DE69421939T3

DE69421939T3 - Nichttoxisches schleimhautadjuvans

Info

Publication number: DE69421939T3
Application number: DE69421939T
Authority: DE
Inventors: Rino Rappuoli
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics SRL
Current assignee: GSK Vaccines SRL
Priority date: 1993-12-22
Filing date: 1994-12-22
Publication date: 2009-11-05
Anticipated expiration: 2014-12-23
Also published as: CA2179771A1; US7070781B2; GB9326174D0; US20060177469A1; GR3032497T3; PT732937E; US7485304B2; ES2139879T5; DK0732937T3; AU1278595A; EP0732937A1; JP2006143729A; ES2139879T3; DK0732937T4; ATE187078T1; US20040028690A1; CA2179771C; DE69421939D1; JPH10500099A; DE69421939T2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Adjuvans, das für die Verabreichung von Impfstoffen an Organismen verwendet werden kann. Insbesondere erlaubt das Adjuvans der Erfindung die Anwendung von Impfstoffen auf die Oberfläche von Schleimhäuten, um eine sekretorische und systemische Immunantwort zu erzeugen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die gegenwärtige Impftechnologie basiert fast ausschließlich auf systemischen Impftechniken, wobei der Impfstoff in das zu impfende Individuum injiziert wird. Nur gewisse Lebendimpfstoffe und abgeschwächte Impfstoffe, wie der Sabin-Polioimpfstoff, können oral eingenommen werden.
Die Vorteile der oralen Immunisierung sind mehrfach. Zum Beispiel ist es selbstverständlich, dass ein Impfstoff, der den Individuen gefüttert werden kann, leichter auf breiter Basis und in Abwesenheit spezieller Geräte angewendet werden kann, vor allem bei Individuen, die schwierig zu handhaben oder gar zu lokalisieren sind, wie Viehherden und wilde Tiere. Die Ausbreitung von Infektionen durch die Wiederverwendung von Nadeln in Entwicklungsländern würde dadurch vermieden. Außerdem kann ein oraler Impfstoff in der Form eines essbaren Feststoffes bereitgestellt werden, der unter extremen Bedingungen leichter handhabbar ist und stabiler ist als die flüssigen Suspensionen, die gegenwärtig verwendet werden.
Außerdem würde das Einwirken eines Immunogens auf eine Schleimhautmembran, wie bei oraler oder intranasaler Impfung, die Erzeugung einer sekretorischen Immunantwort erlauben.
Die sekretorische Immunantwort, vor allem IgA-vermittelt, scheint grundsätzlich getrennt zu sein von der systemischen Immunantwort. Die systemische Impfung ist uneffektiv zur Erzeugung einer sekretorischen Immunantwort. Dies ist ein beträchtlicher Nachteil, wenn man eine Impfung gegen Pathogene in Betracht zieht, die häufig in das Individuum über eine Schleimhautoberfläche eindringen, wie die Eingeweide oder die Lunge.
Unglücklicherweise ist es nicht möglich, eine sekretorische Immunantwort gegen die große Mehrzahl an Antigenen zu erzeugen, indem man einfach eine Schleimhautoberfläche einem solchen Antigen aussetzt. Darüber hinaus ist gegenwärtig kein Adjuvans verfügbar, das in der Lage ist, eine sekretorische Immunantwort gegen ein spezielles Antigen hervorzurufen.
Die offensichtliche Schwierigkeit beruht vor allem auf einem Phänomen, das als orale Toleranz bekannt ist. Die Oberflächen der Eingeweide und der Lunge sind natürlicherweise tolerant gegenüber fremden Antigenen, was die Erzeugung einer Immunantwort gegen aufgenommene oder eingeatmete Substanzen verhindert, wie Nahrungsmittel und Luftschwebstoffe.
Die ADP-ribosylierenden bakteriellen Toxine, nämlich Diphtherie-Toxin, Pertussis-Toxin (PT), Cholera-Toxin (CT), das hitzelabile E. coli-Toxin (LT1 und LT2), Pseudomonas-Endotoxin A, C. Botulinum-Toxine C2 und C3 ebenso wie Toxine von C. perfringens, C. spiriforma und C. difficile sind starke Toxine im Menschen. Diese Toxine sind zusammengesetzt aus einer monomeren, enzymatisch aktiven A-Untereinheit, die für die ADP-Ribosylierung der GTP-bindenden Proteine verantwortlich ist, und einer nicht-toxischen B-Untereinheit, die an die Rezeptoren auf der Oberfläche der Zielzelle bindet und die A-Untereinheit durch die Zellmembran schleust. Im Falle von CT und LT weiß man von der A-Untereinheit, dass sie in den Zielzellen den intrazellulären cAMP-Level erhöht, während die B-Untereinheit pentamer ist und an GM1-Gangliosid-Rezeptoren bindet.
1975 und 1978 wurde beobachtet, dass CT mucosale und systemische Immunität gegen sich selbst erzeugen kann, wenn es intraduodenal angewendet wurde (d. h. an einer Schleimhautoberfläche). Es wurde gezeigt, dass die Membran-bindende Funktion von CT für die mucosale Immunogenität des Cholera-Toxoids essentiell war, aber Cholera-Toxoid, auch bekannt als B-Untereinheit von CT (CTB), war alleine inaktiv (Pierce and Gowans, J. Exp. Med. 1975; 142: 1550; Pierce, J. Exp. Med. 1978; 148: 195–206).
In der Folge wurde gezeigt, dass CT systemische und mucosale Immunität gegen gleichzeitig gegebene Antigene induziert, mit anderen Worten als Schleimhautadjuvans fungiert (Elson, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 1989; 146: 29; Elson and Ealding, J. Immunol. 1984; 133: 2892–2897; Elson and Ealding, Ibid. 1984; 132: 2736–2741; Elson et al., J. Immunol. Methods 1984; 67: 101–118; Lycke and Homgren, Immunology 1986; 59: 301–338).
Die vorstehend zitierten Experimente wurden in Mäusen durchgeführt, die vergleichsweise resistent sind gegenüber den toxischen Effekten von CT. Im Gegensatz dazu ist Wild-Typ-CT extrem toxisch für den Menschen, wodurch der Gebrauch von CT mit wesentlicher Rest-Toxizität als Schleimhautadjuvans völlig außer Frage steht.
Im Stand der Technik wurde auf zwei Arten versucht, dem Problem der Toxizität von CT beizukommen. Die erste Methode beinhaltete die Verwendung von CTB als Schleimhautadjuvans. CTB ist völlig untoxisch.
In einer Reihe von Experimenten wurde CTB kovalent an Meerrettich-Peroxidase (HRP) gebunden und intraduodenal bei Mäusen angewendet. Dies resultierte in einer starken mucosalen Immunantwort auf HRP (McKenzie and Halsey, J. Immunol 1984; 133: 1818–1824).
Dieses Resultat wurde im Folgenden mit anderen Antigenen zum Teil bestätigt (Liang et al., J. Immunol 1988; 141: 1495–1501; Czerkinsky et al., Infect. Immun. 1989; 57: 1072–1077). Es wurde auch gezeigt, dass dasselbe Prinzip wirksam ist, wenn chimäre Antigene getestet wurden, die durch Genfusion an Sequenzen hergestellt wurden, die CTB codieren (Dertzbaugh and Elson, Infect. Immun. 1993; 61: 384–390; Dertzbaugh and Elson, Ibid. 1993; 61: 48–55; Sanchez et al., Res. Microbiol. 1990; 141: 971–979; Holmgren et al., Vaccine 1993; 11: 1179–1184).
Die Herstellung von chimären oder gekoppelten Antigenen führt jedoch eine weitere Stufe bei der Herstellung geeigneter Impfstoffe ein, die im Prinzip erfordert, dass Antigene in einer Form hergestellt werden, die mit CTB konjugiert ist, speziell für orale Anwendung. Es wäre deutlich einfacher und ökonomischer, wenn das Adjuvans in einer einfachen Beimischung zum Antigen angewendet werden könnte.
Ein Adjuvans-Effekt für gleichzeitig gegebenes CTB wurde in einer Reihe von Publikationen behauptet (Tamura et al., J. Immunol. 1992; 149: 981–988; Hirabayashi et al., Immunology 1992; 75: 493–498; Gizurarson et al., Vaccine 1991; 9: 825–832; Kikuta et al., Vaccine 1970; 8: 595–599; Hirabayashi et al., Ibid. 1990; 8: 243–248; Tamura et al., Ibid. 1989; 7: 314–32-; Tamura et al., Ibid. 1989; 7: 257–262; Tamura et al., Ibid. 1988; 6: 409–413; Hirabayashi et al., Immunology 1991; 72: 329–335; Tamura et al., Vaccine 1989; 7: 503–505).
Eine Anzahl von Aspekten der vorstehend berichteten Beobachtungen waren jedoch nicht völlig überzeugend. Zum Beispiel wurde beobachtet, dass der CTB zugeschriebene Adjuvans-Effekt nicht H-2-beschränkt war. Es ist jedoch bekannt, dass die Immunantwort auf CTB H-2-beschränkt ist (Elson and Ealding, Eur. J. Immunol. 1987; 17: 425–428). Darüber hinaus wurde der angebliche Adjuvans-Effekt auch in Individuen beobachtet, die bereits immun gegen CTB waren.
Andere Gruppen konnten keinen Schleimhautadjuvans-Effekt beobachten, den man CTB zuschreiben konnte (Lycke and Holmgren, Immunology 1986; 59: 301–308; Lycke et al., Eur. J. Immunol. 1992; 22: 2277–2281). Experimente mit rekombinantem CTB (Holmgren et al., Vaccine 1993; 11: 1179–1183) bestätigten, dass der angebliche Effekt größtenteils, wenn nicht sogar vollständig, niedrigen Konzentrationen an Verunreinigung von CTB-Präparationen durch CT zuzuschreiben ist.
Daher wird gegenwärtig akzeptiert, dass CTB nicht als Schleimhautadjuvans verwendet werden kann.
Ein zweiter Versuch, die Toxizität von CT zu eliminieren war der, das CT-Holotoxin zu mutieren, um seine Toxizität zu reduzieren oder zu eliminieren. Die Toxizität von CT liegt in der A-Untereinheit und eine Reihe von Mutanten von CT und seines Homologen, LT, einschließlich Punktmutationen in der A-Untereinheit, sind im Fachgebiet bekannt. Siehe z. B. die internationale Patentanmeldung WO92/19265 (Amgen). Es wird im Fachgebiet akzeptiert, dass CT und LT generell austauschbar sind, da sie beträchtliche Homologie zeigen.
Die einzige Mutante jedoch, die bisher als Schleimhautadjuvans getestet wurde, eine LT-Mutante, die eine Glu → Lys-Mutation bei Position 112 hat, wurde als inaktives Schleimhautadjuvans befunden (Lycke et al., Eur. J. Immunol. 1992; 22: 2277–2281; Holmgren et al., Vaccine 1993; 11: 1179–1183). Die Autoren dieser Publikationen schließen, dass es eine Verbindung gibt zwischen der Aktivität von CT und/oder LT zur Ribosylierung von ADP und der Aktivität als Adjuvans. Nach diesen Publikationen scheint es deshalb so, dass CTB oder eine nicht-toxische Mutante von CT oder LT als Schleimhautadjuvans nicht aktiv wären.
WO95/09649 (Medeva Holdings BV) offenbart die Verwendung einer nicht-toxischen, doppelt mutierten Form von Pertussis-Toxin zur Herstellung eines Mittels als Adjuvans zur Stimulierung oder Verstärkung einer schützenden Immunantwort gegen ein Antigen, das gleichzeitig damit gegeben wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es besteht daher Bedarf an einem aktiven Schleimhautadjuvans, das verwendet werden kann, um die Immunogenität eines Antigens zu erhöhen, wenn es an einer Schleimhautoberfläche angewendet wird, wie oral oder intranasal.
Es ist nun gefunden worden, dass, in völligem Gegensatz zu den Ergebnissen und Schlussfolgerungen, die im Stand der Technik gezeigt werden, die toxische Aktivität und die Aktivität als Adjuvans der ADP-ribosylierenden Toxine getrennt werden können. Es konnte gezeigt werden, dass eine völlig untoxische Mutante eines solchen Toxins als Schleimhautadjuvans aktiv ist.
Es ist gezeigt worden, dass eine LT-Mutante ohne jegliche Toxizität als Schleimhautadjuvans aktiv ist und Individuen gegen eine anschließende Gabe einer tödlichen Dosis eines Immunogens schützt. Obwohl die Anmelder nicht an eine spezifische Theorie gebunden sein wollen, wird postuliert, dass den Resultaten von Lycke et al. und Holmgren et al., die oben zitiert werden, zumindest teilweise widersprochen wird, da sie die Stabilität der hergestellten Mutante nicht in Betracht ziehen. Inter alia durch Sicherstellung, dass die nicht-toxische Mutante der Erfindung auch am Ort des Einwirkens stabil ist, ist gezeigt worden, dass der Effekt als Adjuvans von CT und/oder LT beibehalten wird, während die toxischen Effekte eliminiert werden.
Die Erfindung stellt bereit:
ein Arzneimittel, umfassend ein nicht-toxisches Mucosa-Adjuvans im Gemisch mit einem zweiten Antigen, dadurch gekennzeichnet, dass (a) das nicht-toxische Mucosa-Adjuvans ein entgiftetes bakterielles ADP-ribosylierendes Toxin mit einer mutierten A-Untereinheit ist, wobei das bakterielle ADP-ribosylierende Toxin hitzelabiles E. coli-Toxin (LT) ist, und (b) das zweite Antigen ein virales oder bakterielles Antigen ist, das von einem pathogenen Organismus stammt;
die Verwendung eines entgifteten ADP-ribosylierenden Toxins mit einer mutierten A-Untereinheit als Mucosa-Adjuvans für die Herstellung einer Zusammensetzung zu mucosalen Verabreichung, wobei das bakterielle ADP-ribosylierende Toxin Cholera-Toxin (CT) oder hitzelabiles E. coli-Toxin (LT) ist;
die Verwendung eines Mucosa-Adjuvans zur Herstellung eines Impfstoffs, wobei das Mucosa-Adjuvans ein entgiftetes bakterielles ADP-ribosylierendes Toxin mit einer mutierten A-Untereinheit ist, und wobei das bakterielle ADP-ribosylierende Toxin Cholera-Toxin (CT) oder hitzelabiles E. coli-Toxin (LT) ist.
Vorzugsweise umfasst das entgiftete, bakterielle ADP-ribosylierende Toxin eine oder mehrere Aminosäureadditionen, -deletionen oder -substitutionen.
Ein mutiertes LT gemäß der Erfindung kann eine Substitution von Arg7 zu Lys7 an Position 7 der A-Untereinheit enthalten, die sogenannte LTK7-Mutante.
Alternative Mutanten sind dem Fachmann bekannt und sind bevorzugte Moleküle zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung.
Die in der Erfindung verwendete Mutante kann darüber hinaus eine Mutante sein, in der die Mutation in einem Teil des Moleküls vorgenommen wurde, woraus die Verhinderung der proteolytischen Spaltung der A-Untereinheit des Toxins resultiert, so dass enzymatische Aktivität nicht vorliegt. Solche Mutanten sind beschrieben in Grant et al., Inf. and Immunity (1994) 62 (10) 4270–4278. Zum Beispiel kann die Mutation eine Arg 192 → Gly-Mutation im LT umfassen oder eine entsprechende Mutation in einem anderen ADP-ribosylierenden Toxin.
Die Mutante der Erfindung ist vorzugsweise in der Form eines Holotoxins und umfasst die mutierte A-Untereinheit und die B-Untereinheit, die oligomer sein kann wie im Wild-Typ-Holotoxin. Die B-Untereinheit ist vorzugsweise nicht mutiert. Es ist jedoch geplant, dass eine mutierte A-Untereinheit isoliert von der B-Untereinheit verwendet werden kann, entweder in einer essentiell reinen Form oder komplexiert mit anderen Stoffen, die die B-Untereinheit und/oder ihren funktionalen Beitrag ersetzen können.
Verfahren zur Planung und zur Herstellung von Mutanten von CT und/oder LT sind im Fachgebiet bekannt. Geeignete Verfahren sind in der Internationalen Patentanmeldung WO93/13202 (Biocine Sclavo) beschrieben ebenso wie in der WO92/19265 (Amgen).
Das Adjuvans der Erfindung wird vorzugsweise unter Beimischung eines geeigneten Antigens angewendet, gegen das man eine Immunantwort erzeugen möchte. Wenn das Antigen und das Adjuvans nicht in einem Gemisch vorliegen, werden sie vorzugsweise innerhalb einer relativ kurzen Zeit und am selben Ort zugeführt. Es ist beobachtet worden, dass der durch Wild-Typ-CT hervorgerufene Adjuvans-Effekt kurzlebig ist (siehe Lycke and Holmgren, Immunology 1986; 59: 301–308). In einer alternativen Ausführungsform kann das mucosale Adjuvans der Erfindung nach systemischer oder mucosaler Gabe eines Impfstoffs zur Verstärkung angewendet werden, gegebenenfalls isoliert von anderen Antigenen.
Die genaue Formulierung des Impfstoffs kann variieren in Abhängigkeit von der Natur des Immungens. Wenn das Antigen, zum Beispiel, in langsam freisetzenden Mikrokugeln zu Liposomen eingeschlossen ist, kann das mucosale Adjuvans ähnlich eingeschlossen sein, so dass das Antigen und das Adjuvans gleichzeitig mit dem mucosalen Immunsystem interagieren können. Alternativ kann eine getrennte mucosale Verabreichung des Adjuvans der Erfindung verwendet werden, um die mucosale Antwort eines parenteral verabreichten Impfstoffs zu erhöhen.
Vorzugsweise ist das Mittel ein Impfstoff und ist nutzbar zur Immunisierung eines Individuums gegen eine Krankheit oder zur Behandlung eines Individuums, das unter einer Krankheit leidet.
Vorzugsweise umfasst die Mutante eine oder mehrere Aminosäureadditionen, -substitutionen oder -deletionen in der Aminosäuresequenz der A-Untereinheit von CT oder LT mit dem Effekt, dass die Toxizität des Toxins aufgehoben wird.
Die mucosale Oberfläche kann jede geeignete mucosale Oberfläche des Individuums sein. Zum Beispiel kann die Verabreichung durch Inhalation, durch rektale oder vaginale Zäpfchen, durch ein Pessar, durch Verfütterung oder andere buccale Anwendung, durch ein Aerosol, durch intranasale Verabreichung oder durch direkte Anwendung auf mucosale Oberflächen erfolgen. Speziell bevorzugt sind orale und intranasale Verabreichung.
Das Individuum kann jeder Organismus sein, der einer Immunisierung zugänglich ist. Speziell angeführt werden Menschen und andere Säugetiere, wie Viehherden, Haustiere und Wildtiere.
Krankheiten, gegen die das Individuum immunisiert werden kann, schließen alle Krankheiten ein, die durch Immunisierung behandelt oder verhindert werden können, einschließlich viraler Erkrankungen, allergischer Manifestationen, Erkrankungen, die durch bakterielle oder andere Pathogene verursacht werden, die durch mucosale Oberflächen eindringen oder dort kolonisieren, AIDS, Autoimmunerkrankungen wie systemischer Lupus erythematodes, Alzheimer-Erkrankung oder Krebs. Beispiele für virale Erkrankungen, die durch die Anwendung der Erfindung behandelt oder verhindert werden können, schließen die Infektion mit DNA-Viren ein, wie EBV und VZV, und insbesondere Herpesviren, zum Beispiel HSV und HCMV, Adenoviren, Papovaviren wie HPV, Hepadnaviren wie HBV, Infektion mit RNA-Viren, wie Picorvaviren, speziell Polivirus und HAV, Rhinoviren und FMDV, Togaviren, Flaviviren, Coronaviren, Paramyxoviren wie RSV, Orthomyxoviren wie Influenzaviren, und Retroviren, insbesondere HIV. Eine Impfung gegen HCV und HDV ist ebenfalls geplant.
Beispiele für bakterielle Infektionen, die für eine Behandlung oder Prophylaxe mittels der Erfindung geeignet sind, schließen Infektion mit Helicobacter pylori, Streptococcen, Meningococcen A, B und C, Bordetella pertussis und Chlamydien und Trachomatis ein.
Impfstoff-Formulierungen, die zur Anwendung an mucosalen Oberflächen geeignet sind, können hergestellt werden wie nachstehend beschrieben, während andere Formulierungen dem Fachmann offensichtlich sind. Geeignete Verabreichungsformen sind ebenfalls im Folgenden ausgeführt, wobei Abänderungen der beispielhaften Werte dem Fachmann offensichtlich sind.
Insbesondere bevorzugt ist die simultane Anwendung des Adjuvans und des zweiten Antigens, wenn diese kombiniert in einem einzigen Vehikel, Träger oder Partikel vorliegen, wie im Folgenden ausgeführt.
Das zweite Antigen kann jedes Antigen sein, gegen das man eine Immunantwort in dem Individuum erzeugen möchte. Geeignete Antigene umfassen bakterielle, virale und Protozoen-Antigene, die aus pathogenen Organismen stammen, ebenso wie Allergene, Allogene und aus Tumoren abgeleitete Antigene und Selbst-Antigene. Typischerweise ist das Antigen ein Protein, ein Polypeptid oder ein Peptid, aber alternative antigene Strukturen, wie Nucleinsäure-Antigene, Kohlehydrat-Antigene, und ganze oder abgeschwächte oder inaktivierte Organismen, wie Bakterien, Viren oder Protozoen sind nicht ausgeschlossen. Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren für die Herstellung eines Adjuvans-Impfstoffs bereit, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Durchführung einer stellenspezifischen Mutagenese auf der A-Untereinheit von LT, um das Toxin zu entgiften; und
b) Zusammenbringung des entgifteten Toxins mit einem zweiten Antigen, so dass es als Schleimhautadjuvans wirkt.

Spezifische Beispiele für Antigene, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen ein HSV gD, gB und andere Glycoproteine; HIV-gp 120 und andere Proteine; CMV-gB oder –gH; HCV-Antigene; HDV-delta-Antigen; HAV-Antigene; EBV- und VZV-Antigene; B. pertussis- und H. pylori-Antigene.
Generell kann das zweite Antigen die immunogene Komponente des Impfstoffs sein, der zur Injektion vorgesehen ist. Solche Impfstoffe und die immunogenen Komponenten davon können Untereinheit-Impfstoffe sein, ganze abgeschwächte oder inaktivierte Organismen oder Polynucleotid-Impfstoffe.
Die Impfstoffe gemäß der Erfindung können entweder prophylaktisch (um die Infektion zu verhindern) oder therapeutisch (um die Krankheit nach der Infektion zu behandeln) sein.
Solche Impfstoffe umfassen ein Antigen oder Antigene, üblicherweise in Verbindung mit „pharmazeutisch verträglichen Trägern”, die jeden Träger einschließen, der nicht selbst die Produktion von Antikörpern initiiert, die schädlich für das Individuum sind, das das Mittel erhält.
Geeignete Träger sind typischerweise große, langsam metabolisierte Makromoleküle, wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglycolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Copolymere, Lipid-Aggregate (wie Öltropfenemulsionen und Liposome), und inaktive Viruspartikel. Solche Träger sind dem Fachmann wohlbekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können diese Träger als immunstimulierende Mittel wirken („Adjuvantien”). Darüber hinaus kann das Antigen an ein bakterielles Toxoid konjugiert sein, wie Toxoide von Diphtherie-, Tetanus-, Cholera-, H. pylori- usw. -Pathogene.
Bevorzugte Adjuvantien zur Erhöhung der Effektivität des Mittels schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: (1) Aluminiumsalze (Alaun), wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumsulfat usw.; (2) Formulierungen von Öl-in-Wasser-Emulsionen (mit oder ohne andere spezifische, immunstimulierende Mittel wie z. B. Muramylpeptide (siehe weiter unten) oder bakterielle Zellwandkomponenten), wie z. B. (a) MF59^TM (PCT-Veröffentlichung No. WO90/14837 ), das 5% Squalen, 0,5% Tween^TM80 enthält, und 0,5% Span 85 (das gegebenenfalls verschiedene Mengen an MTP-PE (siehe nachstehend) enthält, obwohl nicht erforderlich) enthält und das mittels eines Mikroverflüssigers wie der Modell 110Y-Mikroverflüssiger (Microfluidics, Newton, MA) in Submikronpartikel formuliert ist, (b) SAF, das 10% Squalen, 0,4% Tween^TM80, 5% Pluronic-geblocktes Polymer L121, und thr-MDP (siehe nachstehend) enthält, entweder mikroverflüssigt zu einer Submikron-Emulsion oder verwirbelt, um eine Emulsion mit Partikeln größeren Umfangs zu erhalten, und (c) Ribi^TM Adjuvant-System (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), das 2% Squalen, 0,2% Tween^TM80 und eine oder mehrere bakterielle Zellwandkomponenten aus der Gruppe bestehend aus Monophosphorylipid A (MPL), Trehalosedimycolat (TDM), und Zellwandskelett (CWS), vorzugsweise MPL + CWS (Detox^TM), enthält; (3) Saponin-Adjuvantien, wie Stimulon^TM (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) können verwendet werden oder Partikel daraus hergestellt werden wie ISCOMs (immunstimulierende Komplexe); (4) Komplettes Freundsches Adjuvans (CFA) und inkomplettes Freundsches Adjuvans (IFA); (5) Cytokine, wie Interleukine (z. B. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, usw.), Interferone (z. B. gamma-Interferon), Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor (M-CSF), Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), usw.; und (6) andere Stoffe, die als immunstimulierende Mittel wirken und die Effektivität der Mittel erhöhen. Alaun und MF59 werden bevorzugt.
Wie oben erwähnt, schließen Muramylpeptide ein, sind aber nicht beschränkt auf, N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetyl-normuramyl-1-alanyl-d-isoglutamin (norMDP), N-Acetylmuramyl-1-alanyl-d-isoglutaminyl-1-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin (MTP-PE), usw.
Die immunogenen Mittel (z. B. das Antigen, pharmazeutisch verträglicher Träger und Adjuvans) enthalten typischerweise noch Verdünnungsmittel, wie Wasser, Salzlösung, Glycerin, Äthanol, usw.
Zusätzlich können noch Hilfsmittel wie Netz- und Emulgiermittel, pH-Puffer-Mittel und ähnliches in solchen Vehikeln vorhanden sein.
Das Präparat kann zur Erhöhung des Adjuvans-Effekts emulgiert oder in Liposomen verkapselt werden, wie zuvor unter pharmazeutisch verträglichen Trägern diskutiert.
Die immunogenen Mittel, die als Impfstoffe verwendet werden, schließen eine immunologische wirksame Menge der antigenen Polypeptide ein, ebenso wie jede andere der zuvor erwähnten Komponenten, wie benötigt. Mit „immunologisch wirksame Menge” ist gemeint, dass die Anwendung der Menge bei einem Individuum, entweder als einzelne Dosis oder als Teil einer Serie, effektiv ist für die Behandlung oder Prävention. Diese Menge variiert in Abhängigkeit vom Gesundheitszustand oder dem physischen Zustand des zu behandelnden Individuums, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums (e. g. nicht-menschlicher Primat, Primat, usw.), der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums zur Synthese von Antikörpern, des Grades des gewünschten Schutzes, der Formulierung des Impfstoffes, der Einschätzung der medizinischen Situation durch den behandelnden Arzt, und anderen relevanten Faktoren. Es wird erwartet, dass die Menge in einem relativ breiten Bereich liegen wird, der durch Routineuntersuchungen bestimmt werden kann.
Die immunogenen Mittel werden mucosal verabreicht. Zusätzliche Formulierungen schließen orale und pulmonare Formulierungen ein. Die Dosierung zur Behandlung kann in der Form einer einzelnen Dosis erfolgen oder mehrfacher Dosen. Der Impfstoff kann in Verbindung mit anderen immunregulatorischen Mitteln verabreicht werden.
Beispiele für geeignete immunstimulierende Mittel schließen Interleukine ein, wie die Interleukine 1,2,4-7 und 12, und Interferone, insbesondere γ-Interferon.
Die Erfindung wird nachstehend beispielhaft beschrieben unter Bezug auf die folgenden Figuren:
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1a zeigt den Titer an Ovalbumin-spezifischen Antikörpern in BALG/c-Mäusen, die i/n oder s/c entweder mit Ovalbumin allein oder mit Ovalbumin zusammen mit Toxinderivaten immunisiert wurden;
1b zeigt den Titer der gesamten Toxin-spezifischen Antikörper in den Mäusen der 1a;
2 zeigt die Messung an Ovalbumin-spezifischem IgA in Waschungen der Nasen und der Lungen der Mäuse die wie in 1 injiziert wurden; und
3 zeigt die Anwesenheit Tetanus-Toxoid-spezifischer Antikörper im Serum von BALB/c-Mäusen, die i/n oder s/c mit Tetanus-Toxin-Fragment C allein oder zusammen mit Toxinderivaten immunisiert wurden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Stellen-spezifische Mutagenese wurde verwendet, um den Arginin-Rest an Position sieben der A-Untereinheit von LT durch Lysin zu ersetzen, um eine nicht-toxische Mutante von LT herzustellen, die sich noch als Holotoxin mit Zellbindungsaktivität zusammenlagern konnte. Das mutierte Protein, LTK7 genannt, wurde gereinigt und in mehreren Tests auf ADP-Ribosyltransferase-Aktivität und toxische Aktivität untersucht. LTK7 war noch in der Lage, den GM1-Gangliosid-Rezeptor zu binden, zeigte aber den völligen Verlust der enzymatischen Aktivität, in Übereinstimmung mit publizierten Ergebnissen (Lobet et al., Infect. Immun. 1991; 59: 2870–2879). Darüber hinaus war LTK7 inaktiv im Dünndarm-Schlingen-Test der Maus und in vitro an Y1-Zellen, selbst wenn eine Dosis getestet wurde, die 10⁷ toxischen Einheiten von Wild-Typ LT entsprach (Tabelle 1).
In vivo- und in vitro-Eigenschaften von LT und von der LT K-7 Mutante

TABELLE 1

	LT	LT-K7	LT/LTK7
Codon in Position 7 der A-Untereinheit	CGT	AAG	-
Aminosäure in Position 7 der A-Untereinheit	Arg	Lys	-
ADP-Ribosyltransferase-Aktivität der A-Untereinheit	0,06 μg	>> 20 μg	<< 3 × 10^–3*
In vivo Maus-Dünndarm-Schlinge	10 μg	>> 500 μg/Maus	<< 0,02**
In vitro-Toxizität an YI-Zellen	10 pg/ml	>> 100 μg/ml	<< 10^–7**
Bindung an Eukaryonten	+	+	1

* Von Lobet et al. publizierte Daten und in dieser Studie bestätigt
** Diese Studie
>> Bedeutet, dass LT-K7 noch enzymatisch inaktiv war oder nicht-toxisch, wenn die höchste Konzentration getestet wurde, die in der Tabelle gezeigt wird.
<< Bedeutet, dass die tatsächliche Differenz höher ist als die gezeigte Zahl, die die getestete Differenz angibt.

Die Fähigkeit von LTK7, als Schleimhautadjuvans zu fungieren, wurde in Mäusen getestet. Mäuse wurden in Gruppen aufgeteilt und immunisiert, unter Verwendung von Ovalbumin als Reporter-Antigen. Tiere wurden intranasal (i/n oder subkutan (s/c) immunisiert, unter Verwendung von 10 μg Ovalbumin allein oder Ovalbumin gemischt mit entweder 1 μg CT, LT oder LTK7. Die Mäuse wurden in vier Gruppen zu sechs Mäusen aufgeteilt. Vier Mäuse von jeder Gruppe wurden leicht anästhesiert und mit entweder 10 μg Ovalbumin oder mit 10 μg Ovalbumin mit 1 μg der Toxine immunisiert, verabreicht in einem Gesamtvolumen von 30 μl. Die restlichen beiden Mäuse wurden mit derselben Menge an Proteinen s/c immunisiert in einem Gesamtvolumen von 100 μl. Subkutan verabreichte Proteine wurden zunächst an 2%-igem Al(OH)₃ adsorbiert.
Die Tiere wurden am Tag 1, 22, 36 und 61 immunisiert. Blutproben von 100 μl wurden an den Tagen 0, 21, 35, 56 genommen und am Tag 76 wurden die Tiere durch Herzpunktion getötet.
Die Menge an Antikörpern wurde durch ELISA bestimmt. Zur Bestimmung der Ovalbumin-spezifischen Antikörper wurden EIA-Platten mit 96 Vertiefungen (costar) über Nacht mit 60 μg/ml Ovalbumin beschichtet. Die Messung von Toxin-spezifischen Antikörpern wurde unter Verwendung eines GM1-Capture-ELISA durchgeführt. Toxinspezifische Antikörper wurden gegen das Antigen gemessen, das zur Immunisierung verwendet wurde. Bei der Bestimmung der Toxin-spezifischen Antikörper von jeder Gruppe wurden keine einzelnen Toxine verwendet, und deshalb können die Titer als solche zwischen diesen Gruppen nicht direkt verglichen werden.
Die Seren von jeder Gruppe wurden von vier bzw. zwei Mäusen gesammelt. Proben wurden zweifach hergestellt aus einer Verdünnung von 1:50. Die Absorptionen wurden bei 450 nm bestimmt unter Verwendung des kineticalc version 2.13-Programms (Biotek instruments). Dieses Programm berechnet die Rate der Änderung an Substrat über dreißig Zeitpunkte, die 10 Sekunden voneinander getrennt sind.
Die ELISA-Titer an Antikörpern wurden willkürlich gemessen als die Verdünnung an Serum, die die halbe maximale Absorption bei 450 nm ergab. Seren, deren Absorption bei 450 nm nicht 2,5 mal höher war als die der entsprechenden Seren vor der Immunisierung, wurden als negativ angesehen. Die in 1a und 1b gezeigten Werte zeigen den mittleren Titerwert der beiden Vertiefungen von einem Experiment. Keine signifikanten Level von Antikörpern gegen Ovalbumin über dem Untergrund wurden in Mäusen gefunden, die i/n mit Ovalbumin allein immunisiert waren, obwohl Mäuse, die s/c immunisiert waren, eine effiziente Serokonversion zeigten. Mäuse, die Ovalbumin zusammen mit entweder CT oder LT i/n erhielten, enthielten in ihren Seren sehr hohe Spiegel an Anti-Ovalbumin-Antikörpern. Diese waren äquivalent zu denen, die bei Mäusen beobachtet wurden, die s/c immunisiert wurden. Mäuse, die Ovalbumin zusammen mit LTK7 erhielten, zeigten ebenfalls sehr hohe Spiegel an Antikörpern gegen Ovalbumin.
Die Spiegel an Anti-Toxoid-Antworten in denselben Gruppen werden in 1b gezeigt. Alle Mäuse, einschließlich der mit dem mutierten Toxin immunisierten, entwickelten in ihren Seren hohe Spiegel an Antikörpern gegen diese Toxine.
Die lokalen sekretorischen Antikörperspiegel gegen Ovalbumin wurden sowohl an Lungen- als auch an Nasenwaschungen gemessen (2). Kurz gesagt wurden die Tiere durch Herzpunktion getötet und seziert, so dass die Luftröhre freilag. Eine ultradünne Pipette wurde dann in einen kleinen Einschnitt in der Luftröhre eingeführt. Lungenwaschungen wurden gesammelt durch wiederholtes Spülen und Absaugen von 1,5 ml von 0,1% Rinderserumalbumin (Sigma), in PBS, in der Lunge. Nasenwaschungen wurden gesammelt durch Spülen von 1 ml von 0,1% BSA in PBS durch die Nasenhöhle.
Ovalbumin-spezifische IgA-Antikörper wurden mit ELISA gemessen unter Verwendung eines Anti-Maus-alpha-Ketten-spezifischen konjugierten Antikörpers (Serotec). Proben wurden von individuellen Tieren hergestellt und Spalten in dieser Figur bedeuten den Mittelwert der Veränderung an Substrat, unter Verwendung von kineticalc, für vier und zwei Mäuse, die jeweils i/n bzw. s/c immunisiert waren. Die Figuren wurden erstellt unter Verwendung der unbearbeiteten Absorptionsdaten bei einer Verdünnung von 1:3 in Bezug auf die Lungenwaschungen. Diese entsprechen Titern von zwischen 1:2 und 1:6 für Nasenwaschungen und zwischen 1:70 und 1:120 für Lungenwaschungen. Diese Titer wurden berechnet unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren. Mäuse, die s/c oder i/n mit Ovalbumin allein immunisiert waren, enthielten kein nachweisbares Ovalbumin-spezifisches IgA in den Waschproben. Alle individuellen Mäuse, die mit Ovalbumin in Kombination mit CT, LT oder LTK7 immunisiert waren, zeigten nachweisbare Spiegel von Anti-Ovalbumin-IgA. Deshalb ist sowohl eine lokale als auch eine systemische Anti-Ovalbumin-Antwort in diesen Tieren nachweisbar.

Angesichts dieser ermutigenden Experimente mit Ovalbumin wurden die Immunisierungen wiederholt unter Verwendung von Fragment C, einem nicht-toxischen 50.000 Dalton-Fragment von Tetanus-Toxin, das in der Hefe Pichia pastoris exprimiert und daraus gereinigt wurde. Mäuse wurden entweder s/c oder i/n mit Fragment C alleine oder gemischt mit einzelnen Proben von entweder LT oder LTK7 immunisiert. Die Mäuse wurden aufgeteilt in vier Gruppen von zehn Mäusen und vier Gruppen von fünf Mäusen. 10 Mäuse wurden i/n immunisiert mit a) 10 μg von Fragment C allein; b) 10 μg von Fragment C + 1 μg LT; c) 10 μg von Fragment C + 1 μg LTK7 und d) PBS allein, alles in einem Endvolumen von 30 μl. Fünf Mäuse wurden immunisiert i/n mit a) 1 μg LT und b) 1 μg LTK7. Die restlichen zwei Gruppen an Mäusen wurden s/c immunisiert mit entweder keinem Protein oder mit 10 μg von Fragment C in einem Dosisvolumen von 100 μl. Diese Impfstoffe wurden hergestellt wie in 1 beschrieben. Die Tiere wurden an Tag 1 und 22 immunisiert. Blutproben von 100 μl wurden an Tag 0, 21 und 35 entnommen. Fragment C-spezifische Antikörper wurden mittels ELISA gemessen unter Verwendung von Tetanus-Toxin (10 μg/ml) als Antigen zum Beschichten. Die Seren von den einzelnen Gruppen wurden vereinigt. Proben wurden doppelt hergestellt bei einer Verdünnung von 1:50. ELISA-Titer wurden wie oben beschrieben berechnet. Mäuse, die s/c mit Fragment C immunisiert waren, waren effizient sero-konvertiert und produzierten hohe Spiegel an Anti-Fragment C-Antikörpern (3). Mäuse, die i/n mit Fragment C allein immunisiert waren, zeigten keine signifikante Serokonversion. Mäuse jedoch, die mit Fragment C in Kombination mit LT oder LTK7 immunisiert waren, zeigten hohe Spiegel von Antikörpern gegen Fragment C in ihren Seren (3). Da Mäuse, die eine Serokonversion gegen Fragment C haben, gegen Toxin geschützt werden können, wurden die Gruppen aktivem Tetanus-Toxin ausgesetzt. Alle Mäuse, die s/c mit Fragment C allein immunisiert waren, waren geschützt, während alle Mäuse, die i/n immunisiert waren, in hohem Maße sensitiv waren. Alle Mäuse, die i/n mit Fragment C in Kombination mit entweder LT oder LTK7 immunisiert waren, überlebten die Konfrontation (Tabelle 2). TABELLE 2

	Serum Anti-Fragment C	Tote
LT	....	10/10
LTK7	...	10/10
LTK7 + Fragment C	++	0/10
Lt + Fragment C	++++	0/10
Fragment C	+/–	10/10
Der Titer an Antikörpern gegen Fragment C im Serum von Mäusen war im Durchschnitt 1/3.000 in Mäusen, die mit der Mutante K7 + Fragment C geimpft waren, und 1/12.000 mit LT + Fragment C.

Diese Experimente zeigen, dass eine schützende Immunität gegen Tetanus durch die Verwendung einer nicht-toxischen LT-Mutante als Adjuvans erreicht werden kann und dass eine mucosale Immunisierung mit diesem Molekül sowohl eine lokale sekretorische als auch eine systemische Immunantwort auf das Toxin und gleichzeitig gegebene andere Antigene hervorrufen kann.

Claims

Arzneimittel, umfassend ein nicht-toxisches Mucosa-Adjuvans im Gemisch mit einem zweiten Antigen, dadurch gekennzeichnet, dass (a) das nicht-toxische Mucosa-Adjuvans ein entgiftetes bakterielles ADP-ribosylierendes Toxin mit einer mutierten A-Untereinheit ist, wobei das bakterielle ADP-ribosylierende Toxin hitzelabiles E. coli-Toxin (LT) ist, und (b) das zweite Antigen ein virales oder bakterielles Antigen ist, das von einem pathogenen Organismus stammt.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei das nicht-toxische Mucosa-Adjuvans eine oder mehrere Aminosäureadditionen, -deletionen oder -substitutionen in der A-Untereinheit des Holotoxins umfasst.
Arzneimittel nach Anspruch 2, wobei das nicht-toxische Mucosa-Adjuvans LT-K7 ist.
Verwendung eines entgifteten bakteriellen ADP-ribosylierenden Toxins mit einer mutierten A-Untereinheit als Mucosa-Adjuvans für die Herstellung einer Zusammensetzung zur mucosalen Verabreichung, wobei das bakterielle ADP-ribosylierende Toxin Cholera-Toxin (CT) oder hitzelabiles E. coli-Toxin (LT) ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Zusammensetzung ein Impfstoff ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Impfstoff für die Verwendung in prophylaktischen oder therapeutischen Anwendungen bestimmt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Zusammensetzung des Weiteren ein zweites Antigen umfasst.
Verwendung eines Mucosa-Adjuvans zur Herstellung eines Impfstoffs, wobei das Mucosa-Adjuvans ein entgiftetes bakterielles ADP-ribosylierendes Toxin mit einer mutierten A-Untereinheit ist, und wobei das bakterielle ADP-ribosylierende Toxin Cholera-Toxin (CT) oder hitzelabiles E. coli-Toxin (LT) ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei der Impfstoff zur oralen oder intranasalen Verabreichung bestimmt ist.
Arzneimittel, umfassend ein nicht-toxisches Mucosa-Adjuvans und ein zweites Antigen zur gleichzeitigen Verabreichung, wenn sie in einem einzigen Vehikel, Träger oder Partikel kombiniert sind, dadurch gekennzeichnet, dass (a) das nicht-toxische Mucosa-Adjuvans ein entgiftetes bakterielles ADP-ribosylierendes Toxin mit einer mutierten A-Untereinheit ist, wobei das bakterielle ADP-ribosylierende Toxin hitzelabiles E. coli-Toxin (LT) ist, und (b) das zweite Antigen ein virales oder bakterielles Antigen ist, das von einem pathogenen Organismus stammt.
Verfahren zur Herstellung eines adjuvierten Impfstoffs, umfassend die Schritte: (a) Durchführen einer ortsspezifischen Mutagenese in der A-Untereinheit eines bakteriellen ADP-ribosylierenden Toxins, um das Toxin zu entgiften; und (b) Inkontaktbringen des entgifteten Toxins mit einem zweiten Antigen, so dass es als Mucosa-Adjuvans fungiert, dadurch gekennzeichnet, dass (a) das bakterielle ADP-ribosylierende Toxin ein hitzelabiles E. coli-Toxin (LT) ist und (b) das zweite Antigen ein virales oder bakterielles Antigen ist, das von einem pathogenen Organismus stammt.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 10, wobei das Antigen in langsam freisetzende Mikrosphären eingeschlossen ist.