ES2893293T3 - Métodos de extracción y purificación de proteínas no desnaturalizadas - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende rubisco y un polímero hidrófilo, en donde el polímero hidrófilo está presente en una concentración menor que aproximadamente 0,1 % (p/p) y en donde el polímero hidrófilo comprende polietilenglicol (PEG), butilenglicol, hexilenglicol, glicerina, diglicerina, dietilenglicol, dipropilenglicol, o una mezcla de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de extracción y purificación de proteínas no desnaturalizadas

Campo técnico

El presente documento se refiere a materiales y métodos para extraer y purificar proteínas y, particularmente, a materiales y métodos para extraer y purificar proteínas que se desnaturalizan a baja temperatura.

Antecedentes

Las proteínas que se desnaturalizan a baja temperatura en su estado no desnaturalizado son fundamentales para el éxito de los productos de réplica de alimentos (p. ej., productos de réplica de queso o carne, tales como los productos de réplica de ternera). Los procesos comerciales de extracción de proteínas existentes incluyen operaciones unitarias y condiciones que degradan las proteínas y no son útiles en la fabricación de productos que contienen dichas proteínas. Además, la mayoría de las proteínas tienen un color y olor asociados, lo que puede afectar negativamente a su utilidad en los productos de réplica de alimentos.

Srinavas et al. (Process Biochemistry, vol. 35, núm. 1/2, 25 de octubre de 1999, páginas 43-48) describen la extracción y purificación de peroxidasa de origen vegetal mediante extracción acuosa bifásica acoplada con filtración en gel. Después del reparto, la enzima se concentra por antidiálisis contra PEG 6000 seguido por la filtración en gel.

Resumen

El objeto de la invención se define en la reivindicación 1. Los detalles de la invención se definen en las reivindicaciones dependientes 2-6.

El presente documento se basa, al menos en parte, en el desarrollo de procesos para extraer y purificar proteínas a partir de material vegetal, de manera que las proteínas retengan su estado no desnaturalizado sin sus colores y olores asociados. Por ejemplo, el presente documento se basa, al menos en parte, en el sorprendente descubrimiento de que los polímeros hidrófilos y, particularmente, el polietilenglicol (PEG), pueden adsorber color y compuestos odoríferos de las soluciones proteicas.

En la presente descripción se describe un método para purificar una proteína a partir de una biomasa. El método puede incluir extraer la biomasa con una solución acuosa que contiene PEG y opcionalmente un floculante para generar una suspensión acuosa de extracción que contiene sólidos a granel y un extracto; opcionalmente ajustar el pH de la suspensión acuosa de extracción a un pH de 2 a 10; recoger el extracto y añadir sal para formar una mezcla bifásica; separar la mezcla bifásica para generar una fase de PEG y una fase de producto; y recoger y filtrar la fase del producto para generar una fase del producto filtrado que contiene la proteína. La biomasa puede incluir material vegetal. (p. ej., flores u hojas). La planta puede ser un alga, maíz, trigo, arroz, sorgo, centeno, canola, mijo, cebada, soja, girasol, cártamo, tabaco, alfalfa, patata, Brassica spp., algodón, tomate o tabaco. La proteína puede ser rubisco. El PEG puede tener un peso molecular de aproximadamente 8000. El floculante puede incluir epiclorhidrina de alquilamina. La sal puede incluir sulfato de magnesio. La etapa de separación puede incluir sedimentación por gravedad o centrifugación (p. ej., con una centrífuga de discos apilados). El filtrado puede incluir microfiltrado. El método puede incluir, además, concentrar y diafiltrar la fase de producto filtrado para generar un concentrado de producto. La diafiltración puede incluir el uso de un sistema de ultrafiltración con membrana. El método puede incluir, además, esterilizar el concentrado de producto para obtener un concentrado de producto esterilizado. La esterilización puede incluir irradiación UV, pasteurización o microfiltración. El método puede incluir, además, secar el concentrado de producto esterilizado. El secado puede incluir el uso de un secador por pulverización o un liofilizador en condiciones suaves.

En la presente descripción también se describe un método para eliminar impurezas de una solución de proteínas. El método puede incluir añadir un polímero hidrófilo y una sal a la solución de proteína para generar una fase rica en polímero y una fase de proteína, y separar la fase rica en polímero de la fase de proteína. El polímero hidrófilo puede ser PEG. El PEG puede tener un peso molecular de aproximadamente 8000. El método puede incluir, además, añadir un floculante a la solución de proteína. El floculante puede contener epiclorhidrina de alquilamina. La sal puede incluir sulfato de magnesio. El método puede incluir, además, ajustar el pH de la solución de proteína a un pH de 2 a 10. La proteína puede ser rubisco. La separación puede incluir sedimentación por gravedad o centrifugación (p. ej., centrifugación con una centrífuga de discos apilados). El método puede incluir, además, filtrar la fase proteica para generar una fase de producto filtrado (p. ej., por microfiltrado). El método puede incluir, además, concentrar y diafiltrar la fase de producto filtrado para generar un concentrado de producto. La diafiltración puede incluir el uso de un sistema de ultrafiltración con membrana. El método puede incluir, además, esterilizar el concentrado de producto para obtener un concentrado de producto esterilizado (p. ej., por irradiación UV, pasteurización o microfiltración). El método puede incluir, además, secar el concentrado de producto esterilizado (p. ej., con un secador por pulverización o un liofilizador en condiciones suaves).

La presente invención se refiere a una composición que contiene rubisco y un polímero hidrófilo, en donde el polímero hidrófilo está presente en una concentración menor que aproximadamente 0,1 % (p/p), en donde el polímero hidrófilo comprende polietilenglicol (PEG), butilenglicol, hexilenglicol, glicerina, diglicerina, dietilenglicol, dipropilenglicol, o una mezcla de los mismos. El polímero hidrófilo puede estar presente en una concentración menor que aproximadamente 0,01 % (p/p).

En la presente descripción se describe, además, un método para purificar una proteína, donde el método incluye proporcionar una suspensión de proteínas de la que se han eliminado los sólidos; opcionalmente, añadir sal a la suspensión proteica; opcionalmente, ajustar el pH de la suspensión de proteína a un pH de 2 a 10; dializar la suspensión de proteína contra una solución de PEG, o someter la suspensión de proteína a ultrafiltración con PEG en el lado del permeado de la membrana; y someter la solución de proteína dializada o ultrafiltrada a una o más etapas de concentración o filtrado para generar una fase de producto que contiene la proteína. La suspensión de proteínas puede contener una o más proteínas de material vegetal. El material vegetal puede incluir flores u hojas. La planta puede ser un alga, maíz, trigo, arroz, sorgo, centeno, canola, mijo, cebada, soja, girasol, cártamo, tabaco, alfalfa, patata, Brassica spp., algodón, tomate o tabaco. La proteína puede ser rubisco. El PEG puede tener un peso molecular de aproximadamente 8000. La etapa de suministro puede incluir extraer una biomasa disgregada para eliminar los sólidos y generar la suspensión de proteínas, opcionalmente con la adición de un floculante a la biomasa. El floculante puede incluir epiclorhidrina de alquilamina. La extracción puede incluir el uso de sedimentación por gravedad o centrifugación para separar los sólidos de la suspensión de proteínas. La sal puede incluir sulfato de magnesio. La una o más etapas de filtrado pueden incluir diafiltración. El método puede incluir concentrar y filtrar la solución de proteína dializada o ultrafiltrada para generar un concentrado de producto. El método puede incluir, además, esterilizar el concentrado de producto para obtener un concentrado de producto esterilizado, y/o secar el concentrado de producto esterilizado (p. ej., usando un secador por pulverización o un liofilizador en condiciones suaves).

Además, en la presente descripción se describe un método para purificar una proteína, que comprende proporcionar una suspensión de proteínas de la que se han eliminado los sólidos; opcionalmente, añadir sal a la suspensión proteica; opcionalmente, ajustar el pH de la suspensión de proteína a un pH de 2 a 10; aplicar la suspensión de proteína a un soporte que comprende PEG; y recoger la fase proteica que no ha quedado retenida en el soporte. La suspensión de proteínas puede contener una o más proteínas de material vegetal. El material vegetal puede incluir flores u hojas. La planta puede ser un alga, maíz, trigo, arroz, sorgo, centeno, canola, mijo, cebada, soja, girasol, cártamo, tabaco, alfalfa, patata, Brassica spp., algodón, tomate o tabaco. La proteína puede ser rubisco. El PEG puede tener un peso molecular de aproximadamente 8000. La etapa de suministro puede incluir extraer una biomasa disgregada para eliminar los sólidos y generar la suspensión de proteínas, opcionalmente con la adición de un floculante a la biomasa. El floculante puede incluir epiclorhidrina de alquilamina. La extracción puede incluir el uso de sedimentación por gravedad o centrifugación para separar los sólidos de la suspensión de proteínas. La sal puede incluir sulfato de magnesio. El método puede incluir incubar la suspensión de proteína con el soporte que comprende PEG durante de 24 a 48 horas. El método puede incluir, además, concentrar la fase proteica para generar un concentrado de producto, y/o esterilizar el concentrado de producto para obtener un concentrado de producto esterilizado, y/o secar el concentrado de producto esterilizado (p. ej., usando un secador por pulverización o un liofilizador en condiciones suaves).

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que entendería comúnmente el experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción en la práctica de la invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente especificación, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Los detalles de la descripción se exponen a continuación en las figuras adjuntas y en la descripción. Otras características, objetos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción y las figuras, y a partir de las reivindicaciones.

Descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un diagrama de flujo que muestra las etapas generales de un proceso de extracción y purificación como se describe en la presente descripción.

La Fig. 2A es un diagrama de flujo que muestra las etapas de un proceso de extracción y purificación como se describe en la presente descripción. La Fig. 2B es un diagrama de flujo que representa una alternativa del proceso representado en la Fig. 2A.

La Fig. 3 es un diagrama de flujo que muestra las etapas de un proceso de extracción y purificación como se describe en la presente descripción.

La Fig. 4 es un diagrama de flujo que muestra las etapas de un proceso de purificación basado en el pH.

La Fig. 5 es un diagrama de flujo que muestra las etapas de un proceso de purificación cromatográfica.

La Fig. 6 es un diagrama de flujo que muestra las etapas de un proceso de purificación cromatográfica en lecho expandido.

La Fig.7 es un diagrama de flujo que muestra las etapas de un proceso de purificación que usa una membrana.

La Fig.8 es un diagrama de flujo que muestra las etapas de un proceso de purificación que usa PEG inmovilizado.

La Fig.9 es un diagrama de flujo que muestra las etapas de un proceso de recirculación de PEG.

La Fig. 10 es un diagrama de flujo que muestra las etapas de un proceso de extracción y purificación como se describe en la presente descripción, que indica las etapas de valor añadido posibles.

Descripción detallada

Las proteínas que se desnaturalizan a baja temperatura en su estado no desnaturalizado son fundamentales para el éxito de productos de réplica de alimentos, tales como productos de réplica de ternera. Sin embargo, los procesos comerciales existentes de extracción de proteínas pueden dar como resultado la desnaturalización de tales proteínas. Además, la mayoría de las proteínas que podrían tener funcionalidad en los productos de réplica de alimentos tienen un color y olor asociados, lo que puede perjudicar o inhibir su aplicación. Por ejemplo, rubisco (ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa oxigenasa), que representa aproximadamente de 30 a 50 por ciento de la proteína soluble en los cloroplastos de las plantas, tiene un color verde y un olor a hierba que puede inhibir su aplicación en productos de réplica de alimentos. Rubisco también se desnaturaliza a baja temperatura (de 50 °C a 60 °C). Los métodos notificados en otro sitio para la extracción de rubisco han incluido, por ejemplo, precipitación térmica de 50 °C a 60 °C, extracción con grandes concentraciones de reductores, precipitación por temperatura de proteínas no rubisco, adsorción en carbono, purificación por cristalización y/o extracción a pH 11 seguido por precipitación de la proteína a pH 4,5 y lavado extenso con disolventes orgánicos (véanse, p. ej., las patentes US-3.959.246, Us -4.006.078, US-4.334.024, y US-4.588.691; PCT con n.° de publicación WO 2011/078671; Lamsal et al., Trans. ASAE 46(3):715-720, 2003); y Yang et al., J. Agrie. Food Chem.

52:2223-2225, 2004).

Los materiales y métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para extraer y purificar proteínas que se desnaturalizan a baja temperatura, tales como rubisco, en cantidades suficientes y con características adecuadas que pueden usarse en productos de réplica de alimentos. Estos métodos pueden proporcionar un producto de alta pureza incluso en una sola etapa y, en algunos casos, sin el uso de cromatografía. Los métodos también pueden proporcionar la posibilidad de escalado usando equipos de extracción convencionales en la industria química, y tienen un bajo gasto de capital y una mayor recuperación de fabricación.

Los métodos descritos en la presente descripción pueden incluir el uso de un polímero hidrófilo tal como polietilenglicol (PEG). Por ejemplo, un método puede incluir una etapa de dispersión en PEG y extracción de cuerpos coloreados, seguida por una etapa de separación bifásica acuosa. En algunos casos, la concentración volumétrica de la fase PEG puede ser de 2 % a 50 % (p/v) de PEG (p. ej., 2-10 %, 10-25 % o 25-50 %), con adición potencial de sal a la proteína. La afinidad de los cuerpos coloreados por el PEG puede llevar a su separación del resto de la mezcla. El PEG puede tener un peso molecular que varía de aproximadamente 300 a aproximadamente 300.000 (p. ej., 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000, 100.000, 200.000 o 300.000, de aproximadamente 300 a aproximadamente 3000, de aproximadamente 3000 a aproximadamente 10.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 30.000, de aproximadamente 30.000 a aproximadamente 100.000 o de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 300.000). En algunos casos, por ejemplo, el PEG puede tener un peso molecular de aproximadamente 8000.

En algunos casos, la biomasa (p. ej., flores, hojas u otro material vegetal) puede molerse en un disgregador y/o un mezclador de alto cizallamiento y, extraerse a continuación con agua que contenga PEG (p. ej., PEG de peso molecular 8000) y, opcionalmente, uno o más floculantes que contienen alquilamina-epiclorhidrina, cloruro de polidimetildialilamonio o poliaminas (p. ej., MAGNAFLOC®, SUPERFLOC® o TRAMFLOC®) para formar una suspensión acuosa de extracción. El uno o más floculantes pueden ayudar a reducir la cantidad de sólidos finos que se transportan en el centrado y reducir ligeramente el color del centrado. La presencia de PEG puede mejorar la solubilidad de la(s) proteína(s) y puede aumentar el rendimiento; también se ha observado que el PEG reduce la cantidad de sólidos finos que se transportan en el extracto.

A continuación, la suspensión acuosa de extracción se puede decantar (p. ej., con una centrífuga decantadora) para separar los sólidos a granel del extracto. El extracto puede recogerse en un reactor de tanque agitado, y puede agregarse sal al mismo para formar una mezcla bifásica. La sal puede hacer que el PEG forme una fase discontinua y se separe de la solución. Las sales útiles incluyen, por ejemplo, sales de metales tales como sodio, potasio, calcio, magnesio, cinc, hierro, cobalto o aluminio, con contraiones tales como cloruro, bromuro, sulfato, nitrato, acetato, cianuro, citrato, carbonato, acetato o fosfato. En algunos casos, la sal es NaCl o MgSO⁴. También pueden utilizarse mezclas de sales. La concentración de sal puede ser de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 2 M (p. ej., de 100 a 200 mM, de 200 a 500 mM, de 500 a 750 mM, de 750 mM a 1 M o de 1 a 2 M).

Los compuestos de color que consisten en moléculas pequeñas, tales como clorofilas, carotenoides, flavonoides y productos de reacción, tales como productos de reacción enzimática, de oxidación o de amarronamiento, pueden retenerse selectivamente en la fase PEG en su volumen de exclusión, mientras que las proteínas permanecen en la solución salina acuosa. Los compuestos odoríferos (p. ej., compuestos de olor a hierba, verde) también pueden quedar retenidos en la fase PEG en su volumen de exclusión. Después, la mezcla bifásica se puede separar en una fase PEG y una fase de producto (p. ej., mediante sedimentación por gravedad o con una centrífuga, tal como una centrífuga de discos apilados). La capa de PEG recuperada puede enviarse de regreso al tanque de extracción para la siguiente extracción, hasta que se sature con los componentes de color. En ese punto, la fase PEG se puede tratar térmicamente para separar el PEG puro y los cuerpos coloreados en solución. Debe mencionarse que, en algunos casos, el PEG (y el floculante opcional) puede añadirse a la etapa de separación de fases después de la etapa de separación de sólidos.

La fase del producto que se separó de la mezcla bifásica puede microfiltrarse (p. ej., a través de un sistema de filtración de flujo tangencial o un sistema de microfiltración de punto muerto de un paso) para separar cualquier sólido fino y los microorganismos remanentes. La fase de producto filtrado puede concentrarse y diafiltrarse con agua usando un sistema de ultrafiltración con membrana o una combinación de cromatografía y un sistema de ultrafiltración con membrana, dando como resultado un concentrado de producto. Esta etapa puede permitir la separación del PEG restante y la sal en la fase de producto filtrado. El concentrado de producto también puede someterse a una etapa de reducción microbiana que puede incluir, por ejemplo, pasteurización (p. ej., pasteurización a alta temperatura y corto tiempo, o pasteurización a alta presión), irradiación UV, o irradiación gamma. En algunos casos, puede ser útil un método no térmico. El concentrado de producto (esterilizado o no esterilizado) puede secarse con un secador por pulverización o un liofilizador o similares en condiciones suaves para garantizar que la proteína no se desnaturalice, lo que da como resultando una proteína pura, decolorada, desodorizada. Se observa que el producto puede contener niveles bajos (p. ej., menores de aproximadamente 1 %, 0,1 %, 0,01 %, aproximadamente 0,001 %, aproximadamente 0,0001 %, o aproximadamente 0,00001 % (p/p)) de PEG.

En algunos casos, el polímero hidrófilo (p. ej., PEG) no tiene que entrar en contacto físicamente con la suspensión de proteína, pero puede separarse de la suspensión de proteína mediante una membrana permeable con un tamaño de poro lo suficientemente pequeño para evitar la transferencia del polímero o de la proteína objetivo. Por ejemplo, el PEG y la suspensión de proteína pueden separarse con una membrana que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 3 kDa a aproximadamente 500 kDa (p. ej., de 3 a 5 kDa, de 5 a 10 kDa, de 10 a 30 kDa, de 30 a 50 kDa, de 50 a 100 kDa, o de 100 a 500 kDa). La concentración de la fase PEG puede estar entre 2-50 % (p/v) de PEG (p. ej., 2-10 %, 10-25 % o 25-50 %). La suspensión de proteína puede contener una o más sales para fomentar la transferencia de los cuerpos coloreados y compuestos de sabor desagradable. En algunos casos, el pH de la solución de proteína también se puede ajustar (p. ej., a un pH entre 2 y 10) para fomentar la transferencia de compuestos coloreados y de sabor desagradable. Como anteriormente, la suspensión proteica puede incluir una sal tal como, sin limitarse a, una sal de un metal tal como sodio, potasio, calcio, magnesio, cinc, hierro, cobalto, o aluminio, con contraiones tales como cloruro, bromuro, sulfato, nitrato, acetato, cianuro, citrato, carbonato, acetato, o fosfato (p. ej., NaCl o MgSO⁴), o una mezcla de sales. De nuevo, la concentración de sal puede variar de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 2 M. La afinidad de los cuerpos coloreados por el PEG puede producir su separación del resto de la mezcla. Como anteriormente, el PEG puede tener un peso molecular que varía de aproximadamente 300 Da a aproximadamente 300.000 Da (p. ej., aproximadamente 8000 Da). El uso de PEG para extraer indirectamente cuerpos coloreados y compuestos con sabor desagradable puede ser especialmente útil para proteínas que pueden precipitar a bajas concentraciones de PEG (lo que hace problemática la separación de fases posterior). Por ejemplo, puede usarse PEG a lo largo de una membrana para eliminar sabores desagradables de, sin limitarse a, soja 7S y proteínas de albúmina de guisante.

El uso de una membrana para mantener la suspensión de proteínas separada de la fase PEG puede eliminar la necesidad de una etapa de separación de fases. Las suspensiones de proteína y PEG pueden ponerse en contacto con una membrana permeable usando una variedad de métodos, tales como diálisis, filtración por transflujo, ultrafiltración, microfiltración, o nanofiltración. La membrana puede fabricarse de cualquiera de una variedad de materiales que incluyen polímeros tales como poliétersulfona, polipropileno, fluoruro de polivinilideno, poliacrilonitrilo, acetato de celulosa y polisulfona. En algunos casos, las membranas pueden incorporarse a una matriz física tal como cerámica o acero.

En algunos casos que implican el uso de una membrana, la biomasa (p. ej., flores, hojas u otro material vegetal) puede molerse en un disgregador y/o un mezclador de alto cizallamiento y extraerse a continuación con agua que contenga uno o más floculantes (p. ej., MAGNAFLOC®, SUPERFLOC® o TRAMFLOC®) para formar una suspensión acuosa de extracción. El floculante puede ayudar a reducir la cantidad de sólidos finos que se transportan en el centrado y también puede reducir el color del centrado. A continuación, la suspensión acuosa de extracción se puede decantar con una centrífuga decantadora o hacerse pasar por una unidad de tipo prensa de tornillo para separar los sólidos a granel y el centrado. El centrado puede microfiltrarse a través de un sistema de filtración de flujo tangencial o un sistema de microfiltración de punto muerto de un paso para retirar cualquier sólido fino y los microorganismos remanentes. El permeado de microfiltración puede recogerse en un tanque y puede añadirse sal para lograr una conductividad determinada. Después, esta solución puede diafiltrarse con una membrana de UF contra una solución de PEG al 8 %. Una vez decolorado el producto, se puede detener la diafiltración de PEG, y el material resultante se puede concentrar y diafiltrar con agua para obtener proteína decolorada concentrada con bajo contenido de sal (p. ej., rubisco). En algunos casos, la muestra puede centrifugarse para eliminar los sólidos. El concentrado de producto también puede someterse a una etapa de reducción microbiana que puede incluir, por ejemplo, pasteurización (p. ej., pasteurización a alta temperatura y corto tiempo, o pasteurización a alta presión), irradiación UV, o irradiación gamma. En algunos casos, puede ser útil un método no térmico. El concentrado de producto puede secarse a continuación con un secador por pulverización o un liofilizador o similares en condiciones suaves para garantizar que la proteína no se desnaturalice, lo que da como resultando una proteína pura, decolorada, desodorizada.

En algunos casos, el polímero hidrófilo puede inmovilizarse antes de entrar en contacto con una suspensión de proteína. De nuevo, la biomasa (p. ej., flores, hojas u otro material vegetal) puede molerse con un disgregador y/o un mezclador de alto cizallamiento, y uno o más floculantes que contienen alquilamina-epiclorhidrina, cloruro de polidimetildialilamonio o poliaminas (p. ej., MAGNAFLOC®, SUPERFLOC® o TRAMFLOC®) se pueden añadir opcionalmente para formar una suspensión acuosa de extracción, y la suspensión puede clarificarse opcionalmente para eliminar sólidos, tal como mediante decantación, sedimentación o centrifugación. Después, la suspensión de proteínas puede exponerse a un polímero hidrófilo inmovilizado (p. ej., PEG). En algunos casos, el PEG inmovilizado puede estar presente en forma de una resina. La resina puede construirse de un núcleo sólido que tiene un recubrimiento de moléculas de PEG. El núcleo sólido puede contener cualquiera de una variedad de materiales, tales como SEPHAROSE®, agarosa, policarbonato, hidroxiapatita, vidrio, metal, carbón, sílice, alúmina, cerámica, polipropileno, poliestireno o divinilbenceno. Como anteriormente, el PEG puede tener un peso molecular que varía de aproximadamente 300 Da a aproximadamente 300.000 Da (p. ej., aproximadamente 8000 Da). En algunos casos, el PEG puede inmovilizarse mediante reticulación para formar una resina tal como NovaPEG (EMD Millipore; Billerica, MA). En otros casos, el PEG puede inmovilizarse sobre una membrana. En cuanto a los protocolos descritos anteriormente, la suspensión de proteína puede contener una o más sales para fomentar la transferencia de los cuerpos coloreados (p. ej., sal presente en el intervalo de 100 mM a 2 M incluidas sales de metales tales como sodio, potasio, calcio, magnesio, cinc, hierro, cobalto o aluminio, con contraiones tales como cloruro, bromuro, sulfato, nitrato, acetato, cianuro, citrato, carbonato, acetato o fosfato).

En algunos casos de los métodos que usan un polímero hidrófilo inmovilizado (p. ej., PEG), una suspensión de proteínas puede exponerse al polímero en una resina por adición de la resina a la suspensión. Después de un período de tiempo suficiente para permitir que los cuerpos coloreados se asocien con el PEG (p. ej., de 1 minuto a 48 horas, tal como de 1 a 10 minutos, de 10 a 30 minutos, de 30 a 60 minutos, de 60 minutos a 2 horas, de 2 a 4 horas, de 4 a 6 horas, de 6 a 12 horas, de 12 a 24 horas o de 24 a 48 horas) de 4 °C a 45 °C (p. ej., de 4 °C a 10 °C, de 10 °C a 20 °C o de 20 °C a 45 °C), la proteína se puede separar del PEG inmovilizado por diversos métodos que incluyen filtración por gravedad, filtración al vacío o centrífuga, sedimentación y decantación o centrifugación y aislamiento del centrado. El PEG inmovilizado puede lavarse, opcionalmente, para eliminar las proteínas arrastradas.

En algunos casos, puede usarse PEG inmovilizado como resina de cromatografía. Una suspensión de proteína puede hacerse pasar a través del lecho de resina en condiciones en las que los cuerpos coloreados se unen a la resina pero la proteína objetivo fluye a través del lecho y se recoge. Nuevamente, la fase de proteína puede contener una o más sales para fomentar la unión de cuerpos coloreados.

Una suspensión de proteína desodorizada y decolorada puede procesarse adicionalmente para producir un polvo de proteína desodorizada y decolorada. Por ejemplo, las proteínas decoloradas pueden concentrarse y diafiltrarse. En algunos casos, una suspensión de proteína decolorada se puede centrifugar para eliminar los sólidos. El concentrado también puede someterse a una etapa de reducción microbiana. Como se ha indicado anteriormente, dichos procedimientos pueden incluir pasteurización (p. ej., pasteurización a alta temperatura y corto tiempo, o pasteurización a alta presión), irradiación UV, o irradiación gamma o métodos no térmicos. El concentrado de producto puede secarse a continuación (p. ej., con un secador por pulverización o un liofilizador o similares) en condiciones suaves para garantizar que la proteína no se desnaturalice, lo que da como resultando proteínas puras, decoloradas y desodorizadas.

Volviendo ahora a las figuras, la Fig. 1 es un diagrama de flujo que representa las etapas generales de un método como se describe en la presente descripción. Generalmente, la etapa 110 de extracción (p. ej., usando una biomasa disgregada/molida/homogeneizada y un tampón) puede ir seguida por la etapa 120 de separación de sólidos (p. ej., mediante decantación y adición de un floculante y, opcionalmente, también PEG), la etapa 130 de eliminación del color (p. ej., mediante la adición de PEG y sal y, opcionalmente un floculante, seguido en algunos casos por cromatografía, precipitación según el pH y resolubilización), la etapa 140 de esterilización (p. ej., mediante microfiltración, pasteurización o irradiación UV) y la etapa 150 de concentración (p. ej., mediante ultrafiltración o evaporación en película delgada, seguido por secado).

La Fig. 2 es un diagrama de flujo que representa las etapas de una descripción ilustrativa de un método de extracción y purificación como se describe en la presente descripción. Los sólidos ricos en proteína se someten a la etapa 210 de disgregación, seguida de extracción 220 con una solución acuosa que contiene PEG y, opcionalmente, uno o más floculantes. Los sólidos se separan en la etapa 230. Se añade sal al extracto (p. ej., mediante la etapa de recirculación 265), y la etapa 240 de separación de fases separa el PEG de la fase del producto proteico. El p Eg se recircula en la etapa 245 para usar en futuras etapas de extracción. La fase de producto proteico se somete a la etapa 250 de filtración, seguida de la etapa 260 de concentración, durante la cual la sal se elimina y recircula a través de la etapa 265 para usar en etapas de separación de fases futuras. El producto proteico concentrado se somete a la etapa 270 de esterilización y a la etapa 280 de secado para producir un producto proteico decolorado, desodorizado y no desnaturalizado. Un ejemplo del uso de este método se proporciona en el Ejemplo 1, más adelante.

La Fig. 2B es un diagrama de flujo que muestra las etapas de una variante alternativa del método representado en la Fig. 2A. En esta variante, el PEG se agrega a la etapa 240 de separación de fases, opcionalmente con un floculante, y el PEG se recircula a etapas adicionales de separación de fases.

La Fig. 3 es un diagrama de flujo que representa las etapas de otra variante de un proceso de extracción y purificación como se describe en la presente descripción, en el cual se añade PEG después de la etapa de extracción inicial. Los sólidos ricos en proteína se someten a la etapa 310 de disgregación, seguida de la etapa 320 de extracción con una solución acuosa que contiene opcionalmente uno o más floculantes. Los sólidos se separan en la etapa 330, y el extracto se filtra y concentra en las etapas 340 y 350, respectivamente. Se añaden PEG y sal para generar una mezcla multifásica. Las fases se separan en la etapa 360. El PEG se recircula en la etapa 365 para usar en futuras etapas de separación. La fase de producto proteico se concentra en la etapa 370, durante la cual la sal se extrae y recircula en la etapa 375 para usar en futuras etapas de separación y/o concentración de fases. El producto proteico concentrado se somete a la etapa 380 de esterilización y a la etapa 390 de secado, dando como resultado una proteína decolorada, desodorizada y no desnaturalizada.

La Fig. 4 es un diagrama de flujo que representa las etapas de un proceso de purificación basado en el pH. Los sólidos ricos en proteína se someten a la etapa 410 de disgregación, seguida de la etapa 420 de extracción con adición de tampón de extracción (p. ej., una solución acuosa que contiene opcionalmente un floculante). Los sólidos se separan en la etapa 430, y la solución remanente se filtra en la etapa 440 y se concentra en la etapa 450. El ácido diluido se mezcla con el concentrado en la etapa 460, y la proteína se separa en la etapa 470. La base diluida se mezcla con la proteína en la etapa 475, después de lo cual, el producto proteico se somete a la etapa 480 de esterilización y la etapa 490 de secado. Un ejemplo del uso de este método se proporciona en el Ejemplo 3, más adelante.

La Fig. 5 es un diagrama de flujo que representa las etapas en un proceso de purificación por cromatografía. Los sólidos ricos en proteína se someten a la etapa 510 de disgregación, seguida de la etapa 520 de extracción con tampón de extracción (p. ej., una solución acuosa que contiene opcionalmente un floculante). Los sólidos se separan en la etapa 530, y la solución remanente se filtra en la etapa 540 y se concentran en la etapa 550. El concentrado se aplica a una columna de cromatografía (p. ej., una columna de filtración en gel) en la etapa 560, y el material no proteico y no unido se elimina por lavado. La proteína se eluye y a continuación se concentra en la etapa 570, después de lo cual, el producto proteico concentrado se somete a la etapa 580 de esterilización y a la etapa 590 de secado. Un ejemplo del uso de este método se proporciona en el Ejemplo 4, más adelante.

La Fig. 6 es un diagrama de flujo que representa las etapas de un método de purificación cromatográfica de lecho expandido. Los sólidos ricos en proteína se someten a la etapa 610 de disgregación, seguida de la etapa 620 de extracción con adición de tampón de extracción (p. ej., una solución acuosa que contiene opcionalmente un floculante). Los sólidos se separan en la etapa 630. La solución remanente se aplica a una columna de cromatografía (p. ej., una columna de intercambio iónico o un sistema de interacción hidrófoba o basado en adsorción pura, tal como carbón activado) en la etapa 640, y el material no proteico y no unido se elimina por lavado. La proteína se eluye y a continuación se concentra en la etapa 660, después de lo cual, el producto proteico concentrado se somete a la etapa 670 de esterilización y a la etapa 680 de secado.

La Fig. 7 es un diagrama de flujo que ilustra las etapas de un método en el cual se usa una membrana para mantener la suspensión de proteína separada de la solución de PEG. Los sólidos ricos en proteína se someten a la etapa 710 de disgregación, seguida de la etapa 720 de extracción con agua y floculante opcional. Los sólidos se eliminan en la etapa 730, y la etapa 740 de microfiltración se usa para eliminar los sólidos finos y/o microorganismos remanentes. En la etapa 750, el filtrado se diafiltra contra PEG a través de una membrana, una etapa que puede incluir, por ejemplo, diálisis, filtración por transflujo, ultrafiltración, microfiltración o nanofiltración. Después, la solución proteica se concentra en la etapa 760, se diafiltra para eliminar la sal en la etapa 770 y se somete a la etapa 780 de esterilización y a la etapa 790 de secado.

La Fig. 8 es un diagrama de flujo que ilustra las etapas de un método en el que se eliminan los compuestos colorantes y odoríferos usando PEG inmovilizado. Los sólidos ricos en proteína se someten a la etapa 810 de disgregación, seguida de la etapa 820 de extracción con agua y floculante opcional. Los sólidos se eliminan en la etapa 830 y la suspensión de proteínas se añade a PEG inmovilizado (p. ej., en una columna de cromatografía o como una etapa de cromatografía discontinua) y se incuba en la etapa 840. En la etapa 850, la solución proteica se concentra, seguido por la etapa 860 de esterilización y la etapa 870 de secado.

La Fig. 9 es un diagrama de flujo que representa las etapas de un proceso de recirculación de PEG. Después de la adición de PEG y la separación de fases (p. ej., como se representa en las Figs. 2 y 3 y se ha descrito anteriormente), el PEG de la capa de PEG puede resuspenderse en la etapa 910 y a continuación someterse a la etapa 920 de adsorción en carbono. El PEG puede esterilizarse opcionalmente en la etapa 930 (p. ej., mediante microfiltración, pasteurización o irradiación UV).

La Fig. 10 es un diagrama de flujo que muestra las etapas de un método de extracción y purificación como se describe en la presente descripción, con la inclusión de etapas de valor añadido. Los sólidos extraídos y el disolvente de una etapa de separación (p. ej., en un método basado en PEG como se describe en la presente descripción) se someten a la etapa 1010 de extracción, seguido de la etapa 1020 de separación. El disolvente se evapora en la etapa 1030 para proporcionar compuestos tales como carotenoides, clorofilas, flavonoides y prolaminas. Los sólidos agotados ricos en fibra se granulan en la etapa 1040 y se usan en productos tales como alimento para mascotas, por ejemplo, o se someten a la etapa 1050 de digestión enzimática, seguida de la etapa 1060 de fermentación y la etapa 1070 de separación de sólidos. Los sólidos agotados fermentados se eliminan. El disolvente se evapora en la etapa 1080, proporcionando compuestos solubles no fermentados y otros materiales que pueden usarse, por ejemplo, como biocombustibles.

La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Aislamiento de rubisco de la espinaca

Un kg de hojas de espinaca frescas se maceraron en una mezcladora VITA-PREP® 3 (Vitamix Corp., Cleveland, OH) en una relación de 1:1 (p/p) con tampón de fosfato potásico (pH 7,4) que contenía 8 % (p/v) de PEG (Carbowax Sentry PEG 8000; Dow Chemicals, Midland, MI) y 0,1 % (p/v) de floculante catiónico (863 A; Tramfloc, Inc., Houston, TX). La extracción se realizó durante 3 minutos a la configuración más alta (motor 3 HP) manteniendo la temperatura en menos de 30 °C en todo momento. El pH se ajustó a 7,4 después de la molienda usando una solución de NaOH 10 M. El homogeneizado se centrifugó a 3500 g durante 5 minutos usando una centrífuga de sobremesa (rotor Allegra X15R, SX4750; Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA). El aglomerado se descartó y el sobrenadante (aproximadamente 1,6 l) se recogió por separado. Se añadió sal de heptahidrato de sulfato de magnesio (K+S KALI GmbH, Kassel, Alemania) al sobrenadante para alcanzar una concentración de 1 M. La solución se mezcló completamente y se centrifugó a 5451 g durante 3 minutos usando una centrífuga de mesa (rotor Allegra X15R, SX4750; Beckman Coulter, Inc.). Se formaron tres capas en el vial de la centrífuga, y los sólidos de color verde remanentes se separaron en forma de aglomerado (aproximadamente 0,1 l). La capa de PEG (aproximadamente 0,3 l) se separó y formó la capa superior, fraccionando selectivamente los compuestos de color y los compuestos odoríferos. Un producto proteico transparente que permanecía en la capa intermedia se microfiltró a continuación usando una membrana de poliétersulfona modificada de 0,2 pm (mPES) en un formato de fibra hueca (KROSFLO® K02E20U-05 N; Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA). El retentato (aproximadamente 0,25 l) se diafiltró usando aproximadamente 0,75 l de solución de sulfato de magnesio 1 M. El permeado de esta etapa de filtración (aproximadamente 3 l) se concentró usando una membrana mPES de 70 kDa (N02E070-05N; Spectrum Laboratories, Inc.) hasta aproximadamente 0,1 l. Esto se diafiltró adicionalmente con aproximadamente 0,5 l de agua desionizada en 5 etapas. El concentrado de proteína tenía un pH de aproximadamente 7 y una conductividad menor que 5 mS/cm. El concentrado de proteína resultante era de color amarillo pálido transparente. El producto se secó usando un secador por pulverización, o se congeló y se secó usando un liofilizador. Este material se analizó usando el ensayo estándar de proteína Pierce a 660 nm y densitometría de gel SDS. Los sólidos secos se analizaron usando un analizador de humedad por IR. La concentración del floculante y de PEG en el producto final se analizaron usando métodos de titulación. La concentración de proteínas fue de aproximadamente 91 % (p/p) y el total de sólidos fue de aproximadamente 95 % (p/p). Las concentraciones de PEG y floculante se analizaron a menos de 0,2 % (p/p). El producto tenía más del 90 % de pureza con más del 90 % de recuperación a través del proceso. El producto obtenido estaba decolorado y retuvo la propiedad de desnaturalización a baja temperatura.

Ejemplo 2 - Aislamiento de rubisco de la alfalfa

Se prepararon dos mil l de tampón de extracción (fosfato potásico a pH 7,4) en un tanque agitado encamisado que contenía 8 % (p/v) de PEG (Carbowax Sentry PEG8000; Dow Chemicals) y 0,1 % (p/v) de floculante catiónico (863 A; Tramfloc, Inc.). Quinientos kg de hojas de alfalfa frescas se maceraron en un disgregador Corenco M12DA (Corenco, Santa Rosa, CA) con recirculación continua del tampón de extracción durante la trituración para mejorar la disgregación y mantener la temperatura del proceso a menos de 40 °C en todo momento. El pH se ajustó a 7,4 después de la molienda usando una solución de NaOH 10 M. El homogeneizado se centrifugó a 3500 g con un decantador GEA Westfalia GCE-345 (GEA Mechanical Equipment, Nueva Jersey, NJ) a una velocidad de alimentación de aproximadamente 5 galones por minuto (gpm). El aglomerado se descartó. Se añadieron aproximadamente 625 kg de sal de sulfato de magnesio (K+S KALI GmbH) al centrado líquido (aproximadamente 2200 l). La solución se mezcló completamente y se centrifugó con un separador GEA Westfalia ESD-30 (GEA Mechanical Equipment) a una velocidad de alimentación de aproximadamente 5 gpm. Los sólidos de color verde se expulsaron en forma de aglomerado, perdiendo aproximadamente 10 % (v/v) de la alimentación. La capa de PEG (aproximadamente un 20 % v/v de la alimentación) se separó y formó la capa superior, fraccionando selectivamente los compuestos de color y los compuestos odoríferos. Un producto proteico transparente que permanecía en la capa intermedia se microfiltró a continuación usando una membrana de mPES modificada de 0,2 pm (en un formato de fibra hueca KROSFLO® K02E20U-05 N; Spectrum Laboratories, Inc.). El retentato (aproximadamente 200 l) se diafiltró usando aproximadamente 400 l de solución de sulfato de magnesio 1 M. El permeado de esta etapa de filtración se concentró usando una membrana mPES de 70 kDa (KROSFLO® KM-070 E-300-01N; Spectrum Laboratories, Inc.) hasta aproximadamente 50 l. Esto se diafiltró adicionalmente con aproximadamente 0,5 l de agua desionizada en 5 etapas. El concentrado de proteína tenía un pH de aproximadamente 7 y una conductividad menor que 5 mS/cm. El concentrado de proteína resultante era de color amarillo pálido transparente. El producto se secó usando un secador por pulverización, o se congeló y se secó usando un liofilizador. Este material se analizó usando el ensayo estándar de proteína Pierce a 660 nm y densitometría de gel SDS. Los sólidos secos se analizaron usando un analizador de humedad por IR. La concentración de proteínas fue de aproximadamente 880 g/l y el total de sólidos fue de aproximadamente 95 % (p/p). Las concentraciones de PEG y floculante se analizaron a menos de 0,2 % (p/p). El producto tenía más del 90 % de pureza con más del 90 % de recuperación a través del proceso. El producto obtenido estaba decolorado y retuvo la propiedad de desnaturalización a baja temperatura.

Ejemplo de referencia 3 - Aislamiento de rubisco de espinaca usando purificación basada en pH

Un kg de hojas frescas de espinaca se maceró en un banco “Vitamix” en una relación de 1:1 con tampón de fosfato potásico (pH 7,4) que contenía NaCl 0,1 M. El pH se ajustó a 7,4 después de la molienda usando una solución de NaOH 10 M. El homogeneizado se centrifugó a 3500 g durante 5 minutos. El aglomerado de sólidos se descartó y a continuación el centrado líquido (aproximadamente 1,6 l) se microfiltró usando una membrana mPES de 0,2 um. El retentato se diafiltró usando aproximadamente 1,5 l del tampón de extracción. El permeado de esta etapa de filtración (~3 l) se concentró usando una membrana de mPES de 10 kDa hasta aproximadamente 0,1 l. El concentrado proteico en esta etapa estaba a aproximadamente pH 7,4. Se añadió un ácido (p. ej., HCl) al concentrado para disminuir el pH a 5. La mezcla concentrada se agitó vigorosamente durante 30 minutos usando una placa de agitación magnética o un homogeneizador. Después, esta mezcla se centrifugó a 3500 g durante 5 minutos para obtener un aglomerado blanquecino y un centrado marrón. El sobrenadante se descartó y el aglomerado de proteína se lavó con agua desionizada. El aglomerado se resuspendió en 0,05-0,1 l de agua desionizada. La solución se mezcló intensamente hasta obtener una suspensión acuosa uniforme y el pH se elevó lentamente hasta 11 mediante una base (p. ej., NaOH). La solución era de color amarillo transparente. A continuación el pH se redujo a 9 para mantener la mezcla transparente. El producto se secó usando un secador por pulverización en esta forma, o se congeló y se secó usando un liofilizador. El producto obtenido estaba ligeramente decolorado y retuvo la propiedad de desnaturalización a baja temperatura.

Ejemplo de referencia 4 - Aislamiento de rubisco de espinaca usando cromatografía

El concentrado preparado en el Ejemplo 3 anterior se purificó mediante cromatografía de exclusión molecular. Una columna Superdex 200 (26/600) se equilibró previamente con KPhos 20 mM pH 7,4, NaCl 100 mM. Se inyectaron aproximadamente 0,4 g de proteína (5 ml de concentrado) en la columna a 2,5 ml/min. A continuación la columna se eluyó con tampón KPhos 20 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM. Se observó una separación de alta resolución entre la proteína aglomerada en el volumen intersticial, rubisco pura, componentes de color (rosa, amarillo) y sal.

Ejemplo 5 - Decoloración de rubisco de la espinaca mediante diafiltración

Cien gramos de hojas de espinaca frescas se maceraron en una mezcladora VITA-PREP® 3 (Vitamix Corp.; Cleveland, OH) en una relación de 1:4 (p/p) con agua desionizada. La extracción se realizó durante 3 minutos a la configuración más alta (motor 3 HP) manteniendo la temperatura en menos de 30 °C en todo momento. El pH se ajustó a 7,4 después de la molienda usando NaOH 10 M. El homogeneizado se centrifugó a 10000 g durante 30 minutos usando una centrífuga de sobremesa (rotor Allegra X15R, SX4750; Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA). El aglomerado se descartó y el sobrenadante se recogió por separado. Se añadió sal de cloruro de sodio al sobrenadante para alcanzar una concentración de 0,75 M. A continuación la solución se dializó contra la solución de PEG al 8 % (Carbowax Sentry PEG 8000; Dow Chemicals, Midland, MI) con una membrana UF de 3 kDa.

El color permeó a través de la membrana hasta la fase PEG, junto con algo de proteína y agua. El producto al final de la diálisis se concentró 2 x sin color. Este material se analizó usando un ensayo estándar de proteína Pierce a 660 nm y densitometría de gel SDS.

Ejemplo de referencia 6 - Decoloración de rubisco de espinaca mediante cromatografía por lotes

Cien gramos de hojas de espinaca frescas se maceraron en una mezcladora VITA-PREP® 3 (Vitamix Corp.; Cleveland, OH) en una relación de 1:4 (p/p) con agua desionizada. La extracción se realizó durante 3 minutos a la configuración más alta (motor 3 HP) manteniendo la temperatura en menos de 30 °C en todo momento. El pH se ajustó a 7,4 después de la molienda usando una solución de NaOH 10 M. El homogeneizado se centrifugó a 10000 g durante 30 minutos usando una centrífuga de sobremesa (rotor Allegra X15R, SX4750; Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA). El aglomerado se descartó y el sobrenadante se recogió por separado. A la suspensión se añadieron 20 mg de resina seca NovaPEG Wang (e Md Milipore, n.° de cat. 855122) por ml de suspensión. Después, el material se centrifugó para garantizar la agitación durante 45 horas, después de lo cual el material se centrifugó a 10000 * g durante 5 minutos. El sobrenadante se separó, y el análisis por UV-VIS mostró una absorbancia significativamente reducida a 320 nm. El análisis del contenido proteico y la composición del sobrenadante, mediante el ensayo de proteínas Pierce estándar a 660 nm y densitometría en gel SDS no mostró cambios significativos con respecto a la suspensión proteica inicial.

Ejemplo de referencia 7 - Eliminación de sabores desagradables de proteínas de soja mediante diafiltración contra PEG

Una solución al 3 % (p/v) de conglicinina de soja se llevó a pH 8,5 usando NaOH 2 N. Después, la muestra se llevó a cloruro de sodio 0,75 M y se dializó contra una solución de PEG 8000 al 5 % (pH ajustado a 8,5) que contenía cloruro de sodio 0,75 M, usando una membrana de corte de 3500 Da. Después de la diálisis contra PEG con sal, la muestra de proteína se dializó contra agua para eliminar el exceso de sal. Después de una reducción de 20 veces en la concentración de sal, la muestra se evaluó en cuanto al sabor. Los catadores describieron que la muestra final era amarga pero habían desaparecido por completo los sabores a cartón y a tierra desagradables. En comparación, los catadores describieron que la muestra de conglicinina de soja no tratada era amarga y que tenía fuertes sabores a cartón y lodo.

Ejemplo 8 - Variaciones de los métodos

Pueden usarse otras variaciones de los métodos descritos anteriormente, de la siguiente manera:

Variaciones de proceso

• Una alternativa es añadir el PEG después de la etapa de decantación, minimizando de esta manera la pérdida de PEG a través de los sólidos decantados. En este caso, el centrado del decantador se añade a una solución de sal de PEG bifásica preformada para fraccionar los cuerpos coloreados en la fase PEG.

• Otra opción es añadir PEG sólido al centrado y, al finalizar el mezclado, añadir la sal para provocar la separación de fases.

• Una alternativa adicional al proceso es usar la estrategia de extracción bifásica aplicada al concentrado de UF en lugar de al extracto. En este caso, todo el proceso se realiza sin la adición de PEG o sulfato de magnesio hasta que se produce el concentrado de UF.

• Otra opción es centrifugar la solución tratada con PEG para eliminar todo el precipitado antes de la pasteurización o el secado.

Variaciones en las operaciones unitarias

• La disgregación y rotura de las células se mejora usando un homogeneizador o un molino de alto cizallamiento.

• La etapa de centrifugación con discos apilados para separar las tres capas se sustituye por una etapa que usa tanques de sedimentación por gravedad.

• La separación de la sal se realiza usando una columna de cromatografía de desalación, tal como una columna G50.

Variaciones en los componentes

• El proceso se probó usando espinaca y hojas de alfalfa, pero es extensible a cualquier fuente de rubisco (p. ej., alga, maíz, trigo, arroz, sorgo, centeno, canola, mijo, cebada, soja, girasol, cártamo, tabaco, alfalfa, patata, Brassica spp., algodón, tomate o tabaco) u otras proteínas (p. ej., otras proteínas vegetales).

• El proceso se puede usar para eliminar el color y/u olor de cualquier suspensión de proteínas, incluidas las suspensiones que contienen una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en, sin limitarse a, leghemoglobina, hemoglobina no simbiótica, hemoglobina, mioglobina, clorocruorina, eritrocruorina, neuroglobina, citoglobina, protoglobina, globina 2/2 truncada, HbN, cianoglobina, HbO, Glb3 y citocromos, globina de puerta de Hell I, hemoglobinas bacterianas, mioglobinas ciliadas, flavohemoglobinas, proteínas ribosómicas, actina, hexoquinasa, lactato deshidrogenasa, fructosa bisfosfato aldolasa, fosfofructoquinasas, triosa fosfato isomerasas, fosfoglicerato quinasas, fosfoglicerato mutasas, enolasas, piruvato quinasas, proteasas, lipasas, amilasas, glicoproteínas, lectinas, mucinas, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasas, piruvato descarboxilasas, actinas, factores de elongación de la traducción, histonas, rubisco, ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa activasa (rubisco activasa), albúminas, glicininas, conglicininas, globulinas, vicilinas, conalbúmina, gliadina, glutelina, gluten, glutenina, hordeína, prolamina, faseolina (proteína), proteinoplasto, secalina, extensinas, gluten de triticeae, colágenos, zeína, kafirin, avenina, dehidrinas, hidrofilinas, proteínas abundantes de embiogénesis tardía, proteínas desplegadas de forma natural, cualquier proteína de almacenamiento en semillas, proteínas de almacenamiento en tubérculos, patatinas, dioscorinas, inhibidores de proteasas, proteínas animales, proteínas de pescado, proteínas de huevo, proteínas de aves de corral, proteínas de algas, proteínas fúngicas, proteínas recombinantes, oleosinas, caloleosinas, esteroleosinas u otras proteínas corporales oleosas, proteína de almacenamiento vegetativo A, proteína de almacenamiento vegetativo B, globulina 8S de almacenamiento en semilla de mungo, globulinas de guisante y albúminas de guisante.

• Se usa un PEG de peso molecular más alto para reducir aún más la concentración de PEG en el proceso.

• También son potencialmente útiles otros polímeros hidrófilos tales como polipropilenglicol, butilenglicol, hexilenglicol, glicerina, diglicerina, dietilenglicol, dipropilenglicol y mezclas de los mismos.

• Los floculantes que proporcionan la funcionalidad de 0,05-1 % v/v de floculantes catiónicos (p. ej., SUPERFLOC® 781 G o MAGNAFLOC® LT 7989 de BASF, Florham Park, NJ) se usan en el tampón de extracción. Otros floculantes útiles incluyen, por ejemplo, cal, cal hidratada y sales de metales divalentes o trivalentes tales como cloruro férrico, sulfato férrico, sulfato ferroso, sulfato de aluminio, aluminato de sodio, cloruro de aluminio, hidróxido de carbonato de magnesio, carbonato de calcio, hidróxido de calcio, silicatos activados, gomas guar, almidones, taninos, alginato de sodio, sulfato de polialuminio, hidroxicloruro de polialuminio, BIO-FLOCK® y polielectrolitos sintéticos (p. ej., ZETAG®, MAGNAFLOC® y SUPERFLOC®).

• La sal usada para la ruptura de fases no se limita a sal Epsom. Otras sales útiles incluyen fosfato de potasio, cloruro de sodio y acetato de amonio. La separación es mejor si los iones se seleccionan adecuadamente entre la serie Hoffmiester; las últimas sales de la serie pueden salificar las proteínas.

• El proceso de extracción se modifica mediante la adición de reductores, tales como metabisulfito (solución a aproximadamente el 2 % p/v o más), al tampón de extracción inicial y manteniendo las condiciones anaerobias durante el proceso.

Eficacia del proceso

• La capa de PEG separada se recircula a otra preparación de tampón de extracción y, de esta manera, se maximiza la eficacia del PEG usado. •

• El permeado de la separación de membrana de UF se concentra con una membrana RO para recuperar el agua del proceso y el concentrado de sal.

Otras realizaciones

Debe entenderse que aunque la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   i. Una composición que comprende rubisco y un polímero hidrófilo, en donde el polímero hidrófilo está presente en una concentración menor que aproximadamente 0,1 % (p/p) y en donde el polímero hidrófilo comprende polietilenglicol (PEG), butilenglicol, hexilenglicol, glicerina, diglicerina, dietilenglicol, dipropilenglicol, o una mezcla de los mismos.
2. 2. La composición de la reivindicación 1, en donde el polímero hidrófilo está presente en una concentración menor que aproximadamente 0,01 % (p/p).
3. 3. La composición de la reivindicación 1, en donde la rubisco procede del maíz, trigo, arroz, sorgo, centeno, canola, mijo, cebada, soja, girasol, cártamo, tabaco, alfalfa, patata, Brassica spp., algodón, tomate, o tabaco.
4. 4. La composición de la reivindicación 1, en donde la rubisco procede de un alga.
5. 5. La composición de la reivindicación 1, en donde el polímero hidrófilo es PEG que tiene un peso molecular de aproximadamente 8000.
6. 6. La composición de la reivindicación 1, en donde la composición comprende una solución de proteína dializada o ultrafiltrada que se ha concentrado, opcionalmente esterilizado, y opcionalmente secado.