CN117247962A - 棉花引导蛋白GhDIR5的功能及其在棉酚合成中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了GhDIR5基因及其在改良左旋棉酚生物合成中的应用。具体地，本发明对棉花GhDIR5基因进行功能鉴定，通过分子生物学及转基因技术调控棉花GhDIR5基因的表达量，实现了对左旋棉酚生物合成的调节，获得了左旋棉酚含量显著下降的基因编辑棉花。本发明公开了棉花GhDIR5蛋白的功能与用途，尤其在控制棉酚生物合成、改善棉籽营养价值、且基本不影响抗虫性能方面，具有积极作用，具有广泛的应用前景。

Description

棉花引导蛋白GhDIR5的功能及其在棉酚合成中的应用
技术领域
本发明涉及植物学领域，更具体地涉及棉花引导蛋白GhDIR5的功能及其在棉酚合成中的应用。
背景技术
棉花隶属于锦葵科(Malvaceae)棉属(Gossypium)，是世界范围内广泛种植的经济作物，其棉纤维是纺织工业的主要原料，棉籽中含有丰富的蛋白质(23％)和油脂(21％)等，大约每年可以满足5亿人对蛋白质的需求。然而，棉籽中积累的棉酚限制了棉籽的利用。棉酚是棉花重要的倍半萜类植保素，由两分子半棉酚氧化偶联生成。由于C-C键旋转的阻碍作用，棉酚具有两种不同性质的轴手性异构体：(+)-棉酚(右旋棉酚)和(-)-棉酚(左旋棉酚)。(+)-棉酚和(-)-棉酚具有不同的毒性和生物活性，虽然二者在植物防御中的作用几乎相同，但只有(-)-棉酚具有抗精子形成和抗病毒活性，并且具有治疗各种癌症的潜力。且(-)-棉酚对非反刍动物的毒性比(+)-异构体更大，因此(-)-棉酚的毒性限制了棉籽油和蛋白质在食品和饲料中的使用。自然界中棉酚以对映体混合物的形式存在，不同环境条件、不同植物组织中棉酚的总浓度存在显著差异。在商品棉品种中，(+)-棉酚和(-)-棉酚的比例大约在3:2和2:3之间变化，在一些栽培品种中，如Texas Marker 1，(+)-棉酚和(-)-棉酚的比例约为1:1(实际53:47)，相比之下，一些原产于巴西的棉花品种的(+)-棉酚和(-)-棉酚含量比例高达96:4。本领域目前迫切需要开发一种可有效降低棉花中左旋棉酚含量的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供棉花引导蛋白GhDIR5的功能及其在棉酚合成中的应用。
本发明的第一方面，提供了一种GhDIR5抑制剂的用途，所述的GhDIR5抑制剂用于选自下组的一种或多种用途：
(a)用于抑制调控(-)-棉酚(左旋棉酚)生物合成的试剂或组合物；和
(b)用于降低棉籽毒性，从而改善棉籽营养价值。
在另一优选例中，所述的植物选自下组：锦葵科植物。
在另一优选例中，所述的植物选自下组：棉花。
在另一优选例中，所述的用途基本不影响棉花的抗虫性能。
在另一优选例中，所述的GhDIR5基因包括野生型GhDIR5基因和突变型GhDIR5基因。
在另一优选例中，所述的突变型包括突变后编码蛋白的功能未发生改变的突变形式(即功能与野生型编码蛋白相同或基本相同)。在另一优选例中，所述的突变型GhDIR5基因编码的多肽与野生型GhDIR5基因所编码的多肽相同或基本相同。
在另一优选例中，所述的突变型GhDIR5基因包括与野生型GhDIR5基因相比，同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％)的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的突变型在基于SEQ ID No.:2或4所示的多肽的基础上，具有选自下组关键的三个位点中1、2或3个：98A、100M或100L、167L或167F。
在另一优选例中，所述的突变型在基于SEQ ID No.:2或4所示的多肽的基础上，具有以下关键的三个位点：98A、100M、167L或167F。
在另一优选例中，所述的突变型在基于SEQ ID No.:2或4所示的多肽的基础上，具有以下关键的三个位点：98A、100M、167L。
在另一优选例中，所述的突变型GhDIR5基因包括在野生型GhDIR5基因的5＇端和/或3＇端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的GhDIR5基因包括A亚组GhDIR5基因和D亚组GhDIR5基因。
在另一优选例中，所述的基因包括基因组DNA、cDNA、和/或mRNA。
在另一优选例中，所述的GhDIR5基因的cDNA序列如SEQ ID NO.:1或3所示。
在另一优选例中，所述的GhDIR5基因的编码蛋白如SEQ ID NO.:2或4所示。
在另一优选例中，所述的GhDIR5基因来源于植物，较佳地来源于锦葵科植物，更佳地来源于棉属植物，最佳地来源于陆地棉。
在另一优选例中，所述GhDIR5基因为来源于陆地棉A亚组或D亚组的基因。
本发明的第二方面，提供了一种抑制左旋棉酚生物合成的方法，所述方法包括以下步骤：在所述植物中，抑制GhDIR5基因的表达或抑制GhDIR5蛋白的活性。
在另一优选例中，所述方法包括对植物的内源GhDIR5基因进行敲除。
在另一优选例中，所述方法包括向植物中导入抑制GhDIR5基因表达的外源核苷酸序列。
在另一优选例中，所述外源核苷酸序列包括RNAi干扰序列。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
(a)提供携带GhDIR5基因RNAi干扰序列的表达载体的农杆菌；
(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使GhDIR5基因RNAi干扰序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(c)选择已转入GhDIR5基因RNAi干扰序列的植物细胞或组织或器官；和
(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生为植株。
本发明的第三方面，提供了一种促进左旋棉酚生物合成的方法，包括步骤：
(a)将外源的构建物导入植物细胞，其中所述的构建物含有外源的GhDIR5基因序列、促进GhDIR5基因表达的外源核苷酸序列，从而获得导入外源构建物的植物细胞；
(b)将上一步骤获得的所述导入外源构建物的植物细胞，再生成植株：和
(c)任选地对所述再生的植株进行鉴定，从而获得左旋棉酚生物合成上调的植物。
在另一优选例中，所述的左旋棉酚生物合成上调的植物是指与亲本植物相比，左旋棉酚生物合成量增加改变。
在另一优选例中，所述外源的GhDIR5基因序列还包含与ORF序列操作性连接的启动子和/或终止子。
在另一优选例中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子。
在另一优选例中，所述的外源核苷酸序列包括干扰所述GhDIR5基因表达的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的外源核苷酸序列包括RNA干扰序列。
本发明的第四方面，提供了一种GhDIR5基因或其编码蛋白的调控剂的用途，用于选自下组的一种或多种用途：
(a)用于制备促进或抑制左旋棉酚生物合成的试剂或组合物；和
(b)用于增加或降低棉籽毒性，从而改善棉籽营养价值。
在另一优选例中，所述的用途基本不影响棉花的抗虫性能。
在另一优选例中，所述的组合物包括农用组合物。
在另一优选例中，所述的调控剂包括促进剂、抑制剂。
在另一优选例中，所述的调控剂为抑制剂，并且所述的调控是指抑制左旋棉酚生物合成。
在另一优选例中，所述的调控剂为促进剂，并且所述的调控是指促进左旋棉酚生物合成。
在另一优选例中，所述的调控剂包括小分子化合物、或核酸类物质。
在另一优选例中，所述的核酸类物质选自下组：miRNA、shRNA、siRNA、或其组合。
本发明的第五方面，提供了一种转基因植株，所述转基因植株中敲低和或敲除GhDIR5基因。
在另一优选例中，所述转基因植株为转基因棉花植株。
在另一优选例中，所述的转基因植株用于抑制左旋棉酚生物合成、改善棉籽营养价值、且基本不影响抗虫性能。
本发明的第六方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有表达外源GhDIR5蛋白的表达盒，或含有携带所述外源GhDIR5蛋白的表达盒的载体。
在另一优选例中，所述的GhDIR5蛋白包括野生型和突变型的GhDIR5蛋白(如SEQID No:2或4，或其突变蛋白)。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：植物细胞、原核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括锦葵科植物细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括棉属植物细胞。
本发明的第七方面，提供了一种遗传工程化的植物细胞，所述植物细胞为来自锦葵科植物的植物细胞，并且所述的遗传工程化的植物细胞中原来的内源性的GhDIR5基因被敲除或敲低。
在另一优选例中，所述的遗传工程化的植物细胞具有下降的左旋棉酚的合成能力。
本发明的第八方面，提供了一种改良植物品种的方法，包括步骤：
(a)将第一表达盒导入植物细胞或植物组织，从而获得导入所述第一表达盒的植物细胞或植物组织，其中，所述的第一表达盒为表达外源GhDIR5的表达盒；和
(b)将所述导入了所述第一表达盒的植物细胞或植物组织，再生成转基因植株，其中，所述的植株具有增强的左旋棉酚的合成能力。
在另一优选例中，所述的植物为锦葵科植物，更佳地来源于棉花，最佳地来源于陆地棉。
在另一优选例中，所述的第一表达盒含有用于表达GhDIR5蛋白的cDNA序列或基因组序列。
本发明的第九方面，提供了一种改良植物品种的方法，包括步骤：
(S1)将基因编辑表达盒导入植物细胞或植物组织，从而获得导入所述基因编辑表达盒的植物细胞或植物组织，其中，所述的基因编辑表达盒用于表达靶向内源GhDIR5的gRNA和/或Cas9蛋白；和
(S2)将导入了所述基因编辑表达盒的植物细胞或植物组织，再生成转基因植株，其中，所述的植株具有下降的左旋棉酚的合成能力，
其中，所述的植物细胞或植物组织为来自锦葵科植物的植物细胞或植物组织。
在另一优选例中，在步骤(S1)中，通过农杆菌感染将所述基因编辑表达盒导入植物细胞或植物组织。
在另一优选例中，在步骤(S1)中，用农杆菌感染棉花的外植体。
在另一优选例中，所述的转基因植株中，在选自下组的植物部位中左旋棉酚的合成能力是下降的，或左旋棉酚的水平是下降的、或具有升高的右旋棉酚/左旋棉酚的比值。
本发明的第十方面，提供了一种体外合成棉酚的方法，包括步骤：
(a)在GhDIR5蛋白和漆酶存在下，对半棉酚进行催化反应，从而形成棉酚。
在另一优选例中，所述的棉酚中包括右旋棉酚和左旋棉酚。
在另一优选例中，所述的棉酚中右旋棉酚和左旋棉酚的比例约为(50±5)：(50±5)。
本发明的第十一方面，提供了一种左旋棉酚生物合成相关多肽，所述多肽具有调控左旋棉酚生物合成的功能，并且，所述的多肽选自下组：
(i)SEQ ID NO.:2或4所示氨基酸序列的多肽；
(ii)将(i)所示的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有调控左旋棉酚生物合成功能的多肽；
(iii)氨基酸序列与(i)所示的任一多肽的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)，具有调控左旋棉酚生物合成功能的多肽。
在另一优选例中，所述的突变型在基于SEQ ID No.:2或4所示的多肽的基础上，具有选自下组关键的三个位点中1、2或3个：98A、100M或100L、167L或167F。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为显示通过转录组分析及VIGS筛选到芳香化酶GhDIR5。a,棉酚由两分子半棉酚生成。右旋棉酚由已经报道的GhDIR4控制生成，左旋棉酚生成相关引导蛋白未知。b,GhDIR5与棉酚途径已知细胞色素P450基因CYP71BE79的表达特征相关性分析。纵坐标代表相关性系数，横坐标代表在无酚棉中下调的倍数。c,GhDIR5的表达与棉酚的积累呈正相关。GhDIR5在无腺体棉和PGF抑制植株叶片中几乎不表达，而且能够受到激发子VdNEP的诱导。d,GhDIR5在棉花各个组织中的表达特征。e,GhDIR5与同源基因的共线性分析。
图2为显示GhDIR5进化树分析。利用MEGA软件进行进化树分析，GhDIR5与已经报道的GhDIR4都位于DIR-b亚家族。
图3为显示病毒诱导的转基因沉默技术和基因编辑手段验证GhDIR5的功能。a，GhDIR5在VIGS植株中的表达受到抑制。b,GhDIR5抑制植株叶片中棉酚含量显著下降。c,液相色谱显示GhDIR5抑制植株叶片中左旋棉酚含量急剧下降。d,GhDIR5抑制植株和对照植株叶片中棉酚轴手性异构体的比例。e,GhDIR5的CRISPR编辑类型。f,GhDIR5基因编辑植株不同组织中棉酚的绝对含量。圈大小表示棉酚的含量，单位微克/毫克。g-p,GhDIR5基因编辑植株和野生型棉花植株中不同组织中棉酚轴手性异构体的比值。
图4为显示体外探究GhDIR5的酶活功能。a,利用烟草外泌液体系探究GhDIR5的功能。GhDIR5生成左旋棉酚的能力远远强于已经报道的引导蛋白GhDIR4。b,利用漆酶体系探究GhDIR5的功能。相较于只加漆酶的对照，GhDIR5可以促进半棉酚生成棉酚。c,GhDIR5对于漆酶催化的影响。纵坐标代表加入GhDIR5生成的棉酚与对照生成棉酚的含量比值。利用PTS蛋白进行GhDIR5(d)和GhDIR4(e)蛋白模拟并进行反应产物棉酚的对接。与棉酚异构体生成可能紧密相关的氨基酸突出显示。f,根据蛋白模拟和底物对接结果，对GhDIR5和GhDIR4进行蛋白突变体酶活分析。
图5为显示细胞外的GhDIR5对植物表型的影响。a,GhDIR5启动子驱动GhDIR5-GFP融合蛋白表达结果。与对照相比，棉花腺体腔可以看到明显的GFP信号。b,GhDIR5启动子驱动GUS报告基因表达的转基因叶片染色结果。与对照相比，棉花腺体被明显染色。c,免疫胶体金探究GhDIR5蛋白的亚细胞定位。与对照相比，棉花腺体腔中有明显的胶体金信号。通过与对照植株作比较，观察GhDIR5基因编辑植株叶片对棉铃虫(d)和草地贪夜蛾(e)的抗性变化。通过与野生型棉花种子提取物作对比，利用CASA实验观察GhDIR5基因编辑植株种子提取物对小鼠精子运动能力(f)和精子活力(g)的影响。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种能够调控左旋棉酚合成的GhDIR5蛋白及其基因。
具体地，通过生物信息学分析及病毒诱导的转基因沉默技术(VIGS)，本发明人筛选到棉花引导蛋白GhDIR5能够控制(-)-棉酚生物合成。通过VIGS本发明人发现GhDIR5抑制植株的真叶中棉酚下降，表明GhDIR5在棉花体内参与棉酚生物合成。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除GhDIR5，陆地棉各组织中(-)-棉酚含量均显著下降，包括成熟种子中(-)-棉酚含量下降约95％左右。通过体外酶活实验，本发明人发现体外条件下GhDIR5控制形成(+)-棉酚和(-)-棉酚的比例约为1:1，并且可以提高漆酶催化半棉酚形成棉酚的效率。
术语
如本文所用，术语“特异性表达”是指目的基因在植物中特定的时间和/或特定的组织的表达。
如本文所用，“外源的”或“异源的”是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
基因敲除(knock out)和敲低(knock down)
在本发明中，可通过基因编辑等重组技术对本发明的GhDIR5基因进行敲除或敲低。
一种代表性的基因敲除方法是CRISPR/Cas9介导的基因敲除。针对目的基因，通过人工设计的sgRNA(small guide RNA,sgRNA)来识别目的基因序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA双链，形成DNA的双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的非同源末端连接方式对断裂的DNA进行修复。但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。或者通过碱基编辑工具(如ABE等)，引入终止密码子，从而阻止GhDIR5基因的表达。
此外，可通过RNA水平阻止或降低GhDIR5基因的表达(如RNAi或microRNA)。以RNAi为例，RNAi是最为常见的一种诱发基因沉默的技术，由dsRNA介导的同源RNA降解的过程，是针对基因转录后水平的基因沉默，具有很高的效率与特异性，在植物和各种细胞中具有十分广泛的应用。
GhDIR5基因
如本文所用，术语“GhDIR5基因”、“棉花引导蛋白基因”、“本发明基因”可以互换使用，都是指本发明的具有调控左旋棉酚生成的基因。
本发明的GhDIR5基因可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA形式可以是与SEQ ID NO.:1所示的cDNA序列，或其互补序列，或其对应的基因组序列，或其简并的变异体。本发明的DNA可以是单链的或是双链的，DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。
如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.:2的蛋白质，但与SEQ ID NO.:1所示的cDNA序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO.:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码左旋棉酚生成相关引导蛋白的多聚核苷酸。
GhDIR5基因编码的多肽
如本文所用，术语“GhDIR5多肽”、“GhDIR5蛋白”、“棉花引导蛋白多肽”、“本发明多肽”、“GhDIR5基因编码的多肽”可以互换使用，都是指本发明的具有调控左旋棉酚合成的多肽。
在一优选例中，本发明多肽来源于棉花。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括GhDIR5多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然GhDIR5多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在优选例中，本发明多肽指具有调控左旋棉酚合成功能的SEQ ID NO.:2序列的多肽。还包括具有与GhDIR5多肽相同功能的、SEQ ID NO.:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括GhDIR5多肽的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与GhDIR5多肽的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗GhDIR5多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含GhDIR5多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了GhDIR5多肽的可溶性片段。通常，该片段具有GhDIR5多肽序列的至少约50个连续氨基酸，通常至少约80个连续氨基酸，较佳地至少约100个连续氨基酸，更佳地至少约120个连续氨基酸，最佳地至少约150个连续氨基酸。
本发明还提供GhDIR5多肽或其类似物。这些类似物与天然GhDIR5多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“GhDIR5多肽保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.:2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异多肽最好根据下表进行氨基酸替换而产生。
棉花
棉花是锦葵目(Malvales)锦葵科(Malvaceae)棉属(Gossypium)植物的种子纤维，原产于亚热带。植株灌木状，在热带地区栽培可长到6米高，一般为1到2米。花朵乳白色，开花后不久转成深红色然后凋谢，留下绿色小型的蒴果，称为棉铃。棉铃内有棉籽，棉籽上的茸毛从棉籽表皮长出，塞满棉铃内部。棉铃成熟时裂开，露出柔软的棉纤维。常见棉纤维白色至白中带黄，长约2至4厘米，含纤维素约87～90％。
陆地棉(Gossypium hirsutum L.)因最早在美洲大陆种植而得名，是世界上最重要的棉花栽培品种，占全球棉花种植面积的90％以上。陆地棉为异源四倍体，包括两个亚基因组，A亚组和D亚组。
重组技术和植物改良
本发明基因的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的本发明多肽。一般来说有以下步骤：
(1)用本发明的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明多核苷酸和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞(如农作物和林业植物的细胞)。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得左旋棉酚生物合成性状变化的植物。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超滤处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的本发明多肽有多方面的用途。例如用于筛选具有调控左旋棉酚生物合成的化合物、多肽或其它配体。用表达的重组本发明多肽的筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制、或促进左旋棉酚生物合成的多肽分子。
本发明还涉及定量和定位检测左旋棉酚生物合成相关引导蛋白水平的测试方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的左旋棉酚生物合成相关引导蛋白水平，可用于解释左旋棉酚生物合成相关引导蛋白调控左旋棉酚生物合成的功能。
一种检测样品中是否存在左旋棉酚生物合成相关引导蛋白的方法是利用本发明多肽的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与本发明多肽特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在左旋棉酚生成相关引导蛋白。
本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用本发明多肽特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测本发明多肽的转录产物。
本发明的主要优点包括：
(a)提供了一种参与左旋棉酚合成的GhDIR5基因；
(b)可以通过敲除或下调GhDIR5表达量来抑制左旋棉酚合成；
(c)可以通过过表达GhDIR5表达量增加左旋棉酚的生物合成；
(d)培育棉花新种质，GhDIR5基因通过编辑而失活的棉花中，种子的左旋棉酚含量降低，棉花植株的抗虫性不变。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
序列
GhDIR5基因ID：在陆地棉(Gossypium hirsutum)中GhDIR5基因ID为：A亚基因组的Gh_A04G0066，D亚基因组的Gh_D05G3661。
GhDIR5_A(Gh_A04G0066)核苷酸序列cDNA：(SEQ ID NO.:1)
ATGAGAGGAACATGGATGTTGAGTTGGATTCTGATCATCTGCCTCTCCCAAGTAGCAGTGCAGAGCCAATACTACTCGAAGAGCCGACCATATCATCCCAGGCCAGCTAAGGTCACCAATCTTCACTTCTTTATGCACGAACATACGGGTGTTACAGCAGTCGTGGTAGCCCAAGCTAACATCACAAGCAATAATTCATCAGTGCCATTTGCCACCCTAGTTGCCGTTAATGATCCCCTCAGGACTGGTCCTGAGCCTGACTCGGAGGTGATTGGAAATGTTCAGGGTATTGCGCTAATGGCTGGAATGAATGCATCCAGCACACAATACATAGATTTTGCATTTAATACCGGTAAGTTTAACGGCAGCTCTCTAAGCGTATTTTCAAGGGGAGAACCTGGGCTTGCGGTGGTCGGAGGAAGAGGACGATTCATGATGGCAACAGGGGTTGCACTATTTAACCCTATCCTTATAAATGCCACCACTGTCATTATTGAATTAAACGTTACTGTAATTCATTACTAA
GhDIR5_A(Gh_A04G0066)编码蛋白序列：(SEQ ID No.:2)
MRGTWMLSWILIICLSQVAVQSQYYSKSRPYHPRPAKVTNLHFFMHEHTGVTAVVVAQANITSNNSSVPFATLVAVNDPLRTGPEPDSEVIGNVQGIALMAGMNASSTQYIDFAFNTGKFNGSSLSVFSRGEPGLAVVGGRGRFMMATGVALFNPILINATTVIIELNVTVIHY
GhDIR5_D(Gh_D05G3661)核苷酸序列cDNA：(SEQ ID NO.:3)
ATGAGAGGAACATTGGTGTTGACTTGGATTCTGATCATCTGCCTCTCCCAAGTAGCCGTGCAGAGCCAATACTACTCGAAGACCCGACACTATGATCGCAAGCCAGCTAAGGAAACCAATCTTCATTTCTTTATGCATGAACATACGGGTGTTACAGCAGTCGTGGTAGCCCAAGCTAACATCACAAGCAATAGTTCATCAGTGCCATTTGCCTCCCTGGTTGCCGTTAATGATCCCCTCAGGACTGGTCCTGAGCCTGACTCGAAGGTGATTGGAAATGTTCAGGGTATTGCGCTCCTGGCTGGAATGAATGCATCGAGCACACAATACATAGATTTTGGATTCAATACCGGTAAGTTTAACGGCAGCTCTCTAAGCGTATTTTCAAGAGGAGAACCTGGGCTAGCGGTGGTCGGAGGAAGAGGACGATTCATGATGGCAAGAGGGGTTGCACTATTTAACCCTATCCTTATAAATGCCACCAATGTCATTATTGAATTTAACGTTACTGTAGTTCATTACTAA
GhDIR5_D(Gh_D05G3661)编码蛋白序列：(SEQ ID No.:4)
MRGTLVLTWILIICLSQVAVQSQYYSKTRHYDRKPAKETNLHFFMHEHTGVTAVVVAQANITSNSSSVPFASLVAVNDPLRTGPEPDSKVIGNVQGIALLAGMNASSTQYIDFGFNTGKFNGSSLSVFSRGEPGLAVVGGRGRFMMARGVALFNPILINATNVIIEFNVTVVHY
实施例中所使用的引物如下表所示：
实施例1
转录组分析及棉花VIGS(病毒诱导的转基因沉默)实验证明GhDIR5参与左旋棉酚的生物合成
a:转录组分析推测GhDIR5参与棉酚生物合成
棉酚由两分子半棉酚交联而成，分为右旋棉酚和左旋棉酚(图1a)。
如图1b所示，对有腺体棉和无腺体棉转录组差异基因进行分析，选取无腺体棉中表达量下调最显著的部分基因(logFC<＝8)，利用R语言中的相关性函数，以已知的参与棉酚合成途径的酶基因CYP71BE79的表达量为钓饵基因进行相关性分析，其中Gh_A04G0066[GhDIR5]与CYP71BE79共表达(r≥0.75)，猜测GhDIR5与棉酚的生物合成密切相关。
如图1c所示，GhDIR5同棉酚途径已知基因类似，都在无腺体棉叶片中几乎不表达，在没有腺体与棉酚积累的PGF抑制植株叶片中不表达，并能够受到真菌激发子VdNEP的诱导。
通过分析GhDIR5在不同组织中的转录表达模式，可以看到其表达特征与棉酚积累特征一致，在胚珠发育后期表达量逐渐增加(图1d)，因此推测GhDIR5可能参与半棉酚氧化偶联形成棉酚。
GhDIR5基因位于陆地棉A04染色体的串联重复区域内，该区域还包含许多其他引导基因，包括介导(+)-棉酚生物合成的GhDIR4(图1e)。
GhDIR5的同源基因同样存在于陆地棉Dt亚基因组中，并分别与两个二倍体祖先亚洲棉(Gossypium arboreum)和雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)的同源基因表现出明显的共线性关系，表明GhDIR5可能来源于棉花基因组的串联复制(图1e)。
对进化分析提示，GhDIR5与已报道的GhDIR4均属于引导蛋白b/d亚家族(图2)。
b:构建GhDIR5基因的VIGS载体
PCR扩增300-500bp的基因特异片段，正向引物引入BamHI酶切位点，反向引物引入XbaI酶切位点装入市售的pTRV2载体，利用同源重组的方法将GhDIR5基因连接到pTRV2载体上，将测序正确的载体转入农杆菌GV3101，28℃倒置培养2～3天。
c:将GhDIR5基因VIGS载体转染棉花子叶
将测序正确的质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞，同时将包含市售的pTRV1载体的农杆菌划线，同时将包含PDS基因的pTRV2农杆菌(SU)划线。挑取单克隆进行菌落PCR验证，将菌落PCR阳性的农杆菌克隆挑取至2mL选择抗性的液体LB培养基中，28℃培养过夜，至OD值为2.5。同时将pTRV1和SU农杆菌小摇。将小摇的农杆菌，按照1:100的比例，转接到50mL的选择抗性LB液体培养基中，继续在28℃震荡培养过夜。室温，8,000g离心10min，用等体积的重悬液(10mM MES，10mM MgCl2，150μM acetosyringone，pH＝5.8)重悬，OD值调至1左右，室温放置至少3h，使菌体活化。将转有不同质粒的农杆菌重悬液与转有pTRV1载体的农杆菌重悬液以1:1(V/V)混合，用1mL注射器从棉花子叶背面注射进行转染。注射2～3周后观察正对照是否黄化，采取第二片真叶，液氮速冻，保存于-70℃。
将GhDIR5抑制植株的第二片真叶的RNA，进行qRT-PCR分析，发现GhDIR5在VIGS植株叶片中表达量确实下调非常明显，如图3a所示。
通过液相检测得知，GhDIR5基因沉默之后，棉酚的含量也是下降的(图3b)。
d:HPLC检测GhDIR5抑制植株叶片中棉酚异构体含量
将植物材料在液氮中研磨制成粉末，每100mg粉末加入衍生试剂1mL(d-丙氨酸醇:冰醋酸:乙腈＝1:5:44)，涡旋2min，超声处理15min,12000rpm离心5min，上清液通过0.22μmPTFE过滤器过滤，75℃孵育45min。
采用高效液相色谱(HPLC)或色谱-三重四极杆质谱法对样品中棉酚异构体进行定量分析，采用Agilent C18分析柱(150×2.1mm,2.7μm)。流动相组分为0.1％甲酸水(A)和乙腈(B)，流速为0.420mL/min，梯度为12min，在257nm处检测:0-3min,20-70％B；3-5分钟，70-80％B；5-7分钟，80-84％B；7-8分钟，84-100％B；8-10分钟，100％B；10-11分钟，100-20％B；10-12分钟，20％b。Agilent6470三重四极杆质谱以正离子模式采集MS数据(参数:precursor ion:633.33m/z；product ion:483.18m/z；dwell:200ms；fragmentor:135V；collision energy:20V；cell accelerator voltage:5V)。
经过HPLC或质谱的检测，发现在VIGS抑制GhDIR5表达的株系中，(+)-棉酚与(-)-棉酚含量均下降，(-)-棉酚下降极为显著，结果如图3c,d所示。猜测GhDIR5主要与棉花体内左旋棉酚的生物合成有关。
实施例2
CIRSPR-Cas9技术敲除GhDIR5基因去除陆地棉中(-)-棉酚
GhDIR5基因没有内含子，只有一个外显子，本发明人共设计了两个sgRNA进行GhDIR5基因敲除，两个sgRNA的序列分别为：GTGGTGGCATTTATAAGGAT(SEQ ID NO.:13)与GTCGGCTCTTCGAGTAGTAT(SEQ ID NO.:14)，将两个sgRNA序列克隆到载体pRGEB32-GhU6.7-NPT2中，转化农杆菌LBA4404，用于侵染棉花外植体，获取稳定转化的转基因幼苗。获得T0代转基因株系后提取棉花DNA对基因编辑靶点进行测序验证。
棉花DNA提取：研磨棉花叶片，加入800μL CTAB提取液，涡旋混匀，65℃烘箱放置30min；加入800μL氯仿，上下颠倒混匀，4℃，12000rpm离心10min；取上清于新的1.5mL离心管中，加等体积的氯仿，上下混匀后再次离心，重复一次；取上清于新的离心管中，加入1/2体积的异丙醇，颠倒混匀，冰上静止1h，4℃，12000rpm离心10min，去上清，加入与异丙醇相同体积的75％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心10min，重复一次；将沉淀于37℃烘干10min，用60μL水溶解，后加入RNaseⅠ37℃反应30min去除RNA，再将溶液置于65℃烘箱使RNaseⅠ失活。
CTAB提取试剂：2％CTAB，0.1M Tris，20mM EDTA，1M NaCl(使用时加入2％β-巯基乙醇)
PCR扩增基因编辑位点片段，装入pEASY-Blunt Zero载体(购自全式金公司(TransGen Biotech)，货号为CB501-01)，对目标片段进行测序，发现了基因靶点发生编辑的两个棉花株系(图3e)，检测其T1代阳性后代根、茎、叶、花瓣、萼片、副萼、雌蕊、雄蕊、胚珠和种子中的总棉酚和棉酚异构体的相对含量，通过液相分析，本发明人发现各个组织中的棉酚含量是下降的(图3f)。
在GhDIR5基因被敲除的转基因棉花中，在多种不同的植物部位中左旋棉酚含量均显著下降，萼片、副萼中几乎不能再检测到(-)-棉酚，种子中(-)-棉酚下降95％左右，(+)-棉酚与左旋棉酚的比值相较于野生型棉花大大增加(图3g-p)。
实施例3
GhDIR5基因克隆及烟草表达载体构建和蛋白表达纯化
a:棉花总RNA的提取和cDNA反转录制备
取100mg棉花叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入1mL在65℃预热的RNA提取试剂，立即涡旋剧烈震荡混匀，65℃放置30min。13,500g离心2min。将上清液转移至新的2mL管中，加入0.6mL氯仿，13,500g，离心5min，小心吸取上清至新的RNase-Free的离心管中。重复步骤3。上清转移至新的2mL管中，加入LiCl至终浓度为2M，-20℃放置3h。13,500g离心10min，倒掉废液，沉淀用70％的乙醇清洗两次，室温晾干后加入RNase-Free ddH2O。
RNA提取试剂：0.2M Tris,50mM EDTA,1M NaCl,1％CTAB,1％β-巯基乙醇，pH 8.0
b:PCR扩增目的基因GhDIR5及烟草表达载体构建
用高保真酶HS DNA Polymerase扩增GhDIR5的全长cDNA片段(525bp)。PCR反应条件为：98℃，变性1分钟；98℃，变性10秒钟；57℃，复性10秒；72℃，延伸40秒钟；72℃，5分钟；4℃保温。将pEAQ载体用AgeI/Sal双酶切后，将GhDIR5利用同源重组的方法连分别连接到pEAQ烟草表达载体中。
c:烟草表达蛋白
将测序正确的GhDIR5的表达载体质粒转入GV3101农杆菌菌株，28℃倒置培养2-3天。挑取生长出的单克隆进行菌落PCR。PCR鉴定阳性的克隆加入到2mL抗性的液体LB中小摇，28℃培养过夜。将小摇的农杆菌，按照1:100的比例，转接到50mL的选择抗性LB液体培养基中，继续在28℃震荡培养过夜。室温，8,000g离心10min，用等体积的重悬液(10mM MES，10mM MgCl2，150μMacetosyringone，pH＝5.8)重悬，OD值调至0.6左右，室温放置至少3h，使菌体活化。将转有质粒的农杆菌重悬液与转用1mL注射器从烟草真叶背面注射进行转染。
d:烟草外泌液提取
使用渗透-离心法用于植物细胞外泌液提取。将农杆菌侵染后2-3天的烟草真叶放在一个含有磷酸盐缓冲液(pH值为7.4)的大烧杯中，将液体完全浸没叶片上。在烧杯放置于真空中，在大气压下缓慢释放真空，以消除叶子上的气泡，重复这个步骤，直到叶子完全渗透。将渗透充分的叶片晾干，放入20ml注射器中，代替柱塞。将注射器组件置于50mL离心管中，4℃，750g离心20min。离心管底部收集的提取液可用于酶活性分析，western blot可用于验证蛋白表达。
e:烟草表达蛋白纯化
收集大量表达GhDIR5的烟草外泌液，用Ni-NAT agrose小柱进行纯化。先用10mL的Lysis buffer清洗Ni柱，将收集的烟草外泌液流穿过装好的Ni-NAT agrose小柱；使用10mL的Wash buffer清洗Ni-NAT agrose；使用2mL洗脱缓冲液(Elution buffer)将GhDIR5蛋白从镍柱中洗脱，使用western进行蛋白检测。
缓冲液：
Lysis Buffer：50mM Tris-HCl，300mM NaCl，10mM Imidazole
Wash Buffer:50mM Tris-HCl，300mM NaCl，20mM Imidazole
Elution Buffer:50mM Tris-HCl，300mM NaCl，200mM Imidazole
实施例4
GhDIR5控制半棉酚生成近似等量的(+)-棉酚和(-)-棉酚
a:GhDIR5体外酶活
将200μL表达GhDIR4、GhDIR5或EV的烟草叶片的细胞外泌液与100μM底物半棉酚在30℃下孵育2h。用乙酸乙酯提取，涡旋、超声处理5min,12000rpm离心2min，取上清浓缩，加入50μL衍生化试剂重悬，75℃孵育45min。对棉酚对映体进行定量分析。
经色谱检测发现，表达已报道GhDIR4烟草外泌液催化生成(+)-棉酚达到88.31％，而表达GhDIR5烟草外泌液催化半棉酚氧化偶联生成(+)-棉酚与(-)-棉酚比例为47.75:52.25，表明在体外环境下，GhDIR5控制半棉酚生成近似等量的(+)-棉酚和(-)-棉酚(图4a)。
b：纯化GhDIR5与漆酶催化酶活体系
25mM NaAc缓冲液(pH＝4.5)，100μM CuCl2，5μg GhDIR5蛋白，2μg漆酶，100μM底物半棉酚。30℃反应两小时，利用乙酸乙酯进行萃取，抽干后溶于乙腈，过滤后进行HPLC-MS检测，对照组不加GhDIR5。HPLC-MS分析采用Agilent 1100系统，Agilent Eclipse XDB-C18semi-preparative column(250mm×9.4mm,5μm)反向C18分析柱。流动相为乙腈(B)和甲酸溶液(A)，甲酸浓度为0.1％，流动相流速为1mL/min，进样量为10μl。梯度洗脱条件：0-3min,20-70％B；3-5min,70-80％B；5-8min,80-84％B；8-15min,100％B；15-16min,100-20％B。对反应生成的棉酚进行定量分析。
结果表明，与不加GhDIR5的对照相比，加入GhDIR5的漆酶酶活反应体系生成了更多的棉酚，表明GhDIR5可以提高半棉酚转化成棉酚的效率(图4b,c)。
c:GhDIR5与GhDIR4蛋白结构模拟与关键氨基酸位点突变
以木脂素合成引导蛋白GsPTS1晶体结构(PDB ID:6OOC)为参考，对GhDIR5和GhDIR4进行分子模拟，获得了其可能的蛋白结构。
结果
经过分析，结合一级蛋白序列差异氨基酸，获取了可能影响蛋白口袋大小进而决定形成棉酚异构体比例的关键氨基酸位点，包括98位、100位和167位的氨基酸残基(图4d,e)。
对这些位点相应进行突变，利用烟草表达突变蛋白后提取外泌液进行酶活性分析，发现其中三个氨基酸位点98A/S,100M/L,167L/F(图5a-b)的突变体蛋白明显改变了产物棉酚异构体的比例。
GhDIR5被突变后，倾向于促进半棉酚形成(+)-棉酚，随着突变位点数量的增加，生成(+)-棉酚比例也相应增加。相反，GhDIR4突变蛋白控制形成(+)-棉酚比例明显低于GhDIR4自身，GhDIR4 S98A-L100M-F167L三突变蛋白生成棉酚异构体比例几乎趋近与1:1(图4f)。
实施例5
GhDIR5在棉花腺体中分泌表达
a:构建GhDIR5启动子驱动GhDIR5-GFP的表达载体，进行棉花稳定转化，获得转基因植株，鉴定阳性植株后，观察转基因植株叶片的荧光情况，如图5a所示，可以看到棉花腺体腔中具有GFP的信号，而对照野生型棉花叶片的腺体腔中没有GFP的信号。
b：构建GhDIR5启动子驱动GUS报告基因的表达载体，进行棉花稳定转化，获得转基因植株，鉴定阳性植株后，通过GUS染色，观察转基因植物叶片中的染色情况，如图5b所示，可以看到棉花腺体被染成蓝色，而对照野生型棉花叶片的腺体没有被染色。
c:免疫金标记和透射电镜
样品固定与切片：从棉苗上分离的幼叶切片，用4％(v/v)戊二醛(EM级)固定，切片样品用PBS(pH＝7.2)洗涤三次后，在室温下用2％(w/v)四氧化锇固定1小时；样品用MilliQ水洗三次，在梯度乙醇中脱水，然后用LR White树脂缓慢渗透几天。单个切片放置在明胶胶囊中，胶囊中填充新鲜树脂，在65℃下聚合过夜。使用金刚石刀Leica ultra R切片机进行切片，厚度为80nm，收集在formvar涂层的黄金网格(100和200目)上。
免疫电镜样品处理与电镜观察：首先将超薄切片暴露在10％H2O2中10min，用蒸馏水洗涤3次，然后在1％(w/v)牛血清白蛋白中室温封闭1h。然后，切片与GhDIR5的单克隆抗体(用1％(w/v)牛血清白蛋白在PBS中1:500稀释)在37℃孵育2小时，用非免疫血清替代一抗的切片作为对照。孵育后用加入0.01％吐温20的PBS(PBST)洗涤5次，用山羊抗小鼠IgG(1:30稀释)37℃孵育1h，依次用PBST洗涤5次，蒸馏水洗涤3次。最后用2％(w/v)乙酸铀酰水溶液染色3min，柠檬酸铅染色5min，用蒸馏水洗涤5次，室温干燥。切片置于干燥条件下保存或立即用透射电镜观察，电压设为80kv。
结果：
如图5c，d所示，GhDIR5主要定位于棉花腺体腔中。该结果提示，GhDIR5蛋白可以分泌到细胞外。
实施例6
基因编辑GhDIR5可降低棉籽毒性且不影响棉花抗虫
a:棉铃虫与草地贪夜蛾饲喂
将棉铃虫与草地贪夜蛾3龄幼虫在25℃、70％相对湿度、光照14h/暗光10h的实验室条件下培养。取野生型棉花和CR-Ghdir5棉花真叶饲喂棉铃虫与草地贪夜蛾幼虫，每个实验组幼虫15～30只，在单独的容器中饲养，每天添加新鲜且过量的植物叶片。饲喂指定饲粮3天后，记录棉铃虫或草地贪夜蛾体重。
通过比较饲喂GhDIR5和野生型叶片，结果表明，GhDIR5被敲除植株的叶片抗虫能力并没有发生明显变化(图5d,e)。
b：棉籽提取物对小鼠精子活力的影响
3周龄雄性C57BL小鼠(n＝50)从小鼠培育公司购买，老鼠被放置在12小时的光照12小时黑暗的鼠笼中。老鼠适应新环境1周后使用棉籽提取物处理。动物分为两组，分别对其腹腔注射野生型棉花种子和GhDIR5基因编辑种子提取物，为期4周，每2天注射一次。棉酚(10毫克/千克)，注射体积保持在100μL。处理4周后处死小鼠，取出附睾的精子进行CASA实验，检测精子运动能力和活力。
结果
如图5f，g所示，GhDIR5基因编辑植株种子提取物对小鼠精子的影响较对照显著减轻。
讨论
Dirigent蛋白(DIRs)最早在连翘中鉴定(Forsythia suspensa)，其基因家族在植物中广泛存在，包括苔藓，蕨类，裸子植物和被子植物，许多Dirigent蛋白可被不同类型的非生物和生物胁迫因子诱导，因此通常被认为与植物防御反应相关。Dirigent蛋白家族在植物次生代谢中具有重要作用，被认为缺乏催化活性，但直接导致双分子偶联反应的结果，形成区域和立体定向的产物。研究发现当半棉酚与过氧化物酶/H2O2、漆酶/O2或过硫酸铵共孵育时，仅得到外消旋混合物，但当与含有Dirigent蛋白活性的粗提物共孵育时，优先形成(+)-棉酚。在陆地棉中鉴定到GhDIR4具有Dirigent蛋白活性，对半棉酚的氧化偶联具有一定的选择性，特异形成(+)-棉酚。而控制(-)-棉酚生物合成的引导蛋白尚未见报道。
GhDIR5基因位于陆地棉A04染色体的串联重复区域内，该区域还包含许多其他引导基因，包括先前报道的介导(+)-棉酚生物合成的GhDIR4(Gh_A04G0070)，且GhDIR5的同源基因存在于陆地棉Dt亚基因组中，并分别与两个二倍体祖先亚洲棉(Gossypium arboreum)和雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)的同源基因表现出明显的共线性关系，表明GhDIR5可能来源于棉花基因组的局部重复。对陆地棉、海岛棉、亚洲棉和雷蒙德氏棉中GhDIR5同源基因进行同样的酶活分析，其中大部分蛋白表现出与GhDIR4类似的功能，在半棉酚的偶联反应中生成了更多(+)-棉酚，部分蛋白生成相似比例的(+)-棉酚和(-)-棉酚。对GhDIR5和GhDIR4可能的关键氨基酸位点分别进行突变，发现其中三个氨基酸位点98A,100M,167L与产物棉酚异构体的生成比例密切相关。GhDIR5和GhDIR4可能存在蛋白互作，进一步证明了串联重复的引导蛋白在陆地棉不同组织中竞争合作共同控制棉酚异构体的生物合成，以应对不同的生存或胁迫环境。
GhDIR5属于引导蛋白b/d亚家族，在棉花腺体中分泌表达。取GhDIR5敲除后的棉花(CR-Ghdir5)与野生型棉花真叶饲喂棉铃虫与草地贪夜蛾，发现敲除GhDIR5不影响棉花抗虫能力。CR-Ghdir5种子中仅有少量(-)-棉酚，将CR-Ghdir5与野生型陆地棉种子中的棉酚分别饲喂小鼠，发现CR-Ghdir5种子提取物对小鼠精子活力和精子动力的影响更小。
总之，本发明发现了棉花影响(-)-棉酚合成的引导蛋白GhDIR5，体外条件下控制形成近似等比例的(+)-棉酚和(-)-棉酚。GhDIR5基因编辑几乎去除了陆地棉种子中的(-)-棉酚，在降低棉籽对非反刍动物的毒性的同时最大程度的保留了棉花的抗虫能力，提高了棉籽的营养价值，为低酚棉育种提供了新的思路，具有广阔的应用前景。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种GhDIR5抑制剂的用途，其特征在于，所述的GhDIR5抑制剂用于选自下组的一种或多种用途：
(a)用于抑制调控(-)-棉酚(左旋棉酚)生物合成的试剂或组合物；和
(b)用于降低棉籽毒性，从而改善棉籽营养价值。
2.一种抑制左旋棉酚生物合成的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在所述植物中，抑制GhDIR5基因的表达或抑制GhDIR5蛋白的活性。
3.一种促进左旋棉酚生物合成的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将外源的构建物导入植物细胞，其中所述的构建物含有外源的GhDIR5基因序列、促进GhDIR5基因表达的外源核苷酸序列，从而获得导入外源构建物的植物细胞；
(b)将上一步骤获得的所述导入外源构建物的植物细胞，再生成植株：和
(c)任选地对所述再生的植株进行鉴定，从而获得左旋棉酚生物合成上调的植物。
4.一种GhDIR5基因或其编码蛋白的调控剂的用途，其特征在于，用于选自下组的一种或多种用途：
(a)用于制备促进或抑制左旋棉酚生物合成的试剂或组合物；和
(b)用于增加或降低棉籽毒性，从而改善棉籽营养价值。
5.一种转基因植株，其特征在于，所述转基因植株中敲低和或敲除GhDIR5基因。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有表达外源GhDIR5蛋白的表达盒，或含有携带所述外源GhDIR5蛋白的表达盒的载体。
7.一种遗传工程化的植物细胞，其特征在于，所述植物细胞为来自锦葵科植物的植物细胞，并且所述的遗传工程化的植物细胞中原来的内源性的GhDIR5基因被敲除或敲低。
8.一种改良植物品种的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将第一表达盒导入植物细胞或植物组织，从而获得导入所述第一表达盒的植物细胞或植物组织，其中，所述的第一表达盒为表达外源GhDIR5的表达盒；和
(b)将所述导入了所述第一表达盒的植物细胞或植物组织，再生成转基因植株，其中，所述的植株具有增强的左旋棉酚的合成能力。
9.一种改良植物品种的方法，其特征在于，包括步骤：
(S1)将基因编辑表达盒导入植物细胞或植物组织，从而获得导入所述基因编辑表达盒的植物细胞或植物组织，其中，所述的基因编辑表达盒用于表达靶向内源GhDIR5的gRNA和/或Cas9蛋白；和
(S2)将导入了所述基因编辑表达盒的植物细胞或植物组织，再生成转基因植株，其中，所述的植株具有下降的左旋棉酚的合成能力，
其中，所述的植物细胞或植物组织为来自锦葵科植物的植物细胞或植物组织。
10.一种体外合成棉酚的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在GhDIR5蛋白和漆酶存在下，对半棉酚进行催化反应，从而形成棉酚。
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