DE69505236T2

DE69505236T2 - Liposomen und deren verwendung insbesondere zur herstellung immunomodulatorischer mittel

Info

Publication number: DE69505236T2
Application number: DE69505236T
Authority: DE
Inventors: Andre F-59133 Phalempin Capron; Jean-Marie F-59162 Ostricourt Grzych; Nathalie F-59000 Lille Ivanoff; Nigel Pointe Claire Quebec H9R 2Ga Phillips; Gilles F-59133 Phalempin Riveau
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1994-02-23
Filing date: 1995-02-23
Publication date: 1999-05-20
Anticipated expiration: 2015-02-24
Also published as: EP0748214B1; ATE171867T1; DE69505236D1; FR2716373B1; WO1995022961A1; EP0748214A1; FR2716373A1

Description

Die Erfindung betrifft Liposomen, die als Vehikel für aktive Prinzipien und die Immunadjuvantien zum Erhalten von immunmodulatorischen Mitteln, insbesondere Impfzusammensetzungen, von Nutzen sind.
Liposomen sind Bläschen, in denen eine Lipidphase, die aus einer Doppelschicht amphiphiler Moleküle, wie z. B. Phospholipide oder Cholesterin, besteht, eine innere wäßrige Phase umschließt. Liposomen vom Einlamellentyp enthalten eine einzige Lipiddoppelschicht; Liposomen vom Multilamellentyp umfassen mehrere Lipiddoppelschichten in konzentrischer Anordnung und die wäßrige Phase, die in diesem Falle den zentralen Kern des Liposoms und die Trennung zwischen den Lipiddoppelschichten bildet.
Die Verwendung von Liposomen in der pharmazeutischen Industrie als Vektor für verschiedene Moleküle von biologischem Interesse ist das Ziel vieler Arbeiten.
Insbesondere wurde vorgeschlagen, Liposomen gleichzeitig als Antigenvektor und als Immunadjuvans zum Erhalten von Impfstoffen zu verwenden. Wenngleich die Liposomen selbst nicht immunogen sind, wurde festgestellt, daß sie, wenn sie mit Antigenen beladen sind, die Immunantwort im Vergleich zu derjenigen, die mit dem freien Antigen erhalten wird, erhöhen, d. h., daß sie eine Immunantwort gegen ein Antigen, das selbst nicht immunogen ist, erhöhen. Es wurde gefunden, daß die Wirkung als Immunadjuvans unabhängig von der Zusammensetzung der Liposomen, der Tierart, in welcher die Immunisierungsversuche durchgeführt werden, und dem Verabreichungsweg ist. Nach den Arbeiten, die in einer bibliographischen Zeitschrift zu diesem Thema zitiert wurden [GREGORIADIS, Immunology Today, 11, S. 89-97 (1990)], scheint dieser Effekt im wesentlichen quantitativ, wobei im übrigen das isotypische Profil der Serumantikörper, die durch Injektion eines in Liposomen eingekapselten Antigens induziert werden, das gleiche ist wie das von Serumantikörpern, die durch Injektion des gleichen freien Antigens induziert werden.
Eine Übersicht von PHILLIPS [Bull. Inst. Pasteur, 90, 205-230, (1992)] zitiert verschiedene Arbeiten, die die Immunadjuvanswirkung von Liposomen im Vergleich zu derjenigen von Alaun und Muramyldipeptiden in antigenen Präparationen, die durch Injektion in die Maus verabreicht wurden, betreffen; das verwendete Antigen ist entweder Rinderserumalbumin oder ein Peptid. Bei diesen Verabreichungsbedingungen stimulieren die Liposomen vorzugsweise die IgG-Antwort, und durch Modifikation des isotypischen Profils erhöhen sie den Anteil von IgG2a, IgG2b und IgG3 im Vergleich zu IgG1.
Die internationale Patentanmeldung PCT WO 90/04412 beschreibt Präparationen auf der Basis von Interleukin-2 (IL-2), die in Liposomen, die z. B. aus DMPC und DMPG gebildet werden, eingekapselt sind. Diese Präparationen können als Immunadjuvantien in Assoziation mit verschiedenen Antigenen verwendet werden.
Die Immunadjuvanseigenschaften dieser Präparationen sind jedoch im wesentlichen auf IL-2 zurückzuführen; die verwendeten Liposomen spielen lediglich die Rolle von Transportvehikeln, die es ermöglichen, die Aktivität und die Bioverfügbarkeit von IL-2 zu erhöhen und dessen Toxizität zu verringern, es gibt jedoch weder einen Hinweis noch eine Anregung, daß sie selbst Eigenschaften von Immunadjuvantien besitzen.
Andere Autoren haben die Wirkung von Antigenpräparationen in Form von Liposomen, die über Schleimhäute verabreicht werden, auf die sekretorische Antwort beschrieben:
- MICHALEK et al. [Vaccine Research, 1 : 3, Seiten 241-247 (1992)] haben die Inkorporation verschiedener Antigene von S. mutans in DPPC/Cholesterin/Dicetylphosphat- Liposomen beschrieben und haben nach oraler Verabreichung dieser Zusammensetzungen eine deutliche Erhöhung der sekretorischen IgA-Antwort gegen diese Antigene beobachtet;
- ABRAHAM et al. [Vaccine 10 : 7, Seiten 461-467, (1992)] haben Polysaccharidantigene von P. aeruginosa, A. levanicum und S. pneumoniae in Cholesterin/PC/PS- Liposomen inkorporiert und diese erhaltenen Zusammensetzungen auf intranasalem Weg verabreicht. Sie haben ebenfalls eine Erhöhung der sekretorischen Antwort, die gegen diese Antigene gerichtet ist, beobachtet. Dagegen wurde keinerlei Einfluß auf die systemische Antikörperantwort unter diesen Bedingungen beobachtet.
Ein Problem, das sich bei der in vivo-Verwendung von Liposomen stellt, ist das ihrer Stabilität, damit die liposomale Struktur bis zu den Zielzellen erhalten bleibt.
Im Falle einer Immunisierung durch Injektion fangen die Lipoproteine hoher Dichte (HDL) des Plasmas die Phospholipide ein, was die Desintegration der liposomalen Struktur hervorruft, und dies umso schneller, je flüssiger die Phospholipiddoppelschicht ist. Bei der Verabreichung auf dem oralen Wege sind es die abbauenden Enzyme, insbesondere die Phospholipasen, die zur Degradation der Liposomen führen. Man versucht üblicherweise diese Degradation dadurch zu vermeiden, daß man Liposomen verwendet, die zwischen 30 und 50% Cholesterin, das gegenüber dem Angriff von Phospholipasen resistent ist und ebenso eine höhere Steifigkeit der Lipiddoppelschicht bewirkt, enthalten.
Cholesterin hat jedoch den Nachteil, daß es durch Extraktion, ausgehend von Naturprodukten, erhalten wird, was die Kontaminationsrisiken erhöht und daß es außerdem bestimmte immunsupressive Eigenschaften besitzt.
Die Erfinder haben nunmehr Liposomenformulierungen entwickelt, die, wenn sie zum Verkapseln von Antigenen verwendet werden, eine Immunantwort induzieren können, die nicht nur quantitativ, sondern ebenso qualitativ von derjenigen verschieden ist, die durch freies Antigen erzeugt wird.
Wenn die Impfzusammensetzungen, die gemäß den erfindungsgemäßen Liposomen formuliert wurden, über die Schleimhaut verabreicht werden, induzieren sie nicht nur eine sekretorische Antwort, sondern ebenso eine systemische Antwort im Unterschied zu im Stand der Technik bekannten Zusammensetzungen (z. B. denjenigen, die von ABRAHAM et al. beschrie ben wurden). Außerdem ermöglichen die erfindungsgemäßen Liposomen insbesondere die Erhöhung der Antwort Th2 zu töten, was sich bei der Maus (und zwar unabhängig vom Mausstamm, der zur Immunisierung verwendet wurde) durch eine Modifikation des isotypischen Profils der Serumantwort zugunsten von IgG1 und IgG2b und durch eine Erhöhung der sekretorischen IgA-Antwort äußert.
Das Ziel der Erfindung ist die Verwendung einer Liposomenpräparation, umfassend wenigstens eine Lipiddoppelschicht, die aus einem Gemisch eines Phospholipids (I), dessen Fluiditätstemperatur zwischen 20 und 25ºC liegt, und einem Phospholipid (II), dessen Fluiditätstemperatur zwischen 20 und 60ºC liegt, wobei das molekulare Verhältnis zwischen dem Phospholipid (I) und dem Phospholipid (II) zwischen 5 : 95 und 30 : 70 liegt, gebildet ist, als aktives Immunadjuvansprinzip, um Impfstoffe zu erhalten.
Unter "Fluiditätstemperatur" eines Phospholipids wird die Temperatur verstanden, bei welcher die Umwandlung vom Gelzustand (oder Festzustand) zum Flüssigkristallzustand (Flüssigzustand) einer Doppelschicht des genannten Phospholipids stattfindet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Phospholipid (I) Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG: Fluiditätstemperatur 23ºC), und das Phospholipid (II) ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC: Fluiditätstemperatur 24ºC), Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC: Fluiditätstemperatur 42ºC) und Distearoylphosphatidylcholin (DSPC: Fluiditätstemperatur 58ºC).
Nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt das molare Verhältnis zwischen dem Phospholipid (I) und dem Phospholipid (II) zwischen 5 : 95 und 15 : 85.
Vorteilhafterweise sind die Liposomen, die sich zur Durchführung der Erfindung eignen, multilamelläre Liposomen und besitzen einen mittleren Durchmesser im Bereich zwischen 400 und 800 nm, vorzugsweise etwa 600 nm. Im Hinblick auf die Verwendung als Immunadjuvans und/oder Antigenvektor wird folgendes festgehalten:
- eine bestimmte Heterogenität im Hinblick auf die Dimension verbessert noch die Immunadjuvanseigenschaften der erfindungsgemäßen Liposomenpräparationen;
- insbesondere im Fall von Zusammensetzungen zum Zwecke einer oralen Verabreichung ist es wünschenswert, daß die Präparation einen relativ hohen Anteil von großen Liposomen (d. h. mit einem Durchmesser von größer als 500 nm) enthält.
Die zur Durchführung der Erfindung geeigneten Liposomen können, ausgehend von einem wie oben definierten Phospholipidgemisch, durch verschiedene, an sich bekannte Verfahren [siehe z. B. Liposomes: A practical approach; Practical approach series, D. RICKWOOD und B. D. HAMES, Hrs., IRL press (1990)] hergestellt werden.
Vorzugsweise verwendet man synthetisierte Phospholipide ohne Endotoxinkontamination (LPS< 10 pg/uM Phospholipide). Die erfindungsgemäßen Liposomen enthalten kein Cholesterin und weisen somit nicht die Nachteile auf, die mit der Verwendung von Cholesterin ver bunden sind (schwierig zu kontrollierende Reinheit, möglicherweise toxisch, immunsupressive Aktivität).
Die zur Durchführung der Erfindung geeigneten Liposomen sind zum Erhalt von immunmodulatorischen und insbesondere von immunstimulierenden Zusammensetzungen oder von immunogenen Zusammensetzungen, insbesondere von Impfstoffen, die zur Verabreichung über die Schleimhaut bestimmt sind, geeignet. Diese Zusammensetzungen induzieren z. B. eine Serum-Antikörper-Antwort und/oder eine Antwort vom sekretorischen IgA-Typ und sind geeignet, eine zelluläre Immunität zu induzieren.
Ziel der Erfindung sind immunmodulatorische Zusammensetzungen und insbesondere Immunadjuvantien, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie wie oben definierte Liposomen enthalten.
Die Erfindung betrifft weiterhin immunogene Zusammensetzungen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie wie oben definierte Liposomen, die mit wenigstens einem Antigen beladen sind; enthalten.
Unter "mit einem Antigen beladene Liposomen" werden sowohl Zusammensetzungen verstanden, bei denen das Antigen in der wäßrigen Phase im Inneren des Liposoms gelöst ist, als auch Zusammensetzungen, bei denen das Antigen an der Lipiddoppelschicht, an der Außenseite dieser Doppelschicht, adsorbiert ist als auch Zusammensetzungen, bei denen das Antigen (das in diesem Fall eine hydrophobe Region umfaßt) mit der Lipiddoppelschicht interagiert. Das Antigen kann durch covalente Bindung, wie auch durch Affinitätsbindung (vom Avidinbiotin-Typ) gemäß dem Fachmann bekannten Techniken an Lipide, Phospholipide oder Lipopeptide, die in der Lage sind, sich in die Lipiddoppelschicht zu insertieren, gekoppelt werden.
Die besonderen Adjuvanseigenschaften der erfindungsgemäßen Liposomen hängen mit der spezifischen Zusammensetzung ihrer Lipiddoppelschicht zusammen. Diese Liposomen können somit in Verbindung mit jeglichen, in die Liposomen inkorporierbaren Antigenen, insbesondere Peptid-, Protein-, Glykoprotein-Antigenen, aber ebenso Saccharid- oder Nukleinsäure-Antigenen, etc. verwendet werden. Diese Antigene können insbesondere von viralem, parasitärem oder bakteriellem Ursprung sein; insbesondere kann es sich um HIV-Antigene, wie diejenigen, die in den folgenden Patenten und veröffentlichten Patentanmeldungen EP 138 667, FR 2 571 968, EP 239 425, WO 86/02383 beschrieben wurden, Antigene des Hepatitis-B-Virus, wie z. B. diejenigen, die in den folgenden Patenten und veröffentlichten Patentanmeldungen FR 2·464 269, EP 156 712 beschrieben wurden, Schistosom-Antigene, wie z. B. diejenigen, die im Patent FR 2 689 906 beschrieben wurden; Toxoplasmen, wie z. B. diejenigen, die im Patent FR 2 692 282 beschrieben wurden; Bordetella pertussis- und Bordetella anthracis-Antigene, wie z. B. diejenigen, die in den folgenden Patenten und veröffentlichten Patentanmeldungen WO 87/03301, FR 2 638 090 beschrieben wurden, etc. handeln.
Es ist möglich, zunächst nichtbeladene Liposomen herzustellen und diese dann mit dem gewünschten Antigen zu beladen oder aber in einer einzigen Stufe zur Formulierung von Lipo somen in Gegenwart von Antigen und Phospholipidgemisch voranzuschreiten. Das günstigste Verfahren wird in diesem Fall als Funktion der Natur des Antigens ausgewählt werden, um seiner strukturellen Integrität Rechnung zu tragen.
Die zur Durchführung der Erfindung verwendeten Liposomen können getrennt von den Antigenen hergestellt werden und einer Herstellungskontrolle, die unabhängig vom Antigen ist, unterzogen werden.
Die letztendliche immunogene Zusammensetzung wird durch einfaches Mischen des oder der Antigen(e) mit der Liposomenpräparation in einem annehmbaren pharmazeutischen Träger erhalten.
Die zur Durchführung der Erfindung geeigneten Liposomen können mit mehreren Antigenen beladen sein. Es ist ebenfalls möglich, außerdem die Liposomen mit verschiedenen Substanzen zu beladen, die geeignet sind, die Impfstärke der Präparation zu verbessern.
Zum Beispiel kann man zur Verbesserung der Impfkraft bei oraler Verabreichung die beta-Untereinheit des Choleratoxins verwenden, deren Fähigkeit, vorzugsweise auf der Ebene der M-Zellen der Peyerschen Plaques zu binden, die Induktion einer stärkeren IgA-Antwort erlaubt.
Zur Verbesserung der Impfkraft bei nasaler Verabreichung kann man Adhesine verwenden, z. B. das FHA-Protein (filamentöses Hämagglutinin) von Bordetella pertussis, das eine verbesserte Integration der Liposomen in das Gewebe ermöglicht und die sekretorische IgA- Antwort verstärkt.
Die erfindungsgemäßen Liposomen können ebenfalls an Substanzen mit einer immunmodulatorischen Aktivität, wie z. B. gamma-Interferon, Interleukine IL-1 und IL-2, CGSF, TNF (Tumornekrosefaktor), assoziiert sein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen immunogenen Zusammensetzungen sind die Zusammensetzungen auf oralem Wege verabreichbar.
Nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen immunogenen Zusammensetzungen sind die Zusammensetzungen intranasal verabreichbar.
Es ist ebenso möglich, z. B. im Falle der intranasalen Verabreichung, die Liposomen nicht mit Antigen zu beladen, so daß die Liposomen lediglich eine Rolle als Adjuvans spielen; in diesem Fall kann man die Liposomen und das Antigen entweder gleichzeitig oder getrennt erabreichen, wobei z. B. nach einem Intervall von 24 Stunden auf die Verabreichung der Liposomen eine Verabreichung des Antigens folgt.
Die erfindungsgemäßen Liposomen wurden in Verbindung mit dem Antigen Sm28GST (Glutathion-S-Transferase von 28 kDa) von Schistosoma mansoni verwendet, um einen Impfstoff zu erhalten, der über die Schleimhaut zu verabreichen ist, und um einen Schutz gegenüber der Schistosoma-Parasitose zu induzieren.
Das Antigen Sm28GST induziert eine protektive Immunität bei Säugetieren durch Verminderung der Anzahl adulter Würmer und durch Verringerung der Fruchtbarkeit dieser Würmer. Die durch die Immunisierung induzierte Verminderung des Eierlegens führt zu einer Verminderung der Leberpathologie.
Jüngste Arbeiten [GRZYCH et al., J. Immunol. 150, Seiten 527-535, (1993)] haben die wahrscheinliche Beteiligung von Antikörpern vom IgA-Typ in diesem Prozeß des Schutzes gezeigt. Diese IgA sind im Serum nachweisbar und stellen besonders den Hauptisotyp der sekretorischen Immunantwort dar. Jedoch hat das Verabreichen dieses Antigens auf oralem Weg bis jetzt noch nicht ermöglicht, eine Immunantwort zu erhalten.
Wenn dieses Antigen über die Schleimhaut verabreicht wird, beobachtet man mit den erfindungsgemäßen Liposomen eine starke Immunantwort, die gleichzeitig im Serum vorliegt und sekretorisch ist.
Immundominante Peptide (N-terminale Peptide, 10-43, 115-131, 190-211) von Sm28GST können ebenso verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Liposomen zu beladen. Die Peptidsequenz des Antigens Sm28GST, ebenso wie das Erhalten dieses Antigens durch gentechnologische Verfahren, werden in der europäischen Patentanmeldung 268 501 von TRANSGENE S. A. beschrieben.
Die Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Ergänzung der Beschreibung, die sich auf Herstellungsbeispiele von Liposomen und auf ihre erfindungsgemäße Verwendung als Impfstoff bezieht, besser verstanden werden.
Es muß jedoch klar sein, daß diese Beispiele lediglich zum Zwecke der Darstellung des Erfindungsgegenstandes dienen und daß sie in keinster Weise eine Einschränkung darstellen.

BEISPIEL 1 - ERHALTEN VON LIPOSOMEN

ZUSAMMENSETZUNG DER VERWENDETEN LIPOSOMEN:

Es wurden drei Sorten von Liposomen hergestellt. Diese Liposomen weisen in Abhängigkeit ihrer Zusammensetzung eine variable Steifigkeit auf; dies ermöglicht somit eine unterschiedliche Präsentation des Antigens gegenüber dem Schleimhaut-Immunsystem.
DMPC/DMPG
Dimyristoylphosphatidylcholin/Dimyristoylphosphatidylglycerin
Verhältnis: 9 : 1. Fusionstemperatur: 24ºC
DPPC/DMPG
Dipalmitoylphosphatidylcholin/Dimyristoylphosphatidylglycerin Verhältnis: 9 : 1. Fusionstemperatur: 37ºC
DSPC/DMPG
Distearoylphosphatidylcholin/Dimyristoylphosphatidylglycerin
Verhältnis: 9 : 1. Fusionstemperatur: 56ºC
Die Molekulargewichte der verwendeten Phospholipide sind wie folgt:
DMPC: 677,95
DPPC: 734,05
DSPC: 790,15
DMPG: 688,85.
Alle Glaswaren, die dazu gedacht sind, in Kontakt mit den verwendeten Phospholipiden zu kommen, werden zuvor mit demineralisiertem Wasser gewaschen und gespült und in einem Ofen während 6 Stunden bei 200ºC sterilisiert. Alle Handhabungen von Pulvern, das Lösen und die Handhabung von Glaswaren wie auch die Übertragungen der Lösungen von einem Behältnis zu anderen werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Nach dem Wiegen werden die verschiedenen Phospholipide zu einer Konzentration von 20 Mikromol pro Milliliter in zuvor auf einem Molekularsieb wasserfrei gemachtem tertiärem Butylalkohol gelöst und auf 60ºC erhitzt, um sie zu verflüssigen. Die verschiedenen Lösungen werden in gefärbten 30-Milliliter-Phiolen bei einer Temperatur von -20ºC konserviert.
Das Mischen der Phospholipide, d. h. DMPC + DMPG, DPPC + DMPG und DSPC + DMPG, wird in Lyophilisierungsgefäßen mit einem Inhalt von 10 ml durchgeführt. Die Lösungen werden im Wasserbad bei 60ºC erhitzt, um sie vollständig flüssig werden zu lassen. Ein 900-Mikroliter-Volumen des Phosphatidylcholinderivats (DMPC, DPPC oder DSPC) wird in ein warmes Gefäß (nahe 60ºC) gegeben, und anschließend werden 100 Mikroliter DMPG- Lösung zugegeben. Nach Mischen mit der Pipette läßt man das Gemisch gleichmäßig an den Wänden des Gefäßes durch Schrägrotation in Eis fest werden. Das molare Verhältnis des erhaltenen Gemisches beträgt 9 Teile Phosphatidylcholinderivat (DMPC, DPPC oder DSPC) und 1 Teil DMPG.
Die geöffneten Gefäße werden dann in einen sterilen Container gegeben, und alles wird bei -20ºC bis zur Lyophilisierung konserviert. Die Lyophilisierung erfolgt während 6 Stunden. Nach langsamem Aufheben des Vakuums unter sterilen Bedingungen werden die Gefäße schnell verschlossen und versiegelt. Die so hergestellten Phospholipide erscheinen in Form einer gleichmäßigen Abscheidung auf den Gefäßwänden. Die Bildung von Liposomen wird danach durch Hydratisierung des Gemisches mit Hilfe von 1 ml der Lösung, die das zu verwendende Antigen enthält, durchgeführt.

BEISPIEL 2 - EINBAU UND RETENTION VON Sm28GST IN DIE/DEN LIPOSOMEN

Verwendetes Verfahren

Die Experimente wurden unter paralleler Verwendung einer nichtmarkierten Sm28GST- Lösung und einer mit radioaktivem Iod (¹²&sup5;I) markierten Sm28GST-Lösung, um die Messung der Inkorporation zu ermöglichen, durchgeführt. Rekombinantes Sm28GST (von der Firma TRANSGENE) wird durch Hydratisierung der trockenen Phospholipidpräparationen, die in Beispiel 1 erhalten wurden, mit einer Lösung, die Sm28GST enthält, in die Liposomen inkorporiert. Das Gemisch wird während 45 Sekunden bei einer Temperatur von 60ºC inkubiert. Das Gemisch wird dann geschüttelt oder in ein Ultraschallbad während 1 Minute gegeben und dann bei Raumtemperatur während 15 Minuten inkubiert. Die so gebildeten Liposomen, die das Sm28GST enthalten, sind einzellige Bläschen eines mittleren Durchmessers von etwa 600 nm.
Diese Liposomen werden dann bei großer Geschwindigkeit (13.000 UpM, 20 min) zentrifugiert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Dieser letzte Arbeitsschritt wird dreimal wiederholt, um jegliche Spur nicht in die Liposomen eingebauter radioaktiver Moleküle zu entfernen. Jeder Liposomen-Bodensatz wird zuletzt in einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung suspendiert. Die Menge an eingebautem Sm28GST wird dann durch Messung der 1-Radioaktivität bestimmt.
Die Liposomenpräparationen, die Sm28GST enthalten, werden bei 4ºC oder bei 37ºC während 7 Tagen inkubiert. Die Stabilität der verschiedenen Präparationen wird nach 1, 2, 3 und 7 Tagen durch Messung der 1-Radioaktivität im Überstand analysiert.
Das Erhitzen auf 60ºC des Sm28GST während einer bestimmten Zeit beinhaltet das Risiko, eine Degradation der dreidimensionalen Struktur des Proteins zu induzieren. Diese Denaturierung kann durch die Variation des Erkennens von Sm28GST nach Erhitzen durch verschiedene monoclonale Antikörper, die gegen die Hauptepitope des Proteins gerichtet sind, wie auch durch polyclonale Antikörper, die gegen das Gesamtmolekül gerichtet sind, nachgewiesen werden. Um das Risiko der Degradation zu bewerten, wurde Sm28GST während 5, 30 oder 60 Minuten auf 60ºC erhitzt, und dann wurde die Beibehaltung der Struktur durch monoclonale Antikörper, die gegen den N-terminalen Teil (Anti-24-43) oder C-terminalen Teil (Anti-190- 211) des Moleküls gerichtet sind, wie auch durch ein Serum, das gegen das Gesamtprotein gerichtet ist, verifiziert.

Ergebnisse

Der Einbau von Sm28GST in die verschiedenen Liposomen wurde bei 20ºC und bei 60ºC untersucht.
Der Prozentsatz des Einbaus von Sm28GST in die Liposomen (Verhältnis eingebautes Proteinfreies Protein) bei 20ºC ist wie folgt:
Der Prozentsatz des Einbaus von Sm28GST in die Liposomen (Verhältnis inkorporiertes Proteinfreies Protein) bei 60ºC ist wie folgt:
Der Einbau von Sm28GST in die Liposomen, die aus DMPC/DMPG oder DPPC/DMPG bestehen, ist typisch für eine Inkorporation des Proteins in die wäßrige Phase der Liposomenstruktur. Der Prozentsatz des Einbaus in die DSPC/DMPG-Liposomen zeigt eine Interaktion von Sm28GST mit der Phospholipiddoppelschicht des Liposoms. Diese Interaktion ist zwei felsohne auf zwei hydrophobe Bereiche des Proteins zurückzuführen (Aminosäuren 130-150 und 150-180). Im Fall einer Sm28GST-Lösung mit einer Konzentration von 5 mg/ml beträgt die in die DSPC/DPMG-Liposomen eingebaute Menge 25 Mikrogramm je 2 Mikromol Phospholipide.
Die Retention von Sm28GST in den drei Liposomentypen ist ausgezeichnet, da keine Freisetzung des Proteins im Überstand der Präparationen nach 7 Tagen Inkubation bei 4ºC oder bei 37ºC nachgewiesen werden konnte. Nach 40 Tagen ist die Retention immer noch höher als 99%.
Wie die Fig. 1 zeigt, führt das Erhitzen auf 60ºC von Sm28GST während 5 Minuten zu keiner Änderung der Antigenqualität des Moleküls. Eine Degradation der Struktur kann nach 30 Minuten Erhitzen nachgewiesen werden.
Die Inkorporation von Sm28GST in die Liposomen erfordert kein Erhitzen einer Dauer größer als 1 Minute, so daß die vorgeschlagene Herstellungsweise die Integrität des Moleküls schont.
Dieser Typ der Impfstoffkonstruktion ist besonders geeignet für die Impfung bei oraler Verabreichung.

BEISPIEL 3 - INTEGRATION VON Sm28GST IN DIE LIPIDDOPPELSCHICHT DER LIPOSOMEN

Verwendetes Verfahren

Sm28GST wird mit den Liposomen DMPC/DMPG, DPPC/DMPG oder DSPC/DMPG während 24 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Liposomen werden dann dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen, wie in Beispiel 2 angegeben, um jegliche Spur von freiem Sm28GST zu eliminieren. Die Kontrolle der Integration wird unter Verwendung von mit radioaktivem Iod markiertem Sm28GST durchgeführt. Die Menge des an die Liposomen gebundenen Proteins wird dann durch Messung der Radioaktivität nach 4 und 24 Stunden Inkubation bestimmt. Die drei verschiedenen Liposomenpräparationen, an die das Protein gebunden ist, werden bei 4 oder 37ºC während 7 Tagen inkubiert. Die Stabilität der Bindung von Sm28GST an den verschiedenen liposomalen Präparationen wird nach 1, 2, 3 und 7 Tagen, wie in Beispiel 2 beschrieben, analysiert.

Ergebnisse

Die Bindung bzw. Fixierung von Sm28GST ist von der Länge der Phosphatidylcholinkette abhängig. Die Bindung an den Liposomen DMPC/DMPG und DPPC/DMPG ist schwach, wohingegen diejenige, die mit den Liposomen DSPC/DMPG beobachtet wird, stark ist (siehe Fig. 2). Diese Bindung an den Liposomen DSPC/DMPG ist nach 4 Stunden Inkubation fast maximal. Die Fixierung von Sm28GST ist besser, wenn die Reaktion bei einer Temperatur von 37ºC stattfindet.
Die Stabilität dieser Präparationen ist bemerkenswert, da das Ablösen von Sm28GST von der Oberfläche der verschiedenen liposomalen Präparationen nach 7 Tagen Inkubation bei 4 oder 37ºC vernachlässigbar ist.
Dieser Typ der Impfstoffkonstruktion ist für Impfung auf nasalem Wege geeignet.

BEISPIEL 4 - FIXIERUNG VON BIOTINYLIERTEM Sm28GST MIT LIPOSOMEN, DIE PHOSPHATIDYL-ETHANOLAMIN-BIOTIN-AVIDIN ENTHALTEN

Verwendetes Verfahren

Mit radioaktivem Iod (1251) markiertes und an Biotin gekoppeltes (Verhältnis 1/1) Sm28GST wird während 24 Stunden bei 37ºC mit verschiedenen Liposomenpräparationen (DMPC/DMPG, DPPC/DMPG, DSPC/DMPG) in Gegenwart von 0, 5 oder 10 Mikrogramm an zuvor mit Avidin inkubiertes Biotin gekoppeltes (Verhältnis 1/1) Phosphatidylethanolamin inkubiert. Dieses Verfahren führt zu Bildung eines "Biotin-Avidin-Biotin"-Komplexes, der so die Fixierung von Sm28GST, gekoppelt an die Liposomenoberfläche, ermöglicht. Nach drei Waschschritten wird die Menge an fixiertem Sm28GST bestimmt.

Ergebnisse

Die Bindung von Sm28GST-Biotin an "Liposom-Biotin-Avidin" ist identisch, unabhängig von der Phospholipidzusammensetzung des Liposoms, und beträgt etwa 2 und 4 Mikrogramm je Mikromol Phospholipide, die 5 bzw. 10 Mikrogramm Phosphatidylethanolamin enthalten.
Dieser Typ der Impfstoffkonstruktion ist für eine Impfung auf nasalem Wege geeignet.

BEISPIEL 5 - ANTIGENIZITÄT VON IN LIPOSOMEN INKORPORIERTEM Sm28GST UND VERABREICHUNG AUF ORALEM WEG

Verwendetes Verfahren

Die Liposomen werden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt.
Die Tiere (OFI. C57b1/6 oder Balb/c-Mäuse) erhalten durch intestinale Gabe durch die Schlundsonde 0,25, 2,5 oder 25 Mikrogramm Sm28GST, das in Liposomen (Präparationen dosiert auf 0,25, 2,5 oder 25 Mikrogramm Sm28GST je zwei Mikromol Phospholipide) verschiedener Zusammensetzungen inkorporiert ist, 3-, 4- oder Smal in einem Ein-Wochen-Intervall. Die Antikörper verschiedener Isotypen, die gegen Sm28GST gerichtet sind, werden 1 Woche nach der letzten Verabreichung in dem Serum und der intestinalen Waschung bzw. Spülung dieser Mäuse gesucht. Eine Kontrolle wird durchgeführt durch Verwendung von Tieren, denen destilliertes Wasser verabreicht wurde.

Ergebnisse

a) Serumantikörper
Eine starke Anti-Sm28GST-Antikörperbildung wird im Serum nach drei Verabreichungen auf oralem Weg nachgewiesen (Fig. 3).
Die Fig. 3 zeigt die Intensität und das isotypische Profil der Serum-Antikörper- Antwort von Mäusen, die die Liposomen DSPC/DMPG, enthaltend 2,5 Mikrogramm Sm28GST (einmal pro Woche während drei Wochen), erhielten. Dieses Profil zeigt, daß die Formulierung, wie auch der Verabreichungsweg (oral) eine T-Antwort vom Th2-Typ induziert. Im übrigen wird eine Bildung von Antikörpern des IgA-Typs beobachtet.
Diese Antikörperantwort ist für DSPC/DMPG und DPPC/DMPG im Hinblick auf die Amplitude und das isotypische Profil identisch. Eine niedrigere Serumantwort wird mit DMPC/DMPG erhalten, jedoch mit einem vergleichbaren isotypischen Profil.
b) Sekretorische Antikörper
Der Nachweis von Antikörpern vom IgA-Typ in den intestinalen Sekretionen zeigt, daß die Verabreichung von Liposomen, die Sm28GST enthalten, eine gute sekretorische Antwort induziert. Während freies Sm28GST, das oral verabreicht wird, keinerlei sekretorische Antwort induziert, führen die drei Liposomen-Sm28GST-Formen zu vergleichbaren und starken sekretorischen Antworten (Fig. 3bis).
Die Antikörperantwort, alle Isotypen zusammen(genommen), die nach vier Verabreichungen erhalten wird, ist ein wenig stärker als diejenige, die nach drei Verabreichungen erhalten wird. Fünf Verabreichungen führen nicht zu einer statistisch verschiedenen Antwort im Vergleich zu derjenigen, die nach vier Verabreichungen erhalten wurde.

BEISPIEL 6 - SCHUTZ GEGEN EINE SCHISTOSOMA MANSONI-INFEKTION BEI DER MAUS NACH IMPFUNG AUF ORALEM WEGE UNTER VERWENDUNG VON Sm28GST, DAS IN LIPOSOMEN INKORPORIERT IST

Verwendetes Verfahren

Unter Verwendung des Verabreichungsprotokolls, das in Beispiel 5 angegeben ist, erhielten die Mäuse (C57B1/6, 6 Wochen, weiblich) drei Verabreichungen auf oralem Wege (2,5 oder 25 Mikrogramm Sm28GST für jede Verabreichung) von Sm28GST, enthalten in den Liposomen DPPC/DMPG, die gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren erhalten wurden. Fünfzig Tage nach der ersten Verabreichung wurden die Mäuse (auf transkutanem Weg) mit 100 Schistosoma mansoni-Zerkarien aus Guadeloupe infiziert. Hundert Tage später wurde eine vollständige Perfusion durchgeführt, um die adulten Würmer zu erhalten. Die Leber wie auch der Dünndarm eines jeden Tieres wurden entnommen und mit einer Kaliumhydroxidlösung verdaut, um die Beladung mit Eiern zu bestimmen.

Ergebnisse

Die Immunisierung von Mäusen mit 25 Mikrogramm Sm28GST in den Liposomen führt zu einem Schutz gegen eine Schistosoma mansoni-Parasiteninfektion, wie durch die Verminderung der Beladung mit Würmern (Fig. 4a) und durch eine Verringerung der Anzahl von Eiern (Fig. 4b) bewiesen wurde.
Eine signifikante Verminderung (p < 0,01) von 52,3% der Anzahl der Würmer wird in der Gruppe von Mäusen erhalten, die 25 ug Sm28GST in Form von Liposomen erhielten, wohingegen die Mäuse, die 2,5 ug Sm28GST in Form von Liposomen erhielten, eine nichtsignifikante Verminderung der Wurmbeladung von 22% zeigten. Die Beladung mit Eiern ist ebenfalls in starkem Maße in der Gruppe von Mäusen vermindert, die mit 25 ug Sm28GST, das in den Liposomen enthalten war, immunisiert wurden. Diese Verringerung beträgt 53% und zwar sowohl in der Leber wie auch im Darmgewebe.

BEISPIEL 7 - NASALE IMPFUNG

Untersuchungen zur nasalen Impfung wurden mit Dosierungen von 25 ug Sm28GST durchgeführt, die in Form von den Liposomen DSPC/DMPG, die im Verfahren von Beispiel 2 erhalten wurden, verabreicht wurden. Die C57b1/6-Mäuse erhielten auf nasalem Weg 3mal mit einer Woche Abstand 25 ug freies oder in die Liposomen integriertes Sm28GST in Lösung in einem PBS-Puffer. Die Kontrollmäuse erhielten das gleiche Volumen PBS. Die Eintröpfelung in die Nase wird bei Vollanästhesie durchgeführt, und das Volumen je Verabreichung beträgt 50 ul.
Die Ergebnisse zeigen, daß freies Sm28GST, wenn es auf nasalem Weg verabreicht wird, in der Lage ist, eine Serumantwort in der Größenordnung von 20 ug/ml Antikörper vom IgG1-Typ hervorzurufen. Dagegen führt die Inkorporation von Sm28GST in die Liposomen DSPC/DMPG, alles auf nasalem Weg verabreicht, zu einer sehr starken Antwort des Th2- Profils, was bei der Maus der bevorzugten Expression auf der serologischen Ebene der Isotypen IgG1 und IgG2b entspricht.
Dieses wird in der Fig. 5a dargestellt, die die Aufteilung der verschiedenen IgG1-, IgG2a-, IgG2b- und IgG3-Isotypen in der spezifischen Serumimmunantwort darstellt.
Diese Serumantwort wird von einer starken Antwort vom IgA-Typ auf der bronchoalveolären Ebene begleitet (die spezifischen IgA entsprechen wenigstens 1/10 der Gesamtbronchoalveolären IgA). Man beobachtet ebenso auf dieser Ebene einen starken Anteil spezifischer IgG 1. Dieses wird in der Fig. 5b dargestellt, die die spezifischen in den bronchoalveolären Waschungen nachgewiesenen IgA und IgG1 darstellt.

BEISPIEL 8 - IMPFUNG AUF SYSTEMISCHEM WEGE

Untersuchungen zur Impfung auf systemischen Wegen (intravenös, intramuskulär, subkutan) wurden mit Dosen von 25 ug Sm28GST, verabreicht in Form von Liposomen DPPC/DMPG oder DSPC/DMPG, die gemäß dem Verfahren des Beispiels 2 erhalten wurden, durchgeführt.
Die C57b1/6-Mäuse erhielten 3mal in einem Abstand von einer Woche 25 ug freies oder in die Liposomen integriertes Sm28GST in Lösung in einem PBS-Puffer.
Die Verabreichung wurde durch Injektion auf intravenösem Wege, auf intramuskulärem Wege oder auf subkutanem Wege vorgenommen. Die Injektion wurde unter Anästhesie vorgenommen, und das injizierte Volumen betrug 0,2 ml, unabhängig von dem Injektionsweg. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß durch die drei systemischen Injektionswege die mit Sm28GST beladenen Liposomen gleichzeitig eine Serum- und eine sekretorische Immunantwort induzieren, wohingegen unter den gleichen Bedingungen freies Sm28GST in PBS keinerlei spezifische Antikörperbildung induziert.
Der intravenöse Weg scheint für die beiden verwendeten Liposomenformulierungen der am meisten adäquate Weg zu sein; tatsächlich führt die intravenöse Injektion von Sm28GST in Form von Liposomen zu einer starken und dauerhaften (dargestellt bis über 70 Tage hinaus) Serumantwort vom Th2-Profil und dies für die beiden getesteten Liposomenformulierungen, d. h. DPPC/DMPG und DSPC/DMPG. Dies wird in der Fig. 6a dargestellt, die die Aufteilung der verschiedenen IgG1-, IgG2a-, IgG2b- und IgG3-Isotypen in der spezifischen Serumimmunantwort nach intravenöser Injektion der beiden Liposomenformulierungen zeigt.
Diese Serumantwort wird im übrigen von einer starken sekretorischen Antwort begleitet, die durch die bronchoalveolären Sekretionen und die vaginalen Sekretionen nachgewiesen wird, jedoch nicht in den intestinalen Sekretionen (Fig. 6b). Dies wird durch die Fig. 6b gezeigt, die die Menge spezifischer IgA in den intestinalen (LI), bronchoalveolären (LBA) und vaginalen (LV) Waschungen nach intravenöser Injektion der beiden Liposomenformulierungen zeigt.
Der Haupttyp der sekretorischen Antwort, d. h. bronchoalveolär oder vaginal, variiert andererseits gemäß dem Typ der verwendeten Liposomen. Sm28GST in Form der Liposomen DPPC/DMPG favorisiert eine vaginale Sekretion spezifischer IgA, wohingegen Sm28GST in Form von Liposomen DSPC/DMPG die spezifische IgA-Sekretion auf der bronchoalveolären Ebene favorisiert.

Claims

1. Verwendung einer Liposomenpräparation, gebildet aus einer oder mehreren Lipiddoppelschicht(en), die aus einem Gemisch eines Phospholipids (I), dessen Fluiditätstemperatur zwischen 20 und 25ºC liegt, und einem Phospholipid (II), dessen Fluiditätstemperatur zwischen 20 und 60ºC liegt, wobei das molare Verhältnis zwischen dem Phospholipid (I) und dem Phospholipid (II) zwischen 5 : 95 und 30 : 70 liegt, gebildet ist bzw. sind, als aktives Immunadjuvansprinzip, um Impfstoffe zu erhalten.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Phospholipid (I) Dimyristoylphosphatidylglycerin ist, und daß das Phospholipid (II) aus der Gruppe bestehend aus Dimyristoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin ausgewählt ist.

3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das molare Verhältnis zwischen dem Phospholipid (I) und dem Phospholipid (II) zwischen 5 : 95 und 15 : 85 liegt.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Liposomenpräparation verwendet wird, um einen Impfstoff zu erhalten, der oral verabreicht werden kann.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Liposomen präparation verwendet wird, um einen Impfstoff zu erhalten, der intranasal verabreicht werden kann.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Liposomenpräparation verwendet wird, um einen Impfstoff zu erhalten, der durch intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Injektion verabreicht werden kann.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Liposomenpräparation verwendet wird, um einen Impfstoff zu erhalten, der eine Immunantwort vom sekretorischen IgA-Typ induziert.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Liposomen präparation verwendet wird, um einen Impfstoff zu erhalten, der eine Immunantwort vom cellulären Typ induziert.

9. Immunmodulatorische Zusammensetzung, insbesondere eine Immunadjuvanszusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definierten Liposomenzusammensetzung gebildet wird.

10. Immunogene Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definierten Liposomenpräparation gebildet wird, wobei die Liposomen mit mindestens einem Antigen, gegen welches spezifische Antikörper gebildet werden sollen, assoziiert sind.

11. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen, gegen welches spezifische Antikörper gebildet werden sol len, das Protein Sm28GST oder ein immundominantes Peptid dieses Proteins ist.