DE69938144T2

DE69938144T2 - Antikörper-vermittelte verminderungsregulation von pflanzenproteinen

Info

Publication number: DE69938144T2
Application number: DE69938144T
Authority: DE
Inventors: Kitisri Zionsville SUKHAPINDA; James M. Danville HASLER; James K. Zionsville PETELL; James A. Goodlettsville STRICKLAND; Otto Guilford FOLKERTS
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Corteva Agriscience LLC
Priority date: 1998-07-21
Filing date: 1999-07-21
Publication date: 2009-02-12
Anticipated expiration: 2019-07-22
Also published as: WO2000005391A1; CA2328449A1; EP1124973A1; EP1124973B1; DE69938144D1; AU775017B2; AU5219999A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung und Verwendung von Nukleinsäurefragmenten oder Genen, die monoklonale Antikörper kodieren, die immunologisch reaktiv gegenüber Transitpeptiden sind und die Verwendung dieser Gene, um transgene Pflanzen, die veränderte Proteinlevel haben, zu erzeugen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In den letzten Jahren bestand ein beträchtliches Interesse an der Modifikation von Pflanzen mittels Gentechnik. Bis heute wurden viele verschiedene Pflanzenarten modifiziert, indem neue Gene, die für Proteine mit enzymatischer Aktivität kodieren, eingeführt wurden. Im Wesentlichen führt das Vorhandensein dieser von Transgenen kodierten Enzyme zu der Produktion von Proteinen, die vorhandene Pflanzeneigenschaften verändern können und/oder die neue und verbesserte Merkmale hervorbringen. Wenn diese Proteine exprimiert werden, können neue oder modifizierte Enzymaktivitäten, die vorher nicht endogen in der Pflanze vorhanden waren, beobachtet werden oder die darin gefundenen Proteinlevel können erhöht werden.
Ein anderer genetischer Ansatz, der verwendet wurde, um Pflanzenarten zu modifizieren, ist die Herunterregulierung eines spezifischen Pflanzenproteins. Die Herunterregulierung kann zu entweder partieller oder vollständiger Eliminierung einer bestimmten ausgewählten Enzymaktivität führen, indem die Gesamt-Gleichgewichtslevel des damit assoziierten Proteins vermindert werden. Ein gebräuchlicher Herunterregulierungsansatz, der verwendet wird, um einen gewünschten Pflanzen-Enzymlevel oder eine Aktivität zu modifizieren, ist die Antisense-RNA-Technologie. Antisense-RNA führt zur Herunterregulierung auf dem RNA-Translationslevel. Es wurde gezeigt, dass die Herunterregulierung durch Antisense-RNA, wie in US Patent 5 107 065 von Calgene beschrieben, für eine Vielzahl an Pflanzengenen nutzbar ist, wie von Shimada et al., (1993) Theor. Appl. Genet. 86: 665–672; Kull et al., (1995), J. Genet. Breed. 49: 67–76; Slabas und Elborough, (1997) WO 97/07222 von Zeneca, veröffentlicht 27.02.97 und Knutzon et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 2624–2628 beschrieben.
Ein anderer Herunterregulierungsansatz schließt die Verwendung der Ribozymtechnologie ein, wie von Hasselhoff und Gerlach, (1988) Nature 342: 76–79 beschrieben. Die Ribozymtechnologie funktioniert wie die Antisense-Methodiken auch auf dem RNA-Translationslevel und schließt die Herstellung katalytischer RNA-Moleküle, die an die mRNA von Interesse binden und sie spalten, ein.
Es wurde kürzlich gezeigt, dass Ribozyme ein wirksames Verfahren zur Herunterregulierung von Pflanzenproteinen sind, wie in WO 97/10328 von Ribozyme Pharmaceuticals und Dow AgroSciences, LLC, formell DowElanco, beschrieben.
Co-Suppression, wie von Seymour et al., (1993, Plant Mol. Biol. 23: 1–9) beschrieben, ist ein anderer Ansatz, der für die Herunterregulierung der Pflanzengenexpression anwendbar ist. Zur Zeit ist der genaue Mechanismus der Herunterregulierung mittels Co-Suppression nicht bekannt. Sie wurde jedoch umfassend zur Herstellung transgener Pflanzen mit modifizierten Genexpressionleveln verwendet, wie in Brusslan et al., (1993) Plant Cell 5: 667–677; Vaucheret et al., (1995) Mol. Gen, Genet. 248: 311–317 und Jorgensen et al., (1996) Plant Mol. Biol. 31: 957–973 beschrieben.
Wie hierin offenbart, haben die Anmelder einen alternativen Ansatz zur Herunterregulierung von Proteinen in Pflanzen erfunden, der auf die Verwendung monoklonaler Antikörper (MAb) und funktioneller Fragmente davon, wie Einzelketten-Antikörper (SCAb), die Transitpeptide erkennen und binden, gestützt ist. Als ein Resultat können die Gleichgewichtslevel der entsprechenden Passagierproteine reduziert werden. Der vorgeschlagene Ansatz wird weiter durch die Herunterregulierung von Mais Stearoyl-ACP-Δ-9-Desaturase, wie in den nicht einschränkenden Beispielen gezeigt, veranschaulicht.
Es wird in vielen Situationen wünschenswert sein, eher ein bestehendes Merkmal einer Pflanzenzelle zu modifizieren, als ein neues Merkmal einzuführen. Somit kann es erwünscht sein, die Gesamtaktivitätslevel eines speziellen Enzyms zu modifizieren, für die bevorzugte Akkumulation eines Allels verglichen mit einem anderen oder eines Isozyms verglichen mit einem anderen zu sorgen oder desgleichen.
In anderen Fällen kann es erwünscht sein, eher die Expressionsmenge eines von einem Gen kodierten Proteins zu vermindern, als die Expression vollständig zu inhibieren. Es ist deshalb interessant, die hierin offenbarte Erfindung, die eine gerichtete Modifikation von spezifischen Proteinen, insbesondere von Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen ermöglicht, zu verwenden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In der vorliegenden Erfindung wurden monoklonale Antikörper gegen Transitpeptide, die Pflanzen-Passagierproteine zu Organellen dirigieren, erzeugt. Gleichgewichtslevel von Passagierproteinen in Pflanzenzellen können verändert werden, indem Antikörper exprimiert werden, die immunologisch mit den Transitpeptiden reagieren, die man als an die Passagierproteine in der Vorläuferform angeheftet gefunden hat.
Somit stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem Aspekt ein Nukleinsäurekonstrukt bereit, umfassend in 5'- nach 3'-Richtung der Transkription einen in einer Pflanzenzelle funktionellen Promotor, eine Nukleinsäuresequenz, die einen Antikörper oder ein Fragment davon kodiert, welcher/s die Fähigkeit hat, an ein Transitpeptid zu binden, das ein Passagierprotein, das mit dem Transitpeptid assoziiert ist, zu einer Organelle einer Pflanzenzelle dirigiert und eine in einer Pflanzenzelle funktionelle Terminationsregion.
Gemäß einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, um den Gleichgewichtslevel eines Passagierproteins in einer Pflanzenzelle zu vermindern, umfassend das Einbringen eines Nukleinsäurekonstrukts gemäß dem ersten Aspekt in die Pflanzenzelle.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird eine Pflanzenzelle bereitgestellt, umfassend ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß dem ersten Aspekt, wobei der Gleichgewichtslevel eines in der Zelle vorkommenden Passagierproteins dadurch vermindert worden ist. Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung Pflanzen oder Nachkommenschaft davon, die von einer derartigen Pflanzenzelle stammen, bereit.
Gemäß dem obigen Aspekt kann die Pflanzenzelle zweikeimblättrig oder einkeimblättrig sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Pflanze Mais und das Transitpeptid ist das Transitpeptid für Mais Stearoyl-ACP-Δ-9-Desaturase oder Mais Palmitoyl-ACP-Thioesterase.
Die Organelle kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Chloroplast, Amyloplast, Chromoplast, Leukoplast, Mitochondrien und dem Zellkern.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper oder das Fragment davon ein Einzelketten-Antikörper (SCAb). SCAbs können erhalten werden, indem die Gene, die einen monoklonalen Antikörper kodieren, modifiziert werden, um einen davon abgeleiteten SCAb zu exprimieren. Diese SCAbs können eine Eindungs- und Antigenaffinität aufweisen, die diesen monoklonalen Antikörpern ähnlich ist, werden aber von einem einzelnen Gen kodiert.
Bevorzugt umfasst das Epitop des Transitpeptids, das von dem Antikörper oder dem Fragment davon erkannt werden soll, mindestens 6 Aminosäuren, wobei die Aminosäuren in dem Transitpeptid direkt benachbart sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz, die einen Antikörper oder ein Fragment davon kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 43 und SEQ ID NO: 48.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine als 10E10 bezeichnete Hybridomzelllinie bereit, die die ATTC-Bezeichnung HB-12544 hat.
Daneben stellt die vorliegende Erfindung Antikörper, die von dieser Zelllinie produziert werden, bereit.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen, um transgene Pflanzen zu erhalten, die veränderte Gleichgewichts-Passagierproteinlevel haben durch die Expression von Antikörpern, die gegenüber Transitpeptiden immunologisch reaktiv sind. Die folgenden Ausdrücke und Bezeichnungen sind untenstehend definiert:
Mit „verändertem Gleichgewicht" ist gemeint, dass der Gesamtlevel eines bestimmten Pflanzen-Passagierproteins, das in einer modifizierten Pflanze ein Transitpeptid hat, sich von dem einer normalen unmodifizierten Pflanze unter ähnlichen Bedingungen unterscheidet. Verminderte Gleichgewichtslevel können erreicht werden, indem Antikörper, die gegenüber dem Transitpeptid immunologisch reaktiv sind, exprimiert werden.
Mit „Antikörper" ist ein Proteinmolekül gemeint, das funktionelle Aktivität hat und das zwei identische Polypeptidketten mit etwa 600 Aminosäureresten (üblicherweise als schwere Ketten, H, bezeichnet) umfasst, die kovalent über Disulfidbrücken aneinandergeheftet sind und zwei identische kürzere Polypeptidketten mit etwa 220 Aminosäureresten (üblicherweise als leichte Ketten, L, bezeichnet), die kovalent über Disulfidbrücken aneinandergeheftet sind.
Die Bezeichnung Antikörper schließt auch immunologisch aktive Fragmente des oben beschriebenen Tetramers ein sowie Fragmente, Segmente, proteolytisch gespaltene Anteile oder rekombinant hergestellte Anteile, die die Antigenbindende Kapazität, wie hierin beschrieben, noch bewahren.
Mit „cDNA" ist DNA gemeint, die komplementär zu einer mRNA ist und die davon abgeleitet ist.
Mit „chimärer DNA Konstruktion" ist eine rekombinante DNA gemeint, die Gene oder Anteile davon aus einer oder mehreren Arten enthält.
Mit „konstitutivem Promotor" ist ein Promotorelement gemeint, das eine kontinuierliche Genexpression in allen Zelltypen und zu jeder Zeit steuert (d. h. Actin, Ubiquitin, CaMV 35S, 35T und desgleichen).
Mit „Co-Suppression" ist das Einführen eines fremden Gens gemeint, das im Wesentlichen homolog zu einem endogenen Gen ist und das in einer Pflanzenzelle zu einer Verminderung der Aktivität des Fremdgens und/oder des endogenen Proteinprodukts führen kann.
Mit „entwicklungsspezifischem Promotor" sind Promotorelemente gemeint, die für die Genexpression in unterschiedlichen Pflanzenentwicklungsstufen, wie in der frühen oder späten Embryogenese, verantwortlich sind.
Mit „Enhancer" sind Nukleotidsequenzelemente wie diejenigen aus dem Maize Streck Virus (MSV) und aus dem Alkoholdehydrogenaseintron 1 gemeint, die die Promotoraktivität stimulieren können.
Mit „Expression", wie hierin verwendet, ist die Transkription und stabile Akkumulation der Antikörper-RNA in einer Pflanzenzelle gemeint.
Mit „fremdem" oder „heterologem Gen" ist ein Gen gemeint, das ein Protein kodiert, dessen genaue Aminosäuresequenz nicht normal in der Wirtszelle gefunden wird, aber dort eingeführt wurde.
Mit „funktionellen Fragmenten" und „funktionellen Antikörpern" ist gemeint, dass der Antikörper oder die Fragmente davon ihre Fähigkeit behalten, die Epitope zu binden, die während des Immunisierungsverfahrens und der Produktion dieses Antikörpers verwendet wurden.
Mit „Gen" soll jegliches genetisches Material, das an der Proteinexpression, einschließlich der Konstruktion von chimärer DNA, Genen, Pflanzengenen und Anteilen davon, beteiligt ist, eingeschlossen sein.
Mit „Genom" ist genetisches Material gemeint, das in jeder Zelle eines Organismus und/oder Virus enthalten ist.
Mit „Ur-" Gen ist das Gen gemeint, das das Vorläuferprotein, das Passagierprotein oder Transitpeptid kodiert, wie es im nativen Organismus gefunden wird. Typischerweise findet man das Transitpeptid und das Passagierprotein zusammen in der Quelle, aus der das Gen isoliert wurde, auch wenn das nicht notwendigerweise innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung so ist. Ein nicht einschränkendes Beispiel eines Ur-Gens wäre das Gen, welches das Mais Δ-9-Desaturase-Vorläuferprotein kodiert, wobei das Gen in Mais vorkommt
Mit „induzierbarem Promotor" sind Promotorelemente gemeint, die für die Expression von Genen als Antwort auf ein spezifisches Signal, wie z. B. physikalische Stimuli (Hitzeschockgene), Licht (RUBP-Carboxylase), ein Hormon (Em), Metabolite und Stress verantwortlich sind.
Mit „reifem Protein" oder „Passagierprotein" ist das Protein gemeint, das nach Prozessierung und Transport in einer Organelle gefunden wird.
Passagierproteine werden ursprünglich in einer Vorläuferform hergestellt, die ein Transitpeptid und das Passagierprotein einschließt. Nach dem Eintritt in eine Organelle wird der Transitpeptidanteil abgespalten und hinterlässt somit das „Passagier-" oder „reife" Protein. Passagierproteine sind die Proteine, die typischerweise nach Aufreinigung eines Homogenats, wie hierin beschrieben, erhalten werden. Die Sequenz von Passagierproteinen kann, wie hierin beschrieben, bestimmt werden. Passagierproteine können ursprünglich sein, wenn sie natürlicherweise in der Organelle von Interesse vorkommen.
Passagierproteine können auch nicht ursprünglich sein, wenn eine Pflanze mit einem heterologen Gen, das ein Passagierprotein kodiert, das darin nicht natürlicherweise vorkommt, transformiert wird.
Mit „modifizierter Pflanze" ist eine Pflanze gemeint, in der die Proteinlevel oder die gesamten proteinspezifischen Aktivitätslevel eines Passagierproteins durch die funktionelle Aktivität eines Antikörpers relativ zu denen, die in einer unmodifizierten Pflanze gefunden werden, verändert wurden.
„Nukleinsäuren" soll alle Formen von DNA und RNA einschließen.
„Organelle" oder „Pflanzenorganelle" soll Chloroplasten, Chromoplast, Leukoplast, Amyloplast, Mitochondrien, den Zellkern und desgleichen einschließen.
„Phänotypänderung" soll Veränderungen in Gleichgewichts-Proteinleveln in einer transformierten oder modifizierten Pflanze durch die Expression eines Antikörpers oder Fragments davon, das an ein Organellen-Transitpeptid bindet, einschließen.
Mit „Pflanze" ist ein photosynthetischer Organismus, einschließlich sowohl Eukaryoten als auch Prokaryoten gemeint.
Mit „Vorläufer-"Protein ist ein Protein gemeint, das ein Transitpeptid und ein Passagierprotein hat, die kovalent aneinandergeheftet sind. Das Passagierprotein und das Transitpeptid können homolog zueinander sein, indem sie auf eine Art, wie sie aus der Natur isoliert werden, kodiert werden. Ein nicht einschränkendes Beispiel könnte das native Mais-Transitpeptid von Δ-9-Desaturase, das kovalent mit dem nativen Mais Δ-9-Desaturase Passagierprotein verknüpft ist, sein. Zusätzlich können das Transitpeptid und das Passagierprotein zueinander heterolog sein. Ein nicht einschränkendes Beispiel könnte das native Transitpeptid für Δ-9-Desaturase sein, das heterolog an das Passagierproteingen angeheftet ist, das das Chlorophyll a/b-bindende Protein kodiert.
Mit „promotorregulatorischem Element" sind Nukleotidsequenzelemente innerhalb eines Nukleinsäurefragments oder Gens gemeint, die die Expression des Nukleinsäurefragments oder Gens kontrollieren. Promotorsequenzen stellen Erkennungsstellen für die RNA-Polymerase und andere Transkriptionsfaktoren, die für eine wirksame Transkription benötigt werden, bereit.
Promotorregulatorische Elemente sollen auch konstitutive, gewebsspezifische, entwicklungsspezifische, induzierbare Promotoren und desgleichen einschließen. Promotorregulatorische Elemente können auch bestimmte Enhancer-Sequenzelemente, die die Effizienz der Transkription verbessern, einschließen. Zusätzlich sollen Promotoren und promotorregulatorische Elemente, wie hierin verwendet, auch subgenomische Promotoren, die in einzelsträngigen Plusstrang-RNA-Viren, wie dem Tabak-Mosaik-Virus und desgleichen gefunden werden, einschließen.
Mit „gewebsspezifischem" Promotor sind Promotorelemente gemeint, die für die Genexpression in spezifischen Zell- oder Gewebetypen, wie in den Blättern oder Samen (d. h. Zein, Oleosin, Napin, ACP, Globulin und desgleichen) verantwortlich sind.
Mit „transgener Pflanze" ist eine Pflanze gemeint, die ein chimäres Gen exprimiert, das durch Transformation eingeführt wurde.
Mit „Transitpeptid" oder „Signalpeptid" sind diejenigen Aminosäuren gemeint, die ein Passagierprotein zu einer spezifischen Organelle, wie hierin definiert, dirigieren. Innerhalb des Schutzbereichs dieser Erfindung kann das Transitpeptid in der Pflanze von Interesse entweder ursprünglich oder nicht ursprünglich enthalten sein. Zusätzlich kann das Transitpeptid, wie hierin weiter beschrieben, entweder homolog oder heterolog zu dem Passagierprotein von Interesse sein, indem es natürlicherweise zusammen mit dem Passagierprotein, wie es aus der Natur isoliert wurde, vorkommt (homolog) oder nicht (heterolog).
Die vorliegende Erfindung ist auf die Herunterregulierung von organellenspezifischen Proteinen durch die Expression von Antikörpern oder funktionellen Fragmenten davon, die den Transitpeptiden gegenüber immunologisch reaktiv sind, gerichtet. Die Herunterregulierung kann in verminderten Gleichgewichtsleveln der Passagierproteine oder enzymatischen Aktivitätsleveln dieser Passagierproteine resultieren. Passagierproteine können hinsichtlich des Transitpeptids homolog oder heterolog sein.
Desweiteren können Transitpeptide hinsichtlich der Passagierproteine homolog oder heterolog sein. Sowohl Transitpeptide als auch Passagierproteine können entweder zusammen oder einzeln in der Pflanzenzelle, in der sie gefunden werden, ursprünglich oder nicht ursprünglich vorkommen.
In Pflanzen benutzen Chloroplasten, Mitochondrien, der Zellkern und andere Organellen, wie hierin definiert, Transitpeptide, um Passagierproteine zu den entsprechenden Organellen zu dirigieren. Transitpeptide können, wie hierin offenbart, als Antigene für die Produktion funktioneller Antikörper, die ihnen gegenüber immunreaktiv sind, verwendet werden. Diese funktionellen Antikörper können dann innerhalb der Zelle exprimiert werden, wodurch sie an die Transitpeptide binden können und die Akkumulation der Passagierproteine in der Organelle und somit in der Zelle verhindern. Während Chloroplasten, Mitochondrien und der Zellkern die primären Organellen sind, die in einem Pflanzengewebe vorkommen, haben Zellen auch häufig andere Arten von Organellen, einschließlich Amyloplasten, Chromoplasten, Leukoplasten und desgleichen, die alle Transitpeptide zur Proteinlokalisierung verwenden. Deshalb kann die Proteinaufnahme in Pflanzenorganellen durch das Ausführen der Erfindung, wie hierin offenbart, verhindert werden.
Wie hierin weiter offenbart, kann die Expression von funktionellen Antikörpern, die Transitpeptide binden können, innerhalb von Pflanzenzellen zu verminderten Gleichgewichtsleveln des damit assoziierten Passagierproteins führen, verglichen mit untransformierten Pflanzen. Bevorzugt können die Gleichgewichtslevel von Passagierproteinen um etwa 10% bis etwa 90% vermindert sein, stärker bevorzugt um etwa 50% bis etwa 90%, wobei Gleichgewichtslevel von Passagierproteinen, die um etwa 90% vermindert sind, verglichen mit unmodifizierten, am stärksten bevorzugt sind.
Wie hierin weiter beschrieben, können Aminosäure-, Gen- und Nukleinsäurefragmentsequenzen, die Transitpeptide kodieren, verwendet werden, um Antikörper herzustellen, die dann in transgenen Anwendungen verwendet werden können, um Pflanzen mit veränderten Gleichgewichts-Proteinleveln herzustellen. Die Erfindung wird veranschaulicht durch das Bestimmen der Transitpeptidsequenz von Mais Stearoyl-ACP-Δ-9-Desaturase (Δ-9-Desaturase), gefolgt von der Produktion, der Klonierung und der Expression funktioneller Antikörper, die eine Affinität zu dieser haben. In manchen Fällen können die Transitpeptidsequenzen durch Vergleich der Gen- und Aminosäuresequenz, die für das vollständige Vorläuferprotein, wie hierin beschrieben, kodiert, bestimmt werden.
Bevorzugt werden Gene und Nukleinsäurefragmente, die für Passagierproteine kodieren aus Pflanzen isoliert und diese Gene werden bevorzugt verwendet, um Nukleinsäurefragmente und Gene, die Transitpeptide kodieren, zu bestimmen. Stärker bevorzugt sind diejenigen Aminosäure-, Gen- und Nukleinsäurefragmente, die hierin als SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ IDN: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15 offenbart sind.
Hybridomzelllinien, die monoklonale Antikörper produzieren, können wie hierin offenbart erhalten werden. Die am stärksten bevorzugte derartige Zelllinie ist 10E10 (Mab-Tp1), die gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110–220, am 18. Juni 1998 (ATTC-Bezeichnung HB-12544) hinterlegt wurde. Monoklonale Antikörper, die gegenüber den hierin offenbarten Transitpeptiden immunologisch reaktiv sind, können von Hybridomzelllinien hergestellt werden. Bevorzugt können die Aminosäuresequenz, Gensequenz und Nukleinsäurefragmente, die Vorläuferproteine, Transitpeptide und Passagierproteine kodieren, bestimmt werden. Am stärksten bevorzugt sind diejenigen Aminosäure-, Gen- und Nukleinsäuresequenzen, die hierin als SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 und SEQ ID NO: 51 offenbart sind.
Wie hierin offenbart, können funktionelle Antikörper gegen Transitpeptide, die Passagierproteine zu Organellen dirigieren, identifiziert und produziert werden. Die Aminosäuresequenz und somit die Nukleinsäuresequenz eines Transitpeptids kann auf eine Vielzahl von Arten, die der Fachmann kennt, bestimmt werden. Zum Beispiel können Passagierproteine von Interesse durch eine Vielzahl von Verfahren, wie hierin offenbart, aufgereinigt werden. Sobald sie aufgereinigt sind, kann die Sequenz durch aminoterminale Sequenzierung dieses Proteins bestimmt werden. Das Gen, das dieses Protein kodiert, kann dann kloniert werden. Der Vergleich der Aminosäuresequenz, die durch und von der cDNA bestimmt wurde, mit der, die durch die aminoterminalen Sequenzierung des Passagierproteins erhalten wurde, ermöglicht es, die Transitpeptidsequenz festzustellen.
Daneben sind viele Transitpeptidsequenzen im Fachgebiet bekannt und können leicht von GenBank, die auf der National Center for Biotechnology Information Website lokalisiert sind, erhalten werden. In Pflanzen werden Transitpeptide typischerweise gespalten und abgebaut, wenn das Passagierprotein in die Organelle von Interesse eintritt, deshalb ist eine Aufreinigung von Transitpeptiden aus Pflanzengeweben typischerweise nicht möglich.
Transitpeptide können für den intrazellulären Transport zu Plastiden und Mitochondrien sorgen.
Das Thema Transitpeptide in Pflanzen wurde ausführlich von Keegstra et al., ((1989) Cell, 56: 247–253) behandelt.
Typischerweise gibt es eine sehr geringe primäre Aminosäuresequenzhomologie zwischen verschiedenen Pflanzen-Transitpeptiden. Daneben zeigen, obwohl Passagierproteine Aminosäure- und Nukleinsäuresequenz-Ähnlichkeiten zwischen Sorten, Linien und Arten haben können, Transitpeptide, die daraus erhalten wurden, eine sehr geringe Aminosäure- oder DNA-Sequenzhomologie. Darüber hinaus kann die Länge der Transitpeptide variieren, wobei einige Passagierproteine Transitpeptide mit nur etwa 30 Aminosäuren haben, während andere etwa 150 Aminosäuren lang oder länger sein können. Nahezu alle Transitpeptid-Aminosäuresequenzen beginnen mit Met-Ala am Aminoterminus. Der Carboxyterminus kann häufig durch Untersuchung bestimmt werden, denn Spaltung tritt meistens am oder in der Nähe des Motivs Val-Ala-Val-Val, Val-Ala- Ala-Val oder bei Variationen davon auf. In vielen Fällen können Transitpeptide auch weitere Informationen zum Targeting von Organellen enthalten. Abhängig von der Quelle des Transitpeptids können Vorläuferproteine Unterschiede beim Importverhalten, bezüglich Aktivität und Effizienz zeigen. Es wird angenommen, dass diese Unterschiede nicht nur durch das Transitpeptid kommen, sondern auch durch die Passagierproteine und durch damit assoziierte Interaktion.
Zusätzliche Beschreibungen der Merkmale von Transitpeptiden in Pflanzen und von damit assoziierten Mechanismen, können in Pfanner et al., (1988) Eur. J. Biochem, 175: 205–212; Ko und Ko, (1992) J. Biol. Chem. 267, 13910–13916; Pfanner et al., (1988) TIBS 13: 165–167; Bascomb et al., (1992) Plant Microb. Biotechnol. Res. Ser. 1: 142–163 und Bukau et al., (1996) Trends in Cell Biol. 6: 480–486 gefunden werden.
Transitpeptide können auch verwendet werden, um Proteine in den Zellkern zu importieren.
Es können Antikörper gegen diese Peptide hergestellt werden und dazu verwendet werden, Gleichgewichtslevel von Passagierproteinen zu verringern, wie hierin beschrieben. Kern-Transitpeptide umfassen typischerweise kurze Polypeptidregionen und können als einer von drei verschiedenen Typen klassifiziert werden. Zum Beispiel besitzt ein Typ eine einzelne kurze Region, die reich an basischen Aminosäuren ist. Ein anderer Typ ist aus zwei durch einen Spacer getrennte basische Regionen zusammengesetzt. Schließlich besitzt ein dritter Typ sowohl hydrophobe als auch basische Aminosäuren. Kern-Transitpeptide sind weiter in Silver (1991) Cell 64: 489–497; Hicks et al., (1995) Plant Physiol. 107: 1055–1058; Ballas und Citovsky, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 10723–10728; Citovsky et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (91): 3210–3214; Lyck et al., (1997) Planta, 202: 117–125; Reiss et al., (1997) Mol. Gen. Genet. 253: 695–702; Sakamoto et al., (1996) Plant J., 10: 859–868 und Raikhel (1992) Plant Physiol. 100: 1627–1632 beschrieben.
Wie hierin weiter beschrieben, können Transitpeptide, wenn sie einmal identifiziert sind, durch eine Vielzahl an Verfahren hergestellt werden.
Derartige Verfahren können heterologe Expression in einem geeigneten System, wie E. coli, Baculovirus, Hefe und desgleichen einschließen. Das bevorzugte Verfahren der Peptidherstellung ist durch chemische Synthese unter Verwendung von entweder t-Butyloxycarbonyl (t-BOC) oder 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC) wie in Baraby und Merrifield (1980) In The Peptides Band 2 (E. Gross und Meienhofer, Hrsg.) S. 1–284, Academic Press, San Diego, CA und Stewart und Young, (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Ausgabe, Pierce Chemical Co., Rockford, IL beschrieben Es ist nicht nötig, dass das gesamte Transitpeptid in der Antikörperproduktion verwendet wird, um in den Schutzbereich dieser Erfindung zu fallen. Im Allgemeinen können Peptide mit einer Länge von etwa 10 bis etwa 15 Resten verwendet werden; Peptide mit nur 6 und bis zu etwa 150 Aminosäuren oder mehr werden als innerhalb des Schutzbereiches der Erfindung angesehen. Typischerweise induzieren Polypeptidfragmente, die reich an hydrophilen Aminosäuren sind, die beste immunologische Antwort. Diese hydrophilen Aminosäuren schließen Arginin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Serin, Asparagin, Glutamin, Glycin und Prolin ein. Es können jedoch ebenfalls Polypeptidfragmente mit anderen Aminosäuren verwendet werden.
Antikörper binden auf der Basis von Aminosäure/Aminosäure-Interaktionen an Epitopstellen und sind somit für einzelne Epitopstellen hochspezifisch. Es besteht jedoch, wie hierin dargelegt, ein gewisser Mangel an Aminosäure- und DNA-Homologie zwischen Transitpeptiden, die in Pflanzen vorkommen.
Deshalb kann die Verwendung von dazu immunologisch reaktiven Antikörpern in einer Gattung, Art, Sorte oder Linie gegenüber dem Transitpeptid für das gleiche Passagierprotein, das in einer anderen Gattung, Art, Sorte oder Linie vorkommt, immunologisch reaktiv sein oder auch nicht.
Um die Funktion sicherzustellen werden Transitpeptide, von denen das Passagierprotein von Interesse abstammt, typischerweise aus einer Reihe von Arten, Sorten oder Linien sequenziert, um zu sehen, ob gemeinsame Aminosäuremotive festgestellt werden können. Falls das der Fall ist, können diese allgemeinen Aminosäuremotive zur Herstellung synthetischer Peptide und Antikörper ausgewählt werden. Wenn derartige Stellen nicht vorkommen, können für das Transitpeptid jedes Passagierproteins von Interesse, einzelne Hybridomlinien erforderlich sein. Es ist besonders wichtig, dieses Merkmal bei der Herstellung von Hybridanbaupflanzen, die aus transgenen und/oder parentalen Linien stammen, zu berücksichtigen.
Sobald ein Transitpeptid synthetisiert ist, kann es vor der Zusammensetzung aufgereinigt werden. Dem Fachmann steht eine Vielzahl von Aufreinigungsverfahren zur Verfügung, einschließlich Gelfiltration, Dialyse, Reverse-Phase-Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie und desgleichen.
Nachdem das Transitpeptid synthetisiert und aufgereinigt wurde, kann es wünschenswert sein, das Peptid mit einem geeigneten Trägerprotein zu konjugieren, um die Immunantwort zu erhöhen. Ein Trägerprotein sollte ein gutes Immunogen sein und eine ausreichende Anzahl an Aminosäureresten mit reaktiven Seitenketten besitzen, um es mit dem synthetischen Peptid zu koppeln. Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) wird wegen seiner bewährten Wirksamkeit für gewöhnlich verwendet. Andere als Trägermoleküle nützliche Moleküle schließen Thyroglobulin, Rinderserumalbumin, Tetanustoxin, und desgleichen ein.
Zusätzlich zu der Wahl eines Trägerproteins kann auch ein Verfahren ausgewählt werden, um das synthetische Peptid (Antigen) mit dem Trägerprotein zu koppeln. Die meisten Kopplungsverfahren beruhen auf dem Vorhandensein freier Amino-, Sulfhydryl-, Phenol-, oder Carboxylgruppen. Das Kopplungsverfahren, das ausgewählt wird, kann das Transitpeptid entweder über die carboxy- oder die aminoterminalen Reste mit dem Träger verbinden. Dem Fachmann steht eine Vielzahl an Kopplungsreagenzien zur Verfügung, einschließlich Glutaraldehyd, Bis-Imidoester, Bis-diazotiertes Benzidin, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid und desgleichen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird Material bereitgestellt, das dazu geeignet ist, eine Immunantwort in einem von Säugern stammenden System hervorzurufen. Bevorzugt kann der Säuger eine Ratte, eine Maus, ein Pferd, eine Ziege, ein Kaninchen und desgleichen sein. Am stärksten bevorzugt ist es, wenn eine Maus zur Antikörperproduktion verwendet wird. Das Hervorrufen dieser Antwort wird typischerweise durch Immunisierung induziert.
Immunisierungsprotokolle sind im Fachgebiet wohlbekannt und können sich beträchtlich unterscheiden, wobei sie jedoch wie in Current Protocols in Immunology, herausgegeben von John E. Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc. (1991) beschrieben, wirksam sein können. Typischerweise werden etwa 1 μg bis 50 μg Antigen in Emulsionen von etwa 1 ml bis etwa 2 ml einer Ratte und etwa einem Zehntel so viel Mäusen gegeben. Die erste Antigeninjektion in ein Wirtstier kann subkutan, intramuskulär, intraperitoneal oder intravaskulär sein. Danach werden etwa 1 bis etwa 10 oder mehr Wiederholungs-Immunisierungen in Intervallen von etwa 2 bis etwa 8 Wochen gegeben. Der Immunisierungsweg kann gemäß dem Protokoll variieren.
Die als Folge der Injektion hervorgerufene Immunantwort wird überwacht, indem eine Westernanalyse durchgeführt wird, um den Antikörperlevel, der in dem Serum eines Tieres vorhanden ist, zu bestimmen, wobei Techniken verwendet werden, die dem Immunologie-Fachmann üblicherweise zur Verfügung stehen. Die Antigeninjektionen werden typischerweise fortgesetzt, bis die Immunantwort ein Plateau der maximalen Antwort erreicht.
Nachdem die Immunisierung abgeschlossen ist, werden die Immunlymphozyten des immunisierten Tieres typischerweise mit Myelomzellen fusioniert, um Hybridomzelllinien zu erzeugen, die unsterblich sind und monoklonale Antikörper produzieren. Lymphozyten werden im Allgemeinen entweder aus Lymphknotengewebe oder Milzgewebe entnommen und mit Plasmocytomzellen fusioniert, die spezialisierte Myelomzellen sind und dem Fachmann aus der American Type Culture Collection, Manassas, VA zur Verfügung stehen.
Bei einer typischen Fusion wird eine Suspension von Lymphozytenzellen den Myelomzellen in Gegenwart eines Fusionierungsmittels, wie z. B. Polyethylenglykol (PEG) zugegeben. Es sind jedoch auch andere Verfahren der Zelltransformation möglich, einschließlich der Transformation von Myelomzellen mit Viren wie dem Epstein-Barr-Virus und desgleichen.
Nach der Fusion werden die Zellen geerntet, verdünnt und für eine Woche oder länger in einzelnen Wells kultiviert, die das geeignete Selektionsmittel, wie Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT), das nicht-fusionierte Zellen eliminieren kann, enthalten. Die Kulturüberstände dieser Wells können gescreent werden, um Hybridomwachstum festzustellen sowie um die Selektivität und Affinität des jeweiligen Antikörpers für das Antigen zu bestimmen. Die Zellen können auf das Vorhandensein von Antikörpern, die ausgewählte Antigendeterminanten erkennen können, gescreent werden, indem Verfahren verwendet werden, die dem Fachmann zur Verfügung stehen, wie Feste-Phase-Radioimmunoassay, Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest, Westernanalyse und desgleichen. Die auf diese Weise selektierten Zellen können dann als einzelne Zellkolonien durch limitierende Verdünnung in einzelne Wells gebracht werden. Feederzellen (z. B. Thymozyten, peritoneale Exsudatzellen und desgleichen) können nach Bedarf zugesetzt werden. Nach dem Wachstum können die Überstände davon hinsichtlich der Antikörperproduktion durch erneutes Screening, wie hierin beschrieben, charakterisiert werden.
Antikörper können nach Klasse oder Subklasse klassifiziert werden, abhängig von ihrer Anzahl an konstanten Domänen schwerer Ketten. Schwere Ketten werden gemäß ihrer konstanten Region klassifiziert: IgA, IgD, IgE, IgG oder IgM, wobei es darunter einige Subklassen gibt. Leichte Ketten werden entweder als Kappa oder als Lambda klassifiziert. Die Einordnung von Antikörpern kann mit kommerziell erhältlichen Isotypisierungskits, wie hierin offenbart, durchgeführt werden.
Sobald Hybridomzelllinien etabliert sind und Antikörper hergestellt und charakterisiert worden sind, können die Antikörper durch eine Vielzahl an Verfahren für die weitere Analyse aufgereinigt werden. Derartige Verfahren können die Verwendung von Sepharose-Protein-G-Säulen einschließen, wobei die Antikörper gebunden werden, gefolgt von Elution mit 0,5 M Ammoniumacetat (pH 3,0) und Neutralisierung mit 1 M Tris. Andere Aufreinigungsverfahren können die Verwendung von Ammoniumsulfatfällung/Größenausschlusschromatographie, Affinitätschromatographie unter Verwendung von Protein-A-Sepharose sowie Standard-Ionenaustausch-Chromatographieverfahren, die dem Fachmann der Proteinbiochemie zur Verfügung stehen, einschließen. Zur Aufreinigung konstruierter Antikörper, können Affinitätsmarkierungen durch die DNA kodiert werden, so dass Aminosäuren exprimiert werden, die an eine vorbestimmte Matrix binden. Derartige Markierungen können das 6×-Histidinmotiv einschließen, das an eine Ni-Sepharosesäule binden kann, eine C-Myc-Markierung und desgleichen.
Die Aminosäuresequenz des Antikörpers kann durch eine Vielzahl an Verfahren, die dem Fachmann zur Verfügung stehen, bestimmt werden. Derartige Methoden können die direkte Proteinsequenzierung unter Verwendung einer Vielzahl an Verfahren einschließen, einschließlich Edman-Abbau, Massenspektroskopie, kernmagnetischer Resonanz und desgleichen. Andere Verfahren, um eine Aminosäuresequenz zu bestimmen können die Verwendung molekularbiologischer Verfahren einschließen, wobei das Gen, das die Antikörper kodiert, kloniert und sequenziert wird, wie hierin beschrieben.
Durch das Bestimmen der Aminosäuresequenz können der Antikörper oder Derivate davon synthetisiert werden, indem eine Vielzahl an Peptidsyntheseverfahren, die dem Fachmann zur Verfügung stehen, verwendet werden, einschließlich Feste-Phase-t-Butyloxycarbonyl- (t-BOC), Feste-Phase-9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-(t-FMOC)Verfahren sowie den von Geysen et al., (1987, J. Immunnol. Methods, 102: 259–274); Houghton et al., (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5131–5135) entwickelten Verfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform können Antikörper in vitro aus chromosomaler DNA, cDNA oder synthetischen Oligonukleotiden hergestellt werden, unter Verwendung molekularbiologischer Verfahren und heterologer Expressionssysteme wie E. coli, Hefe, Baculoviren und desgleichen. Zellen oder anderes DNA- oder RNA-enthaltendes Ausgangsmaterial, die den gewünschten Antikörper kodieren, können isoliert werden. In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, die genomische DNA oder mRNA (um cDNA zu erzeugen) aus derartigem Ausgangsmaterial zu isolieren, wie in Goldfein et al., (1987, J. Immunology, 138: 940–944) beschrieben. Wenn keine signifikanten Level an Nukleinsäuren verfügbar sind, kann Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet werden, um Nukleinsäurefragmente, die den gewünschten Antikörper kodieren zu isolieren, wie hierin beschrieben.
Wenn die Aminosäuresequenz unter Verwendung der hierin offenbarten oder anderer, dem Fachmann zur Verfügung stehenden Verfahren, bereits bestimmt worden ist, kann der genetische Code verwendet werden, um die Aminosäuresequenz revers in eine DNA-Sequenz zu translatieren. Dann kann eine Abfolge von etwa 20 bis etwa 50 Basen oder mehr synthetisiert werden, um eine Reihe an überlappenden Fragmenten bereitzustellen. Die synthetisierten Oligonukleotide können dann annealed und ligiert werden, um das Gen, das den Antikörper kodiert, zu erzeugen.
Die gesamte Genomsequenz eines spezifischen Antikörpers kann durch Screening einer Genom oder Cosmid-Bibliothek mittels einer Sonde erhalten werden. Sonden können erheblich kürzer sein als die gesamte Gensequenz, sollten aber mindestens etwa 10 Nukleotide lang sein, bevorzugt mindestens etwa 15 Nukleotide, stärker bevorzugt mindestens etwa 20 oder so Nukleotide.
Längere Oligonukleotide bis zu der Gesamtlänge des Gens, das das Polypeptid von Interesse kodiert, sind ebenfalls nützlich. Sowohl DNA als auch RNA können als Sonden verwendet werden. Bei der Verwendung sind Sonden typischerweise mit ³²P markiert, biotinyliert und desgleichen, so dass sie nachgewiesen werden können. Diese Sonden werden häufig mit einzelsträngiger DNA aus der gewünschten Quelle des Gens inkubiert. Die Hybridisierung oder der Vorgang der Bindung der Sonde an die DNA wird für gewöhnlich nach dem Binden unter Verwendung von Nitrocellulosepapier oder Nylonmembranen mittels der Markierung der Sonde nachgewiesen. Hybridisierungsverfahren sind dem Fachmann der Molekularbiologie wohlbekannt. Somit können Antikörpergene isoliert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann mRNA unter Verwendung einer Vielzahl an wohlbekannten Verfahren aus den Hybridomzelllinien, die den Antikörper von Interesse exprimieren, isoliert werden. Die kontinuierliche Kultivierung dieser Zelllinien in Verbindung mit limitierenden Verdünnungen, wie hierin offenbart, resultiert in einer Monokultur, wodurch daraus erhaltene cDNA im Wesentlichen nur einen Antikörper kodiert. Nach dem Isotypisieren dieses Antikörpers, können durch die Verwendung von Oligonukleotidprimern, die den darin vorhandenen konstanten Regionen entsprechen, diese kloniert werden, ohne dass es nötig ist, andere Schritte zu durchlaufen, die bei anderen Klonierungsverfahren üblich sind, wie die Erzeugung einer Bibliothek in Phagemiden, Cosmiden und desgleichen. Sobald sie kloniert ist, kann die cDNA sequenziert werden und die Aminosäuresequenz kann über den genetischen Code bestimmt werden.
Man kann eine variable Region der schweren Antikörperkette oder der leichten Antikörperkette konstruieren, die wirksam homolog zu der variable Region der schweren Antikörperkette oder der leichten Antikörperkette eines bekannten Antikörpers ist. Die Bezeichnung „wirksam homolog" bezieht sich auf die Idee, dass die primäre Aminosäuresequenz der variablen Region verändert werden kann und der Antikörper dennoch eine funktionelle Bindestelle mit der Eigenschaft, an das gleiche Antigen oder Epitop zu binden, behält. Dementsprechend werden derartige Variationen und Derivatisierungen als innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung angesehen. So konstruierte Antikörper können experimentell bestimmt werden, indem Kreuzblockierungsverfahren verwendet werden, wobei das Binden eines Antikörpers das Binden eines zweiten Antikörpers an das gleiche Epitop durch entweder lokale oder entfernte sterische Hinderung, verhindert.
Die Modifikationen, die die vorliegende Erfindung ausdrücklich betrachtet, schließen das Hinzufügen, die Deletion oder die konservative Substitution einer begrenzten Anzahl verschiedener Aminosäuren ein.
Im Allgemeinen ist eine Aminosäuresequenz zu einer zweiten Aminosäuresequenz wirksam homolog, wenn mindestens etwa 70 Prozent, bevorzugt etwa 80 Prozent und am stärksten bevorzugt etwa 90 Prozent der Aminosäuresequenz der variablen Anteile der beiden fraglichen Antikörper homolog sind. Konservative Substitutionen werden veranschaulicht durch solche wie Glutaminsäure und Asparaginsäure; Valin, Leucin und Isoleucin; Asparagin und Glutamin; Threonin und Serin; Glycin und Alanin; Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan und Lysine und Arginin. Dementsprechend werden derartige Variationen und Derivatisierungen als innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung angesehen.
Die Bindeaffinitäten zwischen dem ursprünglichen und dem homologen Antikörper gegenüber dem gewünschten Antigen können auch verwendet werden, um die „wirksame Homologie" zu bestimmen. Es wäre zu erwarten, dass effektiv homologe Antikörper Antikörper:Antigen-Bindekonstanten besitzen, die mindestens innerhalb von 3 Größenordnungen verglichen mit dem ursprünglichen Antikörper sind und stärker bevorzugt Bindekonstanten, die innerhalb von etwa 2 Größenordnungen relativ zum ursprünglichen Antikörper sind, wobei die Bindekonstanten, die im Wesentlichen die gleichen wie die des ursprünglichen Antikörpers sind, am meisten bevorzugt sind. Die Bestimmung von Antikörper-Bindekonstanten ist im Fachgebiet wohlbekannt.
Fragmente von Antikörpern, die ihre Fähigkeit, an das Antigen zu binden, behalten, werden als funktionell gemäß der vorliegenden Erfindung angesehen. Diese Fragmente schließen Abschnitte ein, die durch proteolytische Spaltung oder rekombinant hergestellte Anteile davon erzeugt wurden. So können zum Beispiel Anteile von variablen und konstanten Domänen des Antikörpers spezifisch verändert oder teilweise oder vollständig weggelassen werden.
Nicht einschränkende Beispiele derartiger rekombinanter Fragmente schließen Fab, F(ab)₂ und Fv Fragmente ein, wie in U. S. Patent 4 642 334 von Moore und U. S. Patent 4 816 567 von Genentech beschrieben. Daneben können Antikörper modifiziert werden, so dass sie einzelkettige Fv Moleküle bilden, wie in U. S. Patent 4 946 778 von Genex Corp. beschrieben und wie hierin offenbart.
Diese Fragmente und Modifikationen davon können auch erzeugt werden, indem die Gene, die diese Fragmente kodieren, wie hierin beschrieben, manipuliert werden. Rekombinante Konstrukte, die Nukleinsäuresequenzen enthalten, die einen funktionellen Antikörper von Interesse oder Fragmente davon kodieren und heterologe Nukleinsäuresequenzen können hergestellt werden. Mit heterolog ist irgendeine Sequenz gemeint, die nicht natürlicherweise an die Antikörpersequenz gebunden vorkommt. Somit gilt per Definition, dass eine DNA-Sequenz, die mit einer Sequenz verbunden ist, die nicht natürlicherweise in einem Gen, das einen Antikörper kodiert, vorkommt, als heterolog angesehen wird.
Konstrukte können entworfen sein, um Antikörper von Interesse oder funktionelle Fragmente davon entweder in prokaryotischen oder in eukaryotischen Zellen herzustellen. Die Expression von Antikörpern in Pflanzenzellen ist von besonderem Interesse.
Daneben können Nukleinsäuresequenzen, die diese Antikörper kodieren, in ein Pflanzen-Wirtsgenom integriert werden.
Wenn die Nukleinsäuresequenzen, die die Antikörper oder funktionellen Fragmente davon kodieren in einem Pflanzenwirt transkribiert und translatiert werden, wird erwartet, dass die Pflanze Eigenschaften aufweist, worin die Gleichgewichts-Passagierproteinlevel, die mit einem Gen-Transitpeptid assoziiert sind, niedriger sind als diejenigen, die in der untransformierten Pflanze unter ähnlichen Bedingungen beobachtet werden.
Die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie hierin offenbart, stellen verminderte Gleichgewichtslevel von Passagierproteinen, die für Organellen bestimmt sind, bereit.
Eine Vielzahl an Modifikationen kann in zahlreichen Pflanzenarten gemacht werden. Bevorzugte einkeimblättrige Pflanzen schließen zum Beispiel Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hafer, Roggen und Hirse ein. Beispiele für bevorzugte zweikeimblättrige Pflanzen schließen Raps, Erbse, Sojabohne, Sonnenblume, Tabak, Baumwolle, Zuckerrübe, Petunie, Tomate, Brokkoli, Salat, Apfel, Pflaume, Orange und Zitrone ein.
Die Modifikation von Pflanzen unter Verwendung der Erfindung wie hierin offenbart, kann es einschließen, die Gleichgewichts-Proteinlevel, die bei der Fettsäureverteilung einer Fettsäurequelle wie Raps, Cuphea, Mais, Sojabohne, Canola-Raps oder irgend einer anderen Ölsamenanbaupflanze von Interesse beteiligt sind, zu variieren.
Es können auch Antikörper gegen das Transitpeptid von Passagierproteinen wie Δ-9-Desaturase, Palmitoyl-ACP-Thioesterase, β-Ketoacyl-ACP-Synthase, Oleyl-ACP-Thioesterase und desgleichen gemacht werden. Es können auch Antikörper gegen das Transitpeptid von Proteinen wie dem Chlorophyll a/b-bindenden Protein gemacht werden, als ein Weg, um den Chlorophyllgehalt zu reduzieren. Andere in Organellen lokalisierte Proteine, die Transitpeptide haben, für die Antikörper gemacht werden können, indem das Transitpeptid, wie hierin offenbart, als Antigen verwendet werden kann, schließen ein: NADPH+ abhängige Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, Early Light Inducible Protein, Clip-Protease regulatorische Protease, Pyruvat-Orthophosphat-Dikinase, Chlorophyll a/b-bindendes Protein, Triosephosphat-3-Phosphoglyceratphosphat-Translokator, 5-Enol-Pyruvat-Shikimat-3-Phosphat-Synthase, Dihydrofolatreduktase, Thymidylatsynthase, Acetyl-Coenzym-A-Carboxylase, Cu/Zn-Superoxid-Dismutase, Cysteinsynthase, Rubisco-Activase, Ferritin, in Körnchen gebundene Stärkesynthase, Pyrophosphat, Glutaminsynthase, Aldolase, Glutathionreduktase, Nitritreduktase, 2-Oxoglutarat/Malat-Translokator, ADP-Glucose-Pyrophosphorylase, Ferrodoxin, Carboanhydrase, Polyphenoloxidase, Ferrodoxin-NADP=Oxidoreduktase, Platocyanin, Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase, Lipoxygenase, o-Acetylserin-(Thiol)-Lyase, Acyl-Trägerprotein (acyl carrier protein), 3-Deoxy-D-Arabinoheptulosonat-7-phosphat-Synthase, in Chloroplasten lokalisiertes Hitzeschockprotein, Stärke-Phosphorylase, Pyruvat-Orthophosphat-Dikinase, Stärke-Glycosyltransferase, und desgleichen.
Es ist innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung, dass die Gleichgewichtslevel von Passagierproteinen vermindert werden können, indem eine Pflanzenzelle mit einem Gen transformiert wird, das einen Antikörper kodiert, der gegen das Transitpeptid, das mit dem Passagierprotein in einer Vorläufer-Proteinform assoziiert ist, gerichtet ist. Es ist auch innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung, dass die Transitpeptide zu dem Passagierprotein, wie hierin beschrieben, homolog oder heterolog sein können. Wie hierin weiter offenbart, können Transitpeptide entweder ursprünglich oder nicht ursprünglich in der transformierten Pflanzenzelle vorkommen. In ähnlicher Weise können Passagierproteine entweder ursprünglich oder nicht ursprünglich in der transformierten Pflanzenzelle vorkommen.
Transitpeptide und Passagierproteine können zueinander heterolog sein, als sie nicht in einer Weise, wie sie in der Natur vorkommen, assoziiert sein können. Zum Beispiel kann das Transitpeptid der kleinen Untereinheit von Rubisco (SSU) verwendet werden, um eine Vielzahl an Proteinen in die Chloroplasten einer Pflanzenzelle einzubringen, so dass es zu einer Akkumulation von Proteinen, die normalerweise nicht dort vorkommen, kommt. Es wäre zu erwarten, dass Antikörper, die gegenüber dem SSU Transitpeptid reaktiv sind, die Akkumulation verhindern und die Gleichgewichtslevel von damit assoziierten Passagierproteinen relativ zu untransformierten Kontrollen vermindern.
Um eine hohe Expression von heterologen Genen in Pflanzen zu erhalten, kann es bevorzugt sein, die Gene neu zu konstruieren, so dass sie im Cytoplasma von Pflanzenzellen effizienter exprimiert werden. Mais ist eine solche Pflanze, wo es bevorzugt sein kann, das heterologe Gen/die heterologen Gene vor der Transformation neu zu konstruieren, um deren Expressionslevel in der Pflanze zu erhöhen. Deshalb kann ein zusätzlicher Schritt bei der Gestaltung von Genen, die Antikörper zur Expression in Pflanzen kodieren, die Neukonstruktion eines heterologen Gens für die optimale Expression einschließen.
Ein Grund für die Neukonstruktion eines Antikörpergens zur Expression in Mais ist es, den optimalen G+C-Gehalt des nativen Gens sicherzustellen sowie alle Sequenzen, die Kontrollsequenzen von Pflanzengenen nachahmen oder verdoppeln, zu eliminieren. Das Vorhandensein einiger A+T-reicher Sequenzen in der DNA von einem/mehreren in Pflanzen eingebrachten Gen(en) (z. B. die TATA-Box-Regionen, die normalerweise in Genpromotoren vorkommen), kann in einer abweichenden Transkription des Gens/der Gene resultieren. Auf der anderen Seite kann das Vorhandensein anderer regulatorischer Sequenzen, die in der transkribierten mRNA vorhanden sind (z. B. Polyadenylierungssignal-Sequenzen (AAUAAA) oder Sequenzen, die komplementär zu kleinen Kern-RNAs (small nuclear RNA) sind, die am prä-mRNA-Spleißen beteiligt sind) zu RNA-Instabilität führen. Deshalb ist es ein Aspekt bei der Gestaltung von Genen, die ein Antikörpergen zur Expression in Mais kodieren, bevorzugt als pflanzenoptimierte(s) Gen(e) bezeichnet, eine DNA-Sequenz zu erzeugen, die einen höheren G+C-Gehalt hat und bevorzugt einen, der nahe an dem des Maisgens, das das metabolische Enzym kodiert, ist. Ein anderes Ziel bei der Gestaltung des pflanzenoptimierten Gens/der pflanzenoptimierten Gene ist es, eine DNA-Sequenz zu erzeugen, bei der die Modifikationen der Sequenz die Translation nicht behindern.
Die Tabelle unten (Tabelle 1) veranschaulicht wie hoch der G+C-Gehalt in Mais ist. Für die Daten in Tabelle 1 wurden die kodierenden Regionen der Gene aus GenBank-Einträgen (Version 71) gewonnen und die Basenzusammensetzungen wurden mit dem MacVector^TM Programm (IBI, New Haven, CT) berechnet. Die Intronsequenzen wurden bei den Berechnungen außer Acht gelassen.
Aufgrund der Plastizität, die durch die Redundanz des genetischen Codes (d. h. manche Aminosäuren werden durch mehr als ein Codon spezifiziert) hervorgebracht wird, hat die Evolution der Genome in verschiedenen Organismen oder Klassen von Organismen die unterschiedliche Verwendung redundanter Codons zur Folge. Dieser „Codongebrauch" spiegelt sich wieder in der durchschnittlichen Basenzusammensetzung proteinkodierender Regionen. Zum Beispiel verwenden Organismen mit relativ geringen G+C-Gehalten Codons, die A oder T an der dritten Position redundanter Codons haben, wohingegen diejenigen, die höhere G+C-Gehalte haben, Codons verwenden, die G oder C an der dritten Position haben. Es wird angenommen, dass das Vorhandensein von „seltenen" Codons innerhalb einer mRNA die absolute Translationsrate dieser mRNA reduzieren kann, insbesondere, wenn die relative Häufigkeit der geladenen tRNA, die dem seltenen Codon entspricht, niedrig ist. Eine Erweiterung davon ist es, dass die Verminderung der Translationsrate durch einzelne seltene Codons für mehrere seltene Codons mindestens additiv sein müsste. Deshalb müssten mRNAs, die einen hohen relativen Gehalt an seltenen Codons haben, entsprechend niedrige Translationsraten haben. Diese Rate müsste durch die daraus folgenden niedrigen Level des kodierten Proteins wiedergespiegelt werden.

Bei der Neukonstruktion von Genen, die einen Antikörper zur Expression in Mais kodierenden, wurde der Codongebrauch der Pflanze bestimmt. Der Codongebrauch von Mais ist die statistische Codonverteilung, die die Pflanze verwendet, um ihre Proteine zu kodieren und die bevorzugte Codonverwendung ist in Tabelle 2 gezeigt. Nach dem Feststellen des Gebrauchs, wird die Frequenz der Codons in dem Gen/den Genen von Interesse in Prozent bestimmt. Die hauptsächlich von der Pflanze bevorzugten Codons sollten bestimmt werden, ebenso wie die bevorzugten Codons zweiter und dritter Wahl. Danach wird die Aminosäuresequenz des Gens von Interesse revers translatiert, so dass die resultierende Nukleinsäuresequenz genau dasselbe Protein codiert wie das native Gen, das man heterolog exprimieren möchte. Tabelle 1. Zusammenstellung von G+C-Gehalten proteinkodierender Regionen in Maisgenen.

Proteinklasse^a	Bereich %G+C	Mittelwert %G+C^b
Metabolische Enzyme (76)	44,4–75,3	59,0 (±8,0)
Strukturproteine (18)	48.6–70,5	63,6 (±6,7)
Regulatorische Proteine (5)	57,2–68,9	62,0 (±4,9)
Nicht-charakterisierte Proteine (9)	41,5–70,3	64,3 (±7,2)
Alle Proteine (108)	44,4–75,3	60,8 (±5,2)

a Anzahl an Genen in einer Klasse in Klammem angegeben.
^b Standardabweichungen in Klammern angegeben.
^c Bei kombinierten Gruppen wurden die Mittelwerte bei der Berechnung der Mittelwerte außer Acht gelassen.

Die neuen DNA-Sequenzen werden unter Verwendung der Codongebrauchs-Informationen entworfen, so dass sie den am stärksten bevorzugten Codons der gewünschten Pflanze entsprechen. Die neuen Sequenzen werden dann auf Restriktionsschnittstellen, die durch die Modifikationen geschaffen worden sein könnten, analysiert. Die identifizierten Stellen werden dann weiter modifiziert, indem die Codons zweiter oder dritter Wahl durch bevorzugte Codons ersetzt werden. Andere Stellen in der Sequenz, die die Transkription oder Translation des Gens von Interesse beeinträchtigen könnten, sind die Exon:Intron 5'- oder 3'-Verbindungen, Polyadenylierungssignale oder RNA-Polymerase-Terminationssignale. Die Sequenz wird weiter analysiert und modifiziert, um die Häufigkeit von TA oder GC Dubletts zu reduzieren. Zusätzlich zu den Dubletts können G- oder C-Sequenzblöcke, die mehr als etwa vier gleiche Reste haben, die Transkription der Sequenz beeinträchtigen.
Deshalb werden diese Blöcke auch modifiziert, indem die Codons erster oder zweiter Wahl etc. durch die am nächsten bevorzugt gewählten Codons ersetzt werden.
Es ist bevorzugt, dass das/die optimierte(n) Pflanzengen(e), die einen Antikörper codieren, etwa 63% Codons erster Wahl enthält/enthalten, zwischen etwa 22% und etwa 37% Codons zweiter Wahl und zwischen etwa 15% und etwa 0% Codons dritter Wahl, wobei der gesamte Prozentsatz 100% ist. Am stärksten bevorzugt, enthält/enthalten das/die optimierte(n) Pflanzengen(e) etwa 63% Codons erster Wahl, mindestens etwa 22% Codons zweiter Wahl, etwa 7,5% Codons dritter Wahl und etwa 7,5% Codons vierter Wahl, wobei der gesamte Prozentsatz 100% ist. Die bevorzugt für die Genkonstruktion für Expression in Mais verwendeten Codons sind in Tabelle 2 gezeigt. Das oben beschriebene Verfahren ermöglicht es dem Fachmann, ein Gen/Gene zu modifizieren, die für eine spezifische Pflanze fremd sind, so dass die Gene optimal in Pflanzen exprimiert werden. Das Verfahren wird in der anhängigen PCT-Anmeldung WO 97/13402 weiter erläutert.
Um optimierte Pflanzengene zu entwerfen, wird die Aminosäuresequenz des Antikörpers von Interesse revers in eine DNA-Sequenz translatiert, indem ein nicht-redundanter genetischer Code verwendet wird, der aus einer Codongebrauchs-Tabelle, die für die Gensequenzen für die spezifische Pflanze zusammengestellt wurde, wie in Tabelle 2 gezeigt, festgesetzt wurde. Die resultierende DNA-Sequenz, die in Bezug auf die Codon-Verwendung vollständig homogen ist, wird weiter modifiziert, um eine DNA-Sequenz festzusetzen, die neben einem höheren Grad an Codon-Diversität auch strategisch platzierte Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme enthalten, eine erwünschte Basenzusammensetzung und die keine Sequenzen haben, die die Transkription des Gens oder die Translation der Produkt-mRNA beeinträchtigen.
Beim Entwerfen eines Antikörpergens zur optimalen Expression in Pflanzen, kann es notwendig sein, Nukleinsäuresequenzen hinzuzufügen, die Aminosäuren kodieren, von denen gezeigt werden konnte, dass sie die Expressionslevel davon steigern. Zum Beispiel haben Schnuten et al., (1996, Plant Molecular Biology, 30: 781–793) gezeigt, dass die carboxyterminale Aminosäuresequenz KDEL die Antikörper-Akkumulation in transgenen Tabakpflanzen steigert. Andere Strategien, um die Expression von Antikörpergenen zu steigern, sind von Owen et al., (1992, Chem. Ind., 11: 406–408); Ma (1995, ACS Symp. Ser., 604: 56–59); Schnuten et al., (1997 FERS Lett. 415: 235–241); Conrad und Fiedler, (1994, Plant Mol. Biol. 26: 1023–1030); Fiedler et al., (1997, Immunotechnology 3: 205–216); van Engelen et al., (1994, Plant Mol. Biol. 26: 1701–1710); Hiatt et al., (1989, Nature 342: 76–78); Firek et al., (1993, Plant Mol. Biol. 23: 861–870); Ma et al., (1994, Eur. J. Immunol. 24: 131–138), erforscht worden.
In einem anderen Aspekt der Erfindung werden Gene, die die Antikörper codieren, von Transkriptionseinheiten, die in das Pflanzengenom eingefügt wurden, exprimiert. Bevorzugt sind diese Transkriptionseinheiten rekombinante Vektoren, die stabil in das Pflanzengenom integrieren können und die Selektion transformierter Pflanzenlinien erlauben, die mRNA exprimieren, die die Antikörper kodiert, welche entweder durch konstitutive oder induzierbare Promotoren in der Pflanzenzelle exprimiert wird. Sobald sie exprimiert wurde, wird die mRNA in Proteine translatiert, wobei die Aminosäuren von Interesse eingebaut werden. Die Gene, die einen Antikörper kodieren, der in Pflanzenzellen exprimiert wird, können unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors, eines gewebespezifischen Promotors, eines induzierbaren Promotors und desgleichen sein. Es gibt eine Vielzahl an Verfahren, um fremde rekombinante Vektoren in Pflanzenzellen einzuführen und um Pflanzen zu erhalten, die das eingeführte Gen stabil behalten und exprimieren. Derartige Verfahren schließen die Beschleunigung von genetischem Material, mit dem Mikropartikel beschichtet wurden, direkt in Zellen ein ( U. S. Patente 4 945 050 von Cornell und 5 141 131 von DowElanco, jetzt Dow AgroSciences, LLC). Daneben können Pflanzen transformiert werden, indem das Agrobacterium-Verfahren verwendet wird, siehe U. S. Patent 5 177 010 der Universität von Toledo, 5 104 310 von Texas A & M, Europäische Patentanmeldung 0131624 B1 , Europäische Patentanmeldungen 120516 , 159418 B1 und 176 112 von Schilperoot, U. S. Patente 5 149 645 , 5 469 976 , 5 464 763 und 4 940 838 und 4 693 976 von Schilperoot, Europäische Patentanmeldungen 116718 , 290799 , 320500 alle von Max Planck, Europäische Patentanmeldungen 604662 , 627752 und US Patent 5 591 616 von Japan Tobacco, Europäische Patentanmeldungen 0267159 , und 0292435 and U. S. Patent 5 231 019 alle von Ciba Geigy, jetzt Novartis, U. S. Patente 5 463 174 und 4 762 785 beide von Calgene und U. S. Patente 5 004 863 und 5 159 135 beide von Agracetus.
Andere Transformationsverfahren schließen die Whisker-Technologie ein, siehe U. S. Patente 5 302 523 und 5 464 765 beide von Zeneca. Es wurde auch das Elektroporationsverfahren verwendet, um Pflanzen zu transformieren, siehe WO 87/06614 vom Boyce Thompson Institut, 5 472 869 und 5 384 253 beide von Dekalb, WO9209696 und WO9321335 beide von Plant Genetic Systems.
Desweiteren können auch virale Vektoren verwendet werden, um transgene Pflanzen herzustellen, die das Protein von Interesse exprimieren.
Zum Beispiel können einkeimblättrige Pflanzen mit einem viralen Vektor transformiert werden, indem die in den U. S. Patenten 5 569 597 von Mycogen und Ciba-Geigy, jetzt Novartis sowie in den U. S. Patenten 5 589 367 und 5 316 931 , beide von Biosource beschriebenen Verfahren verwendet werden.
Wie bereits erwähnt, ist die Art, auf die das DNA-Konstrukt in die Pflanzenzelle eingeführt wird, für diese Erfindung nicht kritisch. Es kann jedes Verfahren, das für eine wirksame Transformation sorgt, verwendet werden. Zum Beispiel werden hierin verschiedene Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen beschrieben und diese schließen die Verwendung von Ti- oder Ri-Plasmiden und desgleichen ein, um eine Agrobacterium-vermittelte Transformation durchzuführen. In vielen Fällen wird es wünschenswert sein, dass die zur Transformation verwendeten Konstrukte auf einer oder beiden Seiten, insbesondere auf der rechten Seite, durch T-DNA-Grenzen begrenzt werden. Das ist besonders nützlich, wenn das Konstrukt Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsart verwendet, wobei T-DNA-Grenzen Verwendung bei anderen Transformationsarten finden können.
Wenn Agrobacterium zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet wird, kann ein Vektor verwendet werden, der in den Wirt zum Zweck homologer Rekombination mit T-DNA oder dem Ti- oder Ri-Plasmid, das in dem Wirt vorhanden ist, eingeführt werden kann.
Das Einführen des Vektors kann mittels Elektroporation, tri-parentaler Paarung und anderer Verfahren zur Transformation gram-negativer Bakterien, die dem Fachmann bekannt sind, durchgeführt werden. Die Art der Vektor-Transformation in den Agrobacterium-Wirt ist für diese Erfindung nicht kritisch. Das Ti- or Ri-Plasmid, das die T-DNA für die Rekombination enthält, kann oder kann nicht in der Lage sein, Kallus zu bilden und ist für die Erfindung nicht kritisch, solange die Vir-Gene vorhanden sind. Tabelle 2. Bevorzugte Aminosäurecodons für in Mais exprimierte Proteine
In manchen Fällen, in denen Agrobacterium zur Transformation verwendet wird, wird das Expressionskonstrukt, das sich innerhalb der T-DNA-Grenzen befindet, in einen Breitspektrumvektor, wie pRK2 oder Derivate davon eingesetzt, wie in Ditta et al., (PNAS USA (1980) 77: 7347–7351) und EPO 0 120 515 , auf die hierin verwiesen wird, beschrieben.
Im Expressionskonstrukt und der T-DNA wird einer oder mehrere Marker, wie hierin beschrieben, enthalten sein, der die Selektion von transformiertem Agrobacterium und von transformierten Pflanzenzellen ermöglicht. Der spezifische Marker, der eingesetzt wird, ist für die Erfindung nicht essentiell und die bevorzugten Marker sind abhängig vom verwendeten Wirt und der Konstruktion.
Zur Transformation von Pflanzenzellen mit Agrobacterium können Explantate mit dem transformierten Agrobacterium für eine Zeit, die für die Transformation damit ausreichend ist, vereinigt und inkubiert werden. Nach der Transformation werden die Agrobacterien durch Selektion mit dem geeigneten Antibiotikum getötet und die Pflanzenzellen werden mit dem geeigneten selektiven Medium kultiviert. Sobald sich Kalli gebildet haben, kann die Bildung von Schösslingen durch die Verwendung geeigneter Pflanzenhormone gemäß Verfahren, die im Fachgebiet der Pflanzengewebe-Kultivierung und Pflanzenregeneration wohlbekannt sind, unterstützt werden. Ein Kallus-Zwischenstadium muss jedoch nicht immer notwendig sein. Nach der Bildung von Schösslingen, können die Pflanzen in Medium, das die Wurzelbildung unterstützt, überführt werden, wodurch die Pflanzenregeneration vervollständigt wird.
Die Pflanzen werden dann kultiviert, um Samen zu bilden und die Samen können verwendet werden, um künftige Generationen zu etablieren. Unabhängig von dem Transformationsverfahren wird das Antikörpergen bevorzugt in einen Gentransfer-Vektor eingesetzt, der daran angepasst wurde, das Gen in einer Pflanzenzelle zu exprimieren, indem in den Vektor ein promotorregulatorisches Element für Pflanzen sowie 3' untranslatierte Transkriptions-Terminationsregionen, wie Nos und desgleichen, eingebaut wurden.
Neben den zahlreichen Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen, kann auch der Gewebetyp, der mit den fremden Genen in Kontakt gebracht wird, variieren. Derartige Gewebe schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, embryogenes Gewebe, Kallusgewebetypen I, II und III, Hypokotyl, Meristem, Wurzelgewebe und desgleichen ein. Fast alle Pflanzengewebe können während der zellulären Entdifferenzierung transformiert werden, indem geeignete Verfahren, wie hierin beschrieben, verwendet werden.
Eine andere Variable ist die Wahl eines selektierbaren Markers. Die Bevorzugung eines spezifischen Markers bleibt dem Fachmann überlassen, aber jeder der folgenden selektierbaren Marker kann zusammen mit anderen Genen, die hierin nicht aufgelistet sind, die als selektierbarer Marker fungieren können, verwendet werden. Derartige selektierbare Marker schließen, ohne darauf beschränkt zu sein das Aminoglykosidphosphotransferase-Gen von Transposon Tn5 (Aph II), das die Resistenz gegenüber den Antibiotika Kanamycin, Neomycin und G418 kodiert sowie diejenigen Gene, die die Resistenz oder Toleranz gegenüber Glyphosat, Hygromycin, Methotrexat, Phosphinothricin(bialophos), Imidazolinone, Sulfonylharnstoffe und Triazolopyrimidinherbizide wie Chlorsulfuron, Bromoxynil, Dalapon und desgleichen ein.
Neben einem selektierbaren Marker kann es erwünscht sein, ein Reportergen zu verwenden. In manchen Fällen kann ein Reportergen mit oder ohne einem selektierbaren Marker verwendet werden. Reportergene sind Gene, die typischerweise im Empfängerorganismus oder -gewebe nicht vorhanden sind und sie kodieren typischerweise Proteine, die eine gewisse phänotypische Veränderung oder enzymatische Eigenschaft zur Folge haben. Beispiele für derartige Gene werden in K. Wising et al., (1988) Ann. Rev. Genetics, 22: 421, bereitgestellt, auf das hierin verwiesen wird.
Bevorzugte Reportergene schließen die Betaglucuronidase (GUS) des uidA-Locus aus E. coli ein, das Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen von Tn9 aus E. coli, das Grün-Fluoreszierende Protein aus der biolumineszenten Qualle Aequorea victoria und die Luziferasegene aus der Feuerfliege Photinus pyralis. Ein Assay um die Reportergen-Expression nachzuweisen kann dann zu einem geeigneten Zeitpunkt, nachdem das Gen in die Empfängerzelle eingeführt worden ist, durchgeführt werden. Ein bevorzugter derartiger Assay beinhaltet die Verwendung des Gens, das die Betaglucuronidase (GUS) des uidA-Locus aus E. coli kodiert, wie von Jefferson et al. (1987 Biochem. Soc. Trans. 15, 17–19) beschrieben, um die transformierte Zellen zu identifizieren.
Zusätzlich zu promotorregulatorischen Elementen von Pflanzen, können promotorregulatorische Elemente aus einer Vielzahl an Quellen wirksam in Pflanzen verwendet werden, um fremde Gene zu exprimieren. Zum Beispiel können promotorregulatorische Elemente bakteriellen Ursprungs, wie der Octopinsynthase-Promoter, der Nopalinsynthase-Promoter, der Mannopinsynthase-Promoter; Promotoren viralen Ursprungs, wie der Blumenkohl-Mosaik-Virus (35S und 19S) 35T-Promotor (der ein neukonstruierter 35S-Promotor ist, siehe WO 97/13402 , veröffentlicht am 17. April 1997) und desgleichen, verwendet werden. Promotorregulatorischen Elemente von Pflanzen schließen, ohne darauf begrenzt zu sein, die kleine Untereinheit (ssu) von Ribulose-1,6-bisphosphat-(RUBP)Carboxylase, den Beta-Conglycinin-Promotor, den Beta-Phaseolinpromotor, den ADH-Promotor, Hitzeschockpromotoren und gewebespezifische Promotoren ein.
Andere Elemente, wie Matrix-Anheftungs-Regionen, Gerüst-Anheftungs-Regionen, Enhancer, Polyadenylierungssequenzen und desgleichen, können vorhanden sein und somit die Transkriptionseffizienz oder DNA-Integration verbessern. Derartige Elemente können für die DNA-Funktion nötig sein, oder nicht, auch wenn sie für eine bessere Expression oder ein besseres Funktionieren der DNA sorgen können, indem sie sich auf die Transkription, mRNA-Stabilität und desgleichen auswirken. Derartige Elemente können in der DNA enthalten sein, da es erwünscht ist, eine optimale Leistung der transformierten DNA in der Pflanze zu erhalten.
Typische Elemente schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, das Adh-Intron 1, das Adh-Intron 6, die Alfalfa-Mosaik-Virus-Hüllprotein-Leadersequenz, die Maize Streckt Virus Hüllprotein-Leadersequenz sowie andere, die dem Fachmann zur Verfügung stehen, ein.
Konstitutive promotorregulatorische Elemente können ebenfalls verwendet werden, wodurch die kontinuierliche Genexpression in allen Zelltypen und zu allen Zeiten gesteuert wird (z. B. Actin, Ubiquitin, CaMV 35S und desgleichen). Gewebespezifische promotorregulatorische: Elemente sind für die Genexpression in spezifischen Zell- oder Gewebearten, wie den Blättern oder Samen (z. B. Zein, Oleosin, Napin, ACP, Globulin, und desgleichen) verantwortlich und diese können auch verwendet werden.
Promotorregulatorische Elemente können auch während einem bestimmten Stadium der Pflanzenentwicklung aktiv sein sowie in Pflanzengeweben oder Pflanzenorganen aktiv sein. Beispiele für solche schließen, ohne darauf begrenzt zu sein, pollenspezifische, embryospezifische, Maisseide-spezifische, Baumwollfaser-spezifische, Wurzel-spezifische, Samenendosperm, Frucht-spezifische, spezifische promotorregulatorische Elemente und desgleichen ein. Unter gewissen Umständen kann es wünschenswert sein, ein induzierbares promotorregulatorisches Element zu verwenden, das für die Genexpression als Antwort auf ein spezifisches Signal, wie einen physikalischen Stimulus (Hitzeschockgene), Licht (RUBP-Carboxylase), ein Hormon (Em), Metabolite, eine Chemikalie und Stress, verantwortlich ist. Es können auch andere erwünschte Transkriptions- und Translationselemente, die in Pflanzen funktionieren, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrachtet auch die Verwendung transformierter Pflanzen, die sich selbst befruchten, um eine Reinzuchtpflanze hervorzubringen. Die Reinzuchtpflanze kann Samen produzieren, die Antikörper-kodierende Gene enthalten. Die Reinzuchtlinie kann auch mit anderen Reinzuchtlinien gekreuzt werden, um Hybride hervorzubringen.
Teile, die von der regenerierten Pflanze erhalten werden, wie Blüten, Samen, Blätter, Zweige, Früchte und desgleichen, sind von der Erfindung umfasst, vorausgesetzt, dass diese Teile Gene enthalten, die den Antikörper von Interesse kodieren und/oder den Antikörper von Interesse exprimieren.
Nachkommen, Varianten und Mutanten der regenerierten Pflanzen sind ebenfalls im Schutzumfang der Erfindung eingeschlosen.
In diploiden Pflanzen kann typischerweise ein Elternteil transformiert sein und der andere kann Wildtyp sein. Nach dem Kreuzen der Eltern können die Hybride der ersten Generation (F₁) untereinander befruchtet werden, um Hybride der zweiten Generation (F₂) hervorzubringen.
Die Pflanzen, die die höchsten Antikörperlevel exprimieren oder den gewünschten Phänotyp haben, können ausgewählt werden.
Ein anderer Weg, um Pflanzenzu erzeugen, die aktive Antikörper exprimieren, ist es, zwei Pflanzenlinien zu transformieren, eine mit einem Gen, das entweder eine schwere Kette oder eine leichte Kette kodiert und die andere Pflanze mit der komplementären Kette. Die zwei oder mehr Pflanzenlinien können dann gekreuzt werden, um Nachkommen hervorzubringen, die die beiden Bestandteile schwere Kette und leichte Kette enthalten.
Funktionelle Antikörper können auf diese Weise wie von Ma et al., (1995) Science 268: 716–719 beschrieben, erhalten werden.
Auf Pflanzen-RNA-Viren basierende Systeme können auch verwendet werden, um die Antikörpergene für die hierin offenbarten Zwecke zu exprimieren. Dabei kann das Gen in die Hüllproteinregion eines geeigneten Pflanzenvirus eingefügt werden, der die Wirtspflanze von Interesse infiziert. Der Antikörper kann dann exprimiert werden, wodurch die Gleichgewichts-Passagierproteinlevel modifiziert werden. Auf Pflanzen-RNA-Viren basierende Systeme sind in den U. S. Patenten 5 500 360 von Mycogen Plant Sciences, Inc. und U. S. Patenten 5 316 931 und 5 589 367 von Biosource Genetics Corp. beschrieben.
Es können auch standard- und molekularbiologische Verfahren verwendet werden, um die hierin beschriebenen Toxine zu klonieren und zu sequenzieren.
Zusätzliche Informationen können in Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Press, gefunden werden.
Die Erfindung wird detaillierter durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht. Die Beispiele dienen nur dem Zweck der Veranschaulichung und sollen nicht als den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung einschränkend ausgelegt werden.
BEISPIEL 1
ISOLIERUNG UND KLONIERUNG VON STEAROYL-ACP-Δ-9-DESATURASE (Δ-9-DESATURASE) AUS MAIS
Ein cDNA-Klon, der Mais Stearoyl-ACP-Δ-9-Desaturase (Δ-9-Desaturase) kodiert, wurde aus einer cDNA-Bibliothek, die aus Maiskörnern der Reinzuchtlinie CS608 stammen, die in einem Gewächshaus gezüchtet und von Hand bestäubt wurde, erhalten. Die cDNA-Bibliothek wurde aus den Körnern hergestellt, die 20 Tage nach der Bestäubung, nachfolgend 20-DAP genannt, geerntet wurden. Nach der Ernte wurden die Embryos sofort gesammelt, auf Trockeneis eingefroren und bei –70°C aufbewahrt. Die RNA wurde durch Mahlen von 2,5 g zu feinem Pulver in flüssigem Stickstoff extrahiert. Danach wurde 10 ml Extraktionspuffer [50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 4% para-Aminosalicylsäure (Sigma Chemical Co), 1% Triisopropylnaphtalensulfonsäure (Eastman Kodak Co., Rochester, NY), 10 mM DTT und 10 mM Natriummetabisulfit (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)] zugegeben und das Gemisch wurde für 1 min mit einem TEKMAR TISSUMIZER (Tekmar Co., Cincinnati, OH) homogenisiert. Das Homogenat wurde mit dem gleichen Volumen an Phenol, das mit 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 äquilibriert worden war, extrahiert. Die organischen und die wässrigen Phasen wurden mittels Zentrifugation bei 4°C getrennt. Die wässrige Phase wurde entfernt und mit dem gleichen Volumen an Chloroform/Octanol (24:1) extrahiert. Der Überstand wurde dann überführt, zentrifugiert und wieder überführt und es wurde das halbe Volumen an 7,5 M Ammoniumacetat (pH 8,0) zugegeben. Die RNA wurde dann auf Eis für 30 min präzipitiert.
Die präzipitierte DNA wurde mittels Zentrfugation gesammelt und in 1 ml mit Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser (0,1% v/v), nachfolgend DEPC-Wasser genannt, gelöst. Ein halbes Volumen an 7,5 M Ammoniumacetat (pH 8,0) und zwei Volumen an 100%igem Ethanol wurden zugegeben und die RNA konnte bei –20°C für 30 min präzipitieren. Das Präzipitat wurde mittels Zentrifugation gesammelt, in eiskaltem 70%igem Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 0,5 ml DEPC-behandeltem Wasser gelöst.
PolyA⁺-mRNA wurde über Oligo-dT-Cellulose-Säulen (Collaborative Biomedical Products, Redford, MA) aufgereinigt.
Typ 3-Oligo-dT-Cellulose (0,1 g) wurde in 5 ml Puffer 1 für 30 min äquilibriert, wobei Puffer 1 Ladepuffer mit 0,5 M NaCl war und Ladepuffer war 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA und 0,1% Natriumlaurylsulfat (SDS). Die Säule wurde mit 3 Volumen DEPC-Wasser, 3 Volumen Waschpuffer [0,1 N NaOH, 5 mM EDTA], 3 Volumen DEPC-Wasser und 5 Volumen Puffer 1 gewaschen. Das gelöste RNA-Pellet wurde bei 65°C für 5 min erhitzt, 2 × mit Puffer 2 [2 × Ladepuffer] verdünnt und dann auf die Oligo-dT-Säule aufgebracht. Das Durchflußmaterial wurde dann gesammelt, nochmals erhitzt und wieder auf die Säule aufgebracht. Darauf folgend wurde die Säule mit 10 Volumen Puffer 1 gefolgt von 10 Volumen Puffer 3 [Ladepuffer mit 0,1 M NaCl] gewaschen. Die PolyA⁺-RNA wurde mit 3 Volumen Elutionspuffer [10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,05% SDS] eluiert und in 0,5 ml-Fraktionen gesammelt. Die RNA-Fraktionen wurden vereinigt, auf 0,3 M Natriumacetat pH 5,2 gepuffert und nach der Zugabe von 2,2 Volumen 100%igem Ethanol bei –20°C für 16 h präzipitiert. Das Präzipitat wurde mittels Zentrifugation gesammelt, mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 50 μl DEPC-behandeltem Wasser gelöst. Dieses Material wurde dann wiederum über eine frische Oligo-dT-Säule, wie hierin beschrieben, aufgereinigt, um hochangereicherte PolyA⁺-mRNA hervorzubringen. Die RNA-Konzentrationen wurden bestimmt, indem die OD₂₆₀ nm gemessen wurde.
Fünf μg PolyA⁺-RNA wurde in cDNA umgewandelt und in den LAMBDA UNI-ZAP Vektor unter Verwendung des Lambda ZAP-cDNA Synthese- und Klonierungskits gemäß den Protokollen des Herstellers (Stratagene, La Jolla, CA). Die resultierende Bibliothek wies einen Ausgangstiter von 3,38 × 10¹⁰ plaquebildenden Einheiten/ml (pfu/ml), mehr als 95% Rekombinante und eine durchschnittliche Insertgröße von 1,35 kb auf. Die cDNA-Bibliothek wurde gemäß Sambrook et al., (Molecular Cloning, A Laborstory Manual, 2. Ausgabe (1989) Cold Spring Harbor Laborstory Press) amplifiziert und hatte einen Titer von 6,0 × 10⁶ pfu/ml. Die gesamte cDNA der Bibliothek wurde in Batchkultur wiederhergestellt und wie folgt isoliert: 5 ml XL1 Blue E. coli Zellen (Stratagene) bei einer OD₆₀₀ nm = 1,0 in 10 mM MgSO₄ wurde mit 8,3 μl (5 × 10⁸ pfu) einer amplifizierten Ausgangs-Phagen-Embryo-cDNA-Bibliothek und 100 μl EXASSIST Helferphagen (Stratagene) gemischt und bei 37°C für 20 min inkubiert. Fünfundzwanzig ml TV-Medium [8,0 g/l Trypton, 5,0 g/l Hefeextrakt und 2,5 g/l NaCl, pH 7,8] wurde zugegeben und die Zellen wurden unter Schütteln für 3 h bei 37°C inkubiert.
Danach wurden die Bakterienzellen durch Hitze bei 68°C für 15 min getötet und der Überstand wurde abgenommen. Fünfhundert μl Überstand wurde mit 14,5 ml SOLR-Zellen (Stratagene) (OD₆₀₀ nm = 1,5) gemischt, bei 37°C für 15 min inkubiert, zu 500 ml LB [10 g/l Trypton, 10 g/l NaCl und 5 g/l Hefeextrakt enthaltend 50 μg/ml Ampicillin] gegeben und über Nacht kultiviert. Danach wurde die Plasmid-DNA durch alkalische Lyse/CsCl-Aufreinigung gemäß Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laborstory Manual, 2. Auflage (1989) Cold Spring Harbor Laborstory Press), auf das verwiesen wird, erhalten und mittels Agarosegelelektrophorese nach Verdau mit EcoRI/Xhol analysiert. Nach der Elektrophorese wurde ein von 0,5 bis 3,0 kb reichender Schmier beobachtet.
Um einen Klon, der Mais Δ-9-Desaturase kodiert, zu isolieren, wurde ein DNA-Fragment mittels Polymerase-Ketten-Reaktion, nachfolgend PCR, amplifiziert, um eine Sonde hervorzubringen, die verwendet werden konnte, um eine Gesamtlängen-cDNA zu isolieren. Ein 5'-Primer mit 128-facher Degeneriertheit und ein 3'-Primer mit 128-facher Degeneriertheit, hier entsprechend als SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 eingetragen, wurde mit einem Applied Biosystems Hochdurchsatz-DNA-Synthetisierer Modell 394 (Foster City, CA) synthetisiert. Doppelsträngige cDNA wurde als Matrize verwendet. Die PCR-Amplifikation wurde wie folgt durchgeführt: 10 ng Matrizen-DNA, 5 μl 10 × Reaktionspuffer, nachfolgend 10 × RB, [100 mM Tris-HCl pH 8,3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 0,01% (w/v) Gelatine], 5 μl 2 mM Desoxyribosenucleotidtriphosphate (dNTPs), 50 pmol Primer (SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2), 2,5 Einheiten AMPLITAQ DNA-Polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) und Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 50 μl. Ein DNA-Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus Modell #9600, Norwalk, CT) wurde wie folgt programmiert: 96°C für 1 min, gefolgt von [94°C (1 min), 37°C (2 min) und 72°C (3 min)] für 35 Zyklen, gefolgt von 7 min bei 72°C. Es wurde ein DNA-Produkt von 276 Basenpaaren (bp) erhalten, wie unten beschrieben sequenziert und hierin als SEQ ID NO: 3 eingetragen.
Das PCR-Fragment wurde direkt in den pBC-Vektor (Stratagene, LaJolla, CA) kloniert und in OneShot^TM INVaF' kompetente Zellen (Invitrogen) gemäß den Beschreibungen des Herstellers transformiert. Die DNA wurde unter Verwendung des Qiawell Plasmid-Aufreinigungs-Systems (Qiagen, Santa Clarita, CA) gemäß den Instruktionen des Herstellers, extrahiert. Die rekombinanten Klone wurden mittels Didesoxykettenabbruch unter Verwendung eines PRISM AMPLITAQ READY REACTION DYEDEOXY Terminationszyklus-Sequenzierkits #401384 gemäß dem Hersteller (Perkin-Elmer Applied Biosystems Division, Foster City, CA) sequenziert. Die Proben wurden auf einem automatisierten AB1373A DNA- Sequenzierer (Perkin-Elmer, Applied Biosystems Division) aufgetrennt. Die DNA-Sequenzanalyse von SEQ ID NO: 3 wurde unter Verwendung von MACVECTOR v. 4.1.4 (Oxford Molecular, Campbell, KY) durchgeführt, was die theoretischen Translationen und Alignments ergab und somit die Aminosäuresequenz, die hierin als SEQ ID NO: 4 eingetragen ist, erzeugte.
Die hierin beschriebene CS608 Embryo-cDNA-Bibliothek wurde gescreent, indem ein DNA-Fragment, das im Wesentlichen SEQ ID NO: 3 war, verwendet wurde. Dieses Fragment wurde verwendet, um Gesamtlängenklone, die Mais Δ-9-Desaturase kodieren, zu erhalten. Die Sonden-DNA wurde erhalten, indem das klonierte PCR-Fragment (SEQ ID NO: 3) mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut wurde. Dieses Material wurde dann auf einem 1%igen präparativen Agarosegel aufgetrennt, die Bande wurde ausgeschnitten und die DNA wurde mit QIAEX (Qiagen) extrahiert. Eine α-³²P-Deoxyribocytosintriphosphat-(dCTP) markierte Sonde wurde erzeugt, indem das QUICKPRIME Random-Labeling-Kit (Stratagene, LaJolla, CA) gemäß den Instruktionen des Herstellers verwendet wurde, unter Verwendung von 5 μl [α³²P]-dCTP (3000 Ci/mmol, 10 μCi/μl, DuPont, NEN Life Science Products, Boston, MA). Danach wurde die Markierungsreaktion auf eine NucTrap-Säule (Stratagene), die mit TE [10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA] äquilibriert worden war, aufgebracht. Die markierte DNA wurde mit 2 Volumen TE (jeweils 400 μl) eluiert. Die Sonde wurde hitzedenaturiert, bevor sie zu Hybridisierungspuffer gegeben wurde, wie hierin beschrieben.
Verfahren zum Titrieren, Ausplattieren, Entkernen (coring) und zur Wiederherstellung von Phagen waren wie in dem LAMBDA ZAP II Bibliothek (Stratagene) Instruktionshandbuch beschrieben. Die cDNA-Bibliothek wurde ausplattiert (100000 pfu/Platte) auf fünf 22,5 × 22,5 cm NUNC Assay-Platten (Nunc Inc. Roskilde, Dänemark). Phagenabdrücke wurden von jeder Platte genommen, indem 0,45 μm Hybond N+ Nylonmembranen (Amersham, Arlington Heights, IL) verwendet wurden. Auf den Transfer der Phagen auf die Filter folgend wurden die Zellen und Phagen denaturiert und die DNA wurde durch Autoklavieren für 8 min bei 125°C gefolgt von UV-Kreuzvernetzung mit einem STRATALINKER UV Crosslinker (Stratagene) auf den Membranen fixiert. Vor der Hybridisierung wurden die Filter gründlich in 2 × SSC [1 × SSC entspricht 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,0] 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 65°C gewaschen. Die Vorhybridisierung der Filter wurde bei 42°C für 1 h in 200 ml Hybridisierungspuffer, enthaltend 50% (v/v) Formamid, 3 × SSC, 10 × Denhardt's Lösung [1 × Denhardt's Lösung entspricht 0,02% Ficoll (Typ 400, Pharmacia), 0,02% Polyvinylpyrollidon und 0,02% Rinderserumalbumin], 0,1% (w/v) SDS und 100 μg/ml gescherter und denaturierter Lachsspermien-DNA durchgeführt. Danach wurde der benutzte Hybridisierungspuffer durch 100 ml frischen Hybridisierungspuffer, der markierte Sonde enthält (Endaktivität = 6,1 × 10⁶ dpm/ml) ersetzt. Die Hybridisierung wurde für 18–20 h bei 42°C mit leichter Rotation fortgesetzt. Danach wurden die Filter zweimal für 40 min bei Raumtemperatur in 100 ml Waschlösung, enthaltend 0,1 × SSC und 0,1% SDS gewaschen, gefolgt von 3–1 h Waschschritten mit 1 l davon bei 60°C, gefolgt von 2–1 h Waschschritten mit 2 l davon bei 60°C. Die Filter wurden dann einem Kodak XOMAT-AR Film (Eastman Kodak Company, Rochester, NY) mit Verstärkungsplatten (Lightening Plus, DuPont CRONEX, DuPont, Wilmington DE) für 16 h bei –70°C exponiert. Durch das Untersuchen der Filme konnten die positiven Plaques identifiziert werden.
Einige der positiven Plaques wurden entkernt und in 1 ml SM-Puffer [5,8 g/l NaCl, 2 g/l MgSO₄, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 ml/l 2%ige (w/v) Gelatine] mit 50 μl Chloroform aufbewahrt. Die Phagen wurden für das sekundäre Screening ausplattiert, indem 50 μl einer 1:1000-Verdünnung des primären Phagen-Stocks verwendet wurden. Die positiven Plaques des sekundären Screenings wurden entkernt und in 500 μl SM-Puffer aufbewahrt. Die Phagen von diesen Stocks wurden dann für die tertiären Screenings ausplattiert, indem Mengen im Bereich von 5 μl unverdünntem sekundären Stock bis zu 20 μl einer 1:100-Verdünnung in SM-Puffer verwendet wurde.
Alle nachfolgenden Hybridisierungen wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Die Isolate wurden in Phagemidenform gemäß dem LAMBDA-ZAP II Bibliothek-Instruktionshandbuch (Stratagene) wiederhergestellt. Die wiederhergestellten Phagemiden wurden ausplattiert, indem 200 μl SOLR-Zellen (Stratagene), die bis zu einer OD₆₀₀ nm = 0,5 bis 1,0 angezogen wurden, mit 50–100 μl Phagemid vereinigt wurden und für 15 min bei 37°C inkubiert wurden. Die Phagemid-enthaltenden Zellen wurden auf Ampicillin (75 μg/ml) enthaltendem LB-Agar ausgestrichen und über Nacht bei 37°C angezogen. Die DNA wurde aus 4 ml Flüssigkultur, die über Nacht bei 37°C in TB [1,2% Trypton, 2,4% Hefeextrakt, 0,4% Glycerin, 0,17 M KH₂PO₄ und 0,72 M K₂HPO₄] angezogen worden waren, unter Verwendung des alkalische Lyse/Polyethylenglykol-Protokolls extrahiert, wie im PRISM READY REACTION DYEDEOXY Terminator Cycle Sequencing Kit Protokoll #401388 Rev. B (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division) beschrieben. Eine Sequenz der Gesamtlängen-Mais-Δ-9-Desaturase cDNA und die entsprechende Aminosäuresequenz ist hierin entsprechend als SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 eingetragen.
BEISPIEL 2
EXPRESSION DER GENE, DIE DAS REIFE PROTEIN UND DAS VORLAUFERPROTEIN DER MAIS STEAROYL-ACP-Δ-9-DESATURASE (Δ-9-DESATURASE) KODIEREN
Die kodierende Sequenz von Mais Δ-9-Desaturase wurde in den Expressionsvektor pET9d DN unter Verwendung von Standard molekularbiologischen Klonierungsverfahren kloniert. pET9d DN ist eine modifizierte Version des Expressionsvektors pET9d (Novagen Inc., Madison, WI), der es ermöglicht Fragmente in eine einzelne NheI-Schnittstelle stromabwärts der Shine & Dalgarno-Sequenz und des Translations-Initiations ATG-Codons zu subklonieren. Um die Subklonierung zu erleichtern, wurde der cDNA-Klon (SEQ ID NO: 5) mit Primern, die die hierin als SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 eingetragenen Sequenzen hatten, amplifiziert. Nach der Amplifizierung wurde das PCR-Produkt mit einem. Überschuss an NheI verdaut, über ein Agarosegel aufgereinigt und direkt in den Vektor pET9d DN kloniert, der mit NheI geschnitten und mit Kälbermagen-Phosphatase dephosphoryliert worden war.
Der Ligationsansatz wurde in E. coli DH5α-Zellen transformiert und die rekombinanten Plasmide, die die Inserts enthielten, wurden durch Miniprep-Screening und Verdau mit NheI selektiert. Ein Klon mit dem Insert in der richtigen Größe und in der richtigen Orientierung relativ zum T7-Promoter wurde durch separaten Verdau mit NheI, NcoI oder XhoI identifiziert. Durch Subklonierung des Fragments in die NheI-Schnittstelle von pET9d DN wurde das mutmaßliche Vorläuferpolypeptid mit dem ATG-Codon stromabwärts des T7-Promotors und der bakteriellen Shine & Dalgamo-Sequenz, die durch pET9d DN bereitgestellt wurden, verbunden. Diese NheI-Schnittstelle änderte die Nukleotidsequenz des mutmaßlichen N-Terminus des Vorläuferproteins von ATG GCG CTC CGC zu ATG GCT AGC CTC CGC, was die kodierte Met-Ala-Leu-Arg Aminosäuresequenz in Met-Ala-Ser-Leu-Arg umwandelte. Das Insert dieses Klons wurde komplett sequenziert und dem Klon wurde die Nummer pDAB432D zugeordnet.
Die Vorläufer-Mais-Δ-9-Desaturase wurde in E. coli BL21(DE3) (Novagen Inc., Madison, WI) exprimiert. Für die Expression im kleinen Maßstab wurde 1 μg des Plasmids pDAB432D in 200 μl CaCl₂ kompetente Zellen transformiert und auf zwei LB-Platten mit 25 μg/ml Kanamycin ausplattiert.
Nach Inkubation bei 37°C über Nacht wurden die Kolonien von den Platten geschabt und in 10 ml LB-Nährmedium mit Kanamycin (50 μg/ml) und 1,0 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) resuspendiert. Die Zellen konnten die Proteine für 3 h unter lebhaftem Schütteln bei 37°C exprimieren. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation bei 3000 rpm für 10 min bei 4°C geerntet. Das Zellpellet wurde zweimal in Trockeneis-Ethanol eingefroren und aufgetaut, um die Zelllyse zu verbessern. Als nächstes wurde das Zellpellet in 1,0 ml Lysepuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.1% Triton-X-100, 100 μg/ml DNaseI, 100 μg/ml RNaseH, 1,0 mg/ml Lysozym) resuspendiert und bei 37°C inkubiert bis es nicht mehr viskos war. Die löslichen Proteine wurden von den aggregierten denaturierten Proteinen durch Zentrifugation bei 4°C für 10 min abgetrennt. Das unlösliche Zellpellet wurde in etwa 300 μl des obigen Lysepuffers resuspendiert. Die beiden Fraktionen hatten ein ungefähres Endvolumen von 0,5 ml.
Die Proteinexpressions-Experimente wurden durch Elektrophorese kleiner Aliquots (1,0 bis 2,0 μl) der löslichen und der Pellet-Fraktionen auf 10–15% Gradienten-SDS-Polyacrylamid Phast-Gelen (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) analysiert. Die Proteinbanden wurden durch Färben mit Coomassie Brilliant Blue im Phast-Gel-Apparat visualisiert und über Nacht durch Schütteln in einem kleinen Volumen 10% Glycerin, 10% Essigsäure entfärbt. Die molekulare Größe der Banden wurde durch Vergleich mit Bio-Rad Niedrig-Molekulargewichts-Markern (Bio-Rad Laborstories, Hercules, CA) bestimmt. Es wurde eine Western-Blot-Analyse durchgeführt, unter Verwendung der für den reifen Anteil der Mais Δ-9-Desaturase spezifischen Antikörper, die, wie hierin beschrieben, hergestellt worden waren. Die Expression des Plasmids pDAB432D in E. coli resultierte in der Produktion eines 42 kDa-Proteins im Zellpellet, was darauf hinweist, dass das in E. coli produzierte Vorläuferprotein unlöslich ist.
Zur Herstellung des reifen Δ-9-Desaturase-Proteins wurde der Anteil des cDNA-Klons, der das reife Desaturase-Protein kodiert, in pETdDΔN subkloniert. Der Aminoterminus des reifen Mais Δ-9-Desaturase-Proteins wurde, wie hierin beschrieben, bestimmt. Um das reife Protein zu exprimieren wurde DNA, die der SEQ ID NO: 11 entspricht, in den Expressionsvektor pET9dΔN, der eine modifizierte Version von pET9d (Novagen, Inc.) ist, subkloniert. Durch den Vektor pET9dΔN konnten Fragmente in eine einzelne NheI-Schnittstelle stromabwärts von der Shine und Dalgarno-Sequenz und dem Translationsinitiations ATG-Codon subkloniert werden.
Um das Subklonieren zu erleichtern, wurde die der SEQ ID NO: 5 entsprechende DNA mit Primern, die hierin als SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 eingetragen sind, amplifiziert. Das DNA-Produkt hatte die hierin als SEQ ID NO: 11 eingetragene Sequenz und kodierte ein Protein mit der hier als SEQ ID NO: 12 eingetragenen Aminosäuresequenz. Nach der Amplifikation wurde das PCR-Produkt mit einem Überschuss an NheI verdaut, über ein Agarosegel aufgereinigt und direkt in den Vektor pET9dΔN ligiert, der mit NheI geschnitten und mit Kälbermagen-Phosphatase dephosphoryliert worden war. Der Ligationsansatz wurde in E. coli DH5α-Zellen transformiert und rekombinante Plasmide, die die Inserts enthielten wurden durch Miniprep-Screening selektiert und mit NheI verdaut. Die Klone mit dem Insert in der richtigen Orientierung relativ zu dem T7-Promoter wurden durch separaten Verdau mit NcoI oder XhoI identifiziert. Das Plasmid mit dem DNA-Konstrukt in der richtigen Orientierung wurden pDAB428 genannt. Die Expression von Protein von diesem Plasmid wurde in einer ähnlich zu der für das Plasmid pDAB432D beschriebenen Weise durchgeführt.
BEISPIEL 3
AUFREINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON NATIVER UND IN E. COLT EXPRIMIERTER MAIS STEAROYL-ACP-Δ-9-DESATURASE (Δ-9-DESATURASE)
Ein in E. coli hergestellter Überstand, enthaltend reife MaisΔ-9-Desaturase, wie oben beschrieben, wurde mit Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) auf 25 mM gebracht und auf Eis für 1 h gekühlt. Danach wurde das resultierende flockige Präzipitat durch Zentrifugation entfernt. Der Inkubationsschritt auf Eis wurde zweimal wiederholt, wonach die Lösung klar blieb. Die geklärte Lösung wurde auf eine Mono S HR10/10-Säule (Pharmacia), die in 25 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) äquilibriert worden war, geladen. Die an die Säulenmatrix gebundenen Proteine wurden unter Verwendung eines 0–500 mM NaCl-Gradienten während 1 h (2 ml/min; 2 ml-Fraktionen) eluiert. Die Fraktionen, die Δ-9-Desaturase-Aktivität, wie hierin beschrieben, enthielten, wurden vereinigt und nach Größe aufgetrennt, indem eine Superose 12B HR16/50 (Pharmacia) Säule mit einer Flussrate von 1,2 ml/min verwendet wurde, die in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) äquilibriert worden war. Die Fraktionen wurden gesammelt (1,2 ml/Fraktion) und die Proben wurden auf das Vorhandensein des Δ-9-Desaturase-Proteins mittels SDS-PAGE untersucht. Die Berechnungen des Molekulargewichts basierten auf einer Kalibrierung der Säule mit den folgenden Standards: Ribonuklease A (13,7 kDa), Ovalbumin (43,0 kDa), Rinderserumalbumin (67,0 kDa), Aldolase (158,0 kDa), Katalase (232,0 kDa), Ferritin (440,0 kDa) und blaues Dextran (2000 kDa).
Das mutmaßliche Protein von Interesse wurde SDS-PAGE unterworfen, auf eine ProBlott-Membran (Amersham) geblottet, mit 0,02% Amidoschwarz visualisiert, ausgeschnitten und an Harvard Microchem (Boston, MA) geschickt für die aminoterminale Sequenzanalyse, was die hierin als SEQ ID NO: 13 eingetragene Sequenz ergab. Die spektrophotometrische Analyse des mit dem exprimierten Protein assoziierten di-Eisen-Oxo-Bestandteils (Fox et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2486–2490) sowie die Identifizierung mit einem für Nicht-Häm-Eisen spezifischen Färbemittel (Leong et al., 1992, Anal. Biochem. 207: 317–320) wurden ebenfalls verwendet, um zu bestätigen, dass es sich bei dem Protein um reife Δ-9-Desaturase handelte.
Die in E. coli hergestellte, durch aminoterminale Sequenzierung bestimmte reife Δ-9-Desaturase wurde über SDS-PAGE gelaufgereinigt und in der Gelmatrix für die Herstellung eines polyklonalen Antiserums in Kaninchen an Berkeley Antibody Co. (Richmond, CA) geschickt. Die Impfungen mit dem Antigen wurden mit 200 μg Protein begonnen, gefolgt von drei Auffrischungsimpfungen von jeweils 100 μg im Abstand von drei Wochen.
Die Evaluierungen der Antikörpertiter gegen reife Δ-9-Desaturase wurden mittels Westernanalyse unter Verwendung des ECL-Detektionssystems (Amersham, Inc.; Arlington Heights, IL). durchgeführt.
Die wie oben beschrieben hergestellten polyklonalen Antiseren wurden wie folgt für die Westernanalyse verwendet: aufgereinigte oder teilweise aufgereinigte Proteine wurden einer SDS-PAGE-Analyse auf einem 10–20%igen Polyacrylamidgel (Integrated Separation Systems, Natick, MA), unter Verwendung des von Laemmli (1970, Nature 277: 680) beschriebenen Verfahrens, unterworfen. Die Proteine wurden dann auf Nitrocellulosepapier transferiert, indem ein Pharmacia Semi-Dry Blotter verwendet wurde und die unspezifischen Bindestellen wurden mit BLOTTO (5% Trockenmilch in phosphategepufferter Saline [PBS]/0,05% Tween-20) blockiert. Die Membran wurde in den polyklonalen Medien (polyklonaler Antikörper 1:1000 in BLOTTO verdünnt) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, während sie auf einem Kreisschüttler bewegt wurde. Danach wurden die Membranen dreimal für jeweils 0,5 h mit einem Überschuss an BLOTTO gewaschen, gefolgt von 0,5 h Inkubation mit einer 1:2000-Verdünnung von mit Meerrettich-Peroxidase gekoppeltem polyklonalen Ziege anti-Kaninchen-Serum (BioRad, Hercules, CA). Nach der Inkubation wurden die Blots dreimal für jeweils 10 min mit einem Überschuss BLOTTO gewaschen und dann unter Verwendung des ECL-Detektionssystems (Amersham Inc.) gemäß den Instruktionen des Herstellers entwickelt.
Δ-9-Desaturase wurde aus Maiskömern nach der Homogenisierung mit einem Warring-Mixer in 25 mM phosphatgepufferter Saline (pH 7,0), enthaltend 25 mM Natriumbisulfit und 2,5% Polyvinylpolypyrrolidon, aufgereinigt. Das rohe Homogenat wurde durch ein Seihtuch abfiltriert, für 0,25 h zentrifugiert (10000 × g) und der resultierende Überstand wurde noch einmal durch ein Seihtuch abfiltriert. In manchen Fällen wurde der Überstand durch Präzipitation mit 20% (v/v) gesättigtem Ammoniumsulfat fraktioniert. Nach der Zentrifugation wurde der resultierende Überstand dann mit 80% (v/v) Ammoniumsulfat präzipitiert. Die resultierenden Pellets wurden gründlich gegen 25 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) dialysiert. Nach der Dialyse wurde das Material durch Zentrifugation geklärt und auf eine Mono S HR10/10 Säule (Pharmacia, Inc. Piscataway, NJ) aufgebracht, die in 25 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) äquilibriert worden war. Nach gründlichem Waschen der Säule wurden die an die Säulenmatrix gebundenen Proteine unter Verwendung eines 0–500 mM NaCl-Gradienten während 1 h (2 ml/min; 2 ml-Fraktionen) eluiert. Nach der Dialyse wurde das Material durch Acyl-Trägerprotein(ACP)-Sepharose-Chromatographie und -Phenyl-Superose-Chromatographie weiter fraktioniert.
Die ACP-Sepharose-Matrix wurde, wie folgt, vorbereitet: ACP wurde von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erworben und durch wiederholte Präzipitation, gefolgt von erneutem Lösen bei pH 4,1 aufgereinigt (Rock und Cronan, 1981, Methods in Enzymology 71: 341–351). Das Anheften von ACP an Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose-4-B-Kügelchen wurde im Wesentlichen wie von Pharmacia, Inc. im Beipackzettel beschrieben, durchgeführt. Nach dem Binden und Blockieren der restlichen Bindestellen mit Glycin wurde das ACP- Sepharose-Material in eine HR-5/5-Säule (Pharmacia, Inc.) gepackt und in 25 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) äquilibriert.
Mono-S-Fraktionen, in denen Δ-9-Desaturase-Aktivität nachgewiesen wurde, wurden dann auf die ACP-Sepharose-Säule geladen, wie bereits beschrieben (McKeon und Stumpf, 1982, J. Biol. Chem. 254: 7116–7122; Thompson et al., 1991, J. Biol. Chem. 257: 12141–12147). Nach gründlichem Waschen der Säule wurden die ACP-bindenden Proteine mit 1 M NaCl eluiert.
Fraktionen mit Δ-9-Desaturase-Aktivität, die von der ACP-Sepharose-Säule erhalten wurden, wurden auf 0,4 M Ammoniumsulfat (25 mM Natriumphosphat, pH 7,0) eingestellt und auf eine Pharmacia Phenyl-Superose-Säule (HR 10/10) geladen. Die Proteine wurden eluiert, indem ein Gradient (0,4–0,0 M Ammoniumsulfat) mit 2 ml/min für 1 h gefahren wurde. Die Δ-9-Desaturase-Aktivität, bestimmt durch enzymatische und Westernanalyse, eluierte typischerweise zwischen 60- und 30 mM Ammoniumsulfat. Die Proteine wurden gründlich dialysiert und mit einem Centricon-10-Konzentrator (Amicon, Inc., Beverly, MA) einkonzentriert. Die Proben wurden dann auf eine PVDF-Membran geblottet, wie hierein beschrieben und dann für die aminoterminale Analyse an Harvard Microchem geschickt. Die aminoterminale Sequenz ist hierin als SEQ ID NO: 14 eingetragen.
Die Herstellung von Substrat für die Δ-9-Desaturase-Aktivität wurde wie folgt durchgeführt. Zellen mit einem die Acyl-ACP-Synthetase kodierenden Plasmid (Jackowski et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 2921–2928) wurden angezogen, durch Hitzeschock induziert und das darin produzierte Acyl-ACP-Synthetase-Protein wurde, wie im Wesentlichen von Rock und Cronan (1979, J. Biol. Chem. 254: 7116–7122) beschrieben, teilweise aufgereinigt. [9,10(n)-³H]Stearinsäure (spezifische Aktivität = 49 Ci/mmol) wurde nach Bedarf von Amersham Life Sciences, Inc synthetisiert. Radioaktives und nicht-radioaktives ACP-Stearat wurde, wie im Wesentlichen von Rocket al., (1981, Methods in Enzymology 71: 341–351) beschrieben, aufgereinigt.
Die Reaktionen zur Substratproduktion konnten für 16 h bei 37°C ablaufen, bevor sie beendet und aufgereinigt wurden.
Nicht-radioaktives Substrat wurde hergestellt, indem unmarkierte Stearinsäure verwendet wurde. Alle Reagenzien wurden, soweit nicht anders angegeben, von Sigma Chemical Co. erhalten.
Die Analyse der enzymatischen Aktivität der Δ-9-Desaturase wurde im Wesentlichen wie von Thompson et al., (1991, Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 2578–2582) beschrieben, durchgeführt.
Die Reaktionen wurden typischerweise in Triplikaten und mit drei verschiedenen Enzymkonzentrationen durchgeführt, um Linearität sicherzustellen. Nicht-radioaktives ACP-Stearat wurde mit ³H-Substrat versetzt und in einer Endkonzentration von 60 μM verwendet (Gesamtvolumen = 500 μl; Gesamtradioaktivität = 5,1 × 10⁴ dpm/Probe). Die Reaktionen konnten für 10 min bei 25°C ablaufen und wurden dann durch die Zugabe von 0,5 ml 12%iger (w/v) Trichloressigsäure (TCA) gestoppt. Nach Inkubation für 5 min wurde das resultierende Präzipitat zentrifugiert und es wurde ein Aliquot des verbleibenden Überstands entfernt (0,5 ml) und der pH durch Zugabe von 500 μl 1 M Tris (pH 8,0) eingestellt.
Die enzymatische Aktivität der Δ-9-Desaturase wurde durch Messen der Menge an freigesetztem ³H mittels Flüssig-Szintillations-Messung quantifiziert. Eine Aktivitätseinheit wurde als die Produktion von 1 μmol Oleat/min definiert, bestimmt durch die Freisetzung von 3H₂O (Mckeon und Stumpf, 1982, J. Biol. Chem. 257, 12141–12147). Das Testen des aus Mais aufgereinigten und des in E. coli exprimierten Δ-9-Desaturase-Proteins hat bewiesen, dass beide Protein-Präparationen die geeignete Desaturase-Enzymaktivität hatten.
BEISPIEL 4
PRODUKTION EINES SYNTHETISCHEN Δ-9-DESATURASE-TRANSITPEPTIDS (Δ-9TP) UND PRODUKTION VON DAZU SPEZIFISCHEN POLYKLONALEN ANTIKÖRPERN
Wie hierin beschrieben, wurde das MaisΔ-9-Desaturase-Gen kloniert und die Aminosäuresequenz des mutmaßlichen Transitpeptids (Δ-9TP) wurde bestimmt und hierin als SEQ ID NO: 15 eingetragen. Diese Sequenzinformation wurde für die Peptidsynthese an Bio-Synthesis, Inc. (Lewisville, TX) geschickt. Nach dem Erhalt wurde das Peptid in sterilem Wasser gelöst und Aliquots davon wurden durch Gelelektrophorese auf einem 4–27% Gradientengel (Integrated Separation Science, Inc., Natick, MA) analysiert. Durch Vergleich mit den Molekulargewichtsmarkern wurde bestimmt, dass das synthetische Δ-9TP etwa 4,0 kDa hatte. Das synthetische Δ-9TP wurde dann mit Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) konjugiert und durch BioSynthesis, Inc für die Produktion polyklonaler Antikörper in Kaninchen injiziert. Es wurde nach 10 Wochen und nach 13 Wochen nach der ersten Injektion Serum abgenommen. Die aus dieser Produktion stammenden polyklonalen Antikörper wurden Pab-TP genannt.
Die Immunospezifität von Pab-TP gegenüber dem Δ-9TP-Peptid wurde durch Western-Blot-Analyse bestimmt, wobei in E. coli produziertes Vorläufer-(pDAB432D) und reifes Δ-9-Desaturase-Protein (pDAB428) sowie das synthetisch hergestellte Δ-9TP-Polypeptid verwendet wurden. Die Proteine wurden auf ein SDS-PAGE-Gel geladen, wie hierin beschrieben und dann für die Westernanalyse, wie bereits beschrieben, auf eine PVDF-Membran geblottet.
Beim Testen der Pab-TP-Antikörper wurde beobachtet, dass die Antikörper sowohl gegenüber der Vorläufer-Δ-9-Desaturase als auch gegenüber dem Δ-9TP-Polypeptid immunologisch reaktiv waren, aber das reife Protein nicht erkannten. Diese Daten weisen darauf hin, dass die Pab-TP-Antikörper nur für den Transitpeptidanteil der Mais Δ-9-Desaturase spezifisch waren.
BEISPIEL 5
PRODUKTION UND SCREENING VON HYBRIDOMZELLLINIEN
Ungefähr 100 bis 200 μg mit KLH konjugiertes Δ-9-TP oder reife Δ-9-Desaturase wurde mit 1,0 ml eines 1:1-Gemischs aus Freund's Komplettem Adjuvans und Freund's Inkompletten Adjuvans (Sigma Chemical Co.) für die ersten Immunisierungen gemischt. Für die nachfolgende Immunisierung wurden die Proben nur mit Freund's Inkompletten Adjuvans gemischt.
Ungefähr 150 ml des Antigens wurde intraperitoneal in einzelne Balb/c-Mäuse im Abstand von zwei Wochen injiziert. Nach 5 Injektionen wurde die Immunantwort durch Westernanalyse von Seren der Maus bestimmt.
Die Injektionen wurden fortgesetzt, wenn die Immunantwort schwach war, andernfalls wurden die Mäuse für die Produktion von Hybridomzelllinien verwendet.
Das Zellfusions-Protokoll basierte auf dem von Galfre und Milstein (1981, Methods in Enzymology 73: 3–46) beschriebenen Verfahren. Nach dem Entfernen der Milz aus einer einzelnen Maus unter sterilen Bedingungen, wurden die Milzzellen getrennt und zweimal mit RPMI 1640-Medium (Cellgro^TM, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) gewaschen. Eine Lebendzellzählung wurde nach der Zugabe des gleichen Volumens an Rote-Blutzellen-Lysepuffer (Sigma, St. Louis, MO) und 2 Volumen Trypanblau (Sigma, St. Louis, MO) durchgeführt.
Myelomzellen (X63Ag8), die ursprünglich von der American Tissue Culture Collection (ATCC) erworben worden waren, wurden als die Fusionspartner verwendet.
Die Myelomzellen wurden bis zu einer Zelldichte von 7 × 10⁵ Zellen/ml angezogen. Zwei Tage vor der Zellfusion wurden die Kulturen auf 2 × 10⁵ Zellen/ml verdünnt und zweimal mit RPMI 1640-Medium gewaschen. Es wurden ungefähr 10⁸ Milzzellen und 3,5 × 10 Myelomzellen (ein Verhältnis von 3:1 Milzzellen:Myelomzellen) für jede Fusion verwendet. Diese Zellen wurden einmal zusammen gewaschen und das Waschmedium wurde verworfen. Ein ml vorgeschmolzenes PEG 4000 (5,0 mg in 2,5 ml RPMI 1640-Medium, 40°C) wurde zu dem Zellpellet gegeben. Nach 1 min wurde 20 ml RPMI 1640-Medium vorsichtig zugegeben und das Gemisch wurde bei 37°C für 20 min inkubiert. Das Medium wurde durch Zentrifugation entfernt. Die Zellpellets wurden dann in 200 ml Selektionsmedium, enthaltend: Vollmedium [500 ml RPMI 1640, 50 ml fötales Kälberserum (Sigma Chemical Co.), 6 ml 200 mM L-Glutamin (Cellgro^TM), 6 ml 100 mM Natriumpyruvat (Cellgro^TM), 5000 Einheiten Penicillin-Streptomycin (Cellgro^TM)], 10% Origen Hybridoma Cloning Factor (HCF; Origen, Fisher Scientific) und 1× HAT-Lösung (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (Cellgro^TM)) resuspendiert. Die Zellen wurden für 1 h bei 37°C inkubiert und 200 μl davon wurde in jedes Well von 96-Well-Platten verteilt. Nach 10 bis 14 Tagen wurde Medium aus jedem Well auf Antikörper-produzierende Hybridome gescreent.
ELISA-Verfahren wurden verwendet, um auf Hybridomzelllinien zu screenen, die Δ-9-TP-spezifische monoklonale Antikörper (Mab) produzieren. Der Assay beeinhaltet es, das Antigen (10–50 ng synthetisches Δ-9-TP oder von pDAB432D hergestelltes Vorläuferprotein) in 0,1 M Natriumcarbonat in Wells von Mikrotiterplatten (Dynatech Laborstories, Chantilly, Virginia) einzubringen und über Nacht bei 4°C zu inkubieren.
Danach wurde die überschüssige Antigenlösung verworfen und die Wells wurden mit 1% BSA (Rinderserumalbumin) in PBS (phosphatgepufferte Saline, Sigma) bei 37°C für mindestens 1 h blockiert. Die Blockierungslösung wurde verworfen und es wurde 100 μl Hybridomzellmedium in jedes Well gegeben.
Die Platten wurden bei 37°C für mindestens 1 h inkubiert, wonach sie 3 Mal mit Waschlösung (0,025% Tween-20 in PBS) gewaschen wurden. Ein 100 μl-Volumen einer 1:1000-Verdünnung von mit anti-IgG + IgM-Antikörpern konjugierter alkalischer Phosphatase (Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) in 1% BSA in PBS wurde zu jedem Well gegeben. Die Platten wurden bei 37°C für 1 h inkubiert und 3 Mal mit der Waschlösung gewaschen. Schließlich wurde das Phosphatase-Substrat p-NPP (para-Nitrophenylphosphat; Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD), hergestellt gemäß dem Verfahren des Herstellers, zu den Wells gegeben. Die Farbe konnte sich innerhalb von 10 bis 30 min entwickeln, bevor die A₄₀₅ nm unter Verwendung eines Plattenlesegerätes (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) bestimmt wurde.
Zelllinien, die im ELISA als positiv bestimmt wurden, wurden vermehrt, indem die Zellen in 6-Well-Platten, die frisches mit 5% HCF ergänztes Vollmedium enthielten, überführt wurden. Nach dem Festsetzen wurden die Zelllinien durch eine Standard-Westernanalyse nochmals gescreent. Typischerweise wurde 20 bis 50 ng Δ-9-Desaturase-Vorläuferprotein (pDAB432D) in jedes Well eines SDS-Polyacrylamidgels eingebracht. Nachdem die Gelelektrophorese abgeschlossen war, wurden die Proteine auf eine Hybond-ECL-Nitrocellulosemembran (Amersham, Arlington Heights, IL) elektrogeblottet und die Westernanalyse wurde, wie bereits beschrieben, durchgeführt. Das von den Test-Zelllinien erhaltene Hybridomzellmedium wurde als der primäre Antikörper verwendet. Sekundäre Antikörper waren typischerweise mit Meerrettichperoxidase konjugierte Ziege anti-Maus IgG (BioRad).
Die Detektion einer immunologischen Bindung wurde mit einem ECL-Detektions-Kit (Amersham) gemäß den Instruktionen des Herstellers, durchgeführt.
Die Antikörper von Interesse wurden mit einem Pure I Antikörper-Aufreinigungs-Kit (Sigma) aus dem Zellmedium isoliert.
Zwei aus monoklonalen Zelllinien erhaltene Antikörper (Mab-TP1 und Mab-Δ9M) wurden durch Isotypisierung weiter charakterisiert.
Der Antikörper-Isotyp wurde mit einem Maus-Isotypisierungs-Kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) klassifiziert. Mab-TP1 und Mab-Δ9M wurden jeweils als IgG 2b Kappa Leichte Kette und IgG1 Kappa Leichte Kette bestimmt.
Um die Bindespezifität der ausgewählten Mabs zu bestimmen, wurde eine Western-Blot-Analyse durchgeführt, wobei das Folgende als Antigen verwendet wurde: Kallusgewebe von schwarzem mexikanischen Mais (BMS), Typ II-Mais-Kallusgewebe, Mais-Samenextrakt, in E. coli hergestelltes Vorläuferprotein (pDAB432D) und aufgereinigtes reifes Δ-9-Desaturase-Protein. Die Blots wurden in zweifacher Ausfertigung gemacht und jeder Blot wurde mit MAb-TP1 oder MAb-Δ9M inkubiert. Das Ergebnis zeigte, dass MAb-TP1 nur das Δ-9-Desaturase-Vorläuferprotein erkennen konnte und reife Δ-9-Desaturase nicht erkannte oder nur andere Proteine in Kallusgeweben oder Samen. Diese Daten zeigten an, dass die gegen Δ-9TP erzeugten Mabs dafür spezifisch waren.
BEISPIEL 6
KLONIEREN VON GENEN AUS MONOKLONALEN ZELLLINIEN
Die Hybridomzelllinien von Interese wurden in zwei 150 ml-Flaschen mit 60 ml Hybridommedium angezogen.
Sieben Tage nach der Inokulation wurden etwa 1 × 10⁸ Zellen in 50 ml Zentrifugenröhrchen geerntet und durch Zentrifugation bei 800 rpm in einer Tischzentrifuge pelletiert.
Das Medium wurde verworfen und die Zellen wurden zweimal mit sterilem PBS gewaschen. Die Röhrchen mit den gewaschenen Zellen wurden vor der mRNA-Isolierung für 15 min auf Trockeneis gestellt.
PolyA⁺-mRNA wurde mit einem Fast-Track-mRNA-Isolierungs-Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) isoliert. Die Hybridomzellen wurden in 15 ml Lysepuffer, der darin mitgeliefert ist, resuspendiert. Die Zellen wurden geschert, indem sie durch eine sterile 60 cc Spritze mit aufgesetzter 18–21 Kanüle passiert wurden. Dieser Vorgang wurde 4 Mal wiederholt. Die Lysate wurden für 15 min bei 45°C unter Schütteln inkubiert, wonach 950 μl 5 M NaCl zugegeben wurde. Nach gründlichem Mischen wurde die Lösung weitere 4 Mal durch die Spritze passiert, um die DNA zu scheren. Dann wurde fünfundsiebzig mg Oligo-(dt)-Cellulose in Pulverform zugegeben und das Röhrchen wurde für 1 h bei Raumtemperatur vorsichtig geschüttelt. Danach wurden die Lysate bei 2000–4000 × g für 5 min in einer Tischzentrifuge zentrifugiert, die Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden zweimal mit dem mitgelieferten Bindepuffer und Niedrigsalzpuffer gewaschen. Die Pellets wurden dann in 800 μl Niedrigsalzpuffer resuspendiert. Die Cellulosesuspensionen wurden in eine Zentrifugationssäule überführt und 3 Mal mittels Zentrifugation und durch Zugabe von Niedrigsalzpuffer gewaschen. Nach der letzten Zentrifugation wurden die Pellets in 200 μl Elutionspuffer resuspendiert, die Lösung wurde durch Zentrifugation gesammelt und der Vorgang bis zu einem Gesamtvolumen von 400 μl wiederholt. Um die RNA zu präzipitieren wurden 60 μl 2 M Natriumacetat und 1000 μl absoluter Ethanol zu der gesammelten Lösung gegeben, gefolgt von Gefrieren auf Trockeneis. Darauf folgend wurden die Röhrchen für 15 min bei 14000 × g zentrifugiert und das mRNA-Pellet wurde in 20 bis 40 μl sterilfiltriertem Wasser resuspendiert.
Die oben erhaltene mRNA wurde verwendet, um cDNA durch Reverse-Transkriptase-Reaktionen unter Verwendung des cDNA-Cycling^®-Kits (Invitrogen, Carlsbad, CA) gemäß den Instruktionen des Herstellers zu produzieren. Typischerweise war das Gesamtreaktionsvolumen 20 μl, wobei 8 μl mRNA zugegeben wurden. Die Reaktionen wurden gestartet, indem mRNA und Wasser zugegeben wurden, gefolgt von Erhitzen für 10 min bei 65°C und dann gefolgt von Abkühlen für 2 min bei Raumtemperatur. Danach wurden RNase-Inhibitor, Puffer, Nucleotidtriphosphate, Natriumpyrophosphat und Reverse Transkriptase zugegeben. Die Zutaten wurden gemischt und die Röhrchen wurden wurden vor der Inkubation bei 42°C für 1 h kurz zentrifugiert. Die Röhrchen wurden dann für 2 min bei 95°C inkubiert, befor sie auf Eis gestellt wurden. Die cDNA-Synthese wurde nochmals wiederholt durch die Zugabe von weiterer Reverser Transkriptase, gefolgt von Inkubation für 1 h, gefolgt von Phenolextraktion mit 1 μl 0,5 M EDTA, pH 8,0 und 20 μl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1). Das Röhrchen wurde gevortext, zentrifugiert und die wässrige Lösung wurde abgenommen. Zu der wässrigen Lösung wurden 22 μl Ammoniumacetat und 88 μl absoluter Ethanol gegeben, gefolgt von Gefrieren auf Trockeneis und Sammeln der Pellets mittels Zentrifugation. Die Pellets wurden in sterilem Wasser gelöst und bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.
Degenerierte Primer wurden wie hierin beschrieben entworfen und synthetisiert. Die 5'-Primer wurden so entworfen, dass sie sich an das Signalpeptid der Gene der schweren (SEQ ID NO: 16) oder leichten Kette (SEQ ID NO: 17) anlagern, basierend auf den veröffentlichten Sequenzen (Kabat et al., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest; 4. Ausgabe. U. S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, NIH). Die 3'-Primer wurden so entworfen, dass sie sich an die konstante Region der Gene der schweren (SEQ ID NO: 18) und leichten Kette (SEQ ID NO: 19) anlagern.
Die Gene von Interesse wurden durch PCR erhalten. Die Reaktion (100 μl Gesamtvolumen) wurde unter Verwendung eines PCR-Core-Kits (Boehringer Mannheim, Corp., Indianapolis, IN) vorbereitet und enthielt typischerweise 0,5 μg cDNA-Matrize und 100 pm von jedem Primer. Die cDNAs der leichten und der schweren Kette wurden in separaten Experimenten amplifiziert. Die PCR- Bedingungen waren wie folgt: [95°C (1 min); 55°C (0,5 min); 72°C (0,5 min)] für 30 Zyklen, gefolgt von 1 Zyklus mit 95°C (1 min); 55°C (0,5 min); 72°C für 2 min. Die PCR-Produkte wurden durch Agarose-Gelelektrophorese und Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht. Die Amplifizierung der schweren und der leichten Ketten resultierte in DNA-Fragmenten von jeweils etwa 730 bp, die hierin entsprechend als SEQ ID NO: 24 und SEQ ID NO: 21 eingetragen sind. Die Produkte wurden dann mit NheI verdaut, in pBlueBacI (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert und mittels Standardverfahren in den DH5α-Stamm von E. coli transformiert. Die Klone wurden wiederhergestellt und mit NheI verdaut, um das DNA-Insert zu verifizieren. Die Plasmid-DNA wurde wie bereits beschrieben hergestellt, isoliert und sequenziert, wobei mehrere externe und interne Primer verwendet wurden. Die DNA, die die leichte Kette kodiert (SEQ ID NO: 50), wurde wie folgt modifiziert: ein 5'-Primer, hierin als SEQ ID NO: 20 eingetragen, wurde entworfen, um das native Maus-Signalpeptid mit einem Baculovirus gp67 und (p67) Leader (Murphy et al., 1993, Protein Expression and Purification, 4: 349–357) zu ersetzen. SEQ ID NO: 50 wurde als der 3'-Primer verwendet. Nach der Durchführung der PCR wie hierin beschrieben, wurde die DNA mit XbaI- und NotI-Enzymen verdaut und in ein Baculovirus-Transferplasmid, pAcMP3 (PharMingen, San Diego, CA) eingefügt. Das klonierte Plasmid (AcMP3/TpLCp67) wurde in den DH5α-Stamm von E. coli transformiert (Gibco, Gaithersburg, MD). Auf den Selektionsplatten wurden mehrere Klone erhalten. Die Plasmid-DNA wurde aus einem ausgewählten Klon isoliert und nochmals sequenziert.
Die Sequenz ist hierin als SEQ ID NO: 49 eingetragen. Die DNA, die die hypervariable Region des Klons kodiert, ist hierin als SEQ ID NO: 22 eingetragen. Ein Vergleich der Sequenzinformation zeigte an, dass die klonierte Kappa-Kette die echte leichte Kette des Mab-Δ-9TP1-Gens war und nicht die endogene, nichtfunktionelle leichte Kette der Myelomzellen (X63Ag8).
Die DNA, die die schwere Kette kodiert (SEQ ID NO: 24), erhalten unter Verwendung der PCR-Primer SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 18, wurde aufgereinigt, mit XbaI und NotI verdaut und in pAcMP3 ligiert. Die Sequenzierungsdaten zeigten an, dass der Klon ein echtes Gen der IgG2B schweren Kette war. Das Gen wurde nochmals mittels PCR amplifiziert, wobei Primer mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 18 verwendet wurden, um eine p67 Baculovirus-Leadersequenz hinzuzufügen, in das AcMP3 Baculovirus Transferplasmid (AcMP3/TpHCp67) kloniert und wie hierin beschrieben, in E. coli transformiert. Die Kolonien wurden gescreent und ein geeigneter Klon wurde sequenziert. Die Sequenz (SEQ ID NO: 51) passte zu der, die bereits für die Mab-TP1 schwere Kette bestimmt worden war. Vergleiche mit bekannten schweren Ketten offenbarte, dass die beiden CH1-Sequenzen identisch waren, was anzeigte, dass das klonierte Schwere-Kette-Gen eine echte IgG2B-Sequenz ist. Die Sequenz der hypervariablen Region ist hierin als SEQ ID NO: 25 eingetragen.
BEISPIEL 7
ERZEUGEN EINES REKOMBINANTEN BACULOVIRUS, DER MAB-TP1 EXPRIMIERT
SF9-Zellen (Invitrogen) wurden bei 27°C bei ½ Geschwindigkeit in Spinnerflaschen mit Sf900II (Gibco, Gaithersburg, MD) serumfreien Vollmedium, das mit Penicillin/Streptomycin/Fungizon ergänzt war kultiviert. Die Zellen wurden alle vier Tage auf 3 × 10⁵ Zellen/ml gesplittet. Die SF9-Zellen wurden mit 8 × 10⁵ Zellen/Well in eine Sechs-Well-Platte ausgesät und konnten sich für 1 h bei 27°C anheften. Das Medium wurde verworfen und die Zellen wurden zweimal mit frischem Medium ohne Antibiotika gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurde 1,5 ml frisches Medium ohne Antibiotika zugegeben. In einem Polystyrolröhrchen wurde 0,1 μg linearisierte parentale Baculovirus-DNA (Baculogold, PharMingen, San Diego, CA) mit 0,5 μg Transfervektor (AcMP3/TpLCp67- oder AcMP3/pHCp67-Plasmid) gemischt, gefolgt von dem Transfektionsmix, wie im Standard kationischen Lipisom-vermittelten Transfektionsprotokoll, das von CLONTECH (Palo Alto, CA) bereitgestellt worden war, beschrieben. Das Transfektionsmedium wurde nach vier Tagen geerntet und Proben von Medium und Zellpellet wurden durch Westernanalyse, wie hierin beschrieben, auf Proteinexpression analysiert. Eine 1:1000-Verdünnung von mit Meerrettichperoxidase konjugiertem Ziege anti-Maus FAb-spezifischen IgG (Sigma Chemical Co.) wurde mit einem ECL-Detektionskit (Amersham) verwendet. Die Ergebnisse zeigten an, dass Leichte-Kette- und Schwere-Kette-Proteine hergestellt werden konnten und durch geeignete Antikörper erkannt wurden, wodurch die Authentizität bestätigt wurde.
Um zu bestimmen, ob funktionelle Antikörper hergestellt werden könnten, wurde rekombinantes Virus, AcMP3/TpLCp67 und AcMP3/TpHCp67 in SF9-Zellen co-infiziert. Das Zellmedium wurde geerntet und als der primäre Antikörper in der Westernanalyse verwendet, wobei Vorläufer-Δ-9-Desaturase (pDAB432D) als Antigen verwendet wurde. Es wurde eine Bande mit der erwarteten Größe (42 kDa) gefunden, was anzeigte, dass der rekombinante Antikörper tatsächlich funktionell war.
BEISPIEL 8
KONSTRUKTION DES EINZELKETTEN-ANTIKÖRPER-TP1 (SCAB-TP1)-GENS
Die Erzeugung des SCAb-Tp1-Gens wurde durch eine zweistufige PCR-Reaktion unter Verwendung des PCR-Core-Kits (Boehringer Mannheim) erreicht. Die Standardreaktionen enthielten 200 μM dNTPs, 100 pM Primer, SEQ ID NO: 24 oder SEQ ID NO: 49 als Matrize (0,5 μg), PCR-Puffer und 4 Einheiten Taq-Polymerase wie bereits beschrieben. Eine Probe von jeder Reaktion wurde auf einem 1%igen Agarosegel analysiert. Dann wurden ungefähr gleiche molare Mengen der Produkte der leichten und der schweren Kette zu einer zweiten Reaktion gegeben, wobei die gleichen Bedingungen wie oben verwendet wurden, außer dass unterschiedliche Primer benutzt wurden. Die resultierenden PCR-Produkte wurden dann isoliert und mit dem Qaiex II-Kit (Qiagen) aus 1%igen Agarosegelen aufgereinigt.
Die Amplifizierung der variablen Region der schweren Kette der SEQ ID NO: 24 (welche SEQ ID NO: 25 ist) mit Primern gemäß SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 26 resultierte in einem PCR-Produkt von ~450 bp, hierin als SEQ ID NO: 29 eingetragen.
Die Amplifizierung der variablen Region der leichten Kette der SEQ ID NO: 21 (welche SEQ ID NO: 22 ist) mit Primern gemäß SEQ ID NO: 27 und SEQ ID NO: 28 resultierte in einem PCR-Produkt von ~440 bp, hierin als SEQ ID NO: 30 eingetragen. Eine Verknüpfungsreaktion mit äquimolaren Mengen an DNA gemäß SEQ ID NO: 29 und SEQ ID NO: 30 unter Verwendung von Primern gemäß SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 28 ergab das SCAb-Tp1 Genprodukt mit ~830 bp und mit einer DNA- und Aminosäuresequenz, die hierin entsprechend als SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO: 32 eingetragen ist. Die DNA wurde dann mit XbaI und NotI verdaut und in den AcMP3-Baculovirus-Transfervektor (PharMingen) ligiert. Ein positiver Klon wurde identifiziert und sequenziert (SEQ ID NO: 31), eine C-Myc-Markierung (SEQ ID NO: 33) wurde an das 3'-Ende des Gens angefügt und die p67-Leadersequenz (SEQ ID NO: 34) wurde am 5'-Ende angefügt.
Das SCAb-TP1-Gen (SEQ ID NO: 31) wurde mittels PCR rekonstruiert, wobei die oben beschriebenen Reaktionsbedingungen verwendet wurden.
Die Amplifizierung von DNA gemäß SEQ ID NO: 22 mit Primern gemäß SEQ ID NO: 35 und SEQ ID NO: 36 resultierte in einem Produkt von ~450 bp mit einer Sequenz, die hierin als SEQ ID NO: 40 eingetragen ist. Die Amplifizierung von DNA gemäß SEQ ID NO: 25 mit Primern gemäß SEQ ID NO: 37 und SEQ ID NO: 38 (TABELLE V) resultierte in einem Produkt von ~440 bp mit einer DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 41. Es wurden ungefähr gleiche Mengen von jedem Produkt (SEQ ID NO: 40 und SEQ ID NO: 41) zu einer anderen Reaktion gegeben mit Primern gemäß SEQ ID NO: 35 und SEQ ID NO: 38, was ein Produkt von ~846 bp (SEQ ID NO: 42) ergab.
Es wurde eine zusätzliche PCR-Reaktion mit DNA gemäß SEQ ID NO: 42 durchgeführt, wobei das Primerpaar mit einer DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 35 und SEQ ID NO: 39 verwendet wurde, um ein Stop-Codon am 3'-Ende des Gens anzufügen. Das ~849 bp-Produkt (SEQ ID NO: 43) wurde aus einem 1%igen Agarosegel isoliert, mit XbaI/NotI verdaut und in den AcMP3-Transfervektor (AcMP3/TPSCegt) ligiert. Ein geeigneter Klon wurde identifiziert und sequenziert.
AcMP3/TPSCegt und BacPAK6 Bsu36 I lineare parentale DNA (Clontech) wurden in SF9-Insektenzellen co-transfiziert, um rekombinantes Virus zu erzeugen. Die kationische Lipisomen-vermittelte Transfektion wurde durchgeführt wie in den in der BacPAK6-DNA enthaltenen Instruktionen beschrieben. Das Transfektionsmedium wurde nach 48 h geerntet und 0,5 ml wurde verwendet, um eine 175 cm²-Flasche mit 2 × 10 SF9-Zellen zu infizieren, um das rekombinante Virus zu amplifizieren. Die Westernanalyse wurde mit einem anti-HIS-Antikörper (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA), wie hierin beschrieben, durchgeführt und identifizierte ein ~28 kD Protein in infizierten Zellen. Das im Baculosystem hergestellte SCAb-Tp1 wurde in Western Blots mit dem nativen MAb-Δ-9TP1 verglichen, wobei in E. coli exprimierte Vorläufer-Δ-9-Desaturase (pDAB432D) als Antigen verwendet wurde. Diese Blots zeigten keinen Unterschied im Bindemuster zwischen dem nativen Mab TP1 und dem rekombinanten SCAb-TP1.
Das SCAb-TP1-Gen wurde umkonstruiert, um die Klonierung in den pDAB439-Pflanzentransformationsvektor zu erleichtern. Die PCR-Reaktionen wurden mit der DNA gemäß SEQ ID NO: 43 durchgeführt, mit Primerpaaren, die DNA-Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 44/SEQ ID NO: 46 hatten, und mit Primerpaaren, die DNA-Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 45/SEQ ID NO: 46 hatten. Die resultierenden Produkte (SEQ ID NO: 47 und SEQ ID NO: 48) wurden aus einem 1%igen Agarosegel isoliert, mit SfiI verdaut und in pDAB439 ligiert. Für jedes Produkt wurde ein geeigneter Klon identifiziert, angezogen und sequenziert, so wurden die Plasmide pDAB439/TPE enthaltend SEQ ID NO: 47 und pDAB439/TPnoE enthaltend SEQ ID NO: 48 erhalten.
Das Plasmid pDAB439 war ein 7040 Basenpaar langer Pflanzentransformationsvektor, der im Uhrzeigersinn aus den folgenden Sequenzen zusammengesetzt war. Das Plasmidrückgrat stammte aus pUC19 (Yanish-Perron et al., (1985) Gene 33: 103–119). Die Nukleotide 1 bis 2252 von pDAB439 entsprachen dem reversen Komplement der Nukleotide 435 bis 2686 von pUC19. Die Nukleotide 2253 bis 2271 von pDAB439 hatten die Sequenz TGCATGTGTT CTCCTTTTT (SEQ ID NO: 52). Die Nukleotide 2272 bis 4264 von pDAB439 waren der Mais-Ubiquitin-Promotor und das erste Intron und wurden aus genomischer DNA des Mais Genotyp B73 (Christensen et al., (1992) Plant. Mol. Biol. 18: 675–689) durch PCR amplifiziert. Die Nukleotide 4265 bis 4308 von pDAB439 hatten die Sequenz GGTACGGCCA TATTGGCCGA GCTCGGCCTC TCTGGCCGAT CCCC (SEQ ID NO: 53). Die Nukleotide 4309 bis 4576 von pDAB439 entsprachen den Nukleotiden 4420 bis 4687 von Plasmid pB1101 (Clontech, Palo Alto, CA) gefolgt von dem Linker GG als die Nukleotide 4577 und 4578 von pDAB439. Die Nukleotide 4579 bis 4743 von pDAB439 waren das reverse Komplement der Nukleotide 238–402 von pUC19. Die Nukleotide 4744 bis 4807 von pDAB439 entsprachen: GCGGCCGCTT TAACGCCCGG GCATTTAAAT GGCGCGCCGC GATCGCTTGC AGATCTGCAT GGG (SEQ ID NO: 54).
Die Nukleotide 4808–5416 von pDAB439 umfassten den doppelt verstärkten 35S-Promotor, wobei die Nukleotide 5070 bis 5416 den Nukleotiden 7093 bis 7439 aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus-Genom entsprachen (Franck et al., (1980) Cell 21: 285–294). Die Nukleotide 4808 bis 5061 von pDAB439 waren eine Vervielfältigung der Nukleotide 5068 bis 5321.
Die Nukleotide 5062 bis 5067 von pDAB439 umfassten den Linker CATCGA. Die Nukleotide 5417–5436 von pDAB439 umfassten den Linker GGGGACTCTA GAGGATCCAG (SEQ ID NO: 55). Die Nukleotide 5437 bis 5547 von pDAB439 entsprachen den Nukleotiden 167 bis 277 aus dem Maize-Streck-Virus-Genom (Mullineaux et al., (1984) EMBO J. 3: 3063–3068). Die Nukleotide 5548 bis 5764 von pDAB439 entsprachen dem modifizierten ersten Intron des Mais Alkoholdehydrogenase-Gens (Adh1-S) (Dennis et al., (1984) Nucleic Acid Res. 12: 3983–4000). Die Modifikation resultierte in dem Entfernen von 343 Nukleotiden (Basen 1313 bis 1656), wobei die Basen 1222 bis 1312 (Intron 5'-Ende) und die Nukleotide 1657 bis 1775 (Intron 3'-Ende) des Mais Adh1-S Gens beibehalten wurden. Die Nukleotide 5765 bis 5802 von pDAB439 entsprachen den Mais Streck-Virus (MSV) Nukleotiden 278 bis 312, gefolgt von der Linker-Sequenz CAG. Beide Abschnitte der Maize-Streck-Virus-, nachstehend MSV, Sequenz umfasste den nicht-translatierten Leader des MSV-Hüllprotein V2-Gens und war in dem Plasmid pDAB439 durch das modifizierte Adh1-Intron unterbrochen. Die Nukleotide 5803 bis 6359 von Plasmid pDAB439 entsprachen den Nukleotiden 29 bis 585 des Phosphinotricin-Acetyltransferase-(BAR)Gens von Streptomyces hygroscopicus (White et al., (1989) Nucleic Acids Res. 18: 1062). Um das Klonieren zu erleichtern, wurden die Nukleotide 34 und 575 der publizierten Sequenz von A und G entsprechend zu G und A geändert. Diese Sequenz diente als der selektierbare Marker in Pflanzenzellen. Die Nukleotide 6360 bis 6364 umfassten den Linker GATCT. Die Nukleotide 6365 bis 6635 von pDAB439 entsprachen den Nukleotiden 4420 bis 4683 von Plasmid pB1101 (Clontech, Palo Alto, CA) gefolgt von der Linkersequenz AGATCGC. Die Nukleotide 6636 bis 6639 von pDAB439 umfassen den Linker TCGG. Die restliche Sequenz von pDAB439 (Nukleotide 6640 bis 7040) entsprachen den Nukleotiden 284 bis 684 von pUC19.
BEISPIEL 9
ERZEUGEN VON TRANSGENEN MAISPFLANZEN, DIE DIE GENE VON INTERESSE ENTHALTEN UND EXPRIMIEREN
Typ II-Kallus-Kulturen wurden aus unreifen zygotischen Embryos mit dem Genotyp „Hi-II." (Armstrong et al., (1991) Maize Cooperation Newsletter, S. 92–93) initiiert.
Die Embryos wurden aus im Gewächshaus gezogenen Ähren von Kreuzungen zwischen Hi-II Elter A und Hi-II Elter B oder F2-Embryos, die aus einer Selbst- oder Geschwisterbestäubung einer Hi-II-Pflanze stammen, isoliert. Unreife Embryos (1,5 bis 3,5 mm) wurden auf Initiationsmedium kultiviert, enthaltend N6 Salze und Vitamine (Chu et al., (1978) The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops. Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Peking Press, 43–56) 1,0 mg/l 2,4-D, 25 mM L-Prolin, 100 mg/l Caseinhydrolysat, 10 mg/l AgNO₃, 2,5 g/l GELRITE und 20 g/l Saccharose mit einem pH von 5,8.
Die Selektion auf Typ II-Kallus erfolgte innerhalb von ca. 2–12 Wochen. Nach vier bis sechs Wochen wurde der Kallus auf Aufrechterhaltungsmedium (Initiationsmedium, in welchem AgNO₃ wegelassen wurde und L-Prolin auf 6 mM reduziert war) subkultiviert.
Die Plasmide pDAB439/TPE und pDAB439/TPnoE wurden mittels Heliumbeschuss in embryogenen Kallus transformiert. Für den Beschuss wurde 140 μg Plasmid-DNA auf 60 mg mit Alkohol gespülten, kugeligen Goldpartikeln (1,5–3,0 μm Durchmesser) präzipitiert, indem 74 μl 2,5 M CaCl₂ H₂O und 30 μl 0,1 M Spermidin (freie Base) zu 300 μl Plasmid-DNA und H₂O gegeben wurde. Die Lösung wurde sofort gevortext und die DNA-beschichteten Goldpartikel konnten absinken. Der resultierende klare Überstand wurde entfernt und die Goldpartikel wurden in 1 ml absolutem Ethanol resuspendiert. Diese Suspension wurde mit absolutem Ethanol verdünnt, um 15 mg DNA-beschichtetes Gold/ml zu erhalten. Ungefähr 600 mg embryogenes Kallusgewebe wurde über die Oberfläche von Typ II-Kallus-Aufrechterhaltungsmedium verteilt, dem, wie hierin beschrieben, Caseinhydrolysat und L-Prolin fehlte, das aber mit 0,2 M Sorbit und 0,2 M Mannit als Osmoticum ergänzt war. Nach einer 4 h Vorbehandlung wurde das Gewebe in Kulturschälchen überführt, die Beschussmedium (osmotisches Medium, das mit 20 g/l Gewebekulturagar (JRH Biosciences, Lenexa, KS) anstelle von 7 g/l GELRITE (Schweizerhall, South Plainfield, NJ) verfestigt ist), enthielten.
Der Heliumbeschuss beschleunigte die suspendierten DNA-beschichteten Goldpartikel in Richtung auf und in die vorbereiteten Gewebeziele hinein.
Die verwendete Vorrichtung war ein früher Prototyp der in US Patent # 5 141 131 beschriebenen, auf welches hierin verwiesen wird. Die Gewebe wurden mit einer rostfreien Stahlabschirmung bedeckt (104 μm Öffnungen) in die Vorrichtungskammer unter ein partielles Vakuum mit 25 Inch Hg eingebracht. Die DNA-beschichteten Goldpartikel wurden ferner vor dem Beschuss 1:1 mit absolutem Ethanol verdünnt und wurden in Richtung der Kallusziele unter Verwendung eines Heliumdrucks von 1500 psi vierfach beschleunigt, wobei mit jedem Beschuss 20 μl der DNA/Gold-Suspension eingebracht wurden. Sofort nach dem Beschuss wurde das Gewebe für eine 16–24 h Erholungsphase in osmotische Medien überführt. Danach wurde das Gewebe in kleine Stücke geteilt und in Selektionsmedium überführt (Aufrechterhaltungsmedium ohne Caseinhydrolysat und L-Prolin, aber mit 30 mg/l BASTA (Agrevo)). Drei Monate lang wurden alle vier Wochen wahllos Gewebestücke in frisches Selektionsmedium überführt. Nach 7 Wochen und bis zu 22 Wochen wurden Kallusabschnitte, die gegenüber wachstumsinhibiertem Gewebe als proliferierend identifiziert wurden, entfernt und isoliert. Das resultierende BASTA- resistente Gewebe wurde zweiwöchentlich auf frisches Selektionsmedium subkultiviert. Nach den Gaschromatographie/Fettsäuremethylester-, nachstehend GC/FAME, Analysen, wie hierin beschrieben, wurden positive transgene Linien identifiziert und in Regenerationsmedium überführt.
Die Regeneration wurde durch Überführen des Kallusgewebes in Cytokinin-basiertes Induktionsmedium überführt, welches auf Murashige- und Skoog-Salzen, nachfolgend MS-Salzen, und Vitaminen (Murashige und Skoog, (1962) Physiol. Plant. 15: 473–497) 30 g/l Saccharose, 100 mg/l Myoinositol, 30 g/l Mannitol, 5 mg/l 6-Benzylaminopurin, nachfolgend BAP, 0,025 mg/l 2,4-D, 30 mg/l BASTA und 2,5 g/l GELRITE (Schweizerhall) mit pH 5,7 bestand. Die Kulturen wurden für eine Woche schwacher Beleuchtung (125 Foot-candles) ausgesetzt, gefolgt von einer Woche in starker Beleuchtung (325 Foot-candles). Nach einer zweiwöchigen Induktionsperiode wurde das Gewebe nicht-selektiv in hormonfreies Regenerationsmedium, das identisch mit dem Induktionsmedium war, außer dass es kein 2,4-D und BAP beinhaltete, überführt und wurde unter starker Beleuchtung gehalten. Es wurden kleine Pflänzchen (1,5–3 cm) entfernt und in 150 × 25 mm Kulturröhrchen mit SH-Medium (SH-Salze und Vitamine (Schenk und Hildebrandt, (1972) Can. J. Bot. 50: 199–204), 10 g/l Saccharose, 100 mg/l myo-Inositol, 5 ml/l FeEDTA und 2,5 g/l GELRITE (Schweizerhall), pH 5,8) gesetzt. Die Pflänzchen wurden dann, sobald sie Wachstum zeigten und ein ausreichendes Wurzelsystem entwickelten, im Gewächshaus in 10 cm-Töpfe überführt, die ungefähr 0,1 kg METRO-MIX 360 (The Scotts Co. Marysville, OH) enthielten. Sie wurden mit einer 16 h Lichtdauer, ergänzt mit einer Kombination aus Hochdrucknatrium- und Halogen-Metalldampflampen angezogen und wurden nach Bedarf mit einer Kombination aus drei unabhängigen Peters-Excel-Düngemittel-Formulierungen (Grace-Sierra Horticultural Products Company, Milpitas, CA) bewässert. Im 3-5-Blattstadium wurden die Pflanzen in Fünf-Gallonen-Töpfe mit etwa 4 kg METRO-MIX 360 überführt. Die primären regenerierten Pflanzen wurden nach zusätzlichen 6–10 Wochen in den Fünf- Gallonen-Töpfen selbst- oder geschwisterbestäubt oder entweder mit Auslese-Reinzucht-Pflanzen oder mit transgenen Pflanzen ausgekreuzt. R1-Samen wurden 40 bis 45 Tage nach der Bestäubung gesammelt.
Embryogenes Kallusmaterial, das die Gene von Interesse enthielt, wurde, wie hierin beschrieben, erhalten. Die fortgesetzte Produktion von somatischen Embryos, die einen großen Anteil an dem embryogenen Kallus ausmachen, wurde durchgeführt, indem das Kallusgewebe alle zwei Wochen überführt wurde. Während die somatischen Embryos weiter proliferierten, blieben sie für gewöhnlich aufgrund der andauernden Gegenwart von 2,4-D im Kulturmedium in einem Frühstadium der Embryonalentwicklung. Aus den somatischen Embryos konnten Pflänzchen regeneriert werden, wenn der Kallus dem hierin beschriebenen Regenerationsverfahren unterworfen wurde. Während der Regeneration bildeten die somatischen Embryos Wurzeln und einen Schössling und stellten anschließend die Entwicklung als ein Embryo ein.
Die somatischen Embryos wurden so gemacht, dass sie sich als Samenembryos entwickelten, indem embryogener Kallus auf MS-Medium mit 6% Saccharose (w/v) angezogen wurde. Der Kallus wurde für 7 Tage angezogen und dann wurden die somatischen Embryos einzeln in MS-Medium mit 6% Saccharose und 10 μM Abscisinsäure, nachfolgend ABA, transferiert.
BEISPIEL 10
SOUTHERN ANALYSE VON TRANSFORMIERTEM KALLUS UND PFLANZENGEWEBEN
BASTA-resistente Linien, die mit verschiedenen Plasmiden transformiert waren, wurden durch Southern-Analyse charakterisiert, indem eine DNA-Sonde, die spezifisch für die kodierende Region des Gens von Interesse war, verwendet wurde, um das Vorhandensein des Transgens zu bestätigen. Es wurde DNA aus Blattmaterial analysiert.
Blattmaterial aus Pflanzen wurde im 6-8-Blattstadium geerntet. Die genomische DNA wurde aus lyophilisiertem Gewebe, wie von Saghai-Maroof et al., ((1984) Proceed. Nat. Acad. Sci. USA 81: 8014–8018) beschrieben, hergestellt. Acht μg von jeder DNA wurde mit dem/den für jedes Plasmidkonstrukt spezifischen Restriktionsenzym(en) verdaut, wobei die vom Hersteller (Bethesda Research Laborstory) vorgeschlagenen Bedingungen verwendet wurden, und wurde durch Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt. Die DNA wurde dann auf Nylonmembranen geblottet, wie von Southern ((1975) J. Mol. Biol., 98: 503–517) beschrieben. Die radioaktive Sonde wurde dann mit der genomischen DNA auf den Blots in 45 ml Minimal-Hybridisierungspuffer [10% Polyethylenglycol, 7% SDS, 0,6 × SSC, 10 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA und 100 μg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA] über Nacht bei 60°C hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Blots bei 60°C in 0,25 × SSC und 0,2% SDS für 45 min gewaschen, trocken geblottet und XAR-5-Film (Kodak) auf zwei Verstärkungsfolien (DuPont) exponiert.
Alle analysierten Linien zeigten mindestens eine Kopie des Fragments mit der erwarteten Größe, was auf eine vollständige Kopie des SCAb-TP1-Gens hinwies.
BEISPIEL 11
SCAB-TP1-EXPRESSION IN MAIS
Für die RNA-Isolierung wurde das Gewebe mit einem Bessman-Gewebe-Pulverisiergerät (Spectrum Medical Industries, Houston, TX) pulverisiert. Die RNA wurde aus dem gefrorenen Pulver mit RNEASY Pflanzen-Minikits (Qiagen) gemäß den Instruktionen des Herstellers extrahiert. Für die Expressionsanalyse (Northern Analyse) wurde 5 μg RNA pro Probe durch Elektrophorese in nicht- denaturierenden 10 mM NaPO₄ pH 6,8, 1,0%igen Agarosegelen fraktioniert. Das Probenvolumen, das die RNA enthielt, wurde mit einer SAVANT SpeedVac (Savant Instruments, Inc., Farmingdale, NY) getrocknet, in 8 μl Wasser resuspendiert und mit einem gleichen Volumen an 2× Probenpuffer (40 mM NaHPO₄, pH 6,8; 10 mM EDTA, 6% Formaldehyd, 50% Formamid) denaturiert und für 15 min auf 68°C erhitzt. Die denaturierte Probe wurde auf Eis gekühlt und es wurde 4 μl Ladepuffer (50% Glycerin, 10 mM EDTA, 5 mM NaPO₄, 0,25 Bromphenolblau) zugegeben. Die Proben wurden auf das Gel geladen und für 3 h bei 60 V in 10 mM Phosphatpuffer elektrophoretisch aufgetrennt. Die RNA wurde aus dem Gel durch Kapillartransfer mit sterilem Wasser als Transfermedium auf eine GENESCREEN PLUS Membran (NEN Research Products, Boston, MA) überführt. Nach dem Transfer wurde die RNA mit dieser Membran durch UV kreuzvernetzt (STRATALINKER, Stratagene Cloning Systems, Inc. La Jolla, CA).
Der RNA-Blot wurde für 3 h bei 42°C in Hybridisierungspuffer (50 mM Natriumphosphat, pH 6,5, 0,8 M Natriumchlorid, 1 M EDTA, 0,2% Natriumdodecylsulfat, 0,05% Rinderserumalbumin, 0,05% Ficoll Typ40, 10% Dextransulfat) vorhybridisiert. Eine Hybridisierungssonde, die spezifisch war für den Antikörper, der gegen das Transitpeptid gemacht worden war, wurde mit 50 μCi aus α-³²P-dCTP (NEN Research Products) unter Verwendung von READY-TO-GO Markierungs-Kügelchen (Pharmacia, Piscataway, NJ) gemäß den Instruktionen des Herstellers markiert und über NUCTRAP-Säulen (Stratagene) aufgereinigt. Die markierte Sonde wurde durch Kochen für 5 min denaturiert, für 5 min auf Eis gekühlt und direkt zu den vorhybridisierten Blots gegeben. Die Hybridisierung wurde in SEAL-A-MEHL-Beuteln (Dazey Corp., Industrial Airport, KA) für 16 h bei 42°C durchgeführt. Die Blots wurden 6 Mal für jeweils 0,5 h mit einem großen Überschuss an vorgewärmter Waschlösung (20 mM NaPO₄, pH 6,5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0,1% Natriumdodecylsulfat) gewaschen. Für die Analyse wurde der Blot einer Phosphorlagerplatte exponiert, auf einem Molecular Dynamics Personal PHOSPHORIMAGER (Molecular Dynamics, Inc., Sunnyvale, CA).
Für die Analyse von R₀-Pflanzen wurde Blattgewebe (~0,2 g) von Pflanzen geerntet, die mit pDAB439/TPE und pDAB439/TPnoE transformiert worden waren. Die RNA wurde extrahiert, fraktioniert, auf Membranen geblottet und hybridisiert, wie oben beschrieben. Die Linien, die im Kallusstadium positiv für transgene RNA waren, wurden als positiv im R₀-Pflanzenstadium identifiziert. Diese Daten zeigten an, dass das Transgen integriert worden war und mRNA, die zu dem Gen von Interesse gehörte, exprimierte.
Um die Proteinexpression zu untersuchen, wurde SCAb-TP1-Protein unter Verwendung des Ni-NTA-Kits aus transformiertem Mais-Kallusgewebe aufgereinigt. Das Kallusgewebe (0,75–1,45 g) wurde mit 400–600 μl 1 × Bindepuffer mit 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) mit einer Plastikgewebemühle und einer kleinen Menge Sand gemahlen. Das Lysat wurde dann für 10 min in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, um Zelltrümmer zu pelletieren. Der Überstand wurde durch einen 0,2 μm Spritzenfilter abfiltriert und auf eine Ni-NTA-Zentrifugationssäule (Qiagen) aufgebracht. Die Säule wurde mit 600 μl Waschpuffer gewaschen und mit 400 μl Elutionspuffer eluiert. Das eluierte Material wurde dann mit Aceton präzipitiert oder mit einer 3000 mw Micro-Zentrifugationssäule (Amicon, Beverly, MA) einkonzentriert und der Puffer wurde mit 10 mM Phosphat ausgetauscht.
Das einkonzentrierte Protein wurde dann in 4–20%igen SDS-PAGE-Gelen (Integrated Separation Systems, Natick, MA) aufgetrennt und die Westernanalyse wurde, wie hierin beschrieben, durchgeführt. Es wurde eine MRGS 6 × HIS Mab-Präparation (Qiagen) als primärer Antikörper verwendet. Es wurden nachweisbare Level an SCAb-TP1-Protein in den mit pDAB439/TPE und pDAB439/TPnoE transformierten Linien gefunden.
BEISPIEL 12
EFFEKT DER SCAB-TP1-EXPRESSION AUF ENDOGENE Δ-9-DESATURASE-LEVEL IN TRANSFORMIERTEM MAIS

Die Effekte der SCAb-TP1-Proteinexpression auf die endogenen Δ-9-Desaturase-Level wurde unter Verwendung von transformierten Mais-Kallusgeweben mittels Westernanalyse, wie hierin beschrieben, untersucht. Polyklonale Antikörper, die gegen reife Δ-9-Desaturase immunologisch reaktiv waren, wurden als der primäre Antikörper verwendet. Die Westerndaten zeigten an, dass die Expression von SCAb-TP1 in Kallusgewebe eine etwa 70%ige Reduktion in den Δ-9-Desaturase-Leveln hervorrief, verglichen mit Kontroll-Kalluslinien, die mit nicht-verwandten Genen transformiert worden waren. Die Proteinanalyse von Blattgeweben von R₀-Pflanzen zeigte auch reduzierte Level (10 bis 50%) an Δ-9-Desaturase, verglichen mit Kontrolllinien. Diese Daten zeigten eine direkte Korrelation zwischen dem Vorhandensein und der Expression des Transgens und reduzierten Δ-9-Desaturase-Leveln (Tabelle 1). Tabelle 1. Vergleich von Δ-9-Desaturase-Leveln in Maislinien, die mit pDAB439/TPE und pDAB439/TPnoE transformiert worden waren, bezüglich Kontrollen

Linie	SCAb-TP1 Protein	Reduzierte Δ-9-Desaturase
TPE-04	+	yes
TPE-05	+	yes
TPE-06	+	yes
TPE-07	+	yes
TPE-08	nd	yes
TPE-09	+	yes
TPE-10	+	yes
TPnoE-01	nd	yes
TPnoE-04	nd	yes
TPnoE-05	+	yes
TPnoE-07	+	yes
TPnoE-11	+	yes
TPnoE-12	nd	yes

nd: nicht bestimmt

Fruchtbare Pflanzen, die pDAB463/TPnoE enthielten, wurden mit Reinzucht-CQ715 HO-I (Mycogen Seeds, San Diego, CA) als Pollendonatoren gekreuzt und es wurden Samen erhalten. Diese Samen wurden eingepflanzt und es wurden molekulare Analysen mit Blattproben durchgeführt, um das Vorhandensein von SCAB-TP1-Gen, SCAB-TP1-Protein und deren Effekt auf die Δ-9-Desaturase-Level festzustellen.
Es wurde herausgefunden, dass die Reduktion von Δ-9-Desaturase-Leveln (40–70%) mit dem Vorhandensein des Transgens und dem davon exprimierten SCAB-TP1 korrelierte.
BEISPIEL 13
ANTIKÖRPER-VERMITTELTE HERUNTERREGULIERUNG VON MAIS PALMITOYL-ACP-THIOESTERASE (PTE)
Gegen die Chloroplasten-Transitpeptiddomäne des PTE-Proteins gerichtete Antikörper wurden in diesem Beispiel verwendet, um den Import von PTE in die Chloroplasten, wo die frühen Schritte der Fettsäurebiosynthese stattfinden, zu blockieren.
A. Analyse von PTE-Transitpeptiden aus verschiedenen Mais-Genotypen
Für die erfolgreiche Verwendung Antikörper-vermittelter Herunterregulierung ist es erforderlich, dass die Aminosäuresequenz des Transitpeptids zwischen den Maislinien, die für die Transformation und die Regeneration im Labor verwendet werden und den Auswahl-Maislinien, in die die Gene für die kommerzielle Entwicklung eingefügt werden, stark konserviert sind.
Die DNA-Sequenzen, die die Transitpeptiddomäne von PTE kodieren, wurden aus acht verschiedenen Maissorten amplifiziert: CS608, CQ806, HOI, Hill, OQ414, H0601, 2XH753 und 2XH755.
Die abgeleiteten Proteinsequenzen waren zwischen allen Linien fast identisch und unterschieden sich nur duch das Fehlen von einer oder zwei Aminosäuren der 90 Aminosäuren, die das Transitpeptid umfasst. Diese theoretischen Aminosäuresequenzen wurden verwendet, um eine Region für das Antikörper-Targeting zu entwerfen.
B. Entwerfen von Antikörpern die gegen das Mais-PTE-Transitpeptid gerichtet sind
Die Aminosäuresequenz des PTE-Vorläuferproteins aus der Maislinie CS608 wurde analysiert, um eine Region des Transitpeptidanteils zu finden, die eine hohe Antigenität und Oberflächenwahrscheinlichkeit aufweist. Es wurde eine Sequenz (PGSPAPAAPKNGLGERPESLDVRG) (SEQ ID NO: 56) ausgewählt, die sich über die Aminosäurereste Nummer 12 bis 35 erstreckte. Die Sequenzinformation wurde für die Peptidsynthese und die Produktion polyklonaler Antikörper in zwei Kaninchen an Zymed Laborstories Inc. geschickt.
C. Baculovirusexpression des PTE-Vorläuferproteins
Das Gen, das für den PTE-Vorläufer (einschließlich Signalpeptid) kodierte, wurde in den Baculovirus-Transfervektor pAcSG2 (PharMingen, San Diego, CA) kloniert. Es wurde eine Co-Transfektion in einer 6-Well-Platte mit 6 × 10⁵ Sf9-Zellen/Well durchgeführt.
BacPAK6 lineare DNA (Clontech, Palo Alto, CA) wurde als parentale DNA bei der Co-Transfektion verwendet. Bacfectin-Reagenz wurde verwendet, um die Co-Transfektion zu erleichtern (in der BacPAK6-DNA enthalten). Das Transfektionsmedium wurde 3 und 6 Tage nach der Transfektion geerntet. Die Sf9-Zellen (6 × 10⁵ Zellen/Well) wurden mit 100 μl Transfektionsmedium infiziert. Nach 3 Tagen wurden die Zellen geerntet und es wurden Western Blots durchgeführt. Die Blots wurden mit polyklonalem Kaninchen-Antikörper, der gegen das reife PTE-Protein oder gegen das Transitpeptid des Vorläuferproteins (Kaninchen 1 oder Kaninchen 2) erzeugt worden war, hybridisiert. Der Blot, der mit Antikörpern gegen das reife Protein hybridisiert worden war, zeigte 2 verschiedene Banden für PTE mit oder ohne das Transitpeptid. Die Blots, die mit Antikörpern gegen das Transitpeptid alleine hybridisiert worden waren, detektierten nur die Form mit höherem Molekulargewicht vom PTE mit dem Transitpeptid.
Die Produktion von Hybridomzelllinien, die Antikörper produzieren, die an das PTE-Vorläuferprotein binden, die Klonierung der Antikörpergene und Einzelketten-Antikörpergene und die Transformation in Mais kann wie in den vorhergehenden Beispielen 5 bis 9 beschrieben durchgeführt werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nukleinsäurekonstrukt, umfassend in 5' nach 3'-Richtung der Transkription, einen in einer Pflanzenzelle funktionellen Promotor, eine Nukleinsäuresequenz, welche für einen Antikörper oder ein Fragment hiervon kodiert, wobei der Antikörper oder das Fragment hiervon die Fähigkeit besitzt, an ein Transitpeptid zu binden, welches ein mit dem Transitpeptid assoziiertes Passagierprotein zu einer Organelle einer Pflanzenzelle dirigiert, und eine in einer Pflanzenzelle funktionelle Terminationsregion.
Verfahren zur Verringerung der stationären Menge eines Passagierproteins in einer Pflanzenzelle, welches das Einbringen eines Nukleinsäurekonstrukts nach Anspruch 1 in die Pflanzenzelle umfasst.
Pflanzenzelle, umfassend ein Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1.
Pflanzenzelle nach Anspruch 3, wobei die stationäre Menge eines darin gefundenen Passagierproteins durch das Verfahren nach Anspruch 2 verringert worden ist.
Pflanze oder Nachkommenschaft hiervon, welche aus der Pflanzenzelle nach Anspruch 2 oder 3 erhalten wird.
Konstrukt, Verfahren, Zelle, Pflanze oder Nachkommenschaft nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Pflanzenzelle zweikeimblättrig ist.
Konstrukt, Verfahren, Zelle, Pflanze oder Nachkommenschaft nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Pflanzenzelle einkeimblättrig ist.
Konstrukt, Verfahren, Zelle, Pflanze oder Nachkommenschaft nach Anspruch 7, wobei die Pflanze eine Maispflanze ist.
Konstrukt, Verfahren, Zelle, Pflanze oder Nachkommenschaft nach Anspruch 8, wobei das Transitpeptid das Transitpeptid für Stearoyl-ACP-Δ9-Desaturase aus Mais oder Palmitoyl-ACP-Thioesterase aus Mais ist.
Konstrukt, Verfahren, Zelle, Pflanze oder Nachkommenschaft nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Organelle aus der Gruppe bestehend aus Chloroplast, Amyloplast, Chromoplast, Leukoplast, Mitochondrien und dem Zellkern ausgewählt ist.
Konstrukt, Verfahren, Zelle, Pflanze oder Nachkommenschaft nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Antikörper oder das Fragment hiervon ein einzelkettiges Antikörpermolekül ist.
Konstrukt, Verfahren, Zelle, Pflanze oder Nachkommenschaft nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Epitop mindestens 6 Aminosäuren umfasst, wobei die Aminosäuren in dem Transitpeptid kontinuierlich aneinander gereiht sind.
Konstrukt, Verfahren, Zelle, Pflanze oder Nachkommenschaft nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Nukleinsäuresequenz aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 43 und SEQ ID NO: 48 ausgewählt ist.
Hybridomzelllinie mit der Bezeichnung 10E10, welche die ATCC-Bezeichnung HB-12544 besitzt.
Antikörper, produziert von der Hybridomzelllinie nach Anspruch 14.