PT732937E - Adjuvante nao toxico das mucosas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: ADJUVANTE NÃO TÓXICO DAS MUCOSAS’’

Campo do invento O presente invento relaciona-se com um adjuvante útil para a administração de vacinas a organismos. Em particular, o adjuvante do invento permite a administração de vacinas a superfícies mucosas com o fim de induzir uma resposta imune secretória e sistémica.

Antecedentes do invento A tecnologia de vacinação actual baseia-se quase exclusivamente em técnicas de vacinação sistémica, segundo as quais a vacina é injectada no indivíduo a ser vacinado. Apenas algumas vacinas vivas/atenuadas, como a vacina de Sabin contra a poliomielite, se podem tomar por via oral.

As vantagens das técnicas de imunização oral são múltiplas. Por exemplo, tornar-se-á evidente que uma vacina que pode ser dada por via oral aos indivíduos a vacinar é mais fácil de administrar em larga escala na ausência de equipamento especializado, especialmente quando os indivíduos em causa são de trato ou mesmo de localização difícil, como acontece com o gado ou os animais selvagens. A disseminação de infecções através da reutilização de agulhas nos países em vias de desenvolvimento seria, desta forma, evitada. Adicionalmente, poderá produzir-se uma vacina sob a forma de sólido comestível, de tratamento mais simples sob condições extremas e mais estável do que as suspensões líquidas actualmente

Para além destas vantagens, a administração de imunogénios a uma membrana mucosa, por vacinação oral ou intranasal, permitiria a indução de uma resposta imune secretória. A resposta imune secretória, fundamentalmente mediada por IgA, parece diferir substancialmente da resposta imune sistémica. A vacinação sistémica é ineficaz na indução de uma resposta imune secretória. Tal constitui uma desvantagem considerável quando se considera a imunização contra os patogénios que frequentemente penetram no indivíduo através de uma membrana mucosa, tal como os intestinos ou os pulmões.

Infelizmente, não é possível induzir uma resposta imune secretória contra a grande maioria dos antigénios apenas por exposição da superfície da mucosa a estes antigénios. Para além disto, não existem actualmente adjuvantes com a capacidade de induzir uma resposta imune secretória contra um dado antigénio.

Esta aparente dificuldade deve-se principalmente a um fenómeno conhecido por tolerância oral. Os revestimentos mucosos dos intestinos e dos pulmões são naturalmente tolerantes a antigénios estranhos, o que impede que seja produzida uma resposta imune contra as substâncias ingeridas ou inaladas, tais como os alimentos e as partículas transportadas pelo ar.

As toxinas bacterianas ribosilantes do ADP, nomeadamente a toxina diftérica, a toxina de Bordetella pertussis (PT), a toxina da cólera (CT), a toxina lábil ao calor de E. coli (LT1 e LT2), a endotoxina A de Pseudomonas, as toxinas C2 e C3 de C. botulinum, assim como as toxinas de C. perfringens, C. spiriforma e C. difficile, são toxinas potentes para o homem. Estas toxinas são compostas por uma subunidade A monomérica e enzimaticamente activa, que é responsável pela ribosilação do ADP pelas proteínas de ligação ao GTP, e uma subunidade B, não tóxica, que se liga a receptores na superfície da célula-alvo e liberta a subunidade A através da membrana celular. No caso da CT e da LT, sabe-se que a subunidade A aumenta a concentração intracelular de cAMP nas células-alvo, enquanto que a subunidade B é pentamérica e se liga aos receptores gangliosídicos GM1. 2

Certas observações feitas em 1975 e 1978 demonstraram que a CT tem a capacidade de induzir uma resposta imune, a nível mucoso e sistémico, contra si própria quando administrada intraduodenalmente (i.e., a uma superfície mucosa). Demonstrou-se que a função de ligação às membranas exibida pela CT é essencial para a imunogenicidade a nível das mucosas, mas o toxóide da cólera, também conhecido por subunidade B da CT (CTB), mostrou-se inactivo quando isolado (Pierce e Gowans, J. Exp. Med. 1975; 142: 1550; Pierce, J. Exp. Med. 1978; 148: 195-206).

Subsequentemente, foi demonstrado que a CT induz uma imunidade mucosa e sistémica contra antigénios co-administrados, ou, por outras palavras, funciona como um adjuvante das mucosas (Elson, Curr. Top. Microbiol. Immunal., 1989; 146: 29; Elson e Ealding, J. Immunol. 1984; 133: 2892-2897; Elson e Ealding, Ibid. 1984; 132: 2736-2741; Elson et al., J. Immunol. Methods 1984; 67: 101-118; Lycke e Homgren, Immunology 1986; 59: 301-338).

As experiências acima referidas foram realizadas em ratos, que são comparativamente resistentes aos efeitos tóxicos da CT. Em contraste, a CT de tipo selvagem é extremamente tóxica para os seres humanos, o que faz com que a ideia de utilizar uma CT de toxicidade residual substancial como adjuvante das mucosas em seres humanos esteja inteiramente fora de questão.

Foram já anteriormente tomadas duas abordagens técnicas distintas para contornar o problema da toxicidade da CT. A primeira abordagem envolveu a utilização da CTB como adjuvante das mucosas. A CTB é inteiramente não tóxica.

Em uma das séries experimentais, a CTB foi reunida por ligação covalente à peroxidase de rábano (HRP) e administrada intraduodenalmente a ratos. Isto desencadeou uma poderosa resposta imune a nível das mucosas, dirigida contra a HRP (McKenzie e Halsey, J. Immunol. 1984; 133: 1818-1824).

Este resultado foi subsequentemente confirmado de modo parcial utilizando outros antigénios (Liang et al., J. Immunol. 1988; 141: 1495-1501; Czerkinsky et al., Infect. Immun. 1989; 57: 1072-1077). A eficácia do mesmo princípio foi estabelecida ao testar antigénios quiméricos produzidos por fusão de genes a sequências 3 codificando para a CTB (Dertzbaugh e Elson, Infect. Immun. 1993; 61; 384-390; Dertzbaugh e Elson, Ibid. 1993; 61: 48-55; Sanchez et al., Res. Microbiol. 1990; 141: 971-979; Holmgren et al., Vaccine 1993; H: 1179-1184).

No entanto, a produção de antigénios quiméricos ou acoplados introduz um passo adicional na preparação de vacinas adequadas, passo esse que requer essencialmente que os antigénios sejam preparados sob forma conjugada com CTB especialmente para uso oral. O processo resultaria bastante mais simples e económico se o adjuvante pudesse ser administrado por simples mistura com o antigénio.

Diversas publicações alegaram já existir um efeito adjuvante da CTB co-administrada (Tamura et al., J. Immunol. 1992; 149: 981-988; Hirabayashi et al., Immunology 1992; 75: 493-498; Gizurarson et al., Vaccine 1991; 9: 825-832; Kikuta et al., Vaccine 1970; 8: 595-599; Hirabayashi et al., Ibid. 1990; 8: 243-248; Tamura et al., Ibid. 1989; 7: 314-32-; Tamura et al., Ibid. 1989; 7: 257-262; Tamura et al., Ibid. 1988; 6: 409-413; Hirabayashi et al., Immunology 1991; 72: 329-335; Tamura et al., Vaccine 1989; 7: 503-505).

No entanto, diversos aspectos das observações acima referidas não foram inteiramente convincentes. Por exemplo, verificou-se que o efeito adjuvante atribuído à CTB não se restringia aos receptores H-2. Sabe-se, no entanto, que a resposta imune à CTB se restringe aos receptores H-2 (Elson e Ealding, Eur. J. Immunol. 1987; 17: 425-428). Para além disto, o alegado efeito adjuvante foi observado até nos indivíduos que eram já imunes à CTB.

Outros grupos de trabalho não observaram qualquer efeito adjuvante das mucosas atribuível à CTB (Lycke e Holmgren, Immunology 1986; 59: 301-308; Lycke et al., Eur. J. Immunol. 1992; 22: 2277-2281). As experiências com CTB recombinante (Holmgren et al., Vaccine 1993; 11.: 1179-1183) confirmaram que o alegado efeito adjuvante é principalmente, se não exclusivamente, atribuível à contaminação das preparações de CTB com baixas concentrações de CT.

Assim, é actualmente aceite que a CTB não tem utilidade como adjuvante das mucosas. 4

Uma segunda tentativa de eliminação da toxicidade da CT envolveu a mutação da holotoxina da CT com o objectivo de reduzir ou eliminar a sua toxicidade. A toxicidade da CT reside na subunidade A, e são conhecidos da técnica diversos mutantes da CT e da sua homóloga, a LT, contendo mutações pontuais da subunidade A. Ver, por exemplo, o Pedido de Patente Internacional W092/19265 (Amgen). Neste campo técnico, a CT e a LT são consideradas como genericamente correspondentes por exibirem um grau considerável de homologia.

Todavia, para o único mutante até agora testado quanto às suas propriedades de adjuvante das mucosas, um mutante da LT possuindo uma mutação Glu->Lys na posição 112, verificou-se a sua inactividade neste âmbito (Lycke et al; Eur. J. Immunol. 1992; 22: 2277-2251; Holmgren et al., Vaccine 1993; 11: 1179-1183). Os autores destas publicações concluíram que existe uma ligação entre a actividade de ribosilação do ADP exibida pela CT e/ou LT e a actividade adjuvante. Assim, parece inferir-se destas publicações que a CTB ou um mutante não tóxico da CT ou da LT não serão activas como adjuvantes das mucosas. O pedido de patente WO95/09649 (Medeva Holdings BV) propõe o uso de uma forma duplamente mutante, não tóxica, da toxina pertússica para o fabrico de uma composição adjuvante destinada a estimular ou a acentuar uma resposta imune de protecção contra um antigénio co-administrado.

Resumo do invento

Existe, portanto, a necessidade de encontrar um adjuvante activo das mucosas que possa ser utilizado para aumentar a imunogenicidade de um antigénio quando administrado a uma superfície mucosa, tal como por administração oral ou intranasal.

Foi agora descoberto que, em completa contradição com os resultados e conclusões apresentados anteriormente neste campo, as actividades tóxica e adjuvante das toxinas ribosilantes do ADP são separáveis. Foi demonstrada a actividade como adjuvante das mucosas de um mutante inteiramente não tóxico de uma toxina deste tipo. 5

Verificou-se que um mutante da LT , completamente isento de toxicidade, possui actividade como adjuvante das mucosas e protege os indivíduos contra uma provocação subsequente com uma dose letal do imunogénio. Apesar de não se pretender vincular este invento a qualquer teoria em particular, considera-se que os resultados de Lycke et al. e de Holmgren et al., acima citados, poderão ser pelo menos parcialmente questionados por não tomarem em conta a estabilidade do mutante produzido. Assegurando, entre outros factores, que o mutante não tóxico do invento é estável a nível do local de libertação, foi possível demonstrar que o efeito adjuvante da CT e/ou LT pode ser mantido enquanto que os seus efeitos tóxicos são eliminados.

Num primeiro aspecto, o presente invento fornece uma composição farmacêutica composta por um adjuvante não tóxico das mucosas em mistura com um segundo antigénio, caracterizada pelo facto de o dito adjuvante não tóxico das mucosas ser uma toxina bacteriana destoxificada ribosilante do ADP possuindo uma subunidade A mutante (tendo como restrição o facto de o dito adjuvante não tóxico das mucosas não poder corresponder a uma forma duplamente mutante e não tóxica da toxina pertússica - ver WO95/09649). A toxina bacteriana destoxificada ribosilante do ADP compreende, de preferência, uma ou mais adições, delecções ou substituições de aminoácidos.

Os mutantes destoxificados da CT ou LT são particularmente adequados. Por exemplo, uma LT mutante em consonância com o invento poderá possuir uma substituição de Arg7 para Lys7 a nível da posição 7 da subunidade A, sendo este mutante designado por LTK7. São conhecidos dos peritos na técnica mutantes alternativos que constituem moléculas preferidas para uso no âmbito do presente invento. Os exemplos incluem a PT com uma mutação na posição 129, em particular a PT possuindo uma mutação Glu 129-»Gly. Outros mutantes incluem a PT com uma mutação a nível do Trp 26 ou do Arg 9, ou de ambos, opcionalmente em combinação com a mutação em Glu 129. 6

O mutante utilizado no invento poderá ainda corresponder a uma forma em que a mutação é efectuada numa parte da molécula que resulta na prevenção do corte proteolítico da subunidade A da toxina, de tal forma que a actividade enzimática não é desencadeada. Tais mutantes encontram-se descritos em Grant et al., Inf. and Immunity (1994) 62 (10) 4270-4278. Por exemplo, o mutante poderá compreender uma mutação Arg 192-»Gly da LT ou uma mutação correspondente em outra toxina ribosilante do ADP. O mutante do invento poderá corresponder a uma holotoxina compreendendo a subunidade A com mutação e a subunidade B, e que poderá ser oligomérica, tal como acontece com a holotoxina de tipo selvagem. De preferência, a subunidade B não sofre mutação. No entanto, é possível utilizar apenas uma subunidade A com mutação, separada da subunidade B, tanto em forma essencialmente pura como complexada com outros agentes que poderão substituir a subunidade B e/ou suprir a sua contribuição funcional.

Os métodos de concepção e produção de mutantes da CT e/ou LT são já conhecidos da técnica. São descritos métodos adequados no Pedido de Patente Internacional WO93/13202 (Biocine Sclavo), assim como em W092/19265 (Amgen). O adjuvante do invento é preferencialmente administrado em mistura com um antigénio adequado contra o qual se deseja desencadear uma resposta imune. Se o antigénio e o adjuvante não estiverem misturados, é preferível que a administração de ambos se faça num intervalo de tempo relativamente curto e se utilize o mesmo local de administração. Observou-se que o efeito adjuvante proporcionado pela CT de tipo selvagem é de curta duração (ver Lycke e Holmgren, Immunology 1986; 59: 301-308). Numa forma de realização alternativa, o adjuvante das mucosas deste invento poderá ser administrado, opcionalmente isolado de outros antigénios, como um estimulante da reacção do organismo após a administração sistémica ou a mucosas de uma vacina. A formulação precisa da vacina poderá variar de acordo com a natureza do imunogénio. Por exemplo, se o antigénio estiver encerrado em microsferas ou lipossomas de libertação lenta, o adjuvante das mucosas poderá ser incluído em 7 sistemas semelhantes de forma a que o antigénio e o adjuvante possam interagir simultaneamente com o sistema imunitário das mucosas. Alternativamente, o adjuvante poderá ser administrado às mucosas em separado, com o fim de amplificar a resposta das mucosas a vacinas administradas por via parentérica.

Num segundo aspecto, o presente invento faculta a utilização de um mutante não tóxico da CT ou LT como adjuvante das mucosas na preparação de uma composição para administração a mucosas.

De preferência, esta composição constitui uma vacina e possui utilidade na imunização de um indivíduo contra uma doença ou no tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença.

Preferencialmente ainda, o mutante sofreu uma ou mais adições, substituições ou delecções na sequência de aminoácidos da subunidade A da CT ou LT, alteração, ou alterações, esta(s) que demonstra(m) eficácia na abolição da toxicidade da toxina.

De acordo com um terceiro aspecto do invento, é facultado o uso de um adjuvante não tóxico das mucosas e de um segundo antigénio durante o fabrico da vacina, com a ressalva de que o dito adjuvante não tóxico das mucosas não corresponda a uma forma não tóxica duplamente mutante da toxina pertússica. A superfície mucosa poderá corresponder a qualquer superfície adequada de mucosa do indivíduo. Por exemplo, a administração poderá ser efectuada por inalação, por meio de um supositório vaginal ou rectal, através de um pessário, por ingestão ou por outra forma de administração bucal, por meio de um aerossol, por administração intranasal ou por aplicação directa às superfícies mucosas. São especialmente preferidas a vias de administração oral e intranasal. O indivíduo poderá ser qualquer organismo susceptível à imunização. São especialmente indicados os seres humanos e outros mamíferos como o gado, os animais de estimação e os animais selvagens.

As doenças contra as quais o indivíduo poderá ser imunizado incluem todas as doenças que podem ser tratadas ou prevenidas através da imunização, incluindo as doenças virais, as manifestações alérgicas, as doenças causadas por patogénios 8 virais, ou outros, que penetram através das superfícies mucosas ou as colonizam, a SIDA, as doenças autoimunes tal como o lúpus eritematoso sistémico, a doença de Alzheimer e cancros. Os exemplos de infecções virais que podem ser tratadas ou evitadas utilizando o invento incluem a infecção por vírus DNA, tais como o EBV e o VZV. e em particular os herpesvírus, por exemplo o HSV e o HCMV, os adenovírus, os papovavírus, tal como o HPV, os hepadnavírus, tal como o HBV; a infecção por vírus RNA, tais como os picornavírus, especialmente os polivírus e o HAV, os rinovírus e o FMDV, os togavírus, os flavivírus, os coronavírus, os paramixovírus, tal como o RSV, os ortomixovírus, tal como o vírus da influenza, e os retrovírus, especialmente o HIV. A vacinação contra o HCV e o HDV é igualmente contemplada.

Os exemplos de infecções bacterianas adequadas para tratamento ou profilaxia por meio do invento incluem a infecção por Helicobacter pylori, estreptococos, meningococos A, B e C, Bordetella pertussis e Chlamydia trachomatis.

As formulações de vacina adequadas para administração a superfícies mucosas poderão ser preparadas tal como abaixo descrito, sendo que a preparação de outras formulações se tornará evidente aos peritos na técnica. São igualmente descritos regimes de administração adequados, sendo que os peritos na técnica poderão facilmente produzir modificações nos valores exemplificados.

Adicionalmente, o invento fornece um mutante da CT ou da LT, que constitui um adjuvante não tóxico das mucosas, e um segundo antigénio, destinados a administração simultânea, em separado ou sequencial. A administração simultânea do adjuvante e do segundo antigénio combinados num só veículo, transportador ou partícula, tal como abaixo exemplificado, é particularmente preferida. O segundo antigénio poderá ser um antigénio para o qual é desejável estimular uma resposta imune no indivíduo. Os antigénios adequados incluem antigénios bacterianos, virais e protozoários derivados de organismos patogénicos, assim como alergenos, alogénios e antigénios derivados de tumores e autoantigénios. Tipicamente, o antigénio corresponderá a uma proteína, um 9 polipéptido ou um péptido, mas não é excluída a possibilidade de uso de estruturas antigénicas alternativas, tal como antigénios de ácidos nucleicos, antigénios de hidratos de carbono e organismos íntegros, atenuados ou inactivados, tais como bactérias, vírus ou protozoários. O invento proporciona ainda um método de fabrico de uma vacina com adjuvante que compreende os passos de: a) realização de uma mutagénese específica de local sobre a subunidade A de uma toxina bacteriana ribosilante de ADP, com o fim de destoxificar a toxina; e b) associação da toxina destoxificada a um segundo antigénio, de modo a que funcione como um adjuvante das mucosas.

Os exemplos específicos de antigénios úteis no âmbito do presente invento incluem as glicoproteínas do HSV gD, gB e outras; a proteína gp120 do HIV e outras; as proteínas gB ou gH do CMV ; os antigénios do HCV; o antigénio delta do HDV; os antigénios do HAV; os antigénios do EBV e do VZV; os antigénios de B. pertussis e de H. pylori.

Em geral, o segundo antigénio poderá constituir o elemento imunogénico da vacina que se pretende preparar para injecção. Tais vacinas, e os seus componentes imunogénicos, poderão corresponder a vacinas de subunidade, organismos íntegros inactivados ou atenuados ou vacinas de polinucleótidos.

As vacinas preparadas de acordo com o invento poderão ser profilácticas (para evitar a infecção) ou terapêuticas (para tratar a doença após a infecção).

Estas vacinas compreendem um antigénio ou antigénios, normalmente em combinação com “veículos farmaceuticamente aceitáveis”, os quais incluem qualquer veículo que não induza por si próprio a produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo que recebe a composição.

Os veículos adequados são tipicamente grandes macromoléculas de metabolização lenta, tais como proteínas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados de lípidos (tais como emulsões de gotículas de óleo ou lipossomas) e partículas 10 inactivas de vírus. Tais veículos são bem conhecidos dos técnicos de perícia média. Em aspectos preferenciais do invento, estes veículos poderão funcionar como agentes imunoestimulantes (“adjuvantes”). Adicionalmente, o antigénio poderá ser conjugado com um toxóide bacteriano, tal como um toxóide dos patogénios da difteria, tétano, cólera, H. pylori, etc.

Os adjuvantes preferidos para acentuar a eficácia da composição incluem, não se limitando a: (1) sais de alumínio (aíum), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc.; (2) formulações de emulsão óleo-em-água, (com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos, como os muramilpéptidos [ver abaixo] ou componentes de paredes celulares bacterianas), tais como, por exemplo, (a) MF59™ (Publ. PCT N° WO 90/14837)t contendo 5% de esqualeno, 0,5% de Tween™ 80 e 0,5% de Span 85 (contendo opcionalmente quantidades variáveis de MTP-PE [ver abaixo], se bem que tal não seja requerido), formulado em partículas submicrónicas por utilização de um microfluidificador tal como o microfluidificador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, contendo 10% de esqualeno, 0,4% de Tween™ 80, 5% de polímero L121 de blocos plurónicos e thr-MDP (ver abaixo), podendo proceder-se a uma microfluidização, de modo a formar uma emulsão submicrónica, ou a uma vortexação, para gerar uma emulsão de partículas de maiores dimensões; e (c) sistema adjuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) contendo 2% de esqualeno, 0,2% de Tween™ 80 e um ou mais componentes de paredes celulares bacterianas pertencentes ao grupo formado pelo monofosforil-lípido A (MPL), dimicolato de trealose (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS), de preferência MPL + CWS (Detox™); poderão utilizar-se adjuvantes de saponinas, tal como o Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), ou partículas geradas a partir destes, tais como ISCOMs (complexos imunoestimulantes); (4) Adjuvante Completo de Freund (CFA) e Adjuvante Incompleto de Freund (IFA); (5) citoquinas, tais como as interleuquinas (p.ex., IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferões (p. ex., interferão gama), factor estimulante de colónias de macrófagos (M-CSF), factor de necrose de tumor (TNF), 11 1 c

etc.; e (6) outras substâncias que agem como agentes imunoestimulantes para aumentar a eficácia da composição. São preferidos o alum e o MF59.

Tal como mencionado acima, os muramilpéptídos incluem, mas não se limitam a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-l-alanil-d-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-l-alanil-d-isoglutaminil-l-alanina-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

As composições imunogénicas (p. ex., o antigénio, o veículo farmaceuticamente aceitável e o adjuvante) contêm tipicamente diluentes, tais como água, soro fisiológico, glicerol, etanol, etc.

Adicionalmente, poderão estar presentes em tais veículos substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsificantes, substâncias tamponantes de pH e outras.

Tipicamente, as composições imunogénicas são preparadas como injectáveis, sob a forma de soluções ou suspensões líquidas; poderão igualmente preparar-se formas sólidas que sejam adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injecção. A preparação poderá igualmente ser emulsificada ou encapsulada em lipossomas para que se obtenha um efeito adjuvante aumentado, tal como acima exposto para os veículos farmaceuticamente aceitáveis.

As composições imunogénicas usadas como vacinas compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz dos polipéptidos antigénicos, juntamente com qualquer dos componentes acima referidos, segundo necessário. Por “quantidade imunologicamente eficaz” pretende-se significar que a administração daquela quantidade a um indivíduo, em dose única ou como parte de uma série, é eficaz para fins de tratamento ou prevenção. Esta quantidade varia, dependendo da saúde e da condição física do indivíduo a ser tratado, do grupo taxonómico do indivíduo a ser tratado (p.ex., primata não humano, primata, etc.), da capacidade de síntese de anticorpos apresentada pelo sistema imunológico do indivíduo, do grau de protecção desejado, da formulação da vacina, da avaliação da situação clínica feita pelo médico responsável pelo tratamento e de outros factores relevantes. É esperado 12 que esta quantidade esteja contida num intervalo relativamente largo que poderá ser determinado através de ensaios de rotina.

As composições imunogénicas são convencionalmente administradas por via parentérica, ou seja, por injecção, tanto subcutânea como intramuscular. Outras formulações adequadas a outros modos de administração incluem formulações orais e pulmonares, supositórios e aplicações transdérmicas. A dosagem do tratamento poderá corresponder a um regime de dose única ou a um regime de doses múltiplas. A vacina poderá ser administrada em conjunção com outros agentes imunoreguladores.

Os exemplos de agentes imunoestimulantes adequados incluem as interleuquinas, tais como as interleuquinas 1, 2, 4-7 e 12, e os interferões, especialmente o interferão γ. A descrição do invento abaixo apresentada é fornecida apenas a título de exemplo, sendo feitas referências às Figuras seguintes:-

Descricão das Figuras A Figura 1a apresenta o titulo de anticorpos totais específicos contra a ovalbumina detectado em ratinhos BALB/c imunizados por via i.n. ou s.c. com ovalbumina isolada ou com ovalbumina associada a derivados de toxina; A Figura 1b mostra o título de anticorpos totais específicos contra a toxina detectado nos ratinhos da Figura 1a; A Figura 2 apresenta a medição dos níveis de IgA específica contra a ovalbumina presentes em lavados nasais e pulmonares dos ratinhos injectados segundo o procedimento da Figura 1; e A Figura 3 expõe a presença de anticorpos específicos contra o toxóide do tétano no soro de ratinhos BALB/c imunizados por via i.n. ou s.c. com o fragmento C da toxina do tétano, isolado ou associado a derivados da toxina. 13

Descrição detalhada do invento

Foi utilizada uma mutagénese específica de local para substituir o resíduo de arginina na posição sete da subunidade A da LT por lisina, de modo a construir um mutante não tóxico da LT que retém a capacidade de funcionar como holotoxina com actividade de ligação às células. A proteína mutante, designada por LTK7, foi purificada e testada quanto às actividades tóxica e de ADP-ribosiltransferase em diversos ensaios. A LTK7 demonstrou reter a capacidade de ligação ao receptor gangliosídico GM1 mas evidenciou uma completa perda de actividade enzimática, de acordo com os dados publicados (Lobet et al., Infect. Immun. 1991; 59: 2870-2879). Adicionalmente, a LTK7 mostrou-se inactiva no ensaio do segmento ileal de ratinho e, in vitro, em células Y1, mesmo quando foi testada uma dose equivalente a 107 unidades tóxicas da LT de tipo selvagem (Tabela 1).

Propriedades in vivo e in vitro da LT e do mutante LT K-7 TABELA 1 LT LT-K7 LT/LTK7 Codão na posição 7 da subunidade A CGT AAG - Aminoácido na posição 7 da subunidade A Arg Lys - Actividade de ADP-ribosiltransferase da Subunidade A 0,06 pg » 20 pg « 3.10'3’ Ensaio in vivo no segmento ileal de ratinho 10 pg »500 pg/ratinho « 0,02 ** Toxicidade in vitro em células Y1 10 pg/ml » 100 pg/ml « 10'7 ** Ligação a células eucarióticas + + 1

Dados publicados por Lobet et al. e confirmados neste estudo Neste estudo 14 » Significa que a LT-K7 se mostrou ainda enzimaticamente inactiva ou não-tóxica ao ser testada a concentração mais elevada que é apresentada na tabela. « Significa que a diferença real é superior ao número apresentado, o qual representa a diferença testada. A capacidade, exibida pela LTK7, de actuar como um adjuvante das mucosas foi avaliada em ratinhos. Os ratinhos foram separados em grupos e imunizados utilizando a ovalbumina como antigénio marcador. Os animais foram imunizados por via intranasal (i.n.) ou subcutânea (s.c.), utilizando 10 pg de ovalbumina isolada ou ovalbumina misturada com 1 pg de CT, LT ou LTK7. Os ratinhos foram divididos em quatro grupos com seis ratinhos cada. Quatro ratinhos de cada grupo foram levemente anestesiados e imunizados com 10 pg de ovalbumina isolada ou com 10 pg de ovalbumina associada a 1 pg de toxinas, correspondendo o volume total de administração a 30 pl. Os restantes dois ratos foram imunizados s.c. com a mesma quantidade de proteínas num volume total de 100 pl. As proteínas administradas subcutaneamente foram previamente adsorvidas em AI(OH)3 a 2%.

Os animais foram imunizados aos dias 1, 22, 36 e 61. Foram recolhidas amostras de 100 pl de sangue aos dias 0, 21, 35 e 56, e no dia 76 os animais foram sacrificados por perfuração cardíaca. A quantificação do anticorpo foi executada pelo método de ELISA. Para a avaliação dos anticorpos específicos contra a ovalbumina, foram revestidas placas de EIA com 96 cúpulas (costar), ao longo de 12 horas, com 60 pg/ml de ovalbumina. A medição dos anticorpos específicos contra as toxinas foi realizada um método ELISA de captura de GM1. Os anticorpos específicos contra as toxinas foram medidos face ao antigénio que foi usado nas imunizações. As toxinas não foram usadas isoladamente na medição de anticorpos específicos contra as toxinas em cada grupo, pelo que os títulos obtidos não permitem uma comparação directa entre os grupos. 15 A partir dos soros recolhidos em cada grupo, foi feito um “pool” de soros de quatro e de dois ratos, respectivamente. As amostras foram preparadas em duplicado a partir de uma diluição de 1:50. As absorvências foram lidas a 450 nm utilizando o programa de cálculo aplicado a reacções cinéticas, versão 2.13, da Biotek Instruments. Este programa calcula a taxa de conversão do substrato a partir de trinta pontos de tempo distanciados entre si em dez segundos.

Os títulos de anticorpo determinados por ELISA foram medidos arbitrariamente como correspondendo à diluição de soro que exibiu metade da absorvência máxima a 450 nm. Os soros que não evidenciaram uma absorvência a 450 nm 2,5 vezes superior à observada com os soros pré-imunes equivalentes foram considerados como negativos. Os resultados apresentados nas Figuras 1a e 1b representam os valores médios de titulação obtidos a partir de cúpulas em duplicado em uma das experiências. Não foram detectados níveis significativos de anticorpos contra a ovalbumina (acima dos níveis de fundo) nos soros de ratinhos imunizados i.n. com ovalbumina isolada; no entanto, os ratinhos imunizados por via s.c. fizeram uma seroconversão eficiente. Os ratinhos que receberam ovalbumina juntamente com CT ou com LT i.n. continham níveis muito elevados de anticorpos anti-ovalbumina nos seus soros. Estes eram equivalentes aos observados nos ratos imunizados por via s.c. Os ratos que receberam ovalbumina com LTK7 exibiram igualmente níveis muito elevados de anticorpos contra a ovalbumina.

Os níveis de resposta anti-toxóide nestes mesmos grupos são apresentados na Figura 1b. Todos os ratinhos, incluindo os imunizados com a toxina mutante, desenvolveram níveis elevados de anticorpos contra esta toxina nos seus soros.

Os níveis locais de anticorpos secretórios contra a ovalbumina foram medidos utilizando lavados nasais e pulmonares (Fig. 2). Abreviadamente, os animais foram sacrificados por perfuração cardíaca e dissecados de modo a expôr a traqueia. Foi inserida uma pipeta ultra-fina num pequeno orifício da traqueia. Os lavados pulmonares foram recolhidos por lavagem e aspiração repetida dos pulmões com 1,5 ml de albumina sérica bovina a 0,1% (Sigma) em PBS. Os lavados nasais foram recolhidos fazendo passar 1 ml de BSA a 0,1% em PBS através da cavidade nasal. 16

Os anticorpos IgA específicos para a ovalbumina foram medidos por ELISA utilizando um anticorpo conjugado anti-rato específico para a cadeia alfa (Serotec). Foram preparadas amostras a partir de cada animal, e as colunas nesta figura representam as taxas médias de conversão do substrato, obtidas utilizando o programa de cálculo cinético, para quatro e dois ratinhos imunizados por via i.n. e s.c., respectivamente. As figuras foram construídas utilizando os dados brutos da absorvência obtidos com uma diluição de 1:3 dos lavados pulmonares. Estes correspondem a títulos de entre 1:2 e 1:6 para os lavados nasais e de entre 1:70 e 1:120 para os lavados pulmonares. Estes títulos foram calculados utilizando o método acima descrito. Os ratos imunizados por via s.c. ou i.n. com ovalbumina isolada não continham níveis detectáveis de IgA específica contra a albumina nos lavados recolhidos como amostra. Todos os ratinhos imunizados com ovalbumina em combinação com LT, CT ou LTK7 evidenciaram níveis detectáveis de IgA anti-ovalbumina. Assim, foi possível detectar uma resposta anti-ovalbumina tanto local como sistémica nestes animais.

Em face destas experiências encorajadoras com a ovalbumina, a imunização foi repetida utilizando o Fragmento C, uma porção com 50.000 Dalton, não tóxica, da toxina do tétano que havia sido expressa pela levedura Pichia pastoris e purificada a partir desta. Os ratinhos foram imunizados por via s.c. ou i.n. com o Fragmento C isolado ou misturado com amostras individualizadas de LT ou de LTK7. Os ratinhos foram separados em quatro grupos de dez ratinhos e quatro grupos de cinco ratinhos. Dez ratos foram imunizados i.n. com: a) 10 pg do fragmento C isolado; b) 10 pg do fragmento C com 1 pg de LT; c) 10 pg de fragmento C com 1 pg de LTK7 e d) apenas PBS, todos num volume final de 30 pl. Cinco ratinhos foram imunizados i.n. com a) 1 pg de LT e b) 1 pg de LTK7. Os restantes dois grupos de ratinhos foram imunizados por via s.c., sem utilizar proteína ou usando 10 pg de fragmento C, num volume de dose de 100 pl. Estas vacinas foram preparadas tal como descrito na Figura 1. Os animais foram imunizados aos dias 1 e 22. Foram recolhidas amostras de 100 pl de sangue aos dias 0, 21 e 35. Os anticorpos específicos contra o fragmento C foram doseados por ELISA usando o 17 toxóide do tétano (10 pg/ml) como antigénio de revestimento das placas. Fez-se um pool dos soros de cada grupo. As amostras foram preparadas em duplicado a partir de uma diluição de 1:50. Os títulos ELISA foram calculados como acima descrito. Os ratinhos imunizados por via s.c. com o Fragmento C fizeram uma seroconversão eficiente, produzindo níveis elevados de anticorpos anti-Fragmento C (Fig. 3). Os ratinhos imunizados i.n. com o Fragmento C isolado não exibiram uma seroconversão significativa. No entanto, os ratinhos imunizados com o Fragmento C combinado com LT ou LTK7 apresentaram níveis séricos elevados de anticorpos anti-Fragmento C (Fig. 3). Uma vez que os ratinhos que produzem uma seroconversão face ao Fragmento C podem ser protegidos contra uma provocação por toxina, os grupos foram submetidos a uma provocação com a toxina do tétano activa. Todos os ratinhos imunizados s.c. com o Fragmento C isolado foram protegidos, enquanto que todos os ratinhos imunizados i.n. se mostraram altamente susceptíveis. Todos os ratinhos imunizados i.n. com o Fragmento C combinado com LT ou LTK7 sobreviveram à provocação antigénica (Tabela 2). TABELA 2

Ac sérico anti-fragmento C Mortes LT — 10/10 LTK7 — 10/10 LTK7 + Fragmento C ++ 0/10 LT + Fragmento C ++++ 0/10 Fragmento C +/- 10/10 0 título de anticorpos correspondeu em média a anti-Fragmento C presentes no soro dos cerca de 1/3.000 em ratinhos vacinados com o ratinhos mutante K7 + Fragmento C e a 1/12.000 com a associação LT + Fragmento C.

Estas experiências mostram que a imunidade protectora contra o tétano pode ser obtida utilizando um mutante não tóxico da LT como adjuvante, e que a imunização por via mucosa com esta molécula poderá gerar uma resposta imune 18 tanto secretória local como sistémica face à toxina e aos antigénios co-administrados. 17 FEV. 2000

Lisboa, Q AGENTE OFICIAI DA PROPREOAOf NDUSTWAi

FRANCISCO DE NOVAES AGENTE OnCiAL DA PROPRIEDADE INCUS rWAt. Αν. Duque D' Ávila, 32, t - X-OO biuGA Ta.: 547763 7 3155038 19

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1- Uma composição farmacêutica compreendendo um adjuvante não tóxico das mucosas em mistura com um segundo antigénio, caracterizada pelo facto de o dito adjuvante não tóxico das mucosas corresponder a uma toxina bacteriana ribosilante do ADP destoxificada que possui uma subunidade A mutante, tendo como restrição o facto de o dito adjuvante não tóxico das mucosas não poder corresponder a uma forma duplamente mutante e não tóxica da toxina pertússica.
2. 2- Uma composição farmacêutica, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o dito adjuvante não tóxico das mucosas corresponde a um mutante destoxificado da CT ou da LT.
3. 3- Uma composição farmacêutica, conforme reivindicado nas Reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o adjuvante não tóxico das mucosas compreende uma ou mais adições, delecções ou substituições de aminoácidos a nível da subunidade A da holotoxina.
4. 4- Uma composição farmacêutica, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o adjuvante não tóxico das mucosas ser a LT-K7.
5. 5- Uso de uma toxina bacteriana ribosilante do ADP destoxificada que possui uma subunidade A mutante como adjuvante das mucosas na preparação de uma composição para administração a mucosas, tendo como restrição o facto de o dito adjuvante não tóxico das mucosas não poder corresponder a uma forma duplamente mutante e não tóxica da toxina pertússica.
6. 6- Uso, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterizado pelo facto de a composição ser uma vacina.
7. 7- Uso, conforme reivindicado na reivindicação 6, caracterizado pelo facto de a vacina se destinar a aplicações profilácticas ou terapêuticas.
8. 8- Uso, conforme reivindicado nas reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo facto de a composição compreender ainda um segundo antigénio. 1
9. 9- O uso de um adjuvante das mucosas, conforme reivindicado nas reivindicações 1 a 4, durante o fabrico de uma vacina, caracterizado pelo facto de ter como restrição o facto de o dito adjuvante não tóxico das mucosas não poder corresponder a uma forma duplamente mutante e não tóxica da toxina pertússica.
10. 10- Uso, conforme reivindicado na reivindicação 10, caracterizado pelo facto de a vacina se destinar à administração oral ou intranasal.
11. 11- Uma composição farmacêutica compreendendo um adjuvante não tóxico das mucosas e um segundo antigénio para administração simultânea, em separado ou sequencial, caracterizada pelo facto de o dito adjuvante não tóxico das mucosas constituir uma toxina bacteriana ribosilante de ADP destoxificada que possui uma subunidade A mutante, tendo como restrição o facto de o dito adjuvante não tóxico das mucosas não poder corresponder a uma forma duplamente mutante e não tóxica da toxina pertússica.
12. 12- Uma composição farmacêutica compreendendo um adjuvante não tóxico das mucosas e um segundo antigénio para administração em simultâneo quando combinados num só veículo, transportador ou partícula, caracterizada pelo facto de o dito adjuvante não tóxico das mucosas constituir uma toxina bacteriana ribosilante de ADP destoxificada que possui uma subunidade A mutante, tendo como restrição o facto de o dito adjuvante não tóxico das mucosas não poder corresponder a uma forma duplamente mutante e não tóxica da toxina pertússica.
13. 13- Um método de fabrico de uma vacina com adjuvante, caracterizado pelo facto de compreender os passos de: (a) execução de uma mutagénese específica de local, a nível da subunidade A de uma toxina bacteriana ribosilante de ADP, de modo a destoxificar a toxina; e (b) colocação da toxina destoxificada em associação com um segundo antigénio, de tal modo que a primeira funcione como um adjuvante das mucosa, 2 tendo como restrição o facto de o dito adjuvante não tóxico das mucosas não poder corresponder a uma forma duplamente mutante e não tóxica da toxina pertússica.
14. 14- Uma composição farmacêutica, conforme reivindicado nas reivindicações 1, 2, 3, 4, 11 ou 12, caracterizada pelo facto de o antigénio se encontrar encapsulado em microsferas de libertação retardada. Lisboa, f 7 FEV. 2000

    ÍRÂNCÍSCO OE NOVAES AX3CNTE OriCIAL. DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL AV.·Duque D' Ávila, 32, f - ΪΟΟΟ LISBOA TEL: 547763 / 3155038' 3