DE60033414T2

DE60033414T2 - Allergievakzine sowie ihre Herstellung

Info

Publication number: DE60033414T2
Application number: DE60033414T
Authority: DE
Inventors: Dr. Margarete Focke; Dr. Vera Mahler; Dr. Wolfgang R. Sperr; Dr. Peter Valent; Dr. Dietrich Kraft; Dr. Rudolf Valenta
Original assignee: Biomay AG
Current assignee: BIOMAY AG, WIEN, AT
Priority date: 2000-12-28
Filing date: 2000-12-28
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2020-12-29
Also published as: DE60033414T3; HK1045810A1; EP1219299B1; US20030078201A1; ATE353669T1; EP1219299A1; EP1219299B2; HK1045810B; US7244431B2; DK1219299T3; DE60033414D1; DK1219299T4; US20090017051A1

Description

Fast 500 Millionen leiden unter einer Allergie vom Typ 1, einer genetisch festgelegten Überempfindlichkeitsstörung, die auf der Bildung von IgE-Antikörpern gegen an sich harmlose Antigene (d.h. Allergene) basiert. Bei sensibilisierten Patienten kann ein Allergenkontakt eine Vielzahl von Symptomen induzieren, die von allergischer Rhinokonjunktivitis, atopischer Dermatitis, Diarrhö, Asthma bronchiale bis manchmal lebensbedrohender Anaphylaxie reichen. Die sofortigen Symptome des allergischen Leidens werden verursacht durch Vernetzung von effektorzellgebundenen IgE-Antikörpern durch Allergene, die die Freisetzung von biologisch aktiven Mediatoren (z.B. Histamin, Leukotriene) anschalten. Zusätzlich kann die Allergenpräsentation für T-Zellen auch durch IgE-Antikörper vermittelt werden und chronische Symptome von allergischen Leiden induzieren (z.B. atopische Dermatitis, chronisches Asthma) über eine T-Zellaktivierung und Freisetzung von proentzündlichen Cytokinen.
Der einzige heilende Ansatz in Bezug auf eine Allergiebehandlung, eine allergenspezifische Immuntherapie, basiert auf der kontinuierlichen Verabreichung der die Krankheit hervorrufenden Allergene an die Patienten, um ein allergenspezifisches Nichtansprechen zu induzieren. Viele Studien dokumentieren die klinische Wirksamkeit der spezifischen Immuntherapie, aber zwei Hauptnachteile müssen überwunden werden: Erstens kann die systemische Verabreichung von Allergenen lebensbedrohliche anaphylaktische Nebenwirkungen induzieren. Zweitens wird die Immuntherapie mit Allergenextrakten durchgeführt, die aus schwer zu standardisierenden Mischungen von allergenen und nicht allergenen Komponenten bestehen, die nicht für das Sensibilisierungsprofil des einzelnen Patienten zugeschnitten werden können.
WO 96/27005 A2 offenbart rekombinante DNA-Moleküle, die Polypeptide codieren mit antigenen Eigenschaften der Allergene Clah8 und Clah12.
EP-A-0714662 A2 beschreibt Peptide, die ein monovalentes B-Zell-Epitop auf einem Allergenmolekül enthalten, mit dem ein IgE-Antikörper spezifisch kombiniert und die die Wirkung haben, die Bildung einer vernetzten Struktur durch Kombination des Allergens mit dem IgE-Antikörper zu hemmen.
WO 97/05258 A2 offenbart ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine Polypeptid-Antigeneigenschaft der Cofaktor-unabhängigen Phosphoglyceratmutase von Birke, Beifuß oder Wiesen-Lieschgraspollen codiert.
Ganglberger et al. (2000), FASEB J. 14, 2177–2184, beschreiben Allergenmimotope für eine dreidimensionale Epitopsuche und die Induktion von Antikörpern, die Human-IgE hemmen. Die beschriebenen Peptide stammen aus einer Phagenbibliothek und zeigen keine Ähnlichkeit mit der primären Sequenz von Bet v 1.
WO 97/24139 A1 offenbart verschiedene Erdnussallergene einschließlich Ara h I und Ara h II.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, eine vorteilhafte pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von allergischen Leiden bereitzustellen.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Verabreichung von Peptiden, die einem Lösungsmittel ausgesetzte Aminosäuren eines Allergens enthalten, zur Herstellung von protektiven Antikörpern führen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das als erste Stufe die Bestimmung, welche Aminosäuren eines gegebenen allergenen Proteins auf der Oberfläche des allergenen Proteins einem Lösungsmittel ausgesetzt sind, umfasst. Als zweite Stufe umfasst das Verfahren die Herstellung eines Peptids mit einer Länge von 8 bis 50 Aminosäuren, wobei mindestens drei aufeinander folgende Aminosäuren des Peptids identisch sind mit mindestens drei Aminosäuren, die auf der Moleküloberfläche des allergenen Proteins in einem Oberflächenstück von 500 Å² erscheinen, wobei die mindestens drei Aminosäuren dem Lösungsmittel ausgesetzte Aminosäuren des allergenen Proteins sind. Das Peptid wird dann mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger (z.B. KLH) oder einem Verdünnungsmittel vermischt, z.B. mit einem Puffer und/oder Salzlösungen.
Bevorzugter betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das als erste Stufe die Bestimmung umfasst, welche Aminosäuren eines gegebenen Allergens auf der Oberfläche des allergenen Proteins einem Lösungsmittel ausgesetzt sind. Als zweite Stufe umfasst das Verfahren die Herstellung eines Peptids mit einer Länge von 8 bis 50 Aminosäuren, wobei mindestens fünf aufeinander folgende Aminosäuren des Peptids identisch sind mit mindestens fünf aufeinander folgenden Aminosäuren der Aminosäuresequenz des allergenen Proteins, wobei die mindestens fünf aufeinander folgenden Aminosäuren dem Lösungsmittel ausgesetzte Aminosäuren des allergenen Proteins sind. Das Peptid kann dann mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel vermischt werden, z.B. einem Puffer und/oder einer Salzlösung.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren als weitere Stufe die Zugabe eines Adjuvans. Adjuvantien, die im Stand der Technik bekannt sind und erfindungsgemäß verwendet werden können, sind z.B. Al(OH)₃.
Das Peptid kann mit synthetischen Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind, z.B. einer Festphasensynthese, hergestellt werden. Das Peptid kann auch durch Expression einer rekombinanten DNA hergestellt werden. Eine cDNA-Sequenz, die das Peptid codiert, kann in einen Wirt, wie E.-coli-Zellen, eingeführt werden und exprimiert werden. Nach der Expression werden die Peptide mit bekannten Reinigungsmethoden gewonnen. Das Verfahren der rekombinanten Erzeugung von Peptiden kann bevorzugt sein, wenn längere Peptide für die Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden. Das Verfahren der synthetischen Herstellung von Peptiden ist bevorzugt, wenn kürzere Peptide angewendet werden.
In der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird bestimmt, welche Aminosäuren eines gegebenen allergenen Proteins auf der Oberfläche des allergenen Proteins einem Lösungsmittel ausgesetzt sind. Jedes bekannte allergene Protein kann für die Entwicklung der Peptide verwendet werden. Eine Allergenquelle kann ausgewählt werden, gegen die ein hoher Prozentanteil allergischer Patienten sensibilisiert ist. Bevorzugte allergene Proteine stammen aus Pflanzen. Eine bevorzugte Allergenquelle sind Birkenpollen, da sie in Europa, Nordamerika und Australien weit verbreitet sind. Fast 25% der allergischen Patienten leiden unter einer Allergie des Hauptbirkenpollenallergens Bet v 1. Bet v 1 enthält die meisten IgE-Epitope, die in Pollen von Bäumen vorhanden sind, die zur Ordnung der Fagales gehören (Birke, Erle, Haselnuss, Eiche, Hainbuche) und in von Pflanzen stammenden Früchten. Die cDNA und Aminosäuresequenz ebenso wie die dreidimensionale Struktur von Bet v 1 wurden bestimmt und rekombinantes Bet v 1, das dem natürlichen Bet-v-1-Wildtyp gleicht, wurde mit rekombinanter DNA-Technik erzeugt. Weitere allergene Proteine, die in Betracht gezogen werden können, sind der Hauptgraspollen (z.B. Gruppe 1, Gruppe 2, Gruppe 5 etc.), Milben (z.B. Der p 2), Bienengift (z.B. Phospholipase) und Tierhaarschuppenallergene (z.B. Cat: Fel d 1).
In einer Ausführungsform werden die dem Lösungsmittel ausgesetzten Aminosäuren durch Untersuchung der dreidimensionalen Struktur des allergenen Proteins bestimmt. Aminosäuren, die auf der Oberfläche des Proteins sind und nicht in dem Protein verborgen sind, werden als dem Lösungsmittel ausgesetzt angesehen. Im Zu sammenhang mit der vorliegenden Anmeldung ist eine Aminosäure dem Lösungsmittel ausgesetzt, wenn sie eine relative Lösungsmittelzugänglichkeit von mindestens 16%, bevorzugt mindestens 25% hat. Lösungsmittelzugänglichkeit kann bestimmt werden nach der Resthydrophobizität, wie von Rost und Sander (1994), in Proteins 20, 216–226, beschrieben. Die dreidimensionale Struktur des Proteins kann mit Röntgenkristallographie oder NMR bestimmt werden.
Wenn die Aminosäuresequenz des Proteins bekannt ist, ist es auch möglich, eine Hydrophilitäts-Analyse durchzuführen, um zu bestimmen, welche Aminosäuren innerhalb der Sequenz einen hohen Hydrophilitäts-Index haben und somit eine hohe Wahrscheinlichkeit, an der Oberfläche exponiert zu sein. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, eine "Oberflächenwahrscheinlichkeitsanalyse" durchzuführen, um herauszufinden, für welche Aminosäuren die höchste Wahrscheinlichkeit besteht, dass sie dem Lösungsmittel ausgesetzt sind.
Wenn weder die Sequenz noch die dreidimensionale Struktur des allergenen Proteins bekannt ist, ist es gewöhnlich notwendig, das Gen, das das allergene Protein codiert, zu klonieren. Dies kann mit im Stand der Technik bekannten Methoden erfolgen.
In einigen Fällen wurden IgE-Epitope für ein Allergen bestimmt. Solche Epitope können auch zur Entwicklung von Peptiden verwendet werden, da diese Epitope auf der Oberfläche des allergenen Proteins sind.
Sobald bekannt ist, welche Aminosäuren innerhalb der Aminosäuresequenz des allergenen Proteins dem Lösungsmittel ausgesetzt sind, wird ein Peptid hergestellt, das mindestens fünf aufeinander folgende Aminosäuren aufweist, die identisch sind mit mindestens fünf aufeinander folgenden dem Lösungsmittel ausgesetzten Aminosäuren des allergenen Proteins. Das Peptid hat eine Länge von 8 bis 50 Aminosäuren. Bevorzugt ist die minimale Länge des Peptids 12, bevorzugter 15, noch bevorzugter 18, am meisten bevorzugt 21 Aminosäuren. Die maximale Länge eines Peptids ist bevorzugt 45, bevorzugter 40, am meisten bevorzugt 35 Aminosäuren. Die am meisten bevorzugte Länge des Peptids liegt in einem Bereich zwischen 21 und 35 Aminosäuren.
Es ist auch bevorzugt, dass mindestens acht aufeinander folgende Aminosäuren des Peptids identisch sind mit mindestens acht aufeinander folgenden dem Lösungsmittel ausgesetzten Aminosäuren des allergenen Proteins. Am meisten bevorzugt sind mindestens zehn aufeinander folgende Aminosäuren des Peptids identisch mit mindestens zehn aufeinander folgenden dem Lösungsmittel ausgesetzten Aminosäuren des allergenen Proteins.
Die zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung verwendeten Peptide können auch Aminosäuren enthalten, die nicht von dem allergenen Protein stammen. N-terminal oder C-terminal zu den mindestens fünf aufeinander folgenden dem Lösungsmittel ausgesetzten Aminosäuren können Aminosäuren, die aus einer anderen Quelle stammen oder künstlich entworfene Aminosäuren zugefügt werden. Es ist jedoch bevorzugt, dass fast die gesamte Sequenz des Peptids aus dem allergenen Protein stammt. In einer speziellen Ausführungsform stammt nur eine Aminosäure aus der Peptidsequenz nicht aus der Aminosäuresequenz des allergenen Proteins. Bevorzugt ist dies die N-terminale oder C-terminale Aminosäure des Peptids. Am meisten bevorzugt ist diese Aminosäure ein Cysteinrest, der das Kuppeln des Peptids an verschiedene Trägermoleküle zulässt, wie Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH).
In einer weiteren Ausführungsform enthält das Peptid mindestens die N-terminalen oder C-terminalen fünf Aminosäuren des allergenen Proteins. Die N- und C-Enden sind häufig dem Lösungsmittel ausgesetzt.
In einer weiteren Ausführungsform stammt die vollständige Peptidsequenz aus der Aminosäuresequenz des allergenen Proteins.
Bevorzugt führen die erfindungsgemäß hergestellten Peptide bei Verabreichung zur Erzeugung von IgG-Antikörpern, die mit dem Protein reagieren, aus dem die Peptide abgeleitet sind. Bevorzugter sind diese IgG-Antikörper "blockierende Antikörper" oder "schützende Antikörper", die verhindern, dass IgE-Antikörper an das jeweilige allergene Protein, aus dem die Peptide abgeleitet sind, binden. Eine signifikante Reduktion allergener Symptome kann auf diese Weise erreicht werden.
Ein weiteres bevorzugtes Merkmal der Peptide ist es, dass sie keine IgE-Antwort gegen sich selbst bei Verabreichung hervorrufen, d.h. dass sie hypoallergen oder nicht allergen sind.
Die Menge des verabreichten Peptids kann 0,1 μg bis 500 μg sein. Die Menge kann variieren abhängig von der Art der Behandlung. Während der Immuntherapiebehandlung können etwa 50 μg in einem Volumen von 100 μl pro Injektion verabreicht werden. In einer speziellen Ausführungsform ist mehr als ein Peptid in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten. Es ist bevorzugt, dass zwei, drei, vier, fünf oder sechs verschiedene Peptide enthalten sind. Diese verschiedenen Peptide können aus demselben Allergen stammen, es ist jedoch auch möglich, dass sie aus verschiedenen Proteinen stammen. So kann durch Verabreichung einer einzigen pharmazeutischen Zusammensetzung eine antiallergene Wirkung im Hinblick auf verschiedene Allergene erreicht werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, wie in den Ansprüchen definiert, die mit dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Die pharmazeutische Zusammensetzung enthält ein Peptid, wie in den Ansprüchen definiert. Die bevorzugten Eigenschaften und Kennzeichen des Peptids, das in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten ist, wurden für das Verfahren zu seiner Herstellung beschrieben.
Die pharmazeutische Zusammensetzung ist bevorzugt eine Impfstoffzusammensetzung. Sie kann an allergische Patienten auf verschiedenen Wegen verabreicht werden. Bevorzugt wird die pharmazeutische Zusammensetzung durch subcutane Injektion verabreicht. Andere Verabreichungsarten sind eine intramuskuläre oder intravenöse Injektion. Weitere bevorzugte Arten sind sublinguale, orale oder nasale Verabreichung.
Die systemische Verabreichung von Allergenen an allergische Patienten im Verlauf einer spezifischen Immuntherapie, wie sie im Stand der Technik durchgeführt wird, birgt das Risiko, dass lebensbedrohende anaphylaktische Reaktionen ausgelöst werden. Weiterhin enthalten Allergenextrakte, die derzeit zur Behandlung verwendet werden, eine Vielzahl von allergenen und nicht allergenen Komponenten, die nicht auf das individuelle Sensibilisierungsprofil des Patienten zugeschnitten werden können. Die Verbesserung der Sicherheit und Spezifität der Allergieimpfstoffe war daher ein lang gesuchtes Ziel. Die Impfstrategie der vorliegenden Erfindung lässt es zu, sichere, hypoallergene Allergieimpfstoffe zu erzeugen, wann immer die Sequenz, dreidimensionale Struktur und/oder IgE-Epitope eines allergenen Moleküls verfügbar sind.
Die IgE-Antikörper von gegen Birkenpollen allergischen Patienten erkennen hauptsächlich Bet-v-1-IgE-Konformationsepitope. Überraschenderweise wurde von den Erfindern gefunden, dass hypoallergene Peptide auch für Allergene synthetisiert werden können, die kontinuierliche (d.h. sequenzielle, lineare) IgE-Epitope ent halten. Die Erfinder waren erfolgreich in der Produktion einer Reihe von hypoallergenen Peptiden für das Haupt-Wiesenlieschgraspollenallergen, Phl p 1, das kontinuierliche Epitope enthält.
Unerwarteterweise führte die Peptidimmunisierung von Mäusen und Kaninchen mit den Peptiden, die erfindungsgemäß verwendet werden, zur Produktion von IgG-Antikörpern, die für die Allergie gegen den kompletten Bet-v-1-Wildtyp spezifisch sind, obwohl die Peptide viel kürzer waren (25 bis 32 Aminosäuren) und trotz der Tatsache, dass bestimmten Peptiden (P1 bis P3) Bet-v-1-spezifische T-Zellepitope fehlten.
Es wurde auch gefunden, dass durch Peptid induzierte IgG-Antikörper mit mit Bet v 1 verwandten Allergenen von Erlen-, Haselnuss- und Hainbuche-Pollen reagierten, was darauf hindeutet, dass die Peptidimmuntherapie auch gegen eine Allergie gegen Allergenquellen schützen kann, die ein verwandtes Allergen enthalten.
Der Ansatz der Peptidimmuntherapie der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von bisher gemachten Ansätzen der Verwendung von T-Zellepitop-haltigen Peptiden für eine Modulation der allergenspezifischen T-Zellantworten. Während die Verabreichung von freiem, löslichem T-Zellepitop, das Peptide enthält, entweder darauf ausgerichtet ist, Toleranz zu induzieren oder zu Thl-Antworten umzuschalten, verwendeten die Erfinder Adjuvans-gebundene auf der Oberfläche exponierte Peptide, um blockierende IgG-Antikörper zu den dem Lösungsmittel ausgesetzten Allergendomänen zu dirigieren, die Hauptziele für IgE-Antikörper sein können. Da bevorzugt Adjuvans-gebundene Peptide zur Induktion von blockierenden Antikörpern verwendet werden, ist es unwahrscheinlich, dass die Injektion von Peptiden, selbst wenn sie T-Zellepitope enthalten, eine T-Zellvermittelte systemische Reaktion verursachen, wie sie für das Hauptkatzenallergen, Fel d 1, berichtet wurde.
Hypoallergene auf der Oberfläche exponiere Allergenpeptide können in gut kontrollierter Art und Weise erzeugt werden und stellen therapeutische Reagenzien dar, die leicht gereinigt und standardisiert werden können. Solche Peptide können in hohen Dosen mit einem geringen Risiko der Induktion anaphylaktischer Nebenwirkungen verabreicht werden, insbesondere, wenn sie an Adjuvantien gebunden sind. Es wird erwartet, dass die Verabreichung von hohen Peptiddosen eine heftige Erzeugung von IgG-Antikörper induziert, die von einer Thl-Immunantwort begleitet ist. Der Ansatz, an der Oberfläche exponierte Peptide nach der dreidimensionalen Struktur wichtiger kreuzreaktiver Allergene auszuwählen, ist von allgemeiner Anwendbarkeit und lässt die rationale Entwicklung von sicheren auf Peptid basierenden Impfstoffen für viele andere Formen einer Allergie vom Typ I zu.
Beschreibung der Tabellen und Figuren
Tabelle 1 fasst die Eigenschaften von nicht allergenen von Bet v 1 stammenden synthetischen Peptiden zusammen. Position, Sequenz, Länge, Molekulargewicht, isoelektrischer Punkt, Restfaltung, Gegenwart von T-Zellepitopen und AGADIR-Vorhersage von sechs von Bet v 1 stammenden Peptiden sind dargestellt.
Tabelle 2 zeigt die serologische Kennzeichnung von 60 gegen Birkenpollen allergischen Patienten und einem nicht allergischen Kontrollindividuum (NHS). Geschlecht, Alter, Gesamtserum-IgE-Pegel (kU/L), Birkenpollenextrakt-spezifische IgE-Pegel (kUA/L) werden dargestellt. IgE-Antikörper, die für rBet v 1 spezifisch waren und die von Bet v 1 abgeleiteten Peptide wurden mit ELISA und OD (optische Dichte) gemessen, wie gezeigt. Bindestriche zeigen Reaktivitäten unter der Ausschlussgrenze (OD = 0,050).
Tabelle 3 fasst Hautreaktionen vom Soforttyp zusammen, um rBet v 1 und von Bet v 1 abgeleitete Peptide zu vervollständigen. Fünf gegen Birkenpollen allergische Patienten (#1 bis 5) und eine allergische Person ohne Birkenpollenallergie (#6) wurden getestet. Die mittleren Quaddeldurchmesser (mm) sind für verschiedene Konzentrationen von rBet v 1, für Birkenpollenextrakt, Histamin, die einzelnen Peptide und eine Mischung der sechs Peptide gezeigt.
Tabelle 4. IgG-Reaktivität von Antipeptid-Antiseren mit vollständigem rBet-v-1-Wildtyp. Das obere Feld zeigt die mittleren IgG-Reaktivitäten (OD-Werte) gegen rBet v 1 in 4 Serumproben (Blutentnahme 1: Präimmunserum; Blutentnahmen 2 bis 4: Serumproben, die in monatlichen Intervallen erhalten worden waren) von Mäusen, die mit KLH-gekuppelten Peptiden (P1-KLH bis P6-KLH) immunisiert worden waren. Im unteren Feld sind IgG-Reaktivitäten gegen rBet v 1 für 3 Serumproben gezeigt (Blutentnahme 1: Präimmunserum; Blutentnahmen 2 bis 3: Serumproben, die in monatlichen Intervallen gesammelt worden waren), die von 6 Kaninchen erhalten wurden, von denen jedes mit einem der KLH-konjugierten Peptide immunisiert worden war.
Tabelle 5: Kreuzreaktivität von anti-Bet-v-1-Peptid-Antiseren mit natürlichen Allergenen von Birke, Erle, Haselnuss und Hainbuche. IgG-Reaktivitäten von Peptid-Antiseren (anti-P1 bis anti-P6) gegen Pollenextrakte von Birke, Erle, Haselnuss und Hainbuche (mittlere OD-Werte ± SEM) sind für 6 Gruppen von Mäusen dargestellt, die mit Bet-v-1-Peptiden (P1 bis P6) immunisiert wurden.
Tabelle 6. Kaninchen-anti-Bet-v-1-Peptid-Antiseren hemmen die Serum-IgE-Bindung von gegen Birkenpollen allergischen Patienten an rBet v 1. Der Prozentanteil an Hemmung der IgE-Bindung gegen vollständiges rBet v 1, der mit den einzelnen Antipeptid-Antiseren (anti-P1 bis anti-P6) und mit einer Mischung der Antipeptid-Antiseren (anti-P1 bis anti-P6) erhalten wurde, ist für Seren von 60 gegen Birkenpollen allergischen Patienten dargestellt. Die untere Linie fasst die mittleren Prozentanteile der Hemmung, die für alle Serumproben erhalten wurden, zusammen.
1 zeigt 1H-ID-Spektren der Amidregionen der sechs Peptide. Die Spektren wurden bei 20°C an einem 600-MHz-Spektrometer aufgezeichnet.
2 zeigt die Induktion der Histaminfreisetzung aus Basophilen eines gegen Birkenpollen allergischen Patienten. Die Granulozyten eines gegen Birkenpollen allergischen Patienten wurden mit verschiedenen Konzentrationen (X-Achse) von rBet-v-1-Wildtyp, von Bet v 1 abgeleiteten Peptiden (P1, P2, P3, P4, P5, P6) und einer äquimolaren Mischung der 6 Peptide (P1 bis P6) inkubiert. Der Prozentanteil an freigesetztem Histamin in den zellfreien Kulturüberstand ist auf der Y-Achse gezeigt.
3 zeigt die Reaktivität von Peptid-Antiseren mit auf Nitrocellulose geblottetem natürlichen Bet v 1. Auf Nitrocellulose geblotteter Birkenpollenextrakt wurde mit Seren von sechs Peptid-immunisierten Mäusen (Bahnen i; Felder 1 bis 6; Peptide 1 bis 6) inkubiert. Die Bahnen p zeigen die entsprechenden Präimmunseren. Die Position von nBet v 1 (17 kDa) ist angezeigt.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1: Eigenschaften von sechs synthetischen Peptiden, die die Oberfläche des Bet-v-1-Allergen überspannen
Sechs von Bet v 1 abgeleitete Peptide mit einer Länge zwischen 25 (P1: 2809,3 Dalton) bis 32 (P5: 3556,1 Dalton) Aminosäuren, die dem Lösungsmittel ausgesetzte Bereiche des Bet-v-1-Moleküls überspannen, wurden ausgewählt nach der dreidimensionalen Struktur von Bet v 1, die mit Röntgenkristallographie und NMR bestimmt wurde (M. Gajhede et al. (1996 X-ray and NMR structure of Bet v 1, the origin of birch pollen allergy. Nat. Struct. Biol. 3, 1040–1045).
Die für die 6 Peptide berechneten isoelektrischen Punkte liegen in einem Bereich von 4,70 (P6) bis 8,63 (P2) (Tabelle 1). Drei der Peptide (P4, P5, P6) enthalten Sequenzmotive, von denen gefunden wurde, dass sie Bet-v-1-spezifische menschliche T-Zellen stimulieren, wohingegen die anderen drei Peptide (P1, P2, P3) keine Bet-v-1-spezifischen T-Zellepitope enthalten (Tabelle 1).
a) Peptidsynthese
Peptide wurden synthetisiert unter Verwendung der Fmoc-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-Strategie mit HBTU (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat)-Aktivierung (Zyklen in kleinem Maßstab mit 0,1 mmol) auf dem Peptidsyntheseautomaten Modell 433A von Applied Biosystems (Foster City, CA). Vorbeladene PEG-PS-(Polyethylenglycolpolystyrol)-Harze (0,15–0,2 mmol/g Beladung) (Per Septive Biosystems, Warrington, GB) wurden als Festphase verwendet, um die Peptide aufzubauen. Die Chemikalien wurden von Applied Biosystems erworben. Die Kupplung von Aminosäuren wurde bestätigt durch Überwachung der Leitfähigkeit in einem Feedback-Kontrollsystem. Ein Cysteinrest wurde jedem Peptid zugefügt, um die Kupplung der Peptide an die Träger zu erleichtern. Die Peptide wurden 2 h lang von den Harzen abgespalten mit einer Mischung aus 250 μl destilliertem Wasser, 250 ml Triisopropylsilan (Fluka, Buchs, Schweiz), 9,5 ml TFA und in tert.-Butylmethylether (Fluka, Buchs, Schweiz) ausgefällt. Die Identität der Peptide wurde mit Massenspektrometrie überprüft und sie wurden auf mehr als 90% Reinheit gereinigt mit präparativer HPLC (PiChem, Graz, Österreich).
b) Analyse der Sekundärstruktur
Die sechs von Bet v 1 abgeleiteten Peptide ahmen fast alle primären Strukturelemente des Bet-v-1-Allergens nach, aber gemäß AGADIR-Vorhersage und NMR-Analyse fehlt ihnen die Sekundärstruktur. Das AGADIR-Programm basiert auf der Theorie zum Übergang Helix-Coil und schätzt die Neigung einer Sequenz ab, um eine alpha-helikale Konformation unabhängig von anderen Sekundärstrukturen anzunehmen (V. Munoz & L. Serrano (1994) Elucidating the folding problem of helical peptides using empirical parameters. Nat. Struct. Biol. 1, 399–409). Es hat sich gezeigt, dass das helikale Verhalten einer Datenbank von Peptiden im Vergleich zu CD (Circulardichroismus) und NMR-Daten korrekt abgeschätzt werden kann. Da für jede Aminosäure in einer gegebenen Sequenz die helikale Tendenz berechnet wird, kann AGADIR sowohl die durchschnittliche helikale Population eines Peptids als auch die Wahrscheinlichkeit, mit der die helikale Konformation für jeden Rest hergestellt wird, vorhersagen. Die Ergebnisse dieser Berechnungen sind in Tabelle 1 angegeben. Von den Peptiden zeigt nur P5 eine annehmbare Tendenz, eine helikale Konformation zu bilden.
c) NMR-Analyse
NMR wurde dann verwendet, um die restliche sekundäre oder tertiäre Struktur zu untersuchen. Im Vergleich zu anderen spektroskopischen Ansätzen hat diese Technik den Vorteil, dass sie Positionsinformationen entlang der Sequenz liefert.
Die Peptide wurden untersucht auf tertiäre und/oder sekundäre Struktur mit ein- und zweidimensionaler kernmagnetischer Resonanz (NMR) an einem UNITY VARIAN 600 MHz Spektrometer, das mit z-abgeschirmten Gradientenspulen ausgerüstet war, unter Verwendung von 0,1 bis 1,0 mM Proben in 90% H₂O/10% D₂O, 20 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 bei 20°C. Die Wasserunterdrückung wurde mit WATERGATE erreicht. Die verwendeten Mischzeiten waren 70 ms und 150 bzw. 200 ms für TOCSY- bzw. NOESY-Versuche.
Das Aussehen der ID-Versuche zeigt eindeutig die Abwesenheit einer tertiären Struktur bei allen sechs Peptiden: Alle Resonanzen haben eine schlechte spektrale Verteilung, wie es für eine Mischung von Aminosäuren oder Peptiden ohne tertiäre Faltung erwartet wird (1). Die Abwesenheit von durch Ringstrom verschobenen Peaks in dem Bereich der Spektren unterhalb 0,5 ppm, der typisch ist für gut gefaltete Proteine, ist auch ein Merkmal, das den Spektren der Bet-v-1-Peptide gemeinsam ist (Daten nicht gezeigt). Das Spektrum von P5 enthält jedoch ungewöhnlich breite Resonanzen, was auf eine Aggregation dieses Peptids hindeutet. Dieses Peptid (P5), das in der Bet-v-1-Struktur die gesamte C-terminale Helix überspannt, neigt wahrscheinlich dazu, helikale Strukturen zu bilden, die sich in wässriger Lösung aggregieren.
Beispiel 2: An der Oberfläche exponierten von Bet v 1 abgeleiteten Peptiden fehlt die Fähigkeit zur IgE-Bindung und die allergene Aktivität
a) IgE-Bindungsfähigkeit
Die IgE-Bindungsfähigkeit der sechs von Bet v 1 abgeleiteten Peptide wurde verglichen mit der des kompletten rBet-v-1-Wildtypallergens unter Verwendung von Seren von 60 gegen Birkenpollen allergischen Patienten (Tabelle 2).
Charakterisierung der allergischen Patienten und der Seren der Patienten:
Gegen Birkenpollen allergische Patienten, die unter allergischer Rhinokonjunktivitis und/oder Asthma gegen Birkenpollen und verwandte Allergene litten, wurden ausgewählt, wenn die Fallhistorie auf saisonale Birkenpollinose hinwies und sie wurden mit einem Hautpricktest mit Birkenpollenextrakt und serologische CAP-RIST-(Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Schweden)-Tests gekennzeichnet. Die Gesamt-IgE-Pegel in den Seren wurden mit CAP-RIST-Messungen (Pharmacia) bestimmt. IgE-Antikörper, die für rBet v 1 spezifisch waren, wurden mit ELISA bestimmt (Niederberger et al. (1998) IgE-Antikörper gegen rekombinante Pollenallergene (Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 und Bet v 2) deuten auf einen hohen Prozentanteil von Graspollen-spezifischen IgE (J. Allergy Clin. Immunol. 101, 258–264). Seren von 60 gegen Birkenpollen allergischen Patienten und einem nicht atopischen Individuum wurden für die IgE-Vergleichsstudien verwendet. Die Gruppe der gegen Birkenpollen allergischen Patienten bestand aus 25 männlichen und 35 weiblichen Patienten mit einem Durchschnittsalter von 37 Jahren (im Bereich von 19 bis 60 Jahren) (Tabelle 2).
Ergebnis:
Die Gesamt-IgE-Pegel und IgE-Pegel, die spezifisch für Birkenpollenextrakt waren, lagen in einem Bereich von 24 bis 2000 kU/L (Mittelwert: 300) und 3 bis 100 kUA/L (Mittelwert: 47). Alle Patienten zeigten rBet-v-1-spezifische IgE-Antikörper im Bereich von 0,081 bis 2,530 OD-Einheiten (Mittelwert: 1,416 OD-Einheiten) (Tabelle 2). Als auf IgE-Reaktivität gegen auf einer ELISA-Platte gebundene Peptide (P1 bis P6) getestet wurde, zeigte kein Serum eine signifikante IgE-Reaktivität oberhalb des Ausschlusspegels, der mit Serum aus einer nicht atopischen Person bestimmt wurde (NHS) (Tabelle 2).
Tabelle 2: Serologische Kennzeichnung von gegen Birkenpollen allergischen Patienten
Tabelle 2: Fortsetzung
b) Histaminfreisetzung
Als Nächstes wurden die von Bet v 1 abgeleiteten Peptide verglichen mit vollständigem rBet v 1 im Hinblick auf ihre Fähigkeit, eine Histaminfreisetzung aus basophilen Granulozyten von drei gegen Birkenpollen allergischen Personen zu induzieren.
Test auf Histaminfreisetzung aus Basophilen:
Granulozyten wurden aus heparinisierten Blutproben von drei gegen Birkenpollen allergischen Personen mit Dextransedimentation isoliert (P. Valent et al. (1989). Interleukin 3 aktiviert Basophile im menschlichen Blut über Hochaffinitätsbindungsstellen (Proc. Natl. Sci. USA 86, 5542–5547). Die Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen (10^–3 bis 10 μg/mL) jeden Peptids, einer äquimolaren Mischung der 6 Peptide und, für Kontrollzwecke, dem vollständigen rBet v 1 inkubiert. Histamin, das in den zellfreien Überstand abgegeben wurde, wurde mit Radioimmuntest gemessen (Immunotech, Marseille, Frankreich). Das Gesamthistamin wurde nach Einfrieren und Auftauen der Zellen bestimmt. Die Ergebnisse sind dargestellt als Mittelwerte von Dreifachbestimmungen.
Ergebnis:
Wie in 2 dargestellt, wurde gefunden, dass keines der Peptide eine Freisetzung von Histamin bis zu Konzentrationen von 10 μg/mL induzierte, wohingegen der vollständige rBet-v-1-Wildtyp eine dosisabhängige Freisetzung von Histamin induziere mit einer maximalen Freisetzung schon bei einer Konzentration von 1 ng/mL.
c) Allergene Aktivität in vivo
Die in-vivo-Tests bei gegen Birkenpollen allergischen Patienten bestätigten das Fehlen einer allergenen Aktivität der von Bet v 1 abgeleiteten Peptide.
Hautpricktest bei allergischen Patienten:
Die allergene Aktivität der Peptide in vivo wurde untersucht mit Hautpricktests (SPT) bei 5 gegen Birkenpollen allergischen Patienten und einem nicht atopischen gegen Graspollen allergischen Patienten ohne Birkenpollenallergie. SPTs wurden durchgeführt an den Vorderarmen der einzelnen Personen, wie beschrieben (S. Vrtala et al. (1997), J. Clin Invest. 99, 1673–168; S. Dreborg: (1989), J. Am. Acad. Dermatol. 21, 820–821). 20-μL-Aliquots, die 6 Konzentrationen von vollständigem rBet v 1 enthielten (0,78 μg/mL, 1,56 μg/mL, 3,12 μg/mL, 6,25 μg/mL, 12,5 μg/mL, 25 μg/mL), 100 μg/mL jeden Peptids und eine äquimolare Peptidmischung wurden angewendet. Zusätzlich wurden standardisierte Hautpricklösungen (Birkenpollenextrakt und Histamin) (Allergopharma, Reinbek, Deutschland) getestet. Die Reaktionen wurden 20 Minuten nach SPT durch Fotografie aufgezeichnet und indem die mit einem Ballpoint-Schreiber umrundete Quaddelfläche mit einem Klebeband auf Papier übertragen wurde. Der mittlere Quaddeldurchmesser (Dm) wurde berechnet, indem der maximale Längs- und Querdurchmesser gemessen wurde und ihre Summe durch 2 geteilt wurde.
Ergebnis:
Hautpricktests wurden an 5 gegen Birkenpollen allergischen Patienten und einer allergischen Person ohne Birkenpollenallergie mit rBet v 1 und von Bet v 1 abgeleiteten Peptiden durchgeführt (Tabelle 3). Keines der von Bet v 1 abgeleiteten Peptide induzierte irgendeine sofortige Hautreaktion, wenn es in einer Konzentration von 100 μg/mL aufgetragen wurde oder als Peptidmischung, die 100 μg/mL jeden Peptids enthielt (Tabelle 3). Kompletter rBet-v-1-Wildtyp induzierte schon Hautreaktionen vom Soforttyp bei 3 Patienten (Tabelle 3: #1 bis 3) bei einer Konzentration < 0,78 μg/mL. Eine Konzentration von 3,12 μg/mL war ausreichend, um Quaddelreaktionen bei allen 5 gegen Birkenpollen allergischen Patienten zu induzieren (Tabelle 3). Alle gegen Birkenpollen allergischen Patienten zeigten sofortige Hautreaktionen auf Birkenpollenextrakt. Der gegen Graspollen allergische Patient ohne Birkenpollenallergie (Tabelle 3: #6) zeigte keine Reaktionen auf Birkenpollenextrakt, rBet v 1 und von Bet v 1 abgeleitete Peptide (Tabelle 3), zeigte aber eine Quaddelreaktion nach Pricktest mit Wiesenlieschgraspollenextrakt (5,5 mm mittlerer Durchmesser) (Daten nicht gezeigt). Alle Einzelpersonen reagierten nach dem Test mit Histamin, das als positive Kontrolle verwendet wurde (Tabelle 3). Da lokale und sogar systemische Spätphasenreaktionen auf Allergene und insbesondere auf von Allergenen abgeleitete nicht allergene Peptide berichtet wurden, wurden die Anwendungsstellen 24 und 48 Stunden nach dem Hautpricktest untersucht, aber es wurde kein Hinweis auf durch Peptid induzierte Spätphasenreaktionen bei irgendeiner der getesteten Personen gefunden (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 3: Immunisierung mit von Bet v 1 abgeleiteten Peptiden induziert IgG-Antikörper, die mit komplettem Bet v 1 und mit Bet v 1 verwandten Pflanzenallergenen reaktiv sind
a) Induktion von IgG-Antikörpern
Um zu testen, ob die Immunisierung mit von Bet v 1 abgeleiteten Peptiden IgG-Antikörper induziert, die mit dem kompletten Bet-v-1-Molekül und mit mit Bet v 1 verwandten Allergenen reagieren, wurden Mäuse und Kaninchen mit KLH-konjugierten Peptiden unter Verwendung verschiedener Adjuvantien (Aluminiumhydroxid, Freund's Adjuvans) immunisiert.
Immunisierung von Mäusen und Kaninchen
Mit HPLC gereinigte Peptide wurden nach der Anleitung des Herstellers an KLH gekuppelt (Keyhole Limpet Hämocyanin, MW, 4,5 × 10³ – 1,3 × 10⁷, Pierce, Rockford, IL) und unter Verwendung eines Conjugation Kits (Sigma, St. Louis) gereinigt. Mit KLH konjugierte Peptide wurden verwendet, um Mäuse und Kaninchen zu immunisieren unter Verwendung von Al(OH)₃ bzw. CFA als Adjuvans. Sechs Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden von Charles River erworben (Kißlegg, Deutschland). Die Tiere wurden in der Tierpflegeeinheit des Pathophysiologie-Departments, Universität von Wien, nach den lokalen Richtlinien für die Tierpflege gehalten. Gruppen von 5 Tieren wurden mit konjugierten und nicht konjugierten Peptiden, die an AluGel adsorbiert waren, immunisiert (Serva, Heidelberg, Deutschland). Jede Maus erhielt vier 100-μL-Injektionen (20 μg Peptid oder Peptid-KLH-Konjugat absorbiert an 15 μg Al(OH)₃) subcutan in den Hals in Intervallen von 4 Wochen. Kurz vor jeder Injektion und 4 Wochen nach der letzten Immunisierung wurde den Mäusen Blut aus der Schwanzvene entnommen. Die Seren wurden bei –20°C bis zur Analyse aufbewahrt.
Parallel wurden sechs Kaninchen mit einem der Peptid-KLH-Konjugate immunisiert (200 μg/Injektion) unter Verwendung von Freund's komplettem und inkomplettem Adjuvans (Charles River, Kißlegg, Deutschland). Serumproben wurden in Intervallen von 4 Wochen entnommen.
Kreuzreaktivität von Antipeptid-Antiseren
Die Reaktivität von durch Peptid induzierten IgG-Antikörpern gegen rBet v 1, natürliches Bet v 1 und mit Bet v 1 verwandten Pollen und Pflanzen-Lebensmittel-Allergenen wurde mit ELISA und Immunoblot untersucht. Für den ELISA-Nachweis wurden Platten (Nunc Maxisorp, Roskilde, Dänemark) mit Pollenallergenextrakten (100 μg/mL: Betula verrucosa, Alnus glutinosa, Corylus avellana und Carpinus betulus) oder gereinigten Allergenen (5 μg/mL: rBet v 1) beschichtet. ELISA-Platten wurden gewaschen und blockiert wie beschrieben (V. Niederberger et al. (1998). J. Allergy Clin. Immunol. 101, 258–264) und anschließend mit Maus-Antipeptid-Antiseren, die 1:500 verdünnt waren, inkubiert. Gebunde Maus-IgG₁-Antikörper wurden mit monoklonalem Ratten-Antimaus-IgG₁-Antikörper (Pharmingen, San Diego, CA), verdünnt 1:1000, und anschließend 1:2000 verdünntem HRP-gekuppeltem Schaf-Antiratten-Ig-Antiserum (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen den Mittelwert von doppelten Bestimmungen mit einem Fehler von < 5% und sind dargestellt als Mittelwert ± SEM für die Gruppe der 5 Mäuse. ELISAs mit Kaninchen-Antipeptid-Antiseren wurden durchgeführt, wie für die Mausseren beschrieben, mit der Ausnahme, dass Kaninchenseren 1:1000 verdünnt wurden und gebundene Kaninchen-Antikörper mit einem HRP-gekuppelten Ziege-Antikaninchen-Ig-Antiserum (Jackson Immunresearch, Pennsylvania) nachgewiesen wurden.
Immunoblot-Versuche wurden mit auf Nitrocellulose geblotteten Allergenen durchgeführt. Pollenextrakte und Pflanzenlebensmittelextrakte wurden mit 12,5% präparativer SDS-PAGE (12 μg/cm Gel) getrennt und auf Nitrocellulosemembranen (Schleicher & Schüll, Dassel, Deutschland) geblottet. Die Nitrocellulosemembranen wurden 1:1000 verdünnten Kaninchenseren (präimmun, Immunseren) und in bestimmten Versuchen Seren von Mäusen, die mit unkonjugierten Al(OH)₃-adsorbierten Peptiden immunisiert worden waren, ausgesetzt. Gebunde Kaninchen-Antikörper wurden mit 1:2000 verdünntem ¹²⁵I-markiertem Esel-Antikaninchen-IgG-Antiserum (Amersham Pharmacia Biotech) nachgewiesen. Gebundene Maus-Antikörper wurden mit einem 1:2500 verdünnten Kaninchen-Antimaus-IgG-Antiserum (Jackson Immunresearch) und anschließend 1:2000 verdünntem ¹²⁵I-markierten Esel-Antikaninchen-IgG-Antiserum (Amersham) nachgewiesen.
Ergebnis:
Tabelle 4A zeigt die Entwicklung von IgG-anti-rBet-v-1-Antikörperantworten in Gruppen von Mäusen, die mit Al(OH)₃-adsorbierten, KLH-konjugierten Peptiden immunisiert worden waren. Alle 6 Peptiden induzierten IgG-anti-rBet-v-1-Antikörperantworten, die 4 bis 8 Wochen nach der ersten Immunisierung nachgewiesen werden konnten (Tabelle 4A: Blutentnahme 2 bis 3). Durch Peptid induzierte IgG-anti-rBet-v-1-Antworten erhöhten sich konstant während der Immunisierung. Unter Verwendung von unkonjugierten Peptiden konnten anti-rBet-v-1-IgG-Antikörperantworten induziert werden, jedoch in geringerer Stärke (Daten nicht gezeigt).
Ähnliche Ergebnisse wurden nach Immunisierung von Kaninchen mit KLH-konjugierten Peptiden erhalten, die s.c. zusammen mit Freund's Adjuvans verabreicht wurden (Tabelle 4B). Alle 6 Peptide induzierten IgG-anti-rBet-v-1-Antikörperantworten, die sich im Verlauf der Immunisierung erhöhten. Durch Peptid induzierte Maus-IgG-Antikörper reagierten auch mit auf Nitrocellulose geblottetem von Pollen abgeleitetem natürlichen Bet v 1, wohingegen keine Signale erhalten wurden mit den entsprechenden Präimmunseren (3).
Tabelle 4: IgG-Reaktivität von Maus-Antipeptid-Antiseren mit rBet v 1
IgG-Reaktivität von Kaninchen-Antipeptid-Antiseren mit rBet v 1
b) Reaktivität der induzierten IgG-Antikörper mit mit Bet v 1 verwandten Pflanzenallergenen
Als Nächstes wurde untersucht, ob anti-Bet-v-1-Peptidantiseren mit mit Bet v 1 verwandten Allergenen, die in Pollen von Erle, Haselnuss und Hainbuche vorhanden sind, kreuzreagieren.
Allergenextrakte
Pollen aus Bäumen der Ordnung Fagales (Birke: Betula verrucosa; Erle: Alnus glutinosa; Haselnuss: Corylus avellana; Hainbuche: Carpinus betulus) wurden von Allergon (Välinge, Schweden) erworben. Wässrige Pollenextrakte wurden hergestellt und auf Menge und Qualität der Proteine mit SDS-PAGE und Coomassie-Blaufärbung untersucht (S. Vrtala et al. (1993) Int. Arch. Allergy Immunol. 102, 160–169). Gereinigtes rekombinantes Bet v 1 wurde von BIOMAY (Linz, Österreich) erworben.
Ergebnis
Tabelle 5 zeigt, dass fast alle anti-Bet-v-1-Peptidantiseren IgG-Antikörper gegen natürliches Bet v 1 und mit Bet v 1 verwandte Fagales-Pollenallergene enthielten. Nur Antipeptid-4-Antikörper zeigten eine schwache Reaktivität mit dem Haupthaselnusspollenallergen, Cor a 1 und Antipeptid-6-Antikörper reagierten schwach mit dem Haupterlen- und Haselnusspollenallergen, Aln g 1 bzw. Cor a 1.
Tabelle 5: Kreuzreaktivität von anti-Bet-v-1-Peptidantiseren mit natürlichen Allergenen aus Birke, Erle, Haselnuss und Hainbuche
Beispiel 4: Antipeptid-Antiseren hemmen die Bindung von IgE von gegen Birkenpollen allergischen Patienten an komplettes Bet v 1
Die Fähigkeit von anti-Bet-v-1-Peptidantikörpern, die Bindung von IgE von allergischen Patienten an komplettes rBet v 1 zu hemmen, wurde mit ELISA untersucht unter Verwendung von Seren von 60 gegen Birkenpollen allergischen Patienten (Tabellen 2 und 6).
ELISA-Nachweis von Peptid- und rBet-v-1-spezifischen IgE-Antikörpern
Hemmung der IgE-Bindung von allergischen Patienten an rBet v 1 durch Peptid-induziertes IgG: ELISA-Platten (Nunc Maxisorp, Roskilde, Dänemark) wurden mit von Bet v 1 abgeleiteten Peptiden (5 μg/mL) oder rBet v 1 als Kontrolle (5 μg/mL) beschichtet, gewaschen und blockiert, wie in Beispiel 3 beschrieben. Anschließend wurden die Platten mit 1:3 verdünnten Seren von 60 gegen Birkenpollen allergischen Patienten und von einem nicht atopischen Individuum über Nacht bei 4°C inkubiert. Gebundene IgE-Antikörper wurden mit 1:1000 verdünnten mit alkalischer Phosphatase gekuppelten monoklonalen Maus-Antihuman-IgE-Antikörpern nachgewiesen (Pharmingen, San Diego, CA).
Die Fähigkeit von mit Peptid induziertem Kaninchen-Ig, die Bindung von IgE von allergischen Patienten an komplettes rBet v 1 zu hemmen, wurde mit einem ELISA-Konkurrenz-Test untersucht, wie beschrieben (Denepoux et al. (2000) FEBS Lett. 465, 39–46). ELISA-Platten wurden mit rBet v 1 (1 μg/mL) beschichtet und entweder mit einer 1:250-Verdünnung von jedem der Antipeptid-Antiseren (anti-P1 bis anti-P6), einer Mischung, die gleiche Volumina der Antipeptid-Antiseren enthielt, und, für Kontrollzwecke, mit den entsprechenden Präimmunseren und einer Mischung der Präimmunseren, wie beschrieben, vorinkubiert. Nach dem Waschen wurden die Platten mit 1:3-verdünnten Seren von 60 gegen Birkenpollen allergischen Patienten inkubiert und gebundene IgE-Antikörper wurden mit mit alkalischer Phosphate gekuppelten monoklonalen Maus-Antihuman-IgE-Antikörpern nachgewiesen (Pharmingen). Der Prozentanteil Hemmung der IgE-Bindung, der durch Vorinkubation mit den Antipeptid-Antiseren erreicht wurde, wurde wie folgt berechnet: Prozent Hemmung der IgE-Bindung = 100 – OD_l/OD_p × 100. OD_l und OD_p bedeuten die Extinktionen nach Vorinkubation mit Kaninchen-Immun- bzw. Präimmunserum.
Ergebnis:
Alle getesteten gegen Birkenpollen allergischen Patienten zeigten Hautreaktionen vom Soforttyp gegen Birkenpollenextrakt. Bei allen bis auf 3 Seren (Serum #9, 10, 38) hemmte die Vorinkubation mit durch Peptid induziertem Kaninchen-IgG die Bindung von Human-IgE an Bet v 1 beträchtlich. Die stärkste Hemmung der IgE-Bindung wurde beobachtet nach Vorinkubation mit anti-P2 (68% durchschnittliche Hemmung), anti-P6 (60% durchschnittliche Hemmung) und anti-P3 (53,6% durchschnittliche Hemmung) und anti-P5 (41,6% durchschnittliche Hemmung). Anti-P4-Antikörper zeigten eine geringere Fähigkeit, die Serum-IgE-Bindung an Bet v 1 zu hemmen (durchschnittliche Hemmung 28,5%) und anti-P1-Antikörper, die gegen das N-Ende von Bet v 1 hergestellt worden waren, hemmten die IgE-Bindung an Bet v 1 schwach (durchschnittliche Hemmung 11,4%). Interessanterweise zeigte eine Mischung von anti-P1- bis anti-P6-Antikörpern keine stärkere Hemmung der IgE-Bindung (durchschnittliche Hemmung 56,9%), als Antikörper, die gegen einzelne Peptide induziert worden waren (z.B. anti-P2-, anti-P6-Antikörper) (Tabelle 6). Es konnte keine Beziehung zwischen dem Pegel an rBet-v-1-spezifischen IgE in den Seren und dem Grad der Hemmung der IgE-Bindung durch die Antipeptid-Antiseren beobachtet werden.
Tabelle 6: Kaninchen-anti-Bet-v-1-Peptid-Antiseren hemmen Serum-IgE-Bindung von gegen Birkenpollen allergischen Patienten an rBet v 1 % Hemmung
Tabelle 6: Fortsetzung
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Peptid, bei dem die Aminosäuresequenz des Peptids identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, die Teil des Birkenpollenallergens Bet v 1 ist oder bei dem alle Aminosäuren des Peptids außer der N-terminalen oder C-terminalen Aminosäure des Peptids identisch sind mit einer Aminosäuresequenz, die Teil des Birkenpollenallergens Bet v 1 ist, dadurch gekennzeichnet, dass diese Aminosäuresequenz, die Teil des Birkenpollenallergens Bet v 1 ist, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäurepositionen 1 bis 24, 30 bis 59, 50 bis 79, 110 bis 139, 130 bis 160 und 75 bis 104 des Birkenpollenallergens Bet v 1.
Peptid nach Anspruch 1 bestehend aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6.
Peptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid bei Verabreichung IgG-Antikörper induzieren kann, die mit dem Birkenpollenallergen Bet v 1 reagieren.
Peptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die induzierten IgG-Antikörper das Binden von IgE-Antikörpern an das Birkenpollenallergen Bet v 1 vermindern oder verhindern können.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid bei Verabreichung keine IgE-Antwort induziert.
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, die weiterhin ein Adjuvans enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Impfzusammensetzung ist.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das die folgenden Stufen umfasst: a) dass bestimmt wird, welche Aminosäuren eines gegebenen allergenen Proteins an der Oberfläche des allergenen Proteins einem Lösungsmittel ausgesetzt sind; b) ein Peptid hergestellt wird mit einer Länge von 8 bis 50 Aminosäuren, wobei mindestens drei aufeinander folgende Aminosäuren des Peptids identisch sind mit mindestens drei Aminosäuren, die auf der Moleküloberfläche eines allergenen Proteins erscheinen innerhalb eines Oberflächenstücks von 500 Å², wobei mindestens drei Aminosäuren in dem allergenen Protein Aminosäuren sind, die dem Lösungsmittel ausgesetzt sind und c) das Peptid mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel vermischt wird; wobei dem Peptid die IgE-Bindungskapazität fehlt.
Verfahren nach Anspruch 9 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das die folgenden Stufen umfasst: a) dass bestimmt wird, welche Aminosäuren eines gegebenen allergenen Proteins auf der Oberfläche des allergenen Proteins einem Lösungsmittel ausgesetzt sind; b) ein Peptid mit einer Länge von 8 bis 50 Aminosäuren hergestellt wird, wobei mindestens fünf aufeinander folgende Aminosäuren des Peptids identisch sind mit mindestens fünf aufeinander folgenden Aminosäuren der Aminosäuresequenz des allergenen Proteins, wobei die mindestens fünf aufeinander folgenden Aminosäuren in dem allergenen Protein dem Lösungsmittel ausgesetzte Aminosäuren sind und c) das Peptid mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel vermischt wird.
Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, das weiterhin die Zugabe eines Adjuvans beinhaltet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass alle Aminosäuren des Peptids außer einer identisch sind mit einer Aminosäuresequenz, die Teil des allergenen Proteins ist.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die eine Aminosäure, die von der Aminosäuresequenz des allergenen Proteins abweicht, die N-terminale oder C-terminate Aminosäure des Peptids ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des Peptids identisch ist mit einer Aminosäuresequenz, die Teil des allergenen Proteins ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das allergene Protein das Birkenpollenallergen Bet v 1 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die dem Lösungsmittel ausgesetzten Aminosäuren des allergenen Proteins bestimmt werden, indem das Hydrophilieprofil der Aminosäuresequenz des allergenen Proteins bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die dem Lösungsmittel ausgesetzten Aminosäuren aus der dreidimensionalen Struktur des allergenen Proteins bestimmt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17, wobei die Länge des Peptids in einem Bereich von 21 bis 35 Aminosäuren liegt.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Peptid die Aminosäurepositionen 1 bis 24, 30 bis 59, 50 bis 79, 110 bis 139, 130 bis 160 oder 75 bis 104 des Birkenpollenallergens Bet v 1 enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 19, wobei das Peptid aus einer Aminosäuresequenz besteht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6.
Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer allergischen Krankheit.