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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Schutz gegen eine
Infektion oder zur Behandlung einer Infektion durch H. pylori, das
die Verabreichung einer wirksamen Menge eines oder mehrerer H. pylori-Antigene
auf einem nicht über
die Schleimhäute
führenden
Wege umfasst.
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Hintergrund der Erfindung
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H.
pylori wurde 1982 von B. Marshall und J. Warren unter Anwendung
von mikroaerophilen Bedingungen isoliert, die zur Kultivierung von
Campylobacter jejuni entwickelt worden waren. H. pylori-Bakterien
sind S-förmige,
gramnegative Bazillen einer Länger
von 2 bis 3,5 μm
und einer Breite von 0,5 bis 1 μm
(Blaser, M.J., und Parsonnet J., 1994, J. Clin. Invest. 94:4-8).
Es ist nunmehr (seit kurzem) bekannt, dass die Infektion mit H.
pylori die weltweit verbreitetste Infektion darstellt. In Entwicklungsländern sind
80 % der Bevölkerung
im Alter von 20 Jahren von dem Bakterium infiziert, während in
entwickelten Ländern
die Infektion mit H. pylori von <20
% bei 30-Jährigen
auf >50 % bei 60-Jährigen mit
dem Alter ansteigt (Axon, A.T., 1995, Pharmacol. Ther. 9:585-588; Blaser und Parsonnet,
1994). Die Infektion wird entweder auf oral-fäkalem oder oral-oralem Weg übertragen
(Blaser und Parsonnet, 1994). Die Infektion tritt während der
ersten Lebensjahre auf und bleibt lebenslang erhalten. Eine einmal
eingetretene Infektion wird chronisch und möglicherweise permanent. Risikofaktoren
für die Infektion
sind große
Menschenansammlungen, schlechte Hygiene und wirtspezifische genetische
Faktoren.
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Die
vollständige
Genomsequenz von H. pylori wurde veröffentlicht (Tomb, J.-F., et
al., 1997, Nature 388: 539-547). Eine kurze Zusammenfassung dieses
Artikels und eine allgemeine Zusammenfassung der Biologie von H.
pylori sind in Doolittle, R.F., 1997, Nature 388:515-516, zu finden.
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Die
chronische Infektion der gastroduodenalen Schleimhäute beim
Menschen durch H. pylori ist häufig von
chronischer Gastritis, Ulcus pepticum und einer Erhöhung des
Risikos des Auftretens von malignen Magengeschwüren wie etwa Adenokarzinomen
und B-Zell-Lymphomen
niederen Grades begleitet (Blaser und Parsonnet, 1994; Parsonnet,
J., et al., 1991, N. Engl. J. Med. 325:1127-1231; Parsonnet, J.,
et al., 1994, N. Engl. J. Med. 330:1267-1271). Die meisten Infektionen
bleiben asymptomatisch, während
symptomatische, schwere Erkrankungen epidemiologisch mit der Infektion
durch eine Untergruppe von H. pylori-Stämmen, die Typ I genannt werden,
zu korrelieren sind (Blaser, M.J., et al., 1995, Cancer Res. 55:2111-2115;
Covacci, A., et al., 1997, Trends Microbiol. 5:205-208; Covacci,
A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5791-5795; Eck, M., et
al., 1997, Gastoenterology 112:1482-1486; Xiang, Z., et al., 1995,
Infect. Immun. 63:94-98). Diese Untergruppe von Stämmen ist
aufgrund der Expression eines biologisch aktiven Toxins (VacA),
das gegenüber Epithelzellen
des Magens in vitro und in vivo cytopatisch ist, mit einer erhöhten Virulenz
behaftet (Ghiara, P., et al., 1995, Infect. Immun. 63:4154-4160;
Harris, P.R., et al., 1996, Infect. Immun. 64:4867-4871; Telford,
J.L., et al., 1994, J. Exp. Med. 179:1653-1658), ferner auch aufgrund
des Erwerbs einer Pathogenitätsinsel
(Pathogenicity Island, PAI), die als cag bezeichnet wird und einen
Satz von Genen enthält,
die verschiedene Virulenzfaktoren codieren (Censini, S., et al.,
1996, Proc. Natl. Sci.
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USA
93:14648-14653), die für
die Induktion der Synthese des neutrophilen chemotaktischen Cytokins IL-8
durch Epithelzellen des Magens verantwortlich sind (Censini et al.,
1996).
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Zu
den bisher identifizierten Faktoren von H. pylori gehören die
Flagellen, die wahrscheinlich zur Bewegung durch die Schleimhautschicht
erforderlich sind, vgl. zum Beispiel Leying et al., 1992, Vol. Microbiol. 6:2863-2874;
die Urease, die erforderlich ist, um die saure Umgebung des Magens
zu neutralisieren und eine anfängliche
Koloniebildung zu ermöglichen,
vgl. zum Beispiel Cussac et al., 1992, J. Bacteriol. 174:2466-2473, Perez-Perez
et al., 1992, J. Infect. Immun. 60:3658-3663, Austin et al., 1992,
J. Bacteriol. 174:7470-7473, WO 90/04030; das H. pylori-Cytotoxin
(zuweilen als VacA bezeichnet, da es Vakuolenbildung hervorruft),
vgl. zum Beispiel WO 93/18150, Telford, J.L., et al., 1994, J. Exp.
Med. 179:1653-1658, Cover et al., 1992, J. Bio. Chem. 267:10570-10575,
Cover et al., 1992, J. Clin. Invest. 90:913-918, Leunk, 1991, Rev.
Infect. Dis. 13:5686-5689; die Hitzeschockproteine (hsp) von H.
pylori, vgl. zum Beispiel WO 93/ 18150, Evans et al., 1992, Infect.
Immun. 60:2125-2127, Dunn et al., 1992, Infect. Immun. 60:1946-1951, Austin et al.,
1992; sowie das Cytotoxin-assoziierte Protein, CagA, vgl. zum Beispiel
WO 93/18150, Covacci, A., et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:5791-5795,
Tummuru, M.K., et al., 1994, Infect. Immun. 61:1799-1809.
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Gegenwärtig können die
Stämme
von H. pylori in mindestens zwei Hauptgruppen unterteilt werden, die
das Cytotoxin (VacA) und die CagA-Proteine entweder exprimieren
(Typ I) oder nicht exprimieren (Typ II). Die Stämme vom Typ I enthalten die
Gene für
CagA und das Toxin und erzeugen aktive Formen dieser Antigene. Stämme vom
Typ II weisen den CagA-Locus nicht auf und exprimieren das Cytotoxin
nicht. Die Verknüpfung
zwischen dem Vorliegen des CagA-Gens und der Cytotoxizität legt nahe,
dass die Erzeugung des CagA-Gens für die Transkription, die Faltung,
die Ausschleusung oder die Funktion des Cytotoxins erforderlich ist.
Epidemiologische Analysen zeigen, dass Bakterien vom Typ I mit duodenalen
Ulcerationen, Magenulcera und schweren Formen der aktiven Gastritis
in Zusammenhang stehen.
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Bezüglich einer
allgemeinen Zusammenfassung der pathogenen Rolle von H. pylori bei
Ulcus pepticum vgl. Telford, J.L., et al., 1994, TIBTECH 12:420-426.
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Von
verschiedenen Autoren wurde gezeigt, dass Kulturüberstände von H. pylori ein Antigen
mit einem Molekulargewicht von 120, 128 oder 130 kDa enthalten (Apel
et al., 1988, Zentralblatt für
Bakterio. Mikrob. und Hygiene 268:271-276; Crabtree et al., 1992,
J. Clin. Pathol. 45: 733-734; Cover et al., 1990, Infect. Immun. 58:603-610;
Figura et al., 1990, H. pylori gastritis and peptic ulcer (Herausgeber
Malfertheiner et al.), Springer Verlag Berlin). Es war dabei nicht
klar, ob der Unterschied in der Größe des beschriebenen Antigens
durch Unterschiede bei der Abschätzung
des Molekulargewichts des gleichen Proteins bei verschiedenen Labors, durch
eine Größenvariabilität des gleichen
Antigens oder durch tatsächlich
unterschiedliche Proteine bedingt ist. Dieses Protein ist bei infizierten
Menschen sehr immunogen, da im Serum praktisch aller mit H. pylori
infizierter Patienten spezifische Antikörper nachgewiesen werden (Gerstenecker
et al., 1992, Eur. J. Clin. Microbiol. 11:595-601).
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Ein
als NAP (neutrophil activating protein) bekanntes Protein (Evans,
D.J., et al., 1995, Gene 153:123-127; WO 96/01272 und WO 96/01273,
insbesondere die Sequenz SEQ ID No:6; vgl. ferner WO 97/25429),
das bei Stämmen
sowohl vom Typ I als auch vom Typ II gefunden wird, scheint im Test
im H. pylori-Mäusemodell
eine Schutzfunktion zu besitzen (Marchetti, M., et al., 1995, Science 267:1655-1658).
NAP ist ein Homodekamer aus 15 kDa-Untereinheiten, und es wurde angegeben,
dass der multimere Komplex eine ringförmige Struktur besitzt, die
spontan hexagonale parakristalline Strukturen ausbildet. Das Gesamtprotein scheint
mit den Glycosphingolipid-Rezeptoren von menschlichen Neutrophilen
zu wechselwirken.
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In
WO 98/04702 sind eine Reihe anderer Antigene von H. pylori beschrieben,
zu denen Urease B (SEQ ID NO:4), HopX (SEQ ID NO:21), HopY (SEQ
ID NO:21), 36 kDa (SEQ ID NO:26), 42 kDa (SEQ ID NO:25) und 17 kDa
(SEQ ID NO:27) gehören.
Urease ist ferner beispielsweise beschrieben in EP-B-0 367 644 (Protein
mit Ureaseaktivität),
EP-A-0 610 322 (Urease E, F, G, H und I), EP-A-0 625 053 (Urease-Protein)
und EP-A-0 831 892 (multimere Formen von Urease). Zu weiteren Antigenen
von H. pylori gehören
die Proteine mit 54 kDa (SEQ ID NO:2) und 50 kDa (SEQ ID NO:1),
die in EP-A-0 793 676 beschrieben sind.
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Eine
Diskussion der verschiedenen Virulenzfaktoren von H. pylori ist
beispielsweise in EP-A-93905285.5 und EP-A-96908300.5 zu finden.
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Die
Besiedlung der Magenschleimhaut durch H. pylori wird heute als Hauptursache
für akute
und chronische gastroduodenale pathologische Zustände beim
Menschen angesehen (Blaser und Parsonnet, 1994; Covacci et al.,
1997). Die Feststellung der infektionsbedingten Natur der Erkrankung
ist von erheblichem Einfluss auf die Behandlung der Erkrankung,
die sich von der Behandlung der Symptome durch Anti-H2-Blocker zur
Ausrottung der bakteriellen Infektion durch Antibiotikumsbehandlung
hin verschob.
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Trotz
der unbestreitbaren Erfolge, die mit der Antibiotikumsbehandlung
erzielt werden, sollte nicht außer
Acht gelassen werden, dass eine derartige Behandlung unvermeidlich
zum Auftreten resistenter Stämme führt, gegen
die auf lange Sicht Antibiotika nicht mehr wirksam sind. Dies legt
nahe, dass die Impfung, die klassischerweise der wirksamste Weg
zur Vorbeugung und Kontrolle von Infektionskrankheiten in einer
großen
Population darstellt, angewandt werden sollte, um eine Infektion
zu verhindern und möglicherweise
auch die Erkrankung zu behandeln.
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Die
steigende Bedeutung von H. pylori bei der Induktion einer großen Vielfalt
von Magenerkrankungen stellte die Hauptherausforderung für die Entwicklung
wirksamer prophylaktischer und/oder therapeutischer Strategien dar.
Zum besseren Verständnis
der Wechselwirkungen zwischen dem Bakterium und dem Wirt konzentrierten
sich erhebliche Anstrengungen auf die Entwicklung geeigneter Tiermodelle
der Infektion, mit denen Aspekte der natürlichen menschlichen Infektion
reproduziert werden können.
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Es
wurden bereits einige Tiermodelle der Infektion und der Erkrankung
entwickelt, denen die Zielsetzung zugrunde lag, die Pathogenese
der Infektion und die Entwicklung vorbeugender und therapeutischer Strategien
zu studieren. Viele dieser Modelle sind in hohem Maße unanwendbar,
da bei ihnen Affen (Dubois, A. et al.., 1994, Gastroenterology 106:1405-1417)
oder Species eingesetzt werden, die unter gnotobiotischen (das heißt keimfreien)
Bedingungen gehalten werden, zum Beispiel keimfreie Hunde oder Ferkel,
eingesetzt werden (Krakowka, S., et al., 1987, Infekt. Immun. 55:2789-2796;
Radin, M.J., et al., 1990, Infekt. Immun. 58:2606-2612). So wurde die
Besiedlung von gnotobiotischen Ferkeln (Krakowka, S et al., 1987)
unter Verwendung von H. pylori-Stämmen berichtet, die von Patienten
mit gastroduodenalen Erkrankungen isoliert worden waren. Ferkel
können
jedoch nicht länger
als zwei Monate unter keimfreien Bedingungen gehalten werden (Radin
et al., 1990), hauptsächlich
aufgrund ihrer Ernährungserfordernisse.
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Ferner
wurde die erfolgreiche Infizierung spezieller pathogenfreier (SPF-)
Katzen mit einem aus normalen Katzen isolierten Stamm beschrieben
(Fox, J.G., et al., 1995, Infection and Immunity 63:2674-2681; Handt, L.K.,
et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33:2280-2289). Ferner wurden gnotobiotische
Beagle-Welpen mit einem menschlichen Isolat von H. pylori infiziert
und 30 Tage unter keimfreien Bedingungen gehalten. Bei diesem Modell
sind allerdings keine Daten zu Langzeitinfektionen mit H. pylori
verfügbar
(Radin et al., 1990). Zu weiteren experimentellen Tiermodellen gehören athymische
nu/nu-Mäuse
oder keimfreie Mäuse
(Karita, M., et al., 1991, Am. J. Gastroenterol. 86:1596-1603).
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Die
Hauptnachteile dieser experimentellen Infektionen sind allerdings
die erforderlichen aufwändigen und
teuren Unterbringungssysteme sowie, was noch wichtiger ist, der
spezielle immunologische Status der verwendeten gnotobiotischen
oder Immundefizienten Wirte. In jüngerer Zeit wurde H. pylori,
der frisch aus menschlichem Gastroduodenalbiopsiematerial isoliert
worden war, an eine andauernde Besiedlung der Magenschleimhaut xenobiotischer
Mäuse angepasst
(Marchetti et al., 1995). Dieses Modell erwies sich als besonders
nützlich
zur Prüfung
der Realisierbarkeit einer vorbeugenden Impfung (Manetti, R., et
al., 1997, Infect. Immun. 65:4615-4619; Marchetti et al., 1995;
Marchetti, M., et al., 1998, Vaccine 16:33-37; Radcliff, F.J., et
al., 1997, Infect. Immun. 65:4668-4674) oder einer therapeutischen
Impfung (Ghiara, P., et al., 1997, Infect. Immun. 65:4996-5002),
zum In-vivo-Screening von antimikrobiellen Mitteln gegen H. pylori
(Lee, A., et al., 1997, Gastoenterol. 112:1386-1397) sowie zur Untersuchung
der Pathogenese der Infektion (Sakagami, T., et al., 1996, Gut 39:639-648). Zur Auswertung
der Mageninfektion müssen
die Mäuse
allerdings getötet
werden; dementsprechend können
die durch die chronische Infektion und/oder die Wirkung des therapeutischen
oder Immunisierungsregimes induzierten Änderungen nicht beim gleichen
individuellen Tier verfolgt werden.
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In
der britischen Patentanmeldung
GB
9801000.2 (Anmeldetag 16. Januar 1998) und der zugehörigen internationalen
Patentanmeldung PCT/IB 99/00217 (Anmeldetag 15. Januar 1999) ist
zum ersten Mal ein Tiermodell beschrieben, mit dem Symptome reproduziert
werden können,
die klar mit den akuten Phasen der Infektion mit H. pylori beim
Menschen korreliert wurden (Marshall, B.J., et al., 1985, Med. J.
Australia 142:436-439; Mitchell, J.D., et al., 1992, Am. J. Gastroenterol.
87:382-386; Morris, A., und G. Nicholson, 1987, Am. J. Gastroenterol.
82:192-199; Sobala, G.M., et al., 1991, Gut 32:1415-1418). Die in
GB 9801000.2 und PCT/IB99/00217
beschriebene Erfindung beruht auf der Feststellung, dass H. pylori
in persistierender Weise die Magenschleimhaut herkömmlicher
xenobiotischer Hunde besiedeln kann, und dass diese Besiedlung akute
Symptome und histopathologische Läsionen hervorruft und spezifische
Immunantworten auslöst.
Daher ist das in
GB 9801000.2 und
PCT/IB99/00217 angegebene Tiermodell ideal zur Untersuchung der
Wirksamkeit von Behandlungen bei Infektionen durch H. pylori geeignet.
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Da
die Infektion mit H. pylori schleimhautbezogen ist, wobei die Bakterien
nicht in die umgebenden Wirtszellen eindringen, konzentrierten sich
die Anstrengungen zur Entwicklung von Impfstoffen gegen diese Erkrankung
oder von Behandlungen dieser Erkrankung auf die Verabreichung auf
die Schleimhaut, speziell die orale Verabreichung in den Gastrointestinaltrakt.
Da früher
angenommen wurde, dass eine lokale Behandlung (Schleimhautbehandlung)
am Ort der Infektion mit H. pylori erforderlich ist, waren die Forschungsanstrengungen
auf diesem Gebiet darauf gerichtet, Mucosa-assoziierte Anti-H. pylori-Antikörper durch
Verabreichung von Prophylaktika/Therapeutika auf die Schleimhaut
zu entwickeln (vgl. zum Beispiel Chen, M., et al., 1992, Lancet 339:1120-1121;
Ferrero, R.L., et al., 1994, Infect. Immun. 62:4981-4989; Michetti,
P., et al., 1994, Gastroenterology 107:1002-1011; Lee, A., et al., 1994, Infect.
Immun. 62:3594-3597; Doidge, C., et al., 1994, Lancet 343:974-979;
Marchetti et al., 1995; Lee, C.K., et al., 1995, J. Infect. Dis.
172:161-172; Corthesy-Theulaz, I., et al., 1995, Gastroenterology
109:115-121; Cuency, R., et al., 1996, Gastroenterology 110:1770-1775;
Radcliff, F.J., et al., 1996, Vaccine 14:780-784; Stadtlander, C.T.K.H.,
et al., 1996, Dig. Dis. Sci. 41:1853-1862; Ferrero, R.L., et al.,
1997, Gastroenterology 113:185-194;
Weltzin, R., et al., 1997, Vaccine 15:370-376; Radcliff et al.,
1997; Ghiara et al., 1997; Marchetti et al., 1998).
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde allerdings gezeigt, dass
eine systemische Schutzwirkung gegen eine Infektion durch infektiösen H. pylori
in unerwarteter Weise durch Verwendung einer Antigene gegen H. pylori
enthaltenden Zusammensetzung erzielt werden kann, die nicht über die
Schleimhaut verabreicht wird. Es wurde speziell gezeigt, dass zum
Beispiel die intramuskuläre
(i.m.) Immunisierung mit einem Zelllysat aus ganzen H. pylori-Zellen
Hunde gegen eine Infektion durch infektiösen H. pylori zu schützen vermag,
sowie, dass der intramuskuläre
Verabreichungsweg, als Beispiel für einen nicht über die
Mucosa erfolgenden Verabreichungsweg, in unerwarteter Weise für eine Impfung
gegen dieses Bakterium in Betracht gezogen werden kann. Ein solches
Verfahren kann auch bei der Behandlung einer bereits ausgebildeten
Infektion durch H. pylori therapeutisch von Nutzen sein.
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Sämtliche
in der vorliegenden Anmeldung erwähnten Dokumente (einschließlich Patente,
Patentanmeldungen, Forschungsartikel und Bücher) werden hierbei zur Gänze in Bezug
genommen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung beruht dementsprechend auf der Feststellung,
dass Zusammensetzungen, die Antigene von H. pylori enthalten, gegen
H. pylori auf einem nicht über
die Schleimhaut führenden
Weg verabreicht werden können
und noch zu einem wirksamen (systemischen) Schutz vor dieser Erkrankung
führen, obwohl
die H. pylori-Bakterien schleimhautassoziiert sind.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Verfahren zum Schutz gegen eine Infektion oder
zur Behandlung einer Infektion durch H. pylori angegeben, das die
nicht über
die Schleimhaut führende
Verabreichung einer wirksamen Menge eines oder mehrerer Antigene
von H. pylori umfasst.
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Der
Ausdruck "umfasst" bedeutet sowohl "enthält" als auch "besteht aus".
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Die
Verabreichung erfolgt bevorzugt parenteral und noch bevorzugter
intramuskulär.
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Das
eine Antigen oder mehrere verabreichte Antigene können separat
oder in Kombination eine schützende
Immunantwort in einem Lebewesen, bevorzugt einem Säuger, und
noch bevorzugter beim Menschen hervorrufen.
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Mindestens
eines der Antigene kann ein Virulenzfaktor von H. pylori sein. Beispiele
für derartige
Virulenzfaktoren sind VacA, CagA, NAP oder Urease. Zu weiteren bevorzugten
Antigenen gehören
die Antigene HopX, HopY, 36 kDa, 42 kDa und 17 kDa (vgl. WO 98/04702)
oder 50 kDa (vgl. EO-A-0 793 676). Zu den bevorzugt verabreichten
Virulenzfaktoren von H. pylori gehören VacA, CagA, NAP und Urease.
Noch bevorzugter umfassen die Virulenzfaktoren VacA, CagA und NAP.
Zu den am meisten bevorzugten Virulenzfaktoren gehören CagA
und NAP.
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Die
verabreichten Antigene von H. pylori können lediglich aus Virulenzfaktoren
oder lediglich speziellen Kombinationen von Virulenzfaktoren wie
VacA, CagA, NAP und Urease; VacA, CagA und NAP; oder CagA und NAP
bestehen.
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Die
verabreichten Antigene können
ferner auch nicht von H. pylori stammende Antigene enthalten.
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Das
eine Antigen oder mehrere Antigene ist/sind bevorzugt gereinigtes)
Antigene) oder stellen ein Gesamtzellimmunogen dar. Der Ausdruck "gereinigt" gedeutet, dass mindestens
ein Reinigungsschritt durchgeführt
wurde, sodass ein gereinigtes Antigen reiner ist als das gleiche
Antigen in seinem natürlichen
Kontext. Es können
jedoch einige mit solchen gereinigten Antigenen verbundene Verunreinigungen
vorliegen. Der Ausdruck "gereinigt" schließt die Situation
ein, dass ein Antigen "isoliert" ist. In diesem Fall
liegt das Antigen allgemein nicht zusammen mit irgendeiner anderen
Substanz vor, die seine Fähigkeit
beeinträchtigt,
vor einer Infektion durch H. pylori zu schützen oder eine Infektion durch
H. pylori behandeln zu können.
Daher umfasst der Ausdruck "isoliert" den höchsten Reinigungsgrad.
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Die
Antigene werden durch verschiedene übliche Verfahren erhalten,
zum Beispiel durch Reinigung/Isolierung aus einer Zellkultur, durch
Rekombinanttechnik oder durch chemische Synthese. Das Gesamtzellimmunogen
wird bevorzugt durch Gewinnung aus Zellen von H. pylori hergestellt.
Die Gewinnung kann durch Lyse oder Beschallen von Zellen von H.
pylori oder nach einem anderen geeigneten Verfahren durchgeführt werden.
Das Gesamtzellimmunogen kann aus inaktivierten Zellen von H. pylori
bestehen oder inaktivierte Zellen von H. pylori enthalten.
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Zusammen
mit einem oder mehreren Antigenen von H. pylori wird bevorzugt ein
Adjuvans verabreicht. Das Adjuvans ist bevorzugt Aluminiumhydroxid
oder MF59® (vgl.
WO 90/14837; EP-B-0 399 843; Ott et al., Kapitel 10 von Vaccine
Design: The subunit and adjuvant approach, Herausgeber Powell und
Niewman, Plenum Press 1995).
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Das
eine Antigen oder mehrere Antigene können ferner auch in Kombination
mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Excipientien
vorliegen.
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Die
vorliegende Erfindung gibt ferner die Verwendung einer wirksamen
Menge eines oder mehrerer Antigene von H. pylori zur Herstellung
eines Arzneimittels zur nicht über
die Schleimhaut erfolgenden Verabreichung zum Schutz gegen eine
Infektion durch H. pylori oder zur Behandlung einer Infektion durch
H. pylori an.
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Die
vorliegende Erfindung gibt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung
zur nicht über
die Schleimhaut erfolgenden Verabreichung an, die ein Antigen von
H. pylori oder mehrere Antigene von H. pylori sowie ein oder mehrere
pharmazeutisch akzeptable Excipientien enthält. Dabei handelt es sich bevorzugt
um eine immunogene Zusammensetzung.
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Das
eine Antigen oder mehrere Antigene der pharmazeutischen Zusammensetzung
können
separat oder in Kombination eine schützende Immunantwort in einem
Lebewesen, bevorzugt einem Säuger
und noch bevorzugter einem Menschen, hervorrufen.
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Bevorzugt
ist mindestens eines der Antigene ein Virulenzfaktor von H. pylori.
Beispiele für
derartige Virulenzfaktoren sind, zusammen mit Beispielen für andere
bevorzugte Antigene, oben angegeben.
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Die
pharmazeutische Zusammensetzung enthält bevorzugt mindestens die
Virulenzfaktoren VacA, CagA, NAP und Urease. Die pharmazeutische
Zusammensetzung enthält
noch bevorzugter mindestens die Virulenzfaktoren VacA, CagA und
NAP. Die pharmazeutische Zusammensetzung enthält am bevorzugtesten mindestens
die Virulenzfaktoren CagA und NAP.
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Die
Antigene von H. pylori der pharmazeutischen Zusammensetzung können aus
lediglich Virulenzfaktoren oder lediglich speziellen Kombinationen
von Virulenzfaktoren wie VacA, CagA, NAP und Urease, VacA, CagA
und NAP oder CagA und NAP bestehen.
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Die
Antigene der pharmazeutischen Zusammensetzung können ferner auch nicht von
H. pylori stammende Antigene enthalten.
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Das
Antigen oder mehrere Antigene ist/sind bevorzugt gereinigte Antigene
oder ein Gesamtzellimmunogen, wie oben beschrieben.
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Die
pharmazeutische Zusammensetzung kann ferner auch ein Adjuvans enthalten.
Das Adjuvans ist bevorzugt Aluminiumhydroxid oder MF59®.
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Die
pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung kann eine immunogene
Zusammensetzung wie etwa ein Vakzin sein, ist jedoch nicht darauf
beschränkt.
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Die
vorliegende Erfindung gibt entsprechend eine immunogene Zusammensetzung
zur nicht über
die Schleimhaut erfolgenden Verabreichung an, die ein oder mehrere
Antigene von H. pylori und ein oder mehrere pharmazeutisch akzeptable
Excipientien enthält.
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Immunogene
Zusammensetzungen und Vakzine gemäß der Erfindung können entweder
prophylaktisch (das heißt
zur Vorbeugung einer Infektion vorgesehen) oder therapeutisch (das
heißt
zur Behandlung der Erkrankung nach der Infektion vorgesehen) sein.
Derartige Vakzine enthalten ein Antigen oder Antigene, üblicherweise
in Kombination mit "pharmazeutisch
akzeptablen Trägern", wozu beliebige
Träger
gehören,
die nicht selbst die Produktion von Antikörpern induzieren, die für das Individuum,
das die Zusammensetzung erhält, schädlich sind.
Geeignete Träger
sind typischerweise große,
langsam metabolisierte Makromoleküle, wie Proteine, Polysaccharide,
Polymilchsäuren,
Polyglykolsäuren,
polymere Aminosäuren,
Aminosäure-Copolymere, Lipidaggregate
(wie Öltröpfchen oder
Liposomen) sowie inaktive Viruspartikel. Derartige Träger sind
den Fachleuten auf dem vorliegenden Gebiet geläufig. Diese Träger können zusätzlich auch
als immunstimulierende Mittel ("Adjuvantien") wirken. Das Antigen
kann ferner mit einem bakteriellen Toxoid konjugiert sein.
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Bevorzugte
Adjuvantien zur Erhöhung
der Wirksamkeit der Zusammensetzung sind beispielsweise, ohne dass
damit eine Beschränkung
verbunden ist: (1) Aluminiumsalze (Aluminiumhydroxid), wie Aluminiumhydroxid,
Aluminiumphosphat, Aluminiumsulfat, etc.; (2) Öl-in-Wasser-Emulsionsformulierungen
(mit oder ohne andere spezifische immunstimulierende Mittel, wie
Muramylpeptide oder Wandkomponenten von Bakterienzellen), wie zum
Beispiel (a) MF59®, das 5 % Squalen, 0,5
% Tween® 80
und 0,5 % Span 85 enthält
und unter Verwendung eines Mikrofluidizers zu Submikron-Partikeln
formuliert ist, (b) SAF, das 10 % Squalen, 0,4 % Tween® 80,
5 % Pluronic-geblocktes Polymer L121 und thr-MDP enthält und entweder zu einer Submikron-Emulsion mikrofluidisiert
oder zur Erzeugung einer Emulsion mit einer größeren Partikelgröße in einer Rührvorrichtung
behandelt ist, sowie (c) das Ribi®-Adjuvanssystem
(RAS), das 2 % Squalen, 0,2 % Tween® 80 sowie
eine oder mehrere Wandkomponenten von Bakterienzellen aus der Gruppe
enthält,
die aus Monophosphoryllipid A (MPL), Trehalose-dimycolat (TDM) und
Zellwandskelett (VWS) besteht, wobei MPL + CWS (Detox®) bevorzugt
ist; (3) Saponin-Adjuvantien, wie Stimulon® oder
daraus erzeugte Partikel, wie ISCOMs (immunostimulating complexes);
(4) komplettes und inkomplettes Freundsches Adjuvans (CFA und IFA);
(5) Cytokine, wie Interleukine (zum Beispiel IL-1, IL-2, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-12, etc. ), Interferone (zum Beispiel IFN-γ), der Makrophagen-Kolonie-stimulierende
Faktor (M-CSF), der Tumornekrosefaktor (TNF), etc., sowie (6) weitere
Substanzen, die als immunstimulierende Mittel wirken, um die Wirksamkeit
der Zusammensetzung zu erhöhen.
Aluminiumhydroxid und MF59® sind bevorzugt.
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Wie
oben erwähnt,
gehören
zu den Muramylpeptiden, ohne dass diesbezüglich eine Beschränkung vorliegt,
N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin
(thr-MDP), N-Acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin (MTP-PE),
etc.
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Die
immunogenen Zusammensetzungen (zum Beispiel das Antigen, der pharmazeutisch
akzeptable Träger
und das Adjuvans) enthalten typischerweise Verdünnungsmittel, wie Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin,
Ethanol, etc. Zusätzlich
können
Hilfssubstanzen, wie Netzmittel oder Emulgatoren, pH-Puffersubstanzen und
dergleichen in solchen Trägern
vorliegen.
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Die
immunogenen Zusammensetzungen werden typischerweise als injizierbare
Zusammensetzungen entweder als flüssige Lösungen oder als Suspensionen
hergestellt; feste Formen, die zum Lösen oder Suspendieren in flüssigen Trägern vor
der Injektion geeignet sind, können
ebenfalls hergestellt werden. Die Präparation kann auch emulgiert
oder in Liposomen verkapselt werden, um die Adjuvanswirkung, wie
oben diskutiert, zu verstärken.
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Immunogene
Zusammensetzungen, die als Impfstoffe Verwendung finden, enthalten
eine immunologisch wirksame Menge der antigenen Polypeptide sowie
erforderlichenfalls beliebige andere Komponenten, wie oben erwähnt, falls
erforderlich. Der Ausdruck "immunologisch
wirksame Menge" bedeutet,
dass die Verabreichung dieser Menge an ein Individuum entweder in
einer einzigen Dosis oder als Teil einer Reihe von Dosen zur Behandlung
oder zur Vorbeugung wirksam ist. Diese Menge hängt ab vom Gesundheitszustand
und vom körperlichen
Zustand des zu behandelnden Individuums, der taxonomischen Gruppe
des zu behandelnden Individuums (zum Beispiel nichtmenschliche Primaten,
Primaten, etc.), der Fähigkeit
des Immunsystems des Individuums zur Synthese von Antikörpern, dem
Grad des angestrebten Schutzes, der Formulierung des Impfstoffs,
der Beurteilung der medizinischen Situation durch den behandelnden
Arzt und anderen relevanten Faktoren. Es ist davon auszugehen, dass
diese Menge in einem relativ breiten Bereich liegt, der durch Routineversuche
ermittelt werden kann.
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Die
immunogenen Zusammensetzungen werden auf einem nicht über die
Schleimhaut führenden Weg
verabreicht, insbesondere parenteral, zum Beispiel durch Injektion,
und zwar entweder subkutan oder intramuskulär. Die transdermale oder transkutane
Verabreichung kann ebenfalls angewandt werden. Die Dosierung bei
der Behandlung kann nach einem Einzeldosenschema oder nach einem
Schema mit mehrfacher Verabreichung erfolgen. Das Vakzin kann in
Verbindung mit anderen immunregulatorischen Mitteln verabreicht werden.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ferner die Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung
wie oben beschrieben oder der immunogenen Zusammensetzung wie oben
beschrieben zum Schutz gegen eine Infektion oder zur Behandlung
einer Infektion durch H. pylori angegeben.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt die endoskopische Untersuchung
des Antralbereichs von geschützten
Hunden (1A) und von zur Kontrolle dienenden
(infizierten) Hunden (1B) 42 Tage nach der H. pylori.-Exposition.
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2 zeigt die histologische Untersuchung
(Hämatoxylin-Eosin
(HE)-Färbung)
von Biopsien, die dem Antralbereich von geschützten Hunden (2A,
Vergrößerung 10×) und zur
Kontrolle dienenden (infizierten) Hunden (2B, Vergrößerung 10×; 2C,
Vergrößerung 40×; 2D,
Vergrößerung 100×) 42 Tage
nach der H. pylori-Exposition entnommen worden waren.
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3 zeigt die immunhistochemische Untersuchung
von Biopsien, die aus dem Antralbereich von geschützten Hunden
(3A) und zur Kontrolle dienenden (infizierten)
Hunden (3B) 42 Tage nach der H. pylori-Exposition
entnommen worden waren (Vergrößerung 40×).
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4 zeigt
den Zeitplan des Versuchs zur Ermittlung, ob Beagle-Hunde gegen eine
Infektion mit H. pylori durch Verwendung von gereinigten Antigenen,
die i.m. verabreicht werden, geschützt werden können.
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5 zeigt die Serum-Antikörpertiter
gegen rekombinantes VacA (5A), CagA
(5B) und NAP (5C) (Mittelwerte)
vor der ersten Immunisierung sowie nach der zweiten, dritten und
vierten Immunisierung i.m. mit gereinigten Antigenen oder mit einem
Gesamtzelllysat. Der waagerechte Pfeil zeigt die Untergrenze für positive
ELISA-Resultate an.
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6 zeigt die Serumtiter der IgG-Antikörper-Unterklassen
IgG1 und IgG2 gegen CagA (6A) und NAP
(6B) (mittlere Titer pro Gruppe nach i.m.-Immunisierung
mit gereinigten Antigenen oder mit Gesamtzelllysat) zu den gleichen
Zeitpunkten wie oben (5).
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7 zeigt die Serum-IgA-Antikörpertiter
gegen p95 (rekombinantes VacA) bei Beagle-Hunden, die i.m. mit gereinigten
Antigenen (VacA, CagA und NAP) oder mit Gesamtzelllysat (einzelne
Hunde – 7A bis 7F)
immunisiert worden waren, vor der Immunisierung und nach der dritten
Immunisierung (ähnliche
Serum-IgA-Antikörpertiter
wurden gegen CagA festgestellt).
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8 zeigt die endoskopischen Bilder von
geschützten
(8A) und nichtgeschützten (infizierten) Hunden
(8B), die etwa 8 Wochen nach der Exposition aufgenommen
wurden.
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9 zeigt die Histologie (HE-Färbung, Vergrößerung 10×) der Magenschleimhaut
von geschützten (9A)
und nichtgeschützten
(infizierten) Hunden (9B), wobei die Proben etwa 8
Wochen nach der Exposition entnommen wurden. In 9A ist
eine normale Mucosa und Submucosa festzustellen. Im Gegensatz dazu
ist anhand von 9 ein großes lymphoides
Follikel festzustellen, das die Struktur der Mucosa und der Submucosa
aufbricht.
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10 zeigt die Immunhistochemie unter Verwendung
eines monoklonalen Anti-VacA-Antikörpers, wobei die Probe etwa
8 Wochen nach der Exposition entnommen wurde (Vergrößerung 10×). Bei
dem geschützten
Hund (10A) ist negative Färbung festzustellen,
während
bei dem nichtgeschützten
(infizierten) Hund (10B) auf die stark positive
Färbung
hinzuweisen ist.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Gesamtzellvakzin aus H.
pylori
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Im
Rahmen einer Ausführungsform
der Erfindung wurde die Realisierbarkeit einer Immunisierung von normalen
Hunden mit einem Gesamtzellvakzin aus H. pylori (das heißt einem
H. pylori-Zelllysat)
untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass eine derartige Präparation
eine Immunität
hervorrufen kann, die zu einer Schutzwirkung gegen eine spätere Exposition
mit infektiösem
H. pylori führt.
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Immunogenität.
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Die
Schutzwirkung eines H. pylori-Gesamtzellvakzins wurde bei Hunden
untersucht, die infektiösem H.
pylori ausgesetzt worden waren. Die Details der angewandten experimentellen
Verfahren werden später
erläutert.
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, induzierte die intramuskuläre Immunisierung
im Vergleich mit dem Zeitpunkt 0 und mit den zu Kontrollzwecken
dienenden Hunden sehr hohe Serumtiter an IgG-Antikörpern. Die i.m.-Immunisierung
mit H. pylori-Lysat induzierte ferner die Erzeugung von antigenspezifischen
Serum-IgA-Antikörpern.
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Symptome.
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Die
zur Kontrolle dienenden Hunde Nr. 2 und Nr. 3 hatten während der
ersten Woche nach der letzten Exposition Durchfall. Der zur Kontrolle
dienende Hund Nr. 2 litt ferner unter Erbrechen. In der i.m.-immunisierten
Gruppe gab es keine Symptome einer H. pylori-Infektion.
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Ureasetest an Magenbiopsiematerial
(antral) und an durch Magenspülung
gewonnenem Material.
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Dieser
Test, der an antralem Biopsiematerial und Magenspülmaterial
vorgenommen wurde, das 10 Tage nach der letzten Exposition gewonnen
worden war, war bei der Kontrollgruppe positiv und bei der i.m.-immunisierten
Gruppe negativ, wie aus der nachstehenden Tabelle 2 hervorgeht,
und zwar sogar 24 h später. Diese
Daten wurden auch am Tag 42 nach der Exposition bestätigt.
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Ergebnisse von Endoskopie,
Histologie und Immunohistochemie.
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Geschützte Hunde
zeigten bei endoskopischer Untersuchung am 42. Tag nach der Exposition
eine normale Mucosa (
1A) mit einer hellen und glatten
Oberfläche
und ohne Zeichen einer Hyperämie
oder eines Ödems.
Im Gegensatz dazu war bei den zur Kontrolle dienenden (infizierten)
Hunden die Magenschleimhaut stark gerötet und ödematös und hatte eine gekräuselte Oberfläche mit
dem Aussehen von Lamellen (
1B), was
auf das Vorliegen der nodularen (follikularen) Gastritis hindeutet,
die früher
beobachtet und in den Patentanmeldungen
GB 9801000.2 und PCT/IB99/00217 beschrieben
worden war.
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Histologisch
besaß die
Magenschleimhaut der geschützten
Hunde nach wie vor eine intakte Struktur, und zwar an der Oberfläche und
an der Submucosa (2A), während bei den infizierten Hunden
Hyperämie (2B,
Pfeile), ein Ödem
(2B, Sternchen) und entzündliche Zellinfiltrate (2B,
dreieckige Pfeile, und 2C) auftraten. H. pylori war
ferner in der Mucosa-Schicht leicht zu identifizieren (2D).
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Alle
diese Daten wurden durch Immunhistochemie unter Verwendung eines
monoklonalen Anti-VacA-Antikörpers
bestätigt,
der Epithelzellen der infizierten Hunde stark färbte (3B, Pfeile),
nicht jedoch die Epithelzellen der geschützten Hunde (3A).
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Schlussfolgerungen.
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Zusammengenommen
zeigen diese Daten, dass die intramuskuläre Immunisierung mit H. pylori-Lysat Hunde
gegen eine Infektion durch infektiösen H. pylori schützen kann
und dass der intramuskuläre
Weg für eine
Impfung gegen dieses Bakterium in Betracht gezogen werden kann.
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Vakzin mit gereinigtem
H. pylori-Antigen
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Im
Rahmen einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wurde ferner die Realisierbarkeit einer Immunisierung
von normalen Hunden mit gereinigten H. pylori-Antigenen untersucht.
Es zeigte sich, dass eine solche Präparation eine Immunität hervorrufen
kann, die eine Schutzwirkung gegen eine spätere Exposition mit infektiösem H. pylori
ergibt.
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Immunogenität.
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Die
Schutzwirkung von gereinigten H. pylori-Antigenen (speziell VacA, CagA und NAP)
wurde bei Hunden untersucht, die einem infektiösen H. pylori ausgesetzt worden
waren. Die Details der angewandten experimentellen Verfahren werden
weiter unten erläutert.
Die Immunisierung mit diesen Antigenen induzierte eine sehr starke
Serum-IgG-Antikörper-Antwort,
die für
jedes Antigen nach lediglich zwei Dosen spezifisch war. Die Titer
erhöhten
sich nach der dritten Dosis. Dosen von 50 und 10 μg Antigenen
waren ebenso gut wie eine Dosis von 250 μg, um hohe Titer von antigenspezifischen
Antikörpern
zu induzieren. Im Vergleich dazu waren bei den mit Kpylori-Lysat
immunisierten Hunden niedrigere Antikörpertiter festzustellen (vgl. 5).
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Die
Immunisierung mit diesen Antigenen induzierte ferner hohe Titer
der antigenspezifischen Serum-IgG1-Antikörper und -IgG2-Antikörper, was
nahelegt, dass diese Immunisierung sowohl die Immunantwort vom Typ
Th1 als auch vom Typ Th2 induziert, im Unterschied zu dem, was bereits
bei infizierten Mäusen
und Hunden festgestellt worden war, bei denen eine überwiegende
Immunantwort vom Typ Th1 evident ist (vgl. 6).
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In
dieser Weise immunisierte Hunde hatten ferner nachweisbare Titer
der antigenspezifischen IgA-Antikörper im Serum (vgl. 7).
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Ergebnisse der Endoskopie,
Histologie und Immunhistochemie.
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Bei
den geschützten
Tieren (vgl. Tabelle 3, in der zusammenfassende Ergebnisse zum Schutz
aufgeführt
sind, die auf einer Zusammenfassung aller Parameter beruhen, einschließlich der
Endoskopie (Gastroskopie), der Histologie und Immunhistochemie)
war die Magenschleimhaut aufgrund der endoskopischen Untersuchung,
der Histologie und der Immunhistochemie normal (vgl. die 8A, 9A bzw. 10A). Die nicht geschützten (infizierten) Tiere zeigten
bei der Endoskopie ein hyperämisches,
stark entzündliches
Aussehen der Magenschleimhaut (8B) mit
einer diffusen Infiltration mit einkernigen, in lymphoiden Follikelstrukturen
aggregierten Zellen (9B), welche die normale Drüsenstruktur
aufbrachen. 10B zeigt eine stark positive
Reaktion in der Immunhistochemie unter Verwendung eines monoklonalen
Anti-VacA-Antikörpers.
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Schlussfolgerungen.
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Zusammengenommen
zeigen diese Daten, dass die intramuskuläre Immunisierung mit H. pylori-Antigenen
Hunde gegen eine Infektion durch infektiösen H. pylori schützen kann.
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Tabelle
3 Intramuskuläre Immunisierung
mit gereinigten Antigenen schützt
Hunde vor Infektion durch Helicobacter pylori
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Experimenteller Teil
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H. pylori-Stämme.
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SPM326s,
ein Streptomycin-resistenter Abkömmling
des mausadaptierten H. pylori-Typ 1 (CagA+/VacA+)-Stamms SPM326 (Marchetti
et al., 1995), wurde wie früher
beschrieben kultiviert (Marchetti et al., 1995) und zur Infizierung
der Hunde verwendet. Der CCUG-Stamm von H. pylori ist im Stand der
Technik gut bekannt.
-
Tiere.
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Sechs
4–6 Monate
alte xenobiotische Beagle-Hunde, sämtliche weiblich (Morini s.a.s.,
S. Polo D'Enza, Italien)
wurden auf der Basis des Fehlens von nachweisbarem Serum-IgG gegen
Helicobacter spp. in der Western-Blot(WB)-Analyse unter Verwendung
von Bakterien-Gesamtlysat als Antigen ausgewählt (vgl. unten). Die sechs
ausgewählten
Hunde wurden unter Standardbedingungen gehalten und erhielten eine
Diät aus
Trockenfutter (MIL, Morini s.a.s.) und Leitungswater ad libitum.
Nach der Ankunft in der Tierunterkunft der Anmelderin bestätigte eine
zusätzliche
WB-Analyse der Seren
ihren H. pylori-Status. Die Hunde wurden in individuellen Käfigen gehalten
und konnten sich einen Monat an die neue Umgebung anpassen. Während des
Anpassungsmonats wurden zwei Tests an Fäkalproben durchgeführt, um
das Vorliegen von Darmparasiten oder üblichen pathogenen Darmbakterien
zu ermitteln.
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Herstellung des H. pylori-Lysats.
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Zwei
Pellets des H. pylori-CCUG-Stamms
aus zwei 5-Liter-Fermentern (Olivieri, R. et al., 1993, J. Clin. Microbiol.
31:160-162) wurden hergestellt. Danach wurde jedes Pellet in 50
ml Puffer (50 mM Na2HPO4·2H2O, 300 mM NaCl, pH 7,8) unter Beschallen
resuspendiert; die beiden resuspendierten Pellets wurden gemischt. Die
optische Dichte OD530nm der kombinierten
Resuspension wurde gemessen, um die Bakterienkonzentration zu ermitteln
(= 3,2·1010 CFU/ml). Die Resuspension wurde mit Beschallungspuffer
verdünnt,
um die Konzentration auf 2·1010 CFU/ml zu bringen. Vor dem Beschallen
besaßen
die Bakterien die klassische Spiralform bei Betrachtung unter dem
Mikroskop. Die Beschallung der resuspendierten Bakterien wurde dann
auf Eis durchgeführt:
2 Zyklen von 4 Minuten und 2 Zyklen von 5 Minuten, wobei zwischen
jedem Zyklus 1 Minute gewartet wurde. Nach dem Beschallen erschienen
alle Bakterien bei Betrachtung unter dem Mikroskop aufgebrochen. Danach
wurde die Proteinkonzentration durch Anwendung des Bradford-Verfahrens
ermittelt (Proteinkonzentration = 57,5 mg/ml). Dann wurden Aliquote
des Zelllysats hergestellt und bis zur Verwendung bei –80 °C eingefroren.
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Immunisierung.
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Drei
Hunde wurden am Tag 0 intramuskulär (i.m.) mit dem herstellten
H. pylori-Lysat (Äquivalent
von 1010 CFU H. pylori (= 28 mg/Dosis))
immunisiert, das auf 1 mg Aluminiumhydroxid (Chiron Behring GmbH & Co., Marburg,
Deutschland; Lot Nr. 277345) in einem Volumen von 1 ml adsorbiert
worden war. Die Immunisierungen wurden an den Tagen 7, 14 und 22
wiederholt. An den Tagen 0, 21 (Post-3) und 43 (Post-4) wurden Serumproben
entnommen. Die anderen drei Hunde, die als Kontrollgruppe dienten,
wurden identisch behandelt, wobei jedoch anstelle des H. pylori-Lysats Kochsalzlösung verwendet
wurde.
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Exposition gegenüber infektiösem H. pylori.
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Die
Hunde wurden an den Tagen 49, 51 und 53 folgendermaßen dem
mausadaptierten H. pylori-Stamm SPM326s ausgesetzt: 24 h vor jeder
Exposition wurden die Hunde nüchtern
gehalten. 2 h vor der Bakterieninokulation erhielten die Hunde 10
mg/kg Cimetidine i.m. (Tagamet® 200; Smith Kline & French, USA).
Zum Zeitpunkt der Infizierung wurden die Hunde mit einem Gemisch
von 40 μg/kg
Medetomidine-Hydrochlorid (Domitor®; Centralvet-Vetem
s.p.a., Milano, Italien) und 5 mg/kg Ketamine (Ketavet®, Gellini,
Latina, Italien) intravenös
(i.v.) anästhesiert;
anschließend
wurde eine Magenspülung
mit 100 ml einer sterilen 0,2 M NaHCO3-Lösung vorgenommen,
wonach eine orale Infizierung mit 3 ml einer frisch hergestellten
Suspension von 109 CFUs des H. pylori-Stamms
SPM326s in steriler Kochsalzlösung
vorgenommen wurde, der unter mikroaeroben Bedingungen (vgl. unten)
unmittelbar vor der Inokulationsprozedur kultiviert worden war.
Am Ende der Bakterieninokulation wurden 200 μg/kg des anästhetischen Antagonisten Atipamezol
(Antisedan®;
Centralvet-Vetem s.p.a., Milano, Italien) verabreicht, wonach die
Hunde wiederum mit Cimetidine behandelt und nach 2 h gefüttert wurden.
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Folgeprogramm nach der
Infektion.
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10
und 42 Tage nach der letzten Exposition wurden Magenendoskopien
unter Verwendung eines pädiatrischen
Bronchoskops der Fa. Pentax von 4,9 mm Durchmesser (Pentax Technologies,
Zaventem, Belgien) durchgeführt.
Gleichzeitig wurden während
der Endoskopien unter Verwendung einer Biopsie-Pinzette mit flexiblen
Spitzen am Antrum, am Corpus fundus und an der Cardia Biopsie-Proben
für den
Urease-Test und für
mikrobiologische, histopathologische und immunhistochemische Analysen
entnommen. Vor jeder Endoskopie wurden das gesamte Instrument und
die flexible Pinzette 45 min in 4-%ige Glutaraldehyd-Lösung eingelegt und dann mit
steriler Kochsalzlösung
gespült.
Zur Vermeidung einer Kreuzkontamination zwischen an unterschiedlichen
Stellen entnommenen Biopsie-Proben wurden die Pinzetten mit Leitungswasser
gewaschen und vor jeder Entnahme der Biopsie-Probe leicht in der
Flamme sterilisiert. Das obige experimentelle Protokoll war vom
Scientific and Ethical Commitee der Universität Pisa genehmigt und hatte
vom italienischen Gesundheitsministerium (Department of Veterinary
Health, Food and Nutrition) die offizielle Autorisierung erhalten
(Ministerialdekret Nr. 21/97-C).
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Urease-Schnelltest.
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Die
antralen Biopsie-Proben und die Flüssigkeit von der Magenspülung wurden
bis zu 24 h in 1 ml einer 10-%igen Harnstofflösung in destilliertem Wasser
unter Zusatz von 2 Tropfen einer 1 %igen Phenolrotlösung (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO, USA) in Phosphatpuffer, pH 6,5, inkubiert.
Ein positiver Test wird durch Farbänderung (von Orange nach Dunkel-Lachsrosa)
im Medium angezeigt; die zur Farbänderung erforderliche Zeit
wird aufgezeichnet. Zur Zeit 0 wurde die Endoskopie an den sechs
Hunden vorgenommen, und die antralen Biopsie-Proben wurden für den Urease-Test
verwendet. Bei allen sechs Hunden war der Urease-Test zur Zeit 0 negativ.
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Histopathologie und Transmissionselektronenmikroskopie.
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Proben
zur histologischen und immunhistochemischen Untersuchung sowie zur
Ultrastrukturuntersuchung wurden von den Biopsie-Proben an Stellen
entnommen, die den Stellen benachbart waren, die für die mikrobiologische
Analyse verwendet worden waren. Die Proben wurden in 10-%igem gepuffertem
Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Zur histopathologischen
Untersuchung wurden 3 μm-Schnitte
mit Hämatoxylin-Eosin
(H + E), Alcian und durch Periodsäure-Färbung nach Schiff (PAS-Färbung) unter
Anwendung von Standardprozeduren gefärbt. Gleiche Schnitte wurden
auch für
immunhistochemische Analysen unter Anwendung des Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Peroxidase-Verfahrens
mit einem für
H. pylori spezifischen monoklonalen Antikörper (Mab) (Biogenesis Ltd.,
Poole, England) oder einem monoklonalen Mäuse-Anti-VacA-Antikörper (C1G9)
durchgeführt,
der durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit gereinigtem nativem
H. pylori-VacA erhalten worden war (Burroni und Telford, unveröffentlichte
Mitteilungen). Als zweiter Antikörper
wurde biotinylierter Pferde-Anti-Maus-Antikörper verwendet. Die Reaktion
wurde mit 3,1-Diaminobenzidin-Hydrochlorid (DAB) (Sigma) zur Identifizierung
und Lokalisierung des Bakterienantigens entwickelt. Zur elektronenmikroskopischen
Untersuchung wurden andere Proben nach Karnowsky fixiert, in OsO4 nachfixiert und in Epon-Araldite (Polysciences
Inc., Warrington, PA; USA) eingebettet. Halbdünne Schnitte wurden zur Ermittlung
einer Zellschädigung
mit Toluidinblau gefärbt,
während
Ultradünnschnitte
mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und dann mit einem Philips-EM
301-Transmissionselektronenmikroskop
(TEM) bei einer Betriebsspannung von 80 kV untersucht wurden.
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Nachweis von Anti-H. pylori-Antikörpern.
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SDS-PAGE-Analysen
von H. pylori (Stamm SPM326s) und WB-Analysen von Seren wurden nach
den früher
veröffentlichten
Verfahren durchgeführt
(Marchetti et al., 1995). Kurz zusammengefasst wurden Hundeseren
1:200 verdünnt
und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde Meerrettich-Peroxidase(HRP)-konjugierter
Kaninchen-Anti-Hund-IgG-Antikörper (Nordic
Immunological Laboratories, Tilburg, Niederlande) in einer Verdünnung von
1:2000 2 h zugegeben, und die Reaktion wurde unter Verwendung von 4-α-Chlornaphthol
als Substrat entwickelt. Die Bestimmung des Antikörpers gegen
H. pylori durch ELISA wurde an beschichteten Platten mit 96 Vertiefungen über Nacht
bei 4 °C
mit dem hergestellten CCUG-Stamm-Lysat, das für die Immunisierung verwendet
worden war (5 μg/Vertiefung),
oder mit gereinigtem nativem CagA oder NAP (0,2 μg/Vertiefung) durchgeführt. Die
beschichteten Vertiefungen wurden mit PBS, die 5 % entrahmte Milch
enthielt, blockiert. Zweifache Serienverdünnungen der Seren wurden 2
h bei 37 °C
inkubiert und dann mit PBS gewaschen. Die antigenspezifischen IgG-Titer
wurden unter Verwendung eines 1:4000-verdünnten HRP-konjugierten Ziegen-Anti-Hund-IgG-Antikörpers (Bethyl
Laboratories, Inc., Montgomery, TX, USA) 2 h bei 37 °C durchgeführt. Die
Antikörper,
an die Antigen gebunden war, wurden durch Zusatz von o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid
(Sigma) als Substrat erfasst. Die Antikörper-Titer wurden bestimmt,
wie früher
beschrieben worden war (Ghiara et al, 1997).
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Intramuskuläre (i.m.)
Immunisierung von Hunden mit gereinigten Antigenen von H. pylori.
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VacA
und CagA wurden exprimiert und gereinigt, wie in Ghiara et al.,
1997, beschrieben. NAP wurde exprimiert und gereinigt, wie in den
früheren
Patentanmeldungen
GB 9807721.7 und
PCT/IB99/00695 beschrieben ist. Wie aus Tabelle 4 hervorgeht, wurden
Gruppen von vier Hunden i.m. immunisiert mit:
- (i)
einem Gemisch von rekombinantem VacA, CagA und NAP (250, 50 oder
10 μg von
jedem Antigen), die auf Aluminiumhydroxid adsorbiert waren (Dosis
1 mg);
- (ii) CCUG-Lysat (hergestellt wie oben erläutert) mit 25 oder 5 mg pro
Dosis, adsorbiert an Aluminiumhydroxid (Dosis 1 mg);
- (iii) Aluminiumhydroxid allein (Dosis 1 mg).
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Die
Hunde wurden 4-mal in Intervallen von einer Woche immunisiert. Die
Exposition gegen H. pylori wurde 4 Wochen später durchgeführt, wie
bereits beschrieben wurde. Proben (Blutproben, Biopsie-Proben, etc. – wie vorstehend
beschrieben) wurden vor der Immunisierung, nach der zweiten, dritten
und vierten Immunisierung sowie dann 2 bis 3 Wochen und 8 Wochen
nach der letzten Exposition entnommen.
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