CN107109392A - 提取和纯化非变性蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

提供用于提取和纯化蛋白质的材料和方法。举例来说，本文所提供的材料和方法可用于提取和纯化在低温下变性的蛋白质。

Description

提取和纯化非变性蛋白质的方法
相关申请案的交叉引用
本申请案要求2014年10月6日申请的美国临时申请案第62/060,400号和2014年10月1日申请的62/058,211的优先权，它们都以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本文涉及用于提取和纯化蛋白质的材料和方法，并且具体来说涉及用于提取和纯化在低温下变性的蛋白质的材料和方法。
背景技术
未变性状态的低温变性蛋白质对于食品仿真产品(例如乳酪或肉类仿真产品，例如牛肉仿真产品)的成功至关重要。现有商业蛋白质提取工艺包括降解蛋白质的单元操作和条件，并且不适用于制造含有这类蛋白质的产品。另外，大部分蛋白质具有相关的颜色和气味，这可能对其在食品仿真产品中的效用有负面影响。
发明内容
本文至少部分基于用于从植物材料提取和纯化蛋白质，使得蛋白质保留其非变性状态而不具有其相关颜色和气味的工艺的开发。举例来说，本文至少部分基于如下出人意料的发现，亲水性聚合物并且具体来说聚乙二醇(PEG)可以从蛋白质溶液吸附有颜色和有气味的化合物。
一方面，本文提供一种用于从生物质纯化蛋白质的方法。所述方法可以包括用含有PEG和任选地絮凝剂的水溶液提取生物质，产生含有大块固体和提取物的提取浆液；任选地将提取浆液的pH调整到pH 2到10；收集提取物并且添加盐形成两相混合物；分离两相混合物产生PEG相和产物相；以及收集和过滤产物相产生含有蛋白质的经过滤的产物相。生物质可以包括植物材料。(例如花或叶子)。植物可以是藻类、玉米、小麦、大米、高粱、黑麦、芥花、小米、大麦、大豆、向日葵、红花、烟草、苜蓿、马铃薯、芸苔属、棉花、西红柿或烟草。蛋白质可以是核酮糖二磷酸羧化酶。PEG的分子量可以是约8000。絮凝剂可以包括烷基胺表氯醇。盐可以包括硫酸镁。分离步骤可以包括重力沉降或离心(例如使用圆盘堆叠离心机)。过滤可以包括微过滤。所述方法可以进一步包括浓缩和透滤经过滤的产物相，产生产物浓缩物。透滤可以包括使用超滤膜系统。所述方法可以进一步包括对产物浓缩物灭菌，获得经灭菌的产物浓缩物。灭菌可以包括UV照射、巴氏灭菌或微过滤。所述方法可以进一步包括干燥所述经灭菌的产物浓缩物。干燥可以包括在温和条件下使用喷雾干燥器或冷冻干燥器。
另一方面，本文提供一种从蛋白质溶液去除杂质的方法。所述方法可以包括向蛋白质溶液添加亲水性聚合物和盐，产生聚合物富集相和蛋白质相，并且分离聚合物富集相与蛋白质相。亲水性聚合物可以是PEG。PEG的分子量可以是约8000。所述方法可以进一步包括向蛋白质溶液添加絮凝剂。絮凝剂可以含有烷基胺表氯醇。盐可以包括硫酸镁。所述方法可以进一步包括将蛋白质溶液的pH调整到pH 2到10。蛋白质可以是核酮糖二磷酸羧化酶。分离可以包括重力沉降或离心(例如使用圆盘堆叠离心机离心)。所述方法可以进一步包括过滤所述蛋白质相产生经过滤的产物相(例如通过微过滤)。所述方法可以进一步包括浓缩和透滤经过滤的产物相，产生产物浓缩物。透滤可以包括使用超滤膜系统。所述方法可以进一步包括对产物浓缩物灭菌，获得经灭菌的产物浓缩物(例如通过UV照射、巴氏灭菌或微过滤)。所述方法可以进一步包括干燥所述经灭菌的产物浓缩物(例如在温和条件下使用喷雾干燥器或冷冻干燥器)。
本文还提供一种含有核酮糖二磷酸羧化酶和亲水性聚合物的组合物，其中亲水性聚合物以低于约0.1％(w/w)的浓度存在。亲水性聚合物可以是PEG。亲水性聚合物可以低于约0.01％(w/w)的浓度存在。
另一方面，本文提供一种用于纯化蛋白质的方法，其中所述方法包括提供已经去除固体的蛋白质悬浮液；任选地向蛋白质悬浮液添加盐；任选地将蛋白质悬浮液的pH调整到pH 2到10；针对PEG溶液渗析蛋白质悬浮液，或使PEG在膜的渗透侧的方式对蛋白质悬浮液进行超滤；以及使经渗析或超滤的蛋白质溶液进行一或多个浓缩或过滤步骤，产生含有蛋白质的产物相。蛋白质悬浮液可以含有一或多种来自植物材料的蛋白质。植物材料可以包括花或叶子。植物可以是藻类、玉米、小麦、大米、高粱、黑麦、芥花、小米、大麦、大豆、向日葵、红花、烟草、苜蓿、马铃薯、芸苔属、棉花、西红柿或烟草。蛋白质可以是核酮糖二磷酸羧化酶。PEG的分子量可以是约8000。提供步骤可以包括提取经分解的生物质以去除固体并且产生蛋白质悬浮液，任选地向生物质添加絮凝剂。絮凝剂可以包括烷基胺表氯醇。提取可以包括使用重力沉降或离心来分离固体与蛋白质悬浮液。盐可以包括硫酸镁。一或多个过滤步骤可以包括透滤。所述方法可以包括浓缩和过滤经渗析或超滤的蛋白质溶液，产生产物浓缩物。所述方法可以进一步包括对产物浓缩物灭菌，获得经灭菌的产物浓缩物，和/或干燥经灭菌的产物浓缩物(例如在温和条件下使用喷雾干燥器或冷冻干燥器)。
另一方面，本文提供一种用于纯化蛋白质的方法，其包含提供已经去除固体的蛋白质悬浮液；任选地向蛋白质悬浮液添加盐；任选地将蛋白质悬浮液的pH调整到pH 2到10；向包含PEG的支撑物施加蛋白质悬浮液；以及收集未保留在支撑物上的蛋白质相。蛋白质悬浮液可以含有一或多种来自植物材料的蛋白质。植物材料可以包括花或叶子。植物可以是藻类、玉米、小麦、大米、高粱、黑麦、芥花、小米、大麦、大豆、向日葵、红花、烟草、苜蓿、马铃薯、芸苔属、棉花、西红柿或烟草。蛋白质可以是核酮糖二磷酸羧化酶。PEG的分子量可以是约8000。提供步骤可以包括提取经分解的生物质以去除固体并且产生蛋白质悬浮液，任选地向生物质添加絮凝剂。絮凝剂可以包括烷基胺表氯醇。提取可以包括使用重力沉降或离心来分离固体与蛋白质悬浮液。盐可以包括硫酸镁。所述方法可以包括用包含PEG的支撑物培育蛋白质悬浮液持续24到48小时。所述方法可以进一步包括浓缩蛋白质相产生产物浓缩物，和/或对产物浓缩物灭菌获得经灭菌的产物浓缩物，和/或干燥经灭菌的产物浓缩物(例如在温和条件下使用喷雾干燥器或冷冻干燥器)。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料实践本发明，但适合的方法和材料描述如下。本文提到的所有公开案、专利申请案、专利和其它参考文献都以全文引用的方式并入。在矛盾的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅仅是说明性的并且不打算是限制性的。
在附图和以下描述中阐述本发明的一或多个实施例的细节。本发明的其它特征、目标和优势将在具体实施方式和附图以及权利要求书中显而易知。
附图说明
图1为显示如本文所提供的提取和纯化过程的通用实施例的步骤的流程图。
图2A为显示如本文所提供的提取和纯化过程的一个实施例的步骤的流程图。图2B为描绘图2A中所描绘的方法的替代实施例的流程图。
图3为显示如本文所提供的提取和纯化过程的另一个实施例的步骤的流程图。
图4为显示基于pH的纯化过程的一个实施例的步骤的流程图。
图5为显示色谱纯化过程的一个实施例的步骤的流程图。
图6为显示膨胀床色谱纯化过程的一个实施例的步骤的流程图。
图7为显示利用膜的纯化过程的一个实施例的步骤的流程图。
图8为显示利用固定PEG的纯化过程的一个实施例的步骤的流程图。
图9为显示PEG再循环方法的一个实施例的步骤的流程图。
图10为显示如本文所提供的提取和纯化过程的另一个实施例的步骤的流程图，指示可能添加的有用步骤。
具体实施方式
未变性状态的低温变性蛋白质对于食品仿真产品(例如牛肉仿真产品)的成功至关重要。然而，现有商业蛋白质提取工艺可能导致这类蛋白质的变性。另外，可能在食品仿真产品中具有功能的大部分蛋白质具有相关颜色和气味，这可能降低或抑制其应用。举例来说，核酮糖二磷酸羧化酶(核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶)代表了植物叶绿体中的约30到50％可溶性蛋白质，它的绿色颜色和青草味气味可能抑制其在食品仿真产品中的应用。核酮糖二磷酸羧化酶也在低温(50℃到60℃)下变性。别处针对提取核酮糖二磷酸羧化酶报道的方法包括例如在50℃到60℃下基于加热的沉淀、用高浓度的还原剂提取、非核酮糖二磷酸羧化酶蛋白质的基于温度的沉淀、碳吸附、基于结晶的纯化和/或在pH 11下提取随后在pH 4.5下沉淀蛋白质以及用有机溶剂大规模洗涤(参看例如美国专利案第3,959,246号、第4,006,078,4,334,024号以及第4,588,691号；PCT公开案第WO2011/078671号；拉姆索(Lamsal)等人,美国农业工程师学会会报(Trans.ASAE)46(3):715-720,2003)；以及杨(Yang)等人,农业与食品化学杂志(J.Agric.Food Chem.)52:2223-2225,2004)。
本文所提供的材料和方法可以用于提取和纯化足够量并且具有可用于食品仿真产品中的适合特征的低温变性蛋白质(诸如核酮糖二磷酸羧化酶)。这些方法可以在低至一个步骤中提供高纯度的产品，并且在一些情况下，不使用色谱法。所述方法还可以提供通过使用化学行业的常规提取设备按比例放大的可能性，并且具有低资本支出和提高的制造回收率。
本文所提供的方法可以包括使用亲水性聚合物，诸如聚乙二醇(PEG)。举例来说，一种方法可以包括PEG分散和提取有色体的步骤，随后含水的两相分离步骤。在一些实施例中，PEG相的体积浓度可以是2％(w/v)到50％(w/v)PEG(例如2-10％(w/v)、10-25％(w/v)或25-50％(w/v))，潜在地盐析蛋白质。有色体对PEG的亲和力可能导致其与混合物的其余部分分离。PEG的分子量在约300到约300,000范围内(例如300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000或300,000、约300到约3000、约3000到约10,000、约10,000到约30,000、约30,000到约100,000，或约100,000到约300,000)。在一些情况下，举例来说，PEG的分子量可以是约8000。
在一些实施例中，生物质(例如花、叶子或其它植物材料)可以通过粉碎机和/或高剪切混合机研磨，接着用含有PEG(例如分子量8000PEG)和任选地一或多种含有烷基胺表氯醇、聚二甲基二烯丙基氯化铵或多元胺(例如或)的絮凝剂的水提取，形成提取浆液。一或多种絮凝剂可以帮助减少离心分离液中留存的微细固体的量并且略微减少离心分离液的颜色。PEG的存在可以提高蛋白质的溶解度并且可以提高产量；还观测到PEG会减少提取物中留存的微细固体的量。
接着可以倾析(例如使用倾析式离心机)提取浆液来分大块固体与提取物。提取物可以收集到搅拌槽反应器中，并且可以向其中添加盐形成两相混合物。盐可以使PEG形成不连续相并且从溶液分离出来。适用的盐包括例如金属(例如钠、钾、钙、镁、锌、铁、钴或铝)与抗衡离子(例如氯离子、溴离子、硫酸根、硝酸根、乙酸根、氰离子、柠檬酸根、碳酸根、乙酸根或磷酸根)的盐。在一些实施例中，盐是NaCl或MgSO4。还可以使用盐的混合物。盐浓度可以是约100mM到约2M(例如100到200mM、200到500mM、500到750mM、750mM到1M或1到2M)。
由例如叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮的小分子组成的有色化合物和反应产物(例如酶促、氧化或褐变反应产物)可以排斥体积选择性地留在PEG相中，而蛋白质留在盐水溶液中。有气味化合物(例如青草味、绿色气味化合物)也可以排斥体积留在PEG相中。两相混合物接着可以分离成PEG相和产物相(例如通过重力沉降或使用离心机，例如圆盘堆叠离心机)。回收的PEG层可以送回到提取槽用于随后提取，直到其被有色组分饱和。这时，PEG相可以经热处理来分离纯PEG和溶液中的有色体。应注意，在一些实施例中，在固体分离步骤之后，可以向相分离步骤添加PEG(和任选的絮凝剂)。
与两相混合物分离的产物相可以经微过滤(例如通过切向流过滤系统或一次性通过空端微过滤系统)来分离任何残余微细固体和微生物。经过滤的产物相可以使用超滤膜系统或色谱法与超滤膜系统的组合浓缩并且用水透滤，产生产物浓缩物。这一步骤可以允许分离经过滤的产物相中的剩余PEG和盐。产物浓缩物还可以进行微生物减少步骤，其可以包含例如巴氏灭菌(例如高温短时巴氏灭菌或高压巴氏灭菌)、UV照射或γ照射。在一些情况下，非热方法可能适用。产物浓缩物(灭菌或非灭菌)可以在温和条件下使用喷雾干燥器或冷冻干燥器等干燥，确保蛋白质不变性，产生脱色脱味的纯蛋白质。应注意，产物可以含有低含量(例如低于约1％(w/w)、0.1％(w/w)、0.01％(w/w)、约0.001％(w/w)、约0.0001％(w/w)或约0.00001％(w/w))PEG。
在一些实施例中，亲水性聚合物(例如PEG)并非必须与蛋白质悬浮液物理接触，但可以经孔径足够小以防止聚合物或目标蛋白质转移的渗透膜与蛋白质悬浮液分离。举例来说，PEG和蛋白质悬浮液可以经孔径为约3kDa到约500kDa(例如3到5kDa、5到10kDa、10到30kDa、30到50kDa、50到100kDa或100到500kDa)的膜分离。PEG相的浓度可以是2-50％(w/v)PEG(例如2-10％、10-25％或25-50％)。蛋白质悬浮液可以含有一或多种盐来促进有色体和异味化合物转移。在一些实施例中，还可以调整蛋白质溶液的pH(例如调整到介于2与10之间的pH)来促进有色和异味化合物的转移。如上所述，蛋白质悬浮液可以包括盐，例如(但不限于)金属(例如钠、钾、钙、镁、锌、铁、钴或铝)与抗衡离子(例如氯离子、溴离子、硫酸根、硝酸根、乙酸根、氰离子、柠檬酸根、碳酸根、乙酸根或磷酸根)的盐(例如NaCl或MgSO4)，或盐的混合物。同样，盐浓度可以在约100mM到约2M范围内。有色体对PEG的亲和力可能导致其与混合物的其余部分分离。如上所述，PEG的分子量可以在约300Da到约300,000Da范围内(例如约8000Da)。使用PEG以间接脱去有色体和异味化合物可尤其适用于可能在低PEG浓度下沉淀(因此使随后的相分离成问题)的蛋白质。举例来说，PEG可以跨膜使用，以从(但不限于)大豆7S和豌豆白蛋白蛋白质去除异味。
使用膜保持蛋白质悬浮液与PEG相分离可以消除对相分离步骤的需要。蛋白质和PEG悬浮液可以使用多种方法与渗透膜接触，所述方法例如渗析、返流过滤、超滤、微过滤或纳米过滤。所述膜可以由多种材料中的任一种制成，包括聚合物，例如聚醚砜、聚丙烯、聚偏二氟乙烯、聚丙烯腈、乙酸纤维素以及聚砜。在一些实施例中，膜可以并入到物理基质中，例如陶瓷或钢。
在一些涉及使用膜的实施例中，生物质(例如花、叶子或其它植物材料)可以通过粉碎机和/或高剪切混合机磨碎，接着用含有一或多种絮凝剂(例如 或)的水提取，形成提取浆液。絮凝剂可以帮助减少离心分离液中留存的微细固体的量，并且还可以减少离心分离液的颜色。提取浆液接着可以使用倾析式离心机倾析或穿过螺旋压力单元来分离大块固体和离心分离液。离心分离液可以经切向流过滤系统或一次性通过空端微过滤系统微过滤，去除任何残余微细固体和微生物。微过滤渗透物可以收集于槽中并且可以添加盐以达到特定导电性。这一溶液接着可以针对8％PEG溶液用UF膜透滤。一旦产物脱色，可以停止PEG透滤，并且所得材料可以浓缩并且用水透滤，以获得低盐浓缩脱色的蛋白质(例如核酮糖二磷酸羧化酶)。在一些实施例中，可以对样品进行离心以去除固体。产物浓缩物还可以经历微生物减少步骤，其可以包含例如巴氏灭菌(例如高温短时巴氏灭菌或高压巴氏灭菌)、UV照射或γ照射。在一些情况下，非热方法可能适用。产物浓缩物接着可以在温和条件下使用喷雾干燥器、冷冻干燥器等干燥，确保蛋白质不变性，因此产生脱色脱味的纯蛋白质。
在一些实施例中，亲水性聚合物在与蛋白质悬浮液接触之前可以经固定。同样，生物质(例如花、叶子或其它植物材料)可以使用粉碎机和/或高剪切混合器研磨，并且任选地可以添加一或多种含有烷基胺表氯醇、聚二甲基二烯丙基氯化铵或多元胺(例如或)的絮凝剂形成提取浆液，并且悬浮液任选地可以例如通过倾析、沉降或离心来澄清化，从而去除固体。蛋白质的悬浮液接着可以暴露于经固定的亲水性聚合物(例如PEG)。在一些实施例中，经固定的PEG可以树脂形式存在。树脂可以由具有PEG分子涂层的固体核建构。固体核可以含有多种材料中的任一种，例如琼脂糖、聚碳酸酯、羟基磷灰石、玻璃、金属、木炭、二氧化硅、氧化铝、陶瓷、聚丙烯、聚苯乙烯或二乙烯基苯。如上所述，PEG的分子量可以在约300Da到约300,000Da范围内(例如约8000Da)。在一些实施例中，PEG可以通过交联固定，形成树脂，例如NovaPEG(EMD密理博(EMD Millipore)；马萨诸塞州比勒利卡(Billerica,MA))。在其它实施例中，PEG可以固定于膜上。对于上文所述的方案，蛋白质悬浮液可以含有一或多种盐来促进有色体转移(例如100mM到2M范围内存在的盐，包括金属(例如钠、钾、钙、镁、锌、铁、钴或铝)与抗衡离子(例如氯离子、溴离子、硫酸根、硝酸根、乙酸根、氰离子、柠檬酸根、碳酸根、乙酸根或磷酸根)的盐)。
在利用经固定的亲水性聚合物(例如PEG)的方法的一些实施例中，可以通过将树脂添加到蛋白质悬浮液来将蛋白质悬浮液暴露于所述树脂上的聚合物。在4℃到45℃(例如4℃到10℃、10℃到20℃，或20℃到45℃)下足以允许有色体与PEG缔合的时间段(例如1分钟到48小时，例如1到10分钟、10到30分钟、30到60分钟、60分钟到2小时、2到4小时、4到6小时、6到12小时、12到24小时或24到48小时)之后，可以通过多种方法分离蛋白质与经固定的PEG，所述方法包括重力过滤、真空或离心过滤、沉降和倾析，或离心和分离离心分离液。经固定的PEG任选地可以经洗涤以去除所夹带的蛋白质。
在一些实施例中，经固定的PEG可以用作色谱树脂。蛋白质悬浮液可以在有色体结合于树脂但目标蛋白质流过床并且被收集的条件下穿过树脂床。同样，蛋白质相可以含有一或多种盐来促进有色体的结合。
经脱色脱味的蛋白质悬浮液可以经进一步加工产生经脱色脱味的蛋白质粉末。举例来说，经脱色的蛋白质可以浓缩和透滤。在一些实施例中，经脱色的蛋白质悬浮液可以经离心去除固体。浓缩物还可以进行微生物减少步骤。如上所述，这类程序可以包括巴氏灭菌(例如高温短时巴氏灭菌或高压巴氏灭菌)、UV照射或γ照射，或非热方法。产物浓缩物接着可以在温和条件下干燥(例如使用喷雾干燥器、冷冻干燥器等)，确保蛋白质不变性，产生脱色脱味的纯蛋白质。
现在转而参看图式，图1是描绘如本文所提供的方法的一个实施例中的通用步骤的流程图。一般来说，提取步骤110(例如使用分解/研磨/均质化生物质和缓冲液)可以后面接着是固体分离步骤120(例如通过倾析和添加絮凝剂，以及任选地还有PEG)、颜色去除步骤130(例如通过添加PEG和盐，以及任选地絮凝剂，在一些实施例中后面是色谱法、pH沉淀和再增溶)、灭菌步骤140(例如通过微过滤、巴氏灭菌或UV照射)和浓缩步骤150(例如通过超滤或薄膜蒸发，后面是干燥)。
图2是描绘如本文所提供的提取和纯化方法的一个示范性实施例中的步骤的流程图。蛋白质富集固体进行分解步骤210，后面是使用含有PEG和任选地一或多种絮凝剂的水溶液的提取220。在步骤230中分离出固体。向提取物添加盐(例如经再循环步骤265)，并且相分离步骤240分离PEG与蛋白质产物相。PEG在步骤245中再循环用于将来的提取步骤。蛋白质产物相进行过滤步骤250，后面是浓缩步骤260，在此期间去除盐并且经步骤265再循环用于将来的相分离步骤。浓缩的蛋白质产物进行灭菌步骤270和干燥步骤280，产生脱色脱味的非变性蛋白质产物。使用这一方法的实例提供于下文实例1中。
图2B是显示图2A中描绘的方法的替代实施例中的步骤的流程图。在这一实施例中，向相分离步骤240中添加PEG和任选地絮凝剂，并且PEG再循环到进一步相分离步骤。
图3是描绘如本文所提供的提取和纯化过程的另一个实施例中的步骤的流程图，其中在初始提取步骤之后添加PEG。蛋白质富集固体进行分解步骤310，后面是使用任选地含有一或多种絮凝剂的水溶液的提取步骤320。在步骤330中分离固体，并且提取物分别在步骤340和350中过滤和浓缩。添加PEG和盐产生多相混合物。在步骤360中分离各相。PEG在步骤365中再循环用于将来的分离步骤。蛋白质产物相在步骤370中浓缩，在此期间去除盐并且在步骤375中再循环用于将来的相分离和/或浓缩步骤。浓缩的蛋白质产物进行灭菌步骤380和干燥步骤390，产生脱色脱味的非变性蛋白质。
图4是描绘基于pH的纯化过程的一个实施例中的步骤的流程图。蛋白质富集固体进行分解步骤410，后面是使用添加的提取缓冲液的提取步骤420(例如任选地含有絮凝剂的水溶液)。在步骤430中分离固体，并且剩余溶液在步骤440中过滤，并且在步骤450中浓缩。在步骤460中混合稀酸与浓缩物，并且在步骤470中分离出蛋白质。在步骤475中混合稀碱与蛋白质，随后蛋白质产物进行灭菌步骤480和干燥步骤490。这一方法的用途的实例提供于下文实例3中。
图5为描绘色谱纯化过程的一个实施例中的步骤的流程图。蛋白质富集固体进行分解步骤510，后面是使用提取缓冲液的提取步骤520(例如任选地含有絮凝剂的水溶液)。在步骤530中分离固体，并且剩余溶液在步骤540中过滤，并且在步骤550中浓缩。在步骤560中将浓缩物施加于色谱柱(例如凝胶过滤柱)并且洗出非蛋白质和未结合材料。洗脱蛋白质并且接着在步骤570中浓缩，随后经浓缩的蛋白质产物进行灭菌步骤580和干燥步骤590。这一方法的用途的实例提供于下文实例4中。
图6为描绘膨胀床色谱纯化方法的一个实施例的步骤的流程图。蛋白质富集固体进行分解步骤610，后面是使用添加的提取缓冲液的提取步骤620(例如任选地含有絮凝剂的水溶液)。在步骤630中分离固体。在步骤640中将剩余溶液施加于色谱柱(例如离子交换柱，或基于疏水性相互作用或纯吸附的系统，例如活化碳)，并且洗出非蛋白质和未结合材料。洗脱蛋白质接着在步骤660中浓缩，随后经浓缩的蛋白质产物进行灭菌步骤670和干燥步骤680。
图7是说明使用膜保持蛋白质悬浮液与PEG溶液分离的方法的一个实施例中的步骤的流程图。蛋白质富集固体进行分解步骤710，后面是使用水和任选的絮凝剂的提取步骤720。在步骤730中去除固体，并且使用微过滤步骤740去除微细残余固体和/或微生物。在步骤750中，针对PEG跨膜透滤滤液，这是可以包括例如渗析、返流过滤、超滤、微过滤或纳米过滤的步骤。接着在步骤760中浓缩蛋白质溶液，在步骤770中透滤去除盐，并且进行灭菌步骤780和干燥步骤790。
图8是说明使用经固定的PEG去除着色剂和有气味化合物的方法的一个实施例中的步骤的流程图。蛋白质富集固体进行分解步骤810，后面是使用水和任选的絮凝剂的提取步骤820。在步骤830中去除固体，并且将蛋白质悬浮液添加到经固定的PEG(例如在色谱柱中或作为分批色谱步骤)并且在步骤840中培育。在步骤850中，浓缩蛋白质溶液，后面是灭菌步骤860和干燥步骤870。
图9是描绘PEG再循环方法的一个实施例中的步骤的流程图。添加PEG和相分离之后(例如图2和3中描绘并且上文所述)，可以在步骤910中再悬浮PEG层中的PEG，接着进行碳吸附步骤920。PEG可任选地在步骤930中(例如通过微过滤、巴氏灭菌或UV照射)灭菌。
图10为显示如本文所提供的提取和纯化方法的一个实施例中的步骤的流程图，其包括添加的有用步骤。来自分离步骤(例如如本文所述的基于PEG的方法中)的所提取的固体和溶剂进行提取步骤1010，后面是分离步骤1020。在步骤1030中蒸发溶剂，获得例如类胡萝卜素、叶绿素、类黄酮和醇溶谷蛋白等化合物。富含纤维的废固体在步骤1040中球粒化并且例如用于例如宠物饲料的产品中，或进行酶消化步骤1050，接着是发酵步骤1060和固体分离步骤1070。去除发酵的废固体。溶剂在步骤1080中蒸发，获得未发酵的可溶性化合物，以及可以用作例如生物燃料的其它材料。
本发明将在以下实例中进一步描述，所述实例不限制权利要求书中所述的本发明的范围。
实例
实例1-菠菜核酮糖二磷酸羧化酶分离
将一千克新鲜菠菜叶在3掺合机(俄亥俄州克利夫兰的维他美仕公司(Vitamix Corp.,Cleveland,OH))中以1:1(w/w)的比率用含有8％(w/v)PEG(CarbowaxSentry PEG 8000；密歇根州米德兰的陶氏化学公司(Dow Chemicals,Midland,MI))和0.1％(w/v)阳离子絮凝剂(863A；德克萨斯州休斯顿的端福克公司(Tramfloc,Inc.,Houston,TX))的磷酸钾缓冲液(pH 7.4)浸软。在最高设置(3HP电动机)下进行提取3分钟，始终使温度维持在30℃以下。磨碎后使用10M NaOH溶液将pH调整到7.4。匀浆使用台式离心机(Allegra X15R，SX4750转子；加利福尼亚州帕萨迪纳的贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter,Inc.,Pasadena,CA))在3500g下离心5分钟。弃去离心块并且单独收集清液层(约1.6L)。将七水合硫酸镁盐(德国卡塞尔的K+S KALI有限公司(K+S KALI GmbH,Kassel,Germany))添加至清液层中以达到1M浓度。将溶液彻底混合并且使用台式离心机(AllegraX15R，SX4750转子；贝克曼库尔特公司)在5451g下离心3分钟。在离心瓶中形成三层，并且其余的绿色固体以离心块形式被分离出(约0.1L)。分离PEG层(约0.3L)并且形成顶层，选择性分级分离有色化合物和有气味的化合物。中间层中剩余的澄清产物蛋白质接着使用中空纤维型式的0.2μm改性的聚醚砜(mPES)膜(K02E20U-05N；加利福尼亚州多明格斯牧场的光谱实验室公司(Spectrum Laboratories,Inc.,Rancho Dominguez,CA)微过滤。保留物(约0.25L)使用约0.75L的1M硫酸镁溶液透滤。来自这一过滤步骤的渗透物(约3L)使用70kDa mPES膜(MiniKros N02E070-05N；光谱实验室公司(Spectrum Laboratories,Inc.))浓缩到约0.1L。将其用约0.5L去离子水分5步进行进一步透滤。蛋白质浓缩物的pH为约7并且导电率小于5mS/cm。所得蛋白质浓缩物为澄清的浅黄色。产物使用喷雾干燥器干燥，或使用冷冻干燥器冷冻并干燥。使用标准660nm皮尔斯蛋白质分析(Pierce protein assay)和SDS凝胶密度测定法分析这一材料。使用IR湿度分析仪分析干燥固体。使用滴定方法分析最终产物中的絮凝剂和PEG浓度。蛋白质浓度为约91％(w/w)，并且总固体为约95％(w/w)。PEG和絮凝剂浓度经分析小于0.2％(w/w)。产物纯度超过90％，且在整个工艺中的回收率超过90％。所获得的产物脱色并且保留低温变性特性。
实例2-苜蓿核酮糖二磷酸羧化酶分离
在含有8％(w/v)PEG(Carbowax Sentry PEG8000；陶氏化学公司(DowChemicals))和0.1％(w/v)阳离子絮凝剂(863A；端福克公司)的有夹套的搅拌槽中制备两千升提取缓冲液(pH 7.4的磷酸钾)。将五百千克新鲜苜蓿叶在Corenco M12DA粉碎机(加利福尼亚州圣罗莎的克伦可(Corenco,Santa Rosa,CA))中浸软，在磨碎期间连续再循环提取缓冲液以改善分解并且将工艺温度始终维持在低于40℃。磨碎后使用10M NaOH溶液将pH调整到7.4。匀浆在3500g下在约5加仑每分钟(gpm)的馈入速率下使用GEA韦斯伐里亚倾析机GCE-345(新泽西新泽西州的GEA机械设备(GEA Mechanical Equipment,New Jersey,NJ))离心。弃去离心块。将约625kg硫酸镁盐(K+S KALI有限公司)添加到液体离心分离液(约2200L)中。将溶液彻底混合并且在约5gpm的馈入速率下用GEA韦斯伐里亚分离器ESD-30(GEA机械设备)离心。绿色固体作为球粒排出，损失约10％(v/v)馈料。分离PEG层(馈料的约20％v/v)并且形成顶层，选择性分级分离有色化合物和有气味的化合物。中间层中剩余的澄清产物蛋白质接着使用呈中空纤维型式的0.2μm改性mPES膜(K02E20U-05N；光谱实验室公司)微过滤。保留物(约200L)使用约400L的1M硫酸镁溶液透滤。来自这一过滤步骤的渗透物使用70kDa mPES膜(KM-070E-300-01N；光谱实验室公司)浓缩到约50L。将其用约250L去离子水分5步进行进一步透滤。蛋白质浓缩物的pH为约7并且导电率小于5mS/cm。所得蛋白质浓缩物为澄清的浅黄色。产物使用喷雾干燥器干燥，或使用冷冻干燥器冷冻并干燥。使用标准660nm皮尔斯蛋白质分析和SDS凝胶密度测定法分析这一材料。使用IR湿度分析仪分析干燥固体。蛋白质浓度为约880g/L，并且总固体为约95％(w/w)。PEG和絮凝剂浓度经分析小于0.2％(w/w)。产物纯度超过90％，且在整个工艺中的回收率超过90％。所获得的产物脱色并且保留低温变性特性。
实例3-使用基于pH的纯化的菠菜核酮糖二磷酸羧化酶分离
一千克新鲜菠菜叶在“维他美仕”折弯机中以1:1的比率用含有0.1M NaCl的磷酸钾缓冲液(pH 7.4)浸软。磨碎后使用10M NaOH溶液将pH调整到7.4。匀浆在3500g下离心5分钟。弃去固体球粒，并且接着使用0.2μm mPES膜对液体离心分离液(约1.6L)进行微过滤。保留物使用约1.5L提取缓冲液透滤。来自这一过滤步骤的渗透物(约3L)使用10kDa mPES膜浓缩到约0.1L。这一步骤的蛋白质浓缩物为约pH 7.4。向浓缩物添加酸(例如HCl)，以将pH降低到5。使用磁性搅拌板或均质机剧烈搅拌浓缩物混合物30分钟。这一混合物接着在3500g下离心5分钟以获得灰白色球粒和褐色离心分离液。弃去上清液并且用去离子水洗涤蛋白质球粒。将球粒再悬浮于0.05-0.1L去离子水中。将溶液剧烈混合成均匀浆液并且使用碱(例如NaOH)将pH缓慢升高到11。所得溶液为澄清的黄色。接着，将pH降到9以保持澄清的混合物。产物以此形式使用喷雾干燥器干燥，或使用冷冻干燥器冷冻和干燥。所获得的产物略微脱色并且保留低温变性特性。
实例4-使用色谱法的菠菜核酮糖二磷酸羧化酶分离
通过尺寸排阻色谱纯化上文实例3中制备的浓缩物。Superdex 200柱(26/600)用20mM KPhos pH 7.4、100mM NaCl预平衡。将0.4g蛋白质(5ml浓缩物)以2.5ml/min注入到柱上。柱接着用20mM KPhos pH 7.4、100mM NaCl缓冲液洗脱。观测到间隙体积中聚结的蛋白质、纯核酮糖二磷酸羧化酶、有色组分(粉红色、黄色)与盐之间发生高分辨分离。
实例5-通过透滤作用的菠菜核酮糖二磷酸羧化酶脱色
一百克新鲜菠菜叶在3掺合机(俄亥俄州克利夫兰的维他美仕公司)中以1:4(w/w)的比率用去离子水浸软。在最高设置(3HP电动机)下进行提取3分钟，始终使温度维持在30℃以下。磨碎后使用10M NaOH将pH调整到7.4。匀浆使用台式离心机(AllegraX15R，SX4750转子；加利福尼亚州帕萨迪纳的贝克曼库尔特公司)在10000g下离心30分钟。弃去离心块并且分别收集清液层。向清液层添加氯化钠盐以达到0.75M浓度。溶液接着针对8％PEG(Carbowax Sentry PEG 8000；密歇根州米德兰的陶氏化学公司)溶液使用3kDa UF膜渗析。
颜色与一些蛋白质和水一起通过膜渗透到PEG相中。渗析结束时的产物经2倍浓缩并且没有颜色。使用标准660nm皮尔斯蛋白质分析和SDS凝胶密度测定法分析这一材料。
实例6-通过分批色谱法的菠菜核酮糖二磷酸羧化酶脱色
一百克新鲜菠菜叶在3掺合机(俄亥俄州克利夫兰的维他美仕公司)中以1:4(w/w)的比率用去离子水浸软。在最高设置(3HP电动机)下进行提取3分钟，始终使温度维持在30℃以下。磨碎后使用10M NaOH溶液将pH调整到7.4。匀浆使用台式离心机(Allegra X15R，SX4750转子；加利福尼亚州帕萨迪纳的贝克曼库尔特公司)在10000g下离心30分钟。弃去离心块并且分别收集清液层。向悬浮液中每毫升悬浮液添加20mg干燥NovaPEG Wang树脂(EMD米利波尔(EMD Milipore)，目录号855122)。接着滚磨材料以确保搅拌45小时，随后材料在10000×g下离心5分钟。分离清液层，并且UV-VIS分析显示在320nm下吸光率显著降低。通过标准660nm皮尔斯蛋白质分析和SDS凝胶密度测定法分析清液层的蛋白质含量和组成，显示相对于初始蛋白质悬浮液没有发生显著改变。
实例7-通过针对PEG的透滤作用从大豆蛋白质去除异味
使用2N NaOH使3％(w/v)大豆伴大豆球蛋白溶液达到pH 8.5。接着使样品达到0.75M氯化钠，并且使用3500Da截止膜针对含有0.75M氯化钠的5％PEG 8000溶液(pH调整到8.5)渗析。针对PEG加盐进行渗析之后，针对水对蛋白质样品进行渗析以去除过量盐。盐浓度降低20倍之后，评估样品的口味。品尝者描述最终样品有苦味，但完全去除了纸板和泥土的异味。相比之下，品尝者描述未经处理的大豆伴大豆球蛋白样品有苦味并且具有强烈的纸板和泥土风味。
实例8-方法的变化
可以使用上文所描述的方法的如下的其它变化：
方法变化
●一种替代方案是在倾析步骤之后添加PEG，由此使PEG经倾析固体的损失降到最低。在这一情形下，将倾析器离心分离液添加到预先形成的两相PEG-盐溶液中，分级分离PEG相中的有色体。
●另一选择是向离心分离液添加固体PEG，并且当混合完成时，添加盐以形成相分离。
●所述方法的一种另外替代是对UF浓缩物而非提取物利用两相提取策略。在这一情形下，在不添加PEG或硫酸镁的情况下进行整个工艺直到产生UF浓缩物。
●另一选择是在巴氏灭菌或干燥之前对PEG处理的溶液进行离心以去除任何沉淀。
单元操作变化
●使用均质机或高剪切研磨机加强分解和细胞破坏。
●用于分离三个层的圆盘堆叠离心步骤换成使用重力沉降槽的步骤。
●使用脱盐色谱柱(例如G50柱)进行盐的分离。
组分变化
●所述方法使用菠菜和苜蓿叶测试，但可以扩展到任何核酮糖二磷酸羧化酶来源(例如藻类、玉米、小麦、大米、高粱、黑麦、芥花、小米、大麦、大豆、向日葵、红花、烟草、苜蓿、马铃薯、芸苔属、棉花、西红柿或烟草)或其它蛋白质(例如其它植物蛋白)。
●所述方法可以用于去除任何蛋白质悬浮液的颜色和/或气味，包括含有一或多种选自由以下组成的群组的蛋白质的悬浮液(非限制性)：豆血红蛋白、非共生血红蛋白、血红蛋白、肌红蛋白、血绿蛋白、无脊椎动物血红蛋白、神经球蛋白、细胞球蛋白、原球蛋白、截短的2/2球蛋白、HbN、蓝藻球蛋白、HbO、Glb3以及细胞色素、地狱之门球蛋白I(Hell's gateglobin I)、细菌血红蛋白、纤毛肌红蛋白、黄素血红蛋白、核糖体蛋白、肌动蛋白、己糖激酶、乳酸脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、糖蛋白、凝集素、粘蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、肌动蛋白、转译延长因子、组蛋白、核酮糖二磷酸羧化酶、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶活化酶(核酮糖二磷酸羧化酶活化酶)、白蛋白、大豆球蛋白、伴大豆球蛋白、球蛋白、豌豆球蛋白、伴白蛋白、麦胶蛋白、谷蛋白、谷蛋白、麦谷蛋白、大麦醇溶蛋白、醇溶谷蛋白、菜豆蛋白(蛋白质)、蛋白质体、黑麦醇溶蛋白、伸展蛋白、小麦族谷蛋白、胶原蛋白、玉米蛋白、高梁醇溶蛋白、燕麦蛋白、脱水蛋白、亲水素、胚胎后期富集蛋白、天然非折叠蛋白、任何种子贮藏蛋白、块茎贮藏蛋白、马铃薯糖蛋白、块茎特异蛋、蛋白酶抑制剂、动物蛋白、鱼蛋白、卵蛋白、家禽蛋白、藻类蛋白、真菌蛋白、重组蛋白、油体蛋白、油体钙蛋白、油体固醇蛋白或其它油体蛋白、营养贮藏蛋白A、营养贮藏蛋白B、绿豆种子贮藏8S球蛋白、豌豆球蛋白以及豌豆白蛋白。
●使用较高分子量PEG进一步降低工艺中的PEG浓度。
●其它亲水性聚合物(例如聚丙二醇、丁二醇、己二醇、甘油、二甘油、二乙二醇、二丙二醇以及其混合物)也潜在地适用。
●提取缓冲液中使用提供0.05-1体积％阳离子絮凝剂官能度的絮凝剂(例如来自新泽西州弗洛勒姆帕克巴斯夫(BASF,Florham Park,NJ)的781G或LT 7989)。其它适用絮凝剂包括例如石灰石、熟石灰和二价或三价金属的盐(例如氯化铁、硫酸铁、硫酸亚铁)、硫酸铝、铝酸钠、氯化铝、碱式碳酸镁、碳酸钙、氢氧化钙、活化硅酸盐、瓜尔胶、淀粉、丹宁、海藻酸钠、聚合硫酸铝、聚合羟基氯化铝、以及合成聚电解质(例如以及)。
●用于相破裂的盐不限于泻盐(Epsom salt)。其它适用盐包括磷酸钾、氯化钠和乙酸铵。如果基于霍夫迈斯特系列(Hoffmiester series)适当选择离子，那么分离更好；所述系列中后来的盐可以使蛋白质盐化。
●提取方法通过向初始提取缓冲液添加还原剂(例如偏亚硫酸氢盐(约2％(w/v)溶液或更多))并且通过所述方法维持厌氧条件来改进。
方法效率
●分离的PEG层再循环到另一提取缓冲液制剂中，由此使所用PEG的效率最大。
●来自UF膜分离的渗透物使用RO膜浓缩以回收工艺用水和盐浓缩物。
其它实施例
应理解，虽然本发明已经结合其上述详细说明进行了描述，但是上述描述是打算说明并且不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优势和修改在所附权利要求书的范围内。

Claims (67)

1.一种从生物质纯化蛋白质的方法，其包含：
用含有聚乙二醇PEG以及任选地絮凝剂的水溶液提取所述生物质，产生含有大块固体和提取物的提取浆液；
任选地将所述提取浆液的pH调整到pH 2到10；
收集所述提取物并且添加盐以形成两相混合物；
分离所述两相混合物以产生PEG相和产物相；以及
收集和过滤所述产物相以产生含有所述蛋白质的经过滤的产物相。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物质包含植物材料。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述植物材料包含花或叶子。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述植物为藻类、玉米、小麦、大米、高粱、黑麦、芥花、小米、大麦、大豆、向日葵、红花、烟草、苜蓿、马铃薯、芸苔属、棉花、西红柿或烟草。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质为核酮糖二磷酸羧化酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述PEG的分子量为约8000。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述絮凝剂包含烷基胺表氯醇。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述盐包含硫酸镁。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离包含重力沉降或离心。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述离心包含使用圆盘堆叠离心机。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述过滤包含微过滤。
12.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含浓缩和透滤所述经过滤的产物相，产生产物浓缩物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述透滤包含使用超滤膜系统。
14.根据权利要求12所述的方法，其进一步包含对所述产物浓缩物灭菌，获得经灭菌的产物浓缩物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述灭菌包含UV照射、巴氏灭菌或微过滤。
16.根据权利要求14所述的方法，其进一步包含干燥所述经灭菌的产物浓缩物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述干燥包含在温和条件下使用喷雾干燥器或冷冻干燥器。
18.一种从蛋白质溶液去除杂质的方法，其包含：
向所述蛋白质溶液添加亲水性聚合物和盐，产生聚合物富集相和蛋白质相；以及分离所述聚合物富集相与所述蛋白质相。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述亲水性聚合物为PEG。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述PEG的分子量为约8000。
21.根据权利要求18所述的方法，其进一步包含向所述蛋白质溶液添加絮凝剂。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述絮凝剂包含烷基胺表氯醇。
23.根据权利要求18所述的方法，其中所述盐包含硫酸镁。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述蛋白质为核酮糖二磷酸羧化酶。
25.根据权利要求18所述的方法，其中所述分离包含重力沉降或离心。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述离心包含使用圆盘堆叠离心机。
27.根据权利要求18所述的方法，其进一步包含过滤所述蛋白质相以产生经过滤的产物相。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述过滤包含微过滤。
29.根据权利要求27所述的方法，其进一步包含浓缩和透滤所述经过滤的产物相，产生产物浓缩物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述透滤包含使用超滤膜系统。
31.根据权利要求29所述的方法，其进一步包含对所述产物浓缩物灭菌，获得经灭菌的产物浓缩物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述灭菌包含UV照射、巴氏灭菌或微过滤。
33.根据权利要求31所述的方法，其进一步包含干燥所述经灭菌的产物浓缩物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述干燥包含在温和条件下使用喷雾干燥器或冷冻干燥器。
35.一种包含核酮糖二磷酸羧化酶和亲水性聚合物的组合物，其中所述亲水性聚合物以低于约0.1％(w/w)的浓度存在。
36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述亲水性聚合物为PEG。
37.根据权利要求35所述的组合物，其中所述亲水性聚合物以低于约0.01％(w/w)的浓度存在。
38.一种用于纯化蛋白质的方法，其包含：
提供已经去除固体的蛋白质悬浮液；
任选地向所述蛋白质悬浮液添加盐；
任选地将所述蛋白质悬浮液的pH调整到pH 2到10；
针对PEG溶液渗析所述蛋白质悬浮液，或使PEG在膜的渗透侧的方式对所述蛋白质悬浮液进行超滤；以及
使所述经渗析或超滤的蛋白质溶液经历一或多个浓缩或过滤步骤，产生含有所述蛋白质的产物相。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述蛋白质悬浮液包含来自植物材料的一或多种蛋白质。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述植物材料包含花或叶子。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述植物为藻类、玉米、小麦、大米、高粱、黑麦、芥花、小米、大麦、大豆、向日葵、红花、烟草、苜蓿、马铃薯、芸苔属、棉花、西红柿或烟草。
42.根据权利要求38所述的方法，其中所述蛋白质为核酮糖二磷酸羧化酶。
43.根据权利要求38所述的方法，其中所述PEG的分子量为约8000。
44.根据权利要求38所述的方法，其中所述提供步骤包含提取分解的生物质以去除所述固体并且产生所述蛋白质悬浮液，任选地向所述生物质添加絮凝剂。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述絮凝剂包含烷基胺表氯醇。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述提取包含使用重力沉降或离心来分离固体与所述蛋白质悬浮液。
47.根据权利要求38所述的方法，其中所述盐包含硫酸镁。
48.根据权利要求38所述的方法，其中所述一或多个过滤步骤包含透滤。
49.根据权利要求38所述的方法，其包含浓缩和过滤所述经渗析或超滤的蛋白质溶液，产生产物浓缩物。
50.根据权利要求49所述的方法，其进一步包含对所述产物浓缩物灭菌，获得经灭菌的产物浓缩物。
51.根据权利要求50所述的方法，其进一步包含干燥所述经灭菌的产物浓缩物。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述干燥包含在温和条件下使用喷雾干燥器或冷冻干燥器。
53.一种用于纯化蛋白质的方法，其包含：
提供已经去除固体的蛋白质悬浮液；
任选地向所述蛋白质悬浮液添加盐；
任选地将所述蛋白质悬浮液的pH调整到pH 2到10；
向包含PEG的支撑物施加所述蛋白质悬浮液；以及
收集未保留在所述支撑物上的蛋白质相。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述蛋白质悬浮液包含来自植物材料的一或多种蛋白质。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述植物材料包含花或叶子。
56.根据权利要求53所述的方法，其中所述植物为藻类、玉米、小麦、大米、高粱、黑麦、芥花、小米、大麦、大豆、向日葵、红花、烟草、苜蓿、马铃薯、芸苔属、棉花、西红柿或烟草。
57.根据权利要求53所述的方法，其中所述蛋白质为核酮糖二磷酸羧化酶。
58.根据权利要求53所述的方法，其中所述PEG的分子量为约8000。
59.根据权利要求53所述的方法，其中所述提供步骤包含提取分解的生物质以去除所述固体并且产生所述蛋白质悬浮液，任选地向所述生物质添加絮凝剂。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述絮凝剂包含烷基胺表氯醇。
61.根据权利要求59所述的方法，其中所述提取包含使用重力沉降或离心来分离固体与所述蛋白质悬浮液。
62.根据权利要求53所述的方法，其中所述盐包含硫酸镁。
63.根据权利要求53所述的方法，其包含将所述蛋白质悬浮液与包含PEG的支撑物一起培育24到48小时。
64.根据权利要求53所述的方法，其进一步包含浓缩所述蛋白质相以产生产物浓缩物。
65.根据权利要求64所述的方法，其进一步包含对所述产物浓缩物灭菌，获得经灭菌的产物浓缩物。
66.根据权利要求65所述的方法，其进一步包含干燥所述经灭菌的产物浓缩物。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述干燥包含在温和条件下使用喷雾干燥器或冷冻干燥器。
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