DE2422097A1 - Polymerisiertes ambrosiagewaechsantigen e und verfahren zur gewinnung und verwendung des stoffes - Google Patents

Description

Dr. ing. -Wstar Abfti 7. Mai 1974

Dr. Dieter F. Möff
Dr. Hans-A. Brauns

te, Ptazuaunir. Il

ABBOTT LABORATORIES North Chicago, 111. 60.064, V.St.A.

NORTHWESTERN UNIVERSITY 633 Clark Street, Evanston, 111., V.St.A.

Polymerisiertes Ambrosiagewächs— Antigen E und Verfahren zur Gewinnung und Verwendung des Stoffes

Die vorliegende Erfindung betrifft Ambrosiagewächs"""Antigen E ("ragweed") und insbesondere ein verbessertes Ambrosiagewächs "Antigen, Verfahren zu seiner Gewinnung und Verfahren, am damit Immunisierung zu erreichen.

Eine der verbreitesten Allergien ist die gegenüber Ambrosiagewächsen. Seit geraumer Zeit ist es Jetzt möglich, allergische Patienten gegen ihre Allergie gegenüber Ambrosiagewächsen dadurch zu immunisieren, dass den Patienten ein Ambrosiagewächs-Antigen injiziert wird. Mit dem gemeinhin verfügbaren Material sind jedoch mehrere Probleme vei*- bunden:

^. Es ist nicht immer wirksam und

2. die Patienten zeigen, oft eine allergische Reaktion gegen das Serum selbst.

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Durch die vorliegende .Erfindung wird ein Ambrosiagewächs-Antigen "bereitgestellt, das zumindest ebenso antigenisch wie nicht-polymerisiertes Ambrosiagewächs-Antigen E ist, aber stärker antigenisch wirkt als das monomere Ambrosiagewächs-Antigen E.

Voruntersuchungen von polymerisierten Ambrosiagewächs-Antigenen liessen gewisse Antigenmerkmale erkennen. So wurde beispielsweise nachgewiesen, dass alle entscheidenden antigenischen Faktoren des· Ambrosiagewächs-Antigens E an dem polymerisiert en Material vorhanden waren. Zwei hochmolekulare Fraktionen wurden hergestellt, nämlich ein polymerisiertes Ambrosiagewächs-Antigen mit Molekulargewichten im Bereich von etwa 200 000 bis 4- 000 000, das als niedrigmolekulares, polymerisiertes Ambrosiagewächs-Antigen (LMW-P-RV) bezeichnet wurde, und ein hochmolekulares^olymerisiertes Ambrosiagewächs-Antigen (HMV-P-RW) mit Moleku- .. largewichten im Bereich von 4 000 000 bis 20 000 000. Diese beiden Präparate riefen Immunreaktionen in Meerschweinchen und Kaninchen hervor, und diese Untersuchungen deuteten darauf hin, dass das LMW-P-RW eine stärkere Immunreaktion als das nicht-polymerisierte Ambrosiagewächs-Antigen hervorrufen könnte.

Weitere Untersuchungen wurden durchgeführt, um die Merkmale der polymerisierten Ambrosiagewächs-Antigen, einschliesslich derjenigen, die sich potentiell therapeutisch nützlich in der Humantherapie von Patienten, die an Ambrosiagewächs-Heufieber leiden, erweisen könnten, abzuschätzen. Diese Untersuchungen umfassfc-en die Reaktionsfähigkeit des polymerisierten Materials in durch IgE-vermittelten Reaktionen, z. B. der Freisetzung von Histamin basophiler Zellen, die Auslösung von Hautreaktionen und die in vitro-Reaktions- · fähigkeit mit IgE-Antikörper gegen Ambrosiagewächs-Antigen E. Die Geschwindigkeit der Ausbreitung von mit Isotopen markierten, polymerisiert en Ambrosiagewächs-Antigenen aus der Haut

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und aus der Gefässkammer wurde in Untersuchungen an Tieren- abgeschätzt.

Beispiel 1 Herstellung; von-Ambrosiagewächs-Antigen E

Zwergambrosia ("dwarf, ragweed"; Ambrosia elatior) wurde nach der von King und Norman, Biochemistry, J^: (1964), S. 4-58 beschriebenen Methode fraktioniert. Die Fraktion IV, die durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat, Diäthylaminoäthylcellulose und Sephadex-Chromatographie erhalten worden war, wurde durch Triathylamxnoathylcellulose weiter fraktioniert, und die Fraktion IVC, die 100 % Antigen'E enthielt, wurde entfernt und für bestimmte Untersuchungen verwendet. Der Rest der Fraktion IV, der die Fraktionen IVA, IVB und IVD enthielt, wurde vereinigt. Es wurde errechnet, dass diese gesammelte Menge der Fraktion IV minus IVC etwa 60 % Ambrosiagewächs Antigen E enthielt; sie wurde durch Behandeln mit Glutaraldehyd zum Zusammenballen gebracht. Die Fraktion IVC wird als AgE und die Fraktion IV minus IVC als,EW bezeichnet. Später wurde durch Immunisierungsprüfung gezeigt, dass KW zu etwa 30 % AgE war.

Alle R¥-Präparate wurden durch Messung der optischen Dichte bei 280 mn mit einem Beckman DU-Spektrophotometer bewertet. Ea wurde abgeschützt, dass 1 0.D.-Einheit etwa 1 mg Protein war; das Protein wurde in den nachfolgenden immunologischen Untersuchungen in diesen Einheiten ausgedrückt.

Beispiel 2

Polymerisation von Ambrosiagewächs-Antigen E

Nach der Methode des Beispiels 1 erhaltenes RV wurde nach der Methode von Sachs und V/inn (vgl. " Immuno chemistry" , 6_: (1969), Seite 53) mit Glutaraldehyd behandelt. Sie Polyir.cri-

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sation erfolgte bei Raumtemperatur während 4 Stunden. Es wurde ein Mo !verhältnis von Glutaraldehyd zu EW wie 100 : angewandt. 10 mg des RYMProteins wurden für die Glutaraldehyd-Behandlung bei jeder Gelegenheit, bei der polymerisiertes EW (P-EV) hergestellt wurde, verwendet. Die P-RW-Präparate wurden unter Verwendung von Sephadex oder Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) fraktioniert. Verschiedene Fraktionierungen wurden mit Sephadex G-200 oder Sepharose 6B, 4B oder 2B unter Verwendung von 40 χ 2,5 cm-Säulen durchgeführt. Die Sephadex- und Sepharose-Säulen und Protein-Lösungen wurden mit einem 0,1 M TRIS, 0,15 K NaCl-Puffer (pH 7,9) ins Gleichgewicht gebracht. Der Proteingehalt der Eluate wurde durch die optische Dichte bei 280 um unter Verwendung eines Beckman DU-Sp ektrophotomet er s bestimmt. Dextran-Blau 2000 wurde in verschiedenen Säulen als Molekularindikator verwendet, um die Bestimmung ausgeschlossener und eingeschlossener Fraktionen zu unterstützen. Material, dessen Molekulargewicht 200 000 überstieg, wurde als polymerisiertes Ainbrosiagewächs-Antigen (P-RW) angesehen.

Beispiel 3 Herstellung von isotopenmarkiertem AgE und RW

125
AgE wurde mit -^J, wie von Patterson et al. in J. Immun. 95: (1965), Seite 48, beschrieben, markiert. Die Herstellung

1?5 1?5

von -\J-EW erfolgte durch Zugabe von «J AgE zu RV/.

125 125

^J P-RW wurde durch Polymerisieren von ^J RW mit

Glutaraldehyd, wie oben beschrieben, hergestellt. Beispiel 4

Herstellung von Antisera

Ungefähr 3»5 kg schwere Albinokaninchen wurden mit AgE in

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Freund¹ schem Adjuvans ohne Mykobakterien oder mit P-RW ohne Adjuvans injiziert. Jedes Tier erhielt eine intravenöse Anfangsdosis von 2 mg und danach, 3 Wochen später, eine zweite Injektion von 2 mg.

Beispiel 5 Herstellung von isotopenmarkiertem Antigen;Ausfällungsmethode

125
Die direkte Ausfällung von -«T-Antigen erfolgte nach der Methode von Talmage, die in J. Infect. Dio., ^Zy(1953)

125 S. 228, beschrieben ist, unter Verwendung von ^J AgE und nicht-markiertem AgE oder RW und Antisera gegen AgE oder P-RW.

Beispiel 6

Die Bestimmung der Immunreaktion von Kaninchen und Meerschweinchen auf Ambrosiagewächs-Präparate

Etwa 0,5 kg schwere Meerschweinchen erhielten 0,2 mg Ambrosiagewächs-Antigen intravenös und drei subkutane, zusätzliche Immunisierungen von 0,2 mg in Zeitabständen von 2 Wochen. Drei Gruppen von zwei Tieren erhielten RW, niedrigmolekulares, polymerisiertes Ambrosiagewächs-Antigen (IHW-P-RW) oder hochmolekulares, polymerisiertes Ambrosiagewächs-Antigen (HMW-P-RW).

3,5 ^g schwere Albinokaninchen erhielten eine intravenöse Injektion von 1 mg des Ambrosiagewächs-Präparates und 3 Wochen danach eine subkutane Injektion von 0,6 mg. Drei Gruppen von drei Kaninchen erhielten entweder RW, IMW-P-RW bzw. HMW-P-RW.

Vor jeder Immunisierung wurden Serumproben genommen, und es wurde das Bindevermögen jedes Serums für ^J RW nach einer

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abgeänderten Farr-Methode (8). bestimmt. Diese Methode be-

125 stimmt das Bindevermögen von Sera für ^J-Ambrosiagewächs-Antigen E bei 40 % gesättigtem Ammoniumsulfat (9).

125 liach der Festlegung der direkten ^J RW-Ausfällungskurven

125 wurden die Inhibierung der Ausfällung des Anti-RW- "\J-RW-Systems durch P-RV und die Inhibierung des Anti P-RU- -⁷J P-RW-Systems geprüft. Ausgewählte Mengen des nicht-markierten Antigens wurden mit Antiserum 30 Minuten lang bei 37° C und 24 Stunden lang bei 4° C vorinkubiert. Als nächstes

125
wurde die maximale Menge an ^J RV7, von der bekannt war, dass sie ausgefällt werden würde (Iquivalenzpunkt), zugefügt. Das Gemisch wurde wiederum inkubiert, und es wurde die pro-

125 zentuale Inhibierung der Ausfällung des "u RW bestimmt. Die Analyse des Geldiffusionsniederschlags vom Ouchterlony-Typ und die Immunoelektrophorese erfolgten nach Standardmethoden, wie den von Kabat und Mayer in Experimental Immuno· Chemistry, Charles C. Thomas, Springfield, 1961 beschriebenen.

Diskussion

Wenn RW" mit Glutaraldehyd behandelt und das sich ergebende P-RW durch eine Sephadex G-200-Säule fraktioniert wurde, trat der Hauptanteil des mit Glutaraldehyd behandelten RW-Proteins in einem scharfen Scheitelpunkt au£. Dieses Material in dem Ausschlussvolumen des Sephadex G-200 mit einem Molekulargewicht von über 200 000 wurde als polymerisiertes Ambrosiagewächs-Antigen (P-RW) angesehen.

Die Fraktionierung einer anderen Partie von mit Glutaraldehyd behandeltem RW durch eine Sepharose 6B-Säule ergab zwei Proteinfraktionen. Diese traten in einem scharfen Scheitelpunkt, der Protein enthielt, in dem Ausschlussvolumen des Sepharose 6B und einer breiten Schulter in dem Einschlussvolumen auf. Es wurde angenommen, dass der scharfe Scheitelpunkt aus polymerisiertem Ambrosiagewächs-Antigen

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mi-t einem Molekulargewicht von über 4 000 000, als hochmolekulares, polymerisiert es Ambrosiagewächs-Antigen (HMW-P-Ew*) (vereinigte Menge I) bezeichnet, bestand. Es würde angenommen, dass die zweite diffuse Proteinfraktion ein Spektrum eines Materials-mit Mplekulargewichtsbereichen von 200 000 bis 4 000 000 aufwies (LMW-P-HW) (vereinigte Menge II). Wenn die vereinigte Menge I durch eine Sepharose 4B-Säule hindurch fraktioniert wurde, traten zwei Scheitelpunkte auf. Es wurde angenommen, dass der erste Scheitelpunkt in dem Ausschi ussvol um en der Sepharose 4B ein Molekulargewicht von über 20 000 000 und der zweite Scheitelpunkt in dem Einschlussvolumen der Sepharose 4B einen Molekulargewichtsbereich von 4 000 000 bis 20 000 000 aufwies.

Im Anschluss an die oben beschriebenen Untersuchungen, welche die verschiedenen Molekulargewichtsbereiche von polymerisiertem Ambrosiagewächs-Antigen, das durch Behandlung von Ambrosiagewächs mit Glutaraldehyd erhalten worden war, zeigten, wurde eine Standard-Arbeitsweise für die Herstellung des polymerisieren Materials entwickelt. Diese bestand

125

in der Zugabe von J-AgE zu RW, Behandlung mit Glutaraldehyd und Fraktionierung durch Sepharose 6B. Die ausgeschlossenen (HMW-P-RW) und die eingeschlossenen (LMW-P-RW-Fraktionen wurden vereinigt und durch Verdunsten eingeengt. Eine HMW-P-RW-Probe wurde in Sepharose 4B fraktioniert. Wenn alle gezählten Stösse ("counts") in den eingeschlossenen Fraktionen lagen, wurde das HMW-P-RW als in dem Molekulargewichtsbereich von etwa 4 000 000 bis 20 000 000 liegend angesehen. Wenn eine bedeutende Anzahl von Stössen des •HKW-P-RW durch Sepharose 4B ausgeschlossen wurde, wurde die gesamte ausgeschlossene Fraktion aus der Sepharose 6B-Fraktionierung durch Sepharose 4B weiter fraktioniert, und die eingeschlossenen Fraktionen wurden vereinigt und für die Verwendung als HI-IW-P-RW eingeengt. In ähnlicher Weise wurde nach jeder Herstellung von LI-IW-P-RW ein aliquoter Anteil an Sephadex G-2Q0 fraktioniert, und das IHVZ-P-RV/ wurde, wenn

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die meiste Radioaktivität ausgeschlossen war, als innerhalb eines Molekulargewichtsbereichs von etwa 200 000 bis 4- 000 000 liegend angesehen. Wenn ein bedeutender Anteil an Radioaktivität in den eingeschlossenen Fraktionen auftrat, wurde die gesamte Probe durch Sephadex G-200 fraktioniert, und die ausgeschlossenen Fraktionen wurden vereinigt, eingeengt und als LMW-P-RW bezeichnet. Diese Arbeitsweisen wurden wegen des veränderlichen Polymerisationsgrades angewandt, der während jeder Herstellung von P-RW auftreten kann.

125
Die Ausfällung von ^J AgE durch Anti-AgE wurde aufgetragen.

Die Kurve der Isotopenausfällung war charakteristisch für die isotopenmarkierten Antigen-Ausfällungskurven, die mit anderen ausfällenden Kaninchen-Antikörper syst em en mit einer Kurvenhohe bei Antikörperüberschuss und abnehmender Ausfällung bei Antigen-Üb er schuss erhalten worden waren (vgl. beispielsweise Talmage et al., J. Infec. Dis., 92:(1955) S. 288).

Wenn dasselbe Anti-AgE zur Festlegung einer Präzipitinkurve

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mit ^J J RW (durch Zugabe von Spurenmengen ^J AgE zu RW hergestelltes Antigen) herangezogen wurde, wurde die Isotopenpräzipitinkurve verschoben. Dies beweist, dass mehr RW als AgE benöbigt wird, um Äquivalenz und Antigen-Überschuss mit dem Anti-AgE-System zu erreichen, weil AgE eine einzelne Antigenart ist, während RW andere Ambrosiagewächsmaterialien als AgE aufweist. Durch die hier angewandte 0.D.-Bestimmung wird nahegelegt, dass das RW zu 30 % AgE ist, da dreimal soviel RW zur Erzielung von Äquivalenz und Antigen-Überschuss benötigt werden. Die Neigungen der beiden Kurven waren parallel.

Die Isotopenpräzipitinkurve, die sich durch Umsetzung von

125
Kaninchen-Anti-P-RW mit «J RW ergab, zeigte Antiköiperüberschuss und vollständige Inhibierung des Antigen-Über-

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Schusses. Dies zeigt an, dass die entscheidenden Antigen-Faktoren des P-RW immer noch alle diejenigen des ursprünglichen RW enthielten.

Die Reaktionsfähigkeit des polymerisieren RW mit Anti-AgE wurde durch Inhibierung der Ausfällung von ^J AgE "bewertet. Das RRW wurde zunächst vor der Zugabe von

^J AgE mit Anti-AgE inkubiert. Die Wirkung der vorausgehenden Inkubierung von sowohl EMW-P-RW als auch HMW-P-RW

125 mit Anti-AgE beim Ausfällen von ^J AgE vrarde als prozen-

125 tuale Inhibierung der Ausfällung von ^J AgE ausgedrückt. Die Vorbehandlung von Anti-AgE mit dem LMW-P-RW und HMW-P-RW inhibierte vollständig die nachfolgende Ausfällung von

^J RW. Diese vollständige Inhibierung beifeist, dass alle

entscheidenden Faktoren, welche Anti-AgE auslösen, in den polymerisierten Präparaten vorhanden waren. Die für die vollständige Inhibierung benötigten Mengen an polymerisiertem RW betrugen das 2- oder 3fache der Menge an unpolymerisiertem RW, das für die vollständige Inhibierung benötigt wird, wie durch Einzelversuche bestimmt wurde.

Doppel-Geldiffusion-Präzipitinreaktionen, die mit Kaninchen-Anti-RW und RW, LMW-P-RW und HMW-P-RW ausgeführt wurden, bewiesen, dass Identitätsbanden ohne Anregung des RW mit den polymerisierten Präparaten auftragen, was anzeigt, dass kein Verlust an entscheidenden Faktoren während der Polymerisation eintrat. Dies bestätigt die Fähigkeit von polymerisiertem Material, mit allen Antikörpern gegen RW zu reagieren. Da das RW-Monomere und die -Polymeren dieselben Proteinkonzentrationen aufwiesen, erklärt sich der herabgesetzte Bandenabstand von den polymerisierten Antigenquellen durch die herabgesetzte Diffusionsgeschwindigkeit der höhermolekularen Stoffe..

Eine Doppel-Geldiffusion-Präzlpitinanalyse derselben Antigene unter Verwendung von polymerisiertem Kaninchen-Anti-RW zeigte

eine Identitätsbande ohne Anregung von IKV-P-EW oder HMW-P-EV. Die mit LNW-P-EW, HMW-P-EW und Anti-P-EW beobachteten, diffusen Banden können durch die veränderlichen Molekulargewichte in diesen Präparaten oder möglicherweise durch zusätzliche entscheidende Antigen-Faktoren .in diesen Stoffen, die sich aus einer Polymerisation ergeben, selbst wenn keine Anregungen beobachtet wurden, erklärt werden. Die mit Anti-EW und Anti-P-EV entwickelte Immunoelektrophorese von EW und HMW-P-EW zeigte die Ähnlichkeit der EW-Banden, die mit Anti-RW'und Anti-P-EW entwickelt worden waren. Die Doppelbindungen und elektrophoretische Heterogenitat von EW steht in Übereinstimmung mit den früheren Untersuchungen von King, die Ladungsheterogenität von Antigen Ε-Molekülen gezeigt haben. Die HMW-P-EW-Banden sind diffuser und undeutlicher, vermutlich infolge einer begrenzten Wanderung in dem Agar. Der Vergleich der Immunoelektrophorese von LMW-P-EW und HMW-P-EW, die mit Anti-EW und Anti-P-EV entwickelt worden waren, zeigte ähnliche Muster, nur dass das HMW-P-EW weniger ausgeprägt ist, worin wiederum, wie angenommen wird, die sogar noch begrenztere Wanderung des höher-molekularen Materials zum Ausdruck kommt. Keine Unterschiede traten zwischen Mustern zutage, die mit Anti-EW und Anti-P-EW entwickelt worden waren.

125 Es wurde das Binde vermögen für J EW von Serumproben aus Meerschweinchen, denen EW-, LMW-P-EW- und HMW-P-EW-Präparate injiziert worden waren, untersucht. 7 Tage nach der vierten Injektion der wässrigen Präparate wurde nachgewiesen, dass

125
sämtliche Sera <J-EW banden, und dies nahm 7 Tage später •in vier der sechs Tiere zu. In Serumproben, die 2 Wochen nach der Endimmunisierung erhalten worden waren, war das Bindevermögen von Sera, die aus mit LMV-P-RV injizierten Tieren enthalten worden war, höher als dasjenige der zweianderen Gruppen. Nach der zweiten Immunisierung zeigten alle

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Sera ein erhöhtes Bindevermögen für ^J-EW. Das Bindevermögen von Seren, die aus zwei Tieren, die LMV-P-RW erhalten

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hatten, gewonnen worden war, war, wie sich zeigte, höher als das von Seren, die aus Tieren gewonnen worden waren, die RV oder HIiVZ-P-RV erhalten hatten.

Die Präparate von RW-Material, das unter Behandlung mit Glutaraldehyd polymerisiert worden war, zeigten einen weiten Bereich von Molekulargewichten, wie durch die Elutionsmuster der Sepharose- und Sephadex G-200-Fraktionierungen nachgewiesen wurde. Obgleich sich bei unterschiedlichen Partien Änderungen in den Mustern ergaben, bestand allgemeine Ähnlichkeit in mehr als fünf einzelnen Polymerisationsversuchen. Die Ausbeute an polymerisiertem Material betrug über 90 %, wie aus der 0.D.-Ausbeute der polymerisierten Stoffe geschätzt wurde, und die polymerisierten Stoffe blieben im Laufe dieser Versuche löslich. Frühere Mitteilungen von Glutaraldehydbehandlungen anderer Proteine (Sachs et al., Immunochemistry, 8^: (1970), S. 58) bewiesen, dass weniger als 1 % der Proteine ungekoppelt waren, und ähnliche Ergebnisse wurden mit RV erhalten.

Das mit Glutaraldehyd behandelte RV behielt seine antigenen Eigenschaften bei und reagierte mit sämtlichen Antikörpern in Antiserum, das gegen nicht-polymerisiertes RV hergestellt worden war. Obgleich die polymerisierten Ambrosi gewächs-Antigenpräparate mit sämtlichen Antikörpern gegen RV-Antigen in einem Antiserum zu reagieren vermöchten, wurden in Abhängigkeit von der Grosse wachsende Konzentrationen an den polymerisierten Präparaten benötigt, um dies zu bewerkstelligen. Diese Abnahme der Reaktionsfähigkeit ist sehr wahrscheinlich einer sterischen Vechse^irkung der Antikörper—Reaktionsfähigkeit mit entscheidenden Faktoren an Polymeren zuzuschreiben. Der mögliche Verlust an bestimmenden Antigen-Faktoren während der Polymerisation unter Glutaraldehydbehandlung wurde nicht vollständig ausgeschlossen. Es wurde kein überzeugender Beweis für die Entwicklung von neuen entscheidenden Antigen-Faktoren in

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den durch Glutaraldehyd-Behandlung hergestellten Polymeren gefunden, und die Geldiffusion-Präzipitinidentitätsbanden des Polymeren mit RW zeigen, dass die Polymeren weder einen Unterschuss noch einen bedeutenden Überschuss an entscheidenden Antigen-Fakto'ren aufweisen. Dass solche entscheidenden Faktoren nach einer Glutaraldehyd-Behandlung von Proteinen auftreten könnten, konnte auf Grund früherer Arbeiten erwartet werden.

Die Antikörper-Reaktionen bei Meerschweinchen, die mit RV, EMW-P-RW und HMW-P-RW immunisiert worden waren, bewiesen, dass sämtliche Präparate Antikörper-Reaktionen hervorriefen; diese waren aber erst nach einer dritten Immunisierung selbst bei Anwendung einer so empfindlichen Methode wie der für den Fachweis angewandten Ammoniumsulfat-isotopenmarkierten Antigen-Methode offenkundig. Dieser Mangel an Reaktion auf primäre und sekundäre Anregung war nicht unerwartet, da gute Antikörperreaktionen auf Ambrosiagewächs-Antigene im allgemeinen wiederholte Antigen-Verabreichung verlangen. Die Ergebnisse von Antikörper-Reaktionen bei Meex^schweinchen gegen die 3 RW-Stoffe bewiesen, dass die polymerisierten Stoffe mindestens so antigenisch in dieser Art wie RW sind und dass das IiMW-P-RW wahrscheinlich das am meisten antigen wirkende Material der drei molekularen Arten ist.

Die Ergebnisse von Immunisierungsversuchen mit Kaninchen waren ähnlich und deuteten darauf hin, dass die Immunreaktion auf Injektionen mit LEW-P-RW mindestens so gut und wahrscheinlich besser als die mit RW oder HMW-P-RW ist.

Die folgende Untersuchung weist nach, dass bei intravenösen Injektionen von RW, HMW-P-RVJ und LMW-P-RW die ersten zwei Stoffe aus dem Kreislauf am raschesten entfernt werden, wobei das RVJ bedeutend höhere Aktivität im Harn zeigt und das HtW-P-RW frühzeitig in der Leber und der Milz lokalisiert ist. Das LMW-P-RW

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blieb langer im Kreislauf und führte zu einer bedeutenderen Immunreaktion. Dies war analog Ergebnissen, die früher erhalten worden waren, als gezeigt wurde, dass die intravaskuläre Retention von gewissen Antigen-Antikörper-Komplexen zu einer besseren Antikörper-Reaktion im Kreislauf führt (Patterson & Susyko, J. Immun. °ßx (1967), Seite 178).

Beispiel 7

Die Ambrosiagewächs-Antigene mit 3 Molekulargewichtsbereichen (nicht polymerisiertes Ambrosiagewächs-Antigen mit einem Molekulargewicht von 37 800 (RW), polymerisiertes Ambrosiagewächs-Antigen mit einem Molekulargewichtsbereich von 200 000 bis 4- 000 000 (LMW-P-RW), und ein hochmolekulares, polymerisiertes Ambrosiagewächs-Antigen mit einem Molekulargewichtsbereich von 4 000 000 bis 20 000 000 (HMW-P-EW)) wurden durch Polymerisieren von Ambrosiagewächs-Antigen, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt. Hergestellt wurden

125

auch "iF-markierte RW-Präparate, wie in Beispiel 3 beschrieben. Radioaktiv markiertes RW wurde für kutane und intravaskuläre Eliminierungsversuche verwendet. Nicht markiertes RW wurde für die Histamin-Freisetzung, Prausnitz-Küstner-Untersuchungen und Untersuchungen der Reaktionsfähigkeit mit IgE-Antikörper gegen RW verwendet.

Versuche zur kutanen Eliminierung wurden zur Bestimmung der Geschwindigkeit, mit der radioaktiv-markierte RW-Antigene die Haut nach lokaler, kutaner Injektion verlassen, angestellt. Kaninchen und Meerschweinchen wurden intravenös 0,1 ml von ¹²⁵J RW-, ¹²⁵J LMW-P-BW- und

•V-HMW-P-RW-Präparaten, von denen jedes 0,02 mg enthielt, injiziert. Die Injektionen erfolgten in Bezirken nacheinander bei 30, 60 und 120 Minuten, und unmittelbar nach der letzten Injektion wurden die Tiere getötet und sämtliche Hautbezirke, die 2 cm χ 2 cm gross waren, wurden herausgeschnitten. Die restliche Radioaktivität in der Haut wurde

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in einem NaJ-Gamma-Zähl er mit Probenkanal gemessen.

Die intravaskuläre Eliminierung wurde folgendermassen unter-

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sucht: 0,2 mg ^J RW und ^J P-RW wurden Meerschweinchen und Kaninchen intravenös injiziert und der Betrag der mit Trichloressigsaure ausfällbaren Radioaktivität, die in dem Kreislauf zurückblieb, wurde in Zeitabständen bestimmt. 1 ml Blut wurde der Augenhöhle (orbital sinus) von Meerschweinchen und dieselbe Menge aus der Ohrvene von Kaninchen entnommen. Die Radioaktivität jeder Probe wurde bestimmt, und die Prozent Zählstössen in Serum, die durch 10%ige Trichloressigsaure (TCA) ausfällbar ist,wurden ebenfalls bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Prozent der Anfangszählstösse, die mit TCA ausfällbar sind und im Blut zurückbleiben, ausgedrückt. Diese Methoden wurden früher von Patterson & Suszko in*J. Immun., 97: (19&7), Seite 138, beschrieben.

Die Histamin-Freisetzung aus periphären Blutleukocyten erfolgte in der früher von Pruzansky et al., in J. Allergy, ffi: 0956), Seite 315, beschriebenen Weise. Kurz gesagt, wurden 35 ml Blut vier verschiedenen Spendern entnommen, die gegen Ambrosiagewächse klinisch empfindlich waren und deren Leukocyten Histamin freisetzten, wenn sie mit Antigen E inkubiert wurden. Die meisten Erythrocyten wurden nach der Sedimentierung mit Dextran entfernt. Gleich aliquote Anteile gewaschener Leukocyten wurden 30 Minuten lang bei 37° C mit 10fachen Anteilen der drei gereinigten Ambrosiagewächs-Präparate in Tris-Ca⁺⁺-Mg⁺⁺-Puffer bei pH 7,4 inkubiert. Histamin wurde fluormetrisch sowohl in aufschwimmenden als auch sedimentierten Zellen nach sedimentierten Zellen nach Extraktion mit 0,4N HClO^ gemessen.

Die kutanen Titrationen nach Prausnitz-Küstner wurden fol-

gendermassen durchgeführt:

Ein Serum, das von einem Patienten stammte, der an Ambrosia-

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gewächs-Heufieber litt, wurde auf Negativität gegen australisches Antigen hin. geprüft und für die passive Über- " tragungshautprüfung in einem der Erfinder verwendet. Mehrfachen Hautbezirken wurde 0,1 ml Serum injiziert. In 48 Stunden wurde diesen Bezirken intrakutan 0,1 ml serienmi'ssiger 10facher Verdünnungen von EV-, IMW-P-EV und HMW-P-RW injiziert. Die Anfangslösungen dieser drei Präparate wurden durch O.D.-Ablesungen bei 280 nm geeicht. Die Hautbezirke wurden bei 30 Minuten abgelesen, und der Grad der Reaktionsfähigkeit wurde in normaler Weise eingestuft.

Die Reaktionsfähigkeit von Ambrosiagewächs-Antigenen mit Human-IgE-Antiambrosiagewächs in vitro wurde folgendermassen bestimmt:

Ein aus einem.Ambrosiagewächs~empfindlichen Patienten erhal-' tener Serum-IgE-Antikörper gogen Ambrosiagewächse wurde durch eine Myeloma-IgE- Anti-IgE-Bindung fest an die Polystyrolprüf röhrchen gebunden, wie kürzlich von Zeiss et al., in J. Immun. (1973) beschrieben wurde. Steigende Mengen RV, IMW-P-RW und HMW-P-RW, von denen jede eine konstante

125

Menge an ^J-Ambrosiagewächs-Antigen .E enthielt, wurden einer Reihe dieser Röhrchen, an die eine konstante Menge Human-IgE-Anti-Ambrosiagewächs gebunden worden war, zugesetzt.

Nach dem Inkubieren und Waschen wurde für jede Menge der

125 zugesetzten Antigene das gebundene J-Ambrosiagewächs-Antigen E in Prozent errechnet. Die Menge jedes Antigens,

125
die nötig war, um die ^J-Ambrosiagewächs-Antigen-E-Bindung auf 50 % herabzusetzen, wurde durch Interpolation bestimmt.

125 Bei der Untersuchung der Freisetzung von ^J-Ambrosiagewächs-Antigenen aus Hautbezirken ging hervor, dass die Geschwindigkeit, mit der EW aus den Hautbezirken verschwindet, grosser war als die Geschwindigkeit, mit der EMW-P-RW und HIW-P-RV/ verschwanden. Das Verschwinden von

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"¹²⁵J RW, ¹²⁵J UW-P-EW und ¹²⁵J HMW-P-RV/ nach intravenöser Injektion dieser Stoffe bei Meerschweinchen zeigte Unterschiede zwischen den Mengen dieser Stoffe, die in dem Kreislauf nach 1 Stunde und 5 Stunden zurüekblieben, was anzeigt, dass das HMW-P-RW am schnellsten aus dem Kreislauf verschwindet, dass das RW der Zeit nach als nächstes verschwindet, und dass das IMW-P-RW am längsten zurückgehalten wird.

Um das Schicksal der drei Molekulargrössen des Ambrosiagewächs-Antigens nach intravenöser Injektion zu bestimmen, wurde Meerschweinchen dieselbe Menge (0,2 mg) und dieselbe

125 125 Anzahl von radioaktiven Zählstössen an J RW, ^J

IMW-P-RW und ¹²^J" HMW-P-RW injiziert. 10 Minuten nach dieser Injektion wurden die Tiere getötet, und es wurden die mit Trichloressigsäure ausfällbaren Zählstösse im Blut, Harn, der Leber, der Milz und der Niere bestimmt. Die Ergebnisse, die in der Tabelle I gezeigt werden, beweisen die unterschiedliche Lokalisierung des Ambrosiagewächs-Antigens unterschiedlicher Molekulargrösse, wobei das RW stärker im Harn abgegeben wird und das HIiVZ-P-RW stärker in der Leber und der Milz und vermutlich in dem Reticuloendothelsystem lokalisiert wird. Das IjMW-P-RV/ zeigte eine längere Retention in dem Gefässystem und geringere Lokalisierung in entweder den Nieren oder dem Harn oder der Leber und der Milz als das RW bzw. HMW-P-RW.

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Tabelle I

Mit TCA ausfällbare Radioaktivität

RV

HMW-P-RW

Blut je ml
Harn je ml
Niere je g
Milz je g
Leber je g

18 Q'OO^C 34 000 91 800 27 200 36 400

16 730 3 600 16 700 34 600 65 400

4410

2500

3870

56 500

102 000

Die oben stehende Tabelle zeigt die Verteilung der Radioaktivität 10 Minuten nach einer intravenösen Injektion von 0,2 mg ^{Λ 25}J RW, ¹²⁵J LMW-P-RW und ¹²⁵J HPiW-P-EW.

Zählstösse je Minute. Sämtliche Tiere erhielten dabei dieselbe Anfangsanzahl von GPM.

Die Histamin-Preisetzung aus periphären Blutleukocyten von vier Ambrosiagewäehs-empfindlichen Spendern wird in der Tabelle II gezeigt.

- 17 4 0 9 8 4 8/1006

	bei]	Antigen	Antigen	.e II '	2422097	2x10 L	V 2x10-5	(ng/ml)	NDa
	Leukocythistamin-Freisetzung mit	EW				16	30	2x10~2 2x10 1	48
		LMW^-P-RW			gereinigtem Ambrosiagewächs-	• 16	13	46	32
		HMW-P-RW	und Polymeren	15	15	28	ND
		RW	Freigez	15	48	13	ND
T" a	Patient	LMW-P-RW		7	8	73	41
	1	HMW-P-RW		ND	7	32	ND
	RW	3etztes Histamin in %	17	26	16	ND
	LMW-P-RW	Antigen-Koiizentration	16	16	54	28
2	HMW-P-RW	2x10"5	ND	17	24	ND
	RW	16	20	34	17	ND
	LMW-P-RW	ND	12	16	71	ND
3	HMW-P-RW	ND	16	15 ·	34
	ND	17
	ND
4	ND
	ND
	ND
	ND
	16
	15
11

^aND - nickt durchgeführt

Ungefähr 1Ofache Abnahmen der Dosenreaktionen von Spender-Leukocyten gegenüber LMW-P-RW im Vergleich mit RW und gegenüber HMW-P-RW im Vergleich mit LMW-P-RW.

Die Endpunkte serienmässiger Titrationen bei 10facher Verdünnung mit RW, LMW-P-RW und HMW-P-RW werden in der Tabelle III gezeigt.

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Tabelle III

Auslösung yon Hautreaktionen in Prausnitz-Küstner-Hautbezirken mit drei Ambrosiagewächs-Präparaten unterschiedlicher Molekulargrösse

Verdünnung des

Ambrosiagewächs-

Präparates^a

10 10 10 10 10 10 10

Γ² —3 -4

-6

η -8

Ambrosiagewächs-Präparat, das für die

Auslösung einer Hautreaktion in

Prausnitz-Küstner-Bezirken verwendet wurde

RW	LMW-P-EW	HMW-P-EW
NDb	ND	++
ND	++++	++
ND	+++	0
+++	+	0
++	0	KD
+	0	KD
0	ND	ND

Unverdünnte Präparate enthielten 0,31 mg/ml
ND - nicht durchgeführt

Diese Ergebnisse zeigten, dass unterschiedliche Konzentrationen der RV/-, LMW-P-EW- und HMW-P-RW-Präparate benötigt wurden, um denselben Grad an Hautreaktion auszulösen. Das LMW-P-EW benötigte ungefähr 1QOmal so viel wie-RW und das HMW-P-EW ungefähr lOOmal so viel wie LMW-P-RW, um eine
Reaktion auszulösen.

Zunehmende Konzentrationen dieser Stoffe wurden mit einer

125
konstanten Menge J-Ambrosiagewächs-Antigen E vermischt, und die Gemische wurden dem in fester Phase vorliegenden lmmunoadsorbents zugesetzt, das mit IgE-Reaginantikörper gegen Aabrosiagewächs hergestellt worden war. Alle drei

125

Präparate inhibierten die Bindung des J-Ambrosiagewächs-Antigen E. Grössere Mengen an Π-IW-P-RW und HMW-P-BW als

- 19 -" 4098,48/1 00 6

3022

an EV wurden "benötigt, um den IgV-Antikörper gegen Ambrosiagewächs-ÄgE zu neutralisieren. Bei dem 50 %-Bindepunkt waren die ungefähren proportionalen Gewichtsmengen 10 ng RV, 30 ng LKV-P-RV und 70. ng HT¹IV-P-RV.

Die in vivo-Versuche mit radio-markiertem Antigen dreier Molekulargewichtsgrössenbereiche zeigten Ergebnisse, die

125 erwartet werden konnten. Die Verbreitung des ^J-RV aus der Haut nach intrakutaner Injektion erfolgte bedeutend rascher als bei jeder der beiden hochmolekularen Präparate. Das AgE-Monomere, welches das markierte Material in dem RV-Po lymer em darstellte, hatte ein Molekulargewicht von 37 800. Die Diffusion dieser Art aus einem Hautbezirk vermutlich in das intravsskuläre System hinein erfolgte rascher als die Diffusion der beiden polymerisierten Ambrosiagewächsstoffe mit Molekulargewichtsbereichen von ungefähr 0,2 bis 4- Killionen bzw. 4- bis 20 Millionen.

Das Verschwinden der drei Stoffe aus der Gefässkanmer war, was ihre Neigungen und die Dauer angeht, ähnlich, und unterschied sich aber hinsichtlich der Vege. Das hochmolekulare Material (HMV-P-RV) verschwand am raschesten, das RV als nächstes und das LMWI-P-RW wurde am längsten im Kreislauf zurückgehalten. Dies lässt sich durch die rasche Aufnahme des hochmolekularen Ambrosiagewächs-Materials durch die phagocytischen Zellen des Reticuloendothelsystems, die teilweise Eliminierung des RV durch die liiere und die Retention des LMV-P-RV im Kreislauf erklären, weil es weder im Harn so rasch wie RV ausgeschieden wurde oder von dem Reticuloendothel syst em ebenso rasch wie das HMW-P-RV aufgenommen wurde. Bestätigt wird diese Erklärung dieser Unterschiede hinsichtlich der Geschwindigkeiten, mit denen die Stoffe verschwinden, durch die stärkere Lokalisierung des RV " in der Hiere und im Harn und die stärkere Lokalisierung des HKV-P-RV in der Milz und Leber 10 Minuten nach einer intravenösen Injektion dieser Stoffe (Tabelle I). Die unterschiedlichen Mengen an

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5022 χ

dem RU, LMW-P-BW und HMW-P-EW, die benötigt wurden, um ungefähr denselben Grad an Histamin-Freisetzung zu erhalten, bewiesen, dass grössere Mengen des LMW-P-EW als des nichtpolymerisierten Ambrosiagewächs-Materials und dass mehr HMW-P-RW-Material als LMW-P-RW-Material benötigt wurden. Dies deutet darauf hin, dass die molare Konzentration des Antigens ein bestimmender Faktor-bei der Auslösung der Histamin-Freisetzung sein kann. Dieses Ergebnis ähnelt einem von Levine gezogenen Schluss, der fand, dass äquimoalre Konzentrationen und nicht gleiche Gewichtskonzentrationen zweiwertiger und mehrwertiger Penicillin-he.ptene in gleicher Weise wirksam bei der Auslösung von PCA-Reaktionen waren. Diese Beobachtungen scheinen vernünftig zu sein, da 1 Molekül Antigen E, gleichgültig wie hoch es polymerisiert ist, wahrscheinlich nur mit 1 Basophil reagieren kann.

Die Hautreaktionen, die sich infolge einer Injektion der unterschiedlichen Ämbrosiagewächs^APräparate in sensibilisierte Hautbezirke ergeben, laufen parallel den in vitro-Kistamin-Freisetzungsversuchen bezüglich der Forderung nach zunehmend grösseren Mengen an polymerisierten Ambrosiagewächs-Präparaten zur Auslösung desselben Grades der Hautreaktion. Die mögliche Erklärung für die Tatsache, dass sogar grössere Anteile an polymerisierten Ambrosiagewächs-Präparaten benötigt wurden, um Hautreaktionen statt Histamin-Freisetzung auszulösen, kann sowohl zu der molaren Konzentration des für die Auslösung der Histamin-Freisetzung benötigten Antigens als auch der Diffusionsgeschwindigkeit der grösseren Moleküle durch das Hautgewebe in Beziehung gesetzt werden. Das Molekulargewicht von AgE ist 37 800. Der Molekulargewichtsbereich des LMW-P-RW war 0,2 bis 4- Millionen und der Molekulargewichtsbereich des HMW-P-EW 4- Millionen bis 20 Millionen. Die herabgesetzte Diffusionsgeschwindigkeit der höhermolekularen Ambrosiagewächs-Präparate wurde bei Geldiffusionsreaktionen beobachtet und die Abnahme der Ausbreitung aus kutanem Injektionsbezirken.

- 21 409848/1006

Die polymerisierten RV-Präparate reagierten mit und neutralisierten IgE-Antikörper gegen Ambrosiagewächs-AgE. Diese Untersuchungen zeigten durch Inhibierung der Bindung von

^J-AgE, dass IgE-Antikörper gegen Ambrosiagewächs-Antigen E

mit RV und den P-RV-Präparaten reagierte. Die Erklärung für die Unterschiede in den Gewichtsverhältnissen von RV: LMV-P-RV: HMV-P-RV (ungefähr 1 ': 2 ; 3), die für die Neutralisierung von Kaninchen-Anti-AgE benötigt werden, und der Gewichtsverhältnisse dieser Stoffe, die für die Keutralisierung von IgE-Antikörper gegen AgE benötigt v/erden (ungefähr 1 : 3 : 7), ist unsicher; diese Unterschiede können aber der Tatsache zugeschrieben werden, dass bei den Kaninchen-Anti serumversuchen ein Fällungssystem und bei den IgE-Versuchen eine Versuchsanordnunp; einer primären in vitro-Bindung angewandt v/erden.

Die Ergebnisse der in diesem Bericht beschriebenen Untersuchungen beweisen, dass ein polymerisiertes Ambrosiagewächs-Präparat mit einem bedeutenden Anteil an Antigen E, dem Hauptantigen des Ambrosiagewächs-Blütenstaubs, bestimmte Merkmale aufweist. Zu diesen gehören: Vollständige Reaktionsfähigkeit des polymerisieren Ambrosiagewächs-Materials mit Antikörper gegen die monomere JForm, keine bedeutende Bildung oder Freisetzung neuer, entscheidender Antigen-Paktoren während der Polymerisation, Antigen-Aktivität, die mindestens so gross wie diejenige des natürlichen Antigens E ist, Reaktionsfähigkeit mit IgE-Antikörper und eine ausgeprägte Verminderung der Reaktionsfähigkeit auf Gewichtsbasis mit Zwischenträger freisetzenden Zellen, die sowohl durch in vitro-Histamin-Freisetzung als auch in vivo-Hautreaktionen nachgewiesen wurden. Die Ergebnisse weisen auf die potentielle Brauchbarkeit dieser Präparate für die Humanimmunotherapid mit Antigen E und möglicherweise anderen gereinigten Inhalationsantigenen hin. Diese potentielle Verwendbarkeit beruht auf der beständigen und wahrscheinlich erhöhten Antigen-Aktivität polymerisierter Ambrosiagewächs-

4 0 9 8 48/

3022

Präparate in Verbindung mit ihrer herabgesetzten Reaktionsfähigkeit mit sensibilisierten IgE-Mastzellen und ihrer herabgesetzten Geschwindigkeit der Absorption aus lokal injizierten Bezirken im Vergleich mit dem natürlichen Antigen E-Monomeren.

Es wurden die oben beschriebenen Untersuchungen an zwei polymerisierten Ambrosiagewächs-Antigen-Präparaten, die grosse Mengen an Ambrosiagewächs-Antigen E enthielten,durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Geschwindigkeit der Absorption der polymerisierten Stoffe aus Hautbezirken vermindert war. Das Verschwinden des Monomeren und der Polymeren aus de?¹ Gefässkammer war ebenfalls voneinander verschieden, wobei das Monomere am raschesten im Harn auftrat, das hochmolekulare Polymere in der Leber und der Milz und das niedermolekulare Polymere am längsten im Kreislauf zurückgehalten wurden. Die polymerisierten Ambrosiagewächs-Präparate lösten Histamin-Freisetzung aus periphären Humanblutleukocyten aus, verlangten aber beträchtlich höhere Konzentrationen für denselben Freisetzungsgrad. Eine sogar noch grössere Vergleichsdosis der polymerisierten Präparate war notwendig, um Hautreaktionsfähigkeit auszulösen. Die polymerisierten Ambrosiagewächs-Präparate reagierten mit und neutralisierten IgE-Antikörper gegen Ambrosiagewächs-Antigen E in vitro und verlangten dabei etwas unterschiedliche Gewichtsverhältnisse der polymerisierten Formen. Die Ergebnisse weisen Merkmale dieser Präparate nach, wie ihre Brauchbarkeit in der Immunotherapie von Ambrosiagevrächs-Keufieber.

- 23 -A 0 9.8 4 8/-1O 0 6.

Claims (4)

Pat entansprüche

1. Polymerisiertes Ambrosiagewächs-Antigen E.

2. Polymerisiertes Ambrosiagewächs-Antigen E gemäss Anspruch. 1 mit einem Molekulargewicht zwischen 200 und 20 000 000.

5- Polymerisiertes Ambrosiagewächs-Antigen E gemäss Anspruch 2 mit einem Molekulargewicht zwischen 200 000 und 4- 000 000.

4. Polymerisiertes Ambrosiagewächs-Antigen E gemäss Anspruch 2 mit einem Molekulargewicht zwischen 4 000 000/ und 20 000 000.

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