DE69922364T2 - Verfahren zur Immunisierung gegen und zur Behandlung von Infektionen durch H.pylori - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Schutz gegen eine Infektion oder zur Behandlung einer Infektion durch H. pylori, das die Verabreichung einer wirksamen Menge eines oder mehrerer H. pylori-Antigene auf einem nicht über die Schleimhäute führenden Wege umfasst.
  • Hintergrund der Erfindung
  • H. pylori wurde 1982 von B. Marshall und J. Warren unter Anwendung von mikroaerophilen Bedingungen isoliert, die zur Kultivierung von Campylobacter jejuni entwickelt worden waren. H. pylori-Bakterien sind S-förmige, gramnegative Bazillen einer Länger von 2 bis 3,5 μm und einer Breite von 0,5 bis 1 μm (Blaser, M.J., und Parsonnet J., 1994, J. Clin. Invest. 94:4-8). Es ist nunmehr (seit kurzem) bekannt, dass die Infektion mit H. pylori die weltweit verbreitetste Infektion darstellt. In Entwicklungsländern sind 80 % der Bevölkerung im Alter von 20 Jahren von dem Bakterium infiziert, während in entwickelten Ländern die Infektion mit H. pylori von <20 % bei 30-Jährigen auf >50 % bei 60-Jährigen mit dem Alter ansteigt (Axon, A.T., 1995, Pharmacol. Ther. 9:585-588; Blaser und Parsonnet, 1994). Die Infektion wird entweder auf oral-fäkalem oder oral-oralem Weg übertragen (Blaser und Parsonnet, 1994). Die Infektion tritt während der ersten Lebensjahre auf und bleibt lebenslang erhalten. Eine einmal eingetretene Infektion wird chronisch und möglicherweise permanent. Risikofaktoren für die Infektion sind große Menschenansammlungen, schlechte Hygiene und wirtspezifische genetische Faktoren.
  • Die vollständige Genomsequenz von H. pylori wurde veröffentlicht (Tomb, J.-F., et al., 1997, Nature 388: 539-547). Eine kurze Zusammenfassung dieses Artikels und eine allgemeine Zusammenfassung der Biologie von H. pylori sind in Doolittle, R.F., 1997, Nature 388:515-516, zu finden.
  • Die chronische Infektion der gastroduodenalen Schleimhäute beim Menschen durch H. pylori ist häufig von chronischer Gastritis, Ulcus pepticum und einer Erhöhung des Risikos des Auftretens von malignen Magengeschwüren wie etwa Adenokarzinomen und B-Zell-Lymphomen niederen Grades begleitet (Blaser und Parsonnet, 1994; Parsonnet, J., et al., 1991, N. Engl. J. Med. 325:1127-1231; Parsonnet, J., et al., 1994, N. Engl. J. Med. 330:1267-1271). Die meisten Infektionen bleiben asymptomatisch, während symptomatische, schwere Erkrankungen epidemiologisch mit der Infektion durch eine Untergruppe von H. pylori-Stämmen, die Typ I genannt werden, zu korrelieren sind (Blaser, M.J., et al., 1995, Cancer Res. 55:2111-2115; Covacci, A., et al., 1997, Trends Microbiol. 5:205-208; Covacci, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5791-5795; Eck, M., et al., 1997, Gastoenterology 112:1482-1486; Xiang, Z., et al., 1995, Infect. Immun. 63:94-98). Diese Untergruppe von Stämmen ist aufgrund der Expression eines biologisch aktiven Toxins (VacA), das gegenüber Epithelzellen des Magens in vitro und in vivo cytopatisch ist, mit einer erhöhten Virulenz behaftet (Ghiara, P., et al., 1995, Infect. Immun. 63:4154-4160; Harris, P.R., et al., 1996, Infect. Immun. 64:4867-4871; Telford, J.L., et al., 1994, J. Exp. Med. 179:1653-1658), ferner auch aufgrund des Erwerbs einer Pathogenitätsinsel (Pathogenicity Island, PAI), die als cag bezeichnet wird und einen Satz von Genen enthält, die verschiedene Virulenzfaktoren codieren (Censini, S., et al., 1996, Proc. Natl. Sci.
  • USA 93:14648-14653), die für die Induktion der Synthese des neutrophilen chemotaktischen Cytokins IL-8 durch Epithelzellen des Magens verantwortlich sind (Censini et al., 1996).
  • Zu den bisher identifizierten Faktoren von H. pylori gehören die Flagellen, die wahrscheinlich zur Bewegung durch die Schleimhautschicht erforderlich sind, vgl. zum Beispiel Leying et al., 1992, Vol. Microbiol. 6:2863-2874; die Urease, die erforderlich ist, um die saure Umgebung des Magens zu neutralisieren und eine anfängliche Koloniebildung zu ermöglichen, vgl. zum Beispiel Cussac et al., 1992, J. Bacteriol. 174:2466-2473, Perez-Perez et al., 1992, J. Infect. Immun. 60:3658-3663, Austin et al., 1992, J. Bacteriol. 174:7470-7473, WO 90/04030; das H. pylori-Cytotoxin (zuweilen als VacA bezeichnet, da es Vakuolenbildung hervorruft), vgl. zum Beispiel WO 93/18150, Telford, J.L., et al., 1994, J. Exp. Med. 179:1653-1658, Cover et al., 1992, J. Bio. Chem. 267:10570-10575, Cover et al., 1992, J. Clin. Invest. 90:913-918, Leunk, 1991, Rev. Infect. Dis. 13:5686-5689; die Hitzeschockproteine (hsp) von H. pylori, vgl. zum Beispiel WO 93/ 18150, Evans et al., 1992, Infect. Immun. 60:2125-2127, Dunn et al., 1992, Infect. Immun. 60:1946-1951, Austin et al., 1992; sowie das Cytotoxin-assoziierte Protein, CagA, vgl. zum Beispiel WO 93/18150, Covacci, A., et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:5791-5795, Tummuru, M.K., et al., 1994, Infect. Immun. 61:1799-1809.
  • Gegenwärtig können die Stämme von H. pylori in mindestens zwei Hauptgruppen unterteilt werden, die das Cytotoxin (VacA) und die CagA-Proteine entweder exprimieren (Typ I) oder nicht exprimieren (Typ II). Die Stämme vom Typ I enthalten die Gene für CagA und das Toxin und erzeugen aktive Formen dieser Antigene. Stämme vom Typ II weisen den CagA-Locus nicht auf und exprimieren das Cytotoxin nicht. Die Verknüpfung zwischen dem Vorliegen des CagA-Gens und der Cytotoxizität legt nahe, dass die Erzeugung des CagA-Gens für die Transkription, die Faltung, die Ausschleusung oder die Funktion des Cytotoxins erforderlich ist. Epidemiologische Analysen zeigen, dass Bakterien vom Typ I mit duodenalen Ulcerationen, Magenulcera und schweren Formen der aktiven Gastritis in Zusammenhang stehen.
  • Bezüglich einer allgemeinen Zusammenfassung der pathogenen Rolle von H. pylori bei Ulcus pepticum vgl. Telford, J.L., et al., 1994, TIBTECH 12:420-426.
  • Von verschiedenen Autoren wurde gezeigt, dass Kulturüberstände von H. pylori ein Antigen mit einem Molekulargewicht von 120, 128 oder 130 kDa enthalten (Apel et al., 1988, Zentralblatt für Bakterio. Mikrob. und Hygiene 268:271-276; Crabtree et al., 1992, J. Clin. Pathol. 45: 733-734; Cover et al., 1990, Infect. Immun. 58:603-610; Figura et al., 1990, H. pylori gastritis and peptic ulcer (Herausgeber Malfertheiner et al.), Springer Verlag Berlin). Es war dabei nicht klar, ob der Unterschied in der Größe des beschriebenen Antigens durch Unterschiede bei der Abschätzung des Molekulargewichts des gleichen Proteins bei verschiedenen Labors, durch eine Größenvariabilität des gleichen Antigens oder durch tatsächlich unterschiedliche Proteine bedingt ist. Dieses Protein ist bei infizierten Menschen sehr immunogen, da im Serum praktisch aller mit H. pylori infizierter Patienten spezifische Antikörper nachgewiesen werden (Gerstenecker et al., 1992, Eur. J. Clin. Microbiol. 11:595-601).
  • Ein als NAP (neutrophil activating protein) bekanntes Protein (Evans, D.J., et al., 1995, Gene 153:123-127; WO 96/01272 und WO 96/01273, insbesondere die Sequenz SEQ ID No:6; vgl. ferner WO 97/25429), das bei Stämmen sowohl vom Typ I als auch vom Typ II gefunden wird, scheint im Test im H. pylori-Mäusemodell eine Schutzfunktion zu besitzen (Marchetti, M., et al., 1995, Science 267:1655-1658). NAP ist ein Homodekamer aus 15 kDa-Untereinheiten, und es wurde angegeben, dass der multimere Komplex eine ringförmige Struktur besitzt, die spontan hexagonale parakristalline Strukturen ausbildet. Das Gesamtprotein scheint mit den Glycosphingolipid-Rezeptoren von menschlichen Neutrophilen zu wechselwirken.
  • In WO 98/04702 sind eine Reihe anderer Antigene von H. pylori beschrieben, zu denen Urease B (SEQ ID NO:4), HopX (SEQ ID NO:21), HopY (SEQ ID NO:21), 36 kDa (SEQ ID NO:26), 42 kDa (SEQ ID NO:25) und 17 kDa (SEQ ID NO:27) gehören. Urease ist ferner beispielsweise beschrieben in EP-B-0 367 644 (Protein mit Ureaseaktivität), EP-A-0 610 322 (Urease E, F, G, H und I), EP-A-0 625 053 (Urease-Protein) und EP-A-0 831 892 (multimere Formen von Urease). Zu weiteren Antigenen von H. pylori gehören die Proteine mit 54 kDa (SEQ ID NO:2) und 50 kDa (SEQ ID NO:1), die in EP-A-0 793 676 beschrieben sind.
  • Eine Diskussion der verschiedenen Virulenzfaktoren von H. pylori ist beispielsweise in EP-A-93905285.5 und EP-A-96908300.5 zu finden.
  • Die Besiedlung der Magenschleimhaut durch H. pylori wird heute als Hauptursache für akute und chronische gastroduodenale pathologische Zustände beim Menschen angesehen (Blaser und Parsonnet, 1994; Covacci et al., 1997). Die Feststellung der infektionsbedingten Natur der Erkrankung ist von erheblichem Einfluss auf die Behandlung der Erkrankung, die sich von der Behandlung der Symptome durch Anti-H2-Blocker zur Ausrottung der bakteriellen Infektion durch Antibiotikumsbehandlung hin verschob.
  • Trotz der unbestreitbaren Erfolge, die mit der Antibiotikumsbehandlung erzielt werden, sollte nicht außer Acht gelassen werden, dass eine derartige Behandlung unvermeidlich zum Auftreten resistenter Stämme führt, gegen die auf lange Sicht Antibiotika nicht mehr wirksam sind. Dies legt nahe, dass die Impfung, die klassischerweise der wirksamste Weg zur Vorbeugung und Kontrolle von Infektionskrankheiten in einer großen Population darstellt, angewandt werden sollte, um eine Infektion zu verhindern und möglicherweise auch die Erkrankung zu behandeln.
  • Die steigende Bedeutung von H. pylori bei der Induktion einer großen Vielfalt von Magenerkrankungen stellte die Hauptherausforderung für die Entwicklung wirksamer prophylaktischer und/oder therapeutischer Strategien dar. Zum besseren Verständnis der Wechselwirkungen zwischen dem Bakterium und dem Wirt konzentrierten sich erhebliche Anstrengungen auf die Entwicklung geeigneter Tiermodelle der Infektion, mit denen Aspekte der natürlichen menschlichen Infektion reproduziert werden können.
  • Es wurden bereits einige Tiermodelle der Infektion und der Erkrankung entwickelt, denen die Zielsetzung zugrunde lag, die Pathogenese der Infektion und die Entwicklung vorbeugender und therapeutischer Strategien zu studieren. Viele dieser Modelle sind in hohem Maße unanwendbar, da bei ihnen Affen (Dubois, A. et al.., 1994, Gastroenterology 106:1405-1417) oder Species eingesetzt werden, die unter gnotobiotischen (das heißt keimfreien) Bedingungen gehalten werden, zum Beispiel keimfreie Hunde oder Ferkel, eingesetzt werden (Krakowka, S., et al., 1987, Infekt. Immun. 55:2789-2796; Radin, M.J., et al., 1990, Infekt. Immun. 58:2606-2612). So wurde die Besiedlung von gnotobiotischen Ferkeln (Krakowka, S et al., 1987) unter Verwendung von H. pylori-Stämmen berichtet, die von Patienten mit gastroduodenalen Erkrankungen isoliert worden waren. Ferkel können jedoch nicht länger als zwei Monate unter keimfreien Bedingungen gehalten werden (Radin et al., 1990), hauptsächlich aufgrund ihrer Ernährungserfordernisse.
  • Ferner wurde die erfolgreiche Infizierung spezieller pathogenfreier (SPF-) Katzen mit einem aus normalen Katzen isolierten Stamm beschrieben (Fox, J.G., et al., 1995, Infection and Immunity 63:2674-2681; Handt, L.K., et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33:2280-2289). Ferner wurden gnotobiotische Beagle-Welpen mit einem menschlichen Isolat von H. pylori infiziert und 30 Tage unter keimfreien Bedingungen gehalten. Bei diesem Modell sind allerdings keine Daten zu Langzeitinfektionen mit H. pylori verfügbar (Radin et al., 1990). Zu weiteren experimentellen Tiermodellen gehören athymische nu/nu-Mäuse oder keimfreie Mäuse (Karita, M., et al., 1991, Am. J. Gastroenterol. 86:1596-1603).
  • Die Hauptnachteile dieser experimentellen Infektionen sind allerdings die erforderlichen aufwändigen und teuren Unterbringungssysteme sowie, was noch wichtiger ist, der spezielle immunologische Status der verwendeten gnotobiotischen oder Immundefizienten Wirte. In jüngerer Zeit wurde H. pylori, der frisch aus menschlichem Gastroduodenalbiopsiematerial isoliert worden war, an eine andauernde Besiedlung der Magenschleimhaut xenobiotischer Mäuse angepasst (Marchetti et al., 1995). Dieses Modell erwies sich als besonders nützlich zur Prüfung der Realisierbarkeit einer vorbeugenden Impfung (Manetti, R., et al., 1997, Infect. Immun. 65:4615-4619; Marchetti et al., 1995; Marchetti, M., et al., 1998, Vaccine 16:33-37; Radcliff, F.J., et al., 1997, Infect. Immun. 65:4668-4674) oder einer therapeutischen Impfung (Ghiara, P., et al., 1997, Infect. Immun. 65:4996-5002), zum In-vivo-Screening von antimikrobiellen Mitteln gegen H. pylori (Lee, A., et al., 1997, Gastoenterol. 112:1386-1397) sowie zur Untersuchung der Pathogenese der Infektion (Sakagami, T., et al., 1996, Gut 39:639-648). Zur Auswertung der Mageninfektion müssen die Mäuse allerdings getötet werden; dementsprechend können die durch die chronische Infektion und/oder die Wirkung des therapeutischen oder Immunisierungsregimes induzierten Änderungen nicht beim gleichen individuellen Tier verfolgt werden.
  • In der britischen Patentanmeldung GB 9801000.2 (Anmeldetag 16. Januar 1998) und der zugehörigen internationalen Patentanmeldung PCT/IB 99/00217 (Anmeldetag 15. Januar 1999) ist zum ersten Mal ein Tiermodell beschrieben, mit dem Symptome reproduziert werden können, die klar mit den akuten Phasen der Infektion mit H. pylori beim Menschen korreliert wurden (Marshall, B.J., et al., 1985, Med. J. Australia 142:436-439; Mitchell, J.D., et al., 1992, Am. J. Gastroenterol. 87:382-386; Morris, A., und G. Nicholson, 1987, Am. J. Gastroenterol. 82:192-199; Sobala, G.M., et al., 1991, Gut 32:1415-1418). Die in GB 9801000.2 und PCT/IB99/00217 beschriebene Erfindung beruht auf der Feststellung, dass H. pylori in persistierender Weise die Magenschleimhaut herkömmlicher xenobiotischer Hunde besiedeln kann, und dass diese Besiedlung akute Symptome und histopathologische Läsionen hervorruft und spezifische Immunantworten auslöst. Daher ist das in GB 9801000.2 und PCT/IB99/00217 angegebene Tiermodell ideal zur Untersuchung der Wirksamkeit von Behandlungen bei Infektionen durch H. pylori geeignet.
  • Da die Infektion mit H. pylori schleimhautbezogen ist, wobei die Bakterien nicht in die umgebenden Wirtszellen eindringen, konzentrierten sich die Anstrengungen zur Entwicklung von Impfstoffen gegen diese Erkrankung oder von Behandlungen dieser Erkrankung auf die Verabreichung auf die Schleimhaut, speziell die orale Verabreichung in den Gastrointestinaltrakt. Da früher angenommen wurde, dass eine lokale Behandlung (Schleimhautbehandlung) am Ort der Infektion mit H. pylori erforderlich ist, waren die Forschungsanstrengungen auf diesem Gebiet darauf gerichtet, Mucosa-assoziierte Anti-H. pylori-Antikörper durch Verabreichung von Prophylaktika/Therapeutika auf die Schleimhaut zu entwickeln (vgl. zum Beispiel Chen, M., et al., 1992, Lancet 339:1120-1121; Ferrero, R.L., et al., 1994, Infect. Immun. 62:4981-4989; Michetti, P., et al., 1994, Gastroenterology 107:1002-1011; Lee, A., et al., 1994, Infect. Immun. 62:3594-3597; Doidge, C., et al., 1994, Lancet 343:974-979; Marchetti et al., 1995; Lee, C.K., et al., 1995, J. Infect. Dis. 172:161-172; Corthesy-Theulaz, I., et al., 1995, Gastroenterology 109:115-121; Cuency, R., et al., 1996, Gastroenterology 110:1770-1775; Radcliff, F.J., et al., 1996, Vaccine 14:780-784; Stadtlander, C.T.K.H., et al., 1996, Dig. Dis. Sci. 41:1853-1862; Ferrero, R.L., et al., 1997, Gastroenterology 113:185-194; Weltzin, R., et al., 1997, Vaccine 15:370-376; Radcliff et al., 1997; Ghiara et al., 1997; Marchetti et al., 1998).
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde allerdings gezeigt, dass eine systemische Schutzwirkung gegen eine Infektion durch infektiösen H. pylori in unerwarteter Weise durch Verwendung einer Antigene gegen H. pylori enthaltenden Zusammensetzung erzielt werden kann, die nicht über die Schleimhaut verabreicht wird. Es wurde speziell gezeigt, dass zum Beispiel die intramuskuläre (i.m.) Immunisierung mit einem Zelllysat aus ganzen H. pylori-Zellen Hunde gegen eine Infektion durch infektiösen H. pylori zu schützen vermag, sowie, dass der intramuskuläre Verabreichungsweg, als Beispiel für einen nicht über die Mucosa erfolgenden Verabreichungsweg, in unerwarteter Weise für eine Impfung gegen dieses Bakterium in Betracht gezogen werden kann. Ein solches Verfahren kann auch bei der Behandlung einer bereits ausgebildeten Infektion durch H. pylori therapeutisch von Nutzen sein.
  • Sämtliche in der vorliegenden Anmeldung erwähnten Dokumente (einschließlich Patente, Patentanmeldungen, Forschungsartikel und Bücher) werden hierbei zur Gänze in Bezug genommen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung beruht dementsprechend auf der Feststellung, dass Zusammensetzungen, die Antigene von H. pylori enthalten, gegen H. pylori auf einem nicht über die Schleimhaut führenden Weg verabreicht werden können und noch zu einem wirksamen (systemischen) Schutz vor dieser Erkrankung führen, obwohl die H. pylori-Bakterien schleimhautassoziiert sind.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Schutz gegen eine Infektion oder zur Behandlung einer Infektion durch H. pylori angegeben, das die nicht über die Schleimhaut führende Verabreichung einer wirksamen Menge eines oder mehrerer Antigene von H. pylori umfasst.
  • Der Ausdruck "umfasst" bedeutet sowohl "enthält" als auch "besteht aus".
  • Die Verabreichung erfolgt bevorzugt parenteral und noch bevorzugter intramuskulär.
  • Das eine Antigen oder mehrere verabreichte Antigene können separat oder in Kombination eine schützende Immunantwort in einem Lebewesen, bevorzugt einem Säuger, und noch bevorzugter beim Menschen hervorrufen.
  • Mindestens eines der Antigene kann ein Virulenzfaktor von H. pylori sein. Beispiele für derartige Virulenzfaktoren sind VacA, CagA, NAP oder Urease. Zu weiteren bevorzugten Antigenen gehören die Antigene HopX, HopY, 36 kDa, 42 kDa und 17 kDa (vgl. WO 98/04702) oder 50 kDa (vgl. EO-A-0 793 676). Zu den bevorzugt verabreichten Virulenzfaktoren von H. pylori gehören VacA, CagA, NAP und Urease. Noch bevorzugter umfassen die Virulenzfaktoren VacA, CagA und NAP. Zu den am meisten bevorzugten Virulenzfaktoren gehören CagA und NAP.
  • Die verabreichten Antigene von H. pylori können lediglich aus Virulenzfaktoren oder lediglich speziellen Kombinationen von Virulenzfaktoren wie VacA, CagA, NAP und Urease; VacA, CagA und NAP; oder CagA und NAP bestehen.
  • Die verabreichten Antigene können ferner auch nicht von H. pylori stammende Antigene enthalten.
  • Das eine Antigen oder mehrere Antigene ist/sind bevorzugt gereinigtes) Antigene) oder stellen ein Gesamtzellimmunogen dar. Der Ausdruck "gereinigt" gedeutet, dass mindestens ein Reinigungsschritt durchgeführt wurde, sodass ein gereinigtes Antigen reiner ist als das gleiche Antigen in seinem natürlichen Kontext. Es können jedoch einige mit solchen gereinigten Antigenen verbundene Verunreinigungen vorliegen. Der Ausdruck "gereinigt" schließt die Situation ein, dass ein Antigen "isoliert" ist. In diesem Fall liegt das Antigen allgemein nicht zusammen mit irgendeiner anderen Substanz vor, die seine Fähigkeit beeinträchtigt, vor einer Infektion durch H. pylori zu schützen oder eine Infektion durch H. pylori behandeln zu können. Daher umfasst der Ausdruck "isoliert" den höchsten Reinigungsgrad.
  • Die Antigene werden durch verschiedene übliche Verfahren erhalten, zum Beispiel durch Reinigung/Isolierung aus einer Zellkultur, durch Rekombinanttechnik oder durch chemische Synthese. Das Gesamtzellimmunogen wird bevorzugt durch Gewinnung aus Zellen von H. pylori hergestellt. Die Gewinnung kann durch Lyse oder Beschallen von Zellen von H. pylori oder nach einem anderen geeigneten Verfahren durchgeführt werden. Das Gesamtzellimmunogen kann aus inaktivierten Zellen von H. pylori bestehen oder inaktivierte Zellen von H. pylori enthalten.
  • Zusammen mit einem oder mehreren Antigenen von H. pylori wird bevorzugt ein Adjuvans verabreicht. Das Adjuvans ist bevorzugt Aluminiumhydroxid oder MF59® (vgl. WO 90/14837; EP-B-0 399 843; Ott et al., Kapitel 10 von Vaccine Design: The subunit and adjuvant approach, Herausgeber Powell und Niewman, Plenum Press 1995).
  • Das eine Antigen oder mehrere Antigene können ferner auch in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Excipientien vorliegen.
  • Die vorliegende Erfindung gibt ferner die Verwendung einer wirksamen Menge eines oder mehrerer Antigene von H. pylori zur Herstellung eines Arzneimittels zur nicht über die Schleimhaut erfolgenden Verabreichung zum Schutz gegen eine Infektion durch H. pylori oder zur Behandlung einer Infektion durch H. pylori an.
  • Die vorliegende Erfindung gibt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung zur nicht über die Schleimhaut erfolgenden Verabreichung an, die ein Antigen von H. pylori oder mehrere Antigene von H. pylori sowie ein oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Excipientien enthält. Dabei handelt es sich bevorzugt um eine immunogene Zusammensetzung.
  • Das eine Antigen oder mehrere Antigene der pharmazeutischen Zusammensetzung können separat oder in Kombination eine schützende Immunantwort in einem Lebewesen, bevorzugt einem Säuger und noch bevorzugter einem Menschen, hervorrufen.
  • Bevorzugt ist mindestens eines der Antigene ein Virulenzfaktor von H. pylori. Beispiele für derartige Virulenzfaktoren sind, zusammen mit Beispielen für andere bevorzugte Antigene, oben angegeben.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung enthält bevorzugt mindestens die Virulenzfaktoren VacA, CagA, NAP und Urease. Die pharmazeutische Zusammensetzung enthält noch bevorzugter mindestens die Virulenzfaktoren VacA, CagA und NAP. Die pharmazeutische Zusammensetzung enthält am bevorzugtesten mindestens die Virulenzfaktoren CagA und NAP.
  • Die Antigene von H. pylori der pharmazeutischen Zusammensetzung können aus lediglich Virulenzfaktoren oder lediglich speziellen Kombinationen von Virulenzfaktoren wie VacA, CagA, NAP und Urease, VacA, CagA und NAP oder CagA und NAP bestehen.
  • Die Antigene der pharmazeutischen Zusammensetzung können ferner auch nicht von H. pylori stammende Antigene enthalten.
  • Das Antigen oder mehrere Antigene ist/sind bevorzugt gereinigte Antigene oder ein Gesamtzellimmunogen, wie oben beschrieben.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann ferner auch ein Adjuvans enthalten. Das Adjuvans ist bevorzugt Aluminiumhydroxid oder MF59®.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung kann eine immunogene Zusammensetzung wie etwa ein Vakzin sein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Die vorliegende Erfindung gibt entsprechend eine immunogene Zusammensetzung zur nicht über die Schleimhaut erfolgenden Verabreichung an, die ein oder mehrere Antigene von H. pylori und ein oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Excipientien enthält.
  • Immunogene Zusammensetzungen und Vakzine gemäß der Erfindung können entweder prophylaktisch (das heißt zur Vorbeugung einer Infektion vorgesehen) oder therapeutisch (das heißt zur Behandlung der Erkrankung nach der Infektion vorgesehen) sein. Derartige Vakzine enthalten ein Antigen oder Antigene, üblicherweise in Kombination mit "pharmazeutisch akzeptablen Trägern", wozu beliebige Träger gehören, die nicht selbst die Produktion von Antikörpern induzieren, die für das Individuum, das die Zusammensetzung erhält, schädlich sind. Geeignete Träger sind typischerweise große, langsam metabolisierte Makromoleküle, wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Copolymere, Lipidaggregate (wie Öltröpfchen oder Liposomen) sowie inaktive Viruspartikel. Derartige Träger sind den Fachleuten auf dem vorliegenden Gebiet geläufig. Diese Träger können zusätzlich auch als immunstimulierende Mittel ("Adjuvantien") wirken. Das Antigen kann ferner mit einem bakteriellen Toxoid konjugiert sein.
  • Bevorzugte Adjuvantien zur Erhöhung der Wirksamkeit der Zusammensetzung sind beispielsweise, ohne dass damit eine Beschränkung verbunden ist: (1) Aluminiumsalze (Aluminiumhydroxid), wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumsulfat, etc.; (2) Öl-in-Wasser-Emulsionsformulierungen (mit oder ohne andere spezifische immunstimulierende Mittel, wie Muramylpeptide oder Wandkomponenten von Bakterienzellen), wie zum Beispiel (a) MF59®, das 5 % Squalen, 0,5 % Tween® 80 und 0,5 % Span 85 enthält und unter Verwendung eines Mikrofluidizers zu Submikron-Partikeln formuliert ist, (b) SAF, das 10 % Squalen, 0,4 % Tween® 80, 5 % Pluronic-geblocktes Polymer L121 und thr-MDP enthält und entweder zu einer Submikron-Emulsion mikrofluidisiert oder zur Erzeugung einer Emulsion mit einer größeren Partikelgröße in einer Rührvorrichtung behandelt ist, sowie (c) das Ribi®-Adjuvanssystem (RAS), das 2 % Squalen, 0,2 % Tween® 80 sowie eine oder mehrere Wandkomponenten von Bakterienzellen aus der Gruppe enthält, die aus Monophosphoryllipid A (MPL), Trehalose-dimycolat (TDM) und Zellwandskelett (VWS) besteht, wobei MPL + CWS (Detox®) bevorzugt ist; (3) Saponin-Adjuvantien, wie Stimulon® oder daraus erzeugte Partikel, wie ISCOMs (immunostimulating complexes); (4) komplettes und inkomplettes Freundsches Adjuvans (CFA und IFA); (5) Cytokine, wie Interleukine (zum Beispiel IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc. ), Interferone (zum Beispiel IFN-γ), der Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF), der Tumornekrosefaktor (TNF), etc., sowie (6) weitere Substanzen, die als immunstimulierende Mittel wirken, um die Wirksamkeit der Zusammensetzung zu erhöhen. Aluminiumhydroxid und MF59® sind bevorzugt.
  • Wie oben erwähnt, gehören zu den Muramylpeptiden, ohne dass diesbezüglich eine Beschränkung vorliegt, N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin (MTP-PE), etc.
  • Die immunogenen Zusammensetzungen (zum Beispiel das Antigen, der pharmazeutisch akzeptable Träger und das Adjuvans) enthalten typischerweise Verdünnungsmittel, wie Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin, Ethanol, etc. Zusätzlich können Hilfssubstanzen, wie Netzmittel oder Emulgatoren, pH-Puffersubstanzen und dergleichen in solchen Trägern vorliegen.
  • Die immunogenen Zusammensetzungen werden typischerweise als injizierbare Zusammensetzungen entweder als flüssige Lösungen oder als Suspensionen hergestellt; feste Formen, die zum Lösen oder Suspendieren in flüssigen Trägern vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Die Präparation kann auch emulgiert oder in Liposomen verkapselt werden, um die Adjuvanswirkung, wie oben diskutiert, zu verstärken.
  • Immunogene Zusammensetzungen, die als Impfstoffe Verwendung finden, enthalten eine immunologisch wirksame Menge der antigenen Polypeptide sowie erforderlichenfalls beliebige andere Komponenten, wie oben erwähnt, falls erforderlich. Der Ausdruck "immunologisch wirksame Menge" bedeutet, dass die Verabreichung dieser Menge an ein Individuum entweder in einer einzigen Dosis oder als Teil einer Reihe von Dosen zur Behandlung oder zur Vorbeugung wirksam ist. Diese Menge hängt ab vom Gesundheitszustand und vom körperlichen Zustand des zu behandelnden Individuums, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums (zum Beispiel nichtmenschliche Primaten, Primaten, etc.), der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums zur Synthese von Antikörpern, dem Grad des angestrebten Schutzes, der Formulierung des Impfstoffs, der Beurteilung der medizinischen Situation durch den behandelnden Arzt und anderen relevanten Faktoren. Es ist davon auszugehen, dass diese Menge in einem relativ breiten Bereich liegt, der durch Routineversuche ermittelt werden kann.
  • Die immunogenen Zusammensetzungen werden auf einem nicht über die Schleimhaut führenden Weg verabreicht, insbesondere parenteral, zum Beispiel durch Injektion, und zwar entweder subkutan oder intramuskulär. Die transdermale oder transkutane Verabreichung kann ebenfalls angewandt werden. Die Dosierung bei der Behandlung kann nach einem Einzeldosenschema oder nach einem Schema mit mehrfacher Verabreichung erfolgen. Das Vakzin kann in Verbindung mit anderen immunregulatorischen Mitteln verabreicht werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ferner die Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung wie oben beschrieben oder der immunogenen Zusammensetzung wie oben beschrieben zum Schutz gegen eine Infektion oder zur Behandlung einer Infektion durch H. pylori angegeben.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die endoskopische Untersuchung des Antralbereichs von geschützten Hunden (1A) und von zur Kontrolle dienenden (infizierten) Hunden (1B) 42 Tage nach der H. pylori.-Exposition.
  • 2 zeigt die histologische Untersuchung (Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung) von Biopsien, die dem Antralbereich von geschützten Hunden (2A, Vergrößerung 10×) und zur Kontrolle dienenden (infizierten) Hunden (2B, Vergrößerung 10×; 2C, Vergrößerung 40×; 2D, Vergrößerung 100×) 42 Tage nach der H. pylori-Exposition entnommen worden waren.
  • 3 zeigt die immunhistochemische Untersuchung von Biopsien, die aus dem Antralbereich von geschützten Hunden (3A) und zur Kontrolle dienenden (infizierten) Hunden (3B) 42 Tage nach der H. pylori-Exposition entnommen worden waren (Vergrößerung 40×).
  • 4 zeigt den Zeitplan des Versuchs zur Ermittlung, ob Beagle-Hunde gegen eine Infektion mit H. pylori durch Verwendung von gereinigten Antigenen, die i.m. verabreicht werden, geschützt werden können.
  • 5 zeigt die Serum-Antikörpertiter gegen rekombinantes VacA (5A), CagA (5B) und NAP (5C) (Mittelwerte) vor der ersten Immunisierung sowie nach der zweiten, dritten und vierten Immunisierung i.m. mit gereinigten Antigenen oder mit einem Gesamtzelllysat. Der waagerechte Pfeil zeigt die Untergrenze für positive ELISA-Resultate an.
  • 6 zeigt die Serumtiter der IgG-Antikörper-Unterklassen IgG1 und IgG2 gegen CagA (6A) und NAP (6B) (mittlere Titer pro Gruppe nach i.m.-Immunisierung mit gereinigten Antigenen oder mit Gesamtzelllysat) zu den gleichen Zeitpunkten wie oben (5).
  • 7 zeigt die Serum-IgA-Antikörpertiter gegen p95 (rekombinantes VacA) bei Beagle-Hunden, die i.m. mit gereinigten Antigenen (VacA, CagA und NAP) oder mit Gesamtzelllysat (einzelne Hunde – 7A bis 7F) immunisiert worden waren, vor der Immunisierung und nach der dritten Immunisierung (ähnliche Serum-IgA-Antikörpertiter wurden gegen CagA festgestellt).
  • 8 zeigt die endoskopischen Bilder von geschützten (8A) und nichtgeschützten (infizierten) Hunden (8B), die etwa 8 Wochen nach der Exposition aufgenommen wurden.
  • 9 zeigt die Histologie (HE-Färbung, Vergrößerung 10×) der Magenschleimhaut von geschützten (9A) und nichtgeschützten (infizierten) Hunden (9B), wobei die Proben etwa 8 Wochen nach der Exposition entnommen wurden. In 9A ist eine normale Mucosa und Submucosa festzustellen. Im Gegensatz dazu ist anhand von 9 ein großes lymphoides Follikel festzustellen, das die Struktur der Mucosa und der Submucosa aufbricht.
  • 10 zeigt die Immunhistochemie unter Verwendung eines monoklonalen Anti-VacA-Antikörpers, wobei die Probe etwa 8 Wochen nach der Exposition entnommen wurde (Vergrößerung 10×). Bei dem geschützten Hund (10A) ist negative Färbung festzustellen, während bei dem nichtgeschützten (infizierten) Hund (10B) auf die stark positive Färbung hinzuweisen ist.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Gesamtzellvakzin aus H. pylori
  • Im Rahmen einer Ausführungsform der Erfindung wurde die Realisierbarkeit einer Immunisierung von normalen Hunden mit einem Gesamtzellvakzin aus H. pylori (das heißt einem H. pylori-Zelllysat) untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass eine derartige Präparation eine Immunität hervorrufen kann, die zu einer Schutzwirkung gegen eine spätere Exposition mit infektiösem H. pylori führt.
  • Immunogenität.
  • Die Schutzwirkung eines H. pylori-Gesamtzellvakzins wurde bei Hunden untersucht, die infektiösem H. pylori ausgesetzt worden waren. Die Details der angewandten experimentellen Verfahren werden später erläutert. Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, induzierte die intramuskuläre Immunisierung im Vergleich mit dem Zeitpunkt 0 und mit den zu Kontrollzwecken dienenden Hunden sehr hohe Serumtiter an IgG-Antikörpern. Die i.m.-Immunisierung mit H. pylori-Lysat induzierte ferner die Erzeugung von antigenspezifischen Serum-IgA-Antikörpern.
  • Symptome.
  • Die zur Kontrolle dienenden Hunde Nr. 2 und Nr. 3 hatten während der ersten Woche nach der letzten Exposition Durchfall. Der zur Kontrolle dienende Hund Nr. 2 litt ferner unter Erbrechen. In der i.m.-immunisierten Gruppe gab es keine Symptome einer H. pylori-Infektion.
  • Ureasetest an Magenbiopsiematerial (antral) und an durch Magenspülung gewonnenem Material.
  • Dieser Test, der an antralem Biopsiematerial und Magenspülmaterial vorgenommen wurde, das 10 Tage nach der letzten Exposition gewonnen worden war, war bei der Kontrollgruppe positiv und bei der i.m.-immunisierten Gruppe negativ, wie aus der nachstehenden Tabelle 2 hervorgeht, und zwar sogar 24 h später. Diese Daten wurden auch am Tag 42 nach der Exposition bestätigt.
  • Figure 00210001
  • Tabelle 2
    Figure 00220001
  • Ergebnisse von Endoskopie, Histologie und Immunohistochemie.
  • Geschützte Hunde zeigten bei endoskopischer Untersuchung am 42. Tag nach der Exposition eine normale Mucosa (1A) mit einer hellen und glatten Oberfläche und ohne Zeichen einer Hyperämie oder eines Ödems. Im Gegensatz dazu war bei den zur Kontrolle dienenden (infizierten) Hunden die Magenschleimhaut stark gerötet und ödematös und hatte eine gekräuselte Oberfläche mit dem Aussehen von Lamellen (1B), was auf das Vorliegen der nodularen (follikularen) Gastritis hindeutet, die früher beobachtet und in den Patentanmeldungen GB 9801000.2 und PCT/IB99/00217 beschrieben worden war.
  • Histologisch besaß die Magenschleimhaut der geschützten Hunde nach wie vor eine intakte Struktur, und zwar an der Oberfläche und an der Submucosa (2A), während bei den infizierten Hunden Hyperämie (2B, Pfeile), ein Ödem (2B, Sternchen) und entzündliche Zellinfiltrate (2B, dreieckige Pfeile, und 2C) auftraten. H. pylori war ferner in der Mucosa-Schicht leicht zu identifizieren (2D).
  • Alle diese Daten wurden durch Immunhistochemie unter Verwendung eines monoklonalen Anti-VacA-Antikörpers bestätigt, der Epithelzellen der infizierten Hunde stark färbte (3B, Pfeile), nicht jedoch die Epithelzellen der geschützten Hunde (3A).
  • Schlussfolgerungen.
  • Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die intramuskuläre Immunisierung mit H. pylori-Lysat Hunde gegen eine Infektion durch infektiösen H. pylori schützen kann und dass der intramuskuläre Weg für eine Impfung gegen dieses Bakterium in Betracht gezogen werden kann.
  • Vakzin mit gereinigtem H. pylori-Antigen
  • Im Rahmen einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wurde ferner die Realisierbarkeit einer Immunisierung von normalen Hunden mit gereinigten H. pylori-Antigenen untersucht. Es zeigte sich, dass eine solche Präparation eine Immunität hervorrufen kann, die eine Schutzwirkung gegen eine spätere Exposition mit infektiösem H. pylori ergibt.
  • Immunogenität.
  • Die Schutzwirkung von gereinigten H. pylori-Antigenen (speziell VacA, CagA und NAP) wurde bei Hunden untersucht, die einem infektiösen H. pylori ausgesetzt worden waren. Die Details der angewandten experimentellen Verfahren werden weiter unten erläutert. Die Immunisierung mit diesen Antigenen induzierte eine sehr starke Serum-IgG-Antikörper-Antwort, die für jedes Antigen nach lediglich zwei Dosen spezifisch war. Die Titer erhöhten sich nach der dritten Dosis. Dosen von 50 und 10 μg Antigenen waren ebenso gut wie eine Dosis von 250 μg, um hohe Titer von antigenspezifischen Antikörpern zu induzieren. Im Vergleich dazu waren bei den mit Kpylori-Lysat immunisierten Hunden niedrigere Antikörpertiter festzustellen (vgl. 5).
  • Die Immunisierung mit diesen Antigenen induzierte ferner hohe Titer der antigenspezifischen Serum-IgG1-Antikörper und -IgG2-Antikörper, was nahelegt, dass diese Immunisierung sowohl die Immunantwort vom Typ Th1 als auch vom Typ Th2 induziert, im Unterschied zu dem, was bereits bei infizierten Mäusen und Hunden festgestellt worden war, bei denen eine überwiegende Immunantwort vom Typ Th1 evident ist (vgl. 6).
  • In dieser Weise immunisierte Hunde hatten ferner nachweisbare Titer der antigenspezifischen IgA-Antikörper im Serum (vgl. 7).
  • Ergebnisse der Endoskopie, Histologie und Immunhistochemie.
  • Bei den geschützten Tieren (vgl. Tabelle 3, in der zusammenfassende Ergebnisse zum Schutz aufgeführt sind, die auf einer Zusammenfassung aller Parameter beruhen, einschließlich der Endoskopie (Gastroskopie), der Histologie und Immunhistochemie) war die Magenschleimhaut aufgrund der endoskopischen Untersuchung, der Histologie und der Immunhistochemie normal (vgl. die 8A, 9A bzw. 10A). Die nicht geschützten (infizierten) Tiere zeigten bei der Endoskopie ein hyperämisches, stark entzündliches Aussehen der Magenschleimhaut (8B) mit einer diffusen Infiltration mit einkernigen, in lymphoiden Follikelstrukturen aggregierten Zellen (9B), welche die normale Drüsenstruktur aufbrachen. 10B zeigt eine stark positive Reaktion in der Immunhistochemie unter Verwendung eines monoklonalen Anti-VacA-Antikörpers.
  • Schlussfolgerungen.
  • Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die intramuskuläre Immunisierung mit H. pylori-Antigenen Hunde gegen eine Infektion durch infektiösen H. pylori schützen kann.
  • Tabelle 3 Intramuskuläre Immunisierung mit gereinigten Antigenen schützt Hunde vor Infektion durch Helicobacter pylori
    Figure 00250001
  • Experimenteller Teil
  • H. pylori-Stämme.
  • SPM326s, ein Streptomycin-resistenter Abkömmling des mausadaptierten H. pylori-Typ 1 (CagA+/VacA+)-Stamms SPM326 (Marchetti et al., 1995), wurde wie früher beschrieben kultiviert (Marchetti et al., 1995) und zur Infizierung der Hunde verwendet. Der CCUG-Stamm von H. pylori ist im Stand der Technik gut bekannt.
  • Tiere.
  • Sechs 4–6 Monate alte xenobiotische Beagle-Hunde, sämtliche weiblich (Morini s.a.s., S. Polo D'Enza, Italien) wurden auf der Basis des Fehlens von nachweisbarem Serum-IgG gegen Helicobacter spp. in der Western-Blot(WB)-Analyse unter Verwendung von Bakterien-Gesamtlysat als Antigen ausgewählt (vgl. unten). Die sechs ausgewählten Hunde wurden unter Standardbedingungen gehalten und erhielten eine Diät aus Trockenfutter (MIL, Morini s.a.s.) und Leitungswater ad libitum. Nach der Ankunft in der Tierunterkunft der Anmelderin bestätigte eine zusätzliche WB-Analyse der Seren ihren H. pylori-Status. Die Hunde wurden in individuellen Käfigen gehalten und konnten sich einen Monat an die neue Umgebung anpassen. Während des Anpassungsmonats wurden zwei Tests an Fäkalproben durchgeführt, um das Vorliegen von Darmparasiten oder üblichen pathogenen Darmbakterien zu ermitteln.
  • Herstellung des H. pylori-Lysats.
  • Zwei Pellets des H. pylori-CCUG-Stamms aus zwei 5-Liter-Fermentern (Olivieri, R. et al., 1993, J. Clin. Microbiol. 31:160-162) wurden hergestellt. Danach wurde jedes Pellet in 50 ml Puffer (50 mM Na2HPO4·2H2O, 300 mM NaCl, pH 7,8) unter Beschallen resuspendiert; die beiden resuspendierten Pellets wurden gemischt. Die optische Dichte OD530nm der kombinierten Resuspension wurde gemessen, um die Bakterienkonzentration zu ermitteln (= 3,2·1010 CFU/ml). Die Resuspension wurde mit Beschallungspuffer verdünnt, um die Konzentration auf 2·1010 CFU/ml zu bringen. Vor dem Beschallen besaßen die Bakterien die klassische Spiralform bei Betrachtung unter dem Mikroskop. Die Beschallung der resuspendierten Bakterien wurde dann auf Eis durchgeführt: 2 Zyklen von 4 Minuten und 2 Zyklen von 5 Minuten, wobei zwischen jedem Zyklus 1 Minute gewartet wurde. Nach dem Beschallen erschienen alle Bakterien bei Betrachtung unter dem Mikroskop aufgebrochen. Danach wurde die Proteinkonzentration durch Anwendung des Bradford-Verfahrens ermittelt (Proteinkonzentration = 57,5 mg/ml). Dann wurden Aliquote des Zelllysats hergestellt und bis zur Verwendung bei –80 °C eingefroren.
  • Immunisierung.
  • Drei Hunde wurden am Tag 0 intramuskulär (i.m.) mit dem herstellten H. pylori-Lysat (Äquivalent von 1010 CFU H. pylori (= 28 mg/Dosis)) immunisiert, das auf 1 mg Aluminiumhydroxid (Chiron Behring GmbH & Co., Marburg, Deutschland; Lot Nr. 277345) in einem Volumen von 1 ml adsorbiert worden war. Die Immunisierungen wurden an den Tagen 7, 14 und 22 wiederholt. An den Tagen 0, 21 (Post-3) und 43 (Post-4) wurden Serumproben entnommen. Die anderen drei Hunde, die als Kontrollgruppe dienten, wurden identisch behandelt, wobei jedoch anstelle des H. pylori-Lysats Kochsalzlösung verwendet wurde.
  • Exposition gegenüber infektiösem H. pylori.
  • Die Hunde wurden an den Tagen 49, 51 und 53 folgendermaßen dem mausadaptierten H. pylori-Stamm SPM326s ausgesetzt: 24 h vor jeder Exposition wurden die Hunde nüchtern gehalten. 2 h vor der Bakterieninokulation erhielten die Hunde 10 mg/kg Cimetidine i.m. (Tagamet® 200; Smith Kline & French, USA). Zum Zeitpunkt der Infizierung wurden die Hunde mit einem Gemisch von 40 μg/kg Medetomidine-Hydrochlorid (Domitor®; Centralvet-Vetem s.p.a., Milano, Italien) und 5 mg/kg Ketamine (Ketavet®, Gellini, Latina, Italien) intravenös (i.v.) anästhesiert; anschließend wurde eine Magenspülung mit 100 ml einer sterilen 0,2 M NaHCO3-Lösung vorgenommen, wonach eine orale Infizierung mit 3 ml einer frisch hergestellten Suspension von 109 CFUs des H. pylori-Stamms SPM326s in steriler Kochsalzlösung vorgenommen wurde, der unter mikroaeroben Bedingungen (vgl. unten) unmittelbar vor der Inokulationsprozedur kultiviert worden war. Am Ende der Bakterieninokulation wurden 200 μg/kg des anästhetischen Antagonisten Atipamezol (Antisedan®; Centralvet-Vetem s.p.a., Milano, Italien) verabreicht, wonach die Hunde wiederum mit Cimetidine behandelt und nach 2 h gefüttert wurden.
  • Folgeprogramm nach der Infektion.
  • 10 und 42 Tage nach der letzten Exposition wurden Magenendoskopien unter Verwendung eines pädiatrischen Bronchoskops der Fa. Pentax von 4,9 mm Durchmesser (Pentax Technologies, Zaventem, Belgien) durchgeführt. Gleichzeitig wurden während der Endoskopien unter Verwendung einer Biopsie-Pinzette mit flexiblen Spitzen am Antrum, am Corpus fundus und an der Cardia Biopsie-Proben für den Urease-Test und für mikrobiologische, histopathologische und immunhistochemische Analysen entnommen. Vor jeder Endoskopie wurden das gesamte Instrument und die flexible Pinzette 45 min in 4-%ige Glutaraldehyd-Lösung eingelegt und dann mit steriler Kochsalzlösung gespült. Zur Vermeidung einer Kreuzkontamination zwischen an unterschiedlichen Stellen entnommenen Biopsie-Proben wurden die Pinzetten mit Leitungswasser gewaschen und vor jeder Entnahme der Biopsie-Probe leicht in der Flamme sterilisiert. Das obige experimentelle Protokoll war vom Scientific and Ethical Commitee der Universität Pisa genehmigt und hatte vom italienischen Gesundheitsministerium (Department of Veterinary Health, Food and Nutrition) die offizielle Autorisierung erhalten (Ministerialdekret Nr. 21/97-C).
  • Urease-Schnelltest.
  • Die antralen Biopsie-Proben und die Flüssigkeit von der Magenspülung wurden bis zu 24 h in 1 ml einer 10-%igen Harnstofflösung in destilliertem Wasser unter Zusatz von 2 Tropfen einer 1 %igen Phenolrotlösung (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) in Phosphatpuffer, pH 6,5, inkubiert. Ein positiver Test wird durch Farbänderung (von Orange nach Dunkel-Lachsrosa) im Medium angezeigt; die zur Farbänderung erforderliche Zeit wird aufgezeichnet. Zur Zeit 0 wurde die Endoskopie an den sechs Hunden vorgenommen, und die antralen Biopsie-Proben wurden für den Urease-Test verwendet. Bei allen sechs Hunden war der Urease-Test zur Zeit 0 negativ.
  • Histopathologie und Transmissionselektronenmikroskopie.
  • Proben zur histologischen und immunhistochemischen Untersuchung sowie zur Ultrastrukturuntersuchung wurden von den Biopsie-Proben an Stellen entnommen, die den Stellen benachbart waren, die für die mikrobiologische Analyse verwendet worden waren. Die Proben wurden in 10-%igem gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Zur histopathologischen Untersuchung wurden 3 μm-Schnitte mit Hämatoxylin-Eosin (H + E), Alcian und durch Periodsäure-Färbung nach Schiff (PAS-Färbung) unter Anwendung von Standardprozeduren gefärbt. Gleiche Schnitte wurden auch für immunhistochemische Analysen unter Anwendung des Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Peroxidase-Verfahrens mit einem für H. pylori spezifischen monoklonalen Antikörper (Mab) (Biogenesis Ltd., Poole, England) oder einem monoklonalen Mäuse-Anti-VacA-Antikörper (C1G9) durchgeführt, der durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit gereinigtem nativem H. pylori-VacA erhalten worden war (Burroni und Telford, unveröffentlichte Mitteilungen). Als zweiter Antikörper wurde biotinylierter Pferde-Anti-Maus-Antikörper verwendet. Die Reaktion wurde mit 3,1-Diaminobenzidin-Hydrochlorid (DAB) (Sigma) zur Identifizierung und Lokalisierung des Bakterienantigens entwickelt. Zur elektronenmikroskopischen Untersuchung wurden andere Proben nach Karnowsky fixiert, in OsO4 nachfixiert und in Epon-Araldite (Polysciences Inc., Warrington, PA; USA) eingebettet. Halbdünne Schnitte wurden zur Ermittlung einer Zellschädigung mit Toluidinblau gefärbt, während Ultradünnschnitte mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und dann mit einem Philips-EM 301-Transmissionselektronenmikroskop (TEM) bei einer Betriebsspannung von 80 kV untersucht wurden.
  • Nachweis von Anti-H. pylori-Antikörpern.
  • SDS-PAGE-Analysen von H. pylori (Stamm SPM326s) und WB-Analysen von Seren wurden nach den früher veröffentlichten Verfahren durchgeführt (Marchetti et al., 1995). Kurz zusammengefasst wurden Hundeseren 1:200 verdünnt und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde Meerrettich-Peroxidase(HRP)-konjugierter Kaninchen-Anti-Hund-IgG-Antikörper (Nordic Immunological Laboratories, Tilburg, Niederlande) in einer Verdünnung von 1:2000 2 h zugegeben, und die Reaktion wurde unter Verwendung von 4-α-Chlornaphthol als Substrat entwickelt. Die Bestimmung des Antikörpers gegen H. pylori durch ELISA wurde an beschichteten Platten mit 96 Vertiefungen über Nacht bei 4 °C mit dem hergestellten CCUG-Stamm-Lysat, das für die Immunisierung verwendet worden war (5 μg/Vertiefung), oder mit gereinigtem nativem CagA oder NAP (0,2 μg/Vertiefung) durchgeführt. Die beschichteten Vertiefungen wurden mit PBS, die 5 % entrahmte Milch enthielt, blockiert. Zweifache Serienverdünnungen der Seren wurden 2 h bei 37 °C inkubiert und dann mit PBS gewaschen. Die antigenspezifischen IgG-Titer wurden unter Verwendung eines 1:4000-verdünnten HRP-konjugierten Ziegen-Anti-Hund-IgG-Antikörpers (Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX, USA) 2 h bei 37 °C durchgeführt. Die Antikörper, an die Antigen gebunden war, wurden durch Zusatz von o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid (Sigma) als Substrat erfasst. Die Antikörper-Titer wurden bestimmt, wie früher beschrieben worden war (Ghiara et al, 1997).
  • Intramuskuläre (i.m.) Immunisierung von Hunden mit gereinigten Antigenen von H. pylori.
  • VacA und CagA wurden exprimiert und gereinigt, wie in Ghiara et al., 1997, beschrieben. NAP wurde exprimiert und gereinigt, wie in den früheren Patentanmeldungen GB 9807721.7 und PCT/IB99/00695 beschrieben ist. Wie aus Tabelle 4 hervorgeht, wurden Gruppen von vier Hunden i.m. immunisiert mit:
    • (i) einem Gemisch von rekombinantem VacA, CagA und NAP (250, 50 oder 10 μg von jedem Antigen), die auf Aluminiumhydroxid adsorbiert waren (Dosis 1 mg);
    • (ii) CCUG-Lysat (hergestellt wie oben erläutert) mit 25 oder 5 mg pro Dosis, adsorbiert an Aluminiumhydroxid (Dosis 1 mg);
    • (iii) Aluminiumhydroxid allein (Dosis 1 mg).
  • Die Hunde wurden 4-mal in Intervallen von einer Woche immunisiert. Die Exposition gegen H. pylori wurde 4 Wochen später durchgeführt, wie bereits beschrieben wurde. Proben (Blutproben, Biopsie-Proben, etc. – wie vorstehend beschrieben) wurden vor der Immunisierung, nach der zweiten, dritten und vierten Immunisierung sowie dann 2 bis 3 Wochen und 8 Wochen nach der letzten Exposition entnommen.
  • Figure 00320001

Claims (9)

  1. Verwendung einer wirksamen Menge gereinigter Antigene von H. pylori zur Herstellung eines Arzneimittels zur intramuskulären Verabreichung an Menschen zum Schutz gegen eine Infektion oder zur Behandlung einer Infektion durch H. pylori.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel ein Antigen oder mehrere Antigene von H. pylori und ein oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Excipientien enthält.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das eine Antigen oder die mehreren Antigene separat oder in Kombination eine schützende Immunantwort beim Menschen hervorrufen.
  4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens eines der Antigene ein Virulenzfaktor von H. pylori ist.
  5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Virulenzfaktor VacA, CagA, NAP oder Urease ist.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Arzneimittel mindestens CagA und NAP enthält.
  7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Arzneimittel mindestens VacA, CagA und NAP enthält.
  8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Arzneimittel ferner ein Adjuvans enthält.
  9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Adjuvans Aluminiumhydroxid ist.
DE69922364T 1998-04-30 1999-04-30 Verfahren zur Immunisierung gegen und zur Behandlung von Infektionen durch H.pylori Expired - Lifetime DE69922364T2 (de)

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