DE69229703T2

DE69229703T2 - Wiederhergestellte Influenza-Virosomen mit immunostimulierenden und immunoverstärkenden Eigenschaften und diese enthaltende Impfstoffe

Info

Publication number: DE69229703T2
Application number: DE69229703T
Authority: DE
Inventors: Reinhard Glueck; Robert Mischler
Original assignee: Schweiz Serum und Impfinstitut und Institut zur Erforschung der Infektionskrankheiten
Current assignee: Cilag GmbH International
Priority date: 1991-05-08
Filing date: 1992-05-08
Publication date: 2000-04-27
Anticipated expiration: 2012-05-09
Also published as: US5565203A; DE69229703D1; AU655823B2; DK0538437T3; GR3031520T3; ATE182791T1; JPH06500128A; AU1745692A; ES2135406T3; EP0538437A1; EP0538437B1; CA2086831A1; CA2086831C; WO1992019267A1

Description

Wiederhergestellte Influenza-Virosomen mit immunostimulierenden und immunoverstärkenden Eigenschaften und diese enthaltende Impfstoffe

Die Erfindung betrifft, immunstimulierende und immunverstärkende rekonstituierte Influenza-Virosomen (IRIVs) und diese enthaltende Impfstoffe.
Ein breites Spektrum von Verfahren zur Erhöhung der Immunogenität wurde über mehrere Jahrzehnte durch stark empirisch orientierte Vorgehensweisen entwickelt. Die wirksamsten Verfahren (z. B. Verabreichung des Immunogens zusammen mit komplettem Freundschem Adjuvans) kombinieren eine Reihe von in den nachstehenden Abschnitten erläuterten getrennten Prinzipien:

(A) Umwandlung des Antigens in Partikelform

Partikel sind für Makrophagen attraktiver als lösliche Antigene und beeinflussen das Gleichgewicht zugunsten einer Immunität statt einer Suppression. Die Partikelbildung kann von einer einfachen hitzeinduzierten Aggregation bis zu komplizierten Polymerisationsstrategien, einschließlich der für Antigene charakteristischen Selbstaggregation, wie dem löslichen Antigen des Hepatitis B-Virus, variieren. Bei Liposomen oder Öltröpfchen gibt es eine kombinierte Wirkung von Partikelbeschaffenheit und langsamer Absorption, wie bei einer Alaun-Präzipitation.

(B) Chemische Immunpotenzierung

Auf einer langen Forschungsgeschichte beruht die Suche nach einem reinen, sicheren, effektiven und nicht-toxischen kleinen organischen Molekül, das die Potenzierung der gesamten mit abgetöteten Mycobacterium tuberculosis-Bakterien oder toxischen mikrobiellen Extrakten, wie E. coli-LPS, erreichbaren Immunantwort imitiert. Kein allgemein anerkanntes zufriedenstellendes Mittel wurde zur Verwendung in Menschen gefunden und eine Aufhebung des Zusammenhangs von Toxizität und Effizienz ist schwer zu erreichen.

(C) Gemeinsame Verabreichung mit Interleukinen

Es gibt einige Befunde, daß die gemeinsame Verabreichung von beispielsweise IL-2 mit einem Antigen zu einer größeren Erhöhung der Immunantwort als die getrennte Verabreichung des Antigens und des Interleukins führen kann; vgl. Staruch, M. J., und Wood, D. D., J. Immunol: 130 (1983), 2191. Bevor diese Vorgehensweise als Immunisierungsstrategie am Menschen anwendbar ist, sind weitere intensive Untersuchungen erforderlich. Sie kann jedoch durch die in den nachstehenden Abschnitten eingeschlossenen Vorschläge überholt sein.

(D) Verlangsamung der Freisetzung des Immunogens

Die plötzliche Verabreichung großer Dosen von reinen Proteinantigenen schließt das Risiko der Aktivierung der Suppressorwege in den Immunantworten besonders bei Verwendung des intravenösen Weges ein; vgl. Nossal, G. J. V., New Generation Vaccines, Marcel Dekker, Inc. New York, Basle (Hrsg. Woodrow, Levine) (1990) 85. Die langsame Freisetzung von einer subcutanen Depotstelle ermöglicht dem Antigen einen extensiven Zugang zu den weit verstreuten dendritischen Zellen und Makrophagen, und es stellt ferner sicher, daß das Antigen nach dem anfänglichen clonalen Proliferationsschub noch verfügbar ist, wodurch einige Aspekte einer sekundären Antwort möglich werden. Eine langsame Freisetzung wird begünstigt durch Adsorption von Antigenen auf Aluminiumhydroxid ("Alaunausfällung"); Zugabe der Antigene in Wasser-in-Öl- Emulsionen; Einschluß von Antigenen in Liposome; und weitere ähnliche Manipulationen. Dieses Verfahren gleicht von seinem Konzept her dem in Abschnitt A beschriebenen.

(E) Gemeinsames Präsentieren der Antigene mit einem stark immunogenen Wirkstoff

Bei einer starken Immunogenität eines bestimmten Impfstoffs kann die Adjuvans- Wirkung dieses Impfstoffs und auch die Eigenschaften, die er zur Lenkung der Antwort in einen bestimmten immunologischen Weg besitzt, in eine Antwort gegen ein mit ihm zusammen verabreichtes Antigen übergehen. Beispielsweise sind abgetötete Bordetella pertussis- oder Corynebacterium parvum-Bakterien starke Immunogene; bei der Verabreichung eines reinen Proteins mit der gleichen Injektion ist die Antwort dagegen erhöht. Bestimmte Immunogene (aus unbekannten Gründen) leiten die Antwort in bestimmte Richtungen. Beispielsweise rufen Extrakte eines Parasiten, wie Nippostrongylus brasiliensis, starke IgE-Antworten hervor. Zusammen mit den Parasitenextrakten verabreichte reine Proteine rufen ebenfalls eine IgE-Antwort hervor; vgl. Nossal, G, J. V., New Generation Vaccines, Marcel Dekker, Inc., New York, Basle (Hrsg. Woodrow, Levine), (1990), 85. Vermutlich ist diese Wirkung irgendwie mit der Produktion von bestimmten Lymphokinen verbunden, die durch bestimmte Wirkstoffe induziert wird. Diese Lymphokine, wie IL-4, lenken Isotyp-Umschalt-Muster. Die polyclonalen aktivierenden Charakteristika von Lymphokinen können auch die Basis für die Erhöhung der Immunantworten allgemein bilden.

(F) Genetisch manipulierte Mikroorganismen als Träger von Genen für wichtige Antigene

Die Vorstellung von genetisch manipulierten Mikroorganismen als Antigengenträger wurde durch Panicali, D., und Paoletti, E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 4927, und Smith, G. L., Macket, M. und Moss, B., Nature 302 (1983), 490, vorangetrieben, die das Genom des Vaccinia-Virus genetisch manipulierten, damit es auch Gene einschloß, die wichtige Wirt-schützende Antigene von verschiedenen Pathogenen codieren. Diese werden durch die infizierte Zelle zusammen mit den Vaccinia-Virus-Partikeln und Antigenen synthetisiert. Eine Verbesserung dieses Konzepts wurde von Langford, C. J., Edwards, S. J., Smith, G. L. et al., Mol. Cell. Biol. 6 (1986), 3191, eingeführt. Mit der Vorstellung im Bewußtsein, daß Zelloberflächen-assoziierte Antigene mit größerer Wahrscheinlichkeit eine stärkere T-Zell-Antwort als sezernierte Antigene hervorrufen, wurde eine DNA-Sequenz, die die Transmembrandomäne einer schweren Immunglobulin- Kette codiert, mit dem Gen, das das lösliche S-Antigen von Plasmodium falciparum codiert, verknüpft und das erhaltene Hybridgen in das Genom eines Vaccinia-Virus insertiert. Das Konstrukt bewirkte eine signifikant erhöhte Immunogenität. Lebende Salmonella-, BCG- und Masern-Viren wurden ebenfalls erfolgreich zur Expression von Fremdantigen verwendet. Daher können die Vorteile eines abgeschwächten Lebendimpfstoffs mit denen eines Impfstoffs auf der Basis von rekombinante DNA enthaltenden Viren kombiniert werden.
Eine weitere Entwicklung dieser Vorstellung ist die Insertion von Genen für verschiedene Interleukine in genetisch manipulierte Vaccinia-Viren, die bereits Gene für wichtige Antigene tragen. Beispielsweise kann die Immunantwort auf das Vaccinia-Virus selber durch Insertion des IL-2-Gens in das Virusgenom deutlich erhöht sein, was die Genesung von immundefizienten Mäusen von einer ansonsten tödlichen Infektion ermöglicht (LA. Ramshas, M. E. Andrew, M. Philips et al., Nature 329 (1987), 545).

(G) Hydrophobe Anker und immunstimulierende Komplexe

Grenzflächenaktive Mittel, wie Saponin oder Quil A®, wurden in immunstimulierenden Komplexen (Iscoms) in einer Reihe von experimentellen und veterinären Impfstoffen verwendet. Sie verbesserten die Immunogenität von mehreren Antigenen, besonders von viralen Membranproteinen.
Sämtliche vorstehend beschriebenen "Adjuvans-Zugabe-Verfahren" haben mehrere Nachteile.
Die Alaunfällung ist aufgrund der unerwünschten Nebenwirkungen, wie lokale Reaktionen, und ihres Entzündungs-fördernden und encephalopathogenen Potentials nachteilig. Grenzflächenaktive Mittel zeigen eine Reihe von Nebenwirkungen: Sie sind reizend, Entzündungs-fördernd, sie binden an Cholesterin und lysieren Zellen. Interleukine können systemische Reaktionen provozieren, und daher kann eine Routineverwendung in Massenimpfungen unerwünscht sein.
Sicherheitserwägungen verhinderten die Verwendung von genetisch manipulierten Mikroorganismen als Träger von Genen für wichtige Antigene im Menschen. Das Zeigen des Antigens gemeinsam mit einem stark immunogenen Wirkstoff ist nur mit einer begrenzten Klasse von kleinen Peptiden durchführbar. Die Überführung des Antigens in Partikelform geht häufig parallel mit einem signifikanten Verlust der Menge an Antigen. Die immunstimulatorische Wirkung des Liposom-assoziierten Antigens auf die humorale Immunantwort ist ein breit anerkanntes Phänomen, die Immunpotenzierung ist jedoch begrenzt, und der Mechanismus, durch den diese Potenzierung erfolgt, ist bisher nicht vollständig aufgeklärt worden.
Das Dokument EP-A 0 356 339 (The Liposome Company) offenbart die Herstellung von Liposomen, die im Inneren das Bromelain-Fragment des Hämagglutinins enthalten. Im Gegensatz zur Immunisierung mit den erfindungsgemäßen IRIVs ist ein Priming- Schritt zur Erzeugung einer Immunantwort wesentlich. Dies scheint an der Tatsache zu liegen, daß das verwendete HA wahrscheinlich nicht vollständig biologisch aktiv ist, da ihm der Transmembranbereich fehlt. Ferner kann es aufgrund seiner Lage im Inneren nicht die Lyse des Liposoms mit zellulären Membranen induzieren.
US-A 4,663,161 (Mannino et al.) offenbart ein Virosomkonstrukt, das durch Extraktion von viralen Glycoproteinen mit β-D-Octylglucopyranosid, das mindestens teilweise HA inaktiviert, erhalten wird. Daher ist das HA-Präparat im Mannino-Liposom nur in einem stark reduzierten Ausmaß, das negative Auswirkungen im Hinblick auf die Immunogenität dieser Liposome hat, biologisch aktiv.
EP-A 0 011 549 (Merck) stellt ebenfalls Bestandteile der äußeren Membran des Influenza-Virus umfassende Liposome bereit. Das Virus-Präparat wird durch Inaktivierung des Virus durch eine Formalinbehandlung erhalten. Diese Behandlung inaktiviert HA.
EP-A 0 047 480 (Institut Armand Frappier) offenbart eine Immunosom-Konstruktion mit viralen Antigenen. Die viralen Antigene werden wie im von Mannino et al. verwendeten Verfahren mit β-D-Octylglucopyranosid extrahiert, und es wird daher erwartet, daß es den HA-Bestandteil inaktiviert.
US-A 4,148,876 (Almeida et al.) offenbaut unilamellare Mikrovesikel, die vom Virus stammende Proteine auf der Oberfläche umfassen. Almeida et al. verwendeten Nonidet P40R zur Solubilisierung von Influenza-Virus-Untereinheiten. Es wird ferner erwartet, daß dieses Detergens die biologische Aktivität von HA signifikant reduziert.
Harter et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), 6459-6464, untersuchten die molekularen Details der Virusinduzierten Membranfusion. Diese Untersuchung lieferte den Nachweis, daß ein NH&sub2;-terminaler Rest aus 21 Aminosäuren (Fusionspeptid) von HA nur für die hydrophobe Interaktion von HA mit Membranen verantwortlich ist und daß dieser Abschnitt eine helikale Konformation nach einer Bindung an zwei Membranen annehmen kann.
Daher ist das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem die Bereitstellung von immunstimulierenden und immunverstärkenden Mitteln, die die vorstehend beschriebenen Nachteile nicht zeigen.
Die Lösung für das vorstehend beschriebene technische Problem wird durch Bereitstellung der immunstimulierenden rekonstituierten Influenza-Virosomen (IRIVs) und Impfstoffe, die diese in den Ansprüchen charakterisierten IRIVs enthalten, erreicht. Diese IRIVs können als Vehikel verwendet werden, die die gewünschten Antigene von Pathogenen (oder vollständigen Pathogenen) zu den Antigen-präsentierenden Zellen aktive transportieren, wie Makrophagen oder B-Zellen, die dann diese Antigene in einer zur Induktion einer Immunantwort geeigneten Weise dem Immunsystem präsentieren.
Daher werden IRIVs bereitgestellt, die die nachstehend beschriebenen Bestandteile enthalten:
(a) ein Gemisch von Phospholipiden, wobei dieses Gemisch mindestens zwei Verbindungen aus der Gruppe von Glycerophospholipiden und Cholesterin enthält;
(b) im wesentlichen rekonstituierte funktionelle Virushüllen, umfassend ein Influenza- Hämagglutininprotein (HA) oder ein Derivat davon, das im wesentlichen die volle biologische Aktivität von natürlichem HA zeigt und fähig ist, die Fusion des IRIV mit zellulären Membranen zu induzieren und die Lyse der IRIV nach Endocytose durch Antigen-präsentierende Zellen, vorzugsweise Makrophagen oder B-Zellen, bei einem pH von etwa 5,0 zu induzieren; und
(c) ein zusätzliches Antigen, das abgeleitet ist von einem Pathogen oder das ein antiidiotypischer Antikörper gegen einen Pathogen-spezifischen Antikörper oder ein Toxin oder Toxoid ist.
Das "Gemisch von Phospholipiden" von Merkmal (a) enthält natürliche oder synthetische Phospholipide oder ein Gemisch davon. Es enthält mindestens zwei verschiedene Verbindungen, die aus der Gruppe der Glycerophospholipide, wie Phosphatidylcholin oder Phosphatidylethanolamin, und Cholesterin ausgewählt werden. Phosphatidylcholin oder Phosphatidylethanolamin sind bevorzugt, insbesondere in einem Verhältnis von 4 : 1. In bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen ist das Verhältnis dieses Gemisches von Phospholipiden (a) zu diesen im wesentlichen rekonstituierten funktionellen Virushüllen (b) etwa 1 : 1 bis etwa 20 : 1. Am meisten bevorzugt ist es etwa 10 : 1.
Der Begriff "im wesentlichen rekonstituierte funktionale Virushüllen" meint rekonstituierte Influenza-Virushüllen, denen im wesentlichen die Bestandteile fehlen, die üblicherweise innerhalb (unter) des (dem) Membran-Teil(s) der Influenza-Virushüllen vorkommen. In einer bevorzugten Ausführungsform zeigen die im wesentlichen rekonstituierten funktionalen Virushüllen die Form einer unilamellaren Doppelschicht. Ein Beispiel für einen solchen fehlenden Bestandteil ist das Matrixprotein der natürlichen Influenza-Virushülle.
Der Begriff "biologisch aktives HA oder ein Derivat davon" als Bestandteile der erfindungsgemäßen IRIVs meint HAs oder Derivate davon, die im wesentlichen die volle biologische Aktivität des natürlichen HA zeigen und daher die Adsorption der erfindungsgemäßen IRIVs an ihre Zielzellen über Sialinsäure-enthaltende Rezeptoren vermitteln. Ferner können diese HA-Bestandteile durch zirkulierende anti-Influenza- Antikörper erkannt werden. Diese biologische Aktivität ist ein wesentliches Merkmal der erfindungsgemäßen IRIVs.
Daher kann die Funktion des HA-Bestandteils der erfindungsgemäßen IRIVs, wie nachstehend beschrieben, erläutert werden:
(1) er bindet an einen Sialinsäure (N-Acetylneuraminsäure) enthaltenden Rezeptor auf einer Zielzelle zur Initiierung der Virosom-Zell-Interaktion; und
(2) er vermittelt den Eintritt der IRIVs in das Cytoplasma durch ein Membran-Fusions- Ereignis und führt so schließlich zur Freisetzung des transportierten Antigens;
(3) er dient als "Erkennungsantigen", da die meisten Menschen für HA aufgrund einer früheren Exposition durch Erkrankung oder Impfung als "geprimt" angesehen werden können.
Daher ist das wesentliche Merkmal der IRIVs, daß sie auf ihrer Oberfläche neben dem Antigen dieses biologisch aktive virale Glycoprotein (HA) oder ein Derivat davon tragen. Dieser Bestandteil der erfindungsgemäßen IRIVs induziert ihre unmittelbare Fusion mit zellulären cytoplasmatischen Membranen und eine schnelle Freisetzung des transportierten Antigens, z. B. in die Membranen dieser Zellen. Daher wird ein unerwünscht langer Aufenthalt des transportierten Antigens in den Endocytosomen, wo sie unspezifisch abgebaut werden können, vermieden.
Die Tatsache, daß ein Antigen für Makrophagen und andere zusätzliche Zellen schmackhaft sein soll, ist ausschlaggebend. Zu diesem Zweck ist die Partikel-Natur der IRIVs vorteilhaft, da sie wie alle Mikroorganismen eine Partikel-Einheit ist. Die Gegenwart von Antikörpern in menschlichen Körpern (im Fall von Influenza haben alle Menschen Antikörper gegen das Influenza-Antigen. Diese Antikörper stammen entweder von einer vorherigen Influenza-Infektion oder von einer Impfung) erhöht die Geschwindigkeit des Eintritts von Antikörper-gebundenen Antigenen nicht nur in Makrophagen sondern auch in lymphoide Follikel, in denen Antigene langfristig in einer extrazellulären Lage auf der Oberfläche der follikularen dendritischen Zellen verbleiben. Dieses Verfahren des Eintritts in Makrophagen und lymphoide Follikel wird als Opsonierung bezeichnet.
Die Bindung von Antikörpern hat eine weitere Konsequenz für die Immunogenität von Antigenen. Während ein bestimmtes Antigen, A, in Lösung nur an B-Zellen bindet, die Antikörpermoleküle der Spezifität anti-A auf ihrer Oberfläche zeigen, können Immunkomplexe an jede B-Zelle über den Fc-Rezeptor haften. Aufgrund der Fähigkeit von B-Zellen in afferenten Lymphgefäßen zum Eintritt in B-Zellbereiche der Lymphknoten ist diese unspezifische Bindung über den Fe-Rezeptor wahrscheinlich ein Weg in einer natürlichen Infektion, durch den dieses Antigen in lymphoide Follikel und anderswo in lymphatisches Gewebe transportiert wird (Nossal, G. J. V., New Generation Vaccines (Hrsg. Woodrow, G. C., und Levine,, M. M.), Marcel Dekker, Inc., (1990), 85). Der Mechanismus ist ein Zusatz zum Transport durch Monocyten. Daher begünstigt die Gegenwart von Influenza-Antigenen auf der Oberfläche der IRIVs den immunologischen Mechanismus der Opsonierung.
In einer Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen IRIVs das vollständige HA, das als eine einzelne Polypeptidkette von 550 Aminosäuren synthetisiert wird, die anschließend durch Entfernung des Arginin 329 in zwei Ketten, HA&sub1; (36 334 Dalton) und HA&sub2; (25 750 Dalton), gespalten wird. Die se Ketten sind gegebenenfalls durch eine Disulfidbindung unter Beteiligung des Cysteins in HA&sub1;-Position 14 und des Cysteins in HA&sub2;-Position 137 kovalent verbunden, und die Monomeren aus zwei Ketten sind nichtkovalent assoziiert, wobei sie Trimere auf der Oberfläche der IRIVs bilden. Diese HA&sub1;- oder HA&sub2;-Peptide können von natürlichen oder synthetischen Quellen oder durch gentechnische Verfahren erhalten werden.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung IRIVs, in denen dieses Antigen von einem Teile davon einschließenden Pathogen stammt. Bevorzugte Beispiele für diese Pathogene sind ein Virus, Bakterium, Parasit, anti-idiotypische (anti-Id) Antikörper, die diese Viren, Bakterien oder Parasiten nachahmen, Antikörper gegen diese Viren, Bakterien oder Parasiten, oder ein Toxin. Beispiele für Viren sind Hepatitis A-, B-, C-, D- oder E-Virus, Polio-Virus, HIV, Tollwut-Virus, Influenza-Virus oder Parainfluenza-Virus. Beispiele für Bakterien sind Pseudomonas, Klebstella, E. coli, Salmonella typhi, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Clostridium tetani oder Corynebakterium diphtheriae. Ein Beispiel für einen Parasiten ist Plasmodium falciparum.
In einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist dieses Pathogen ein Hepatitis A-Virus (HAV). Ein besonders bevorzugtes HAV ist der HAV- Stamm RG-SB XA112, der gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) des Pasteur-Instituts am 11. April 1991 unter der Hinterlegungsnummer I-1080 hinterlegt wurde.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen IRIVs das VP1, VP2, VP3, VP4 oder das Kernprotein dieser HAVs als Antigen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen IRIVs liegt das Antigen in der Membran. Das inaktivierte HAV-Antigen oder eine Untereinheit davon ist gegebenenfalls an die Oberfläche des IRIV gekoppelt. Dies kann durch eine kovalente Bindung des Antigens an ein geeignetes Vernetzermolekül (z. B. N-Succinimidyl-3-(2- pyridyldithio)propionat, SPDP) oder durch spontane lipophile Bindung an verschiedene Phospholipide oder Glycolipide in der Membran des IRIV erreicht werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Antigens wird vorzugsweise das inaktivierte HAV-Antigen oder eine Untereinheit davon auf der Oberfläche von IRIVs in einer nicht-kovalenten Weise adsorbiert.
In einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist dieses HA- Derivat das Influenza-HA-Fusionspeptid. Da die Fusion des Antigenträgers IRIV mit der Zellmembran der immunkompetenten Zellen ein fundamentales erfindungsgemäßes Prinzip ist, reicht das Influenza-HA-Fusionspeptid allein zur Induktion der Freisetzung des Antigens aus. Dies ist möglich, da die Freisetzung bei einem pH-Wert erfolgt, der für das Innere von Endocytosomen charakteristisch ist. Der pH-Wert in den Endocytosomen, z. B. in Makrophagen, wurde als etwa 5,0 ermittelt (Wiley, D. C. und Skehel, J. J., Ann. Rev. Biochem. 56 (1987), 365). Bei einem pH-Wert von 5 werden die Influenza-HA- Fusionspeptide auf der Oberfläche der IRIVs in der gleichen Weise wie beim natürlichen Influenza-Virus aktiviert.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen ein erfindungsgemäßes IRIV enthaltenden Impfstoff Diese Impfstoffe enthalten gegebenenfalls auch einen geeigneten pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel. Diese Impfstoffe können auf üblichen Wegen und in üblichen Dosierungen verabreicht werden.
Die Figuren zeigen:
Fig. 1: Elektronenmikrogramm von IRIV
Elektronenmikrogramm der Rekonstitutionsprodukte, die mit Phosphorwolframsäure vor der Bindung des Antigens an die Oberfläche der IRIVs negativ gefärbt waren: Gemischte Phospholipide sind mit biologisch voll aktiven Influenza-Hämagglutinin- Glycoprotein-Trimer-Spikes besetzt.
Fig. 2: Prinzip des Verfahrens zur Herstellung von IRIVs
(a) Intaktes Influenza-Virus
(b) Gemisch von Phospholipiden
(c) Intakte, inaktivierte Hepatitis A-Virionen
(d) Lösliche Influenza-Spike-Untereinheit-Antigene, die die HA- und viralen Phospholipide enthalten
(e) Phospholipid-Membranen ohne Antigene
(f) Kovalent gebundene Vernetzer auf der Oberfläche des HAV-Antigens
(g) IRIV, das die rekonstituierte Membran mit Phospholipiden enthält, die von Viren und anderen Phospholipiden extrahiert werden, die die Influenza-Spike-Proteine, einschließlich HA und das HAV, auf der Oberfläche tragen.
Fig. 3: Verträglichkeit von Hepatitis A-Impfstoffen. Vergleich von IRIV-HAV- Impfstoffen mit Al-HAV-Impfstoffen.
Fig. 4: Immunogenität von Hepatitis A-Impfstoffen. Vergleich von IRIV-HAV- Impfstoffen mit Al-HAV-Impfstoffen.
Fig. 5: Biologische Fusionsaktivität von verschiedenen rekonstituierten Influenza- Vesikeln.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung von IRIVs mit nicht-kovalent an ihre Oberfläche gebundenem Hepatitis A- Virus-Antigen

(A) Eine Dispersion von Phosphatidylcholin (z. B. Lecithin, SIGMA) (75%), Phosphatidylethanolamin (Sigma) (20%) und Cholesterin (SIGMA) (S%) (alle Phospholipide 1 bis 2% (Gew./Vol.) = 0,013 bis 0,027 M) in 0,1 M NaCl, das 0,01 M Tris/HCl, pH 7,3, enthielt, wurde durch Vermischen dieser Verbindungen mit einem VIRTIS®-Homogenisator hergestellt. Natriumcholat, rekristallisiert als die Säure aus Aceton/Wasser 4 : 1 (Vol./Vol.), wurde zur milchigen Dispersion in einer Endkonzentration von mindestens 0,03 M (1,3%) zugesetzt, die zur Auflösung der in nicht-Ultraschallbehandelten Phospholipid-Dispersionen vorhandenen multilamellaren Strukturen erforderlich ist.
Ein Pellet des gereinigten Influenza-Virus 90 A/Taiwan (0,002 M Membranphospholipide des Virus) wurde in 700 ml 0,1 M Octaethylenglycolmono(n- dodecyl)ether (C&sub1;&sub2;E&sub8;) (Nikko Chemicals (Tokyo)) in einem Puffer solubilisiert, der 7,9 mg NaCl/ml, 4,4 mg/ml Trinatriumcitratdihydrat, 2,1 mg/ml 2- Morpholinoethansulfonsäuremonohydrat (MES) und 1,2 mg/ml N- Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure in H&sub2;O (mit 1N NaOH auf 7,3 eingestellter pH) enthielt. Das Gemisch wurde 30 min bei 170000 · g zentrifugiert und der Überstand, der Influenza-Spike-Proteine (HA) und virale Phospholipide enthielt, wurde dem vorstehenden milchigen Phospholipidgemisch zugesetzt.
Die ganze Suspension wurde mindestens eine Stunde bei niedriger Temperatur (4ºC) gerührt. Anschließend wurde die Suspension auf eine Sephadex® G-50 (mittlere Partikelgröße)-Säule (80 · 15 cm) aufgetragen, die mit dem gleichen Puffer wie zur Herstellung der Phospholipiddispersion bei 4ºC äquilibriert und eluiert wurde (Fließrate 320 ml/Std.). Die Säule war in ein Wasserbad eingebettet, das mit einem Ultraschallgerät (Bransonic®, Branson Europe BV, Frequenz 50 kHz ± 10%) verbunden war. Jede Minute wiederholte 10 Sekunden lange Ultraschallschocks lieferten kleine unilamellare IRIVs. Die Probenvolumen und Säulendimensionen waren so, daß eine vollständige Trennung der IRIVs, die mit dem leeren Volumen Vo und Cholatmizellen eluiert wurden, erreicht wurde. Die Retention von Cholat wurde mit ³H-markiertem Cholat (NEN Chemicals) getestet. Nach der ersten Sephadex® G-50-Chromatographie wurde weniger als 1% Cholat zurückbehalten, was ein molares Phospholipid/Cholat-Verhältnis von > 50 lieferte. Eine zweite Chromatographiedialyse 12 Stunden bei 4ºC reduzierte die Cholatmenge unter die Nachweisgrenze, was Phospholipid/Cholat-Verhältnisse > 500 (d. h. weniger als 10 Cholatmoleküle/IRIV) lieferte. Die Abwesenheit von restlichem C&sub1;&sub2;E&sub8; wurde durch einen üblichen Hämolysetest getestet: Die Menge war unterhalb der Nachweisgrenze (> 100 nM). Die IRIVs (Fig. 1) zeigten einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 100 nm und wurden mit dem HAV-Antigen in der nachstehenden Weise konjugiert: Eine gereinigte und inaktivierte HAV-Suspension, Stamm RG-SB XA112 (CNCM I-1080), die 1 mg HAV-Antigen enthielt, wurde durch. Ultrazentrifugation (4 Std., 100000 · g) pelletiert. Die vorstehend hergestellten IRIVs wurden dem Pellet zugesetzt. Nach der Resuspension wurde die Suspension bei 20ºC über Nacht (16 Stunden) gerührt. Das HAV- Antigen adsorbierte spontan durch Van-der-Waals-Kräfle auf der Oberfläche der IRIVs.
(B) Das gereinigte Intluenza-Virus A/Singapore/6/86 wurde in einem Puffer stabilisiert, der 0,1 M Octaethylenglycolmono(n-dodecyl)ether (Nikko Chemicals, Tokyo, Japan), 7,9 mg/ml NaCl, 4,4 mg/ml Trinatriumcitratdihydrat, 2,1 mg/ml MES und 1,2 mg/ml N-Hydroxylethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure, pH 7,3, enthielt. Dieses Gemisch wurde bei 100000 · g 30 Minuten zentrifugiert und der HA enthaltende Überstand gewonnen.
Phosphatidylcholin (PC; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und Phosphatidylethanolamin (PE; Sigma) (75% : 25% (Gew./Gew.)) wurden in 0,01 M Tris - 0,1 M NaCl, pH 7,3, suspendiert und homogenisiert. Rekristallisiertes Natriumcholat (Sigma) wurde zu einer Endkonzentration von 0,02 M zur Auflösung der multilamellaren Strukturen zugesetzt. Dieser Lösung wurde der HA enthaltende Überstand zugesetzt und die Suspension 1 Std. bei 4ºC gerührt. Die Suspension wurde auf eine Sephadex® G-50- Säule (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden), die in 0,01 M Tris - 0,1 M NaCl, pH 7,3, äquilibriert war, aufgetragen. Die versiegelte Säule wurde in ein Wasserbad gegeben. Während der Elution wurden Ultraschallschocks (50 kHz; 10 s/min) durch das Wasserbad unter Verwendung eines Ultraschallbehandlungsgeräts (Bransonic®, Branson Europe BV, The Netherlands) geleitet. Das Leervolumen der IRIV enthaltenden Fraktionen wurde vereinigt und unter identischen Bedingungen erneut chromatographiert. Das IRIV besaß einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 150 nm.
Die gereinigte inaktivierte HAV-Suspension mit einer bekannten Menge von Antigen wurde 4 Std. bei 100000 · g zur Pelletierung des Virus zentrifugiert. Eine geeignete Menge der IRIV-Suspension wurde dem Pellet zugesetzt und durch Schütteln vorsichtig resuspendiert. Die Suspension wurde vorsichtig 48 Std. bei 20ºC gerührt, damit das HAV an der Oberfläche des IRIVs adsorbieren konnte. Diese Grundsuspension wurde mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4, zu einer Endkonzentration von 2 ug HAV-Antigen/ml verdünnt und in eine Flasche gefüllt.

Beispiel 2

Herstellung von IRIVs mit dem Membran-gebundenen HAV-Antigenen

Die Herstellung von IRIVs mit gebundenem HAV-Antigenen ist in Fig. 2 schematisch dargestellt.
Die IRIVs wurden gemäß Beispiel 1 mit den nachstehenden Modifikationen hergestellt:
Die HAV-Antigenmoleküle wurden an die IRIVs mit einem geeigneten Vernetzermolekül gebunden. Die nachstehenden Verfahren wurden verwendet:
(A) Phosphoethanolamin (PE) wurde mit N-Succinimidylpyridyldithiopropionat (SPDP, Pierce), wie nachstehend beschrieben, gekoppelt: 15 mg PE (20 umol) wurden in einer 5 ml-Glasflasche eingetrocknet. Das getrocknete PE wurde erneut in 2 ml trockenem Chloroform (Trocknung durch ein Molekularsieb) gelöst. Anschließend wurden 30 umol Triethylamin (TEA) (3 mg) mit anschließenden 30 umol SPDP (10 mg) in 1 ml getrocknetem Methanol zugesetzt. Das Gemisch wurde anschließend bei Raumtemperatur unter Stickstoff 1 bis 2 Stunden bis zum Abschluß der Reaktion (d. h. kein freies PE mehr) gerührt. Das Reaktionsprodukt wurde auf einem Rotationsverdampfer getrocknet. Die getrockneten Lipide wurden in Chloroform resuspendiert und sofort oben auf eine Kieselsäure-Chromatographiesäule aufgetragen, die, wie nachstehend beschrieben, hergestellt wurde: 2 g Kieselsäure wurden in 10 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wurde in einen 10 ml Plastikspritzenzylinder, in den Glasfasern gestopft waren, gegossen. Der Überschuß konnte abfließen und der Spritzenzylinder wurde mit einem Einweg- Dreiwegehahn aus Plastik versehen. Nach dem Auftragen der Lipide wurde die Säule mit 4 ml Chloroform gewaschen. Schließlich wurde die Säule mit 4 ml-Portionen einer Reihe von Chloroform-Methanol-Gemischen, zunächst 4 : 0,25 [Vol./Vol.], anschließend 4 : 0,5 [Vol./Vol.] und 4 : 0,75 [Vol./Vol.] und schließlich 4 : 1 [Vol./Vol.], eluiert, und 2 ml- Fraktionen wurden gesammelt. Das reine Derivat wurde anschließend durch Dünnschichtchromatographie (TLC) unter Verwendung von Kieselgelplatten, die mit Chloroform-Methanol-Wasser (65 : 25 : 4 (Vol./Vol.)) entwickelt wurden, nachgewiesen. Das Derivat wandert schneller als freies PE und die Flecken werden durch Phosphomolybdat oder Iod sichtbar gemacht.
Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und durch Verdampfen bei reduziertem Druck in einem Rotationsverdampfer konzentriert.
(B) Das HAV-Antigen wurde durch das nachstehende Verfahren mit einer Thiogruppe versehen: 5 ml gereinigtes und inaktiviertes HAV wurde in 0,1 M Phosphatpuffer (PBS (pH 7,5)) bei einer Konzentration von 5 mg/m&supmin;¹ gelöst. Anschließend wurde eine SPDP- Lösung zu einer Konzentration von 20 umol&supmin;¹ (6 mg/ml&supmin;¹) mit Ethanol vermischt und 150 ul davon unter Rühren langsam zu 5 ml der HAV-Proteinlösung mit einer Hamilton®- Spritze zugesetzt, um ein molares Verhältnis von SPDP zu Protein von 15 : 1 zu erhalten. Die Ethanolkonzentration wurde unter 5% gehalten, um eine Denaturierung des Proteins zu verhindern. Das Gemisch konnte 30 min bei Raumtemperatur (20ºC) reagieren. Nach Reaktionsende wurde das Protein durch Gelchromatographie auf Sephadex® G-50 getrennt, das mit einer Lösung, die 0,05 M Natriumcitrat (Na&sub3;C&sub6;H&sub5;O&sub7; · 2H&sub2;O, 19,7 g · 1&supmin;¹), 0,05 M Natriumphosphat (Na&sub2;HPO&sub4; · 7H&sub2;O, 13,4 g · 1&supmin;¹) und 0,05 M Natriumchlorid (2,9 g · 1-1), pH 7,0, enthielt, äquilibriert war.
(C) Die vorbehandelten IRIV- und HAV-Antigene wurden in der nachstehend beschriebenen Weise gekoppelt: Die IRIVs wurden wie in Beispiel 1 hergestellt. Anstelle von PE wurde das PE-SPDP verwendet.
Das HAV-SPDP wurde, wie nachstehend beschrieben, reduziert: Der pH-Wert der HAV-SPDP-Lösung in Citrat-Phosphat-Puffer wurde auf einen pH von 5,5 durch Zugabe von 1 M HCl eingestellt. 10 ul DTT-Lösung, 2,5 M Dithiothreit (DTT, 380 mg/ml) in 0,2 M Acetat-Puffer, pH 5,5 (165 mg Natriumacetat in 10 ml), wurde für jeden ml Proteinlösung zugesetzt. Die Lösung konnte 30 min stehenbleiben. Anschließend wurde das Protein vom DTT durch Chromatographie auf einer Sephadex® G-50-Säule, die mit PBS-Puffer, pH 7,0, äquilibriert war, getrennt. Zur Verhinderung der Oxidation der Thiole wurde zur Entfernung des Sauerstoffs durch alle Puffer Stickstoff geleitet. Die Proteinfraktionen wurden ebenfalls unter Stickstoff gesammelt.
Schließlich wurden die IRIVs mit dem thiolierten Protein durch Rühren über Nacht bei Raumtemperatur vermischt.

Beispiel 3

Herstellung der IRIVs mit einem reduzierten HAV-Antigen

Die IRIVs wurden wie in Beispiel 2 mit den nachstehenden Modifikationen hergestellt: Das HAV-Antigen wurde nicht mit SPDP gekoppelt, die Disulfidbrücken, die schon auf der Oberfläche des VP1-Proteins vorhanden waren, wurden jedoch als Vorläufer von freien Thiolgruppen verwendet. Diese Umwandlung in freie Thiolgruppen wurde, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt: 5 ml einer HAV-Lösung wurden in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, zu einer Antigen-Endkonzentration von 5 mg/ml hergestellt. Für jeden ml dieser Lösung wurden 10 ul einer DTT-Lösung (wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt) zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 min stehengelassen. Anschließend wurde das Protein vom DTT durch Chromatographie auf einer mit einem PBS-Puffer, pH 7,0, äquilibrierten Sephadex G-50-Säule getrennt. Proteinfraktionen wurden unter Stickstoff gesammelt und mit den IRIVs von Beispiel 2 gemischt.

Beispiel 4

Herstellung von HAV-Antigen-enthaltenden IRIVs

Die IRIVs wurden gemäß Beispiel 1 mit den nachstehenden Modifikationen hergestellt. 1 mg gereinigter und inaktivierter HAV in Suspension wurde einem Pellet von gereinigtem Influenza-Virus 90 A/Taiwan (0,002 M virale: Membranphospholipide) zugesetzt und in die IRIVs durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren eingeschlossen.

Beispiel 5

Herstellung eines HAV-IRIV-Impfstoffs

Die HAV-IRIVs wurden gemäß den Beispielen 1, 2, 3 oder 4 hergestellt und in PBS, pH 7,4, zu einer Endkonzentration von 500 ng HAV-Protein ml&supmin;¹ verdünnt. Diese Grundlösung wurde durch ein Membranfilter mit einer Porengröße von 0,2 um (Millipore) steril filtriert. Ein Konservierungsstoff (Thiomersal) wurde zu einer Endverdünnung von 10&supmin;&sup4; zugesetzt. Aliquots von 0,6 ml des Grundendimpfstoffs wurden in Impfstoffgefäße unter sterilen Bedingungen gefüllt. Sicherheit und Wirksamkeitstests wurden gemäß den internationalen Bestimmungen durchgeführt.

Beispiel 6

Herstellung eines anti-idiotypischen IRIV-Impfstoffs gegen Hepatitis C

Es wurde gezeigt, daß die Antigenbindungsstellen der Antikörpermoleküle (Ab1), auch als Idiotypen bekannt, die Produktion von Antikörpern (anti-Idiotypen oder Ab2) induzieren. Da die Inokulation von Tieren mit einigen Ab2 zur Produktion von Antikörpern (Ab3) führt, die Ab1 in ihrer Antigenbindungsfähigkeit gleichen, wurde angenommen, daß die Bindungsstellen von Ab2 als "Spiegelbild" der antigenen Determinanten wirken, die ursprünglich von Ab 1 (und anschließend von Ab3 [Jerne, N. K., Ann. Immunol. (Paris) 125 C (1974), 373]) erkannt werden. Der Hauptvorteil der Verwendung von anti-Id-Antikörpern (Ab2) zur Erzeugung von Antigen-spezifischen Antikörpern (Ab3) ist, daß der Impfstoffempfänger niemals in Kontakt mit infektiösen Wirkstoffen oder Materialien, die Fremdgene enthalten, ist.
Der anti-idiotypische IRIV-Impfstoff gegen Hepatitis C wurde, wie nachstehend beschrieben, hergestellt: Schafe wurden mit einem Ab&sub1; (in einer Konzentration von 1 mg/ml in PBS gelöst) gemäß dem nachstehenden Schema immunisiert: Am Tag 0 erhielten die Tiere 4 Dosen von 2 ml i. m. an unterschiedlichen Stellen (Schenkel). An den Tagen 7, 14 und 28 erhielten sie 2 Dosen von 2 ml in beide Hinterbeine. Am Tag 42 wurden 350 ml Blut von jedem Schaf gesammelt. Die Serumfraktion wurde abgetrennt und durch übliche Verfahren (zusammengefaßt von Glück, R. und Labert, D., Laboratory techniques in rabies, WHO, 4. Ausgabe, 1991, im Druck) weiter gereinigt.
Der gereinigte anti-Id-Hepatitis C-Antikörper wurde mit Pepsin gespalten und das erhaltene F(ab')&sub2;-Fragment mit DTT (vgl. Beispiel 2) reduziert, um 2 Fab'-Fragmente zu erhalten. Diese Fab'-Fragmente enthielten freie Sulfhydrylgruppen, die direkt mit den IRIVs von Beispiel 2 reagierten. Dieses Präparat wurde zu einer Proteinkonzentration von 50 ug/ml mit PBS, pH 7,4, verdünnt und in 0,6 ml Aliquots in Impfstoffgefäßen portioniert.

Beispiel 7

Sicherheit und Immunogenität von inaktivierten Hepatitis A-Impfstoffen: Vergleich von IRIV-HAV, das gemäß Beispiel 1 mit Alaun-absorbiertem Impfstoff hergestellt wurde

(A) Hepatis A-Virus (HAV) wurde nach einer Züchtung auf diploiden menschlichen MRC-S-Zellen (von der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC CCL 171 erhältlich) gereinigt. Das Virus wurde durch zehntägige Behandlung mit Formaldehyd (0,05%) bei 37ºC inaktiviert. Zwei Impfstoffreihen wurden getestet. Impfstoffreihe 1 bestand aus inaktiviertem Virus, das an IRIVs gemäß Beispiel 1 (A) (IRIV-HAV) gebunden war. Ein Impfstoff der Reihe 2 war eine Alaun-adsorbierte Präparation, die 0,4% Al(OH)&sub3; (Al-HAV) enthielt. Beide Impfstoffe enthielten 150 ng HAV-Antigen pro 0,5 ml Dosis. Seronegative erwachsene Versuchspersonen (zwei Gruppen von jeweils 15 Personen) erhielten zwei intramuskuläre Injektionen am Tag 0 und eine Nachimmunisierung am Tag 7 in den Deltamuskel. Keine systematische Reaktion oder Veränderungen in der Blutchemie wurden nachgewiesen. Im Hinblick auf lokale Reaktionen provozierten IRIV-Präparationen einen signifikant geringeren Prozentsatz von Reaktionen als der Alaun-absorbierte Impfstoff. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Fig. 3 zusammengefaßt.
Es wurde ferner festgestellt, daß die IRIV-Präparationen stärker immunogen als die Alaun-Präparation waren. Zum Testen der anti-HAV-Immunantwort wurden die Blutproben von den Versuchspersonen am Tag 21 und 28 nach der letzten Injektion genommen. Die Seren wurden auf HAV-spezifische Antikörper unter Verwendung eines im Handel erhältlichen RIA (Abbott) getestet. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 zusammengefaßt. Die Zahlen auf den Säulen repräsentieren den Bereich des anti-HAV- Antikörpertiters. Daher war der Bereich der anti-HAV-Antikörpertiter für das IRIV und Alaun-adsorbierte Impfstofformulierungen am Tag 21 82-988 bzw. 69-844. Der geometrische Durchschnittsliter (Bereich) für die IRIV und Alaun-adsorbierten Impfstofformulierungen am Tag 28 war 453 mIE/ml (92-1210) bzw. 361 mIE/ml (60- 929). Daher sind die erfindungsgemäßen IRIV-Präparationen den Alaun-adsorbierten Impfstoffen überlegen.
(B) In einer klinischen Untersuchung der Phase I mit 120 menschlichen Versuchspersonen konnte gezeigt werden, daß eine einzige IRIV-Adjuvans enthaltende Hepatitis A-Impfstoffdosis schützende Antikörpertiter gegen Hepatitis A, die 7fach höher als der Antikörpertiter nach der Alaunformulierung waren, induzierten. Bisher wurde eine solch hohe Immunverstärkung im Menschen niemals mit irgendeiner anderen liposomalen, virosomalen oder immunosomalen Formulierung aufgrund des offensichtlichen Fehlens von voll biologisch aktiven Fusionspeptiden erreicht.
Insgesamt 120 HAV-seronegative (< 10 mIU/ml) gesunde Erwachsene erhielten zufällig entweder einen flüssigen, Alaun-adsorbierten oder IRIV-Impfstoff gemäß Beispiel 1 (B). Der Impfstoff (0,5 ml) wurde intramuskulär in den Deltamuskel verabreicht. Die Versuchspersonen wurden etwa 30 Minuten nach der Impfung auf Reaktionen vom unmittelbaren Typ beobachtet. Jede Versuchsperson wurde aufgefordert, alle nachteiligen Reaktionen auf einem Berichtsblatt über 4 Tage nach der Immunisierung festzuhalten. Serumproben für anti-HAV-Antikörper-Ermittlungen wurden bei der Immunisierung und 14 Tage später genommen.
Jede Impfstofformulierung enthielt 1 ug HAV-Antigen pro 0,5 ml Dosis. Eine Dosis der IRIV-HAV-Formulierung enthielt ferner 10 ug Influenza-HA und 125 ug Gesamtphospholipide. Alle drei Impfstoffe erwiesen sich als steril und nicht-toxisch für Tiere durch Standardtestverfahren. Ferner erzeugten alle 3 Formulierungen eine gute anti- HAV-Antikörperantwort in Labortieren.
Jede Formulierung wurde intramuskulär an 40 gesunde erwachsene Versuchspersonen, die für einen HAV-Antikörper seronegativ waren, verabreicht. Die Gruppen glichen sich gut in Alter und Geschlecht. Nachteilige Reaktionen im Zusammenhang mit, der Immunisierung sind in Tabelle I dargestellt. Schmerz an der Injektionsstelle wurde am häufigsten bei allen Impfstoffen beanstandet. Diese Unannehmlichkeit wurde von einem die Flüssigformulierung erhaltenden Geimpften (2,5%), von 9 (23%), die mit dem Alaunadsorbierten Impfstoff immunisiert wurden, und von einem (2,5%), der das IRIV-Präparat erhielt, als mäßig eingestuft. Schwere Schmerzen wurden von einer Person, die den Alaun-adsorbierten Impfstoff erhielt, berichtet. Alle anderen Personen, die über eine "schmerzhafte" Reaktion berichteten, stuften sie als schwach ein. Die Immunisierung mit dem Alaun-adsorbierten Impfstoff war mit einem signifikant (P < 0,01) höheren Auftreten sowohl von Schmerz als auch von einer Schwellung/Verhärtung entweder im Vergleich mit den Flüssig- oder den IRIV-Formulierungen assoziiert. Keine auf die Impfung zurückzuführenden systemischen Reaktionen wurden bemerkt.
Die 14 Tage nach der Impfung erzeugte anti-HAV-Antikörperantwort ist in Tabelle 11 dargestellt. Die Immunisierung mit dem Flüssigimpfstoff lieferte einen geometrischen Durchschnittstiter (GMT) von 15,7 mIE/ml, wobei 30% der Individuen serokonvertierten (≥ 20 mIE/ml). Während der Alaun-adsorbierte Impfstoff sowohl ein gering höheres GMT (21,3 mIE/ml) als auch eine Serokonversionsrate (44%) induzierte, war keine signifikant größer als die mit dem Flüssigimpfstoff erhaltene. Im Gegensatz dazu erzeugte die IRIV- Impfstofformulierung eine viel heftigere Antikörperantwort. Der GMT von 139,8 war signifikant (P < 0,0001) höher im Vergleich zu den anderen beiden Impfstoffen. Nur ein Geimpfter besaß ≥ 100 mIE/ml. Wichtiger war die Tatsache, daß alle Geimpften nach 14 Tagen im Vergleich zu weniger als 50% bei den anderen Impfstofformulierungen (P < 0,005) serokonvertierten. Tabelle I Nachteilige Reaktionen im Zusammenhang mit einer Immunisierung
+ v s * oder §: P < 0.01
vs oder **: P < 0.01 Tabelle 11 Immunogenität von Flüssig-, Al(OH)&sub2;-adsorbierten und mit IRIV-Adjuvans versetzten Hepatitis A-Impfstoffen
Individuen erhielten eine einzige Dosis von Impfstoff am Tag 0.
§ vs * oder +: P < 0.0001
** vs oder : P < 0.005

Beispiel 8

Biologische Fusionsaktivität von unterschiedlichen rekonstituierten Influenza-Virosomen

Zur detaillierten Untersuchung der Rolle der Influenza-Virus-Membranbestandteile in der Fusionsreaktion ist es erforderlich, diese Bestandteile manipulieren zu können. Zu diesem Zweck ist ein Verfahren zur Isolierung und Wiederherstellung der viralen Spike- Proteine, die rekonstituierte Virosomen mit voller biologischer Fusionsaktivität produzieren, erforderlich. Die meisten Verfahren, die zur Rekonstitution von Virushüllen verwendet wurden, beruhen auf der Solubilisierung der viralen Membran mit einem Detergens.
Mehrere rekonstituierte Influenza-Virus-Hüllen wurden unter Verwendung von verschiedenen in der Literatur beschriebenen Verfahren hergestellt:
[A] Ein Virosom gemäß R. T. C. Huang et al. (Huang, R. T. C., Wahn, K., Klenk, H. D., und Rott, R., Virology 97 (1979), S. 212-217), das unter Verwendung von Detergenzien mit einer hohen kritischen Micellenkonzentration (c. m. c.) [z. B. Octylglucosid] hergestellt wurde.
[B] Ein Virosom gemäß K. Kawasaki et al. (Kawasaki, K., Sato, S. B. und Ohmiski, S. L, Biochem. Biophys. Acta 733 (1983), S. 268-290), das unter Verwendung von Detergenzien mit einer geringen c. m. c. (z. B. Triton® X-100) hergestellt wurde.
[C] Ein Virosom gemäß Y. Hosoka et al. (Hosaka, Y., Yasuda, Y. und Fukai, K., J. Virol. 46 (1983), S. 1014-1017), das unter Verwendung von Nonidet® P-40 als Detergens hergestellt wurde.
[D] Ein IRIV, wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde.
Ferner wurden die nachstehenden Kontrollen hergestellt:
[E] Eine gereinigte Influenza-Virus-Suspension als positive Kontrolle.
[F] PBS-NaCl, pH 7,4, als negative Kontrolle.
Von jeder Lösung der Hülle des rekonstituierten Influenza-Virus und der Influenza- Virus-Kontrolle wurde eine Konzentration von 10 ug/ml Hämagglutinin in Bicarbonatfreiem RPMI-1640-Medium, dem 10 mM NaCl (pH 7,4) zugesetzt wurden, hergestellt.
Die negative Kontrolle (PBS-NaCl) wurde im gleichen Medium 1 : 10 verdünnt. Für die Vesikelbindung und das Fusionsexperiment wurden menschliche diploide MRC-S- Fibroblasten in 12 Vertiefungen aufweisenden Cluster-Gefäßen (NUNC) gezüchtet. Die Zellen wurden mit 34000 Zellen/ml pro Vertiefung ausgesät und 3 Tage später verwendet. Zu dieser Zeit waren sie zu etwa 70 bis 80% konfluent.
0,5 ml der Lösungen der rekonstituierten Hüllen wurden pro Vertiefung zugesetzt, für jede Präparation 20 Vertiefungen. Die Vesikel konnten an Zellen 30 Minuten bei Raumtemperatur binden. Während dieser Inkubationszeit wurden die Gefäße zweimal 3 Minuten bei 500 g mit einer Drehung von 180º zwischen den Rotationen gedreht. Der Zentrifugationsschritt erhöht die Bindung von Vesikeln etwa 3fach. Nach diesem 30- minütigen Zeitraum wurden die Zellen viermal mit PBS-NaCl, pH 7,4, zur Entfernung von nicht-gebundenen Vesikeln gewaschen. Für das Fusionsexperiment wurde die Fusionsaktivität der fünf Präparationen durch Zugabe eines Fusionsmediums (mit 10 mM Succinat, 0,2% Rinderserumalbumin und 35 mM NaCl, pH 5,0, versetztes RPMI 1640) zu jeder Vertiefung (0,5 ml/Vertiefung) induziert. Nach einer Minute wurde in zwei Vertiefungen pro Präparation die Fusionsreaktion durch Ersatz des Fusionsmediums mit absolutem Ethanol beendet. Dies wurde jede Minute durchgeführt, bis 10 Minuten vergangen waren. Die Zellen wurden anschließend gemäß dem Verfahren von May Grünwald-Giemsa gefärbt: Die Zellen wurden anschließend mit einer alkoholischen May- Grünwald-Lösung (Fluka Nr. 63590) bedeckt. Nach 5 Minuten wurden die Zellen schnell mit einem Phosphatpuffer, pH 6,5, gewaschen und mit einer Giemsa-Lösung (Fluka Nr. 48900) gefärbt, die 1 : 10 mit dem gleichen Phosphatpuffer verdünnt war. Nach weiteren 10 Minuten wurden die Zellen mit fließendem. Wasser gewaschen: Unter dem Mikroskop erschien das Cytoplasma der Zellen in einer hellblauen Farbe, die Membranen in einer dunkelblauen Farbe und die Kerne in einer dunkelroten Farbe.
Unter dem Mikroskop wurden 10 Sichtfelder zur Zählung der fusionierten Zellen (die mindestens zwei Kerne enthielten) bewertet und für jede Präparation und Zeitintervall berechnet. Fig. 5 zeigt den Durchschnittswert der beiden Vertiefungen: Es war offensichtlich, daß nur die IRIV-Präparation eine Fusionsaktivität teilte, die mit der Influenza-Virus-Kontrolle vergleichbar war. Das Präparat [B] lieferte eine Fusionsaktivität, die nur etwa 30% im Vergleich mit der positiven Kontrolle war. Die anderen Präparate zeigten keine Fusionsaktivität (wie die negative Kontrolle). Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, daß nur die beschriebenen IRIVs eine volle biologische Fusionsaktivität zeigen, während die anderen Verfahren zur Rekonstitution der Influenza-Hülle keine Vesikel mit Fusionsaktivität liefern und zu einem beträchtlichen bis vollständigen Verlust der Fusionsaktivität führen.

Claims

1. Immunstimulierendes rekonstituiertes Influenza-Virosom (IRIV), umfassend die folgenden Komponenten:

(a) ein Gemisch von Phospholipiden, wobei dieses Gemisch mindestens zwei Verbindungen aus der Gruppe von Glycerophospholipiden und Cholesterin enthält;

(b) im wesentlichen rekonstituierte funktionelle Virenhüllen, umfassend ein Influenza- Hämagglutininprotein (HA) oder ein Derivat davon, das im wesentlichen die volle biologische Aktivität von natürlichem HA zeigt und fähig ist, die Fusion des IRIV mit zellulären Membranen zu induzieren und die Lyse der IRIV nach Endocytose durch Antigen-präsentierende Zellen, vorzugsweise Makrophagen oder B-Zellen, bei einem pH von etwa 5,0 zu induzieren; und

(c) ein zusätzliches Antigen, das abgeleitet ist von einem Pathogen oder das ein antiidiotypischer Antikörper gegen einen Pathogen-spezifischen Antikörper oder ein Toxin oder Toxoid ist.

2. IRIV nach Anspruch 1, wobei die im wesentlichen rekonstituierten, funktionellen Virushüllen in der Form eines unilamellaren Bilayers sind.

3. IRIV nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Pathogen ein mikrobielles Pathogen ist.

4. IRIV nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Pathogen ein Virus, ein Bakterium, oder ein Parasit oder ein Teil davon ist.

5. IRIV nach Anspruch 4, wobei das Pathogen ein Hepatitis A-Virus (HAV) ist.

6. IRIV nach Anspruch 5, wobei das HAV der Hepatitis A- Virus-Stamm RG-SB XA112 (CNCM I-1080) ist.

7. IRIV nach Anspruch 5 oder 6, wobei das HAV inaktiviert ist.

8. IRIV nach Anspruch 5 oder 6, wobei das vom Pathogen abgeleitete Antigen VP1, VP2, VP3, VP4 oder das Kernprotein des HAV ist.

9. IRIV nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Antigen in der Membran des IRIV lokalisiert ist.

10. IRIV nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Antigen an der Oberfläche des IRIV adsorbiert ist.

11. IRIV nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das HA- Derivat das HA-Fusionsprotein ist.

12. IRIV nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Gemisch Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin umfaßt.

13. IRIV nach Anspruch 12, wobei Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin im Verhältnis von 4 : 1 vorliegen.

14. IRIV nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Verhältnis von (a) : (b) bei etwa 1 : 1 bis etwa 20 : 1 liegt.

15. Impfstoff, der ein IRIV nach einem der Ansprüche 1 bis 14 enthält, gegebenenfalls in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.

16. Verfahren zur Herstellung des IRIV nach einem der Ansprüche 1 bis 14, umfassend das Kombinieren der Komponenten von (a), (b) und (c) gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 14.

17. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs nach Anspruch 15, umfassend das Kombinieren des IRIV nach einem der Ansprüche 1 bis 14 mit einem geeigneten pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.