 비용이 절약되는 효과를 볼 수 있다.
독감 바이러스는 그들의 표면항원인 헤마글루티닌(Hemagglutinin; 이하 ″HA″라 약칭함)과 뉴라미니다아제(Neuraminidase; 이하 ″NA″라 약칭함)가 항원 대/소변이(antigenic shift/antigenic drift)로 인해 쉽게 변형되어 기존의 독감 바이러스 감염이나 백신 예방에 의한 효과를 상쇄시킨다. 따라서 앞으로 유행할 가능성이 있는 독감 바이러스를 예측하여 그와 비슷한 면역원성을 갖는 백신의 제조가 필요하고, 1-2년 마다 새로 백신을 투여하여야 한다.
세계보건기구(World Health Organization; 이하 ″WHO″라 약칭함)에서는 바이러스의 출현 동향을 감시 분석하여 매년 초에 다음에 유행할 독감 바이러스를 발표한다. WHO 가 다음에 유행할 독감 바이러스를 발표하면 그 바이러스 균주를 백신으로 제조하여야 하는데, 백신의 제조에 사용되는 숙주인 10여일간 배양된 수정란에서는 이들 바이러스의 성장이 좋지 않은 것이 일반적이다. 따라서 수정란에서도 성장이 활발한 바이러스 균주를 함께 이용하는데 A형 독감바이러스에서는 A/PR/8/34 나 A/X-31 가 백신 제조에 있어서 HA 와 NA 를 제외한 나머지 6개 유전자를 제공하는 모균주로 널리 사용된다(Influenza, Plenum Medical Book Company, 291, 1987).
현재 사용되는 독감 백신은 사백신(killed vaccine)으로 그 종류로는 1930년대 초반에 처음 개발된 전체 비리온(virion)을 포르말린(formalin)이나 β-프로피오락톤(β-propiolactone)으로 불활성화시켜 정제한 전체 비리온 백신(whole virion vaccine)과 비리온을 트윈-에테르 혼합물(Tween-ether mixture), 소디움 데속시콜레이트(Sodium desoxycholate), 트리톤 N101(Triton N101), 에틸메틸-암모니움브로마이드(Etylmethyl-ammoniumbromide) 등의 비이온성 계면활성제(non-ionic detergent)로 처리하여 바이러스를 분쇄한 후 정제한 파쇄 바이러스 백신(disrupted virus vaccine)이 있으며 바이러스 표면 항원인 HA 와 NA 를 분리 정제한 단위 백신(subunit vaccine) 등이 있다.
현재까지 이들 사백신들이 독감 예방에 주로 사용되어 왔으며 약 70-80%의 예방효과를 나타내는 것으로 보고되었다. 그러나 이러한 사백신은 백신으로서 다음과 같은 문제점이 있다.
첫째, 바이러스의 불활성화 과정 중에 살아있는 맹독성 바이러스가 없도록 하면서 면역원성의 변형이 없도록 하는 세심한 주의가 요구된다.
둘째, 사백신은 순환 항체인 IgM, IgG 등은 고농도로 축적시키나 국소 저항(local resistance)의 원인이 되는 IgA는 생성이 유발되지 않아 초기에 감염 저지가 어렵다.
셋째, 세포-매개 반응(cell-mediated response)이 생백신에 비해 잘 일어나지 않는다.
넷째, 면역의 지속기간이 특히 성인에게서 짧게 나타난다.
다섯째, 주사제이기 때문에 특히 어린이에게 투여하는데 애로 사항이 있다.
여섯째, 이종단백질의 매년 지속적인 체내 투여로 인하여 과민반응성 등의 부작용과 정제과정중에 유입될 수 있는 수정란의 단백질에 의한 부작용 등이 나타날 수 있다.
상기와 같은 사백신의 문제점을 개선하기 위하여 다른 대체 백신의 개발이 요구되어 현재는 생백신(live vaccine)이 유력한 후보로 개발 시험중에 있다.
이러한 생백신은 독성이 현저히 감소되어 인체에 거의 해를 주지 않는 성질과 투여된후 독성이 복귀되지 않는 유전적 안정성 등이 보장되어야 하는데 약독화된 생백신의 제조는 다음과 같은 여러 가지 방법으로 시도되었다.
첫째는 돌연변이를 유발시켜 온도 감수성 변이주(temperature-sensitive mutant)를 얻는 방법이고(J. Infect. Dis. 128, 479, 1973), 둘째는 낮은 온도에서 연속 계대배양하여 저온에서 복제를 잘하는 변이주를 선별하는 방법이고(Vaccine 3, 335, 1985), 세째는 사람 이외의 동물에는 감염하여 쉽게 복제하지만 사람에 감염되었을 때는 쉽게 복제하지 못하는 숙주 변이주(host-range mutant)를 이용하는 방법이다(Science 218, 1330, 1982).
그러나 온도감수성 변이주는 한 두 유전자에서 점 돌연변이(point mutation)에 의해서 만들어지는 경우가 대부분으로 복귀 돌연변이주가 쉽게 생길 수 있는 문제점이 있고(Bull. WHO. 59, 165, 1981), 숙주 변이주는 새나 돼지의 독감 바이러스 유전자가 사람의 독감 바이러스에 유입되어 또 다른 맹독성 바이러스를 만들어 낼 수 있는 잠재적인 위험성을 가지고 있다(Option for the control of Influenza, Excerpta Medica 207, 1986).
지금까지 생백신으로서 가장 많이 사용된 바이러스는 저온적응 방법에 의해 생산된 독감 균주로서 구 소련에서는 수년간 두 종류의 저온적응된 약독화 균주를 사용하여 왔다. 그 한가지는 A/Leningrad/134/17/57 (H2N2)균주로서 25℃에서 17번 계대배양하여 얻은 것으로 이 바이러스의 PA, NP, M 단백질에 온도 감수성 관련 변이가 있음이 알려졌다(J. Gen. Virol.53, 215, 1981). 다른 한 가지 균주는 A/Leningrad/134/47/57 (H2N2)균주로 25℃에서 47번 계대배양하여 얻은 것으로 PB2, PA, NP, M, NS 단백질 등에 온도 감수성 관련 변이가 있음이 확인되었다(Infect Immun.44, 730, 1984). 이 균주는 A/Leningrad/134/17/57 균주가 어린 아이에게 약간의 부작용이 있는 문제점을 해결하기 위하여 25℃에서 더 많이 계대배양하여 독성을 더욱 감소시킨 것이다. 그러나 면역원성은 A/Leningrad/134/17/57 균주에 비해 떨어지는 것으로 알려져 있다.
그리고 아직 시판되고 있지는 않지만 생백신 후보로 유력한 것은 A/Ann Arbor/6/60(H2N2) 저온 적응 바이러스이다(Nature 213, 612, 1967). 저온 적응시킨 A/Ann Arbor/6/60 균주는 33℃, 30℃ 그리고 25℃ 등에서 단계적으로 닭의 신장 세포(primary chick kidney cell)와 수정란에서 계대배양하여 얻은 것이다. 이 균주는 야생형 바이러스는 복제가 되는 38-39℃에서 복제가 저해되는 온도 감수성 표현형을 가지고, 25℃에서 복제가 잘되는 저온 적응성을 지니며, 동물의 호흡기 상부 또는 하부에서는 복제가 억제되는 독성감소 표현형을 가지는 특성을 지니고 있다(Rev. Infect. Dis.2, 421, 1980;Arch. Virol. 64, 171, 1980). 이 바이러스의 게놈 분석 결과 8개의 모든 게놈 유전자에서 돌연변이가 발견되었다(Virology 167, 554-567, 1988).
상기 A/Ann Arbor/6/60 바이러스를 모균주로 하여 H1N1 또는 H3N2 형의 독감 바이러스와의 재조합 바이러스를 만들어 사람에서 사용한 결과 그 재조합 바이러스는 사람에 감염될 수 있으며 약독화된 특성을 유지하고 있고 면역원성이 존재하고 특히 IgA 의 유발을 촉진시켰으며 유전적으로 안정된 특성을 보였으나 전염성은 거의 없는 것으로 나타났다.
저온적응에 의한 바이러스 균주를 생백신으로서 현재 사용되고 있는 사백신과 비교하면 다음과 같은 장점을 가지고 있다.
첫째, 사백신의 불활성화 과정에서 발생하는 바이러스 항원 단백질의 변성으로 면역원성이 감소되는 것을 막을 수 있고,
둘째, 이종단백질의 매년 지속적인 체내투여로 인한 과민반응을 막을 수 있고,
셋째, 분비 항체인 IgA 의 생성이 유도되어 감염예방에 필요한 면역효과를 증진시키고,
넷째, 주사제가 아닌 비강 스프레이 투여로 쉽게 접종할 수 있어 거부감을 줄이고 특히 어린아이의 백신투여에 효과적이며,
다섯째, 생백신 균주를 투여시에 야생형 바이러스의 생육을 저지하는 능력이 있어 치료 효과를 기대할 수도 있다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 장점을 갖으며 보다 안정하고 생산성이 높은 저온적응에 의한 독감 생백신용 균주를 개발하기 위하여 연구하던 중, 수정란에서 생육이 활발한 A/X-31 바이러스 등을 24℃의 저온에서 계대배양하여 저온 적응된 독감 바이러스를 얻고 이를 야생형 독감 바이러스와 동일한 숙주세포에 동시감염시켜 재조합 독감 바이러스를 얻어 이들의 성장능력이 우수하고 독성이 크게 감소된 것을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 독감 바이러스의 감염에 의한 질병을 효과적으로 예방할 수 있는 독성이 감소되고 유전적 안정성이 보장되며 생산성이 향상된 독감 생백신용 저온적응 독감 바이러스를 제공하는데 그 목적이 있다.
도 1은 생쥐에서 독감 바이러스 A/X-31 와 저온적응 독감 바이러스 HTCA-A101(107pfu/ml) 50μl를 비강에 감염시켰을 때의 독성을 비교한 것이고,
△ : PBS 대조군 ; □ : A/X-31 바이러스 감염 ;
○ : HTCA-A101 바이러스 감염 ;
도 2a는 생쥐에서 야생형 A/PR/8/34 바이러스를 농도를 달리하여 비강에 감염시켰을 때 시간에 따른 살아남은 생쥐의 평균체중 변화를 나타낸 것이고,
△ : PBS 대조군 ; □ : 104pfu 바이러스 감염 ;
○ : 105pfu 바이러스 감염 ; ▲ : 106pfu 바이러스 감염 ;
■ : 107pfu 바이러스 감염 ; ● : 108pfu 바이러스 감염 ;
도 2b는 생쥐에서 야생형 A/PR/8/34 바이러스를 농도를 달리하여 비강에 감염시켰을 때 시간에 따른 사망하는 생쥐의 수를 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 독감에 대한 백신으로 사용될 수 있는 신규한 저온적응 독감 바이러스를 제공한다.
구체적으로 본 발명은 수정란에서 생육이 왕성한 독감 바이러스를 24℃의 저온에서 수회 계대배양하여 얻은 수정란에서의 우수한 성장 능력과 생체 독성의 현저한 감소를 보이는 저온적응 독감 바이러스를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 저온적응 바이러스의 cDNA 유전자를 제공한다.
또한 본 발명은 수정란에서 생육이 활발한 독감 바이러스를 수정란에 주입시키고 저온에서 수일 배양한 다음 수정란의 요액에서 바이러스를 회수하고 이를 다시 수정란에 주입시키는 방식으로 계대배양하여 바이러스를 얻는 상기 저온적응 독감 바이러스의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 저온적응 바이러스를 야생형 독감 바이러스와 수정란에 동시감염시켜 얻은 재조합 독감 바이러스를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 저온적응 독감 바이러스와 이를 이용하여 얻은 재조합 독감 바이러스를 독감 생백신(live vaccine)으로 사용하는 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Ⅰ. 저온적응 독감 바이러스의 제조.
본 발명은 수정란에서 생육이 활발한 독감 바이러스 모균주로 하여 저온에서 수회 계대배양하여 저온적응 독감 바이러스를 얻는다.
본 발명에서는 생산성이 좋은 저온적응 독감 바이러스를 얻기 위하여, A형 독감 바이러스 모균주로, 지속적으로 수정란에서 적응시킨 일종의 숙주 변이주로서 사람에서 독성이 감소되고 수정란에서 생육이 월등히 좋은 A/X-31 바이러스를 이용한다. 그리고 B형 독감 바이러스 모균주로는 B/Yamagata/16/88 바이러스와 B/Lee/40 바이러스를 이용한다.
일반적으로 저온 계대배양을 하면 독성은 감소되나 생육이 저하되는 현상이 나타나므로 이러한 문제를 해결하기 위하여 수정란에서 생육이 뛰어난 바이러스를 모균주로 하여 저온에서 계대배양하면 독성은 더욱 감소되고 생산성이 우수한 바이러스 균주가 분리된다.
본 발명은 수정란에서 생육이 활발한 독감 바이러스를 수정란에 주입하고 저온에서 수일 배양한 다음 수정란의 요액에서 바이러스를 회수하고 이를 다시 수정란에 주입시키는 방식으로 계대배양하여 저온적응 독감 바이러스를 얻는다. 이 때 요액에서 회수한 바이러스를 너무 많은 양으로 수정란에 감염시키게 되면 결손형 방해 입자(defective interfering particle)가 생성되어 바이러스의 생육이 저하될 수 있으므로 가능한 최소한의 양을 사용한다.
상기와 같은 방식으로 저온 계대배양을 계속해가는 동안 모균주의 유전자에 저온적응(cold adaptation)에 필요한 돌연변이가 계속 축적되어지며 이렇게 얻어진 저온적응 바이러스는 저온적응 이전의 모균주에 비하여 30℃ 이하의 저온에서 좋은 생장력을 보이는 반면 인체 온도인 약 37℃에서는 거의 생장하지 않는다. 따라서 이러한 저온적응 바이러스는 감염되면 면역성은 유도될 수 있으나 37℃의 체온에서는 생장하지 않기 때문에 병원성이 매우 감소되어 약독화된 백신으로서의 사용이 적합하다.
구체적으로, 본 발명에서는 A/X-31 바이러스를 수정란에 주입하고 30℃에서 19번, 27℃에서 40번 그리고 24℃에서 33번 계대배양하여 A형 저온적응 독감 바이러스를 얻어 이를 HTCA-A101 이라 명명하고 1997년 11월 11일자로 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호:KCTC 0400 BP).
또한 본 발명에서는 B/Yamagata/16/88 바이러스를 수정란에 주입하고 30℃에서 8번, 27℃에서 11번 그리고 24℃에서 21번 계대배양하여 B형 저온적응 독감 바이러스를 얻어 이를 HTCA-B102 이라 명명하고 1997년 11월 11일자로 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호:KCTC 0401 BP).
또한 본 발명에서는 B/Lee/40 바이러스를 수정란에 주입하고 30℃에서 7번, 27℃에서 36번 그리고 24℃에서 32번 계대배양하여 B형 저온적응 독감 바이러스를 얻어 이를 HTCA-B104 이라 명명하고 1997년 11월 11일자로 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호:KCTC 0402 BP).
상기와 같은 방법으로 얻은 저온적응 바이러스 유전자의 변이여부를 확인하기 위하여, 저온적응 독감 바이러스를 MDCK(Madin Darby Canine Kidney) 세포주에 배양하여 RNA를 분리한 다음 이를 주형으로 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse-transcription polymerase chain reaction; 이하 ″RT-PCR″ 라 약칭함)을 수행하여 cDNA를 합성한다.
구체적으로 본 발명에서는 HTCA-A101 바이러스 RNA의 PB2, PB1, PA, NP, M, NS 단백질 유전자 내부에서 시발체를 고안하여 RT-PCR을 수행함으로서 각 유전자의 cDNA를 분리한다. 중합효소를 암호하는 PB2, PB1, PA 단백질의 cDNA 유전자는 각각 서열 1, 2, 3 의 염기서열을 가지고, 뉴클레오프로테인(nucleoprotein)을 암호하는 NP 단백질 cDNA 는 서열 4의 염기서열을, M, NS 단백질 cDNA 유전자는 서열 5, 6의 염기서열을 가진다. 독감 바이러스의 8개의 게놈은 원래 1부터 8까지 고유번호가 있으나 상기 서열번호는 본 발명에서 하기 서열목록에 나타난 순서에 따라 편의상 붙여진 것이다.
본 발명에서 제조한 저온적응 바이러스의 유전적 안정성을 확인하기 위하여, 상기 HTCA-A101 바이러스 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추한 아미노산 서열을 모균주인 A/X-31 바이러스, A/X-31 바이러스의 모균주인 A/PR/8/34 바이러스 그리고 진뱅크(Genbank)에 등록된 타 독감 바이러스와 비교분석한다. 그 결과 본 발명의 HTCA-A101 바이러스는 저온적응과 관련된 새로운 유전자 변이가 발생한 기존의 백신 바이러스와는 다른 신규한 균주로 밝혀졌다.
Ⅱ. 저온적응 독감 바이러스의 특성 시험.
본 발명에서 제조한 저온적응 독감 바이러스가 약독화된 균주임을 확인하기 위하여, MDCK 세포에서 온도를 달리하며 배양하면서 플라그 형성능을 조사한다. 그 결과 본 발명의 독감 바이러스는 저온적응 형질(cold adaptive phenotype)과 온도 민감성 형질(temperature sensitive phenotype)을 갖는다는 것을 확인하였다.
또한 본 발명에서 제조한 저온적응 바이러스의 약독화 정도를 확인하기 위하여, 실험동물인 쥐의 비강에 본 발명의 바이러스를 감염시킨 뒤 시간의 경과에 따른 쥐의 치사율과 체중 변화를 조사한다. 그 결과 본 발명의 독감 바이러스는 독성이 크게 감소되어 독감 생백신으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한 본 발명에서 제조한 저온적응 독감 바이러스의 생장능력을 알아보기 위하여, 수정란에 바이러스를 감염시키고 온도를 달리하며 배양한다. 그 결과 본 발명의 독감 바이러스는 저온에서 그 생장이 뛰어난 것으로 나타나 독감 백신을 생산할 때에 생산단가를 낮출 수 있으므로 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.
Ⅲ. 재조합 독감 바이러스의 제조.
또한 본 발명은 상기 저온적응 바이러스를 야생형 독감 바이러스와 수정란에 동시 감염시켜 얻은 재조합 독감 바이러스를 제공한다.
상기 저온적응 바이러스와 병원성 바이러스 사이의 재조합 바이러스는 각각의 바이러스를 고등세포주에 동시에 감염시킨 후 충분한 시간 동안 생장시키면 그동안 서로의 바이러스 유전자를 교환하여 수종의 재조합 바이러스들이 만들어지게 된다. 이러한 수종의 재조합 바이러스들로부터 저온적응 균주에 대한 항체를 사용하여 저온적응 재조합 바이러스를 선별하게 되는데 그 과정은 고등세포주에 병원성 바이러스와 저온적응 균주를 동시 감염시켜 얻은 바이러스액을 상기 저온적응 균주에 대한 항체가 함유된 배지에서 배양하여 선별하고 이를 다시 플라그 저해 분석(plaque inhibition assay)으로 재조합 바이러스인지 여부를 확인한다.
구체적으로 본 발명은 HTCA-A101 저온적응 바이러스를 H1N1, H3N2형의 맹독성바이러스와 수정란에 동시감염시키고 배양하여 플라그 저해 분석으로 재조합된 독감 바이러스를 선별한다.
Ⅳ. 재조합 독감 바이러스의 특성 시험.
상기 재조합 독감 바이러스의 특성을 알아보기 위하여, MDCK 세포와 수정란에서 온도를 달리하며 배양한 결과 저온 적응성이나 온도 민감성을 유지하고 있는 독성이 감소된 균주임이 확인되었다.
또한 상기 재조합 독감 바이러스의 약독화 정도를 확인하기 위하여, 실험동물인 쥐와 토끼의 비강에 본 발명의 재조합 바이러스를 감염시킨 뒤 시간의 경과에 따른 동물의 상태 변화를 조사한다. 그 결과 본 발명의 재조합 독감 바이러스는 독성이 크게 감소된 균주임이 밝혀졌고 독감 생백신으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
〈실시예 1〉 A형 저온적응 독감 바이러스 HTCA-A101 의 제조
스파파스사(SPAFAS사, 미국)에서 구입한 수정란을 37℃ 배양기에서 10일간 배양한 뒤 부화된 계란을 검란하여 배(embryo)의 성장이 좋은 것만 선택하여 바이러스 감염(virus infection)에 사용하였다.
우선 주사할 부위를 70% 알콜로 닦아낸 다음 펀치(punch)로 살짝 계란 외피에 구멍을 내고 여기에 적절히 인산완충용액(PBS)으로 희석된 A/X-31 바이러스를 1ml 주사기로 약 0.1ml을 주입하였다. 이때 주입되는 바이러스 양은 0.01~0.001HAU 정도이다.
바이러스를 주입한 다음 촛농으로 주입구를 봉하여 30℃, 27℃ 또는 24℃로 저온 조절된 항온기로 옮겨 배양한다. 3일 또는 4일간의 배양 후 계란을 4℃에서 5시간 이상 처리하여 배(embryo)를 불활성화시켰다. 불활성화시킨 계란의 공기 주머니(air sac) 부위를 가위로 오려낸 후 요액(allantoic fluid)을 취해 HA 분석법(Haemagglutination assay)을 통해 바이러스의 양을 측정하고 이를 0.2μm 주사기 필터로 거른 후 적당히 PBS로 희석하여 새로운 계란에 주입하는 방법으로 30℃에서 19번 계대배양하고 이를 27℃에서 40번 계대배양한 후 24℃에서 33번 계대 배양하였다.
상기의 과정으로 얻어진 A형 저온적응 독감 바이러스를 HTCA-A101이라 명명하고 이를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1997년 11월 11일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 0400 BP).
〈실시예 2〉 B형 저온적응 독감 바이러스 HTCA-B102 의 제조
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였으며 B형 독감 바이러스로는 B/Yamagata/16/88 바이러스를 사용하였고 30℃에서 8번, 27℃에서 11번, 그리고 24℃에서 21번 계대배양하여 B형 저온적응 독감 바이러스를 얻었다.
상기 저온적응 바이러스를 HTCA-B102 라고 명명하고 이를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1997년 11월 11일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 0401 BP).
〈실시예 3〉 B형 저온적응 독감 바이러스 HTCA-B104 의 제조
실시예 1에서와 동일한 방법으로 수행하였으며, B형 바이러스로 B/Lee/40 바이러스를 사용하고 30℃에서 7번, 27℃에서 36번, 그리고 24℃에서 32번 계대 배양하여 얻어진 저온적응 바이러스를 HTCA-B104 라고 명명하고 이를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1997년 11월 11일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 0402 BP).
〈실시예 4〉 저온적응 독감 바이러스 HTCA-A101 유전자의 클로닝.
HTCA-A101 이 저온적응 과정을 거치면서 축적되었을 변이를 분자적 수준에서 고찰하기 위해 각 유전자의 염기 서열을 결정하여 비교하였다.
또한 독감 바이러스의 복제 기작의 특성상 비특이적인 염기 서열 치환이 빈번히 발생함을 고려할 때 저온 적응 과정에 의한 변이임을 밝히기 위해서, 모균주인 A/X-31 바이러스와 HTCA-A101의 염기 서열을 동시에 결정하여 비교하였다.
A/X-31 바이러스와 HTCA-A101 바이러스의 유전자의 클로닝은 다음과 같은 방법으로 실행하였다. 우선 개의 신장으로부터 유래된 MDCK 세포 단일층에 상기 두 종류의 바이러스를 5 m.o.i.로 감염시킨 뒤, HTCA-A101 바이러스는 30℃에서, X-31 바이러스는 37℃에서 6시간 동안 배양한 후, 세포 분획을 취해 퀴아젠(QIAGEN)사의 알엔이지 토탈 RNA 키트(RNeasy Total RNA Kit)를 사용하여 RNA를 분리하였다. 각 PB2, PB1, PA 단백질 유전자의 경우 각각의 유전자 내부에서 시발체(primer)를 고안하여 PCR을 수행하여 독감 바이러스 전체 유전자를 포함하는 PCR 반응물(product)을 얻었다.
생성된 RNA의 농도를 260nm에서의 흡광도에 근거하여 결정한 다음, PB2, PB1, PA 단백질 유전자의 경우 5μg 을, 나머지 NP, M, NS 단백질 유전자의 경우 2μg 의 RNA를 주형으로 하여 집코(GIBCO)사의 슈퍼스크립트 전증폭 시스템 (Superscript Preamplification System)을 사용하여 RT-PCR 을 수행하였다. RT-PCR에 사용한 시발체(primer) 서열은 하기 표 1에 나타나 있다.
RT-PCR에 사용한 시발체 서열
시발체 염기서열
PB2+ 5' CCGGATCCGACGCAGCAGAGCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAATATG 3'
PB2- 5' CCGGATCCTAATACGACTCACTATAAGTAGAAACAAGGTCGTTTTTAAACTATTCGACA 3'
PB2I+ 5' ATCAGCGACTGAATCCTATG 3'
PB2I- 5' GCATAGGATTCAGTCGCTGAT 3'
PB2S+ 5' AGCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAATATG 3'
PB2S- 5' AGTAGAAACAAGGTCGTTTTTAAACTATTC 3'
PB1F+ 5' AAGCTTGAAGCTTGAATGCGAGCGAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGATGTC 3'
PB1F- 5' TTCATGATTGGGTGCGTTCACAATCAGAGCA 3'
PB1L+ 5' TGCTCTGATTGTGAACGCACCCAATCATGAA 3'
PB1L- 5' AAGCTTGAAGCTTAATACGACTCACTATAAGTAGGAACAAGGCATTTTTTCATGAAGGACAAG 3'
PB1S+ 5' AGCGAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGAT 3'
PB1S- 5' AGTAGGAACAAGGCATTTTTTCATGAAGGA 3'
PA+ 5' CCGAATTCGAATGCGAGCGAAAGCAGGTACTGATCCAAAATGGAAGAT 3'
PA- 5' CCGAATTCTAATACGACTCACTATAAGTAGAAACAAGGTACTTTTTTGGACAGTATGGA 3'
PAI+ 5' GCAGAACTGCAGGACATTGA 3'
PAI- 5' TCAATGTCCTGCAGTTCT 3'
PAS+ 5' AGCGAAAGCAGGTACTGATCCAAAATGGAA 3'
PAS- 5' AGTAGAAACAAGGTACTTTTTTGGACAGTA 3'
NP+ 5' CCGAATTCCTCTTCGAGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTCACTGAGT 3'
NP- 5' CCGAATTCTAATACGACTCACTATAAGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTAATTGTCGT 3'
Mat+ 5' CCGAATTCTCTTCGAGCGAAAGCAGGTAGATATTGAAAGATGAGTCT 3'
Mat- 5' CCGAATTCTAATACGACTCACTATAAGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTA 3'
NS+ 5' CCGAATTCGAATGCGAGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACATAATGGATC 3'
NS- 5' CCGAATTCTAATACGACTCACTATAAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTATTATTAAATAA 3'
상기의 과정으로 증폭된 PCR 생성물은 퀴아젠사의 퀴아퀵 PCR 정제 키트(Qiaquick PCR Purification Kit)를 사용하여 정제한 다음, 엔이비(NEB)사의 T4 폴리뉴클레오타이드 카이네이즈(polynucleotide kinase)로 인산화시켜 1% 아가로즈 겔(agarose gel)상에서 전기 영동을 실시하였다. 아가로즈 겔상에서 원하는 크기에 해당하는 부분을 분리하여 제노메드(GENOMED)사의 젯소르브 겔 추출 키트(JetSorb Gel Extraction Kit)를 사용하여 정제하였다. 상기와 같은 방법으로 구축된 각 유전자는 염기 서열 결정에 필요한 주형으로 사용되었다.
클로닝에 사용할 벡터를 제조하기 위해 pUC18 플라스미드를 엔이비(NEB)사의HincⅡ 제한 효소로 절단한 후, 1% 아가로즈 겔상에서 전기 영동법으로 분리하고, 제노메드(GENOMED)사의 젯소르브 겔 추출 키트로 정제하여 상기에서 분리한 유전자와 연결시킨 다음 대장균을 형질전환시켜 바이러스 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 제작하였다.
염기 서열 결정은 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystem)사의 자동 서열 결정기를 이용하였고, 시발체도 동일 회사의 DNA/RNA 합성기로 제조하여 사용하였다.
시발체의 서열은 보고된 A/PR/8/34 의 유전자 염기 서열로부터 매 300 뉴클레오타이드(nucleotide) 간격으로 고안되었으며 하기 표 2에 나타내었다.
염기서열 결정을 위한 시발체
유전자 위치 염기서열
PB1 +578 TTCAGAGAAAGAGACGGG
PB1 +880 GTAAGGAAGATGATGACC
PB1 +1200 CCGACCGATCTTAATAGA
PB1 -1786 CAGCTTTGGAACGGGTTT
PB1 -2035 TTCTTTTGGGGATCCAGG
PB1 +2018 CCTGGATCCCCAAAAGAA
PB1 -2290 GCCGTCTGAGCTCTTCAA
PB2 +569 CGCAACTAACACAGCACA
PB2 +871 GAGATGTGCCACAGCACA
PB2 +1174 CAGCTGATAGTGAGTGGG
PA +560 GACAAGAAATGGCCAGCA
PA +871 CTGCTGATGGATGCCTTA
PA -1464 GAAATCATCCATTGCTGC
NP +279 CCTTGAAGAACATCCCAG
NP -330 AGGTCCTCCAGTTTTCTT
NP +585 TGCTGCAGTCAAAGGAGT
NS +275 TGTACCTGCGTCGCGTTA
NS +574 GGGGACTTGAATGGAATG
PB1 +271 GCCCAAACAGATTGTGT
PB1 -329 ATACCAGGATGGGATTCC
PB2 +271 AATGATGCCGGATCAGAC
PB2 -330 CCTATTCCACCATGTCAC
PB2 -1778 GGCCTTAGGTAGTAAAG
PB2 -2083 CTCCAGCTGTGCCTTCAT
PB2 +2066 ATGAAGGCACAGCTGGAG
PA +270 AGATCGCACAATGGCCTG
PA -330 TTTCTCAGCCCCTGTAGT
PA +1447 GCAGCAATGGATGATTTC
유전자 위치 염기서열
PA +1773 TTGTCTCCTCCAGTCACT
PA +2019 GCTTCTTATCGTTCAGGC
NP +871 CTGCCTGCCTGTGTGTAT
NP -1358 GATGTTCTCCCCTCTGT
M +270 ATGCCCTTAATGGGAACG
M -341 CCCTCTTGAGCTTCCTAT
M +572 AGCACTACAGCTAAGGCT
M -898 CCTCCTTTCAGTCCGTAT
3'과 5' 말단부의 15~20 개 정도의 염기 서열은 PCR에 사용한 시발체의 서열로 대치되었고, 모호한 서열의 경우는 다른 부분, 특히 상보적 가닥(complementary strand)에 대한 시발체를 사용함으로써 해결하였다. 각 유전자의 결정된 염기 서열은 서열목록에 나타내었다.
〈실시예 5〉 저온적응 독감 바이러스 HTCA-A101의 염기 서열 및 아미노산 서열 분석.
실시예 4 에서 결정한 HTCA-A101 바이러스 유전자의 염기 서열은 파스타 프로그램(FASTA program,PNAS 85, 2444-2448, 1988)을 이용하여 A/X-31 바이러스의 염기 서열과 비교함으로써 치환된 부분을 확인하였다. 아미노산 서열을 비교하기 위해서, 디엔에이시스 프로그램(DNASIS program)을 이용하여 염기 서열로부터 아미노산 서열을 유추하였다.
구체적으로, A/X-31 바이러스는 A/PR/8/34로부터 6개의 내부 유전자와 A/HK/68으로부터 표면 유전자인 HA와 NA를 물려받은 재조합 바이러스로서, 오랜 동안 수정란에 적응되었기 때문에 그 자체로서 많은 변이가 축적되어 결과적으로는 인간에 대한 병원성을 상실했다고 보여지는 바이러스이므로, 수정란에 적응됨으로써 축적되었을 염기와 아미노산 변이를 추적하기 위하여 최초의 모균주인 A/PR/8/34의 유전자를 A/X-31 바이러스 유전자와 비교하였다(표 3a, 표 4a, 표 5a, 표 6a, 표 7a, 표 8a).
또한 저온 적응 과정에서 HTCA-A101 바이러스에 발생되었으리라 추정되는 변이를 A/X-31 바이러스와 비교하고또한 클러스탈 V 프로그램(clustal V program;Gene 73, 237-244, 1988)으로 진뱅크 데이타베이스(Genbank Database)에 등록되어 있는 타 독감 바이러스(표 3b, 표 4b, 표 5b, 표 6b, 표 7b, 표 8b)의 아미노산 서열과 비교하였다(표 3c, 표 4c, 표 5c, 표 6c, 표 7c).
먼저 A/PR/8/34 바이러스와 A/X-31바이러스 유전자의 염기 서열을 비교해 보면, 총 71개의 변이가 관찰되었는데 이중에서 24개만이 아미노산 치환으로 나타났고, 치환된 아미노산을 진뱅크의 타 독감 바이러스들과 비교한 결과, 9개가 독특하거나 희귀한 변이(PB2에 2개, PB1에 2개, PA에 1개, M1에 2개, M2에 2개)인 것으로 판명되었다. 비록 현재까지 숙주 특이성이나 약독화에 관여한다고 보고된 변이와 일치하는 경우는 없었으나 표현 형질과 관계된 유전자 변이에 대한 연구 자료가 제한적임을 고려하면 각각의 경우 약독화 또는 수정란에서의 우수한 생장능력에 관여할 것으로 생각된다.
다음으로 A/X-31 바이러스를 HTCA-A101 바이러스로 저온적응시켰을 때 축적된 변이를 살펴보면 총 30개의 염기 변이가 관찰되었는데 이중에서 16개가 아미노산 치환으로 나타났다. 이 경우를 진뱅크의 타 바이러스들과 비교한 결과 독특하거나 희귀한 아미노산으로의 변이가 9개(PB2에 2개, PB1에 2개, NP에 2개, M1에 2개, M2에 1개), 숙주 특이성과 관련한 변이가 1개(M1), 약독화에 관여하는 변이가 1개(M2)씩 차지하였다. 따라서 이미 알려진 기존의 저온적응 바이러스와는 매우 다른 유전자 변이를 통하여 약독화되었음을 알 수 있었다.
각 유전자별로 저온적응 과정에서 발생한 염기 및 아미노산 치환의 의미를 고찰해 보았다.
(5-1) PB2 단백질 유전자에 대한 고찰.
A/X-31바이러스 PB2 단백질 유전자의 A/PR/8/34 바이러스와의 비교
유전자 염기번호 염기 변이 아미노산번호 아미노산 변이 단백질명 타균주
PB2(2341nt)759 a.a 49 A -〉C - - PB2
342 G -〉A 105 M -〉I PB2 Met,Thr,Val,Ala
779 A -〉G 251 K -〉R PB2 Arg,Lys
852 C -〉T - - PB2
923 A -〉G 299 K -〉R PB2 Arg,Lys
930 G -〉T - - PB2
953 T -〉A 309 G -〉D PB2 Glu,Asp,Gly
1269 G -〉C - - PB2
1527 C -〉T - - PB2
1530 G -〉T - - PB2
1537 G -〉A 504 V -〉I PB2 Val
1815 G -〉A - - PB2
2001 C -〉T - - PB2
2055 C -〉T - - PB2
2132 G -〉A 702 R -〉K PB2 Arg,Lys
2149 T -〉C - - PB2
2238 A -〉G - - PB2
PB2 단백질의 아미노산 서열을 비교하기 위해 추출한 진뱅크 데이타베이스(Genbank Database)에 등록되어 있는 타 독감 바이러스
균주 등록 번호 저자명
A/Ann Arbor/6/60(H2N2) M23970 J04349M23971 Cox＆ Maassab et al ., 1988
A/budgerrigar/Hokkaido/1/77(H4N7) m73523 M36046 Gorman＆ Webster et al., 1990
A/Dunedin/4/73 M74899 Herlocher ＆ Maassab 1991
A/equine/Kentucky/2/86(H3N8) M73526 M36049 Gorman＆ Webster et al., 1990
A/equine/London/1416/73(H7N7) M73520 M36043 Gorman＆ Webster et al., 1990
A/equine/Prague/1/56(H7N7) M73519 M36042 Gorman＆ Webster et al., 1990
A/FPV/Weybridge M38291 Petrov ＆ Golovin et al., 1988
A/gull/Astrakhan/227/84(H13N6) M73516 M36039 Gorman＆ Webster et al., 1990
A/gull/Maryland/704/77(H13N6) M73525 M36048 Gorman＆ Webster et al., 1990
A/Kiev/59/79(H1N1) M38277 Petrov ＆ Golovin et al., 1988
A/Korea/426/68(H2N2) M73524 M36047 Gorman＆ Webster et al., 1990
A/Leningrad/134/17/57(H2N2) M81581 Klimov ＆ Kendal et., 1992
A/Leningrad/134/47/57(H2N2) M81587 Klimov ＆ Kendal et., 1992
A/Leningrad/134/57(H2N2) M81575 Klimov ＆ Kendal et., 1992
A/Los Angeles/2/87(H3N2) U62543 Parkin et al., 1996
A/Memphis/8/88(H3N2) M73517 M36040 Gorman＆ Webster et al., 1990
A/PR/8/34(H1N1) J02153 Winter ＆ Fields et al., 1990
A/ruddyturnstone/NewJersey(H4N6) M73518 M36041 Gorman＆ Webster et al., 1990
A/seal/Massachusetts/133/82(H4N5) M73522 M36045 Gorman＆ Webster et al., 1990
A/Singapore/1/57(H2N2) M73521 M36044 Gorman＆ Webster et al., 1990
A/swine/1976/31(H1N1) M55470 Schultz ＆ Scholtissek et
A/swine/1976/31(H1N1) M55469 Schultz ＆ Scholtissek et
A/swine/Germany/2/81(H1N1) M55471 Schultz ＆ Scholtissek et
A/swine/Iowa/15/30(H1N1) M73515 M36038 Gorman＆ Webster et al., 1990
A/swine/Tennessee/24/27(H1N1) M75515 M36036 Gorman＆ Webster et al., 1990
A/turkey/Minnesota/833/80(H4N2) M73514 M36037 Gorman＆ Webster et al., 1990
HTCA-A101 바이러스 PB2 단백질 유전자의 A/X-31바이러스와의 비교
유전자 염기번호 염기 변이 아미노산번호 아미노산 변이 단백질명 타균주
PB2(2341nt)759 a.a 300 A -〉T 91 -
357 T -〉G 110 H -〉Q PB2 His
930 T -〉C 301 -
1068 C -〉A 347 -
1309 C -〉T 428 -
1790 T -〉G 588 I -〉S PB2 Ala,lle,Thr,Val
2311 C -〉T -
PB2단백질은 중합 효소 복합체의 일부로서, 숙주 mRNA의 5'-캡(cap)을 특이적으로 인지하여 결합한 후(PANS 78, 7355-7359, 1981;NAR 10, 4803-4812, 1982), 제한효소에 의한 절단(endonucleolytic cleavage)에 의하여 잘려진 짧은(short) RNA가 mRNA의 시발체로 작용할 수 있도록 한다고 알려져 있다(J. Virol.69, 3995-3999, 1995;J. Gen. Virol.76, 603, 1995).
상기 표 3 a, b 및 c를 살펴보면, 총 7개의 염기 치환 중에서 2개만이 아미노산 치환으로 나타났는데 110번 아미노산의 경우 진뱅크의 타 바이러스들이 모두 히스티딘(His)을 갖는데 반해 독특한 아미노산인 글루타민(Gln)으로 치환된 것이 특이하다. 588번 아미노산의 경우 이소루신(Ile)에서 다른 성격의 세린(Ser)으로 치환되었는데 인간에 감염하는 대부분의 경우가 이소루신이고 돼지류와 조류의 경우는 알라닌(Ala), 그리고 말의 경우는 트레오닌(Thr)으로 관찰되어 말의 경우와 유사한 성질을 갖는 것으로 보여진다. 비록 현재까지 보고된 바는 없지만 위와 같은 비교를 통해 PB2 의 588번 아미노산이 숙주 특이성에 관여하리란 가능성을 갖는다.
(5-2) PB1 단백질에 대한 고찰.
A/X-31바이러스 PB1 단백질 유전자의 A/PR/8/34 바이러스와의 비교
유전자 염기번호 염기 변이 아미노산번호 아미노산 변이 단백질명 타균주
PB1(2341nt)757 a.a 99 C -〉T - - PB1
182 C -〉G 53 A -〉G PB1 Gly,Ala
294 A -〉G - - PB1
296 C -〉T 91 A -〉V PB1 Ala
297 A -〉G - - PB1
421 T -〉C - - PB1
435 G -〉A - - PB1
549 A -〉C 175 K -〉M PB1 Asp,Asn.Glu,Lys
639 A -〉G 205 I -〉M PB1 lle
647 G -〉A 208 R -〉K PB1 Lys,Arg
651 A -〉G - - PB1
924 G -〉C 300 L -〉F PB1 Phe,Leu
1152 T -〉C - - PB1
1269 A -〉G - - PB1
1380 T -〉C - - PB1
1442 A -〉T 473 H -〉L PB1 Val,Leu,His
1563 T -〉G - - PB1
1574 G -〉T 517 S -〉I PB1 lle,Ser
2075 A -〉G 684 E -〉G PB1 Glu
2076 A -〉G - - PB1
PB1 단백질의 아미노산 서열을 비교하기 위해 추출한 타 독감 바이러스
균주 등록 번호 저자명
A/Ann Arbor/6/60(H2N2) M23972 J04349M23973 Cox＆ Maassab 1988
A/Bijing/11/56(H1N1) M25932 Kawaoka ＆ Webster et al., 1989
A/chicken/FPV/Rostock/34 M21851 Roditi ＆ Robertson 1984
A/Dunedin/4/73 M74899 Herlocher ＆ Maassab et al., 1991
A/equine/London/1416/73(H7N7) M25928 Kawaoka ＆ Webster et al., 1989
A/equine/Tennessee/5/86(H3N8) M25929 Kawaoka ＆ Webster et al., 1989
A/gull/Maryland/704/77(H13N6) M25933 Kawaoka ＆ Webster et al., 1989
A/Kiev/59/79 M38376 Petrov ＆ Vasilenko et al., 1987
A/Korea/426/68(H2N2) M25935 Kawaoka ＆ Webster et al., 1989
A/Leningrad/134/17/57(H2N2) M81580 Klimov ＆Kendal et al., al 1992
A/Leningrad/134/47/57(H2N2) M81586 Klimov ＆Kendal et al., al 1992
A/Leningrad/134/57(H2N2) M81574 Klimov ＆Kendal et al., al 1992
A/mallard/New York/6750/78(H2N2) M25926 Kawaoka ＆ Webster et al., 1989
A/Memphis/8/88(H3N2) M25936 Kawaoka ＆ Webster et al., 1989
A/PR/8/34(H1N1) J022151 Winter ＆ Fields 1982
A/Singapore/1/57(H2N2) M25924 Kawaoka ＆ Webster et al., 1989
A/swine/1976/31 M55472 Schultz ＆ Scholtissik et
A/swine/Hong Kong/126/82(H3N2) M25927 Kawaoka ＆ Webster et al., 1989
A/swine/Ontario/2/81 M25930 Kawaoka ＆ Webster et al., 1989
A/swine/Tennessee/26/77(H1N1) M25931 Kawaoka ＆ Webster et al., 1989
A/turkey/Minnesota/833/80(H4N2) M25925 Kawaoka ＆ Webster et al., 1989
A/Wisconsin/3523/88(H1N1) M25934 Kawaoka ＆ Webster et al., 1989
HTCA-A101 바이러스 PB1 단백질 유전자의 A/X-31바이러스와의 비교
유전자 염기번호 염기 변이 아미노산번호 아미노산 변이 단백질명 타균주
PB1(2341nt)757 a.a 296 T -〉C 91 V -〉A PB1 Ala
385 A -〉G 121 K -〉E PB1 Lys,Arg
742 G -〉A 240 A -〉T PB1 Ala,Lys
1299 T -〉C 425 -
1380 C -〉T 452 -
2075 G -〉a 684 G -〉E PB1 Glu
2184 C -〉T 720 -
PB1 또한 중합 효소 복합체의 일부로서 전사 과정에서 RNA 사슬 합성의 시작과 진행을 담당한다고 알려져 있다(Cell 34, 609, 1983;J. Virol.70, 6390-6394, 1996). 아미노산이 치환된 4 경우중 V91A와 G684E의 경우 A/X-31 바이러스에서 발생한 변이가 다시 본래 A/PR/8/34의 경우로 되돌아 감에 따라 위의 변이들과 저온 적응성과 온도 민감성 형질 사이의 관계성은 미약한 것으로 생각된다. 그러나, 대부분의 독감 균주가 라이신(Lys)과 알라닌으로 보존되어 있는 121번과 240번 아미노산의 경우 각각 글루탐산(Glu)과 트레오닌 등의 다른 성격의 아미노산으로 변화되었다는 점에서 약독화 형질에 중요한 영향을 준 것으로 시사된다.
(5-3) PA 단백질에 대한 고찰.
A/X-31바이러스 PA 단백질 유전자의 A/PR/8/34 바이러스와의 비교
유전자 염기번호 염기 변이 아미노산번호 아미노산 변이 단백질명 타균주
PA(2233nt)716 a.a 177 C -〉T - - PA
228 T -〉A - - PA
230 A -〉G 69 N -〉S PA Asn
366 A -〉G - - PA
501 C -〉A - - PA
546 G -〉A - - PA
1107 A -〉G - - PA
1257 C -〉T - - PA
1299 T -〉C - - PA
1410 G -〉A - - PA
1431 A -〉G - - PA
1629 C -〉T - - PA
1672 C -〉A 550 L -〉I PA Leu
1722 G -〉A - - PA
1776 T -〉C - - PA
1896 T -〉C - - PA
1962 T -〉C - - PA
2049 T -〉C - - PA
2106 A -〉G - - PA
PA 단백질의 아미노산 서열을 비교하기 위해 추출한 타 독감 바이러스
균주 등록 번호 저자명
A/Ann Arbor/6/60(H2N2) M23974 J04369M23975 Cox＆ Maassab et al., 1988
A/chiken/FPV/Rostock/34 M21850 Robertson ＆ Roditi et al., 1984
A/duck/Hokkaido/8/80(H3N8) M26083 J04369 Okazaki ＆ Webster et al., 1989
A/equine/London/1416/73(H7N7) M26087 J04369 Okazaki ＆ Webster et al., 1989
A/equine/Tennessee/5/86(H3N8) M26082 J04369 Okazaki ＆ Webster et al., 1989
A/gull/Maryland/704/77(H13N6) M26088 J04369 Okazaki ＆ Webster et al., 1989
A/Koera/426/68(H2N2) M26079 J04369 Okazaki ＆ Webster et al., 1989
A/Leningrad/134/17/57(H2N2) M81579 Klimov ＆ Kendal et al., 1992
A/Leningrad/134/47/57(H2N2) M81585 Klimov ＆ Kendal et al., 1992
A/Leningrad/134/57(H2N2) M81573 Klimov ＆ Kendal et al., 1992
A/pintsil/Alberta/119/79(H4N6) M26085 J04369 Okazaki ＆ Webster et al., 1989
A/PR/8/34(H1N1) J02152 Winter ＆ Fields 1982
A/ruddy turnstone/New Jersey/47/85(H4 N6) M26086 J04369 Okazaki ＆ Webster et al., 1989
A/Singapore/1/57(H2N2) M26078 J04369 Okazaki ＆ Webster et al., 1989
A/swine/Hong Kong/126/82(H3N2) M26081 J04369 Okazaki ＆ Webster et al., 1989
A/swine/Hong Kong/81/78(H3N2) M26080 J04369 Okazaki ＆ Webster et al., 1989
A/swine/Iowa/15/30(H1N1) M26076 J04369 Okazaki ＆ Webster et al., 1989
A/swine/Tennessee/26/77(H1N1) M26077 J04369 Okazaki ＆ Webster et al., 1989
A/Turkey/Minnesota/833/80(H4N2) M26084 J04369 Okazaki ＆ Webster et al., 1989
HTCA-A101 바이러스 PA 단백질 유전자의 A/X-31바이러스와의 비교
유전자 염기번호 염기 변이 아미노산번호 아미노산 변이 단백질명 타균주
PA(2233nt)716 a,a 69 G -〉A 15 -
230 G -〉A 69 S -〉N PA Asn
606 C -〉T 194 -
1230 G -〉A 402 -
2026 A -〉G 668 I -〉V PA lle,Val
2206 C -〉T -
PA 단백질 유전자에서는 총 6개의 염기 변이중 2개가 아미노산 변이로 이어졌는데, 두 경우 모두 대부분의 바이러스가 일반적으로 지니고 있는 아미노산으로의 변이여서 그 자체만으로는 약독화에 크게 영향을 줄 것 같지는 않으나 독감 바이러스의 복제는 한 개의 유전자가 독자적으로 형질을 나타낼 수도 있지만, 다른 유전자와의 상호 작용으로 전혀 다른 형질을 표현할 수도 있음을 고려할 때 상기 염기 변이의 약독화에 미치는 영향을 배재할 수는 없다.
(5-4) NP 단백질에 대한 고찰.
A/X-31바이러스 NP 단백질 유전자의 A/PR/8/34 바이러스와의 비교
유전자 염기번호 염기 변이 아미노산번호 아미노산 변이 단백질명 타균주
NP(1565nt)498 a.a 306 G -〉A - - NP
528 T -〉C - - NP
NP 단백질의 아미노산 서열을 비교하기 위해 추출한 타 독감 바이러스
균주 등록 번호 저자명
A/anasacuta/Primorje/695/76(H2N3) M36812 Mandler J. 1990
A/ANN Arbor/6/60(H2N2) M23976 J04349M23977 Cox＆ Maassab et al., 1988
A/chicken'n'/Germany/49(H10N7) M24453 Reinhardt ＆ Scholtissek 1988
A/FPV/Rostock/34 M21937 Tomly ＆ Roditi 1984
A/gull/Maryland/704/77(H13N6) M27521 M30754 Gormam ＆ Webster et al., 1990
A/Leningrad/134/17/57(H2N2) M81577 Klimov ＆ Kendal et al., 1992
A/Leningrad/134/47/57(H2N2) M81583 Klimov ＆ Kendal et al., 1992
A/Leningrad/134/57(H2N2) M81571 Klimov ＆ Kendal et al., 1992
A/Loygang/4/57(H1N1) M76604 Altmueller ＆ Scholtissek., 1992
A/mallard/NY/6750/78(H2N2) D00050 N00050 Buckler-White ＆ Murphy 1986
A/MD/12/91(H1N1) L24394 Wentworth＆Hinshaw et al., 1993
A/mink/Sweden/84(H10N4) M24454 Reinhardt ＆ Scholtissek., 1988
A/New Jersey/4/76(H1N1) M76605 Altmueller ＆ Scholtissek., 1992
A/New Jersey/8/76(H1N1) M76606 Altmueller ＆ Scholtissek., 1992
A/Ohio/3523/88(H1N1) M76602 Altmueller ＆ Scholtissek., 1992
A/PR/8/34(H1N1) M38279 Belemishev ＆ Frolov et al., 1985
A/PR/8/34(H1N1) J02147 Winter ＆ Fields 1981
A/swine/Beijing/94/91(H1N1) U49091 Guan ＆ Webster et al., 1996
A/swine/Wisconsin/1/67(H1N1) M76607 Altmueller ＆ Scholtissek., 1992
A/swine/Wisconsin/1915/88(H1N1) M76608 Altmueller ＆ Scholtissek., 1992
A/turkey/England/647/77(H1N1) M76603 Altmueller ＆ Scholtissek., 1992
A/turkey/NorthCarolina/1790/88(H1N1) M76609 Altmueller ＆ Scholtissek., 1992
A/Udorn/307/72(H3N2) D00051 N00051 Buckler-White ＆ Murphy 1986
A/whale/Maine/328/84(H13N2) M27520 M30759 Gormam ＆ Webster et al., 1990
A/Wisconsin/3623/88 M76610 Altmueller ＆ Scholtissek., 1992
HTCA-A101 바이러스 NP단백질 유전자의 A/X-31바이러스와의 비교
유전자 염기번호 염기 변이 아미노산번호 아미노산 변이 단백질명 타균주
NP(1565nt)498 a,a 98 A -〉G 18 E -〉G NP Glu,Asp
434 C -〉T 130 T -〉M NP Thr
1314 A -〉C 423 -
NP 단백질은 다기능 단백질로서 RNP 복합체의 주축을 이루며, 주로 주형 RNA에 결합하여 전사 과정에서 전사 종결 억제 역할을 한다고 알려져 있다. 아미노산 변이의 경우를 살펴보면 대부분의 독감 균주가 18번과 130번 위치에서 각각 글루탐산과 트레오닌으로 보존되어 있는데 반해, HTCA-A101의 경우 성격이 다른 글라이신(Gly)과 메티오닌(Met)으로 변화됨으로써 약독화에 관계할 가능성을 내포하고 있다. 특히 NP 단백질이 숙주 특이성에 관계한다는 보고에 근거하여 위 아미노산 변이와의 연관성이 중요할 것으로 생각된다(Virology 147, 287-294, 1985).
(5-5) Mat 단백질에 대한 고찰.
A/X-31바이러스 M 단백질 유전자의 A/PR/8/34 바이러스와의 비교
유전자 염기번호 염기 변이 아미노산번호 아미노산 변이 단백질명 타균주
M(1027nt)M1=252 a.aM2=97 a.a 32 C -〉T 3 L -〉F M1,M2 Leu
58 T -〉A - - M1
655 G -〉A - - M1
675 G -〉T 217 R -〉I M1 Arg
792 G -〉A 27 A -〉T M2 Val,lle,Thr,Ala
829 T -〉C 39 I -〉T M2 lle,Thr,Met
M 단백질의 아미노산 서열을 비교하기 위해 추출한 타 독감 바이러스
균주 등록 번호 저자명
A/Ann Arbor/6/60(H2N2) M23978 J04349M23979 Cox＆ Maassab et al., 1988
A/chicken/Brescia/1092(H7N7) L37795 Klimov ＆ Bucher et al.,1992
A/chicken/FPV/Weybridge(H7B7) M23921 M21846 Markushin ＆ Nayak et al.,1988
A/chicken/Hong Kong/14/76(H1N1) U49119 Guan ＆ Webster et al.,1996
A/duck/Bavaria/2/77(H1N1) M55476 Schultz ＆ Scholtissek.,1991
A/duck/Hong Kong/193/77(H1N2) U49118 Guan ＆ Webster et al.,1996
A/duck/Nanchang/1749/92(H11N2) U49117 Guan ＆ Webster et al.,1996
A/Fort Monmouth/1/47-MA(H1N1) M02463 Smeenk ＆ Brown 1994
A/Fort Monmouth/1/47(H1N1) U02084 Smeenk ＆ Brown 1994
A/FPV/Dobson(H7N7) L37796 Klimov ＆ Bucher et al.,1992
A/FPV/Rostock/34 M55475 Schultz ＆ Scholtissek.,1991
A/FPV/Rostock/34 M55474 Schultz ＆ Scholtissek.,1991
A/FPV/Weybridge(H7N7) L37797 Klimov ＆ Bucher et al.,1992
A/FPV/Weybridge(H7N7) M38299 Karginov ＆ Bukrinskaya.,1994
A/Guangdong/39/89(H3N2) L18999 Xu ＆ Cox et al.,1994
A/Guangdong/39/89(H3N2) L18995 Xu ＆ Cox et al.,1994
A/NWS/33(H1N1) L25814 Ward A.C. 1995
A/Phil82/BS(H3N2) U08863 Hartley ＆ Anderes et al.,1994
A/PR/8/34(H1N1) J02145 Winter ＆ Fields 1994
A/Shearwater/Australia/1/72 L25831 Ward ＆ Harley 1994
A/swine/1976/31(H1N1) M55481 Schultz ＆ Scholtissek.,1991
A/swine/England/191973/92(H1N7) U85985 Brown ＆ Mccauley et al.,1997
A/swine/Germany/2/81(H1N1) M55478 Schultz ＆ Scholtissek.,1991
A/swine/Hong Kong/126/82(H1N1) M55477 Schultz ＆ Scholtissek.,1991
A/swine/Hong Kong/168/93(H1N1) U49116 Guan ＆ Webster et al.,1996
A/swine/Hong Kong/273/94(H1N1) U49115 Guan ＆ Webster et al.,1996
A/turkey/NorthCarolina/1780/88(H1N1) M55479 Schultz ＆ Scholtissek.,1991
A/turkey/NorthCarolina/1780/88(H1N1) M55480 Schultz ＆ Scholtissek.,1991
A/USSR/90/70(H1N1) M54941 M38615 Samokhvalov ＆ Zhdanov et
A/WSN/33(H1N1) L25818 Markushin ＆ Nayak et al.,1988
A/WSN/33(H1N1) M23922 M21846 Markushin ＆ Nayak et al.,1988
HTCA-A101 바이러스 M 단백질 유전자의 A/X-31바이러스와의 비교
유전자 염기번호 염기 변이 아미노산번호 아미노산 변이 단백질명 타균주
M(1027nt)M1 =252a,aM2 =97a.a 82 C -〉A 19 -
185 C -〉T 54 P -〉S M1 Pro
307 C -〉A 94 D -〉E M1 Asp
434 G -〉A 137 A -〉T M1 Thr,Ala
675 T -〉G 217 I -〉R M1 Arg
969 G -〉A 86 A -〉T M2 Val,Ala
M 단백질 유전자는 전사된 한 종류의 mRNA 로부터 M1 과 M2 단백질을 만든다. M1 단백질은 껍질(envelope)과 RNP복합체를 연결해 주는 주변부(peripheral) 지질 단백질로서 아미노 말단부의 지질 친화부와 카르복시 말단부의 RNP 복합체 작용 도메인(RNP complex interacting domain)으로 이루어져 있다. 스플라이싱(Splicing)후의 해독에 의해 만들어지는 M2 단백질은 이온 통로(ion channel)로서 바이러스 내부의 수소 이온 농도를 조절해 준다. 아미노산 변이를 살펴보면 총 5개로서 가장 높은 변이율을 나타내고 있다. M1 단백질의 54번과 94번 아미노산은 모두 프롤린(Pro)과 아스파라긴(Asp)으로 보존되어 있는 부분인데 각각 세린(Ser)과 글루탐산(Glu)으로 변화됨으로써 약독화에 중요한 의미를 갖을 수 있다. 특히 M1 단백질의 137번과 M2 단백질의 86번의 경우 모두 숙주 특이성에 관여한다고 알려져 있는데(J.Virol.57, 697-700, 1986), A137T의 경우 인간형은 알라닌(Ala), 돼지와 조류는 트레오닌(Thr)으로 보존되어 있는 것으로 보아 숙주 특이성에 있어 인간형에서 비인간형으로의 변이로 생각할 수 있다. M2 단백질의 A86T의 경우 인간형은 알라닌, 돼지와 조류는 발린(Val)으로 보존되어 있는데 반해, 변화된 트레오닌은 기존의 어떤 종과도 다른 성격의 아미노산이었다. 현재 독감 생백신 공여 바이러스로 사용되고 있는 A/Ann Arbor/6/60/ca 바이러스와 A/Leningrad/57/ca 바이러스의 경우를 살펴 보면 각각 세린과 트레오닌으로서 HTCA-A101 바이러스의 아미노산 성격과 유사하다. 즉 위의 변이가 특정한 숙주 특이성으로 전이된 것은 아니지만 이와 다른 방식(A/Ann Arbor/6/60/ca와 A/Leningrad/57/ca의 경우)으로 바이러스의 약독화에 관여할 수 있다는 것이다.
(5-6) NS 단백질에 대한 고찰.
A/X-31바이러스 NS 단백질 유전자의 A/PR/8/34 바이러스와의 비교
유전자 염기번호 염기 변이 아미노산번호 아미노산 변이 단백질명 타균주
NS(890nt)NS1=230a.aNS2=124a.a 170 C -〉T - - NS1
176 T -〉C - - NS1
189 G -〉A 55 E -〉K NS1 Glu,Arg,Asp
299 C -〉T - - NS1
404 A -〉G - - NS1
763 G -〉A 92 V -〉I NS2 Lys,lle,Thr,Val
849 A -〉G - - NS2
NS 단백질의 아미노산 서열을 비교하기 위해 추출한 타 독감 바이러스
균주 등록 번호 저자명
A/Aichi2/68 D10571 D90526 Odagiri ＆ Tobiea et al.,1990
A/Alaska/6/77(H3N2) K01332 Buonagurio ＆ Maassab et al.,1984
A/anasacuta/primorje/695/76(H3N2) M60800 Ludwig ＆ Scholtissek et al.,1991
A/chicken/Brescia/1902(H7N7) L37798 Klimov ＆ Bucher 1992
A/chicken/Germany`N`/49(H10N7) M55464 M5465 Ludwig ＆ Scholtissek et al.,1996
A/duck/Hong Kong/193/77(H1N2) U49494 Guan ＆ Webster et al.,1996
A/duck/Nanchang/1944/93(H7N4) U49493 Guan ＆ Webster et al.,1996
A/FM/1/47-MA(H1N1) U02087 Smeenk ＆ Brown 1994
A/FPV/Dobson(H7N1) L37799 Klimov ＆ Bucher 1992
A/FPV/Rostock/34 M29617 Buerger ＆ Maassab et al.,1984
A/FPV/Rostock/34(H7N1) M60799 Ludwig ＆ Scholtissek et al.,1996
A/FPV/Weybridge(H7N7) L37800 Klimov ＆ Bucher 1992
A/Goose/Hong Kong/8/76(H1N1) U49495 Guan ＆ Webster et al.,1996
A/mallard/Alberta/827/78 M25372 J04362M27204 Treanor 1989
A/mallard/Alberta/827/78 M25373 J04362M27203 Treanor 1989
A/mallard/NY/6750/78 M25376 J04362M27200 Treanor 1989
A/NWS/33(H1N1) L25720 Ward ＆ Mckimmm-Breschkin et al.,1995
A/pintail/Alberta/119/79 M25374 J04362M27202 Treanor 1989
A/pintail/Alberta/121/79 M25371 J04362M27205 Treanor ＆ Murphy et al.,1989
A/pintail/Alberta/268/78 M25369 J04362M27199 Treanor ＆ Murphy et al.,1989
A/pintail/Alberta/358/79 M25370 J04362M27206 Treanor ＆ Murphy et al.,1989
A/PR/8/34(H1N1) J02150 Baez ＆ Skalka et al.,1980
A/PR/8/34(H1N1) V01104 Baez ＆ Skalka et al.,1980
A/PR/8/34(H1N1) J02150 Baez ＆ Skalka et al.,1980
A/tern/turkmenia/18/72(H3N3) M55466 Ludwig ＆ Scholtissek et al.,1996
A/turkey/Bethlehem-glilit/1942-b/82 (H1N1) M55467 Ludwig ＆ Scholtissek et al.,1996
A/turkey/Canada/63(H6N8) M55468 Ludwig ＆ Scholtissek et al.,1996
A/WI/4755/94 U53170 Wentworth ＆ Hinshaw et al.,1996
A/WI/4755/94 U53191 Wentworth ＆ Hinshaw et al.,1996
HTCA-A101 바이러스 NS 단백질 유전자의 X-31바이러스와의 비교
유전자 염기번호 염기 변이 아미노산번호 아미노산 변이 단백질명 타균주
NS(890nt)NS1 =230a.aNS2 =124a.a 318 A -〉T 98 M -〉L NS1 Met,lle,Leu
NS 단백질은 M 단백질 유전자와 같이 스플라이싱(splicing)에 의해 NS1, NS2 두 종류의 단백질을 만든다. NS1 단백질은 첫째로 폴리 A(poly A) RNA의 핵 밖으로의 이동을 방해하고(Genes Dev. 6, 255-267, 1992;EMBO. J. 13, 704-712, 1994;J. Virol. 68, 2425-2432, 1994), 둘째 pre-mRNA 의 스플라이싱을 억제하며(EMBO. J. 13, 704-712, 1994;Genes Dev. 8, 1817-1828, 1994;RNA. 1, 304-316, 1995), 세째 바이러스 mRNA의 해독 인핸서(enhancer)로 작용한다고 알려진 반면, NS2 단백질의 기능에 대해선 잘 알려져 있지 않다. 다만, 짧은 길이(short length) RNA의 복제를 정상적으로 진행할 수 있도록 보조 요소 역할을 한다는 보고가 있다(J. Gen. Virol. 75, 43-53, 1994). HTCA-A101 바이러스에서는 단지 98번 아미노산 1개만의 변이가 일어났는데, 타 독감 바이러스의 경우 별 숙주 특이성 없이 메티오닌(Met)과 이소루신(Ile)이 산재해 있는 부분이었다. 루이신(Leu)의 경우 타균주에서 드물게 나타나며 계속적인 저온적응에 의해 이러한 드문 아미노산 변이가 NS 단백질에 유도되었다.
이와 같이 HA와 NA를 제외한 6개의 A/X-31바이러스 게놈을 분석한 결과 원래의 A/PR/8/34 바이러스 유전자에 비해 상당히 많은 돌연변이가 발견되었다. 이것은 오랫동안 수정란에서 계대배양하여 수정란에 적응된 결과로써 생긴것으로 보이며 이러한 많은 돌연변이가 약독화된 특성과 수정란에 적응되어 고생장을 보이는 특성에 기여했을 것으로 생각된다. 또한 A/X-31 바이러스와 HTCA-A101 바이러스를 비교하였을 때 저온적응으로 인하여 6개 모든 게놈에서 돌연변이가 발견되었는데 이러한 변이는 다른 저온적응 바이러스와 비교할 때 M 단백질 유전자에서 1개의 공통적인 변이가 발견된 것을 제외하고는 전혀 다른 유전자 변이 특성을 지니고 있었다. 이러한 변이의 특성은 HTCA-A101 바이러스가 현재까지 알려진 다른 백신 바이러스와는 크게 다른 또 다른 형태의 신규한 저온적응 변이주임을 보여주는 것이다.
〈시험예 1〉 저온적응 독감 바이러스 HTCA-A101와 그의 모균주인 A/X-31 바이러스의 MDCK 세포에서의 플라그 형성 능력에 대한 비교.
본 발명에서 제조한 HTCA-A101 바이러스의 약독화된 정도를 관찰하기 위해, MDCK 세포상에서 온도를 달리하여 플라그 분석(Plaque Assay)을 수행하였다. MDCK 세포를 6 웰 플레이트(well plate)에서 90% 정도로 조밀하게 키운 후, 배지를 제거하고 2 HAU에 해당하는 바이러스를 1/10씩 10000배까지 희석하여 200μl 부피로 30분간 감염시켰다. 바이러스 용액을 제거한 뒤 0.5% 시켐 아기로스(Seakem Agarose), 0.2% 소혈청 알부민(Bovine serum albumin), 15μg/μl의 트립신(trypsin)을 함유한 DMEM 배지로 세포층을 덮고 각각 25℃, 30℃, 37℃, 39℃에서 3일간 배양한 후 플라그의 크기를 관찰하여 하기 표 9에 나타내었다. 단 25℃에서 기른 경우는 8일이 지난 후에야 플라그를 관찰할 수 있었다.
균주명 플라그 크기(mm)
25℃ 30℃ 37℃ 39℃
X-31 - 0.5 3 2
HTCA-A101 1 4 2 -
상기 표 9에 나타난 바와 같이, A/X-31 바이러스의 경우 37℃와 39℃에서 각각 3mm, 2mm정도의 정상적인 플라그 형성을 관찰할 수 있었으나, 30℃에서는 0.5mm이하, 25℃에서는 전혀 플라그를 형성하지 못함으로써 저온적응 형질을 볼 수 없었다. 반면에 HTCA-A101 바이러스의 경우 30℃에서 4mm, 25℃에서는 비록 8일만이기는 하나 1mm정도의 플라그를 형성함으로써 저온 적응 형질을 간직하고 있음을 알 수 있었고, 39℃에서는 플라그를 형성하지 못함으로써 온도 민감성 형질 또한 입증되었다. 다만, 37℃에서는 크기면에서 2mm정도의 플라그를 형성하여 A/X-31 바이러스와 별 차이를 보이지 않았으나, 현미경으로 관찰해 본 결과 괴사가 중앙에만 몰려있었고 괴사의 확산 형태가 부분적으로 진행되어 전체적으로는 별표 모양을 이룸으로써 37℃에서도 야생형의 경우와는 달리 온도 민감성을 갖는다는 것을 알 수 있었다.
결론적으로 A/X-31 바이러스를 저온적응 시킨 HTCA-A101 균주는 생체온도에서는 생육이 저해되고 저온에서는 잘 자라는 저온적응성을 지니는 독성감소주로서의 특성을 지니고 있어 생백신 균주로 유용하게 사용할 수 있을 것으로 보인다.
〈시험예 2〉 저온적응 독감 바이러스 HTCA-A101와 그의 모균주 A/X-31 바이러스의 수정란에서의 성장 능력에 대한 비교.
상기 시험예 1 의 목적과 동일하게, HTCA-A101 바이러스의 약독화된 정도를 수정란에서의 성장 정도를 비교함으로써 관찰하고자 하였다. 실시 방법은 시험예 1과 유사하고, 단 초기 감염량을 10 HAU로 변화시킨 점과 배양 조건을 각각 25℃, 30℃, 37℃로 변화시킨 부분이 다르다. 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
균주명 바이러스 타이터(HAU/ml)
25℃b 25℃ 30℃ 37℃
X-31 0 0 3×104 3×104
HTCA-A101 1×103 5×102 3×104 3×103
b ; 100 HAU 로 감염시킴
결과를 살펴보면, A/X-31 바이러스의 경우 37℃에서 3×104HAU/ml로 여타의 독감 균주에 비해 상당히 높은 성장률을 보이고 있고, 이러한 특성은 30℃에서도 3×104HAU/ml 로 유지되고 있다. 그러나 25℃의 경우를 살펴보면 전혀 자라지 못함을 알 수 있고, 이러한 현상은 감염량을 10배(100HAU)로 높였을 때도 마찬가지임을 알 수 있었다. 반면에 HTCA-A101 바이러스의 경우 30℃에서는 야생형과 같은 성장률을 보이고 있지만, 37℃에서는 1/10로 성장률이 감소하여 온도 민감성을 보이고 있다. 25℃에서도 1×103`HAU/ml의 높은 성장률로 저온 적응된 형질을 나타내고 있다.
이와같이 저온적응 변이주 HTCA-A101 이 30℃ 이하의 저온에서도 생장이 뛰어남을 보여주어 백신 생산시에 생산단가를 낮출 수 있어서 산업적으로 유용하게 이용될 수 있다.
〈시험예 3〉 쥐에서의 저온 적응 독감 바이러스 HTCA-A101 에 대한 독성 실험.
HTCA-A101가 MDCK 세포와 수정란에서 저온 적응성과 온도 민감성을 나타냄을 시험예 1 과 시험예 2 에서 확인하였으므로, 본 실시예에서는 실험동물인 쥐에서 HTCA-A101의 약독화 정도를 조사하고자 하였다.
찰스리버사(Charles River사, 일본)에서 공급받은 생후 6주가 지난 생쥐(Balb/c)를 그룹당 5마리씩 묶어 독성 시험에 사용하였다. 이소플루란(Isoflurane)으로 생쥐를 흡입마취시킨 뒤, 107pfu/ml, 106pfu/ml, 105pfu/ml, 104pfu/ml, 103pfu/ml의 농도를 가진 HTCA-A101바이러스 또는 A/X-31 바이러스를 50μl씩 각각 생쥐의 코에 흡입 감염시킨 뒤 시간이 경과됨에 따른 치사율과 체중 변화를 관찰하였다(도 1참조).
그 결과 107pfu/ml, 106pfu/ml 의 농도로 감염시킨 군에서 A/X-31 바이러스 야생형은 감염 후 3일까지 일시적인 체중감소 효과를 보인 후 다시 증가하는 양상을 보였으나 HTCA-A101은 PBS를 투여한 대조군과 비교하였을 때 차이가 보이지 않았다.
상기의 결과는 A/PR/8/34 야생형 바이러스를 같은 방법으로 치사율과 체중감소 효과를 본 결과(도 2참조)와 비교하면 A/PR/8/34 바이러스는 107pfu에서 절반 이상의 생쥐가 사망하는 것으로 관찰된 반면 A/X-31 바이러스는 일시적인 체중감소만을 나타내는 것은 A/X-31 바이러스 자체가 A/PR/8/34 보다 약독화되어 있음을 나타내는 것이며, A/X-31 바이러스가 수정란에서의 계대배양으로 인해 이미 어느 정도 독성이 감소된 변이주이라는 것을 보여준다. 또한 본 발명에서 제조한 HTCA-A101 바이러스는 저온적응으로 인해 더 더욱 독성이 감소되었음을 보여준다.
〈실시예 6〉 재조합 3가 백신의 제조.
최근 10년 이상 매년 유행하고 있는 독감 바이러스는 H1N1 및 H3N2 등 두 종류의 A형과 한 종류의 B형이다. 본 발명에서는 실시예 1에서 얻어진 저온적응 바이러스 HTCA-A101 와 최근 유행하고 있는 맹독성 바이러스와의 재조합 바이러스를 제조하여 3가 백신을 제조하였다.
(6-1) H1N1형 재조합 독감 바이러스의 제조.
H1N1형은 A/Singapore/6/86 바이러스를 사용하여 제조하였다. HTCA-A101 바이러스와 A/Singapore/6/86 바이러스를 계란에 동시 감염시켜 2일간 30℃ 항온기에서 배양하였다. 요액을 취해 MDCK 세포주로 27℃에서 플라그 분석(plaque assay)을 수행하였다. 이때 HTCA-A101 바이러스의 플라그 형성이 저해되는 최소한의 농도의 1.5배 (0.5μl/ml) 되는 폴리클로날(polyclonal) 항체를 배지속에 첨가하였다. 3일 후 형성된 플라그를 취해 각각을 계란에 다시 감염시켜 27℃에서 3일간 배양하였다. 요액을 취해 바이러스 증식 여부를 확인하고 증식된 바이러스가 있으면 이들 각각을 플라그 저해 분석(plaque inhibition assay)을 하여 재조합 바이러스 생성 여부를 확인하였다. 플라그 저해 분석은 MDCK 세포주로 플라그 분석을 할 때 항체 농도를 달리하여 즉 3μl/ml, 1μl/ml, 0.7μl/ml, 0.5μl/ml, 0.3μl/ml, 0.1μl/ml로 각각 첨가하여 플라그 형성이 저해되는 농도를 알아 보는 것이다.
플라그 저해 분석을 한 결과 HTCA-A101 바이러스는 0.3μl/ml까지 플라그가 작게 형성되는데 반해 1μl/ml까지 플라그가 크게 형성되는 재조합 바이러스를 얻었다.
(6-2) H3N2형 재조합 독감 바이러스의 제조.
H3N2형 바이러스는 A/Shangdong/9/93 바이러스를 계란에 감염시켜 30℃에서 배양 후 요액을 취해 이를 다시 계란에 감염시켰다. 이때 각각의 계란에 10μl, 2μl, 0.5μl씩의 항체를 주입하였다. 30℃에서 3일간 배양 후 요액을 취해 바이러스 증식을 확인하였다. 이들 중 0.5μl 계란에서만 바이러스가 증식되었음이 확인되었다. 이 바이러스를 다시 2μl 또는 1μl의 항체를 주입한 계란에 감염시켜 27℃에서 3일간 배양하였다. 2μl 항체가 있는 계란에서도 바이러스가 증식되었음을 확인한 후 이를 다시 10μl의 항체를 주입한 계란에서의 성장 여부를 확인하였다. 10μl의 항체가 포함된 계란에서도 성장한 바이러스를 MDCK 세포주에서 상기와 같은 방법으로 플라그 저해 분석(plaque inhibition assay)을 실시하여 0.7μl/ml의 항체에서도 플라그가 형성되는 것을 확인하였다. 이들 재조합 바이러스들은 항체가 주입되지 않은 계란에서 배양했을 경우 HTCA-A101 바이러스와 거의 비슷하게 증식하고 있어 성장 특성이 변하지 않았음을 알 수 있었다.
이들 재조합 바이러스들이 저온적응성이나 온도민감성 변이주로서의 특성을 유지하고 있는지를 시험예 1과 2의 과정으로 실시한 결과 모균주인 HTCA-A101 바이러스와 다른점이 없어서 독성을 가진 야생형 바이러스와 재조합되었을 때에도 독성이 감소된 특성이 유지되는 유전적으로 안정된 특징을 보여 주었다.
〈시험예 4〉 3가 백신에 대한 전임상 급성및 아급성 독성시험
재조합 3가 백신을 서울대학교 수의과대학에 의뢰하여 다음과 같이 생쥐와 토끼를 이용한 급성 독성시험과 4주간 지속투여 효과를 보는 아급성 독성시험을 실시하였다.
(4-1) 마우스에서 1회 점적 급성 독성시험
ICR 마우스에서 독감 백신의 비강내 점적시 급성 독성을 조사하였다. 8.3×104TCID50(50% tissue culture infectious dose)/g/B.W.을 최고 용량으로 투입하고 공비 ×0.5로 4.15×104TCID50/g/B.W., 2.08×104TCID50/g/B.W., 1.04×104TCID50/g/B.W. 그리고 0.52×104TCID50/g/B.W.의 투여군으로 급성 독성 시험을 실시하였다.
시험 결과 비강내 점적의 방법으로 최고 용량 8.3×104TCID50/g/B.W. 까지 투여한 결과 사망 및 임상 증상과 모든 생존 동물에 대한 해부 병리 소견에서 시험물질의 투여에 기인한다고 사료되는 변화는 관찰되지 않았다.
(4-2) 토끼에서 1회 점적 급성 독성시험
토끼(New Zealand White rabbits)에서 독감 백신의 비강내 점적시 급성 독성을 조사하였다. 8.3×104TCID50/g/B.W.을 최고 용량으로 투입하고 공비 ×0.5로 4.15×104TCID50/g/B.W., 2.075×104TCID50/g/B.W., 1.0375×104TCID50/g/B.W. 그리고 0.51875×104TCID50/g/B.W.의 투여군으로 두었다.
시험 결과 비강내 점적의 방법으로 최고 용량 8.3×104TCID50/g/B.W. 까지 투여한 결과 사망 및 임상 증상과 모든 생존 동물에 대한 해부 병리 소견에서 시험물질의 투여에 기인한다고 사료되는 변화는 관찰되지 않았다.
(4-3) 마우스에서 4주간 점적 반복투여 독성시험
마우스에서 독감 백신의 4주간 점적 반복투여에 대한 독성을 조사하기 위해서, 식품의약품 안전본부 고시 제 96-8호 “의약품 등의 독성 시험 기준”에 따라 저용량 약 8.3×101TCID50/g/days, 중간 용량 8.3×102TCID50/g/days, 고용량 8.3×103TCID50/g/days 를 일일 1 회, 주 7 회, 4주간 반복 투여하였다.
그 결과를 종합하여 보면 시험기간 중 사망동물은 없었으며 체중변화, 음수 및 사료 섭취량 변화를 비롯한 특이한 임상증상을 나타내지 않았다. 혈액학 및 혈청 생화학 검사 결과 독감 백신 투여군에서 특이할 만한 변화는 없었으며 뇨검사, 안검사 등에서도 대조군에 비하여 유의한 변화를 관찰할 수 없었다. 또한 병리 조직학적 검사 결과 기초 병변 이외의 용량의존적 혹은 약물 투여에 의한 것으로 생각되어지는 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 그러므로 마우스에서 4주간 독감 백신의 비강내 점적 반복 투여는 최고 8.3×103TCID50/g/days 까지 독성을 나타내지 않는 것으로 보인다.
(4-4) 토끼에서 1개월간 점적 반복투여 독성시험
토끼에서 독감 백신의 1개월 반복투여에 대한 독성을 조사하기 위해서, 식품의약품 안전본부 고시 제 96-8호 “의약품 등의 독성 시험 기준”에 따라 저용량 약 8.3×101TCID50/g/days, 중간 용량 8.3×102TCID50/g/days, 고용량 8.3×103TCID50/g/days 를 일일 1 회, 주 7 회, 1개월간 반복 투여하였다.
그 결과를 종합하여 보면 시험기간 중 사망동물은 없었으며 체중변화, 음수 및 사료 섭취량 변화를 비롯한 특이한 임상증상을 나타내지 않았다. 혈액학 및 혈청 생화학 검사 결과 독감 백신 투여군에서 특이할 만한 변화는 없었으며 뇨검사, 안검사 등에서도 대조군에 비하여 유의한 변화를 관찰할 수 없었다. 또한 병리 조직학적 검사 결과도 토끼에서 흔히 발견되는 기초 병변이 시험군 및 대조군에서 모두 관찰되었으며 독감 백신 투여에 의한다고 판단되는 병리조직학적 변화는 관찰할 수 없었다. 그러므로 토끼에서 1개월간 독감 백신의 경구 반복 투여는 최고 8.3×103TCID50/g/days 까지 독성을 나타내지 않는 것으로 보인다.
이상으로 3가 재조합 백신을 1회 급성 독성 시험과 4주간 매일 반복 투여의 아급성 시험을 실시한 결과 백신 투여로 인한 특별한 변화는 발견되지 않았다. 이러한 결과는 본 발명에서 만들어진 생백신이 부작용 없이 사용될 수 있을 가능성을 보여주는 것이다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 제조한 저온적응 독감 바이러스는 6개의 유전자 모두에서 변이가 일어나 모균주로의 복귀 가능성이 대폭 감소된 유전적으로 안정된 균주이며, 저온적응 형질 및 온도 감수성 형질을 가지므로 인체에 감염된 경우 증식이 억제되어 독성이 크게 완화되며, 수정란에서 대량으로 증식될 수 있어 독감 바이러스의 감염으로 인한 질병을 예방하는 독감 백신으로 유용하게 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 저온적응 바이러스는 사백신보다 탁월한 장점을 가진 생백신으로 널리 효과적으로 이용될 수 있어 그 효용이 더욱 증대된 것이다.
또한 본 발명의 저온적응 바이러스와 야생형 독감 바이러스가 조합된 재조합 독감 바이러스도 저온적응성과 온도민감성이 유지되고 독성이 크게 감소된 균주로서 3가 독감 백신으로 유용하게 사용될 수 있다.
〔서열목록〕
서열번호 : 1
서열의 길이 : 2341
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : PB2 유전자
Figure kpo00000
Figure kpo00001
Figure kpo00002
〔서열목록〕
서열번호 : 2
서열의 길이 : 2341
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : PB1 유전자
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Figure kpo00004
Figure kpo00005
〔서열목록〕
서열번호 : 3
서열의 길이 : 2233
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : PA 유전자
Figure kpo00006
Figure kpo00007
Figure kpo00008
〔서열목록〕
서열번호 : 4
서열의 길이 : 1565
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : NP 유전자
Figure kpo00009
Figure kpo00010
〔서열목록〕
서열번호 : 5
서열의 길이 : 1027
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : M 유전자
Figure kpo00011
Figure kpo00012
〔서열목록〕
서열번호 : 6
서열의 길이 : 890
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : NS 유전자
Figure kpo00013
Figure kpo00014

Claims (11)

  1. A/X-31 바이러스를 저온에서 계대 배양하여 얻은 신규한 저온적응 독감 바이러스.
  2. 제 1 항에 있어서, 저온적응 독감 바이러스는 HTCA-A101 바이러스 (수탁번호:KCTC 0400 BP).
  3. 제 3 항에 있어서, 서열 1의 염기 서열을 가지는 PB2 단백질 유전자, 서열 2의 염기 서열을 가지는 PB1 단백질 유전자, 서열 3의 염기 서열을 가지는 PA 단백질 유전자, 서열 4의 염기 서열을 가지는 NP 단백질 유전자, 서열 5의 염기 서열을 가지는 M 단백질 유전자 또는 서열 6의 염기 서열을 가지는 NS 단백질 유전자를 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 cDNA 유전자.
  4. 독감 바이러스를 수정란에 주입하여 30℃, 27℃, 24℃의 순차적인 방법으로 24℃까지의 저온에서 수일 배양하여 증식시킨 다음 수정란의 요액에서 바이러스를 회수하고 이를 다시 수정란에 주입시키는 방식으로 계대배양을 반복하여 얻는 제 1 항의 저온적응 독감 바이러스의 제조방법.
  5. 제 5 항에 있어서, 수정란에 처음 주입시키는 독감 바이러스는 A/X-31, B/Yamagata/16/88 또는 B/Lee/40를 포함하는 제조방법.
  6. B/Yamagata/16/88 바이러스를 저온에서 계대배양하여 얻은 B형 저온적응 독감 바이러스 HTCA-B102(수탁번호: KCTC 0401 BP).
  7. B/Lee/40 바이러스를 저온에서 계대배양하여 얻은 B형 저온적응 독감 바이러스 HTCA-B104(수탁번호: KCTC 0402 BP).
  8. 제 1 항, 제 6 항 또는 제 7 항의 저온적응 독감 바이러스를 유효성분으로 하는 독감 백신.
  9. 저온 적응 독감 바이러스 HTCA-A101 과 A/Singapore/6/86 을 숙주세포에 동시 감염시켜 얻은 재조합 H1N1 형 독감 바이러스.
  10. 저온 적응 독감 바이러스 HTCA-A101 과 A/Shangdong/9/93 을 숙주세포에 동시 감염시켜 얻은 재조합 H3N2 형 독감 바이러스.
  11. 제 10 항의 재조합 H1N1 형 독감 바이러스 또는 제 11 항의 재조합 H3N2 형 독감 바이러스를 유효성분으로 하는 독감 백신.
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