JP2002506080A - 植物源からウイルス、可溶性タンパク質及びペプチドを単離及び精製するための方法 - Google Patents

植物源からウイルス、可溶性タンパク質及びペプチドを単離及び精製するための方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、大規模に適用できる植物宿主からの関心のウイルス、タンパク質及びペプチドを単離及び精製するための方法に関する。更に、本発明は、先行技術に開示される方法より、関心のウイルス、タンパク質及びペプチドを単離するために効率よい方法を供する。一般に、関心のウイルス、タンパク質及びペプチドを単離する方法は、植物をホモジナイズしてグリーンジュースを作り出し、そのpHを調節してグリーンジュースを加熱し、遠心、再懸濁、及び限外ろ過の１又は複数のサイクルによりグリーンジュースの他の成分からウイルス又はタンパク質／ペプチドのいずれかの標的種を分離し、そして最後に、ＰＥＧ沈殿のような方法によりウイルス粒子を精製するか、又はクロマトグラフィー及び／又は塩沈殿のような方法によりタンパク質及びペプチドを精製することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、植物中で生産されたウイルス、可溶性タンパク質及びペプチドを単
離及び精製するための方法に関する。より詳しくは、本発明は、大規模に適用で
きる。
【０００２】 発明の背景 植物タンパク質及び酵素は、生きている食物源から生体触媒試薬又は治療剤ま
で多くの目的のために長期にわたり研究されている。過去数十年、トランスジェ
ニック及びトランスフェクトした植物の開発及び遺伝子分析における改良は、こ
れらの適用に対して一新された科学的重要性及び経済的インセンティブをもたら
している。植物系をバイオリアクターとして用いて組換え生物活性材料を作り出
す分子植物育種及び分子植物農業の概念は大きな注目を集めている。
【０００３】 文献における多くの例が、活性な哺乳動物タンパク質、酵素、ワクチン、抗体
、ペプチド及び他の生物活性種を作り出すための植物又は培養食物細胞の利用を
証明した。Maら（Science 268 : 716-719 (1995)) は、トランスジェニックタバ
コにおける機能的分泌イムノグロブリンの生産を最初に記述する。ネズミ抗体の
重鎖及び軽鎖、ネズミ連結鎖、及びウサギ分泌成分をコードする遺伝子が別個の
トランスジェニック植物に導入された。他家受粉を介して、全ての成分を同時発
現し、機能的に活性な分泌抗体を作り出す植物を得た。別の研究において、トラ
ンスジェニック植物においてウイルスタンパク質を発現することにより抗ウイル
スワクチンを生産するための方法が記載されている（Mason ら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 93 : 5335-5340 (1996)) 。ヒトにおいて流行性急性胃腸炎を引き
おこすウイルスであるＮｏｒｗａｌｋウイルスのキャプシドタンパク質は、トラ
ンスジェニックタバコ及びポテト内で発現した時にウイルス様粒子に自己アセン
ブルすることが示されている。精製されたウイルス様粒子及びトランスジェニッ
クポテト塊茎の両方は、マウスに与えた時に、Ｎｏｒｗａｌｋにウイルスキャプ
シドタンパク質に対する抗体の生産を刺激した。あるいは、ワクチンの生産及び
精製は、哺乳動物病原エピトープを有する植物ウイルスを操作することにより容
易にすることができる。植物ウイルスを用いることにより、ビルレントウイルス
のワクチンでの偶発的シェディング（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）が廃止され、同じ植物
ウイルスを用いていくつかの宿主にワクチン接種することができる。例えば、マ
ラリアのエピトープは、組換えタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の表面上に供
されている（Turpenら、BioTechnology 13 : 53-57 (1995))。選択されたＢ細胞
エピトープはＴＭＶコートタンパク質の表面ループ領域に挿入されるか、又はＣ
末端に融合された。感染後のタバコ植物は高タイターの組換えウイルスを含み、
それは、ワクチンサブユニットとして開発し、直ちにスケールアップすることが
できる。マメ科植物の栄養状態を改善することを目的とする別の研究において、
ヒマワリからの硫黄の豊富な種子アルブミンはトランスジェニックサブタレニア
ンクローバの葉において発現された（Khanら、Transgenic Res. 5 : 178-185 (1
996)) 。組換えタンパク質をトランスジェニック植物の葉の細胞の小胞体にター
ゲッティングすることにより、全抽出可能タンパク質の１．３％までのトランス
ジェニックヒマワリ種子アルブミンの蓄積を達成することができた。
【０００４】 植物ホストにおいて外来遺伝子材料を発現するための適切なベクターを開発す
る分野での研究も行った。Ａｈｌｑｕｉｓｔの米国特許４，８８５，２４８及び
米国特許５，１７３，４１０は、発現の目的のための植物宿主細胞に外来遺伝子
材料を移すのに役立ち得る転移ベクターの開発において行った予備的研究を記載
する。ハイブリッドＲＮＡウイルス及びＲＮＡ形質転換ベクターの更なる態様は
、それら全てが引用により本明細書に組み込まれるＡｈｌｑｕｉｓｔらの米国特
許５，４６６，７８８号、５，６０２，２４２号、５，６２７，０６０号及び５
，５００，３６０号に記載される。引用により本明細書に組み込まれるＤｏｎｓ
ｏｎらの米国特許５，３１６，９３１及び米国特許５，５８９，３６７は、最初
に、植物における外来遺伝子材料の全身的発現のために適した植物ウイルスベク
ターを示す。Ｄｏｎｓｏｎらは、外来遺伝子の全身的発現のための異種サブゲノ
ムプロモーターを有する植物ウイルスベクターを記載する。このような組換え植
物ウイルスベクターの利用性は、植物宿主内で組換えにより関心のタンパク質及
びペプチドを生産するのを容易にする。
【０００５】 植物遺伝学の詳しい方法が迅速に開発されており、本質的に全ての植物種の形
質転換及び広範囲の遺伝子の発現の許容を約束する。しかしながら、商業的分野
において広範囲の許容性を得るための植物ベースの分子交雑及び農業のために、
植物中で生産される生体活性種、タンパク質もしくはペプチド、特に組換えタン
パク質もしくはペプチド、又はウイルス粒子、特に遺伝子操作されたウイルスの
ためのコスト的に有効で大規模な精製システムを開発することが必要である。
【０００６】 植物からタンパク質、ペプチド及びウイルスを単離するためのいくつかの方法
が文献に記載されている（Ｊｏｈａｌ、米国特許４，４００，４７１、Ｊｏｈａ
ｌ、米国特許４，３３４，０２４、Ｗｉｌｄｍａｎら、米国特許４，２６８，６
３２、Ｗｉｌｄｍａｎら、米国特許４，２８９，１４７、Ｗｉｌｄｍａｎら、米
国特許４，３４７，３２４、Ｈｏｌｌｏら、米国特許３，６３７，３９６、Ｋｏ
ｃｈ、米国特許４，２３３，２１０、及びＫｏｃｈ、米国特許４，２５０，１９
７、これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる）。植物、例えばタバコ
、ホウレンソウ、ダイズ、及びアルファルファの水気の多い葉は、典型的には１
０〜２０％の固体から構成され、残りの画分は水である。その固体部分は、水溶
性及び水不溶性部分から構成され、ここで後者は主に葉の繊維状構造材料から主
に構成される。水溶性部分は、比較的低分子量（ＭＷ）のもの、例えば糖、ビタ
ミン、アルカロイド、香味物質、アミノ酸、及び比較的高ＭＷの他の化合物、例
えばネイティブ及び組換えタンパク質を含む。
【０００７】 植物バイオマスの可溶性部分中のタンパク質は、更に２つの画分に分けること
ができる。１つの画分は主に光合成タンパク質リブロース１，５−ジホスフェー
トカルボキラーゼ（又はＲｕＢｉｓＣｏ）を含み、そのサブユニットの分子量は
約５５０kDである。この画分は一般に、“Ｆｒａｃｔｉｏｎ １タンパク質”と
呼ばれる。ＲｕＢｉｓＣｏは葉の全タンパク質成分の２５％まで、葉の固体物質
の１０％までを含み、豊富である。他の画分は、サブユニットの分子量が典型的
には約３kD〜１００kDの範囲であるタンパク質及びペプチドの混合物、並びに糖
、ビタミン、アルカロイド、香味物質、アミノ酸を含む、他の化合物を含む。こ
の画分は集合的に“Ｆｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質”と呼ばれる。Ｆｒａｃｔ
ｉｏｎ ２タンパク質は、ネイティブ宿主材料、又はトランスフェクション又は
トランスジェニック形質転換を介して生産されたタンパク質及びペプチドを含む
組換え材料であり得る。トランスフェクトされた植物は、１，０００kDを超える
分子量を有するウイルス粒子も含み得る。
【０００８】 植物タンパク質を単離するための基本的な方法は、一般に、葉バイオマスを分
解し、得られたパルプをプレスして“グリーンジュース”を作り出すことで始ま
る。その方法は、典型的には、不要な酸化を抑えるために還元剤又は酸化防止剤
の存在下で行われる。種々のタンパク質成分及び細かく粒化した緑色色素の材料
を含むグリーンジュースはpHを調節され加熱される。調節後のグリーンジュース
についての典型的なpH域は５．３〜６．０である。この範囲は、Ｆｒａｃｔｉｏ
ｎ １タンパク質１又はリブロース１，５−ジホスフェートカルボキラーゼから
の単離のために最適化されている。緑色素材料の凝固を引きおこす加熱は、典型
的には５０℃近くに調節される。次にその凝固した緑色素材料は、中程度の遠心
により除去して“ブラウンジュース”を作り出すことができる。次に、ブラウン
ジュースは室温又はそれ未満に冷却され保存される。延長期間の、例えば２４時
間の後、リブロース１, ５−ジホスフェートカルボキラーゼはそのブラウンジュ
ースから結晶化される。結晶化したＦｒａｃｔｉｏｎ １タンパク質は、次に、
遠心によりその液体から分離することができる。Ｆｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク
質は、液体に残り、それらは４．５近くのpHまで更に酸化することにより精製す
ることができる。あるいは、ブラウンジュースからのリブロース１, ５−ジホス
フェートカルボキラーゼの結晶形成は、冷却のかわりに十分な量のポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）を加えることにより行うことができる。
【０００９】 ウイルス粒子を単離するための基本的方法は、Ｇｏｏｄｉｎｇら（Phytopatho
logical Note 57 : 1285 (1967) に記載され、その教示は引用により本明細書に
組み込まれる。大量に植物源からタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）を精製する
ために、感染した葉はホモジナイズされ、次にｎ−ブタノールが添加される。次
にその混合物は遠心され、ウイルスは上清に保持される。次にポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）は上清に添加され、次に遠心される。ウイルスは、得られたＰ
ＥＧペレットから回収することができる。ウイルスは、再懸濁、遠心及びＰＥＧ
沈殿の別のサイクルにより更に精製することができる。
【００１０】 しかしながら、植物ウイルス及び可溶性タンパク質及びペプチドを単離及び精
製するための存在するプロトコルには多くの問題が存在する。第１に、植物源か
らのタンパク質単離は、大部分がＦｒａｃｔｉｏｎ １タンパク質の回収のため
デザインされており、他の生物学的に活性を可溶性タンパク質成分のためでない
。Ｆ１タンパク質の大規模抽出のための以前の方法は、動物の飼料又は他の栄養
物質への添加物としてのタンパク質の生産のためであった。先行技術においてＦ
ｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質を得るための酸沈殿は有効でなく、なぜならほと
んどのタンパク質はペレット形態において変性するからである。これは、それら
が酸沈殿に基づき変性することに対してよりセンシティブであり得るので、組換
え核酸により生産されたタンパク質及びペプチドを単離するために特にやっかい
である。第２に、存在する分離の方法は、クロロプラスト腫フラグメント、色素
及び他の宿主関連材料を排除するための溶媒、例えばｎ−ブタノール、クロロホ
ルム、又は四塩化炭素の使用に依存する。小規模ウイルス精製のために有用かつ
有効であるが、大規模精製において溶媒を用いることは問題である。溶媒の処分
、可燃性の液体と適合した特別の装置デザイン、ガス抜き機構、及び労働者の露
出保護のような問題は頻繁に遭遇する。非溶媒ベースの小規模ウイルス精製法が
存在するが、装置及び処理限界及び最終産物純度のための大規模商用作業のため
に実用的でない（Brakke Adv. Virus. Res. 7 : 193-224 (1960)及びBrakkeらVi
rology 39 : 516-533 (1969)) 、最終的に、存在するプロトコルは、異なるウイ
ルス、タンパク質及びペプチドの単離及び精製を一般的な精製手順の最小の改変
で達成することができるようにストリームライン作業を許容しない。
【００１１】 ウイルス及び可溶性タンパク質単離及び精製のための有効な非変性及び溶媒限
定大規模法について当該技術分野で必要性がある。この必要性は植物宿主中で組
換え生産されたタンパク質及びペプチドを単離する場合に特に明らかである。こ
れらのタンパク質及びペプチドの特性はネイティブ植物タンパク質のものから頻
繁に異なる。先行技術のプロトコルは関心の組換えタンパク質及びペプチドを単
離するために適切でない。更に、植物からの組換えタンパク質及びペプチドの広
大な多様性並びに工業的及び医学的適用におけるこれらのタンパク質及びペプチ
ドのためのきびしく、純度の要求は、それらを単離及び精製するための効率よい
かつ経済的な手順を要求する。効率よいウイルス単離はトランスフェクションベ
クター及びワクチンとしてのウイルスの利用性のためかなり重要なものでもある
。特定の状況において、関心のタンパク質及びペプチドは、その関心のタンパク
質又はペプチドがウイルス自体を単離することを実際に含み得るように、ウイル
スに付着し得、又はネイティブウイルスタンパク質に組み込まれ得る（融合タン
パク質）。
【００１２】 発明の概要 本発明は、大規模に適用できる、植物宿主から関心のウイルス、タンパク質及
びペプチドを単離及び精製するための方法を特徴とする。更に、本発明は、先行
技術に記載される方法より関心のウイルス、タンパク質及びペプチドを単離する
ために効率よい方法を供する。
【００１３】 一般に、関心のウイルス、タンパク質及びペプチドを単離する本方法は、植物
をホモジナイズしてグリーンジュースを作り出し、該グリーンジュースのpHを調
節してそれを加熱し、遠心、再懸濁及び限外ろ過の１又は複数のサイクルにより
グリーンジュースの他の成分からウイルス又はタンパク質１ペプチドのいずれか
の標的種を分離し、そして最後に、ＰＥＧ沈殿のような手順によりウイルス粒子
を精製するか、又はクロマトグラフィー、例えばアフィニティーベースの方法、
及び／又は塩沈殿のような手順によりタンパク質及びペプチドを精製するステッ
プを含む。
【００１４】 一実施形態において、グリーンジュースは、pHを約４．０〜５．２の間の値に
調節され、最少約１分で約４５〜５０℃の温度に加熱される。次にこの混合物は
遠心にかけられる。それにより生産された上清は、トランスフェクトしたならウ
イルス及び組換え産物を含むＦｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質を含む。Ｆｒａｃ
ｔｉｏｎ ２タンパク質は、適度の遠心によりペレット化したＦｒａｃｔｉｏｎ
１タンパク質及び他の宿主材料から分離することができる。次に、ウイルス粒
子及びＦｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質は、一連の限外ろ過、クロマトグラフィ
ー、塩沈殿、及び当該技術分野で公知である他の方法、例えばアフィニティープ
ロトコルにより更に精製することができる。本発明の主な利点の１つは、先行技
術の方法ではできない。Ｆｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質を限外ろ過にかけるこ
とができることである。
【００１５】 第２の実施形態において、pH及び熱処理の後、ウイルス、Ｆｒａｃｔｉｏｎ
１タンパク質及び他の宿主材料を含む遠心からのペレットは水又は緩衝液に再度
懸濁されて約５．０〜８．０のpHに調節される。その混合物は２回目の遠心にか
けられる。再度の懸濁は２回目の遠心後にウイルスの大部分を上清に残し、得ら
れたペレット中にＦｒａｃｔｉｏｎ １タンパク質及び他の宿主材料を見い出す
ことができる。ウイルス粒子は、ＰＥＧ沈殿又は必要に応じてＰＥＧ沈殿の前の
限外ろ過により更に精製することができる。
【００１６】 第３の実施形態において、ウイルスのコートタンパク質は融合タンパク質であ
る。ここで関心の組換えタンパク質又はペプチドはウイルスのコートタンパク質
と共に組み込まれる。複製の間又はウイルス単離及び精製の過程の間、そのコー
トタンパク質はウイルスゲノム自体から脱離するか、又は非アセンブルウイルス
コートタンパク質として蓄積し、又はそのコート様式は組み込まれ得ない。pHを
調節し加熱したグリーンジュースの遠心の後、ペレットはウイルス、非アセンブ
ル融合タンパク質、Ｆｒａｃｔｉｏｎ １タンパク質、及び他の宿主材料を含み
得る。次にそのペレットは水又は緩衝液に再度懸濁されて約２．０〜４．０のpH
に調節され、次に２回目の遠心にかけられる。そのタンパク質は、生じた上清中
にあるであろう。非アセンブルタンパク質は、限外ろ過、塩沈殿、アフィニティ
ー分離及びクロマトグラフィーを含む慣用的な方法に従って更に精製することが
できる。関心のペプチド又はタンパク質は、融合タンパク質の化学的開裂によっ
て得ることができる。このような手順は当業者に公知である。
【００１７】 第４の実施形態において、植物からの糖、ビタミン、アルカロイド、香味物質
及びアミノ酸は、慣用的に単離及び精製することもできる。pHを調節し、加熱し
たグリーンジュースの遠心の後、上清はＦｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質、ウイ
ルス及び他の材料、例えば糖、ビタミン、アルカロイド及び香味物質を含む。そ
れにより作られた上清は、ペレット化したＦｒａｃｔｉｏｎ １タンパク質及び
他の宿主材料から適度で遠心により分離することができる。次に、糖、ビタミン
、アルカロイド、及び香味物質は、当該技術分野で公知である限外ろ過及び他の
材料を含む一連の方法により更に精製することができる。
【００１８】 第５の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の方法により得られる関
心のウイルス、タンパク質、ペプチド、糖、ビタミン、アルカロイド、及び香味
物質に関する。 発明の詳細な記載 本発明は、植物宿主から関心のウイルス、タンパク質及びペプチドを単離及び
精製するための新規方法に関する。更に、本発明は、先行技術に記載される方法
より関心のウイルス、タンパク質及びペプチドを単離するために効率よい方法を
供する。更に、その方法は大規模生産に適用できる。
【００１９】 一般に、関心のウイルス、タンパク質及びペプチドを単離する本方法は、植物
をホモジナイズしてグリーンジュースを生産し、該グリーンジュースのpHを調節
してそれを加熱し、遠心、再懸濁、及び限外ろ過の１又は複数のサイクルにより
該グリーンジュースの他の成分からウイルス又はタンパク質／ペプチドのいずれ
かの標的を分離し、そして最後にＰＥＧ沈殿のような手順によりウイルス粒子を
精製し又はクロマトグラフィー、例えばアフィニティー分離、及び／又は塩沈殿
のような手順によりタンパク質及びペプチドを精製するステップを含む。
【００２０】 本発明の実例を図１に示す。しかしながら、この図は単に本発明を見やすくす
ることを意図したものであり、そこに示される見かけの手順又は順番を限定する
ものとして解釈すべきでない。本明細書に開示される手順及び条件と機能的に等
しい本発明のいずれの改変も本発明の範囲内にある。 本方法の最初のステップは、対象の植物をホモジナイズすることに関する。植
物の葉は、利用できるいずれかの好適な機械又は方法を用いて分解することがで
きる。例えば、小規模のためのＷａｒｉｎｇブレンダー又は大規模のためのＲｅ
ｉｔｚディスインテグレーターを、本発明の特定の実施形態に上手く用いること
ができる。ホモジナイズした混合物は、次に、利用できるいずれかの適切な機械
又は方法を用いてプレスすることができる。例えば、大規模のためのスクリュー
プレス及び小規模のチーズクロスは、本発明の特定の実施形態において上手く用
いられている。そのホモジナイズステップは、不要な酸化を抑制するために適切
な還元剤又は酸化剤の存在下で行うことができる。ナトリウムメタビスルファイ
ト（Ｎａ2 Ｓ2 Ｏ5 ）は、本発明の特定の実施形態において上手く用いられる。
ウイルス及び可溶性タンパク質／ペプチドを単離及び精製するための次のステッ
プは、一般に以下の手順に従って行うことができる。
【００２１】 グリーンジュースのpH調節及び熱処理 本発明によれば、最初のグリーンジュースのpHは、５．２未満又はそれに等し
い値に調節され、次に約４５℃の最小温度に加熱される。本発明の好ましい実施
形態において、グリーンジュースは約４．０〜５．２のpHに調節され、次に約４
５〜５０℃の温度に最小１分、加熱される。本発明の特定の実施形態において、
１０〜１５分の熱処理が上手く用いられている。当業者は、熱処理のために割り
当てられる時間が要求される種の回収に依存して多様であろうことを直ちに認め
るであろう。それゆえ、pH調節の後、加熱時間は約１分〜１５分超で多様であり
得る。熱はいずれかの適切な様式で適用することができ、本発明はこの点で限定
するつもりはない。当業者は、pHが、当該技術分野で公知である多くの適切な酸
又は塩基を用いて調節することができることを認めるであろう。本発明の特定の
実施形態において、リン酸が有効であることが判明している。グリーンジュース
のpHは、後の遠心の間の上清又はペレット中のウイルス、タンパク質及びペプチ
ドの分布に影響を与える。標的種のための最適値は、小規模で関心のウイルス及
び／又はタンパク質もしくはペプチドの単離及び精製をテストすることにより得
ることができる。非ウイルス精製について文献に以前に記載される方法はグリー
ンジュースのpHを５．３〜６．０の値に調節し、約４８〜５２℃の温度の熱処理
を用いる。
【００２２】 熱処理しpH調節したグリーンジュースはグリーンジュースのpHが、後の遠心の
間の上清又はペレット中ウイルス、タンパク質及びペプチドの分布に影響を与え
る点で全く特有である。関心の種により、グリーンジュースのpHは、ウイルス粒
子又はタンパク質及びペプチドのいずれかの要求される産物の単離及び精製を容
易にするために直ちに制御することができる。これにより、異なるウイルス並び
にタンパク質及びペプチドの単離及び精製を、一般的な精製手順の小さな改良で
最適化することができるようにストリームライン化作業を供する。このような改
変は、当業者の慣用的な技術の範囲内にあり、過度な実験を要求しない。グリー
ンジュースの特有の特徴は、それを、以下に記載の種々の精製ステップで処理す
ることを可能にすることである。
【００２３】 グリーンジュースの遠心 次に、pH−及び熱−処理グリーンジュースは遠心にかけることができる。当業
者は、時間間隔及びＧ−フォースを含む遠心のための好適な条件を直ちに決定す
ることができる。遠心は上清画分中に要求される標的種を保持させたまま、Ｆｒ
ａｃｔｉｏｎ 1 タンパク質、クロロプラスト及び他の宿主材料の実質的に全て
をペレット化するのに十分なＧ−フォース及び時間、又はＦｒａｃｔｉｏｎ 1
タンパク質、クロロプラスト及び他の宿主材料と共に標的種をペレット化するた
めに十分な速度及び時間のものであるべきである。例えば、２分の３０００×Ｇ
又は３分の６０００×Ｇの遠心が本発明の特定の実施形態においてグリーンジュ
ースに適用されている。本発明によれば、Ｆｒａｃｔｉｏｎ 1 タンパク質、非
アセンブル融合タンパク質及びペプチド、クロロプラスト並びに他の宿主材料の
大部分は遠心によりペレット化し（Ｐ１）、組換えタンパク質及びペプチドを含
むＦｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質は、一般に、この遠心後に上清に残る（Ｓ１
）。しかしながら、ウイルスは、とりわけ、グリーンジュースのpH、ウイルス種
、ウイルス核酸構成物、植物種、植物の年齢：及び植物のソースに依存して、遠
心後にペレットと上清との間を仕切ることがある。低いpH、好ましくは約５．０
未満のpHで、ウイルスは主にペレット（Ｐ１）に保持される。約５．０〜５．２
のpHでウイルスは上清（Ｓ１）に存在する。関心の種により、グリーンジュース
のpH及び次の遠心条件は、ウイルス粒子又はタンパク質及びペプチドの要求され
る産物の単離及び精製を容易にするために直ちに調製することができる。これに
より、本方法は、異なるウイルス並びにタンパク質及びペプチドの単離及び精製
を、一般的な精製手順の小さな改変で行うことができるようにストリームライン
化作業を供する。ここでその改変は、当業者に過度の実験を要求しない。
【００２４】 pH調節緩衝液中のペレットの再懸濁 pHを調節し加熱したグリーンジュースの遠心により得られたペレットは、典型
的には、Ｆｒａｃｔｉｏｎ １タンパク質、非アセンブル融合タンパク質及びペ
プチド、ウイルス、及び他の宿主材料を含む。それは、水、 又は要求されるpH域
又はその範囲に調節されたpHを有する緩衝液に再度懸濁することができる。その
至適pHは、関心の最終的な種により決定される。特定の好ましい実施形態におい
て、再懸濁液のpH域は、ウイルス粒子を単離及び精製するために約５．０〜８．
０である（図１を参照のこと）。他の実施形態において、再懸濁液のpH域は、要
求される産物が融合タンパク質／ペプチドであるなら、約２．０〜４．０である
（図１を参照のこと）。当業者は、過度の実験を行うことなく計画したpH域を達
成するために適切な緩衝液又は酸もしくは塩基を直ちに選択することができる。
最初の遠心手順の結果として形成されたペレットの固体の割合により、再懸濁液
の容量は出発グリーンジュース容量の画分、典型的にはもとのグリーンジュース
容量の１０〜１００倍の量に調節することができる。
【００２５】 ウイルスの単離及び精製 ウイルスは、ペレット（Ｐ１）のみ、上清（Ｓ１）、又は上清（Ｓ１）及びペ
レット（Ｐ１）の両方のいずれかから、pH及びウイルス分画の程度に依存してグ
リーンジュースの遠心後に回収することができる。 グリーンジュースのpHを低い値、例えば約４．０に調節する場合、ウイルスは
、一般に、グリーンジュースの遠心後にＦｒａｃｔｉｏｎ １タンパク質、クロ
ロプラスト及び他の宿主材料と一緒にペレット中に定量的に保持される（図１を
参照のこと）。約５．０から８．０のpHを有する溶液中での再懸濁の後、その混
合物は、別の遠心ステップにかけることができる。ウイルス粒子は主に上清（Ｓ
２）に保持され、そのペレット中のＦｒａｃｔｉｏｎ １タンパク質、クロロプ
ラストフラグメント及び他の宿主材料から分離することができる。通常、出発の
グリーンジュースの約５〜１０％だけがＳ２にある。次にウイルスを含む上清は
、限外ろ過することができ、これは、必要に応じて、当業者に知られた限外ろ過
技術のいずれか１つに従って約１〜５００kDの範囲の膜の分子量カットオフ（Ｍ
ＷＣＯ）を用いる。例えば、１００kD ＭＷＣＯ膜は、より小さなタンパク質成
分にフィルターを通過させながら、その濃縮物中にウイルス粒子を保持するため
に本発明の特定の実施形態に上手く用いられている。限外ろ過ステップは、その
プロセスの容量を実質的に更に減少させる。特定の実施形態において、１〜３０
倍又はそれ超のプロセス容量の更なる減少を得ることができる。限外ろ過又は遠
心から、ウイルスの最終的精製は、ＰＥＧ沈殿、遠心、再懸濁、及びクラリフィ
ケーションのような先行技術の方法により行うことができる。
【００２６】 本発明の特定の実施形態において、ウイルス粒子は、グリーンジュースの遠心
の後、上清（Ｓ１）から得ることもできる。この上清画分は、Ｆｒａｃｔｉｏｎ
２タンパク質及びペプチドを通常、含む（図１を参照のこと）。本発明の特定
の実施形態において、グリーンジュースのpHは約５．０〜５．２、好ましくは約
pH５．０の値に調節することができる。次に、ウイルス粒子の大部分は、グリー
ンジュースの遠心の後、ペレット（Ｐ１）に加えて上清（Ｓ１）から回収するこ
とができる。ウイルスを含む上清は、必要に応じて、当業者に知られた限外ろ過
及びディアフィルトレーション技術のいずれか１つに従って、約１〜５００kDの
範囲の分子量カットオフ膜を用いてディアフィルトレーションを含む限外ろ過す
ることができる。例えば、１００kD ＭＷＣＯ膜は、より小さなタンパク質成分
、例えばＦｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質にフィルターを通過させながら、濃縮
物中にウイルス粒子を保持するために本発明の特定の実施形態で上手く用いられ
ている。限外ろ過ステップは、プロセス容量を実質的に更に減少させる。限外ろ
過又は遠心から、ウイルスの最終精製は、ＰＥＧ沈殿、遠心、再懸濁、及びクラ
リフィケーションのような先行技術の方法により行うことができる。
【００２７】 本明細書に記載される方法に従う単離及び精製手順は、３つのタバコ種（Ｋｙ
８９５９，Ｔｎ８６及びＭＤ６０９）及びニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎｉｃｏ
ｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）からＴＭＶベースのウイルスを単離する
ために用いられている。ＴＭＶ２０４（野生型、配列番号：１）、ＴＭＶ２６１
（コートタンパク質リードスルー、配列番号：２）、ＴＭＶ２９１（コートタン
パク質ループ融合、配列番号：３）、ＴＭＶ８１１（配列番号：４）及びＴＭＶ
８６１（コートタンパク質リードスルー、配列番号：５）を含むいくつかのＴＭ
Ｖベースのウイルスが得られている。ＴＭＶ２６１及びＴＭＶ２９１は、特定の
単離手順の間、不安定であることが示されているが、これらのウイルスベクター
は、単に本発明により回収することができるウイルスの例として用いられ、本発
明の範囲を限定することを意図しない。当業者は、他のウイルスを回収するため
に本発明を用いることができよう。関心のウイルスは、ポティウイルス、トバモ
ウイルス、ブロモウイルス、カルモウイルス、ルテオウイルス、マラフィウイル
ス、ＭＣＤＶ群、ネクロウイルス、ＰＹＦＶ群、ソベモウイルス、トムブスウイ
ルス、ティモウイルス、カピロウイルス、クロステロウイルス、カルラウイルス
、ポテックスウイルス、コモウイルス、ディアンソウイルス、ファバウイルス、
ネポウイルス、ＰＥＭＶ、フロウイルス、トブラウイルス、ＡＭＶ、テヌイウイ
ルス、イネ壊疽ウイルス、カリモウイルス、ジェミニウイルス、レオウイルス、
コメリナイエローモットウイルス郡及びクリプトウイルス、ラボウイルス（Ｒｈ
ａｂｏｖｉｒｕｓ）又はブニアウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ）であり得る。
【００２８】 ウイルス粒子を単離及び精製する本方法は、先行技術の方法に優る大きな利点
を供する。それらは、ウイルス含有上清（Ｓ１及び／又はＳ２）の限外ろ過を許
容し、それはプロセッシング容量を大きく減少させ、糖、アルカロイド、香味物
質、及び色素並びにＦｒａｃｔｉｏｎ １及び２タンパク質のような植物成分を
除去する。要求されるウイルス粒子は微粒子として豊富にすることができる。こ
れにより、ウイルス粒子の濃縮及び精製は迅速かつ有効である。
【００２９】 可溶性タンパク質及びペプチドの単離及び精製 組換えタンパク質及びペプチドを含むＦｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質は、pH
調節及び熱処理並びにグリーンジュースの遠心の後に可溶性である（図１を参照
のこと）。Ｆｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質含有上清は、限外ろ過、濃縮及びデ
ィアフィルトレーションによるサイズ分画を用いて、Ｆｒａｃｔｉｏｎ ２タン
パク質、特に組換えタンパク質及びペプチドの効率より単離及び精製を可能にす
るのに十分なＦｒａｃｔｉｏｎ １タンパク質、クロロプラスト及び他の宿主材
料を除去した。限外ろ過は、典型的には、当該技術分野で公知の方法に従って約
１〜５００kDの範囲のＭＷＣＯ膜を用いて行われる。本発明の特定の実施形態に
おいて、残留ウイルス及び他の宿主材料をろ過して除くために大きなＭＷＣＯ膜
が最初に用いられる。大きな分子量成分は濃縮物中に保持され得る。関心のタン
パク質／ペプチドを含むろ液は、任意に、標的化合物を濃縮物中に収集すること
ができるように、別の限外ろ過膜、典型的にはより小さなＭＷＣＯを通過させる
ことができる。限外ろ過の更なるサイクルは、必要に応じて標的化合物の純度を
改変するために行うことができる。ＭＷＣＯサイズ及び限外ろ過条件の選択は標
的化合物の大きさに依存し、当業者に明らかなバリエーションである。限外ろ過
ステップは、一般に、約１０〜３０倍又はそれ超のプロセス容量、減少させ、デ
ィアフィルトレーションが不要な分子種を更に除去するのを許容する。最後に、
関心のタンパク質又はペプチドは、標準的手順、例えばクロマトグラフィー、塩
沈殿、溶媒抽出、例えば超臨界流体、例えばＣＯ2 及び当業者に知られた別の方
法を用いて精製することができる。
【００３０】 本単離法は、分泌ＩｇＡ抗体及びα−トリコサンチンを上手く単離及び濃縮す
るために用いられている。本発明は、関心のペプチド又はタンパク質が、ＩＬ−
１，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−８
，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２，ＥＰＯ，Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ
−ＣＳＦ，ｈＰＧ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ、第ＶIII 因子、第IX因子、ｔＰＡ、レ
セプター、レセプターアンタゴニスト、抗体、一本鎖抗体、酵素、ニューロペプ
チド、インスリン、抗原、ワクチン、ペプチドホルモン、カルシトニン、及びヒ
ト成長ホルモンからなる群から選択される実施形態を包含することも特に意図す
る。なお別の実施形態において、関心の可溶性タンパク質又はペプチドは、プロ
テグリン、マガイニン、セクロピン、メリトチン、インドリシジン、デフェンシ
ン、β−デフェンシン、クリプトジン、クラバイニン、植物デフェンシン、ニシ
ン及びバクテネシンであり得る。これら並びに関心の他のタンパク質及びペプチ
ドは、自然に生産され得、又は植物中で組換え法により生産され得る。
【００３１】 Ｆｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質を単離及び精製する本方法は、先行技術の方
法から大きな利点を供する。第１に、それはＦ２タンパク質の酸沈殿を要求しな
い。先行技術における酸沈殿は、多くのタンパク質が変性し、又は酵素もしくは
生物活性を失うことがあるので要求されない。本発明の組換えタンパク質及びペ
プチドを含むＦｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質はペレット形態で保持されず、そ
れゆえタンパク質変性の危険を最小限にする。それにより、本方法は関心のタン
パク質及びペプチドの変性を最小にする。第２に、より豊富な成分であるＦｒａ
ｃｔｉｏｎ １タンパク質が精製の早期の段階で除去されるので、下流のプロセ
スでＦｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質の限外ろ過を許容する。Ｆｒａｃｔｉｏｎ
２タンパク質の限外ろ過は、プロセス容量を大きく減少させ、タンパク質及び
ペプチドの迅速な濃縮及び精製を許容する。要求されるタンパク質及びペプチド
は、分子量により豊富にすることができる。迅速な濃縮及び精製は、内在性プロ
テアーゼ活性による分解又は変性も削除し又は排除する。Ｆｒａｃｔｉｏｎ ２
タンパク質の限外ろ過は先行技術の方法に適用できない。最後に、組換えタンパ
ク質及びペプチドを含むＦｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質の濃縮は溶媒も更なる
化学物質も必要としない。先行技術の植物タンパク質及びペプチド単離手順は、
頻繁に、クロロプラスト膜フラグメント、色素及び他の宿主関連材料を排除する
ためにｎ−ブタノール、クロロホルム及び四塩化炭素のような溶媒を用いる。こ
のような方法は大きな商業的に価値のあるスケールで容易に行われず、なぜなら
これらの方法は、安全性及び溶媒廃棄の問題を供し、それらはしばしば、可燃性
流体に適合した特別の装置のデザインを要求し、従って施設の換気及び作業者の
保護装置を供することを要求するからである。
【００３２】 非アセンブル融合タンパク質及び融合ペプチドの単離及び精製 ウイルス複製の間又はウイルスを単離及び精製する過程の間、そのコートタン
パク質は、ウイルスゲノム自体から脱離されるか、又は非アセンブルウイルスコ
ートタンパク質として蓄積し、又はコートタンパク質は組み込まれない。当業者
は、コートタンパク質が、複数の生化学的特徴を有するタンパク質の商業的回収
のために意図的にアセンブルされないための確立された組換え核酸プロトコルを
介してデザインすることができることを認めることができる。このコートタンパ
ク質は、ネイティブコートタンパク質が組み込まれた組換え成分、又は融合タン
パク質を含み得る。これらの非アセンブル融合タンパク質は、典型的には、pHを
調節した加熱したグリーンジュースの遠心の後、Ｆｒａｃｔｉｏｎ １タンパク
質とペレット（Ｐ１）において同時に分離する（図１を参照のこと）。次にその
ペレットは、約２．０〜４．０の範囲のpH値の水又は緩衝液中に再度懸濁され次
に別の遠心にかけられる。非アセンブルタンパク質は、一連の限外ろ過、遠心及
びクロマトグラフィーステップを含む慣用的な方法に従って更に精製することが
できる。融合タンパク質を得た後、その融合ペプチド（融合タンパク質）からの
要求されるペプチド又はタンパク質の化学的開裂が行われる。このような手順は
当業者に公知である。
【００３３】 本単離手順は、α−アミラーゼ−インドリシジン融合タンパク質を上手く単離
及び濃縮するために用いられている。本発明は、融合タンパク質又はペプチドが
ＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，Ｉ
Ｌ−８，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２，ＥＰＯ，Ｇ−ＣＳＦ
，ＧＭ−ＣＳＦ，ｈＰＧ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ、第ＶIII 因子、第IX因子、ｔＰ
Ａ、レセプター、レセプターアンタゴニスト、抗体、一本鎖抗体、酵素、ニュー
ロポリペプチド、インスリン、抗原、ワクチン、ペプチドホルモン、カルシトニ
ン、及びヒト成長ホルモンからなる群から選択されるペプチド又はタンパク質を
含み得る。更に他の実施形態において、融合タンパク質又はペプチド中に存在す
るタンパク質又はペプチドは、プロテグリン、マガイニン、セクロピン、メリト
チン、インドリシジン、デフェンシン、β−デフェンシン、クリプトジン、クラ
バイニン、植物デフェンシン、ニシン及びバクテネシンからなる抗微生物ペプチ
ド又はタンパク質であり得る。
【００３４】 糖、ビタミン、アルカロイド及び香味物質の単離及び精製 植物からの糖、ビタミン、アルカロイド、香味物質、アミノ酸も、本発明の方
法を用いて便利に単離及び精製することができる。pHを調節した加熱したグリー
ンジュースの遠心の後、上清はＦｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質、ウイルス及び
他の材料、例えば糖、ビタミン、アルカロイド、及び香味物質を含むそれにより
生産された上清は、遠心によりペレット化Ｆｒａｃｔｉｏｎ １タンパク質及び
他の宿主材料から分離することができる。次に、糖、ビタミン、アルカロイド、
香味物質は、一連の低分子量カットオフ限外ろ過及び当該技術分野で公知できる
別の方法により更に精製することができる。
【００３５】 定義 本明細書に供される範囲を含む、明細書及び請求の範囲の明確かつ一貫した理
解を供するため、以下の定義を供する： “ウイルス”は、本明細書において、１又は複数のウイルス構造タンパク質と
組み合わせて感染性核酸配列を含んでいるビリオン；１又は複数のウイルス構造
タンパク質と組み合わせて非感染性核酸を含んでいる非感染性ビリオン；及び核
酸配列が存在しないか又は凝集体と組み合わせたウイルス構造タンパク質の凝集
体からなる群を含むと定義され、ここでその凝集体はウイルス様粒子（ＶＬＰｓ
）を含み得る。前記ウイルスは、天然のものでも組換え核酸技術から得られたも
のでもよく、植物全体、植物組織又は植物細胞中での複製のため、デザインによ
るか選択によるかにかかわらず、適合し得るいずれのウイルス由来核酸も含む。
【００３６】 “ウイルス集団”は、本明細書において、上述の１又は複数のウイルスを含む
として定義され、ウイルス集団は、ウイルスの同種選択からなるか、又はウイル
ス集団は前記ウイルスのいずれかの組合せ及び割合を含む異種選択からなる。 “ウイルス様粒子”（ＶＰＬｓ）は、自己アセンブル構造タンパク質として本
明細書において定義され、ここでその構造タンパク質は１又は複数の核酸配列に
よりコードされ、ここで前記核酸配列は宿主ウイルスベクターのゲノムに挿入さ
れる。
【００３７】 “タンパク質”及びペプチドは、天然のタンパク質及びペプチド又はトランス
フェクションもしくはトランスジェニック形質転換を介して生産されたタンパク
質及びペプチドとして定義される。 実施例 以下の例は本発明を更に記述する。これらの例は単に本発明を詳述することを
意図し、限定するものとして解釈すべきでない。例は、特に、本発明の範囲内の
方法を用いて得ることができる関心のウイルス、タンパク質及びペプチドの回収
を示すことを意図する。
【００３８】 実施例１ 低pHでグリーンジュースからペレット化されたＦｒａｃｔｉｏｎ １タンパク 質 品種ＭＤ６０９のタバコ植物に、種子をまいた後２７日に、ＴＭＶ８１１を接
種した。接種後４０日に植物を収集した。葉及び茎組織（１５０ｇ）をＩ−Ｌ
Ｗａｒｉｎｇブレンダー中０．０４％のナトリウムメタビスルファイト溶液（１
５０mL）と組み合わせた。植物組織を２分、高速で粉砕した。得られたホモジネ
ートをチーズクロスの４つの層に通し、プレスした繊維を捨てた。収集したジュ
ースの容量は２４０mLであり、そのpHは５．５７であった。
【００３９】 絶えず撹拌しながら、そのpHを希リン酸（Ｈ3 ＰＯ4 ）で下げるようゆっくり
と調節した。ジュースサンプル（３５mL）を次のpH値：pH５．４，pH５．３，pH
５．２，pH５．１及びpH５．０の各々で除去した。次に全てのサンプルを水浴中
４５℃に加熱し、この温度を１０分、維持した。次にサンプルを冷水浴中２５℃
に冷却した。その冷却したサンプルを１５分、１０，０００×Ｇで遠心した。
【００４０】 上清（図１中Ｓ１）をデカントし、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ及びＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによりＦｒａｃｔｉｏｎ １タンパク質レベルについて分析した。ウイル
スをＰＥＧ沈殿させ、Ｇｏｏｄｉｎｇ、前掲の方法により各々の上清の一部（２
５mL）から単離した。ワクチン濃度を２６０nmでの分光光度分析により決定した
。
【００４１】
【表１】
【００４２】 結果： Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法により決定した全タンパク質は、グリーンジュースの
pHを５．４から５．０に下げた時に遠心を次第に減少させた後に、Ｂｒａｄｆｏ
ｒｄの方法により決定して可溶性部分（Ｓ１）中に保持された。特に、グリーン
ジュースのpH５．０、次の１０分、４５℃の熱処理（“pH５．０／４５℃プロセ
ス”と呼ぶ）で、Ｓ１に残ったＦｒａｃｔｉｏｎ １タンパク質の量はpH５．５
／４５℃プロセスと比べて５倍の減少を示す。より多くのＦｒａｃｔｉｏｎ １
タンパク質がグリーンジュースの低pH値でペレット化する。しかしながら、Ｓ１
中のウイルスの溶解度は影響を受けない。
【００４３】 以下の例は、Ｆｒａｃｔｉｏｎ １タンパク質はこのpH域でペレット化するか
、Ｆｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質の大部分は上清に残ることも示す。可溶性植
物タンパク質を単離する慣用的な方法は、遠心後にＦｒａｃｔｉｏｎ １タンパ
ク質を上清に向かわせる５．３〜６．０の範囲にグリーンジュースのpHを調節す
る。グリーンジュースの５．２未満の値へのpH調節、次のこの手順での適度な加
熱は、これにより、グリーンジュースの遠心に基づくＦｒａｃｔｉｏｎ １及び
Ｆｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質の分離を許容する。可溶性タンパク質からの豊
富なＦｒａｃｔｉｏｎ １タンパク質の除去は後のＦｒａｃｔｉｏｎ ２タンパ
ク質の単離及び精製を容易にする。限外ろ過法は、現在、Ｆｒａｃｔｉｏｎ ２
タンパク質の精製に上手く適用することができる。これは、先行技術に優る認め
られる利点であり、Ｆｒａｃｔｉｏｎ １タンパク質は、最終的な結晶化又は沈
殿まで可溶性部分に保持される。大量のＦｒａｃｔｉｏｎ １タンパク質及び他
の宿主材料の存在下での限外ろ過は有効ではない。
【００４４】 実施例２ 異なるpH値でのグリーンジュースからのウイルスの分布 温室中で成長させたニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃ
ｕｍ）（ＫＹ８９５９）に、種子の発芽後７週目に、ＴＭＶ誘導体（コートタン
パク質ループ融合体）、ＴＭＶ２９１を接種した。ウイルスが全身に広がった後
の接種後２週半で植物を収集した。葉及び茎組織（１５０ｇ）を２分、０．０４
％Ｎａ2 Ｓ2 Ｏ5 （１５０mL）と共に高設定で１リッターＷａｒｉｎｇブレンダ
ーに浸してやわらかくした（ｍａｃｅｒａｔｅ）。そのやわらかくした材料をチ
ーズクロスの４層を介して染色して繊維状材料を除去した。残ったグリーンジュ
ースをＨ3 ＰＯ4 で５．０，４．８，４．６，４．４，４．２及び４．０のpHに
調節した。３０mLのグリーンジュースアリコートを更なる処理のために各々のpH
で除去した。全てのpH調節したグリーンジュースサンプルを水浴中で１５分、４
５℃で熱処理し、次に１５℃に冷やした。サンプルを１５分、１０，０００RPM
でＪＳ−１３．１ローターで遠心して２つの画分、上清（Ｓ１）及びペレット（
Ｐ１）を作り出した（図１を参照のこと）。ペレットを１５mLの５０mMリン酸緩
衝液、pH７．２に再度懸濁し、１５分、１０，０００RPM でＪＳ−１３．１ロー
ター中で遠心して２つの画分、上清（Ｓ２）及びペレット（Ｐ２）を供した（図
１を参照のこと）。Ｇｏｏｄｉｎｇ、前掲により記載されるようにＰＥＧ沈殿（
８，０００MW ＰＥＧ）により両方の上清画分からウイルスを回収し、２６０nm
での分光光度分析により定量した。
【００４５】
【表２】
【００４６】 結果： この例は、第１及び第２の遠心の各々の間の上清Ｓ１及びＳ２中のウイルスの
相対分布を検査する。Ｓ１は、グリーンジュースの５．０から４．０へのpH調節
、次の熱処理及び遠心の後に得られる。ペレット（Ｐ１）を緩衝液（pH７．２）
中に再度懸濁し、次に２回目の遠心にかけて上清（Ｓ２）を作り出した。Ｓ１及
びＳ２部分から回収したウイルスの量は表２においてグリーンジュースのpH５．
０より小さい。しかしながらpHを下げると、ウイルスは次第に上清部分（Ｓ１）
からペレット（Ｐ１）に移動し、Ｓ２中に再び現れる。表２でpH４．０において
、Ｓ２部分から単離されたウイルスの量はＳ１部分より１００倍高い。グリーン
ジュースのpH及び再懸濁緩衝液のpHは遠心の間、上清又はペレット中のウイルス
の相対分布に大きく作用することを示す。低pH、例えばpH４．０／４５℃プロセ
ス及びpH７．２緩衝液において、ウイルスはＳ２部分のみから定量的に回収する
ことができる。このプロセスはウイルスを１つの画分に濃縮する。これは、限外
ろ過することができる画分を形成し、それによりプロセス容量を大きく減少させ
、ウイルス精製の全体の効率を上げる。グリーンジュース及び懸濁液のpH値の調
節は、ウイルスの分布を制御するための方法を供し、これによりウイルスの大き
な回収収率での単離を容易にする。
【００４７】 実施例３ pH４．２／４５℃プロセスを用いるＳ２からのウイルスの小規模単離 品種ＭＤ６０９のタバコ植物にＴＭＶ８１１を接種した。種をまいた後１１週
目に、植物を収集した。葉及び茎組織（２５０ｇ）を１リッターＷａｒｉｎｇブ
レンダー中０．０４％ナトリウムメタビスルファイト溶液（２５０mg）と組み合
わせた。植物組織を２分、高速で粉砕した。得られたホモジネートをチーズクロ
スの４層に通し、プレスした繊維を捨てた。収集したジュースの容量は４０８mL
であり、そのpHは５．４であった。絶え間なく撹拌しながらそのpHを希リン酸で
４．２に調節した。
【００４８】 ジュースの一部（２８５mL）を水浴中で４５℃に加熱し、１０分、この温度に
維持した。冷却せずに、そのジュースを１０，０００×Ｇで１５分、遠心した。
上清をデカントして捨て、ペレットを２倍の蒸留脱イオン水（１４２mL）に再度
懸濁した。その再懸濁したペレットのpHを希水酸化ナトリウムでpH８．０に調節
した。
【００４９】 その再懸濁したpHを調節したペレットを８つのアリコート（各々１５mL）に分
けた。これらのアリコートを異なるRPM でＢｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１遠心機中
ＪＡ−２０ローターで遠心した。２番目の上清（Ｓ２）をデカントしてＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより分析した。ウイルスをＰＥＧ沈殿させ、Ｇｏｏｄｉｎｇ、前掲の
方法に従って残りの上清（Ｓ２）部分から単離した。上清の透明度も目で測った
。
【００５０】
【表３】
【００５１】 結果： 実施例２は、グリーンジュースの低pH及び懸濁液の中性pHがウイルスのほとん
どを２回目の遠心の可溶性部分（Ｓ２）においやる。実施例３は、第２の遠心の
ための至適条件を更にテストする。標的種がウイルスであるなら、上清Ｓ２は出
来るだけ少いタンパク質を含むことが好ましい。このような条件は、表３にアリ
コート１で示されるように、長時間の間隔での高速遠心で一般に達成することが
できる。このような条件は有効であるが、より大きなコスト及びより長い工程が
必要となる。至適条件は、要求される収量及び純度を大きく失うことなく、短い
時間のより低いRPM を供する。アリコート２〜５はかなり低い遠心速度及びより
短い時間で行われるが、大きな可溶性タンパク質濃度及び曇った溶液（大きなタ
ンパク質成分含有を示す）により示されるようにタンパク質の排除が乏しい。ア
リコート６〜８は、上清から多くのタンパク質を取り（ほとんど透明な溶液）、
Ｓ２部分中に回収されるウイルスの量はアリコート１のものと適合するが、アリ
コート１と比べて適度な遠心速度及びより短い時間間隔のみを与える。
【００５２】 過剰な遠心は危険でないことが本例から見ることができるが、コストに有効な
ウイルス精製プロセスのために、妨害するタンパク質を排除するために十分な適
度な速度及び合理的な時間間隔での遠心が好ましい。当業者は、関心のウイルス
の単離のために適した遠心の至適条件を直ちに決定することができる。 実施例４ pH４．２／４５℃プロセスを用いるＳ２からのウイルス回収への宿主成分及び 懸濁容量の効果 温室中で成長させたニコチニア・タバクムＭＤ６０９に、種子発芽後６週目に
ＴＭＶ誘導体（コートタンパク質リーキーストップ（ｌｅａｋｙ−ｓｔｏｐ）Ｔ
ＭＶ８１１を接種した。ウイルスが全身に広がった後の接種後５週目に植物を収
集した。葉及び茎組織（１５０ｇ）を、０．０４％Ｎａ2 Ｓ2 Ｏ5 （１５０mL）
と共に高設定で２分、１リッターＷａｒｉｎｇブレンダー中でやわらかくした。
そのやわらかくした材料をチーズクロスの４層を介してこして繊維状材料を除去
した。残ったグリーンジュースをＨ3 ＰＯ4 で４．２のpHに調節した。pHを調節
したジューズを熱い水道水下で４５℃に加熱し、４５℃の水浴中で１０分、イン
キュベートした。熱処理したグリーンジュースを３０mLアリコートに分け、１５
分、１０，０００RPM でＪＳ−１３．１ローター中で遠心した。そのペレット化
した材料を、上清を加えることにより出発の３０mL容量の１０％又は２０％に調
節し、次に脱イオンＨ2 Ｏを加えることにより出発の３０mL容量の１／４，１／
２又は１容量に更に調節した。グリーンジュース３０mLからの平均ペレット容量
は、１．７mLであった。
【００５３】 全てのペレットを上清及び脱イオンＨ2 Ｏを加えて完全に再度懸濁し、次にＮ
ａＯＨを加えることにより７．５〜７．７のpHに調節した。その再懸濁したサン
プルを１５分、１０，０００RPM でＪＳ１３．１ローターで遠心した。ウイルス
をＧｏｏｄｉｎｇ、前掲に記載されるように、ＰＥＧ沈殿（８０００MW ＰＥＧ
）により上清から回収した。
【００５４】
【表４】
【００５５】 結果： ペレットを遠心から得る場合、それらは頻繁に残留した上清で汚染され、それ
は後の標的種の回収に影響を与えるかもしれないし与えないかもしれない。更に
、再懸濁容量は、標的種の回収にも効果を発揮し得る。この例は、上清の所定の
量をペレットにもどした場合の条件下でウイルス回収をテストするようデザイン
し、その再懸濁量はウイルス回収への効果を評価するために系統的に変化する。
【００５６】 表４は、ウイルス収率に対する再懸濁量の逆の関係を示す。再懸濁容量１／４
から１／２に、出発容量（３０mL）の１／２から１等量に増加すると、ウイルス
の回収は増加する（１〜３及び４〜６を比較のこと）。これにより、ペレット容
量の割合が増加するにつれて、再懸濁容量もウイルスの回収を最大にするよう増
加する。残存した上清の効果について、ウイルス回収の収率は、より少い上清を
ペレットにもどした時により高い（１及び４、２及び５、３及び６を比較のこと
）。上清中の宿主成分はペレットからビリオンを再懸濁／解離する能力に影響を
与え得る。遠心後により少い残存上清でより少いペレットが要求される。要約す
ると、再懸濁容量及びペレットの乾燥のような因子は、標的種の収率及び純度を
最大にするように最適化することができる。
【００５７】 実施例５ pH５．０／４７℃プロセスを用いる大規模ウイルス単離への供給速度の効果 品種ＫＹ８９５９の畑で成長させたタバコにＴＭＶ２９１を接種し、設置後１
０週で収集した。植物組織（８，０９３lbs ）をＲｅｉｔｚ（登録商標）ディス
インテグレーターで粉砕し、スクリュープレスを用いて繊維を除去した。水をタ
ハコ１トン当り１２０ガロンの速度でディスインテグレーターに加えた。そのブ
レスからのジューズを、pHをリン酸で５．０に調節した撹拌タンク中に収集した
。pHを調節したジュースを、ジュースの温度が４７℃に達するように連続様式で
熱交換基を介してくみ上げた。次に加熱したジュースをホールディングチューブ
を介してくみ上げ、この温度が少くとも１０分、維持されるのを確実にした。
【００５８】 次にその処理したジュースを分当り５ガロンから分当り２０ガロンの供給速度
でＷｅｓｔｆａｌｉａ（登録商標）ＳＡＭＲ １５０３７ディスクスタッフ型遠
心機に供給した。その濃縮物のサンプルを各々の供給速度で取り出し、ウイルス
濃度について分析した。
【００５９】
【表５】
【００６０】 結果： ウイルス回収収率を異なる供給速度を用いてテストした。表５は、ウイルス回
収率が、遠心機へのグリーンジュースの供給速度が低くなると低下した。供給速
度は遠心機中のグリーンジュースの保持時間に反比例するので、これらのデータ
は、ウイルスをかなり多くの遠心（低い供給速度）にかけると、ウイルスが失わ
れることを示す。これにより、供給速度は、大規模単離及び精製において標的種
の収率及び純度を最大にするように最適化することもできる。
【００６１】 実施例６ pH５．０／４５℃プロセスを用いる組換えタンパク質α−トリコサンチンの単 離 温室中で成長させたニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎｉｃｏｔｉｎａ ｂｅｎｔ ｈａｍｉｃａｎａ ）にα−トリコサンチン（α−ｔｒｉｃｈｏｓａｎ）をコード
する遺伝子を含むＴＭＶを接種した。ウイルスが全身に広がった後の接種後１０
日に植物を収集した。葉及び茎組織（１５０ｇ）を０．０４％Ｎａ2 Ｓ2 Ｏ5 （
１５０mL）と共に高設定で２分、１リッターＷａｒｉｎｇブレンダー中でやわら
かくした。そのやわらかくした材料を、繊維状材料を除去するためにチーズクロ
スの４層を介してこした。残ったグリーンジュースをＨＣｌでpH５．０に調節し
た。pHを調節したグリーンジュースを水浴中で１０分、４５℃で熱処理し、次に
２８℃に冷却した。熱処理したジュースを１５分、１０，０００RPM （１５，６
００×Ｇ）でＫＡ−１２ローター（Kompspin, Sunnyvale, CA ）で遠心した。上
清（Ｓ１）（５０mLアリコート）を５０PSI でＡｍｉｃｏｎ（登録商標）撹拌セ
ル中の１００及び１０kD ＭＷＣＯ再生セルロース膜を用いて限外ろ過にかけた
。次に１００kD透析物画分を１０kDメンブランを介してのろ過により濃縮し、３
回、ディアフィルトレートした。α−トリコサンチンを１０kD濃縮物から収集し
た。その１０kD透析物は１０kD MW未満の糖、アルカロイド、香味物質、ビタミ
ン及びペプチドを含む。グリーンジュース、上清、１００kD及び１０kD濃縮物及
び１００〜１０kD画分中のα−トリコサンチンの相対量をα−トリコサンチン抗
体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ分析により決定した。
【００６２】
【表６】
【００６３】 結果： この例は、pH５．０／４５℃プロセス及び限外ろ過を用いて可溶性Ｆ２タンパ
ク質、α−トリコサンチンを抽出及び精製する能力を示す。α−トリコサンチン
は、（ウェスタン・ブロットに基づいて）グリーンジュース中に存在する量に対
して上清（Ｓ１）画分中に定量的に保持された。更に、Ｓ１中に存在するα−ト
リコサンチンを、（Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質及びＷｅｓｔｅｒｎ分析に基づ
いて）グリーンジュースに対して６倍、精製した。
【００６４】 Ｓ２画分中に存在するα−トリコサンチンは定量的に保持され、１０kD ＭＷ
ＣＯメンブランを用いて限外ろ過により４倍に濃縮された（５０mLのＳ１を１３
．５mLに濃縮し、α−トリコサンチンの９６％はウェスタン分析に基づき１０kD
濃縮物中に存在した）。 α−トリコサンチンを大分子量タンパク質からも精製し、ウイルスを１００kD
ＭＷＣＯメンブランでの限外ろ過を介して精製した。１００kD濃縮物画分を３
回、ディアフィルトレートして、更なるα−トリコサンチンを回収した。１００
kD濃縮及びディアフィルトレーションの後、α−トリコサンチンの４０．８％だ
けが１００kD濃縮物中に残り、これは、α−トリコサンチンの５９．２％が１０
０kDa 透析物画分中に存在するであろうことを示した。１００kD透析物画分を１
０kD ＭＷＣＯ膜を用いて濃縮した。（１００kD透析物から得られた）１０kD濃
縮物は出発Ｓ２画分の５０mL中に存在するα−トリコサンチンの量に対して３４
％のα−トリコサンチンを含んだ。１００〜１０kD画分中に存在するα−トリコ
サンチンは、（Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質及びウェスタンアッセイに基づき）
グリーンジュースに対して８倍、精製され、１２．５倍、濃縮されると決定され
た（５０mLのＳ１か１００〜１０kD画分４．０mLに濃縮された）。
【００６５】 実施例７ pH５．０／４７℃プロセスを用いるトランスジェニック植物からの分泌ＩｇＡ 抗体の単離 ４つの分泌性ＩｇＡ（ＳＩｇＡ）タンパク質成分を発現する温室で育てたトラ
ンスジェニックタバコの葉及び茎組織（５０ｇの新鮮重量）を０．０４％Ｎａ2 Ｓ2 Ｏ5 （７５mL）と共に高設定で２分、Ｖｉｒｔｉｓブレンダーでやわらかく
した。そのやわらかくした材料を４層のチーズクロスを介してこして繊維状材料
を除去した。残ったグリーンジュースをＨ3 ＰＯ4 でpH５．０に調節した。その
pHを調節したグリーンジュースを水浴中で１０分、４７℃に加熱し、次に２８℃
に冷やした。熱処理したジュースを、３分、３，０００RPM でＪＡ−１３．１ロ
ーター中で遠心した。その上清画分を１０kD ＭＷＣＯ、再生セルロース膜（Ａ
ｍｉｃｏｎ（登録商標）、Ｃｅｎｔｒｉｐｏｅｐ（登録商標））を用いて限外ろ
過にかけた。グリーンジュース、上清及び１０kD濃縮物中のＳＩｇＡの相対量を
その重鎖と反応する抗体を用いてウェスタン分析により決定した。
【００６６】
【表７】
【００６７】 結果： トランスジェニック植物中で組換え生産された分泌性ＩｇＡ抗体は、この例に
おいて上手く回収された。pH調節及び熱処理の後、遠心は上清中の全タンパク質
を８５％だけ減少させた。上清中のＳＩｇＡを回収し限外ろ過して全タンパク質
の１２倍濃縮物及びＳＩｇＡ成分を供した。
【００６８】 実施例８ pH５．０／４５℃プロセス及び限外ろ過を用いるウイルスの小規模単離 ＴＭＶ２６１を感染させた品種ＭＤ６０９の畑で成長させたタバコを収集し、
使用するまで−２０℃に凍結した。の凍結した組織を４リッターＷａｒｉｎｇブ
レンダーにおいて４つのバッチ中で粉砕した。各々のバッチにおいて、植物組織
（１５００ｇ）を０．０４％ナトリウムメタビスルファイト溶液（１５００mL）
中で高速で３分、粉砕した。そのホモジネートを４層のチーズクロスを介してこ
して、ジュースを組み合わせて約１０リッターの容量を供した。
【００６９】 そのジュースのpHは、濃リン酸（Ｈ3 ＰＯ4 ）を用いて５．８の出発値から５
．０に調節した。次にそのジュースを熱い水道水により熱したステンレススチー
ルコイルを用いて４５℃に加熱した。そのジュースを１０分、４５℃に維持した
後、それを冷却水でコイルを用いて２５℃に冷却した。その熱処理したジュース
を５分、１２，０００×Ｇで遠心し、得られた上清をＭｉｒａｃｌｏｔｈ（登録
商標）を介してデカントした。
【００７０】 この上清を、１平方フィート１００kD ＭＷＣＯ再生セルロース、スパイラル
限外ろ過膜を用いて処理した。５０psi の入口圧及び分当り５Ｌの再懸濁で、上
清を出発容量の約５％に濃縮した。最終濃縮物を限外ろ過装置から排出し、その
システムに少量の水をそそいだ。出発上清、最終濃縮物、水そそぎ液、及び組み
合わせた透析物のサンプルをＢｒａｄｆｏｒｄ分析によりタンパク質についてア
ッセイした。それらは、存在するいずれかのウイルスを単離するため、Ｇｏｏｄ
ｉｎｇ、前掲の方法に従ってＰＥＧで沈殿させた。ウイルス濃度を分光光度測定
により決定した。
【００７１】
【表８】
【００７２】 結果： この例において、小規模ウイルス単離は上手く行われた。グリーンジュースを
pHを５．０に調節し、熱処理して遠心した。ウイルス（１．９４ｇ）を含む上清
を１００kD ＭＷＣＯ膜に通した。ウイルス（１．６４ｇ）をその濃縮物から定
量的に回収した。より小さな大きさのタンパク質を透析物から収集した。少量の
ウイルスだけが１００kD膜を用いる限外ろ過により失われる。
【００７３】 実施例９ pH４．０／４７℃プロセスを用いる大規模ウイルス単離 品種ＫＹ８９５９の畑で成長させたタバコにＴＭＶ２９１を接種し、設置後１
０日後に収集した。植物組織１８．３８２lbs ）をＲｅｉｔｚ（登録商標）ディ
スインテグレーター中で粉砕し、スクリュープレスを用いて繊維を除去した。水
をタバコ１トン当り１２０ガロンの速度でディスインテグレーターに加えた。そ
のプレスからのジュースを、pHをリン酸で４．０に調節した撹拌タンク内に収集
した。そのpHを調節したジュースを、ジュースの温度が４７℃に達するように連
続的に熱交換器を介してくみ上げた。次に、その加熱したジュースをホールディ
ングチューブを介してくみ上げ、少くとも１０分、この温度が維持されるのを確
実にした。
【００７４】 次にその処理したジュースを、分当り１０ガロンの供給速度でＷｅｓｔｆａｌ
ｉａ ＳＡＭＲ １５０３７ディスクスタック型遠心機に供給した。全部で１１
２０ガロンの上清及び２００ガロンのペレットを遠心により作り出した。３８０
ガロンの容量の水をペレットに加え、再度懸濁したペレットpHを、ＫＯＨを加え
ることにより７．１２に調節した。そのpHを調節した再度懸濁したペレットを、
分当り５ガロンの供給速度でＷｅｓｔｆａｌｉａ ＳＡＭＲ １５０３７ディス
クスタックタイプ遠心機に供給し、４３５ガロンの上清（Ｓ２）を回収した。上
清（４３５ガロン）を１００平方フィートの１００kD ＭＷＣＯ、セルロースア
セテート、スパイラルメンブラン（SETEL, Livermore, CA）を介しての限外ろ過
により２４．８ガロンに濃縮した。その濃縮物を除去した後、膜を３１．５ガロ
ンの水で洗った。ウイルス（１５８ｇ）を１００kD ＭＷＣＯ濃縮物から精製し
、次に更に濃縮してＧｏｏｄｉｎｇ、前掲に記載されるようにＰＥＧ沈殿（８，
０００MW ＰＥＧ）により洗った。この回収したウイルスの量は以前に単離した
のより２オーダー倍大きい。
【００７５】 この例は、pH４．０／４７℃プロセスを用いる有効な大規模ウイルス単離を示
す。先の実施例２は、pH４．０／４７℃プロセスが小規模での上清Ｓ２中のウイ
ルスの濃縮を許容する。ウイルスは、上清（Ｓ２）を１００kD ＭＷＣＯメンブ
ランに通すことにより限外ろ過を用いて更に濃縮することができる。ウイルス粒
子は、この例に示されるように高収率で回収することができる。
【００７６】 実施例１０ pH５．０／４７℃プロセスを用いる大規模ウイルス及びＦｒａｃｔｉｏｎ ２ タンパク質単離 品種ＫＹ８９５９の畑で成長させたタバコにＴＭＶ２９１を接種し、設置後１
０週目に収集した。植物組織（８．０９３lbs ）をＲｅｉｔｚ（登録商標）ディ
スインテグレーター中で粉砕し、その繊維をスクリュープレスを用いて除去した
。水をタバコ１トン当り１２０ガロンの速度でディスインテグレーターに加えた
。そのプレスからのジュースを、pHをリン酸で５．０に調節した撹拌タンク内に
収集した。pHを調節したジュースを、そのジュースの温度が４７℃に達するよう
に連続的に熱交換器を介してくみ上げた。
【００７７】 次に、その処理したジュースを、分当り１０ガロンの供給速度でＷｅｓｔｆａ
ｌｉａ（登録商標）ＳＡＭＲ １５０３７ディスクスタックタイプ遠心機に供給
した。遠心により形成された上清９９０ガロンのうちの全部で７６０ガロンを、
１００kD ＭＷＣＯ、セルロースアセテート、スパイラルメンブランの１，００
０平方フィートを介しての限外ろ過により３２ガロンに濃縮した。ウイルス（２
１３ｇ）を、Ｇｏｏｄｉｎｇ、前掲に記載されるようにＰＥＧ（８，０００MW）
沈殿により１００kD濃縮物画分から精製した。１００kDろ過透析物中にある可溶
性Ｆｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質（＜１００kD）を、１０kD ＭＷＣＯ、再生
セルロース、スパイラルメンブランの４０平方フィートを介する限外ろ過により
濃縮した。１００kD透析物の全部で６０ガロンを３．５ガロンに濃縮して１．６
９ｇの可溶性Ｆｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質を供した。
【００７８】 この例は、pH５．０／４７℃プロセスを用いてＦｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク
質及びウイルスを単離及び精製するための大規模な方法を上手く証明する。最初
の遠心はウイルス及び他の可溶性タンパク質の両方を含む上清画分を作り出す。
ウイルス及び可溶性Ｆｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質を濃縮及び分離するために
限外ろ過を用いることが可能であり、ここでウイルスは大きなMWのＭＷＣＯメン
ブランの濃縮物中に存在し、Ｆｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質は浸透物中にある
。Ｆｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質は、より小さなMWのＭＷＣＯメンブランを通
過させることにより更に精製し、濃縮することができ、ここで異なる大きさのＦ
ｒａｃｔｉｏｎ ２タンパク質を個々に得ることができる。Ｆｒａｃｔｉｏｎ
２タンパク質及びウイルスは、大規模に本方法を用いて高収率で回収することが
できる。
【００７９】 実施例１１ pH５．０／４７℃又はpH４．０／４７℃プロセスにより生産された精製ウイル ス粒子の物理化学特性 野生型タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ２０４、サンプル９６０８０８）を、
実施例９に記載されるように大規模pH４．０／４７℃プロセスを用いて畑で成長
させたタバコ（品種ＫＹ８９５９、１１，８８４lbs ）から抽出した。組換えＴ
ＭＶ２９１（サンプル９６０８２９）を、実施例１０に記載されるようにpH５．
０／４７℃抽出手順を用いて畑で成長させたタバコ（品種ＫＹ８９５９、１４，
８９８lbs ）から抽出した。ビリオンを、ＰＥＧ沈殿させた後に、生化学的及び
純度プロフィールを確かめるために種々の分析にかけた。
【００８０】
【表９】
【００８１】
【表１０】
【００８２】
【表１１】
【００８３】 結果： 大規模pH５．０／４７℃及びpH４．０／４７℃プロセスにより生産されたＰＥ
Ｇ精製したビリオンの調製物の分析は、高い純度を示し、検出可能なコートタン
パク質分解は見られなかった。２６０／２８０nmにおける１．２０の吸光度比（
表９）は、高度に精製されたＴＭＶを示す。更に、両方のウイルス調製物のＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦマス（表９）は予想されるコートタンパク質分子量についての実
験の範囲内である。両方のウイルス調製物は、低レベルの脂質、ニコチン及びエ
ンドトキシンを含んでおり、ビリオン及びウイルス融合コートタンパク質の単離
及び精製におけるこれらの方法の利用性を証明する。ウイルス抽出物の元素分析
（表１０）は、種々の要素の相対比により決定されるように高度に精製されたタ
ンパク質を示す。ウイルスサンプルのアミノ酸プロフィール（表１１）は、各々
の予想されるアミノ酸の相対的な数度を反映し、２つのテストサンプル間のアミ
ノ酸の予想される差も反映する。
【００８４】 両方のウイルスサンプルは、宿主植物に与えた時に感染することが示された。
このことは、要求される方法が、生物学的に活性なビリオンを回収することを示
す。ウイルス抽出物のＲＴ−ＰＣＲ分析は、完全なＲＮＡゲノムを示す予想され
る核酸フラグメントを作り出した。 本発明は、好ましい実施形態を引用して記載されているが、本発明の精神から
逸脱することなく種々の改変を行うことができることが理解されるはずである。
従って、本発明は、請求の範囲によってのみ限定される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 植物源からウイルス並びに可溶性タンパク質及びペプチドを単離及び精製する
ための本方法を示すフローチャートである。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年６月１０日（２０００．６．１０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ホルツ，アール．バリー アメリカ合衆国， カリフォルニア 95688，ベイカビル，ベイカ バレー パ ークウェイ 3333 (72)発明者 マクロッチ，マイケル ジェイ． アメリカ合衆国， カリフォルニア 95688，ベイカビル，ベイカ バレー パ ークウェイ 3333 (72)発明者 ターペン，トーマス エイチ． アメリカ合衆国， カリフォルニア 95688，ベイカビル，ベイカ バレー パ ークウェイ 3333 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 BA31 BA41 BA80 CA04 DA01 EA01 HA01 HA03 4B065 AA88X AA95X AB01 BA01 BD18 CA24 CA25 CA27 CA44 CA45 4H045 AA20 CA10 CA30 CA40 DA01 DA30 DA75 DA83 DA86 DA89 EA20 EA29 FA74 GA10 GA21 GA22 GA23 GA24 GA25 GA26 【要約の続き】

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 植物から関心の可溶性タンパク質又はペプチドを得るための
    方法であって、 （ａ）植物をホモジナイズしてグリーンジュースを作り出し； （ｂ）該グリーンジュースのpHを約５．２又はそれ未満に調節し； （ｃ）該グリーンジュースを約４５℃の最小温度に加熱し； （ｄ）該グリーンジュースを遠心して上清を作り出し；そして （ｅ）該上清から関心のタンパク質又はペプチドを精製するステップを含む方
    法。
  2. 【請求項２】 前記グリーンジュースのpHを約４．０〜５．２に調節するこ
    とを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記グリーンジュースのpHを約５．０に調節することを特徴
    とする請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記グリーンジュースを約４５〜５０℃の温度に加熱するこ
    とを特徴とする請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 ステップ（ｄ）で作り出された上清を更に限外ろ過にかける
    ことを特徴とする請求項１に記載の関心のタンパク質又はペプチドを精製するた
    めの方法。
  6. 【請求項６】 前記限外ろ過により作り出された浸透物を２回目の限外ろ過
    にかけるステップを更に含む請求項５に記載の関心のタンパク質又はペプチドを
    精製するための方法。
  7. 【請求項７】 前記２回目の限外ろ過から得られた濃縮物を精製するステッ
    プを更に含む請求項６に記載の関心のタンパク質又はペプチドを精製するための
    方法。
  8. 【請求項８】 前記精製が、クロマトグラフィー、精製のアフィニティーベ
    ースの方法、 又は塩沈殿により行われることを特徴とする請求項７に記載の方法
    。
  9. 【請求項９】 前記関心の可溶性タンパク質又はペプチドがＩＬ−１，ＩＬ
    −２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−８，ＩＬ−
    ９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２，ＥＰＯ，Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ
    ，ｈＰＧ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ、第ＶIII 因子、第IX因子、ｔＰＡ、レセプター
    、レセプターアンタゴニスト、抗体、一本鎖抗体、酵素、ニューロポリペプチド
    、インスリン、抗原、ワクチン、ペプチドホルモン、カルシトニン、及びヒト成
    長ホルモンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜８のいずれか
    一に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記関心の可溶性タンパク質又はペプチドが抗微生物ペプ
    チド又はタンパク質であり、プロテグリン、マガイニン、セクロピン、メリトチ
    ン、インドリシジン、デフェンシン、β−デフェンシン、クリプトジン、クラバ
    イニン、植物デフェンシン、ニシン及びバクテネシンからなる群から選択される
    ことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記関心のタンパク質又はペプチドが、組換え技術により
    生産されることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 植物から関心のウイルスを得るための方法であって、 （ａ）植物をホモジナイズしてグリーンジュースを作り出し； （ｂ）該グリーンジュースのpHを約５．２又はそれ未満に調節し； （ｃ）該グリーンジュースを約４５℃の最小温度に加熱し； （ｄ）該グリーンジュースを遠心して上清を作り出し；そして （ｅ）該上清から関心のウイルスを精製するステップを含む方法。
  13. 【請求項１３】 前記グリーンジュースのpHを約４．０〜５．２に調節する
    ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記グリーンジュースのpHを約５．０に調節することを特
    徴とする請求項１２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記グリーンジュースを約４５〜５０℃の温度に加熱する
    ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記上清を限外ろ過にかけるステップを更に含む請求項１
    ２に記載の関心のウイルスを得るための方法。
  17. 【請求項１７】 前記限外ろ過から得られた濃縮物にポリエチレングリコー
    ルを加えるステップを更に含む請求項１５に記載の関心のウイルスを得るための
    方法。
  18. 【請求項１８】 前記関心のウイルスがプラスセンスＲＮＡウイルスである
    ことを特徴とする請求項１２〜１７のいずれか一に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記関心のウイルスが、ポティウイルス、トバモウイルス
    、ブロモウイルス、カルモウイルス、ルテオウイルス、マラフィウイルス、ＭＣ
    ＤＶ群、ネクロウイルス、ＰＹＦＶ群、ソベモウイルス、トムブスウイルス、テ
    ィモウイルス、カピロウイルス、クロステロウイルス、カルラウイルス、ポテッ
    クスウイルス、コモウイルス、ディアンソウイルス、ファバウイルス、ネポウイ
    ルス、ＰＥＭＶ、フロウイルス、トブラウイルス、ＡＭＶ、テヌイウイルス及び
    イネ壊疽ウイルスからなる群から選択されることを特徴とする請求項１２〜１７
    のいずれか一に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記関心のウイルスが、カリモウイルス、ジェミニウイル
    ス、レオウイルス、コメリナイエローモットルウイルス群及びクリプトウイルス
    からなる群から選択されることを特徴とする請求項１２〜１７のいずれか一に記
    載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記関心のウイルスが、ラボウイルス及びブニアウイルス
    から選択されることを特徴とする請求項１２〜１７のいずれか一に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 植物から関心のウイルスを得るための方法であって、 （ａ）植物をホモジナイズしてグリーンジュースを作り出し； （ｂ）該グリーンジュースのpHを約５．２又はそれ未満に調節し； （ｃ）該グリーンジュースを約４５℃の最小温度に加熱し； （ｄ）該グリーンジュースを遠心してペレットを作り出し； （ｅ）該ペレットを液体溶液に再度懸濁し； （ｆ）該再度懸濁されたペレットを含む液体溶液のpHを約５．０〜８．０に調
    節し； （ｇ）該再度懸濁されたペレットを含む液体溶液を遠心して上清を作り出し；
    そして （ｈ）該上清から関心のウイルスを精製するステップを含む方法。
  23. 【請求項２３】 前記精製が、ポリエチレングリコール沈殿又は限外ろ過に
    より行われることを特徴とする請求項２２に記載の関心のウイルスを得るための
    方法。
  24. 【請求項２４】 前記関心のウイルスがプラスセンスＲＮＡウイルスである
    ことを特徴とする請求項２２又は２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記関心のウイルスが、ポティウイルス、トバモウイルス
    、ブロモウイルス、カルモウイルス、ルテオウイルス。マラフィウイルス、ＭＣ
    ＤＶ群、ネクロウイルス、ＰＹＦＶ群、ソベモウイルス、トムブスウイルス、テ
    ィモウイルス、カピロウイルス、クロステロウイルス、カルラウイルス、ポテッ
    クスウイルス、コモウイルス、ディアンソウイルス、ファバウイルス、ネポウイ
    ルス、ＰＥＭＶ、フロウイルス、トブラウイルス、ＡＭＶ、テヌイウイルス及び
    イネ壊疽ウイルスからなる群から選択されることを特徴とする請求項２２又は２
    ３に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記関心のウイルスが、カリモウイルス、ジェミニウイル
    ス、レオウイルス、コメリナイエローモットルウイルス群及びクリプトウイルス
    からなる群から選択されることを特徴とする請求項２２又は２３に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記関心のウイルスが、ラボウイルス及びブニアウイルス
    から選択されることを特徴とする請求項２２又は２３のいずれか一に記載の方法
    。
  28. 【請求項２８】 植物から関心の融合ペプチド又は融合タンパク質を得るた
    めの方法であって、 （ａ）植物をホモジナイズしてグリーンジュースを作り出し； （ｂ）該グリーンジュースのpHを約５．２又はそれ未満に調節し； （ｃ）該グリーンジュースを約４５℃の最小温度に加熱し； （ｄ）該グリーンジュースを遠心してペレットを作り出し； （ｅ）該ペレットを液体溶液に再度懸濁し； （ｆ）該再度懸濁されたペレットを含む液体溶液のpHを約２．０〜４．０に調
    節し； （ｇ）該再度懸濁されたペレットを含む液体溶液を遠心し；そして （ｈ）関心の融合タンパク質又は融合ペプチドを精製するステップを含む方法
    。
  29. 【請求項２９】 前記精製が、クロマトグラフィー、限外ろ過、精製のアフ
    ィニティーベースの方法、 又は塩沈殿により行われることを特徴とする請求項２
    ８に記載の関心の融合タンパク質又は融合ペプチドを得るための方法。
  30. 【請求項３０】 前記融合タンパク質又は融合ペプチドがＩＬ−１，ＩＬ−
    ２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−８，ＩＬ−９
    ，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２，ＥＰＯ，Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ，
    ｈＰＧ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ、第ＶIII 因子、第IX因子、ｔＰＡ、ｈＧＨ、レセ
    プター、レセプターアンタゴニスト、抗体、一本鎖抗体、酵素、ニューロポリペ
    プチド、インスリン、抗原、ワクチン、及びカルシトニンからなる群から選択さ
    れるペプチド又はタンパク質を含むことを特徴とする請求項２８又は２９に記載
    の方法。
  31. 【請求項３１】 前記融合タンパク質又は融合ペプチドが、プロテグリン、
    マガイニン、セクロピン、メリトチン、インドリシジン、デフェンシン、β−デ
    フェンシン、クリプトジン、クラバイニン、植物デフェンシン、ニシン及びバク
    テネシンからなる群から選択される抗微生物ペプチド又はタンパク質を含むこと
    を特徴とする請求項２８又は２９に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記限外ろ過が、糖、ポリサッカライド、ビタミン、アル
    カロイド、香味化合物及びペプチドからなる群から選択される１又は複数の分子
    を含む浸透物を作り出すことを特徴とする請求項５に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記２回目の限外ろ過が、糖、ポリサッカライド、ビタミ
    ン、アルカロイド、香味化合物及びペプチドからなる群から選択される分子を含
    む浸透物を作り出すことを特徴とする請求項６に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 請求項１に記載の方法により得られるタンパク質又はペプ
    チド。
  35. 【請求項３５】 請求項１２又は２２に記載の方法により得られるウイルス
    。
  36. 【請求項３６】 請求項２８に記載の方法により得られる融合タンパク質又
    は融合ペプチド。
  37. 【請求項３７】 請求項３２又は３３に記載の方法により得られる糖、ポリ
    サッカライド、ビタミン、アルカロイド、香味化合物又はペプチド。
  38. 【請求項３８】 植物からグリーンジュースを得るための方法であって、 （ａ）植物をホモジナイズして液体溶液を作り出し； （ｂ）該液体溶液のpHを約５．２又はそれ未満に調節するステップを含む方法
    。
  39. 【請求項３９】 （ａ）植物をホモジナイズしてグリーンジュースを作り出
    し； （ｂ）該グリーンジュースのpHを約５．２又はそれ未満に調節すること により生産されるウイルス、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される
    １又は複数分子を含むグリーンジュース。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013544522A (ja) * 2010-12-01 2013-12-19 アール・ジエイ・レイノルズ・タバコ・カンパニー タバコ由来材料を抽出するためのタバコ分離方法、および関連の抽出システム
JP2021526836A (ja) * 2018-06-12 2021-10-11 ケンタッキー バイオプロセシング，インコーポレイテッド ウイルスと抗原の精製及び結合

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6846968B1 (en) * 1988-02-26 2005-01-25 Large Scale Biology Corporation Production of lysosomal enzymes in plants by transient expression
US6660500B2 (en) * 1988-02-26 2003-12-09 Large Scale Biology Corporation Production of peptides in plants as viral coat protein fusions
US6639050B1 (en) 1997-07-21 2003-10-28 Ohio University Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins
US7378506B2 (en) * 1997-07-21 2008-05-27 Ohio University Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins
US20020197249A1 (en) * 2001-04-10 2002-12-26 Renal Tech International Devices, systems, and methods for reducing levels of pro-inflammatory or anti-inflammatory stimulators or mediators in blood products
US6303848B1 (en) 1998-01-16 2001-10-16 Large Scale Biology Corporation Method for conferring herbicide, pest, or disease resistance in plant hosts
US20020164585A1 (en) * 1998-01-16 2002-11-07 Sean Chapman Method for enhancing RNA or protein production using non-native 5' untranslated sequences in recombinant viral nucleic acids
US6426185B1 (en) 1998-01-16 2002-07-30 Large Scale Biology Corporation Method of compiling a functional gene profile in a plant by transfecting a nucleic acid sequence of a donor plant into a different host plant in an anti-sense orientation
US20030027173A1 (en) * 1998-01-16 2003-02-06 Della-Cioppa Guy Method of determining the function of nucleotide sequences and the proteins they encode by transfecting the same into a host
US6906172B2 (en) * 1998-03-10 2005-06-14 Large Scale Biology Corporation Flexible processing apparatus for isolating and purifying viruses, soluble proteins and peptides from plant sources
US6037456A (en) * 1998-03-10 2000-03-14 Biosource Technologies, Inc. Process for isolating and purifying viruses, soluble proteins and peptides from plant sources
US6303575B1 (en) * 1998-05-12 2001-10-16 The Regents Of The University Of California Indolicidin analogs and methods of using same
WO2001019969A1 (en) * 1999-09-16 2001-03-22 Large Scale Biology Corporation A process for isolating and purifying viruses, soluble proteins and peptides from plant sources
US20020061309A1 (en) * 2000-03-08 2002-05-23 Garger Stephen J. Production of peptides in plants as N-terminal viral coat protein fusions
US6730306B1 (en) * 2000-03-08 2004-05-04 Large Scale Biology Corporation Parvovirus vaccine as viral coat protein fusions
MXPA03006454A (es) 2001-01-18 2004-02-12 Icon Genetics Inc Utilizacion de virus para detectar o purificar proteinas.
US20030033637A1 (en) * 2001-06-05 2003-02-13 Croptech Corporation Gene expression and production of TGF-beta proteins including bioactive mullerian inhibiting substance from plants
WO2003050540A2 (en) * 2001-12-05 2003-06-19 Large Scale Biology Corporation Flexible method and apparatus for high throughput production and purification of multiple proteins
US7442391B2 (en) * 2002-01-25 2008-10-28 Integrated Botanical Technologies, Llc Bioactive botanical cosmetic compositions and processes for their production
US8277852B2 (en) * 2002-01-25 2012-10-02 Akzo Nobel Surface Chemistry Llc Bioactive botanical cosmetic compositions and processes for their production
AU2003237528A1 (en) * 2002-06-07 2003-12-22 Kentucky Bioprocessing, Llc Flexible vaccine assembly and vaccine delivery platform
US6920521B2 (en) * 2002-10-10 2005-07-19 International Business Machines Corporation Method and system of managing virtualized physical memory in a data processing system
WO2004044161A2 (en) * 2002-11-06 2004-05-27 Fraunhofer Usa Expression of foreign sequences in plants using trans-activation system
US7683238B2 (en) * 2002-11-12 2010-03-23 iBio, Inc. and Fraunhofer USA, Inc. Production of pharmaceutically active proteins in sprouted seedlings
US7692063B2 (en) * 2002-11-12 2010-04-06 Ibio, Inc. Production of foreign nucleic acids and polypeptides in sprout systems
EP2192172B1 (en) * 2003-02-03 2014-12-03 iBio, Inc. System for expression of genes in plants
CN103074316B (zh) 2003-05-22 2015-10-21 美国弗劳恩霍夫股份有限公司 用于表达、传递及纯化目标多肽的重组载体分子
ES2652603T3 (es) * 2004-01-12 2018-02-05 Isp Investments Llc Composiciones bioactivas de plantas de Theacea y procedimientos para su producción y uso
CA2553257A1 (en) * 2004-01-14 2005-08-04 Ohio University Methods of producing peptides/proteins in plants and peptides/proteins produced thereby
WO2005081905A2 (en) 2004-02-20 2005-09-09 Fraunhofer Usa Inc. Systems and methods for clonal expression in plants
US8623812B2 (en) * 2004-04-19 2014-01-07 Ohio University Cross-linkable glycoproteins and methods of making the same
US20060288449A1 (en) * 2004-10-12 2006-12-21 Garger Stephen J Process for purifying target compounds from plant sources using ceramic filtration
US7157644B2 (en) * 2004-12-16 2007-01-02 General Cable Technology Corporation Reduced alien crosstalk electrical cable with filler element
TW200634156A (en) * 2004-12-30 2006-10-01 Schering Plough Ltd Neutralizing epitope-based growth enhancing vaccine
WO2007008708A2 (en) * 2005-07-08 2007-01-18 Ohio University Methods of predicting hyp-glycosylation sites for proteins expressed and secreted in plant cells, and related methods and products
KR101446025B1 (ko) * 2005-08-03 2014-10-01 아이바이오, 인크. 면역글로불린의 생산을 위한 조성물 및 방법
JP2009526780A (ja) * 2006-02-13 2009-07-23 フラウンホーファー ユーエスエー， インコーポレイテッド Ｈｐｖ抗原、ワクチン組成物、および関連する方法
US8277816B2 (en) * 2006-02-13 2012-10-02 Fraunhofer Usa, Inc. Bacillus anthracis antigens, vaccine compositions, and related methods
AU2007215080A1 (en) * 2006-02-13 2007-08-23 Fraunhofer Usa, Inc. Influenza antigens, vaccine compositions, and related methods
GB0605684D0 (en) * 2006-03-21 2006-05-03 Sicor Biotech Uab Method For Purifying Granulocyte-Colony Stimulating Factor
CA2663034C (en) * 2006-09-15 2016-05-03 Ottawa Health Research Institute Oncolytic rhabdovirus
US20080214795A1 (en) * 2007-02-14 2008-09-04 Amgen Inc. Method of isolating antibodies by precipitation
EP2152301A4 (en) * 2007-04-28 2010-07-28 Fraunhofer Usa Inc TRYPANOSOME ANTIGENS, VACCINE COMPOSITIONS AND RELATED METHODS
CA2692933C (en) 2007-07-11 2016-10-18 Fraunhofer Usa, Inc. Yersinia pestis antigens, vaccine compositions, and related methods
US20110059130A1 (en) * 2007-08-20 2011-03-10 Fraunhofer Usa, Inc. Prophylactic and therapeutic influenza vaccines, antigens, compositions and methods
WO2010037046A1 (en) 2008-09-28 2010-04-01 Fraunhofer Usa, Inc. Humanized neuraminidase antibody and methods of use thereof
WO2011041391A1 (en) 2009-09-29 2011-04-07 Fraunhofer Usa, Inc. Influenza hemagglutinin antibodies, compositions, and related methods
JP2013523175A (ja) 2010-04-14 2013-06-17 イーエムディー・ミリポア・コーポレーション 高力価、高純度のウイルスストックの作製方法及びその使用方法
JP6007463B2 (ja) * 2011-04-18 2016-10-12 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 薬剤送達粒子及びその製造方法
US20150152457A1 (en) 2012-03-30 2015-06-04 Danisco Us Inc. Direct starch to fermentable sugar
US9315831B2 (en) 2012-03-30 2016-04-19 Danisco Us Inc. Direct starch to fermentable sugar as feedstock for the production of isoprene, isoprenoid precursor molecules, and/or isoprenoids
US9301544B2 (en) 2013-03-14 2016-04-05 R.J. Reynolds Tobacco Company Protein-enriched tobacco-derived composition
US9175052B2 (en) * 2013-05-17 2015-11-03 R.J. Reynolds Tobacco Company Tobacco-derived protein compositions
CN103543264B (zh) * 2013-11-05 2015-10-07 广西大学 淮山药x病毒的多克隆抗体制备、检测及其应用
CN107109392A (zh) 2014-10-01 2017-08-29 非凡食品有限公司 提取和纯化非变性蛋白质的方法
US20170165252A1 (en) 2015-12-10 2017-06-15 Niconovum Usa Inc. Protein-enriched therapeutic composition
US11612183B2 (en) 2015-12-10 2023-03-28 R.J. Reynolds Tobacco Company Protein-enriched tobacco composition
US10499684B2 (en) 2016-01-28 2019-12-10 R.J. Reynolds Tobacco Company Tobacco-derived flavorants
US10155176B1 (en) 2016-11-03 2018-12-18 Healer, LLC Process for the production of a concentrated cannabinoid product
US11091446B2 (en) 2017-03-24 2021-08-17 R.J. Reynolds Tobacco Company Methods of selectively forming substituted pyrazines
US10745682B2 (en) 2017-06-14 2020-08-18 R.J. Reynolds Tobacco Company Method of producing RuBisCO protein fibers
US20180362957A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 R. J. Reynolds Tobacco Company RuBisCO Protein-Based Films
US10757964B2 (en) 2017-07-20 2020-09-01 R.J. Reynolds Tobacco Company Purification of tobacco-derived protein compositions
US11051532B2 (en) 2017-09-22 2021-07-06 Impossible Foods Inc. Methods for purifying protein
US11529413B2 (en) 2018-06-12 2022-12-20 Kbio Holdings Limited Virus and antigen purification and conjugation
US11690907B2 (en) 2018-06-12 2023-07-04 Kbio Holdings Limited Vaccines formed by virus and antigen conjugation
US11696948B2 (en) 2018-06-12 2023-07-11 Kbio Holdings Limited Vaccines formed by virus and antigen conjugation
US11523623B2 (en) 2019-01-18 2022-12-13 R.J. Reynolds Tobacco Company Plant-derived protein purification
US12011016B2 (en) 2020-09-14 2024-06-18 Impossible Foods Inc. Protein methods and compositions

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2593540A (en) 1945-09-01 1952-04-22 American Viscose Corp Semipermeable membrane
US2610932A (en) 1950-07-27 1952-09-16 Laval Separator Co De Clarification of sugar cane juice
BE608328A (ja) 1960-09-19
SE338229B (ja) * 1964-09-28 1971-08-30 Budapesti Mueszaki Egyetem A
US3342729A (en) 1964-12-09 1967-09-19 Dow Chemical Co Permeability separatory cell and apparatus and method of using the same
US4083732A (en) 1965-01-11 1978-04-11 Paley Lewis A Sugar juice treatment
US3298865A (en) 1966-04-18 1967-01-17 Bode Harold Eli Crude sugar liquor defecation process
GB1350261A (en) 1970-10-16 1974-04-18 Hitachi Shipbuilding Eng Co Sugar refining process
SU654149A3 (ru) 1971-05-28 1979-03-25 Kohler George O Способ получени протеиновой кормовой добавки из зеленой массы
US3914410A (en) 1972-06-13 1975-10-21 Bristol Myers Co Method for preparing sucrose composition containing chromium III salt
ZA752191B (en) 1974-04-17 1976-11-24 Dorr Oliver Inc Treatment of raw sugar juice
US4006078A (en) 1974-07-08 1977-02-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Preparation of soluble edible protein from leafy green crops
JPS5912278B2 (ja) 1976-04-01 1984-03-22 三井製糖株式会社 甘庶汁から栄養糖を製造する方法
US4006633A (en) 1976-04-22 1977-02-08 Bethlehem Steel Corporation Method and apparatus for determining heat removal from a continuous caster
HU174943B (hu) * 1976-06-30 1980-04-28 Vepex Foevallalkozasi Iroda Rt Sposob poluchenija koncentratov rastitel'nogo belka i pigmenta
US4156618A (en) 1976-09-07 1979-05-29 Asahi-Dow Limited Process for separating ketoses and aldoses
CA1028552A (en) 1976-09-30 1978-03-28 Edward D. Murray Protein product and process for preparing same
US4250197A (en) * 1976-10-25 1981-02-10 Vepex Fovallalkopasi Iroda Rt. Method for processing plant protein
US4130553A (en) * 1977-01-05 1978-12-19 Batley Jr William R Process for improving the nutritional value of green plant protein
US4234350A (en) 1979-05-07 1980-11-18 Davies Hamakua Sugar Co., A Division Of Theo. H. Davies, Ltd. Process for the purification of evaporated sugar solutions
US4347324A (en) * 1979-09-24 1982-08-31 Leaf Proteins, Inc. Process for isolation of proteins from plant leaves
US4268632A (en) * 1979-09-24 1981-05-19 Leaf Proteins, Inc. Process for isolation of ribulose 1,5-diphosphate carboxylase from plant leaves
US4289147A (en) * 1979-11-15 1981-09-15 Leaf Proteins, Inc. Process for obtaining deproteinized tobacco freed of nicotine and green pigment, for use as a smoking product
US4359530A (en) 1980-09-08 1982-11-16 Aluminum Company Of America Protein extraction from green crops
FR2490676B1 (fr) * 1980-09-19 1985-07-19 Rhone Poulenc Spec Chim Procede d'epuration des jus de canne a sucre
US4334024A (en) * 1980-11-03 1982-06-08 Sarjit Johal Preparation and crystallization of fraction I protein from plant sources
US4400471A (en) * 1980-11-03 1983-08-23 Johal Sarjit S Preparation and crystallization of Fraction I protein from plant sources
US4396763A (en) * 1981-01-14 1983-08-02 Meiji Milk Products Company Limited High molecular polysaccharide MPS-80
FI61988C (fi) 1981-01-28 1982-11-10 Vehnae Ab Oy Foerfarande foer fraktionering av spannmaolsmjoel till fraktioner av livsmedelskvalitet
SU946488A1 (ru) * 1981-02-27 1982-07-30 Центральный Научно-Исследовательский И Проектно-Технологический Институт Механизации И Электрификации Животноводства Южной Зоны Ссср Способ получени протеинового концентрата из сока зеленых растений
US4370267A (en) * 1981-08-10 1983-01-25 A. E. Staley Manufacturing Company Fractionation and isolation of 7S and 11S protein from isoelectrically precipitated vegetable protein mixtures
US4430849A (en) 1981-11-03 1984-02-14 Powell Manufacturing Co. Harvester for tea or the like
US5320953A (en) * 1982-08-12 1994-06-14 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Process for synthesizing human H1-prorelaxin, H1-relaxin and fusion proteins thereof
US4963356A (en) 1982-10-13 1990-10-16 Minnesota Mining And Manufacturing Company Stable antigenic extracts methods
US5173410A (en) * 1984-02-15 1992-12-22 Lubrizol Genetics Inc. Transfer vector
US4885248A (en) * 1984-02-15 1989-12-05 Lubrizol Genetics, Inc. Transfer vector
DE3407364A1 (de) 1984-02-29 1985-08-29 Pfeifer & Langen, 5000 Köln Naturbelassener vollrohrzucker und verfahren zu seiner herstellung
CA1288073C (en) * 1985-03-07 1991-08-27 Paul G. Ahlquist Rna transformation vector
US5466788A (en) * 1985-03-07 1995-11-14 Mycogen Plant Science, Inc. Subgenomic promoter
JPS61212217A (ja) 1985-03-18 1986-09-20 日本たばこ産業株式会社 タバコ葉収穫用脱葉装置
US5597945A (en) * 1986-07-25 1997-01-28 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Plants genetically enhanced for disease resistance
DE3850683T2 (de) * 1987-02-09 1994-10-27 Lubrizol Genetics Inc Hybrides RNS-Virus.
US5316931A (en) * 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
US4950332A (en) 1988-03-17 1990-08-21 The Dow Chemical Company Process for decolorizing aqueous sugar solutions via adsorbent resins, and desorption of color bodies from the adsorbent resins
US4871397A (en) 1988-05-09 1989-10-03 The Dow Chemical Company Process for decolorizing aqueous sugar solution
GB2221696B (en) 1988-07-15 1991-10-02 Itoh Sugar Co Ltd C Method for refining sugar liquor
US5498544A (en) 1988-11-10 1996-03-12 Regents Of The University Of Minnesota Method and an acetyl CoA carboxylase gene for conferring herbicide tolerance
US5077390A (en) * 1989-04-04 1991-12-31 Genelabs, Incorporated Purified trichosanthin and method of preparation
PT92072B (pt) 1989-10-23 1995-06-30 Rar Refinarias Acucar Reunidas Processo para descoloracao e descalcificacao de solucoes de acucar
US5281279A (en) 1991-11-04 1994-01-25 Gil Enrique G Process for producing refined sugar from raw juices
US5301694A (en) * 1991-11-12 1994-04-12 Philip Morris Incorporated Process for isolating plant extract fractions
CA2140891A1 (en) * 1992-07-24 1994-02-03 David C. Parmelee Peptides useful as internal standards for microsequencing and methods for their use
JP2787539B2 (ja) * 1993-02-26 1998-08-20 松森　　昭 ウイルス性疾患の予防または治療剤
FR2707997B1 (fr) 1993-07-19 1995-09-29 Applexion Ste Nle Rech Applic Procédé de raffinage d'un sucre brut, notamment de sucre roux provenant de l'industrie sucrière de la canne à sucre.
US5554227A (en) 1993-11-12 1996-09-10 Societe Nouvelle De Recherches Et D'applications Industrielles D'echangeurs D'ions Applexion Process of manufacturing crystal sugar from an aqueous sugar juice such as cane juice or sugar beet juice
US5693506A (en) 1993-11-16 1997-12-02 The Regents Of The University Of California Process for protein production in plants
US5468300A (en) 1994-04-07 1995-11-21 International Food Processing Incorporated Process for producing refined sugar directly from sugarcane
US6096136A (en) 1996-10-18 2000-08-01 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Method for producing white sugar
RU2114177C1 (ru) 1997-06-02 1998-06-27 Товарищество с ограниченной ответственностью Центр содействия развитию новых технологий "Кантэк" Способ производства сахарного сиропа из сахаросодержащего сырья
US6037456A (en) * 1998-03-10 2000-03-14 Biosource Technologies, Inc. Process for isolating and purifying viruses, soluble proteins and peptides from plant sources
JPH11313634A (ja) 1998-03-12 1999-11-16 Internatl Flavors & Fragrances Inc <Iff> 呈味剤とその製造方法
US6194636B1 (en) 1999-05-14 2001-02-27 Dekalb Genetics Corp. Maize RS324 promoter and methods for use thereof
US6174378B1 (en) 1999-08-19 2001-01-16 Tate Life Industries, Limited Process for production of extra low color cane sugar
US6730306B1 (en) * 2000-03-08 2004-05-04 Large Scale Biology Corporation Parvovirus vaccine as viral coat protein fusions
US6479636B1 (en) 2000-04-11 2002-11-12 Honiron Corporation (A Louisiana Corporation) Sugarcane fractioning system
WO2002083715A1 (en) 2001-04-10 2002-10-24 Honiron Corporation Method and apparatus for fractional separation of proteins from plant material

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013544522A (ja) * 2010-12-01 2013-12-19 アール・ジエイ・レイノルズ・タバコ・カンパニー タバコ由来材料を抽出するためのタバコ分離方法、および関連の抽出システム
JP2021526836A (ja) * 2018-06-12 2021-10-11 ケンタッキー バイオプロセシング，インコーポレイテッド ウイルスと抗原の精製及び結合
JP7315590B2 (ja) 2018-06-12 2023-07-26 クビオ・ホールディングス・リミテッド ウイルスと抗原の精製及び結合

Also Published As

Publication number Publication date
CA2322616C (en) 2008-05-27
US6740740B2 (en) 2004-05-25
KR20010034565A (ko) 2001-04-25
AU3072599A (en) 1999-09-27
DE69934269T2 (de) 2007-09-20
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ATE346861T1 (de) 2006-12-15
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EP1062235B1 (en) 2005-11-16
DE69928379T2 (de) 2006-08-03
WO1999046288A3 (en) 2000-01-20
EP1561758B1 (en) 2006-11-29
US6033895A (en) 2000-03-07
AU747647B2 (en) 2002-05-16
EP1062235A2 (en) 2000-12-27
US20040171813A1 (en) 2004-09-02
CA2322616A1 (en) 1999-09-16
EP1561758A1 (en) 2005-08-10
ATE310017T1 (de) 2005-12-15

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