ES2906417T3 - Recuperación de proteínas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la recuperación de materia proteica, a partir de una corriente de subproductos provenientes de procedimientos de destilación, comprendiendo el procedimiento: - opcionalmente, lisar o romper células presentes en la corriente de subproductos; - eliminar la materia sólida de la corriente de subproductos para producir una solución que contiene materia proteica clarificada; - poner en contacto la solución que contiene materia proteica clarificada con una matriz de adsorción empaquetada en una columna que comprende un aluminosilicato y/o tierra de diatomeas en condiciones tales que la materia proteica se une a la matriz de adsorción empaquetada, en donde la matriz de adsorción comprende un contenido de sílice superior a 50% peso; y - alterar las condiciones para provocar la liberación de la totalidad o una fracción específica de la materia proteica unida a la matriz de adsorción.

Description

DESCRIPCIÓN

Recuperación de proteínas

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento para producir proteínas a partir de las corrientes de subproductos, coproductos y desechos que surgen de los procedimientos de destilación. El procedimiento de la invención recupera, con un alto rendimiento, proteínas, péptidos y/o aminoácidos contenidos en levaduras u otros tipos de células, así como proteínas, péptidos y/o aminoácidos extraídos de granos o cereales para proporcionar un aditivo alimentario sustancialmente libre de metales, de alta pureza, proteico o rico en proteínas que proporciona razones ventajosas de aminoácidos. En particular, el procedimiento de la invención implica tratar la corriente de subproductos conocida como "pot ale" o "burnt ale" (residuos de la primera destilación).

Antecedentes de la invención

Tomando como ejemplo la fabricación de etanol para su uso en el whisky escocés de malta, el grano de cebada malteada triturada se utiliza como fuente de carbohidratos y se mezcla con agua caliente para solubilizar los azúcares presentes en la cebada. Para el whisky de malta, no se utiliza ningún otro grano que no sea cebada malteada. La materia sólida lignocelulósica proporcionada por tal procedimiento se separa para dejar un licor rico en azúcar conocido como "mosto". El mosto puede contener hasta 20% de proteína en materia seca. La materia sólida lignocelulósica separada (principalmente grano malteado conocido como "bagazo") se puede secar o mezclar con otros aditivos para su uso como pienso para animales versátil para ganado vacuno, ovejas, cerdos y caballos.

En un procedimiento típico de destilación, el mosto se transfiere a uno o varios recipientes grandes conocidos como "cubas de fermentación" y se fermenta añadiendo levadura. La levadura convierte el azúcar del mosto en etanol, creando lo que se conoce como "lavado" y se permite que la fermentación prosiga hasta alcanzar el contenido de alcohol deseado, típicamente alrededor de 8%. Al final del procedimiento de fermentación, el lavado fermentado se carga en un primer recipiente de destilación (el alambique de colada). En la fabricación tradicional de whisky escocés de malta, los recipientes de destilación o alambiques están fabricados de metal de cobre (Cu), mientras que para el whisky de grano se pueden utilizar componentes de cobre de sacrificio. El cobre se utiliza comúnmente debido a su capacidad para moldearse fácilmente en diseños intrincados y a su tasa de transferencia de calor. Los alambiques se calientan para expulsar el etanol y el etanol se condensa a continuación en un líquido. Después, este producto destilado se carga en un segundo recipiente de destilación (el alambique de aguardiente). En el alambique de aguardiente, el etanol se vuelve a destilar para aumentar su pureza antes de enfriarlo y recuperarlo como líquido para su maduración en barricas de roble. Por ley, no puede ser whisky escocés hasta que haya madurado en barricas de roble en Escocia durante al menos tres años.

Una vez que se completa la primera destilación, el residuo líquido que queda en el alambique de colada después de la destilación se conoce como "pot ale" o, menos comúnmente, "burnt ale". El pot ale es un líquido de pH bajo que contiene células muertas de levadura, residuos de levadura, carbohidratos, material proteico de la levadura, microbios (especies de Lactobacillus ) y los residuos y extractos del grano.

Si bien el subproducto pot ale generado puede ser rico en nutrientes, típicamente tiene una alta demanda química o biológica de oxígeno (DQO o DBO), lo que hace que el subproducto pot ale sea difícil de procesar y desechar.

Adicionalmente, durante la elaboración y la destilación, una pequeña cantidad de metal de cobre del alambique típicamente se transfiere al pot ale por abrasión o disolución donde permanece en solución o unido a ligandos adecuados. Si bien el cobre es un oligoelemento esencial para la vida, se sabe bien que el cobre (y otros materiales) son bioacumulativos en el hígado de ciertos mamíferos (p. ej., ovejas y cabras) y que esta bioacumulación puede alcanzar niveles agudos/tóxicos.

Con un bajo contenido de sólidos, el pot ale se puede concentrar mediante evaporación u otros medios para su uso como aditivo para alimentación animal conocido como "jarabe de pot ale". La evaporación es un método intensivo en energía que adolece de un alto coste. Además, la evaporación puede sufrir altas emisiones de gases de efecto invernadero y las altas temperaturas utilizadas pueden tener un efecto nocivo en la calidad de la proteína. La evaporación concentra todos los componentes en el pot ale, incluidos los compuestos no deseables tales como fitato y cobre. Típicamente, el jarabe de pot ale se mezcla con el bagazo recuperado y se seca para elaborar alimento para animales conocido como granos oscuros de destilería. Sin embargo, en vista de la presencia de cobre, el uso de jarabe de pot ale y granos oscuros de destilería como pienso está restringido al ganado vacuno, caballos y cerdos. Los ejemplos del uso de pot ales como aditivo para piensos y los métodos de procesamiento de pot ale se describen en el documento GB2094084 (Gilmour et al), e P1927291 (Atherton et al) e IE980676 (Court et al).

Los subproductos de pot ale generados a partir de la fermentación de granos pueden contener al menos 20% de proteína como materia seca. Se ha observado que esta proteína tiene un valor comercial como aditivo para piensos y se han realizado esfuerzos para recuperar esta proteína mediante precipitación o floculación a un pH alto. En el procedimiento descrito en el documento GB2094084, el pot ale se trata con un material cáustico (NaOH, KOH o hidróxido de amonio) para elevar el pH a un pH mayor que el neutro, lo que provoca la floculación de la proteína. A continuación, se permite que la proteína se asiente antes de la recuperación mecánica. Esto requiere un gran volumen de material cáustico, puede ser costoso y, además, no todas las proteínas se recuperan con este procedimiento, ya que solo las proteínas con un pH isoeléctrico inferior al pH neutro precipitarán, mientras que aquellas por encima del pH neutro seguirán en solución. Es típica una recuperación de proteína de 50-60%.

En el documento GB1347933 (NESTLE) se analiza un procedimiento de varias etapas en el que una solución de proteína alcalina se filtra a través de una resina de intercambio iónico macrorreticular antes de eliminar el álcali (amoníaco, NH3) mediante tratamiento térmico para proporcionar proteína purificada. Una desventaja de este procedimiento es que está limitado a material de partida de pH alcalino. El documento WO2013/021161 A divulga la extracción de proteínas de una corriente de subproductos que surgen de un procedimiento de destilación (tal como vinazas, residuos de la producción de biocombustibles o elaboración de alcohol) y el uso de las mismas como pienso para animales. Sin embargo, el documento no dice nada sobre una extracción por unión de materia proteica a una matriz que comprende sílice. Los documentos US5278284A y WO91/19780A divulgan que se puede utilizar sílice (geles) para adsorber o atrapar proteínas para eliminar proteínas no deseables (que forman turbidez) de la cerveza.

Sería ventajoso que los subproductos derivados de los procedimientos de destilación pudieran adaptarse a aplicaciones específicas de alimentos para animales y peces.

Mientras que los subproductos de destilería se han utilizado en la acuicultura (Randall y Drew, 2010 [Randall, K.M., Drew, M.D., 2010. Fractionation of wheat distiller’s dried grains and solubles using sieving increases digestible nutrient content in rainbow trout. Anim. Feed Sci. Technol. 159, 138-142]; Shurson 2012 [Shurson, J., 2012. Maize dried distillers grains with solubles (DDGS) - a new alternative ingredient in aquafeeds. World Aquaculture. Sep 2012. pág.

54-58]), su uso está restringido por el alto contenido de fibra (a expensas de la proteína) y también por la presencia de fitato con la complementación con aminoácidos esenciales tales como lisina y metionina o fitasa requeridos para lograr niveles más altos de incorporación en el alimento total para peces (Reveco et al., 2012 [Reveco, F.E., Collins, S.A., Randall, K.M., Drew, M.D., 2012. Aqueous fractionation improves the nutritional value of wheat distillers dried grains for rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquacult. Nutr. 18 , 202-210]; Stone et al., 2005 [Stone, D.A.J., Hardy, R.W., Barrows, F., Cheng, Z.J., 2005. Effects of extrusion on nutritional value of diets containing corn gluten meal and corn distiller's dried grain for rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Applied Aquaculture 17:1-20]; Cheng et al., 2003 [Cheng, Z.J,, Hardy, R.W., Blair, M., 2003. Effects of supplementing methionine hydroxyl analogue in soybean meal and distiller's dried grain-based diets on the performance and nutrient retention of rainbow trout [Oncorhynchus mykiss (Waibaum)]. Aquaculture Research 34:1303-1310.]; Cheng y Hardy 2004a [Cheng, Z.J., Hardy, R.W., 2004a. Effects of microbial phytase supplementation in corn distiller's dried grains with solubles on nutrient digestibility and growth performance of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Journal of Applied Aquaculture 15:83-100.]; Cheng y Hardy 2004b [Cheng, Z.J., Hardy, R.W., 2004b. Nutritional value of diets containing distiller's dried grain with solubles for rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Journal of Applied Aquaculture 15:101-113]).

Compendio de la invención

La presente invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier tema que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con fines informativos.

Los autores de la presente invención han determinado un procedimiento que concentra la proteína proporcionada en los subproductos de destilación, al tiempo que elimina y minimiza compuestos tales como cobre (Cu), fibra, fitato, polifenoles y carbohidratos, lo que actualmente restringe el uso de jarabe de pot ale como alimento para ganado vacuno, caballos y cerdos. Adicionalmente, el procedimiento se puede utilizar para separar selectivamente proteínas específicas o una mezcla de proteínas de los subproductos de la destilación, lo que permite obtener un mayor valor, por ejemplo, del pot ale.

En particular, los autores de la presente invención han determinado un procedimiento de tratamiento de una corriente de subproductos, adecuadamente "pot ale" o "burn ale" de procedimientos de destilación que contienen células de levadura y/o proteínas de cereales para proporcionar una fuente con alto contenido de proteína/alto contenido de materia proteica. Esta fuente se puede utilizar, por ejemplo, para su uso en acuicultura. En particular, el procedimiento puede ser útil para proporcionar una composición con un contenido de proteína superior a 50% con bajos niveles de cobre, fitato, fibra y polifenoles. Se prefieren bajos niveles de cobre, a menos de 10 mg/kg de pienso compuesto, si la composición se va a utilizar para alimentar ovejas. De manera similar, el control de los niveles de fibra y los niveles reducidos de fitato y polifenoles es de vital importancia para las aplicaciones de alimentos para mascotas. En realizaciones, el procedimiento puede utilizar un agente de lisis o un procedimiento de lisis para aumentar el contenido de nitrógeno (proteína) medido del subproducto o desecho, para proporcionar la recuperación, con un alto rendimiento, de una proteína/material proteico libre de metales de alta pureza. El procedimiento puede utilizar una matriz de adsorción regenerativa empaquetada en una columna o recipiente similar en donde la corriente de subproductos se pone en contacto con la matriz empaquetada para permitir que la proteína o el material proteico del subproducto se unan a la matriz empaquetada. A continuación, la materia proteica/proteína se recuperan en una fase de solución a través de una unión selectiva y desorción/elución de la matriz sólida empaquetada.

La matriz de adsorción regenerativa puede abarcar una matriz de soporte de intercambio iónico, incluidos adsorbentes aniónicos o catiónicos. En realizaciones, tal matriz de adsorción tiene un alto contenido de sílice (por ejemplo, un contenido de sílice superior a 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100% en peso) e incluye tierra de diatomeas, kieselguhr, bentonitas o zeolitas que se pueden unir al componente proteico de la corriente de subproductos que surge de un procedimiento de destilación. Se puede influir en la unión de la matriz de adsorción alterando la carga presente sobre la superficie del adsorbente, por ejemplo, alterando la concentración de sal o el pH en la superficie de la matriz de adsorción. En realizaciones, el componente proteico de la corriente de subproductos, por ejemplo, pot ale, puede unirse a la matriz de adsorción sin requerir ningún cambio de pH de la corriente de subproductos.

Mediante el uso de una matriz de adsorción regenerativa, el procedimiento de la invención es de bajo coste y adicionalmente proporciona una corriente de residuos empobrecida en proteínas que se puede eliminar fácilmente. Esta corriente, con niveles reducidos de nitrógeno, es particularmente adecuada para la digestión anaeróbica. Las corrientes resultantes del equilibrio y la regeneración de la matriz de adsorción también son adecuadas para el procedimiento de digestión anaeróbica y se pueden utilizar como acondicionadores en el sistema.

Además, la materia proteica/proteína recuperada está sustancialmente libre de iones metálicos tales como cobre (Cu), lo que hace que, por ejemplo, un subproducto de pot ale sea adecuado para su uso como aditivo para alimentación animal de alto valor y rico en proteínas. Este aditivo para piensos puede ser adecuado para especies animales que bioacumulan cobre u otros metales hasta niveles potencialmente tóxicos.

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para la recuperación de materia proteica, a partir de una corriente de subproductos provenientes de procedimientos de destilación, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

- opcionalmente, lisar o romper células presentes en la corriente de subproductos;

- eliminar la materia sólida insoluble de la corriente de subproductos para producir una solución que contiene materia proteica clarificada;

- poner en contacto la solución que contiene materia proteica clarificada con una matriz de adsorción empaquetada en una columna que comprende un aluminosilicato y/o tierra de diatomeas en condiciones tales que la materia proteica se una a la matriz de adsorción empaquetada, en donde la matriz de adsorción comprende un contenido de sílice superior a 50% en peso; y

- alterar las condiciones para provocar la liberación de la totalidad o una fracción específica de la materia proteica unida a la matriz de adsorción.

Adecuadamente, la materia proteica puede comprender cualquiera de proteínas, péptidos, aminoácidos o combinaciones de los mismos. Adecuadamente, las etapas en las que se pone en contacto la solución que contiene materia proteica con una matriz de adsorción se realizan sin realizar etapas previas de purificación, adecuadamente en la solución que contiene materia proteica clarificada formada a partir de la eliminación de materia sólida de la corriente de subproductos sin tratamiento previo adicional de la solución, por ejemplo sin ningún cambio en el pH de la corriente de subproductos, en particular pot ale. La matriz de adsorción puede actuar como un medio de intercambio iónico que proporciona una interacción reversible entre una proteína cargada y una matriz con carga opuesta. La matriz de adsorción puede ser un intercambiador de aniones o cationes. En realizaciones, la unión de las proteínas del subproducto, en particular pot ale, antes de cualquier ajuste de pH del subproducto (aproximadamente pH 3 a 4) es indicativa de que la matriz adsorbente con alto contenido de sílice puede actuar como intercambiador de iones catiónicos y que la separación se basa en el intercambio de iones. También pueden estar involucrados el tamizado molecular y las interacciones electrostáticas.

En realizaciones, la etapa de eliminación de materia sólida insoluble de la corriente de subproductos puede utilizar un procedimiento de dos fases. Convenientemente, la primera fase puede eliminar sólidos de un tamaño mayor o igual a 5 pm. En realizaciones, una primera fase puede utilizar centrífugas de pila de discos, decantadores de espiral o hidrociclones. En realizaciones, la primera fase puede ejercer una fuerza centrífuga de al menos 4000 g. En realizaciones, una segunda fase de eliminación de sólidos puede eliminar sólidos de entre 0,1 y 5 pm, en realizaciones, entre 0,1 y 1 pm. Convenientemente, la segunda fase de eliminación de sólidos puede utilizar bolsas de filtro o cartuchos de filtro. En realizaciones, la segunda fase puede utilizar filtros de menos de o igual a 5 pm, en realizaciones de menos de o igual a 1 pm. En realizaciones, los sólidos insolubles de la fase 1 y/o la fase 2 se pueden secar y/o concentrar. En realizaciones, la solución que contiene proteína clarificada se puede concentrar antes de la etapa de contacto.

Opcionalmente, el procedimiento puede incluir adicionalmente la etapa de regeneración de la matriz de adsorción.

Los autores de la presente invención han determinado que utilizando el procedimiento ilustrado en el presente documento, se puede proporcionar materia proteica que incluye productos proteicos específicos con propiedades (tales como proporciones ventajosas de aminoácidos o proteínas con funciones ventajosas) que permiten que los productos proteicos se utilicen como aditivos nutricionales y/o como ingredientes funcionales en formulaciones de alimentos para seres humanos, animales, mascotas y peces.

Aunque ventajosamente el procedimiento de la invención está dirigido al tratamiento de corrientes de subproductos de destilería tales como “pot ale” o “burnt ale”, otro material celular de desecho, por ejemplo, medios o suspensiones que contengan cultivos de células vivas o muertas podrían tratarse de manera similar para recuperar el proteína. En realizaciones, el subproducto o la corriente de desecho que se deben tratar se pueden obtener de la destilación de un alcohol. En realizaciones, el subproducto o la corriente de desecho pueden contener células de levadura.

En realizaciones, la corriente de subproductos se puede seleccionar entre pot ale, aguas de lavado, lías gastadas, vinaza, bagazo, grano gastado, sedimento del intervalo caliente o frío o entre cualquier otro residuo o subproducto de un procedimiento de destilación de alcohol o biocombustible o combinaciones de tales corrientes de subproductos.

En particular, los ejemplos de la presente invención se centran en la preparación de un producto proteico a partir de pot ale. El pot ale es el residuo líquido que queda en el alambique de aguardiente después de la destilación. También se conoce con menos frecuencia como "burnt ale". El pot ale es un líquido de pH bajo que contiene células muertas de levadura, residuos de levadura, carbohidratos, material proteico de levadura, bacterias y residuos y extractos de granos. Contiene al menos 1 % de sólidos en suspensión (principalmente células de levadura), 4% de sólidos disueltos y aproximadamente 30% de contenido de proteína expresado como materia seca. El contenido típico de proteína del pot ale distribuido entre la fracción de sólidos disueltos y de sólidos en suspensión se proporciona en el Ejemplo 1.

En realizaciones particulares, el procedimiento proporciona la recuperación de material proteico de suspensiones celulares tales como desechos de pot o burnt ale de procedimientos de destilación de manera que el material proteico recuperado tiene un contenido sustancialmente reducido de polifenol, fitato, metal, minerales y carbohidratos.

Adecuadamente, la corriente de subproductos puede tener un intervalo de pH de entre 2 y 6. En realizaciones, cuando el pH de una corriente de subproductos, por ejemplo, pot ale, tiene un pH bajo (un intervalo de pH de entre 2 y 6), esto puede conducir a que la mayoría de las proteínas presentes en la misma porten una carga positiva. En realizaciones, se puede utilizar una resina de intercambio catiónico como matriz de adsorción.

Los autores de la presente invención han descubierto que las matrices de adsorción particulares son ventajosas para unir proteínas de granos, así como proteínas de levadura de una corriente de subproductos, por ejemplo, pot ale, en una sola etapa, sin requerir un cambio en el pH ácido del pot ale. Utilizando este procedimiento, se ha determinado que se puede obtener un rendimiento de recuperación de proteínas superior a 70%, en particular superior a 75%, 85%, 90% o 95% a partir de desechos de pot-ale derivados de una destilación de alcohol.

Una matriz de adsorción, adecuada para su uso para unir proteínas en la corriente de subproductos, puede ser una matriz de intercambio iónico que sea de naturaleza catiónica o aniónica y se puede seleccionar en función de su coste u otra propiedad química o física deseada; ventajosamente, el medio incluye un grupo o grupos iónicos que proporciona o proporcionan sitios para unir temporalmente moléculas de proteína. Ventajosamente, la matriz de adsorción se puede seleccionar de modo que proporcione una baja compresibilidad para permitir el flujo de material a través del medio sin caídas de presión elevadas.

Se proporciona una matriz de adsorción con alto contenido de sílice. Una matriz de adsorción con alto contenido de sílice puede tener un contenido de sílice superior a 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100% en peso.

Se puede utilizar un adsorbente comercialmente disponible con un alto contenido de sílice. La sílice puede ser una sílice natural o una sílice sintética.

La matriz de adsorción comprende aluminosilicato y/o tierra de diatomeas empaquetados en una columna. La matriz de adsorción tiene un contenido de sílice superior a 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100% en peso.

La matriz de adsorción puede comprender un mineral arcilloso. Por ejemplo, un mineral de arcilla natural. Los minerales arcillosos están compuestos de sílice, alúmina o magnesia o ambos, y agua. Los minerales arcillosos pueden comprender filosilicatos de aluminio hidratados. Un ejemplo de un mineral arcilloso que se puede utilizar es la bentonita. La matriz de adsorción puede tener un contenido de minerales de arcilla superior a 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100% en peso.

La matriz de adsorción puede comprender zeolita. En su sentido más amplio, las zeolitas se pueden denominar minerales arcillosos. Las zeolitas son compuestos de aluminosilicatos cristalinos. La zeolita puede ser una zeolita natural o una zeolita sintética. Adecuadamente, se puede utilizar una zeolita clinoptilolita. Un ejemplo de una zeolita que se puede utilizar es la "zeolita C". La matriz de adsorción puede tener un contenido de zeolita superior a 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100% en peso

La matriz de adsorción puede comprender tierra de diatomeas o kieselguhr. La matriz de adsorción puede tener un contenido de tierra de diatomeas o kieselguhr superior a 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100% en peso.

Los autores de la presente invención han determinado que estas matrices de adsorción con alto contenido de sílice se unen a proteínas en pot ale en el intervalo de pH bajo al que se produce en las destilerías. Esto permite la separación selectiva de las proteínas de los componentes del pot ale, tales como polifenoles, fósforo, fitato y elementos que incluyen Cu. No se ha reconocido previamente que las proteínas en el pot ale se puedan separar fácilmente de los otros componentes del pot ale utilizando tales matrices adsorbentes con un contenido tan alto de sílice y que las proteínas se pueden unir a tales matrices sin un ajuste previo del pH del pot ale. Esto proporciona un procedimiento sencillo para eliminar las proteínas y a continuación desorberlas selectivamente de la matriz. También permite controlar el perfil de la mezcla proteica. También sorprende que estas proteínas, una vez recuperadas de la matriz, mantengan propiedades funcionales tales como la capacidad espumante.

La matriz de adsorción puede comprender una combinación de uno cualquiera de los siguientes: uno o más minerales arcillosos, zeolitas y/o tierra de diatomeas o kieselguhr.

En realizaciones, se pueden utilizar tamaños de partículas de adsorbentes mayores de 35 micrómetros, preferiblemente mayores de 40 micrómetros. Por ejemplo, se pueden utilizar tamaños de partícula de 40 micrómetros a 700 micrómetros. También se pueden utilizar intervalos de tamaño de partícula. Por ejemplo, se puede utilizar un intervalo de tamaño de partícula de 300 a 700 micrómetros.

El tamaño de partícula se puede restringir tamizando las partículas para seleccionar positiva o seleccionar negativamente el tamaño o tamaños de partícula deseado. Antes de la etapa en la que se pone en contacto la solución que contiene proteína con la matriz de adsorción, las partículas para su uso como adsorbente se pueden clasificar, empaquetar en un lecho y equilibrar en una columna cromatográfica.

En realizaciones, la matriz de adsorción puede ser un material o columna de intercambio catiónico fuerte.

En realizaciones, se pueden utilizar absorbentes comercialmente disponibles con alto contenido de sílice (> 70%) como matrices de adsorción o intercambio iónico, por ejemplo, tierra de diatomeas, bentonitas, kieselguhr y/o zeolitas. Adecuadamente se puede utilizar una zeolita, en particular zeolita clinoptilolita, también conocida como “zeolita C”.

En realizaciones, la matriz de adsorción se puede formar a partir de zeolitas (compuestos de aluminosilicatos cristalinos), en particular clinoptilolitas. Los autores de la presente invención han determinado que estas se unen a proteínas en pot ale en el intervalo de pH bajo en el que se produce en las destilerías. Esto permite la separación selectiva de las proteínas de los componentes del pot ale, tales como polifenoles, fósforo, fitato y elementos que incluyen Cu. No se ha reconocido previamente que las proteínas en el pot ale se puedan separar fácilmente de los otros componentes del pot ale utilizando minerales arcillosos naturales y que las proteínas se puedan unir a la matriz sin un ajuste previo del pH del pot ale. Esto proporciona un procedimiento sencillo para eliminar las proteínas y a continuación desorberlas selectivamente de la matriz. También permite controlar el perfil de la mezcla proteica. También sorprende que estas proteínas, una vez recuperadas de la matriz, mantengan propiedades funcionales tales como la capacidad espumante.

La destilación es un procedimiento bastante severo y se esperaría un alto grado de desnaturalización y/o precipitación de proteínas. Por ejemplo, la primera etapa de destilación en la producción de whisky de malta típicamente implica mantener el lavado a temperaturas entre 90 y 100°C hasta que el alcohol se haya evaporado. Es importante resaltar que el procedimiento del whisky tiene una serie de diferencias en comparación con la elaboración de la cerveza, por lo que no resulta obvio que proteínas similares estén presentes en las corrientes de subproductos o de productos en la destilación y que estas proteínas mantengan propiedades funcionales en el pot ale después de la destilación. Durante el procedimiento de elaboración de cerveza, el mosto, es decir, el extracto rico en azúcar de la cebada malteada, se hierve antes de la fermentación. El lúpulo también se incluye en esta etapa y esta ebullición da como resultado la precipitación de proteínas además de polifenoles en forma de sedimento del intervalo caliente o frío y también inactiva las proteínas proteolíticas de cebada. Esta etapa también está asociada con la modificación de las proteínas solubles restantes mediante reacciones de glicación, acilación y desnaturalización, que se cree que son esenciales para crear el potencial de formación de espuma de las proteínas en la cerveza final. En la producción de licores destilados, el mosto no se hierve y las enzimas proteolíticas de la cebada malteada siguen activas durante la fermentación con proteólisis continua y alteración de las proteínas solubles. Durante la primera etapa de destilación, el lavado, es decir, el licor fermentado, se calienta entre 90 y 100°C hasta que se haya destilado el alcohol. Este es un tratamiento bastante severo y es sorprendente que la mezcla de proteínas que quedan en el lavado aún después de la destilación sean todavía espumantes. Esta actividad también se mantiene después de las etapas de cromatografía en el procedimiento descrito en el presente documento.

Si bien se han utilizado geles a base de sílice para unir selectivamente fragmentos de proteína hordeína en la cerveza, otras proteínas tales como LTP1 y proteínas Z permanecieron sin unirse (Leiper 2003 [Leiper, KA, Stewart, GG, McKeown, I.P. 2003. Bear polypeptides and silica gel. Parte II. Polypeptides involved in form formation. Journal of the Institute of Brewing. 109:73-79]). Por lo tanto, es inesperado que una matriz de tipo sílice, tal como la zeolita, pueda unir casi todas las proteínas del pot ale y separarlas de los subproductos de la destilación, especialmente sin ningún tratamiento previo del pot ale.

El uso de matrices con alto contenido de sílice que comprenden, por ejemplo, zeolitas, ofrece una serie de ventajas sobre otras resinas, tales como ser relativamente económicas, de calidad alimentaria y tener propiedades físicas deseables, tales como porosidad e incompresibilidad a las presiones requeridas para procedimientos cromatográficos a gran escala. Lo que es más importante, sus propiedades inherentes muestran una alta afinidad por la materia proteica/mezcla de proteínas en el pot ale y esto permite la adsorción de proteínas del pot ale en un intervalo de pH que no requiere ningún cambio de pH o adición química al pot ale antes de la unión de la proteína a la matriz.

Las condiciones del procedimiento de adsorción y desorción (p. ej., pH, especies iónicas y concentración) se pueden modificar para eliminar de forma selectiva componentes específicos del pot ale, tales como polifenoles, carbohidratos, fitatos y elementos, incluidos iones de cobre, recuperar toda la proteína, parte de la proteína o fracciones de proteínas específicas.

En realizaciones, las condiciones para mejorar la unión de la materia proteica a la matriz de adsorción (que se puede considerar como un medio de intercambio iónico) pueden comprender el tratamiento de la matriz antes de la cromatografía con soluciones o tampones de pH alcalino, ácido o neutro, tales como hidróxido de sodio, tampón de fosfato de sodio, tampón de citrato o tampón de acetato con un pH en el intervalo de pH 1 a pH 12 y una concentración de sal en el intervalo de 0,01 M a 2 M. En realizaciones, las condiciones para permitir la liberación de la materia proteica/proteína de la matriz de adsorción (que se puede considerar como un medio de intercambio iónico) pueden comprender una sal, por ejemplo NaCl, en el intervalo de concentración de 0,5 M a 2 M, adecuadamente 1 M. También se pueden utilizar otras soluciones o tampones de pH alcalino, ácido o neutro y estos pueden comprender un tampón de fosfato o carbonato en el intervalo de pH de 7 a 11 u 8 a 11 o NaOH en el intervalo de concentración de 0,01 M a 1,0 M o NaOH en el intervalo de pH de 10 a 14.

En realizaciones, la etapa de lisis de las células puede comprender un tratamiento enzimático. Alternativamente, la etapa de lisis o ruptura de las células presentes en la corriente de subproductos puede ser hidrólisis ácida/alcalina, calentamiento, efectos de la presión osmótica, uso de solventes, tratamiento con tensioactivo, sonicación, despresurización rápida o atrición, procesamiento de alto cizallamiento, o combinaciones de estas etapas de lisis o ruptura. El método de lisis o ruptura utilizado dependerá típicamente del volumen de material que se vaya a procesar. Adecuadamente, se puede proporcionar glucanasa o proteasa para ayudar a la liberación de materia proteica/proteína. En realizaciones, la corriente de subproductos tratada se puede proporcionar a una temperatura para optimizar la actividad enzimática. En realizaciones, la corriente de subproductos tratada se puede proporcionar a un pH para optimizar la actividad enzimática. En realizaciones, el procedimiento se puede llevar a cabo en el intervalo de temperatura de temperatura ambiente a 90°C, preferiblemente aproximadamente 45°C.

En realizaciones, se puede recuperar de 50% al 95% de la materia proteica total presente en la corriente de subproductos, por ejemplo, pot ale, utilizando el procedimiento de la presente invención.

En realizaciones, la materia proteica/proteína soluble recuperada de la matriz de adsorción se puede procesar y concentrar adicionalmente utilizando un evaporador, secado por atomización y/o métodos de filtración.

El procedimiento puede incluir adicionalmente una etapa de cromatografía adicional antes y/o después de la etapa de adsorción, incluyendo exclusión por tamaño, afinidad u otras etapas de cromatografía adecuadas.

En realizaciones del procedimiento, el pot ale tratado o no tratado para mejorar la liberación de materia proteica/proteína y/o para promover la lisis o ruptura de las células de la misma se puede clarificar para separar las porciones sólidas y líquidas. La porción líquida se puede proporcionar a una matriz de adsorción en condiciones en las que la materia proteica/proteína de la porción líquida se une a la matriz y la corriente líquida resultante sin proteínas o con bajo contenido de proteínas (una corriente de proteínas que contiene menos de 50% de la proteína original adecuadamente menos de 10%, menos de 20% de la proteína original) se separa del medio unido a materia proteica/proteína. Las condiciones que rodean la matriz de adsorción se pueden cambiar a continuación de modo que la materia proteica/proteína unida a la matriz se libere de la matriz y se pueda recoger. Opcionalmente, la matriz de adsorción se puede regenerar a continuación para permitir una mayor unión de la materia proteica/proteína a la matriz de adsorción. Si se desea, la corriente líquida sin proteína o con bajo contenido de proteína creada después de la eliminación de la proteína de la porción líquida del pot ale clarificado se puede proporcionar a la matriz de adsorción, por ejemplo, la matriz de adsorción regenerada, durante un segundo período o período adicional en condiciones similares a las de la primera etapa de cromatografía.

En realizaciones, la matriz de adsorción se proporciona en una columna de cromatografía. En realizaciones, se pueden ejecutar múltiples columnas de cromatografía en paralelo para mejorar el rendimiento o en serie para mejorar el rendimiento o la pureza. En realizaciones, la invención se puede dirigir de manera continua, semicontinua o discontinua.

En realizaciones, la proteína eluida de la matriz de adsorción se puede concentrar mediante ultrafiltración, diafiltración o evaporación.

En realizaciones, la corriente líquida sin proteína o con bajo contenido de proteína creada después de la eliminación de la proteína de la porción líquida del por ale clarificado se puede proporcionar a un procedimiento de tratamiento adicional, tal como la digestión anaeróbica. Esta corriente, con niveles reducidos de nitrógeno, es particularmente adecuada para la digestión anaeróbica. Las corrientes resultantes del equilibrio y la regeneración de la matriz de adsorción también son adecuadas para el procedimiento de digestión anaeróbica y se pueden utilizar como acondicionadores en el sistema anaeróbico.

También se divulga en este documento una materia proteica, en particular proteínas, en particular proteínas funcionalmente activas obtenidas a partir de un procedimiento del primer aspecto de la invención.

La materia proteínica, por ejemplo proteínas y lo proteínas funcionalmente activas recuperadas por elución de la matriz de adsorción y concentradas por filtración, diafiltración o evaporación o procesadas sin concentración adicional, pueden secarse a continuación solas o secarse combinadas con la corriente de sólidos insolubles utilizando un procedimiento de secado o la mezcla con otros medios tales como los cereales recuperados del bagazo o los sólidos de la vinaza o aguas de lavado para mejorar el contenido proteico de los cereales y sólidos sin aumentar el contenido total de metales de la mezcla.

La materia proteica puede proporcionar proteínas de la familia de proteínas Z de proteínas de cebada tales como Serpina-Z4 (Z4) o Serpina-Z7 (Z7) o proteína LTP1. Estas proteínas tienen las siguientes secuencias de aminoácidos (de la base de datos Swiss-Prot, www.uniprot.org):

Proteína Z4 (número de acceso de Swiss-Prot P06293):

10 20 30 40 50 60

MATTLATDVR LSIAHQTRFA LRLRSAISSN PERAAGNVAF SPLSLHVALS LITAGAAATR

70 80 90 100 110 120

DQLVAILGDG GAGDAKELNA LAEQWQFVL ANESSTGGPR IAFANGIFVD ASLSLKPSFE

130 140 150 160 170 180

ELAVCQYKAK TQSVDFQHKT LEAVGQVNSW VEQVTTGLIK QILPPGSVDN TTKLILGNAL

190 200 210 220 230 240

YFKGAWDQKF DESNTKCDSF HLLDGSSIQT QFMSSTKKQY ISSSDNLKVL KLPYAKGHDK

250 260 270 280 290 300

RQFSMYILLP GAQDGLWSLA KRLSTEPEFI ENHIPKQTVE VGRFQLPKFK ISYQFEASSL

310 320 330 340 350 360

LRALGLQLPF SEEADLSEMV DSSQGLEISH VFHKSFVEVN EEGTEAGAAT VAMGVAMSMP

370 380 390

LKVDLVDFVA NHPFLFLIRE DIAGVWFVG HVTNPLISA (SEQ ID NO: 1)

Proteína Z7 (número de acceso de Swiss-Prot Q43492):

10 20 30 40 50 60

MATTLTTDLR LSIAHQTRFG LRLASAISSD PESAATNVAF SPVSLHVALS LVAAGARGAT

70 80 90 100 110 120

RDQLVAVLGG GGAGEAEALQ SLAEQWQFV LADASINSGP RIAFANGVFV DASLSLKPSF

130 140 150 160 170 180

QELAVCNYKS EVQSVDFKTK APEAASQVNS WVKNVTAGLI EEILPAGSID NTTRLVLGNA

190 200 210 220 230 240

LYFKGLWTKK FDESKTKYDD FHLLNGSTVQ TPFMSSTNKQ YLSSSDGLKV LKLPYQHGGD

250 260 270 280 290 300

NRQFSMYILL PEAHDGLSRL AQKLSTEPDF LENRIPTEEV EVGQFMLPKF KISFGFEANK

310 320 330 340 350 360

LLKTLGLQLP FSLEANLSEM VNSPMGLYIS SVFHKTFVEV DEEGTKAGAA TGDVIVDRSL

370 380 390

PIRMDFVANH PFLFLIREDI AGWLFIGHV ANPAVSS (SEQ ID NO: 2)

LTP1 (Swiss-Prot accession number P07597

10 20 30 40 50 60

MARAQVLLMA AALVLMLTAA PRAAVALNCG QVDSKMKPCL TYVQGGPGPS GECCNGVRDL

70 80 90 100 110

HNQAQSSGDR QTVCNCLKGI ARGIHNLNLN NAASIPSKCN VNVPYTISPD IDCSRIY (SEQ ID NO: 3)

La materia proteica puede comprender restos de aminoácidos en las proporciones.

Tabla 1

La materia proteica puede comprender restos de aminoácidos en las proporciones (expresadas como % de proteína bruta)

Tabla 2

También se describe en el presente documento un alimento para animales, un alimento para peces o un ingrediente alimentario que comprende una materia proteica, por ejemplo, proteínas, como se establece en el primer o segundo aspectos.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de materia proteica como se establece en el primer o segundo aspectos como agente espumante.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de una matriz de adsorción que comprende un contenido de sílice superior a 50% en peso para separar y aislar materia proteica de una corriente de subproductos de pot ale de un procedimiento de destilación.

A lo largo de la memoria descriptiva, a menos que el contexto exija lo contrario, se entenderá que los términos 'comprenden' o 'incluyen', o variaciones tales como 'comprende' o 'que comprende', 'incluye' o 'que incluye' implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros establecido, pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros.

Las características y realizaciones preferidas de cada aspecto de la invención son como para cada uno de los otros aspectos mutatis mutandis a menos que el contexto exija lo contrario.

Descripción específica de las figuras

A continuación, se describirán realizaciones de la presente invención únicamente a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas en las que;

La Figura 1 es un dibujo esquemático del procedimiento para preparar un producto proteico según la invención. La Fase 1 se refiere a la separación sólido/líquido y puede incluir centrífugas de pila de discos, decantadores de espiral o hidrociclones. La Fase 2 es la etapa secundaria de eliminación de sólidos y comprende bolsas de filtro o cartuchos de filtro. La Fase 3 es una etapa opcional que implica el secado de los sólidos recuperados durante la Fase 1 y la Fase 2 cuando se requiere un producto seco en lugar de una suspensión. La Fase 4 es la etapa de cromatografía que permite la separación de la mezcla de proteína y puede incluir una etapa de cromatografía adicional (Fase 5) si fuera necesario. La Fase 6 es una etapa de ultrafiltración/diafiltración o evaporación y la Fase 7 es una etapa de secado adicional que puede incluir: secadores de circulación cruzada y circulación directa, secadores de bandeja, secadores de túnel, secadores rotativos, secadores de tambor, secadores por atomización y/o liofilizadores. Las fases de secado (3 y 7) se pueden combinar para proporcionar un producto seco de levadura rico en proteínas que consiste en los sólidos eliminados durante las etapas 1 y 2 y las proteínas separadas por cromatografía. La corriente de desechos empobrecidos en proteínas y las corrientes resultantes del equilibrio y la regeneración de la matriz de adsorción durante las Fases 4-5 y las corrientes de desechos de la Fase 6 pueden ingresar a los sistemas de tratamiento de aguas residuales (8). Estas corrientes son particularmente adecuadas para los sistemas de digestión anaeróbica y la energía generada a partir del gas anaeróbico se puede utilizar para impulsar otras etapas del procedimiento, ejecutando un procedimiento verdaderamente integrado.

La Figura 2 es un diagrama de flujo de cómo se acondiciona la matriz para la etapa de cromatografía en la Fase 4.

La Figura 3 es una imagen de un gel SDS-PAGE de proteínas en la fracción de sólidos disueltos de pot ale. Las muestras cargadas en las calles marcadas como 1-3 son las siguientes: 1. Patrones de proteínas; 2 y 3 fracción de sólidos disueltos de pot ale (16 gg de proteína).

La Figura 4 es una imagen de un gel SDS-PAGE de proteínas de pot ale separadas mediante cromatografía utilizando la columna Capto S como se describe en el Ejemplo 2. Las muestras cargadas en las calles marcadas como 1-8 se eluyeron secuencialmente de la columna Capto S con tampón de acetato de sodio que contenía NaCl 0,2 M (calles 1 y 2), NaCl 0,4 M (calles 3 y 4) y NaCl 0,6 M calles 5 y 6. La calle 7 contiene un tampón y la calle 8 del blanco patrones de proteína. La proteína cargada por pocillo varió entre 2 y 6 gg de proteína.

La Figura 5 muestra la elución de la proteína de la zeolita c utilizando NaHCÜ3100 mM seguido de NaOH 1 M. Los cromatogramas fueron generados por el AKTA Avant y muestran el tiempo desde la configuración inicial de la cromatografía en el eje x y la concentración de proteína indicada por la absorbancia a 280 nm en el eje y.

La Figura 6 muestra la elución de la proteína de la zeolita c utilizando el tampón NaHCO3-Na2CO3 50 o 100 mM a pH 10,8. Los cromatogramas fueron generados por el AKTA Avant y muestran el tiempo desde la configuración inicial de la cromatografía en el eje x y la concentración de proteína indicada por la absorbancia a 280 nm en el eje y.

La Figura 7 muestra la elución de la proteína de zeolita c de grado fino o grueso, utilizando tampón NaHCO3-Na2CO3100 mM a pH 10,8. Los cromatogramas fueron generados por el AKTA Avant y muestran el tiempo desde la configuración inicial de la cromatografía en el eje x y la concentración de proteína indicada por la absorbancia a 280 nm en el eje y.

La Figura 8 es un gráfico que compara la estabilidad de las espumas producidas por las proteínas en el pot ale concentradas por ultrafiltración y sometidas a diálisis en agua (R1), proteínas en el pot ale separadas por cromatografía utilizando zeolita C y eluidas como se describe en el Ejemplo 4 (RIEX10), proteínas en el pot ale recuperadas de la zeolita C por elución con NaOH 1 M (RIEX14) y lacprodan DI 7017, una proteína láctea disponible comercialmente (L87).

Descripción específica de la invención

El pot o burnt ale es una corriente a base de agua de gran volumen y bajo contenido de sólidos o un subproducto en la industria de la destilación que es típicamente ácido (pH bajo) y contiene una alta porción de proteína (medida como contenido total de nitrógeno utilizando un análisis Kjeldahl) que se obtiene a partir de levadura de cerveza y medios de fermentación (cereales tales como cebada, etc.). La proteína es valiosa como ingrediente de alimentación, pero puede estar contaminada con cobre ya que muchos procedimientos de destilación se llevan a cabo dentro de recipientes de cobre (Cu) y esto puede conducir a que los desechos ácidos (subproductos) sean ricos en sales o complejos de cobre.

Para ser utilizado en alimentos para peces como un sustituto directo de la harina de pescado, sería comercialmente ventajoso que los subproductos tuvieran concentraciones de proteína al menos similares a la harina de pescado (es decir, superiores a 65%). Los subproductos actualmente disponibles no cumplen este criterio con niveles máximos de proteína en torno a 35%. Los peces tienen requerimientos de nutrientes muy específicos, incluidos aminoácidos esenciales. A continuación se resumen los requerimientos de aminoácidos de las principales especies de pescado cultivadas en Europa y de los subproductos de destilería disponibles en el mercado. Los niveles de lisina (a menudo el primer aminoácido limitante en las dietas de alimentos) en los subproductos de destilería son inferiores a los requerimientos del pescado, excepto en el caso de los granos oscuros y el jarabe de pot ale (jarabe de Spey) de las destilerías de malta. En todos los casos, los niveles de metionina son menos de los necesarios, aunque esto es típico de las fuentes de proteínas vegetales. El pot ale es, por lo tanto, uno de los pocos subproductos de la destilería con el perfil de aminoácidos adecuado para el pescado, en particular para la alimentación del salmón. Sin embargo, sería necesario aumentar la concentración de proteínas y reducir los niveles de carbohidratos y fitatos para que sea más compatible con los alimentos para peces.

Tabla 3

Tabla 4

Los componentes se expresan como % de materia seca (MS) con los aminoácidos como % de proteína bruta (PB). Los datos para el bagazo y los granos oscuros (gránulos de cebada de destilería) de las destilerías de malta escocesas, los DDGS de la UE (destilerías de maíz importadas de fuera del Reino Unido), el jarabe de Spey (jarabe de pot ale de las destilerías de malta escocesas) y el jarabe Proflo (jarabe de la planta de bioetanol de trigo Vivergo en Yorkshire, Inglaterra), NDF se refiere a la fibra detergente neutra, más o menos equivalente a la hemicelulosa, la celulosa verdadera y la lignina.

En un ejemplo, la corriente a base de agua del pot ale utilizada en el procedimiento de la presente invención incluye sólidos disueltos y una fracción de sólidos insolubles. En realizaciones, estas dos fracciones se pueden separar en una fracción clarificada y una fracción de sólidos, respectivamente, con las proteínas deseadas separadas adicionalmente de la fracción clarificada del pot ale. La fracción de sólidos insolubles del pot ale consiste principalmente en levadura y residuos de levadura. La concentración de proteína en la fracción clarificada se puede mejorar tratando la fracción de sólidos insolubles mediante procedimientos fisicoquímicos y enzimáticos únicos o combinados conocidos para liberar los componentes proteicos (etapa de lisis). Esta etapa de lisis opcional permite controlar el valor nutritivo del producto proteico.

En realizaciones, las proteínas solubles se separaron selectivamente uniendo preferentemente estas proteínas del pot ale clarificado a un adsorbente. Esto permitió separar del producto proteico los posibles compuestos antinutricionales del pot ale, tales como Cu, fibra, fitato, polifenoles y carbohidratos. El procedimiento ofrece ventajas considerables sobre el método de evaporación convencionales para preparar jarabe de pot ale como alimento para animales, ya que no incurre en altos costes de energía. Además, la evaporación puede sufrir altas emisiones de gases de efecto invernadero y las altas temperaturas utilizadas pueden tener un efecto nocivo en la calidad de la proteína. La evaporación concentra todos los componentes del pot ale, incluidos los compuestos no deseables como el fitato y el cobre. La separación de la proteína de los otros residuos de destilación ofrece la ventaja de que la proteína se puede utilizar en una amplia gama de ingredientes para alimentos, tal como el uso en acuicultura y alimentos para mascotas. El método también se puede utilizar para separar selectivamente proteínas específicas o una mezcla de proteínas, que tienen sorprendentes propiedades espumantes y que tienen usos potenciales como proteínas funcionales en formulaciones de alimentos para seres humanos, animales, mascotas y peces.

La Figura 1 describe la recuperación de proteínas de un subproducto de whisky de malta conocido como pot ale o burnt ale. En esta realización, la primera etapa (Fase 1) en el procedimiento de recuperación de proteínas es la separación de las partículas sólidas. Por lo general, se pueden utilizar centrífugas de pila de discos, decantadores de espiral o hidrociclones para este propósito, siempre que se logre un campo centrífugo de al menos 4000 g para igualar el resultado de la generación de subproductos y las demandas económicas. Se puede incluir una etapa secundaria de eliminación de sólidos (Fase 2) para garantizar que se introduzcan cantidades mínimas de partículas en el equipo implicado en las etapas posteriores de purificación de proteínas. El fracaso para lograr esto podría implicar una seria reducción en los resultados del procedimiento. El equipo típico utilizado para la filtración secundaria puede incluir bolsas de filtro o cartuchos de filtro con un diámetro de poro máximo de 5, adecuadamente 4, 3, 2 o 1 pm. La corriente que contiene sólidos insolubles de las Fases 1 y 2 se puede secar (Fase 3) para proporcionar un producto de levadura. En la Fase 4, los componentes proteicos se pueden eliminar selectivamente de la corriente líquida de subproductos y concentrar. Esto implica un procedimiento de concentración de proteína primario que se puede lograr mediante una etapa de cromatografía. Los tipos de cromatografía que se pueden utilizar incluyen matrices de adsorción con propiedades tales como intercambio iónico (IEX), exclusión por tamaño, afinidad o cualquier otro tipo apropiado utilizado en sistemas de cromatografía líquida. Después de la etapa primaria de concentración de proteína, podría ser necesario una etapa adicional para aumentar la concentración y la pureza de una proteína o proteínas de interés en particular. Para esta etapa se puede incluir una etapa cromatográfica adicional (Fase 5). Se puede utilizar una etapa de ultrafiltración/diafiltración o evaporación (Fase 6) para concentrar adicionalmente la mezcla de proteínas después de las etapas de cromatografía. El tipo de filtro para ultrafiltración/diafiltración dependerá de las propiedades físicas y químicas de la proteína o proteínas deseadas. Un material de filtro adecuado tendrá en ese caso, por ejemplo, propiedades hidrófilas o hidrófobas y un peso molecular nominal de corte entre 3-1000 kDa. Una etapa final en el procedimiento general incluye una concentración adicional, específicamente eliminación de agua (Fase 7). El contenido de humedad típico de las proteínas en polvo es inferior a 20%. Para este propósito, se pueden utilizar secadores que pueden incluir: secadores de circulación cruzada y circulación directa, secadores de bandeja, secadores de túnel, secadores rotativos, secadores de tambor, secadores por aspersión y/o liofilizadores. Las fases de secado (3 y 7) se pueden combinar como una sola fase para proporcionar un producto seco de levadura de alto contenido de proteínas que consiste en los sólidos eliminados durante las etapas 1 y 2 y las proteínas separadas por cromatografía. La corriente de desechos empobrecidos en proteínas y las corrientes resultantes del equilibrio y la regeneración de la matriz de adsorción durante las Fases 4-5 y las corrientes de desechos de la Fase 6 pueden ingresar a los sistemas de tratamiento de aguas residuales (7). Estas corrientes son particularmente adecuadas para los sistemas de digestión anaeróbica. En este caso, el gas generado se puede utilizar como fuente de energía en otras etapas del procedimiento, proporcionando un procedimiento verdaderamente integrado, de bajo consumo energético y ambientalmente sostenible.

Ejemplo 1: Componentes de interés en el pot ale y fracciones clarificadas e insolubles correspondientes

El análisis típico del pot ale de una destilería de whisky de malta escocés se muestra en la Tabla 5 y la Tabla 6. Se analizaron hasta 6 lotes independientes diferentes de pot ale y se muestran los datos medios. El pot ale se analizó como una fracción total (denominada pot ale total) o separada en gránulos (fracción sólida) y sobrenadante (fracción clarificada) mediante centrifugación. Estas corresponden a las fracciones que ingresan a las fases 1, 2 y 4 respectivamente, como se describe en la Figura 1. El contenido de materia seca (MS) de las muestras se determinó secando muestras representativas a 105°C durante 24 horas. Los polifenoles totales en la fracción clarificada se analizaron de acuerdo con el método ASBC Beer-35 para el análisis de polifenoles totales de cerveza (ASBC 1992) y los carbohidratos totales en esta fracción se determinaron utilizando el ensayo de ácido fenol-sulfúrico según Fournier (2001). Se utilizó Espectroscopía de Absorción Atómica de llama para analizar la concentración de los macroelementos Ca, Na, Mg y K y los microelementos Cu, Fe, Mn y Zn. Los elementos de las fracciones clarificadas se analizaron directamente con referencia a los patrones relevantes. Para el pot ale total, las muestras se digirieron con HNO36 M antes del análisis. La concentración de elementos en la fracción de sólidos se determinó como la diferencia entre las otras dos fracciones. El fósforo libre y disponible y el contenido de fitato correspondiente del pot ale total y la fracción clarificada se analizaron utilizando un Kit de ácido Fítico (Fitato)/Fósforo total Megazyme (K-PHYT). La fracción de sólidos se determinó como la diferencia entre las fracciones total y disuelta. Para el análisis de nitrógeno y aminoácidos, las muestras se liofilizaron a menos de 15% de humedad. Tanto las alícuotas totales como las fracciones sólidas se liofilizaron. No fue posible liofilizar las fracciones clarificadas y solo se analizaron las fracciones totales y sólidas y se determinó la composición de la fracción clarificada como la diferencia entre estas dos muestras. El nitrógeno se analizó utilizando un Exeter Analytical CE440 Elemental Analyzer y el contenido de proteína bruta se estimó como N x 6,25. El análisis de aminoácidos se realizó mediante hidrólisis ácida seguida de cromatografía de intercambio iónico con detección por ninhidrina y fue realizado por Abingdon Health Laboratory Services en la Universidad de Birmingham. El contenido de aminoácidos específicos se calculó como un % de la proteína bruta determinada por análisis CHN. Para este método, la asparragina y la glutamina se convierten completamente en ácido aspártico y ácido glutámico, respectivamente.

No se dispone fácilmente de un análisis exhaustivo del pot ale que incluya las diferencias entre las fracciones clarificadas y sólidas. Lo interesante de estos datos es que aproximadamente dos tercios de la proteína en el pot ale están en la fracción clarificada. La concentración de proteína soluble se puede aumentar adicionalmente mediante la lisis de las células de levadura. Esta fracción también contiene 1 % de polifenoles, 43% de carbohidratos y 1 % de fitato con más de 1,6% de fósforo expresado como materia seca. Estos componentes son indeseables en ciertas aplicaciones de alimentos, particularmente en alimentos acuícolas y, sin un procesamiento adicional, el grado de incorporación del pot ale clarificado a los alimentos estaría restringido a un nivel bajo.

Ejemplo 2: Análisis de proteínas en el pot ale mediante SDS-PAGE

Las proteínas en la fracción clarificada se analizaron adicionalmente mediante análisis SDS-PAGE. En primer lugar, las muestras se concentraron y sometieron a diálisis utilizando Amicon Ultra-15 3K Centrifugal Filter Tubes (Merck Millipore Ltd., Cork, Irlanda). La concentración de proteína se determinó mediante el ensayo de Bradford (Bradford 1976) y las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE. Las muestras de concentración de proteína conocida se mezclaron con volúmenes iguales de tampón de muestra Laemmli (Sigma-Aldrich Ltd., Dorset, Inglaterra), se calentaron a 70°C durante 10 min, se enfriaron en hielo y se cargaron en geles de poliacrilamida prefabricados al 4-20% (geles prefabricados Bio-Rad Mini-Protean TGX, Bio-Rad Laboratories, Herts, Reino Unido). Los geles se procesaron utilizando un Bio-Rad Mini-Protean Tetra Cell System para mini geles prefabricados con tampón de migración Tris-Glicina. Se hizo migrar un marcador proteico preteñido de amplio intervalo (7-175 kDa) (New England Biolabs (UK) Ltd., Herts, UK) en todos los geles para estimar el peso molecular de la proteína. La electroforesis se realizó a 180 V durante aproximadamente 40 min y se detuvo cuando el frente del colorante llegó al fondo del gel. Después de la electroforesis, los geles se enjuagaron con agua y se tiñeron durante la noche con una tinción de azul de Coomassie coloidal. Los geles se enjuagaron y se destiñeron con agua hasta que se eliminó la mancha de fondo. Los geles de SDS-PAGE se escanearon con un sistema de imágenes VersaDoc (Bio-Rad) y las imágenes se analizaron utilizando el soporte lógico Image Lab de Bio-Rad para estimar el peso molecular de las bandas de proteína.

Típicamente, la fracción clarificada mostró dos bandas de proteína de diferentes intervalos de peso molecular cuando se analizó mediante SDS-PAGE: una banda ancha de aproximadamente 7-15 kDa y una banda de mayor peso molecular de 38-42 kDa (Figura 3). Las dos bandas están dentro del intervalo de tamaño de LTP1 y Proteína Z, que se originan en la cebada (Leiper et al., 2003 [Leiper, KA, Stewart, GG, McKeown, I.P. 2003. Beer polypeptides and silica gel. Parte II. Polypeptides involved in form formation. Journal of the Institute of Breewing. 109:73-79]). Sin embargo, debe destacarse que los pesos moleculares referidos aquí son solo aproximaciones, ya que se utilizó un marcador de proteína preteñido. Las bandas también aparecen bastante 'borrosas', lo cual es típico de las proteínas que tienen residuos de aminoácidos glicados. Un análisis adicional ha demostrado que la banda de menor peso molecular está compuesta por componentes de diferentes pesos moleculares aparentes. Esto se puede atribuir a que la proteína LTP1 está glicada en diferentes grados o que los fragmentos de hordeína de la cebada también están presentes en el pot ale.

Esta es la primera vez que se identifican tentativamente las proteínas del pot ale. Lo sorprendente es que el perfil de proteínas de SDS-PAGE es similar al de la cerveza (Leiper 2003), a pesar de las diferentes etapas de procesamiento implicadas. Durante la producción de whisky, las proteínas se modifican continuamente durante la fermentación mediante enzimas proteolíticas y no sería descabellado esperar que el calentamiento excesivo durante la destilación produjera una mayor precipitación de proteínas y proteolisis. En base a esto, es sorprendente que las proteínas mayores de 5 kDa todavía estén presentes en el pot ale clarificado.

Tabla 5: Análisis del pot ale total y fracciones clarificadas y sólidas. Todas las concentraciones se refieren a materia seca a menos que se indique lo contrario.

Tabla 6 Análisis de algunos de los aminoácidos en la proteína del pot ale y fracciones clarificadas y sólidas. Los aminoácidos se muestran como % de proteína bruta basándose en el análisis de N.

Ejemplo 3: Separación y recuperación de proteínas del pot ale utilizando Capto S.

Las proteínas de la fracción de sólidos disueltos se separaron y recuperaron mediante cromatografía utilizando la resina Capto S, un medio de intercambio catiónico fuerte suministrado en una columna preempaquetada (GE Healthcare). Se recolectaron secuencialmente tres fracciones de proteína después de la elución con acetato de sodio 0,1 M a pH 4,5 que contenían cantidades crecientes de NaCl a 0,2, 0,4 y 0,6 M. Esto permitió la separación diferencial de las proteínas del pot ale como se demuestra el análisis SDS-PAGE (Figura 4).

Ejemplo 4: Acondicionamiento de la fase sólida (matriz)

Se acondicionó una fase sólida, matriz, adsorbente o resina antes de introducirla en la columna para proporcionar la máxima capacidad de adsorción (proteína) y velocidades de flujo de procesamiento mientras se mantenía una caída de presión baja en toda la columna. En este ejemplo, se utilizó zeolita clinoptilolita también conocida como "zeolita c" en una columna de 5 cm de diámetro. Según los cálculos del autor de la presente invención, se consideran posibles columnas de hasta 1 m3 y funcionarán bajo las condiciones deseadas de presión y flujo

Se utilizaron tres etapas secuenciales (Figura 2) para lograr los objetivos mencionados anteriormente (adsorción máxima, caudal máximo y presión mínima). La etapa de "Clasificación de partículas" tiene como objetivo eliminar partículas de pequeño tamaño (adecuadamente menos de 90 micrómetros de diámetro). Para lograr esto, se utilizó un tamiz adecuado de menos de 90 micras y a continuación, posteriormente, las partículas se introdujeron en la columna y se bombeó agua desde el fondo de la columna y la parte superior de la columna se dejó abierta haciendo que las partículas más pequeñas flotaran (fluidificación del lecho) y después salieran de la columna. Este procedimiento también se conoce como elutriación. En este ejemplo se utilizó una columna de 5 cm de diámetro con caudales típicos de hasta 80 ml/min. Para asegurarse de que se eliminaran todas las partículas pequeñas, este procedimiento se llevó a cabo durante al menos 1 hora.

La segunda etapa "Empaquetamiento del lecho" maximiza la cantidad de fase sólida por unidad de volumen. Para lograr esto, se bombeó agua a través de la columna de arriba hacia abajo. Para la columna de 5 cm de diámetro, los caudales eran normalmente del orden de 100-150 ml/min durante al menos 2 horas. Durante este tiempo, es importante asegurarse de que no quede aire atrapado en la columna y de que la columna no esté sobrepresurizada.

La etapa final, el "Equilibrado del lecho", se utiliza para eliminar los contaminantes adheridos a la resina y para cargar las partículas de resina de forma adecuada a fin de garantizar la máxima interacción proteína-adsorbente. En este caso, se utilizó una solución de NaOH 1 M a un caudal de aproximadamente 40 ml/min (flujo descendente) durante al menos 1 hora.

Posteriormente, se utilizó agua destilada y desionizada para eliminar las sales a un caudal de aproximadamente 40 ml/min durante al menos 1 hora. Finalmente, se utilizó una solución tampón con un intervalo de pH entre 3 y 5, p. ej. tampón de acetato, para asegurar que las partículas sólidas se cargaran con el fin de asegurar la máxima adherencia de proteínas o cualquier otra sustancia de interés a la fase sólida. Esta etapa normalmente se lleva a cabo a caudales de hasta 40 ml/min durante al menos una hora.

Ejemplo 5: Separación y recuperación de proteínas del pot ale utilizando zeolita de calidad alimentaria

Se utilizaron procedimientos de cromatografía de intercambio iónico utilizando columnas empaquetadas con zeolita C y acondicionadas como se describe en el Ejemplo 4 para separar y recuperar proteínas del pot ale. La fracción clarificada del pot ale contenía típicamente 0,7 g/l de proteína según lo determinado por el ensayo de Bradford (Bradford, 1976) y se cargó a una velocidad de 0,1 a 2 volúmenes de columna (VC) por minuto. Después de la etapa de carga, se utilizó una etapa de lavado con tampón de acetato 0,2 M, pH 3,5 para eliminar todas las partículas que no se unieron a la fase sólida de la matriz y para eliminar los componentes o contaminantes no deseados. Después de la etapa de lavado, siguió una etapa de elución. Se podrían utilizar tampones alcalinos, tales como un tampón de carbonato o fosfato con una capacidad tamponadora de 7 a 11 unidades de pH, a caudales similares a los utilizados anteriormente. Se pueden utilizar una serie de soluciones de diferente pH para separar selectivamente las proteínas adsorbidas a la fase sólida de la columna.

Se realizaron varios experimentos para probar la elución en diferentes condiciones y también para probar el uso de dos grados de zeolita C de diferentes tamaños. Los cromatogramas que muestran la elución de proteínas indicada por la absorbancia a 280 nm generada por AKTA Avant (GE Healthcare) en diferentes condiciones de elución se muestran en las Figuras 5-7. El tiempo desde la configuración inicial de la cromatografía se muestra en el eje x con la absorbancia a 280 nm en el eje y. El pot ale se cargó en columnas de zeolita en condiciones similares. Se utilizó zeolita de grado fino en todos los ejemplos excepto en la Figura 7 donde se compararon zeolita de grado grueso y fino. Se proporcionan cromatogramas típicos para elución utilizando NaHCÜ3100 mM seguido de NaOH 1 M (Figura 5), NaHCO3-Na2CO3 50 o 100 mM, tampón de pH 10,8 (Figura 6) y elución utilizando NaHCO3 -Na2CO3100 mM, tampón de pH 10,8 de zeolita fina o gruesa (Figura 7). Los tamaños de menos de 40 micras generalmente no son adecuados. Se probaron dos intervalos de tamaño diferentes de clinoptilolita; 90 y 300-700 micras. Si bien los perfiles de elución eran diferentes, esto probablemente estaba relacionado con diferentes condiciones de flujo en la matriz. Ambos intervalos de tamaño mostraron una capacidad similar para la unión a proteínas y ambos fueron adecuados para preparar un producto proteico a partir de pot ale.

Para el ejemplo se utilizó NaHCO30,1 M a pH 8 para la elución y se retuvieron 2 L de eluyente con un contenido de proteína Bradford de 1,3 g/L para el análisis. Después de la etapa de elución, se añadió a la columna una solución de pH alto (pH 13-14) y se separaron más proteínas de la fase sólida de la columna. Se puede utilizar una solución de NaOH (menos de 10%) a velocidades de flujo similares a las descritas anteriormente para al menos 13 Volúmenes de Columna. La recolección de proteínas de esta etapa es opcional, pero la introducción de esta etapa es importante para desinfectar los materiales adsorbentes y garantizar que se eliminen del sistema contaminantes tales como toxinas o microorganismos. Además, se puede utilizar una solución de etanol del 20% para mejorar la higienización y la descontaminación. A continuación, la columna se puede regenerar enjuagándola con agua seguida de tampones de pH bajo (pH 3-5) como tampones de acetato y citrato antes de volver a utilizarla.

Ejemplo 6-Análisis de la fracción recolectada de la primera etapa de elución a pH 8

La fracción recogida a pH 8 se analizó para determinar el contenido de proteínas y carbohidratos. El producto consistía en 50% de proteína bruta con menos de 0,5% de carbohidratos. La composición de aminoácidos de esta fracción se detalla en la Tabla 7. El triptófano suele sufrir una pérdida completa durante la hidrólisis y se analizó por separado. El ácido cisteico se analizó por separado y se expresó como cistina. Esto confirmó que las resinas de zeolita son adecuadas para separar preferentemente las proteínas de otros componentes disueltos que pueden no ser deseables en los ingredientes de los alimentos.

Tabla 7: Composición de aminoácidos (como % de proteína bruta, PB) de una muestra de pot ale separada preparada utilizando zeolita C

Ejemplo 7: Propiedades potenciales de espuma de las proteínas del pot ale

La capacidad de las proteínas del pot ale para formar espuma y la estabilidad de esta espuma se compararon con los ingredientes proteicos activos de espuma conocidos.

La capacidad espumante y la estabilidad de las proteínas del pot ale se compararon con las de lacprodan (L7017 de Aria Foods). Se prepararon tres muestras diferentes de proteínas de pot ale. R1 era una preparación de ultrafiltración

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la recuperación de materia proteica, a partir de una corriente de subproductos provenientes de procedimientos de destilación, comprendiendo el procedimiento:

- opcionalmente, lisar o romper células presentes en la corriente de subproductos;

- eliminar la materia sólida de la corriente de subproductos para producir una solución que contiene materia proteica clarificada;

- poner en contacto la solución que contiene materia proteica clarificada con una matriz de adsorción empaquetada en una columna que comprende un aluminosilicato y/o tierra de diatomeas en condiciones tales que la materia proteica se une a la matriz de adsorción empaquetada, en donde la matriz de adsorción comprende un contenido de sílice superior a 50% peso; y

- alterar las condiciones para provocar la liberación de la totalidad o una fracción específica de la materia proteica unida a la matriz de adsorción.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde la etapa de eliminación de la materia sólida de la corriente de subproductos utiliza un procedimiento de dos fases.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la corriente de subproductos se selecciona entre pot ale, aguas de lavado, lías gastadas, vinaza, bagazo, grano gastado, sedimento del intervalo caliente o frío de un procedimiento de destilación de alcohol o biocombustible, o un combinación de al menos dos corrientes de subproductos.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el subproducto se selecciona entre pot ale.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la corriente de subproductos tiene un intervalo de pH de entre 2 y 6 cuando la materia proteica en la corriente de subproductos se une a la matriz de adsorción.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la matriz de adsorción tiene un contenido de óxido de sílice superior al 70% en peso.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la matriz de adsorción comprende un mineral arcilloso.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la matriz de adsorción comprende uno cualquiera de los siguientes: bentonita, kieselguhr y/o zeolitas.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en donde la matriz de adsorción es zeolita clinoptilolita.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la etapa de alteración de las condiciones para provocar la liberación de la totalidad o una fracción específica de la materia proteica unida a la matriz de adsorción comprende la elución con un tampón de fosfato o carbonato en el intervalo de pH 7-11; o hidróxido de sodio en el intervalo de pH 10-14.

11. El uso de materia proteica obtenida de un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 como agente espumante.

12. El uso de una matriz de adsorción que comprende un aluminosilicato y/o tierra de diatomeas empaquetados en una columna, en donde la matriz de adsorción tiene un contenido de sílice superior a 50% en peso para separar y aislar la materia proteica de una corriente de subproductos de pot ale de un procedimiento de destilación .

13. El uso de la reivindicación 12, en donde la matriz de adsorción comprende una zeolita clinoptilolita.