JP6191996B2 - 単為結果制御遺伝子およびその利用 - Google Patents

Description

本発明は、単為結果制御遺伝子およびそれを利用した植物の生産方法等に関する。

通常、ナスおよびトマトなどのナス科植物は、開花後に受粉が正常に行われ、果実中に種子が形成されることによって、果実の肥大が起こる。これに対し、受粉および種子形成がなくても、正常に果実が肥大および成熟する形質を単為結果性と呼ぶ。この形質は、例えば、訪花昆虫を用いた受粉誘導、またはホルモン剤処理による着果誘導といった作業を行わなくとも果実が収穫できるという点で、農業または園芸分野等において非常に有用な形質である。

従来、ナス科の植物では、単為結果を誘導する要因の一つとして、植物ホルモンの一種であるオーキシンの子房における量の変化が関与していることが知られている。例えば、ナスの花等に合成オーキシン類を施用することにより単為結果が誘導されることが知られている（非特許文献１）。

天然オーキシンの一種であるインドール酢酸（以下、ＩＡＡと称する）の植物における合成機構については、実験モデル植物であるシロイヌナズナを材料とした研究が先行している。シロイヌナズナにおいては、生合成経路として、ＩＰｙＡ経路の存在が知られており、それ以外にもＴＡＭ経路およびＩＡＭ経路等の存在が推定されている。多数の遺伝子が、これらの経路に関与していることが明らかにされつつあり、ＩＡＡ合成に対して正に機能する酵素をコードする遺伝子のみならず、最近では、負に機能する酵素をコードする遺伝子の存在も報告されている。例えば、非特許文献２には、シロイヌナズナのＩＡＡ合成経路の一つであるＩＰｙＡ経路において、メチオニンからアミノ基をインドールピルビン酸（ＩＰｙＡ）に転移しトリプトファンを生成する反応を触媒しＩＡＡ合成に対して負に機能する酵素をコードしているＶＡＳ１が記載されている。

また、非特許文献３には、ナスにおいて、上述のＩＡＡ合成経路のうち、細菌に存在するＩＡＭ経路に関与するＩＡＡ合成酵素であるｉａａＭを、胎座および胚珠特異的に発現させることにより、単為結果性が誘導されることが記載されている。ただし、非特許文献３における実験は、キンギョソウ由来のプロモータ制御下でシュードモナス属の細菌由来のｉａａＭを過剰発現させた植物を用いて行われたものである。

Nothmann et al.(1975) J. Hort. Sci. 50: 23-27 Zheng et al.(2013) Nature Chem. Biol. 9: 244-246 Rotino et al., (1997) Nature Biotechnology 15: 1398-1401

非特許文献２および３にも記載の通り、ＩＡＡ合成に関与する遺伝子の存在は知られている。しかし、ＩＡＡ合成機構は極めて複雑な経路であり、さらに多数の未知の遺伝子がＩＡＡ合成経路において重要な働きを担っていることが予想される。そして、これら未知の遺伝子のＩＡＡ合成における機能を解明すれば、農業および園芸分野等において非常に有用性のある技術に繋がりうる。また、単為結果性は栽培条件または品種系統によって形質発現が不安定になることがあるため、植物の外見のみに依拠すると評価が難しい場合がしばしば生じる。また、単為結果性の評価には、開花前の除雄および着果性の評価等の多くの労力と手間が必要である。

本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、単為結果性に関与する新規な遺伝子を同定し、その遺伝子の利用を提供することにある。

上記の課題を解決するために、本発明は以下の何れかの一態様を包含する。
＜１＞ 植物において、以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されているかを検査する検査工程を含む、植物の単為結果性の判定方法。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜９８個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜２＞ 以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜９８個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜３＞ 以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリペプチド。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜９８個の置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド、
（４）上記（１）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、単為結果制御活性を有するポリペプチド。
＜４＞ 以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか、当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されており、単為結果性を示す植物。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜９８個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

遺伝子または当該遺伝子がコードするポリペプチドを指標または標的として、植物の単為結果性を判定すること、および単為結果性の植物を生産することが出来る。

本発明の実施例１に係る単為結果性ナス系統「ＰＣＳＳ」の単為結果性を示す図である。 本発明の実施例１に係る、単為結果原因遺伝子Ａが座乗する領域の連鎖地図を示す図である。 本発明の実施例１に係る、単為結果性ナス系統ＰＣＳＳと非単為結果性ナス系統ＴＮ−４３との交雑後の各世代における表現型（すなわち、単為結果性の有無）とマーカー遺伝子型との対応関係を示す図である。 本発明の実施例１に係る、「中生真黒」の各部位の各生育段階における遺伝子ＡのｍＲＮＡ蓄積量を示す図である。 本発明の実施例１に係る、遺伝子Ａの構造およびＰＣＳＳ系統における遺伝子Ａの変異構造についての模式図である。 本発明の実施例１に係る、遺伝子Ａのプロモータ配列を有するベクターの模式図である。 本発明の実施例１に係る、ＲＮＡｉ誘導用ベクターの作製過程において構築したベクターの模式図である。 本発明の実施例１に係る、ＲＮＡｉ誘導用ベクターの作製過程において構築したベクターの模式図である。 本発明の実施例１に係る、ＲＮＡｉ誘導用ベクターの模式図である。 本発明の実施例１に係る、ナス形質転換体の単為結果性を示す図である。 本発明の実施例１に係るナス形質転換体における単為結果遺伝子Ａの転写産物蓄積量を示す図である。 本発明の実施例１に係る、単為結果性ナス系統ＰＣＳＳにおける内生のＩＡＡ濃度を示す図である。 本発明の実施例１に係る、単為結果性ナス系統ＰＣＳＳにおける内生のＩＡＡ合成経路の中間産物濃度またはＩＡＡの代謝産物濃度を示す図である。 本発明の実施例１に係る、ナス形質転換体における内生のＩＡＡ濃度を示す図である。 本発明の実施例１に係る、アミノ基転移酵素活性を示す図である。 本発明の実施例２に係る、ＲＮＡｉ誘導用ベクターの作製過程において構築したベクターの模式図である。 本発明の実施例２に係る、ＲＮＡｉ誘導用ベクターの模式図である。 本発明の実施例２に係る、遺伝子ｔＡのプロモータ配列を有するベクターの模式図である。 本発明の実施例２に係る、ＲＮＡｉ誘導用ベクターの模式図である。 本発明の実施例２に係る、トマト形質転換体の単為結果を示す図である。 本発明の実施例２に係る、トマト形質転換体における単為結果遺伝子ｔＡの転写産物蓄積量を示す図である。 本発明の実施例２に係る、トマト形質転換体における内生のＩＡＡ濃度を示す図である。 本発明の実施例３に係る、トウガラシ変異体の単為結果を示す図である。 本発明の実施例３に係る、トウガラシ変異体における内生のＩＡＡ濃度を示す図である。 本発明の実施例４に係る、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子を用いた単為結果遺伝子Ａのプロモータ解析を示す図である。 本発明の実施例４に係る、実施例１に係るナス形質転換体とは独立に作出されたナス形質転換体の単為結果性を示す図である。 本発明の実施例４に係る、実施例１に係るナス形質転換体とは独立に作出されたナス形質転換体における単為結果遺伝子Ａの転写産物蓄積量および内生のＩＡＡ濃度を示す図である。を示す図である。 本発明の実施例４に係る、ナス形質転換体作製用ベクターの模式図である。 本発明の実施例４に係る、系統「Ｍ３Ａ」におけるナス形質転換体の単為結果性を示す図である。 本発明の実施例４に係る、系統「Ｍ３Ａ」におけるナスの形質転換体の内生のＩＡＡ濃度を示す図である。 本発明の実施例４に係る、準同質遺伝子系統における、通常受粉した花および柱頭切除して受粉を妨げた花に着生した果実重を示す図である。 本発明の実施例４に係る、遺伝子Ａの大腸菌発現用ベクターの模式図である。 本発明の実施例４に係る、大腸菌で発現させたタンパク質Ａの精製タンパク質を電気泳動した結果、および大腸菌発現タンパク質Ａのアミノ基転移酵素活性を示す図である。

本発明の実施の形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。

〔用語等の定義〕
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも換言でき、ヌクレオチドの重合体を意図している。また、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とも換言でき、特に言及のない限り、デオキシリボヌクレオチドの配列またはリボヌクレオチドの配列を意図している。

本明細書において、「ポリペプチド」は、「タンパク質」とも換言できる。

本明細書において、「単為結果（性）」、および「単為結実（性）」は、植物において、受粉をしなくとも果実が肥大する性質を意図している。

本明細書において、「ヘテロ（接合）」は、異なる対立遺伝子が相同染色体上の対応する遺伝子座にある状態を意図し、「ホモ（接合）」は、同一の対立遺伝子が相同染色体上の対応する遺伝子座にある状態を意図する。

本明細書において、「ナス」は、広義には、栽培種「ソラナム（以下、Ｓと称する）・メロンゲナ（Solanum. melongena）」および野生種「Ｓ．インカナム（S. incanum）」、「Ｓ．トルバム（S. torvum）」、「Ｓ．ニグラム（S. nigrum）」、「Ｓ．アエチオピカム（S. aethiopicum）」、「Ｓ．マクロカルポン（S. macrocarpon）」、および「Ｓ．クイトエンセ（S. quitoense）」を含む概念であり、狭義には「Ｓ．メロンゲナ」を意図している。

本明細書において、「トマト」は、広義には、栽培種「Ｓ．リコペルシクム（S. lycopersicum）」および野生種「Ｓ．ケエスマニ（S. cheesmaniae）、Ｓ．チレンセ（S. chilense）、Ｓ．クミエレウスキイ（S. chmielewskii）、Ｓ．ガラパゲンセ（S. galapagense）、Ｓ．ハブロカイテス（S. habrochaites）、Ｓ．リコペルシコイデス（S. lycopersicoides）、Ｓ．ネオリキイ（S. neorickii）、Ｓ．ペネリ（S. pennellii）、Ｓ．ペルビアナム（S. peruvianum）およびＳ．ピンピネリフォリウム（S. pimpinellifolium）を含む概念であり、狭義には「Ｓ．リコペルシクム」を意図している。

本明細書において、「トウガラシ」は、広義には、栽培種「カプシカム（以下、Ｃと称する）・アニウム（Capsicum annuum）」および野生種「Ｃ．プベッセンス（C. pubescens）」、「Ｃ．バッカータム（C. baccatum）」、「Ｃ．チネンセ（C. chinense）」、および「Ｃ．フルテッセンス（C. frutescens）」を含む概念であり、狭義には「Ｃ．アニウム」を意図している。また、「トウガラシ」は、園芸作物の呼称として「ピーマン」、「パプリカ」および「シシトウ」など、「トウガラシ」以外の用語が用いられる上記の植物も含む概念である。

本明細書において、「Ａおよび／またはＢ」は、ＡおよびＢとＡまたはＢとの双方を含む概念であり、「ＡおよびＢの少なくとも一方」とも換言できる。

本明細書において、「ポリヌクレオチド同士が相補的な関係にある」とは、「ポリヌクレオチドが有する塩基配列同士を比較したときに相補的な関係にある」ことと同義である。

〔１．単為結果制御遺伝子〕
本発明に係る単為結果制御遺伝子は、少なくとも単為結果性を制御する活性（単為結果制御活性）を有するポリペプチドをコードするものである。ポリペプチドが「単為結果性を制御する活性を有する」とは、当該ポリペプチドが存在すれば単為結果性（単為結実性）という形質の出現が抑制されること、すなわち単為結果性を負に制御することを指す。また、本発明に係る単為結果制御遺伝子の発現が抑制されるか、当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの活性が阻害されると、植物は単為結果性という形質を示すか、単為結果性という形質を示さなくとも当該形質の素因を保有するようになる。

また、本発明に係る単為結果制御遺伝子の一例は、アミノ酸のアミノ基をＩＰｙＡに転移してトリプトファンを合成する反応を触媒するアミノ基転移酵素をコードしており、当該酵素が活性を有していると、単為結果性という形質の出現は抑制されているが（すなわち、単為結果制御活性を有するが）、当該酵素の活性が阻害されると、植物は単為結果性という形質を示すか、単為結果性という形質を示さなくとも当該形質の素因を保有するものである。

本発明に係る単為結果制御遺伝子は、以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含むものである。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。なお、アミノ酸配列の配列同一性は、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であることが特に好ましい。例えば、ナスに由来する変異遺伝子、またはナス以外の植物に由来する相同遺伝子がこの範疇に含まれる。
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜９８個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。なお、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸の個数は、１〜７８個であることがより好ましく、１〜４３個であることがより好ましく、１〜３９個であることがより好ましく、１〜１９個であることがより好ましく、１〜１５個であることがさらに好ましく、１〜１１個または１〜５もしくは６個であることが特に好ましい。

なお、上記「アミノ酸の欠失、置換、および／または付加」は、例えば、Kunkel法（Kunkel et al.(1985):Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.82.p488-）等の部位特異的突然変異誘発法を用いて人為的に変異を導入してもよいし、天然に存在する同様の変異ポリペプチドに由来するものであってもよい。
（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。なお、ストリンジェントな条件下とは、例えば、参考文献[Molecular cloning-a Laboratory manual 2nd edition(Sambrookら、1989)]に記載の条件等が挙げられる。ストリンジェントな条件下とは、より具体的には例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハートおよび１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。なお、このポリヌクレオチドは、上記（１）に記載のポリヌクレオチドの塩基配列に対して７５％以上の配列同一性を有することが好ましく、８０％以上の配列同一性を有することがより好ましく、８５％以上の配列同一性を有することがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有することがさらに好ましく、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、或いは９９％以上の配列同一性を有することが特に好ましい。

本発明に係る単為結果制御遺伝子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。本発明に係るポリヌクレオチドの一例である、配列番号２に示す塩基配列は、配列番号１に示すポリペプチドをコードする遺伝子の完全長ｃＤＮＡである。本発明に係る単為結果制御遺伝子は、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列等の付加的な配列を含むものであってもよい。

本発明に係る単為結果制御遺伝子を取得する（単離する）方法は、特に限定されるものではないが、例えば、上記単為結果制御遺伝子の塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。

また、本発明に係る単為結果制御遺伝子を取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、当該単為結果制御遺伝子のｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係る単為結果制御遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。

本発明に係る単為結果制御遺伝子の由来は植物である限りにおいて特に限定されず、ナス科、バラ科、およびウリ科等が挙げられ、ナス科の植物が好ましい。なかでも、ナスおよびトマト、等のナス科ナス属の植物かトウガラシ等のナス科トウガラシ属の植物であることが好ましく、ナス、トマトおよびトウガラシの何れかであることがより好ましく、ナスまたはトマトであることがさらに好ましく、ナスであることが特に好ましい。

なお、単離された単為結果制御遺伝子の候補遺伝子が、所望する単為結果制御活性を有するか否かは、由来する植物における当該候補遺伝子の発現を抑制することによって、当該植物の単為結果性が誘導されるかを観察することによって評価ができる。

本発明に係る単為結果制御遺伝子は、植物の単為結果性の機構の解明に利用することができる。

本発明に係る単為結果制御遺伝子として、ナスであるS. melongena由来の遺伝子（配列番号２、配列番号３（ＯＲＦ含む）、配列番号４（転写開始点から転写終止点まで）および配列番号２４（転写開始点の上流2000塩基から転写終結点の下流1000塩基までの配列））、トマトであるS. lycopersicum由来の遺伝子（配列番号２９）、トマト近縁種であるS. pimpinellifolium由来の遺伝子（配列番号３１）、ジャガイモ（２倍種）であるS. tuberosum phureja由来の遺伝子（配列番号３３）、トウガラシであるCapsicum annuum由来の遺伝子（配列番号３５）およびリンゴであるMalus domestica由来の遺伝子（配列番号３７）等を挙げることができる。また、本発明に係る単為結果制御遺伝子の範疇には、ここで例示したポリヌクレオチドの塩基配列に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するヌクレオチドからなる遺伝子も含まれる。

本発明に係る単為結果制御遺伝子の発現部位および発現する生育段階は特に限定されない。一例として、開花前の蕾および開花当日の子房において発現する。

〔２．単為結果制御タンパク質としてのポリペプチド〕
本発明に係るポリペプチドは、上記〔１．単為結果制御遺伝子〕欄に記載した単為結果制御遺伝子の翻訳産物であり、少なくとも植物の単為結果性を制御する活性を有する。上述の通り、本発明に係るポリペプチドは、単為結果性という形質の出現を抑制する、すなわち単為結果性を負に制御する。

本発明に係るポリペプチドは、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。より具体的には、当該ポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された翻訳産物をその範疇に含む。

本発明に係るポリペプチドは、より具体的には、以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリペプチドである。なお、このポリペプチドは単為結果制御遺伝子の翻訳産物であるから、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」等の意味については上記〔１．単為結果制御遺伝子〕欄の記載をそのまま参照すればよい。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド。なお、配列同一性は、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であることが特に好ましい。
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜９８個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド。なお、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸の個数は、１〜７８個であることがより好ましく、１〜４３個であることがより好ましく、１〜３９個であることがより好ましく、１〜１９個であることがより好ましく、１〜１５個であることがさらに好ましく、１〜１１個または１〜５もしくは６個であることが特に好ましい。
（４）上記（１）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、単為結果制御活性を有するポリペプチド。

上記ポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合してなるポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含むものであってもよい。ここでいうポリペプチド以外の構造としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。

また、本発明にかかるポリペプチドの一態様はアミノ基転移酵素である。本発明にかかるポリペプチドは、より具体的には、例えば、アミノ酸に含まれるアミノ基を、ＩＰｙＡに転移しトリプトファンを生成する反応を触媒する酵素タンパク質としての機能を有する。また、本発明にかかるポリペプチドのさらに別の一態様は、例えば、メチオニンに含まれるアミノ基を、ＩＰｙＡに転移しトリプトファンを生成する反応を触媒する酵素タンパク質としての機能を有する。

なお、単為結果制御タンパク質としての本発明に係るポリペプチドとして、ナスであるS. melongena由来のポリペプチド（配列番号１）トマトであるS. lycopersicum由来のポリペプチド（配列番号２８）、トマト近縁種であるS. pimpinellifolium由来のポリペプチド（配列番号３０）、ジャガイモ（２倍種）であるS. tuberosum phureja由来のポリペプチド（配列番号３２）、トウガラシであるCapsicum annuum由来のポリペプチド（配列番号３４）およびリンゴであるMalus domestica由来のポリペプチド（配列番号３６）等を挙げることができる。

〔３．組換え発現ベクター、および形質転換体〕
本発明はまた、本発明に係る単為結果制御遺伝子が発現可能に組み込まれた組換え発現ベクター、並びに、当該組換え発現ベクターまたは単為結果制御遺伝子が発現可能に導入された形質転換体を提供する。

組換え発現ベクターを構成するためのベクターの種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なものを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、適宜プロモータ配列を選択し、当該プロモータ配列と本発明に係る単為結果制御遺伝子とを、例えば、プラスミド、ファージミド、またはコスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。

発現ベクターを導入する宿主細胞としては、例えば、細菌細胞、酵母細胞、酵母細胞以外の真菌細胞および高等真核細胞などが挙げられる。細菌細胞としては、例えば、大腸菌細胞が挙げられる。高等真核細胞としては、例えば、植物細胞および動物細胞が挙げられる。植物細胞としては、例えば、双子葉植物細胞および単子葉植物細胞が挙げられ、双子葉植物細胞としては、例えば、ナス科植物の懸濁培養細胞（例えばタバコＢＹ−２株およびトマトＳｌｙ−１株）が挙げられ、単子葉植物細胞としては例えばイネの懸濁培養細胞であるＯｃ株などが挙げられる。動物細胞としては、昆虫細胞、両生類細胞、爬虫類細胞、鳥類細胞、魚類細胞、哺乳動物細胞などが挙げられる。

上記ベクターは、好ましくは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明に係るポリヌクレオチドは、転写に必要な要素（例えば、プロモータなど）が機能的に連結されている。また、必要に応じて、エンハンサー、選択マーカー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナルおよび５’−ＵＴＲ配列などを連結されていてもよい。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜することができる。

宿主細胞内で作動可能なプロモータ配列としては、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモータ、アグロバクテリウムのノパリン合成酵素遺伝子プロモータおよびイネユビキチン遺伝子プロモータなどが挙げられる。

また、本発明に係る組換え発現プロモータとしては、本発明に係るポリヌクレオチドにおけるプロモータ領域の配列を用いてもよい。

発現ベクターにおいて、本発明に係るポリヌクレオチドは、必要に応じて、適切なターミネータ（例えば、ＮＯＳターミネータおよびカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓターミネータ）に機能的に結合されてもよい。適切なターミネータの種類は、宿主細胞の種類に応じて適宜選択すればよく、上述のプロモータにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよい。エンハンサーは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、例えばタバコモザイクウイルスのオメガ配列が挙げられる。

本発明に係る組換え発現ベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。

また、組換え発現ベクターにおいて本発明に係るポリヌクレオチドは、必要に応じて、好適なタンパク質精製用のタグ配列、または好適なスペーサー配列に結合されていてもよい。

また、上記形質転換体とは、上記組換え発現ベクターまたは単為結果制御遺伝子が発現可能に導入された細胞、組織および器官のみならず、生物個体を含む意味である。形質転換体の生物種は特に限定されず、例えば、大腸菌等の微生物、植物および動物等が挙げられる。

〔４．植物の単為結果性の判定方法〕
本発明に係る単為結果性の判定方法は、植物において、上記単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されているかを検査する検査工程を含んでなる。ここで、「単為結果制御遺伝子」は上記〔１．単為結果制御遺伝子〕欄に記載したものを指し、「単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチド」は上記〔２．単為結果制御タンパク質としてのポリペプチド〕欄に記載したものを指す。なお、「単為結果制御遺伝子の発現を抑制」の範疇には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。

また、単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているとは、機能性を有する単為結果遺伝子が存在するが、当該遺伝子の発現が抑制されている場合、および発現し得る単為結果遺伝子自体が機能を有していないか不完全な機能のみを有している場合のいずれの場合も包含している。このうち、単為結果遺伝子が機能を有していない例として、機能が欠損している変異型の単為結果遺伝子が発現している場合が挙げられる。

さらに、単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されているとは、活性を有するポリペプチドが存在するが、ポリペプチドの発現量が抑制されている場合、および発現しているポリペプチド自体が活性を有していないか不完全な機能のみを有している場合のいずれの場合も包含している。

また、上記検査工程において、上記単為結果制御遺伝子の発現が抑制されている植物、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されている植物と判定されたものを、単為結果性が制御された植物の候補として選抜することが好ましい。

上記検査工程を行う手法は特に限定されないが、検査の手法としては、遺伝学的な手法を用いた方法および生化学的な手法を用いた方法等が挙げられる。このうち、遺伝学的な手法を用いた方法としては、単為結果制御遺伝子の発現量の測定、単為結果制御遺伝子の塩基配列の解析およびマーカー配列を利用した解析等が挙げられ、生化学的な手法を用いた方法としてはポリペプチドのアミノ酸配列の解析、ポリペプチドの活性測定およびポリペプチドの関与する代謝反応産物の定量等が挙げられる。以下、これらの手法について、１）〜６）としてより詳細に説明する。なお、これら手法の中では、実施の容易さの観点で、１）または２）の手法が好ましい。
１）単為結果制御遺伝子の発現量の測定
対象となる植物における単為結果制御遺伝子の発現量を調べ、必要に応じて基準となる発現量と比較して、当該単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか否かを検査する。遺伝子の発現量は、例えば、定量ＲＴ−ＰＣＲ法およびノーザンハイブリダイゼーション法等で転写産物の量を測るか、定量ウエスタンブロット法等で翻訳産物の量を測る方法を採用すればよい。また、基準となる発現量とは、例えば、単為結果性を示さない同種の植物（例えば、単為結果制御遺伝子をホモに持つ個体）における単為結果制御遺伝子の発現量を指す。なお、遺伝子破壊の手法、またはＲＮＡｉ等の手法を用いて、単為結果制御遺伝子の転写または翻訳をほぼ完全に抑制する場合には、基準となる発現量との比較を要しない場合がある。

また、上述の単為結果制御遺伝子の発現量は、特定の生育段階および特定の部位特異的な発現量を調べることが好ましい。特定の部位としては子房または花芽全体が挙げられ、生育段階としては、開花前および開花当日の段階が挙げられる。
２）単為結果制御遺伝子の塩基配列の解析
対象となる植物における単為結果制御遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ）の塩基配列を解析する。そして、解析の結果、単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能に影響を与える変異が生じている場合には、当該ポリペプチドの機能が阻害されていると判定する。ポリペプチドの機能に影響を与える変異の一例は、単為結果制御遺伝子のコード領域を含む数十〜数千ｂｐのヌクレオチドの欠損であり、好ましくは少なくとも４０００ｂｐ〜５０００ｂｐのヌクレオチドの欠損である。

ポリペプチドの機能に影響を与える変異のその他の一例は、単為結果制御遺伝子のコード領域を含む数十〜数千ｂｐのヌクレオチドの重複であり、好ましくは少なくとも２００ｂｐ〜３００ｂｐのヌクレオチドの重複である。

ポリペプチドの機能に影響を与える変異のその他の一例は、いわゆるナンセンス変異やフレームシフト変異を引き起こすような、単為結果制御遺伝子上の変異である。かかる変異は、コード領域における１ｂｐ以上の変異によってもたらされ得る。

またこれらの変異は、例えば、一つの領域において生じており、或いは、複数の領域において生じている。また、複数の領域において変異が生じている場合、上述の異なる種類の変異がそれぞれの変異領域において生じていてもよい。
なお、このような変異は、相同染色体における一対の単為結果制御遺伝子の少なくとも一方に生じていればよいが、双方に生じている（すなわち劣性ホモである）ことが好ましい。
３）マーカー配列を利用した解析
単為結果制御遺伝子上の変異と連鎖するマーカー配列を利用し、単為結果制御遺伝子の塩基配列を直接的または間接的に検査する。上記のマーカー配列は、一例において、単為結果制御遺伝子が座乗する位置から約２０ｃＭ以内（すなわち約２０ｃＭ〜０ｃＭ）に位置しており、好ましくは約１０ｃＭ以内に位置しており、より好ましくは約１ｃＭ以内に位置しており、さらに好ましくは約０．１ｃＭ以内に位置している。なお、単為結果制御遺伝子上の変異をマーカー配列として利用することももちろん可能である。
４）ポリペプチドのアミノ酸配列の解析
対象となる植物から、単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドを単離する。そして、ポリペプチドのアミノ酸配列を解析する。そして、解析の結果、このポリペプチドの機能に影響を与える変異（例えば数十以上のアミノ酸の欠失を伴うトランケート体の発生）が生じている場合には、ポリペプチドの機能が阻害されていると判定する。
５）ポリペプチドの活性測定
対象となる植物から、単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドを単離する。または対象となる植物における単為結果制御遺伝子のクローンを発現ベクターに導入して、宿主細胞に導入することにより、一過的にポリペプチドを発現させる。これを培養、抽出および精製したものを用いて、ＩＰｙＡとアミノ酸とを基質としたトリプトファン合成を触媒するアミノ基転移酵素活性の有無を検査し、当該アミノ基転移酵素活性が無いか、正常な植物と比較して低下している場合に、ポリペプチドの機能が阻害されていると判定する。一態様では、ＩＰｙＡとメチオニンとを基質としたトリプトファン合成を触媒するアミノ基転移酵素活性の有無を検査し、当該アミノ基転移酵素活性が無いか、正常な植物と比較して低下している場合に、ポリペプチドの機能が阻害されていると判定する。

上述のペプチドの発現に用いる発現ベクターとしては、〔３．組換え発現ベクター、および形質転換体〕の項目において記載のものが好適に用いられる。

また、宿主細胞としては、〔３．組換え発現ベクター、および形質転換体〕の項目において記載のものが好適に用いられる。

ポリペプチドの合成、抽出および精製方法は、特に限定されず、公知の方法が好適に用いられる。ポリペプチドの合成方法の一例として、アグロバクテリウムを介して、タバコの葉などに一過的発現させる方法、および大腸菌にポリペプチドの発現ベクターを形質転換し、当該大腸菌を培養することによってポリペプチドを発現させる方法等が挙げられる。

また、ＩＰｙＡとアミノ酸とを基質としたトリプトファン合成を触媒するアミノ基転移酵素活性の測定方法として、例えば、上述の方法によって得られたポリペプチドに対し、アミノ酸混合液（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、ＰｈｅおよびＧｌｕ）およびＩＰｙＡを加えて、インキュベーションした反応液を、精製しＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に供する方法が挙げられる。また、別の一態様では、上述の方法によって得られたポリペプチドに対し、メチオニン（例えば、Ｌ−Ｍｅｔ）およびＩＰｙＡを加えて、インキュベーションした反応液を、精製しＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に供する方法が挙げられる。また、本発明に係る単為結果性の判定方法において、本発明のポリペプチドの機能の阻害を判定するための、上記４）または５）の解析に加え以下の６）の検査をさらに行うことが好ましい。
６）内生のインドール酢酸（ＩＡＡ）およびインドールピルビン酸（ＩＰｙＡ）量の測定
対象となる植物から、内生のインドール酢酸（ＩＡＡ）およびインドールピルビン酸（ＩＰｙＡ）のうちの少なくとも１つの含まれる溶液を抽出し、これらの物質のうちの少なくとも１つの量を検査する。そして、検査の結果、正常な植物と比較して、これら物質の量が有意に多い場合には、ポリペプチドの機能が阻害されていると判定する。なお、物質の量が有意に多いとは特に限定されないが、好ましくは２倍以上の量（濃度）であり、より好ましくは３倍以上の量（濃度）である場合を意図する。

また、上述のこれらの物質のうちの少なくとも１つの量は、特定の生育段階および特定の部位特異的な量を調べることが好ましい。特定の部位としては子房または花芽全体が挙げられ、生育段階としては、開花前および開花当日の段階が挙げられる。すなわち、開花前または開花当日の、子房または花芽におけるＩＡＡまたはその前駆物質であるＩＰｙＡの濃度を測定することがより好ましい。

上述の物質の量の測定方法としては、質量分析装置を用いた測定、ＨＰＬＣを用いた測定およびＥＬＩＳＡ等の方法が挙げられる。なかでも、感度および精度に優れているという点において、質量分析装置を用いた測定方法が好ましい。測定に用いる質量分析装置としては、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳおよびＧＣ／ＭＳ等が挙げられる。

本発明に係る判定方法が適用される植物の種類は特に限定されず、ナス科、バラ科およびウリ科等が挙げられ、ナス科の植物が好ましい。なかでも、ナスおよびトマト等のナス科ナス属の植物かトウガラシ等のナス科トウガラシ属の植物であることが好ましく、ナス、トマトおよびトウガラシの何れかであることがより好ましく、ナスまたはトマトであることがさらに好ましく、ナスであることが特に好ましい。また、この判定方法が適用される植物は、例えば、育種素材（親植物、すなわち花粉親、または種子親）や、育種により得られた子孫等が挙げられる。なお、育種とは交配による手法のほか、遺伝子工学的な手法も含む概念である。

単為結果性は栽培条件または品種系統によって形質発現が不安定になることがあるため、植物の外見のみに依拠すると評価が難しい場合がしばしば生じる。また、単為結果制御遺伝子がヘテロ接合となっている植物も育種材料等として利用価値があるが、特にヘテロ接合の場合は外見だけでは単為結果性を示しうるか否かが明確に判断できない場合もある。本発明に係る単為結果性の判定方法は遺伝子レベルでの判定であるから、遺伝子のホモ化を行って形質評価を行わなくてもよくなり、例えば育種選抜の効率を大幅に向上可能となる。また、単為結果制御遺伝子が明らかとなったため、遺伝子工学的手法を用いる等して、本来この単為結果制御遺伝子と共分離する不良形質との連鎖を切り離すことも可能になる。

〔５．単為結果性が制御された植物の生産方法、および作出した植物〕
本発明に係る、単為結果性が制御された植物の生産方法の一形態（形態１とする）は、上記〔４．植物の単為結果性の判定方法〕欄で記載した判定方法を行って、単為結果性が制御された植物を選抜する工程を含む方法である。

また、本発明に係る、単為結果性が制御された植物の生産方法の他形態（形態２とする）は、植物において、単為結果制御遺伝子の発現を抑制するか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程を含む方法である。ここで、「単為結果制御遺伝子」は上記〔１．単為結果制御遺伝子〕欄に記載したものを指し、「単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチド」は上記〔２．単為結果制御タンパク質としてのポリペプチド〕欄に記載したものを指す。

なお、上記形態２では、上記単為結果制御遺伝子を破壊するか、上記単為結果制御遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを植物に導入することによって、単為結果制御遺伝子の発現を抑制することが好ましい。なお、「単為結果制御遺伝子の発現を抑制」の範疇には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。上記単為結果制御遺伝子を破壊するか、上記単為結果制御遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを植物に導入することによって、単為結果制御遺伝子の発現を抑制する方法としては、例えば、遺伝子工学的な手法が挙げられる。

単為結果制御遺伝子を破壊する手法は特に限定されず、例えば、遺伝子工学的な手法として、相同組換えを用いた特異的な遺伝子破壊を行う、ＥＭＳ（ethyl methane sulfonate：エチルメタンスルホン酸）処理などによって、遺伝子の変異誘導を行う、部位特異的突然変異誘発法を用いて単為結果制御遺伝子の途中に終止コドンを導入する、重イオンビーム等の照射によって物理的に遺伝子の一部を破壊する等の方法で行うことができる。

また、単為結果制御遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを植物に導入する手法は特に限定されず、例えば、ＲＮＡ干渉、またはアンチセンスＲＮＡ等の手法によって行うことができる。このポリヌクレオチドを含む発現カセット（例えばベクター等）を植物へ導入する方法は特に限定されず、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法等を適宜用いればよい。なお、このポリヌクレオチドを含む発現カセットは、植物細胞、カルス、植物組織、または植物個体に対して導入すればよい。

なお、単為結果制御遺伝子の発現の抑制は、単為結果制御遺伝子の遺伝子発現を制御している発現調節配列（例えば、プロモータ配列、またはエンハンサー配列）に、遺伝子発現を抑制するような変異を導入することによっても行うことができる。

本発明はまた、上記の生産方法により生産された、単為結果性が制御された植物も提供する。単為結果性が制御された植物とは、単為結果性という形質が出現した植物の他、単為結果性という形質が出現していないものの、その素因を保有する植物を含む概念である。

本発明に係る方法により生産される植物の種類は特に限定されず、ナス科、バラ科およびウリ科等が挙げられ、ナス科の植物が好ましい。なかでも、ナスおよびトマト等のナス科ナス属の植物かトウガラシ等のナス科トウガラシ属の植物であることが好ましく、ナス、トマトおよびトウガラシの何れかであることがより好ましく、ナスまたはトマトであることがさらに好ましく、ナスであることが特に好ましい。

また、本発明に係る方法により生産される植物の一態様には、本発明に係る単為結果制御遺伝子に、以下の〔６．単為結果性が制御された植物〕において記載する受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２２２５７で特定される植物（ナス）またはその後代植物と、同じ遺伝子変異を有して単為結果性を示す植物も含まれる。

また、本発明に係る方法により生産される植物の別の一態様には、本発明に係る単為結果制御遺伝子に、以下の〔６．単為結果性が制御された植物〕において記載する受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２２２５７で特定される植物（ナス）またはその後代植物と、同じ単為結果性を示す植物も含まれる。

〔６．単為結果性が制御された植物〕
本発明はまた、単為結果性を示す新規な植物も提供する。この植物では、以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子（すなわち、本発明に係る単為結果制御遺伝子）の発現が抑制されているか、当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチド（すなわち、本発明に係るポリペプチド）の機能が阻害されており、単為結果性を示す。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜９８個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

本発明に係る単為結果性を示す新規な植物の好ましい一例では、上記ポリペプチドの機能としての、アミノ酸のアミノ基をインドールピルビン酸（ＩＰｙＡ）に転移してトリプトファンを合成する反応を触媒する活性（アミノ基転移酵素活性）が野生型と比較して低下しているか欠損している。本発明に係る単為結果性を示す新規な植物の他の好ましい一例では、上記ポリペプチドの機能としての、メチオニンのアミノ基をインドールピルビン酸（ＩＰｙＡ）に転移してトリプトファンを合成する反応を触媒する活性（アミノ基転移酵素活性）が野生型と比較して低下しているか欠損している。すなわち、上記ポリペプチドのアミノ酸配列において、アミノ基転移酵素活性の低下または欠損をもたらすアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加が生じている植物が含まれる。このような植物のより具体的な一例は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２２２５７で特定される植物（ナス）またはその後代植物である（実施例も参照）。なお、この植物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許生物寄託センター（２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）へ、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２２２５７（受託日：２０１３年９月１１日）として寄託されている。後代植物のより具体的な一例としては、例えば、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２２２５７で特定されるナス系統を、他のナス系統または受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２２２５７と単交配もしくは複交配させて得られ、本発明に係る単為結果制御遺伝子に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２２２５７と同じ遺伝子変異を有して単為結果性を示すナスが挙げられる。

本発明に係る、単為結果性を示す植物の他の例としては、本発明に係る単為結果制御遺伝子に野生型と比較して塩基配列の変異があり、開花時の未受粉子房における単為結果制御遺伝子のｍＲＮＡの蓄積量が抑制されていて、単為結果性を示す植物が挙げられる。

本発明に係る、単為結果性を示す植物のさらに他の例としては、本発明に係る単為結果制御遺伝子のコードしているポリペプチドに、野生型と比較してアミノ酸配列の変異があり、開花時の未受粉子房における上記ポリペプチドの機能としてのアミノ基転移酵素活性が低下しているか欠損していて単為結果性を示す植物が挙げられる。また、本発明に係る、単為結果性を示す植物のさらに具体的な例示としては、上述の開花時の未受粉子房における本発明に係る単為結果制御遺伝子のコードしているポリペプチドの機能としてのアミノ基転移酵素活性が、メチオニンのアミノ基をインドールピルビン酸（ＩＰｙＡ）に転移してトリプトファンを合成する反応を触媒する活性であって、上記ポリペプチドに、野生型と比較してアミノ酸配列の変異があり、メチオニンのアミノ基をインドールピルビン酸（ＩＰｙＡ）に転移してトリプトファンを合成する反応を触媒する活性が低下しているか欠損していて単為結果性を示す植物が挙げられる。

また、本発明に係る、単為結果性を示す植物のさらに他の例としては、本発明に係る単為結果制御遺伝子の野生型と比較して塩基配列の変異があり、開花時の未受粉子房におけるオーキシン（またはＩＡＡ、またはＩＰｙＡ）の内生量が上昇していて、単為結果性を示す植物が挙げられる。

本発明に係る、単為結果性を示す植物の他の例には、上記〔５．単為結果性が制御された植物の生産方法、および作出した植物〕欄に記載の生産方法により生産された単為結果性が制御された植物のうち、単為結果性という形質が出現した植物も含まれる。本発明に係る、単為結果性を示す植物の種類は特に限定されず、ナス科、バラ科およびウリ科等が挙げられ、ナス科の植物が好ましい。なかでも、ナスおよびトマト等のナス科ナス属の植物かトウガラシ等のナス科トウガラシ属の植物であることが好ましく、ナス、トマトおよびトウガラシの何れかであることがより好ましく、ナスまたはトマトであることがさらに好ましく、ナスであることが特に好ましい。また、本発明に係る、単為結果性を示す植物には、単為結果性を示す新規な植物の後代植物も含まれる。なお、植物とは、植物体自体、当該植物体の部分、または種子等を含む概念である。さらに、本発明に係る、単為結果性を示す植物には、受粉を妨げた花において、同一の栽培条件下で正常に受粉した花が正常に着果した場合と、同等の果実重を有する果実が着生する植物を含んでいる。

〔７．本発明に係る具体的な態様の例示〕
本発明は、以下の＜１＞〜＜１９＞の何れかを包含する。
＜１＞ 植物において、以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されているかを検査する検査工程を含む、植物の単為結果性の判定方法。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜９８個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜２＞ 上記検査工程において、上記単為結果制御活性を有するポリペプチドの配列、上記単為結果制御遺伝子の塩基配列、当該単為結果制御遺伝子の発現量もしくは当該単為結果制御遺伝子の転写産物の量を検査する、＜１＞に記載の判定方法。
＜３＞ 上記検査工程において、上記単為結果制御遺伝子の発現が抑制されている植物、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されている植物を、単為結果性を示す植物として選抜する、＜１＞または＜２＞に記載の判定方法。
＜４＞ ＜１＞〜３の何れかに記載の判定方法を行い、単為結果性を示す植物を選抜する工程を含む、単為結果性が制御された植物の生産方法。
＜５＞ 植物において、以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現を抑制するか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程を含む、単為結果性が制御された植物の生産方法。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜９８個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜６＞ 上記工程において、上記単為結果制御遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを植物に導入するか、上記単為結果制御遺伝子を破壊する、＜５＞に記載の生産方法。
＜７＞ 上記植物がナス科の植物である＜１＞〜＜６＞の何れかに記載の方法。
＜８＞ 上記植物がナスである＜７＞に記載の方法。
＜９＞ ＜５＞〜＜８＞の何れかに記載の生産方法により生産された、単為結果性が制御された植物。
＜１０＞ 以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜９８個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜１１＞ 以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリペプチド。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜９８個の置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド、
（４）上記（１）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、単為結果制御活性を有するポリペプチド。
＜１２＞ 以下の（１）〜（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか、当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されており、単為結果性を示す植物。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜９８個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（４）上記（１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜１３＞ 上記ポリペプチドの機能としての、アミノ酸のアミノ基をインドールピルビン酸（ＩＰｙＡ）に転移してトリプトファンを合成する反応を触媒する活性（アミノ基転移酵素活性）が低下しているか欠損している、請求項１２に記載の植物。
＜１４＞ 上記ポリペプチドのアミノ酸配列において、アミノ基転移酵素活性の低下または欠損をもたらすアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加が生じている、＜１３＞に記載の植物。
＜１５＞ 上記アミノ酸のアミノ基をインドールピルビン酸（ＩＰｙＡ）に転移してトリプトファンを合成する反応において、アミノ基転移の生じるアミノ酸の少なくとも一つはメチオニンである、＜１３＞または＜１４＞に記載の植物。
＜１６＞ ナス科の植物である、＜１２＞〜＜１５＞の何れかに記載に記載の植物およびその後代植物。
＜１７＞ 上記ナス科の植物が、ナス、トマトまたはトウガラシである、＜１６＞に記載の植物およびその後代植物。
＜１８＞ 上記植物が、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２２２５７で特定される植物またはその後代植物である、＜１７＞に記載の植物。
＜１９＞ 植物体、当該植物体の部分または種子である、＜１２＞〜＜１８＞の何れかに記載の植物。

〔８．本発明に係るその他の態様の例示〕
その他の態様として、本発明は以下の何れかの一態様を包含する。
＜ｔ１＞ 植物において、以下の（ｔ１）〜（ｔ４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されているかを検査する検査工程を含む、植物の単為結果性の判定方法。
（ｔ１）配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｔ２）配列番号２８に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｔ３）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において１〜９８個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｔ４）上記（ｔ１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜ｔ２＞ 上記検査工程において、上記単為結果制御活性を有するポリペプチドの配列、上記単為結果制御遺伝子の塩基配列、当該単為結果制御遺伝子の発現量もしくは当該単為結果制御遺伝子の転写産物の量を検査する、＜ｔ１＞に記載の判定方法。
＜ｔ３＞ 上記検査工程において、上記単為結果制御遺伝子の発現が抑制されている植物、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されている植物を、単為結果性を示す植物として選抜する、＜ｔ１＞または＜ｔ２＞に記載の判定方法。＜ｔ４＞ ＜ｔ１＞〜＜ｔ３＞の何れかに記載の判定方法を行い、単為結果性を示す植物を選抜する工程を含む、単為結果性が制御された植物の生産方法。
＜ｔ５＞ 植物において、以下の（ｔ１）〜（ｔ４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現を抑制するか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程を含む、単為結果性が制御された植物の生産方法。
（ｔ１）配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｔ２）配列番号２８に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｔ３）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において１〜９８個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｔ４）上記（ｔ１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜ｔ６＞ 上記工程において、上記単為結果制御遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを植物に導入するか、上記単為結果制御遺伝子を破壊する、＜ｔ７＞に記載の生産方法。
＜ｔ７＞ 上記植物がナス科の植物である＜ｔ１＞〜＜ｔ８＞の何れかに記載の方法。
＜ｔ８＞ 上記植物がナスである＜ｔ９＞に記載の方法。
＜ｔ９＞ ＜ｔ５＞〜＜ｔ８＞の何れかに記載の生産方法により生産された、単為結果性が制御された植物。
＜ｔ１０＞ 以下の（ｔ１）〜（ｔ４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子。
（ｔ１）配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｔ２）配列番号２８に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｔ３）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において１〜９８個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｔ４）上記（ｔ１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜ｔ１１＞ 以下の（ｔ１）〜（ｔ４）の何れかに記載のポリペプチド。
（ｔ１）配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｔ２）配列番号２８に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド、
（ｔ３）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において１〜９８個の置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド、（ｔ４）上記（ｔ１）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、単為結果制御活性を有するポリペプチド。
＜ｔ１２＞ 以下の（ｔ１）〜（ｔ４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか、当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されており、単為結果性を示す植物。
（ｔ１）配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｔ２）配列番号２８に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｔ３）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において１〜９８個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｔ４）上記（ｔ１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜ｔ１３＞ 上記ポリペプチドの機能としての、アミノ酸のアミノ基をインドールピルビン酸（ＩＰｙＡ）に転移してトリプトファンを合成する反応を触媒する活性（アミノ基転移酵素活性）が低下しているか欠損している、請求項１２に記載の植物。
＜ｔ１４＞ 上記ポリペプチドのアミノ酸配列において、アミノ基転移酵素活性の低下または欠損をもたらすアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加が生じている、＜ｔ１３＞に記載の植物。
＜ｔ１５＞ 上記アミノ酸のアミノ基をインドールピルビン酸（ＩＰｙＡ）に転移してトリプトファンを合成する反応において、アミノ基転移の生じるアミノ酸の少なくとも一つはメチオニンである、＜ｔ１３＞または＜ｔ１４＞に記載の植物。
＜ｔ１６＞ ナス科の植物である、＜ｔ１２＞〜＜ｔ１５＞の何れかに記載に記載の植物およびその後代植物。
＜ｔ１７＞ 上記ナス科の植物が、ナス、トマトまたはトウガラシである、＜ｔ１６＞に記載の植物およびその後代植物。
＜ｔ１８＞ 上記植物が、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２２２５７で特定される植物またはその後代植物である、＜ｔ１７＞に記載の植物。
＜ｔ１９＞ 植物体、当該植物体の部分または種子である、＜ｔ１２＞〜＜ｔ１８＞の何れかに記載の植物。

さらに他の態様として、本発明は以下の何れかの一態様を包含する。
＜ｐ１＞ 植物において、以下の（ｐ１）〜（ｐ４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されているかを検査する検査工程を含む、植物の単為結果性の判定方法。
（ｐ１）配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｐ２）配列番号３４に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｐ３）配列番号３４に記載のアミノ酸配列において１〜９８個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｐ４）上記（ｐ１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜ｐ２＞ 上記検査工程において、上記単為結果制御活性を有するポリペプチドの配列、上記単為結果制御遺伝子の塩基配列、当該単為結果制御遺伝子の発現量もしくは当該単為結果制御遺伝子の転写産物の量を検査する、＜ｐ１＞に記載の判定方法。
＜ｐ３＞ 上記検査工程において、上記単為結果制御遺伝子の発現が抑制されている植物、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されている植物を、単為結果性を示す植物として選抜する、＜ｐ１＞または＜ｐ２＞に記載の判定方法。＜ｐ４＞ ＜ｐ１＞〜＜ｐ３＞の何れかに記載の判定方法を行い、単為結果性を示す植物を選抜する工程を含む、単為結果性が制御された植物の生産方法。
＜ｐ５＞ 植物において、以下の（ｐ１）〜（ｐ４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現を抑制するか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程を含む、単為結果性が制御された植物の生産方法。
（ｐ１）配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｐ２）配列番号３４に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｐ３）配列番号３４に記載のアミノ酸配列において１〜９８個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｐ４）上記（ｐ１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜ｐ６＞ 上記工程において、上記単為結果制御遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを植物に導入するか、上記単為結果制御遺伝子を破壊する、＜ｐ７＞に記載の生産方法。
＜ｐ７＞ 上記植物がナス科の植物である＜ｐ１＞〜＜ｐ８＞の何れかに記載の方法。
＜ｐ８＞ 上記植物がナスである＜ｐ９＞に記載の方法。
＜ｐ９＞ ＜ｐ５＞〜＜ｐ８＞の何れかに記載の生産方法により生産された、単為結果性が制御された植物。
＜ｐ１０＞ 以下の（ｐ１）〜（ｐ４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子。
（ｐ１）配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｐ２）配列番号３４に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｐ３）配列番号３４に記載のアミノ酸配列において１〜９８個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｐ４）上記（ｐ１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜ｐ１１＞ 以下の（ｐ１）〜（ｐ４）の何れかに記載のポリペプチド。
（ｐ１）配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｐ２）配列番号３４に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド、
（ｐ３）配列番号３４に記載のアミノ酸配列において１〜９８個の置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド、（ｐ４）上記（ｐ１）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、単為結果制御活性を有するポリペプチド。
＜ｐ１２＞ 以下の（ｐ１）〜（ｐ４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか、当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されており、単為結果性を示す植物。
（ｐ１）配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｐ２）配列番号３４に記載のアミノ酸配列に対して７５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｐ３）配列番号３４に記載のアミノ酸配列において１〜９８個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｐ４）上記（ｐ１）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜ｐ１３＞ 上記ポリペプチドの機能としての、アミノ酸のアミノ基をインドールピルビン酸（ＩＰｙＡ）に転移してトリプトファンを合成する反応を触媒する活性（アミノ基転移酵素活性）が低下しているか欠損している、請求項１２に記載の植物。
＜ｐ１４＞ 上記ポリペプチドのアミノ酸配列において、アミノ基転移酵素活性の低下または欠損をもたらすアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加が生じている、＜ｐ１３＞に記載の植物。
＜ｐ１５＞ 上記アミノ酸のアミノ基をインドールピルビン酸（ＩＰｙＡ）に転移してトリプトファンを合成する反応において、アミノ基転移の生じるアミノ酸の少なくとも一つはメチオニンである、＜ｐ１３＞または＜ｐ１４＞に記載の植物。
＜ｐ１６＞ ナス科の植物である、＜ｐ１２＞〜＜ｐ１５＞の何れかに記載に記載の植物およびその後代植物。
＜ｐ１７＞ 上記ナス科の植物が、ナス、トマトまたはトウガラシである、＜ｐ１６＞に記載の植物およびその後代植物。
＜ｐ１８＞ 上記植物が、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２２２５７で特定される植物またはその後代植物である、＜ｐ１７＞に記載の植物。
＜ｐ１９＞ 植物体、当該植物体の部分または種子である、＜ｐ１２＞〜＜ｐ１８＞の何れかに記載の植物。

本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。

〔実施例１：ナス由来の単為結果遺伝子Ａ〕
（１．ナス由来の単為結果原因遺伝子Ａの同定および解析）
＜単為結果性ナス系統「ＰＣＳＳ」の発見＞
以下、図１を参照して説明する。図１は、本発明の実施例に係る単為結果性ナス系統「ＰＣＳＳ」の単為結果性を示す図である。図１の（ａ）は、開花前の蕾の段階で柱頭を切除し受粉を妨げた場合における、単為結果性ナス系統「ＰＣＳＳ」のナスの果実を示し、図１の（ｂ）は、開花前の蕾の段階で柱頭を切除し受粉を妨げた場合における、単為結果性ナス系統「ＰＣＳＳ」のナスの果実（左）および非単為結果性の一般品種である「千両二号」の果実（右）を示す。

系統ＰＣＳＳは、単為結果性を示すナス（Solanum melongena）の自殖固定系統である。この系統は、発明者が独自に育成したナスの育種母本系統「系統１」および「系統２」の交雑後代を用いた品種改良の過程で見いだされた。

開花前の蕾の段階で柱頭を切除し受粉を妨げた場合、非単為結果性の一般品種である「千両二号」の果実はほとんど肥大しないが、（図１の（ｂ））、系統ＰＣＳＳは正常な果実肥大を示す（図１の（ａ）および（ｂ））。

その後の解析により、以下について明らかとなった：
（１）育成の両親系統として用いた「系統１」および「系統２」はいずれも単為結果性を持たない。（２）その２系統の交雑後代から得られた多数の自殖兄弟系統において、系統ＰＣＳＳ以外に単為結果性を示す系統は認められない。（３）系統ＰＣＳＳの自殖後代では全ての個体が単為結果性を示す。（４）系統ＰＣＳＳと非単為結果性系統との交雑後代には、系統ＰＣＳＳと同様の単為結果性を示す個体が一定頻度で出現する。

以上の結果から、この系統ＰＣＳＳの単為結果性は交雑育種の過程における自然突然変異によって生じた新規の遺伝的変異によるものであると結論した。よって、この系統ＰＣＳＳを単為結果性ナス系統として、受託番号「FERM BP-22257」により登録した。

＜単為結果性の詳細マッピング＞
上述の単為結果性ナス系統ＰＣＳＳと非単為結果性ナス系統ＴＮ−４３（タキイ種苗育成）とを交雑して得られた雑種第１代をさらに自殖して、交雑第２世代（Ｆ２）を得た。このＦ２世代を９３個体栽培し、その単為結果性を評価した。その結果、単為結果性を示す個体は２３個体、非単為結果性の個体は７０個体であり、その分離比はほぼ１：３であった。このことから、ＰＣＳＳの持つ単為結果性は劣性の１遺伝子支配であることが示唆された。これらのＦ２個体よりゲノムＤＮＡを抽出し、ナスゲノム全体に分布した６４個のＤＮＡマーカー（参考文献：Fukuoka et al. (2012) Theor. Appl. Genet. 125: 47-56）を用いてそのマーカー遺伝子型を決定した。そのマーカー遺伝子型情報に基づいて単為結果性を支配する遺伝子のマーカー連鎖地図上の座乗位置をMapmaker/EXP（参考文献：Lander et al., 1987, Genomics 1: 174-181）を用いて計算し、当該遺伝子の座乗位置の推定を行った。図２は、推定された単為結果原因遺伝子Ａが座乗する領域の連鎖地図を示す。図２に示すように、当該遺伝子は第３染色体の２つのＤＮＡマーカーＳＯＬ７２１４とｅｍｅ０７Ｄ０２とに挟まれた約２０ｃＭの領域に座乗すると推定された。

さらに、表現型とマーカー遺伝子型との対応を直接比較して、当該遺伝子の座乗領域の確定を試みた。結果を図３に示す。図３は、単為結果性ナス系統ＰＣＳＳと非単為結果性ナス系統ＴＮ−４３との交雑後の各世代における表現型とマーカー遺伝子型との対応関係を示す図である。図３の（ａ）は、Ｆ２世代の表現型とマーカー遺伝子型との対応関係を示す図である。

図３の（ａ）に示すように、個体２４および個体４４が単為結果性を持たず、個体３０および個体４５が単為結果性を示すことから、当該遺伝子はｅｓｔ＿ｓｍｆｌ２８ｊ２１とｅｍｅ０７Ｄ０２とに挟まれた領域に存在することが明らかとなった。ナス第３連鎖群のこの領域近傍では、トマト染色体との間で各遺伝子の並び順が高度に保存されていること（シンテニー）が報告されている（参考文献：Wu et al. (2009) Theor. Appl. Genet. 118: 927-935, Fukuoka et al. (2012) Theor. Appl. Genet. 125: 47-56）。そこで、さらに当該遺伝子の座乗位置を絞り込むため、トマトゲノム配列を利用した新たなＤＮＡマーカーの開発を行った。推定座乗領域の末端を規定する2つのＤＮＡマーカーのうち、est_smfl28j21はナス発現配列SmFL28J21（参考文献：Fukuoka et al. (2010) Gene 450: 76-84）に基づいて開発されたものであり、トマト全ゲノム配列（ＳＬ２．４０ｃｈ、参考文献：The Tomato Genome Consortium (2012) Nature 485: 635-641）に対するＢＬＡＳＴＮ検索により、トマト第3染色体上の塩基番号６１３５８４７２から６１３７３７７３に存在する予測遺伝子Solyc03g118430.2.1と極めて高い配列同一性を示すことが明らかとなった。一方、eme07D02はナスゲノム上に散在する反復配列を利用したゲノムＳＳＲマーカーであり、トマトゲノム配列との対応関係を正確に予測することが困難であったため、さらにその外側に位置するＳＯＬ８３６９の配列に基づいてマーカーの開発を進めた。ＳＯＬ８３６９の由来配列であるナス発現配列ＳｍＦＬ１４Ｂ２３はトマト第３染色体上の塩基番号６４５９７４２１から６４６０２０１５に予測された推定遺伝子Ｓｏｌｙｃ０３ｇ１２３８４０．２．１と極めて高い配列同一性を示した。すなわち、ＰＣＳＳの単為結果性を支配する遺伝子の座乗領域は、トマトゲノム上では第３染色体上の塩基番号６１３５８４７２から６４６０２０１５までのおよそ３．２４Ｍｂの領域に対応すると推定された。さらに、独自に解読したナスＥＳＴ配列（計４３，２５０配列）を問い合わせ配列として、トマトゲノム配列に対してＢＬＡＳＴによる配列同一性検索を行ったところ、この３．２４Ｍｂのトマトゲノム上に存在する推定遺伝子に対応する４２７のナスＥＳＴが見いだされた。そこで、この４２７のナスＥＳＴ配列に基づいてＰＣＲプライマーを設計し、ＰＣＳＳおよびＴＮ−４３のゲノムＤＮＡを増幅してその多型を調査することにより、９個のＳＮＰマーカーと１個のＳＳＲマーカーをｅｓｔ＿ｓｍｆｌ２８ｊ２１とＳＯＬ８３６９との間に配置することができた。これらのマーカーを用いて、Ｆ３世代以降の各個体において、その表現型、すなわち単為結果性の有無とマーカー遺伝子型との対応の比較を行った。まず、ｅｓｔ＿ｓｍｆｌ２８ｊ２１とＳＯＬ８３６９に挟まれた領域について、ＰＣＳＳ系統に由来する領域とＴＮ−４３に由来する領域をヘテロに持つＦ２個体を自殖し、その後代から当該領域の間で組換えを生じた個体をＤＮＡマーカーによって選抜した。さらに、その個体を自殖して組換え型のホモ系統を育成しその単為結果性の有無を検討するとともに、組換え箇所を特定するための新たなＳＮＰマーカーの開発を繰り返した。結果を図３の（ｂ）に示す。図３の（ｂ）は、Ｆ３世代以降の表現型とマーカー遺伝子型との対応関係を示す図である。図３の（ｂ）に示すように、Ｆ３世代においてはｅｃ３１１０Ａとｅｃ３０７７Ｆとに挟まれる領域、Ｆ５世代ではその内側のＳＳＲ０３とｅｃ３０８７Ｘとに挟まれる領域、Ｆ８世代ではさらに絞りこんだＳＳＲ０３とＰａＳｅｑ１２８とに挟まれる領域へと、世代を追って単為結果性を支配する遺伝子の存在する可能性のあるゲノム領域を狭めることができた。

（２．単為結果性の原因遺伝子Ａの単離）
＜遺伝子Ａの完全長ｃＤＮＡの単離および配列決定＞
ＰａＳｅｑ１２３を増幅するＰＣＲプライマーを用いたナス（系統ＡＥ−Ｐ０３、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構育成）のＢＡＣライブラリーのスクリーニングにより、この領域を含むＢＡＣクローン０８Ｋ１９を単離した。このクローンのショットガンライブラリを作成し、インサートの全長について塩基配列を決定した。その結果、ＳＳＲ０３とＰａＳｅｑ１２８との間の物理距離は系統ＡＥ−Ｐ０３において３１，４８４ｂｐであることが明らかとなった。そこで、この領域について、系統ＰＣＳＳと系統ＴＮ−４３双方の塩基配列を決定したところ、系統ＰＣＳＳには系統ＴＮ−４３および系統ＡＥ−Ｐ０３には見られない特徴的な構造変異が存在することが明らかとなった。その構造をさらに詳細に解析したところ、系統ＰＣＳＳではＳＳＲ０３とＰａＳｅｑ１２３との間の領域において、４５５８ｂｐの欠失と２２７ｂｐの重複が生じていることが明らかとなった。

ＳＳＲ０３とＰａＳｅｑ１２８に挟まれた領域を対象として、野生型（ＡＥ−Ｐ０３）の配列を用いて遺伝子予測プログラムＧｅｎＳｃａｎ（参考文献：Burge, C. and Karlin, S. (1997) J. Mol. Biol. 268: 78-94．）により構造遺伝子を予測したところ、４つの構造遺伝子の存在が示唆された。そのうちの１つの遺伝子（遺伝子Ａ）は、前述した系統ＰＣＳＳに特異的な構造変異の箇所に存在しており、その欠失によって系統ＰＣＳＳではタンパク質のコード領域を含む遺伝子領域の一部が失われていると推定された。

そこで、まず遺伝子予測プログラムで予測された遺伝子が実際に存在することを確認するため、ＲＡＣＥ法によって遺伝子Ａの完全長ｃＤＮＡをクローニングした。クローニングは、予測された遺伝子の塩基配列に基づいて設計したＰＣＲプライマーを用い、非単為結果性のナス標準品種「中生真黒」の蕾から抽出した全ＲＮＡを材料としておこなった。

まず、「中生真黒」の開花約３日前の蕾から摘出した子房から、Ｔｒｉｚｏｌ法によって全ＲＮＡを抽出し、SMARTer RACE cDNA amplification kit（タカラバイオ株式会社）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号３９および配列番号４０で示すポリヌクレオチドを遺伝子特異的プライマーとして用い、Ｎｅｓｔｅｄ−５’−ＲＡＣＥ法によって、ｍＲＮＡの転写開始点および翻訳開始点を含むｃＤＮＡの増幅を試みた。増幅産物を、大腸菌発現ベクターにクローニングし、その配列をＳａｎｇｅｒ法によって決定した。ＰＣＲ法によって生じる、低頻度の配列変異の影響を排除するため、得られた複数のクローンの塩基配列をそれぞれ独立に決定した。その結果、完全長ｃＤＮＡの５’側末端の３９４ｂｐの配列を得た。同様に、配列番号４１および配列番号４２で示すポリヌクレオチドを遺伝子特異的プライマーとして用いたＮｅｓｔｅｄ−３’−ＲＡＣＥ法によって、翻訳終止点およびポリアデニレーション部位を含むｃＤＮＡの増幅と大腸菌発現ベクターへのクローニングおよびその配列決定を試みた。その結果、完全長ｃＤＮＡの３’側末端１２４７ｂｐの配列を得た。これら２つの配列の重複部位に基づいて、配列の統合を行い、配列番号２に示す１６２５ｐの配列を得て、これを単為結果原因遺伝子Ａの完全長ｃＤＮＡ配列とした。

＜植物体の各部位の各生育段階における遺伝子Ａの発現量の解析＞
この結果に基づき、配列番号４３および配列番号４４で示すポリヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより、遺伝子Ａのタンパクコード全体を含むＤＮＡ断片をクローニングした。ＰＣＲ反応の鋳型として、前述した「中生真黒」の全ＲＮＡからトランスクリプターファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いて合成したｃＤＮＡを用いた。得られた増幅断片を、制限酵素ＸｍａＩおよびＳａｃＩで消化し、クローニングベクターｐＵＣ１９（タカラバイオ株式会社）のＸｍａＩ−ＳａｃＩ部位に挿入した。得られた複数のクローンについて挿入断片の塩基配列を決定し、配列番号２で示す完全長ｃＤＮＡ配列と比較して変異のないクローンを選択した。その配列を配列番号３に示す。

また、ナス品種「中生真黒」の開花前の蕾（蕾長４ｍｍ、８ｍｍ、１０ｍｍ、１４ｍｍ、開花前５日および開花前２日の６段階）および開花当日の花から摘出した子房および生育中の未熟果実（開花後３日、７日および１４日の３段階）からＲＮＡを抽出し、このＲＮＡを鋳型として、Superscript VILO ｃＤＮＡ合成キット（ライフテクノロジーズ社）を用いて合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、配列番号４５および配列番号４６に示すオリゴヌクレオチドをプライマーに用いた定量ＰＣＲによって遺伝子ＡのｍＲＮＡ蓄積量を調査した。定量値を標準化するための内部標準遺伝子としては、発明者等が独自に見いだしたナス構成的発現遺伝子２０Ｆ０１Ａを用いた。また内部標準遺伝子増幅用のプライマーとしては、配列番号４７および配列番号４８に示すプライマー対を用いて実験を行った。また、ナス品種「中生真黒」の芽生え（播種後２８日）の地上部および根、播種後約３ヶ月の植物体における成葉および茎、ならびに開花前の蕾（蕾長１４ｍｍ）および開花当日それぞれの葯および花弁についても同様に、ｍＲＮＡ蓄積量を調査した。その定量結果を図４に示す。図４は、「中生真黒」の各部位の各生育段階における遺伝子ＡのｍＲＮＡ蓄積量を示している。この結果から、遺伝子Ａは蕾の発育とともに子房における発現が上昇し、開花日に最も発現が高く、その後は果実の発育に伴って発現が減少することが明らかとなった。以上の結果から、遺伝子Ａは一般的な非単為結果性のナスの花において発育ステージ特異的な発現様式を伴って発現している遺伝子であることが確認された。

＜遺伝子Ａの構造およびＰＣＳＳ系統の変異の詳細な解析＞
完全長ｃＤＮＡの配列とゲノムＤＮＡ配列との比較により、遺伝子Ａは９個のエクソンと８個のイントロンからなり、転写開始点から転写終結点までは６５２８ｂｐであることが明らかとなった。その配列を配列番号４に示す。また、遺伝子Ａの第１〜９エクソンの配列をそれぞれ配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１に示す。また、第１〜第８イントロンの配列をそれぞれ配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０に示す。また、転写開始点の上流２０００塩基および転写終結点の下流１０００塩基の配列をそれぞれ配列番号２２および配列番号２３にそれぞれ示す。以上をまとめ、遺伝子Ａの転写開始点の上流２０００塩基から遺伝子Ａの転写終結点の下流１０００塩基までの９５２８塩基の配列を遺伝子Ａ領域として配列番号２４に示す。この配列における最初の塩基の番号を１、最後の塩基の番号を９５２８とする。

また、ＰＣＳＳ系統の欠失および重複領域との対応を調査したところ、系統ＰＣＳＳにおける変異型の遺伝子Ａ領域においては、配列番号２４の塩基番号３９６３から塩基番号８５２０までに相当する領域（配列番号２５に示す配列）が失われていた。当該領域は、第４イントロンの第４５番目の塩基から第９エクソンの翻訳終止点までの全ておよびそれに続く３’側の非翻訳領域２３５塩基を含む、４，５５８塩基対の領域である。さらに配列番号２４の塩基番号８５９９から塩基番号８８２５までに相当する２２７塩基対の配列（配列番号２６）が重複して、上記欠失した４，５５８塩基対の領域の代わりに挿入されている構造となっていることが明らかとなった。

さらに、野生型遺伝子における第４エクソンの開始点から転写終結点の下流１０００塩基対までの領域、すなわち、配列番号２４の塩基番号３８５９から９５２８までの５６７０塩基の配列は、ＰＣＳＳ系統においては配列番号２７に示す構造をもつ１３３９塩基長の配列となっていた。以上の解析結果に基づき、図５に示すように、遺伝子Ａの構造およびＰＣＳＳ系統における遺伝子Ａの変異構造についての模式図を作成した。

このように、ＰＣＳＳ系統における遺伝子Ａには野生型の遺伝子に対して大きな構造変異が生じていることが明らかとなった。そのため、正常なｍＲＮＡおよびタンパク質は生成されず、遺伝子Ａの機能は完全に失われていることが強く示唆された。そこで、この欠失変異が単為結果性の原因であるとの仮説をたて、以下の実験を進めた。

＜ナス遺伝資源系統における遺伝子Ａ欠失変異の検索＞
当技術分野においてよく知られたＤＮＡ抽出法であるエドワーズ法（参考文献：Edwards et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 1349）によって植物体から粗抽出したトータルＤＮＡを鋳型とし、配列番号４９〜５２に示す４つのプライマーを用いたＰＣＲによって、欠失型では約１ｋｂｐ、野生型では約７００ｂｐの明瞭なバンドが増幅され、この欠失の有無およびヘテロ接合型をそれぞれ明確に判定できる。このプライマーセットを用いて、世界中から収集したナス遺伝資源系統２６９点（このうち４８点は近縁野生種または未同定）についてこの欠失の有無を調査した。その結果、この欠失をもつ系統は全く見いだされなかった。このことから、当該欠失変異は上述した育種過程で新たに生じた自然突然変異であると結論づけた。

＜遺伝子Ａ産物の推定アミノ酸配列の解析および相同配列の探索＞
遺伝子Ａがコードするタンパク質（以下、タンパク質Ａ）の推定アミノ酸配列を配列番号１に示す。このアミノ酸配列をＲｅｆＳｅｑデータベースに対するＢＬＡＳＴ検索（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）によって解析したところ、この配列は様々な生物で報告されているピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）依存性アミノ基転移酵素（ゲノム解読研究による推定配列を含む）のアミノ酸配列と一定の配列同一性を持つことが明らかとなった。そこで、トマト、トマト近縁種であるS. pimpinellifolium、ジャガイモであるS. tuberosum phureja、トウガラシであるCapsicum annuumおよびリンゴであるMalus x domesticaの遺伝子データベースから、配列同一性検索によりタンパク質Ａと配列同一性の高いタンパク質をコードすると予想される遺伝子を取得した。

遺伝子Ａと最も配列同一性の高い配列は、トマトではSolyc03g120450.1.1（データセット名ＩＴＡＧ２．３０、http://solgenomics.net)、トマト近縁種S. pimpinellifoliumではデータセット名S. pimpinellifolium WGS Contigs、ウェブページhttp://solgenomics.net）の相同部分、ジャガイモではSotub03g036610.1.1（データセット名Potato ITAG Release 1、ウェブページhttp://solgenomics.net）、トウガラシではTC19330（データセット名DFCI Pepper Gene Index ver. 4.0、参考文献：Quackenbuch et al., 2001, Nucl. Acid. Res. 29: 159-164、ウェブページhttp://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html）、およびリンゴではMDP0000310976 （データセット名Malus x domestica Genome v1.0、参考文献：Velasco et al., 2010, Nature Genetics 42: 833-839、ウェブページhttp://www.rosaceae.org）であった。トマト由来の遺伝子のコード領域の塩基配列を配列番号２９、推定アミノ酸配列を配列番号２８、トマト近縁種S. pimpinellifolium由来の遺伝子のコード領域の塩基配列を配列番号３１、推定アミノ酸配列を配列番号３０、ジャガイモ由来の遺伝子のコード領域の塩基配列を配列番号３３、推定アミノ酸配列を配列番号３２、トウガラシ由来の遺伝子のコード領域の塩基配列を配列番号３５、推定アミノ酸配列を配列番号３４、リンゴ由来の遺伝子のコード領域の塩基配列を配列番号３７、推定アミノ酸配列を配列番号３６にそれぞれ示す。

また、ナスのタンパク質Ａに対する上記の推定アミノ酸配列の配列同一性は、トマト由来遺伝子では９４．９％、トマト近縁種S. pimpinellifolium由来遺伝子では９４．９％、ジャガイモ由来遺伝子では９５．７％、トウガラシ由来遺伝子では９０．１％、およびリンゴ由来遺伝子では８０．５％であった。また、シロイヌナズナでは、７０％以上の配列同一性を有するものはなかった。

＜ＰＣＳＳにおける遺伝子Ａ転写産物の構造解析＞
系統ＰＣＳＳの子房から抽出した全ＲＮＡを用いて、前述した方法と同じように配列番号３９から４２に示すプライマーを用いたＮｅｓｔｅｄ−５’−ＲＡＣＥ法およびＮｅｓｔｅｄ−３’−ＲＡＣＥ法によって、変異型の遺伝子Ａの転写産物の構造を解析した。その結果、第４エクソンと第４イントロンとの間のスプライシング位置は正常であるが、第４イントロンの終点は正常型遺伝子の転写終結点よりも下流であること、その結果、ＰＣＳＳ型転写産物は第４エクソンよりも３’側において正常型遺伝子産物とは配列が全く異なり、さらに読み枠が合致した翻訳終止コドンを多数もつことが明らかとなった。ＰＣＳＳ型転写産物から翻訳されるタンパク質の推定アミノ酸配列を配列番号３８に示す。（なお、配列番号３８のアミノ酸配列の全配列は、MGSFGMLARRAVLTDTPVMVQIQELIRGNKDCISLAQGVVYWQPPAQALEKVKEIIWEPSVSRYGADEGLPELREALMQKLGHENNLHKSSVMVTAGANQVNEGVQLKVNCLGNYMPLHTYYEERKFSNLSFN*AYGSNYKISSYCP*KIHGCMHCTTAKAAGSETRSADRFQHGNPQGEEQESSTYFLCGEEMPASA*GCHKSMLQHFKWRLP*RYQSPKEEEDHSSWKQLNKCV*SDHFSRL*SVSISSQVTTKE*P*SQLLRQEVP*TTRKDKRNQRFSKKRHS*ESYL*CGTININKVGRHRH*F*SKGSTTMQSICL*YI*EFTGCGAN*KAAIKFHGNAPARYHTKYAGNPCRLDCGGKLVFIPNであり、配列中の*は終止コドンによる翻訳終止シグナルを示す）。この結果から、系統ＰＣＳＳにおいて、遺伝子Ａの転写産物は正常型と大きく異なる構造を持ち、それに基づいて翻訳される変異型のタンパク質Ａは，正常型に比べて構造的に大きく欠損しており、したがってその機能も完全に失われていることが強く示唆された。

＜遺伝子Ａのプロモータの単離＞
上述したＢＡＣクローン０８Ｋ１９の配列から、遺伝子Ａの完全長ｃＤＮＡ配列の上流域の配列を得ることができた。その上流域のゲノム配列は遺伝子Ａの発現制御に関わるプロモータ領域であると推定される。そこで、その領域を増幅するＰＣＲプライマー（配列番号５３および配列番号５４）を合成し、これを用いてナス品種「中生真黒」のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、配列番号５５に示す２１７３塩基対の断片を増幅した。この断片はその３’末端側に完全長ｃＤＮＡ配列の５’側非翻訳領域１９７塩基対およびタンパク質コード領域２６塩基対を含む。強い３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるKOD-plus-NEO（東洋紡）をＰＣＲ反応に用いたことにより、増幅断片の両末端は平滑末端である。次いで、得られたＰＣＲ産物をＳｍａＩのイソスキゾマーであるＸｍａＩで消化し、５’末端が平滑末端、３’末端がＸｍａＩによる５’突出型の付着末端である断片を調製した。また、クローニングベクターｐＵＣ１９８ＡＡ（参考文献：Kuroda et al., 2010, Biosci. Biotechnol. Biochem. 74: 2348-2351）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩサイトに、ｐＢＩ２２１（ＤＤＢＪ/ＧｅｎＢａｎｋ/ＥＭＢＬAccession No. ＡＦ５０２１２８）ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ：：ＧＵＳ：：ＮＯＳターミネータカセットを導入したベクターである、ｐＵＣ１９８ＡＡ−ＣＧＮをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、KOD DNA polymerase（東洋紡）を用いて平滑末端化した後、さらにＸｍａＩで消化した。このようにして、ｐＵＣ１９８ＡＡ−ＣＧＮからＣａＭＶ３５Ｓプロモータ断片を切り出し、そこへ上述の増幅断片を挿入した。得られた組換えプラスミドは大腸菌へ形質転換し、得られたコロニーからプラスミドを抽出し、塩基配列を確認してＰＣＲ増幅による配列変異のないクローンを選択した。以上のようにして、遺伝子Ａのプロモータ領域（以下、プロモータＡとする）をクローニングし、以下の組換えプラスミド構築に用いた。得られたベクター（以下、ｐＵＣ１９８ＡＡ−ＰｇｅｎｅＡＧＮと記す）の構造を図６（ａ）に示す。なお、以下、図６のベクターの模式図においては、プロモータＡの領域を、Ｐｇｅｎｅ＿Ａとして示している。また、図６および図１３のベクターの模式図において、ＮＯＳターミネータの領域についてはＴｎｏｓとして、ＮＯＳプロモータの領域についてはＰｎｏｓとして、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータの領域についてはＰ３５Ｓとして、それぞれ示している。

（３．遺伝子Ａの変異による単為結果性を有するナス形質転換体の作出）
＜遺伝子ＡのＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）誘導のためのベクターの構築＞
配列番号３に示す遺伝子ＡのｃＤＮＡを鋳型として、配列番号５６および配列番号５７に示すプライマーを用い、配列番号５８に示す５２２ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片は５’末端にＸｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの認識部位を有しており、３’末端にＳａｃＩおよびＸｈｏＩの認識部位を有している。この断片をクローニングベクターｐＴＹ２６２（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ登録番号ＡＢ７３６１５２）に挿入し、遺伝子Ａに対するＲＮＡｉ誘導キメラ遺伝子を構築した。このｐＴＹ２６２ベクターはＣａＭＶ３５ＳプロモータとＮＯＳターミネータからなる発現カセットを有し、トマトチューブリン遺伝子の第１イントロンを挟むように外来配列のクローニングサイトを配置したベクターである。

まず、上述した５２２ｂｐ断片（配列番号５８）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩで消化したものをＮＯＳターミネータの直前に挿入した。次いで、得られたベクターをＸｈｏＩで消化し、KOD DNA polymerase（東洋紡）を用いて平滑末端化した後、ＸｍａＩで消化した。上述の５２２ｂｐ断片をＳａｃＩで消化し、同様にKOD DNA polymerase（東洋紡）を用いて平滑末端化した後ＸｍａＩで消化したものを、上述の直鎖状ベクターのＣａＭＶ３５Ｓプロモータの直前に挿入した。得られたＲＮＡｉ誘導キメラ遺伝子は、配列番号５８の５２２ｐ断片のほぼ全域を、トマトチューブリン遺伝子第１イントロンを挟んで逆位反復配列に配置した構造を有し、一般に植物において構成的発現を誘導するＣａＭＶ３５Ｓプロモータによって発現誘導される（図６（ｂ））。なお、以下、図６のベクターの模式図においては、上述した遺伝子Ａの５２２ｂｐのＤＮＡ断片を、ＲＮＡｉ−Ａとして示している。また、図６および図１３のベクターの模式図において、トマトチューブリン遺伝子第１イントロンの領域についてはＴＵＡ６＿ｉｎｔｒｏｎとして示している。さらに、このベクターｐＴＹ２６２−ＣｇｅｎｅＡ−ＲＮＡｉＮの逆位反復配列構造全体を制限酵素ＫｐｎＩで消化し平滑末端化したのちＳａｃＩ処理によって切り出し、上述のｐＵＣ１９８ＡＡ−ＰｇｅｎｅＡＧＮ のＧＵＳ遺伝子をＳｍａＩとＳａｃＩ処理によって切り出した後に挿入したＲＮＡｉ誘導キメラ遺伝子を構築した。得られたＲＮＡｉ誘導キメラ遺伝子ｐＵＣ１９８ＡＡ−ＰｇｅｎｅＡ−ＲＮＡｉＮは、ｐＴＹ２６２−ＣｇｅｎｅＡ−ＲＮＡｉＮと同じ構造の逆位反復配列を持ち、プロモータＡによって発現誘導される。（図６（ｃ））。さらに、このキメラ遺伝子を制限酵素ＡｓｃＩによって切り出し、バイナリーベクターｐＺＫ３（参考文献：Kuroda et al., 2010, Biosci. Biotechnol. Biochem. 74: 2348-2351）にＣａＭＶ３５Ｓプロモータ：：ｓＧＦＰ：：ＮＯＳターミネータ発現カセット（参考文献：Chiu et al., 1993, Curr. Biol. 6: 325-330）を導入して独自に構築したバイナリーベクターｐＺＫ３ＢＧＦＰのＡｓｃＩ認識部位に挿入したバイナリーベクターｐＺＫ３ＢＧＦＰ−ＰｇｅｎｅＡ−ＲＮＡｉＮを構築した（図６（ｄ））。

＜ＲＮＡｉによるナス形質転換体の作出＞
上述のＲＮＡｉ干渉用のバイナリーベクターを導入したナス形質転換体を作出した。具体的な作出法は、以下の通りである。まず、アグロバクテリウム法（参考文献：Billings, S et al., 1997, J Amer. Hort. Sci 122:158-162）を用いて、ナス品種「中生真黒」の子葉にバイナリーベクターを保有するアグロバクテリウムを感染させ、カナマイシン含有培地上で培養及び選抜し、再分化植物を得た。再分化植物の遺伝子導入の成否をマーカー遺伝子ＧＦＰによる蛍光発現および導入遺伝子のＰＣＲによる確認によって判断し、形質転換当代の形質転換植物を得た。さらに、この形質転換体の自殖第1世代において、導入遺伝子をホモに持つ個体、および導入遺伝子を遺伝分離によって失った個体を、それぞれ定量ＰＣＲ法によって選抜した。

＜ナス形質転換体の単為結果性の検討＞
上記の選抜によって得られたナス形質転換体の個体（１２０１２-１_ホモ）を栽培し、開花前に柱頭を除去した後の子房から果実への肥大成長を観察することによって、単為結果性を調査した。また、同時に、非形質転換体である原品種「中生真黒」（コントロール）および形質転換体に由来するが遺伝分離によって導入遺伝子を失った個体（１２０１２-１_ヌル）についても同時に栽培し、同様の処理および通常の放任受粉を行った場合について、果実の肥大成長の観察を行い、対照とした。その結果を図７に示す。図７に示されているように、開花前に柱頭を除去し受粉を妨げた場合でも、導入遺伝子をホモに持つ形質転換体である１２０１２-１_ホモの果実は明瞭な肥大成長を示し、単為結実を示した（図７の（ａ））。また、１２０１２-１_ホモは、未受粉であるために種子が形成されていないことも確認された（図７の（ｄ））。一方、１２０１２-１_ヌル（図７の（ｂ））では、コントロール（図７の（ｃ））と同様に果実の肥大はほとんど見られなかった。１２０１２-１_ヌルおよびコントロールについて未受粉のため肥大不全を呈した果実の状況を、それぞれ図７の（ｅ）および図７の（ｆ）に示す。

上述のナス形質転換体の個体（１２０１２-１_ホモ）、原品種「中生真黒」の非形質転換体（コントロール）および導入遺伝子を失った個体（１２０１２-１_ヌル）について、開花当日の子房から全ＲＮＡを抽出し、この全ＲＮＡを鋳型として、Superscript VILO cDNA 合成キット（ライフテクノロジーズ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、配列番号４５および配列番号４６に示すオリゴヌクレオチドをプライマーに用いた定量ＰＣＲによって、遺伝子ＡのｍＲＮＡ蓄積量を調査した。その結果を図８に示す。図８に示されているように、形質転換体である１２０１２-１_ホモにおいて、開花当日の子房における遺伝子Ａの発現は大きく抑制されていた。また、導入遺伝子を失い、まったく単為結果性を示さない個体である１２０１２-１_ヌルは、果実の肥大成長の状態と同様に、遺伝子Ａの発現量についても、非形質転換体であるコントロールとほぼ同様であった。

以上の結果から、ナスでは遺伝子Ａの発現抑制によって単為結果性が誘導されることが明らかとなった。

（４．単為結果性ナス系統ＰＣＳＳにおけるインドール酢酸（ＩＡＡ）濃度およびＩＡＡ代謝産物濃度の定量）
＜ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析による、単為結果性ナス系統ＰＣＳＳにおけるインドール酢酸（ＩＡＡ）濃度およびＩＡＡ代謝産物濃度の定量＞
単為結果性ナス系統ＰＣＳＳにおけるＩＡＡ量およびＩＡＡ代謝産物量を定量するために、系統ＰＣＳＳを実験材料として、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。

シロイヌナズナを材料として用いてオーキシン代謝産物等のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行う場合では、植物体から、リン酸ナトリウムバッファーを用いて抽出物を抽出する。この抽出物を、OASIS HLBカラム（日本ウォーターズ社）によって精製した溶液を試料として、オーキシン代謝産物等の分析をすることが可能であるとされている（参考文献：Novak et al., 2012, Plant Journal. 72: 523-536）。しかし、ナスの子房を用いる場合は、上記の精製方法によって得た試料では、夾雑物によるイオンサプレッションの影響により、ＬＣ/ＭＳ/ＭＳを用いた分析は極めて困難であった。そのため、OASIS HLBの溶出液を、OASIS MCXカラム（日本ウォーターズ社）によって、酸性物質および中性物質の混合画分と、塩基性物質画分とに分画した。さらに、得られた酸性物質および中性物質の混合画分を、OASIS WAXカラム（日本ウォーターズ社）によって、酸性物質と中性物質とにさらに分画することによって得た試料を、ＬＣ/ＭＳ/ＭＳ分析に供した。上述の精製法によって精製して得た試料を用いることにより、当該試料に含まれる活性物質であるインドール酢酸（ＩＡＡ）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析が可能となった。また、この分析法により、ナスの子房１個から得られる微量の試料においてもＬＣ/ＭＳ/ＭＳ分析が可能となった。一方で、ＩＡＡの前駆物質であるインドールピルビン酸（ＩＰｙＡ）は極めて不安定な物質であることから、抽出物をシステアミンにより誘導体化し、OASIS HLBで精製後に分析に供した。得られた精製物の分析は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（質量分析装置）（3200QTrap、AB SCIEX社)で行った。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳのＨＰＬＣ部による分離は、Shim-pack XR-ODSカラム(島津製作所)で行い、ＥＳＩ(electron spray ionization)でイオン化してＭＳ/ＭＳに導入し、MRM(Multiple Reaction Monitoring)モードで生成した分子イオンおよびフラグメントイオンの検出を行った。

単為結果性ナス系統ＰＣＳＳの蕾（開花約５日前の、花弁着色前および開花約２日前の、花弁着色時）の子房および葯、ならびに系統ＰＣＳＳの開花時の子房、葯、節間および成長点における内生ＩＡＡ濃度について、上述の方法を用いて定量分析を行うことによって測定した。また、比較のため、非単為結果性ナス自殖系統ＮＰについて、同様に測定を行い、コントロールとした。非単為結果性ナス自殖系統ＮＰは、ＰＣＳＳと同じ交配組み合わせにより育成された、非単為結果性の系統である。測定結果を図９に示す。図９に示されているように、成長点および節間においては、系統ＰＣＳＳと系統ＮＰとの間に内生ＩＡＡ量に差が見られなかった。

一方、子房および葯においては、測定した全ての発育ステージ（花弁着色前、花弁着色時および開花時）において、系統ＮＰに比べ、系統ＰＣＳＳでは、約２．６倍から４．６倍程度の高い内生ＩＡＡ濃度が観察された。

さらに、系統ＰＣＳＳの開花時の子房について、同様の手法でＩＡＡ代謝産物等の分析を行った。その結果を図１０に示す。系統ＰＣＳＳでは、系統ＮＰに比べて、ＩＰｙＡおよびＩＡＡが顕著に高濃度で蓄積していることが明らかとなった。一方、他のＩＡＡ合成経路の中間産物またはＩＡＡの代謝産物であるＩＡＭ、ＴＡＭ、ｏｘＩＡＡ、ＩＡＡｓｐ、ＩＡＧｌｕの蓄積には顕著な違いは認められなかった。

＜ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析による、遺伝子Ａの抑制形質転換ナス系統１２０１２−１＿ホモにおけるインドール酢酸（ＩＡＡ）濃度の定量＞
次に、遺伝子Ａの抑制形質転換ナス系統１２０１２−１＿ホモの子房からＩＡＡを抽出し、上述の系統ＰＣＳＳを用いた場合と同様の方法で定量分析を行った。結果を図１１に示す。その結果、図１１に示すように、遺伝子Ａの発現を抑制したナス形質転換体の子房では非形質転換体（品種「中生真黒」）に比べ、平均して約４倍程度の高い内生ＩＡＡ濃度が観察された。

以上の結果から、単為結果性遺伝子Ａは、アミノ基転移酵素をコードしていることが示唆された。そして、このアミノ基転移酵素はＩＰｙＡを基質としてトリプトファンを合成するシロイヌナズナのＶＡＳ１と同様の酵素活性を有するアミノ基転移酵素であることが示唆された。さらに、この遺伝子の発現を抑制することによって、実用的な単為結果性を誘導することができる水準まで、ナス科作物の花器官における内生ＩＡＡ濃度を上昇させ得ること、ならびに、その結果、トマトおよびナスを含むナス科植物が単為結果性を呈することが強く示唆された。

（５．遺伝子Ａのコードするタンパク質Ａの活性測定）
＜タバコ野生種において一過的発現させた組換えタンパク質を用いた、遺伝子Ａのコードするタンパク質Ａの機能解析＞
遺伝子ＡのｃＤＮＡ配列の終止コドン直前に２４塩基からなるＤＮＡ断片（配列番号６９）を読み枠が合致するように付加し、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩ配列である、Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（参考文献：Schmidt et al., 1996, J. Mol. Biol. 255: 753-766）が、遺伝子Ａによってコードされているタンパク質ＡのＣ末端に付与された遺伝子産物が生成されるキメラ遺伝子を構築した。この遺伝子をｐＵＣ１９８ＡＡ−ＣＧＮのＧＵＳ遺伝子と入れ替えた発現コンストラクトを作成し、さらにバイナリーベクターｐＺＫ３ＢＧＦＰに導入して形質転換バイナリーベクターを作出した。このベクターを保持したアグロバクテリウムの懸濁液をタバコ野生種Nicotiana benthamianaの展開葉の気孔から葉組織内部に注入し、タバコの葉に一過的発現させることによって、Ｃ末端にＳｔｒｅｐタグ配列を持つ組換えタンパク質Ａを合成した。注入処理後３日目に、処理した葉から粗タンパク質をリン酸バッファーで抽出し、Strep-Tactinセファロースカラム（ＩＢＡ ＧｍｂＨ社）を用いたクロマトグラフィーによって組換えタンパク質Ａを精製した。また、コントロールとして大腸菌由来のＧＵＳ遺伝子のＣ末端にＳｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩ配列を付与したＧＵＳ遺伝子を構築し、同様の手順によって組換えＧＵＳタンパク質を精製した。

得られたそれぞれのタンパク質溶液（２μｇ／μＬ）に対し、アミノ酸混合液（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、ＰｈｅおよびＧｌｕ）（溶液中の各アミノ酸濃度５ｍＭ）、ピリドキサールリン酸ならびにＩＰｙＡ（５００μＭ）を加えて、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）中で３０℃、２時間反応させた後、反応液をOASIS HLBカラムで精製し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分析した。結果を図１２に示す。図１２の（ａ）に示されているように、組換えタンパク質Ａに依存したトリプトファンの生成を確認した。なお、図１２の（ｂ）に示す組換えＧＵＳタンパク質を用いた場合にトリプトファンが検出されないことから、タンパク質抽出を行ったタバコ野生種N. benthamianaの葉組織からのトリプトファンの持ち込みは検出限界以下であることは明らかである。

以上の結果から、遺伝子Ａがコードしているタンパク質Ａは、ＩＰｙＡおよびアミノ酸を基質としてトリプトファンを合成する反応を触媒するアミノ基転移酵素であることが確認された。

〔実施例２：トマト由来の単為結果遺伝子ｔＡ〕
（１．トマト由来の単為結果原因遺伝子ｔＡの同定および解析）
＜ナスの遺伝子Ａのトマトホモログ遺伝子のｃＤＮＡ断片の調製＞
トマトのゲノム配列（参考文献：The Tomato Genome Consortium 2012, Nature 485: 635-641）から推定される構造遺伝子の推定アミノ酸配列データベース（データベース名：ITAG2.30、ウェブページhttp://www. solgenomics.net）に対してタンパク質Ａの推定アミノ酸配列を問い合わせ配列としたＢＬＡＳＴＰ検索により、遺伝子Ａと９５％の配列同一性を持つタンパク質をコードすると推定されるトマトのホモログ遺伝子ｔＡが得られた。その塩基配列は、上述の＜遺伝子Ａ産物の推定アミノ酸配列の解析および相同配列の探索＞の項目に記載の配列番号２９で示した配列であった。この塩基配列に基づき、その一部を増幅する一対のプライマー（配列番号５９および配列番号６０）を合成した。また、トマト品種「秋玉」の花および蕾から抽出した全ＲＮＡから、トランスクリプターファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）によりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型とし、上述のプライマーを用いたＰＣＲを行うことにより、配列番号６１に示す５２３ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片は、４９６ｂｐのｃＤＮＡ由来配列の５’末端に制限酵素ＸｍａＩおよび制限酵素ＣｌａＩの認識部位、３’末端に制限酵素ＳａｃＩおよび制限酵素ＸｈｏＩの認識部位が付加されたものである。この断片をＣｌａＩおよびＳａｃＩで処理したものをｐＴＹ２６２に導入し、さらにそのプラスミドに上述した断片をＸｈｏＩおよびＸｍａＩで処理したものを導入して、逆位反復配列構造を持つＲＮＡｉ誘導キメラ遺伝子を構築した。導入した断片に塩基配列の変異がないことをシーケンシングによって確認し、正しい配列を持つクローンを選択した。このベクターｐＴＹ２６２−Ｃｇｅｎｅ＿ｔＡ−ＲＮＡｉＮの構造を図１３（ａ）に示す。これをさらにこれをＡｓｃＩで処理して切り出された遺伝子ｔＡの発現カセットをｐＺＫ３ＢＧＦＰのＡｓｃＩ部位に挿入して得られたバイナリーベクターｐＺＫ３ＢＧＦＰ−ＣｔＡＲＮＡｉＮの構造を図１３（ｂ）に示す。なお、以下、図１３のベクターの模式図においては、上述した遺伝子ｔＡの５２３ｂｐのＤＮＡ断片を、ＲＮＡｉ−ｔＡとして示している。

＜トマトホモログ遺伝子ｔＡのプロモータの単離＞
トマトゲノム配列を参考に、遺伝子ｔＡの翻訳開始点の上流１８７０ｂｐおよび翻訳開始点以下のタンパク質コード領域２９ｂｐを含む１９０８塩基対のゲノム断片（配列番号６２）を配列番号６３および配列番号６４に示す一対のプライマーを用いてトマト品種「秋玉」のゲノムＤＮＡより増幅した。強い３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるKOD-plus-NEO（東洋紡）をＰＣＲ反応に用いたことにより、増幅断片の両末端は平滑末端である。また、この断片は３’側のプライマー（配列番号６４）に由来するＸｍａＩ認識部位をもつ。クローニングベクターｐＨＳＧ３９８（タカラバイオ株式会社）を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、KOD DNA polymerase（東洋紡）を用いて平滑末端化したものと上述の断片を混合し、制限酵素ＸｍａＩで処理した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（プロメガ株式会社）を用いてライゲーションし、大腸菌へ導入してトマトホモログ遺伝子ｔＡのプロモータ領域（以下、プロモータｔＡ）をクローニングした。さらに、シーケンシングによって変異のないクローンｐＨＳＧ３９８−ＰｔＡを選抜した。その構造を図１３（ｃ）に示す。なお、以下、図１３のベクターの模式図においては、プロモータｔＡの領域を、Ｐｇｅｎｅ＿ｔＡとして示している。さらに、このｐＨＳＧ３９８−ＰｔＡをＳｍａＩとＸｂａＩで処理してプロモータｔＡ断片を切り出し、前述のｐＴＹ２６２−Ｃｇｅｎｅ＿ｔＡ−ＲＮＡｉＮのＣａＭＶ３５Ｓプロモータと入れ替えたプラスミドｐＴＹ２６２−Ｐｇｅｎｅ＿ｔＡ−ＲＮＡｉＮの構造における発現カセットを、ｐＺＫ３ＢＧＦＰのＡｓｃＩ部位に挿入したバイナリーベクターｐＺＫ３ＢＧＦＰ−ＰｔＡＲＮＡｉＮの構造を図１３（ｄ）に示す。

＜ＲＮＡｉによる遺伝子ｔＡ発現抑制トマト形質転換体の作出＞
上述した手順により構築したバイナリーベクターｐＺＫ３ＢＧＦＰ−ＰｔＡＲＮＡｉＮおよびｐＺＫ３ＢＧＦＰ−ＣｔＡＲＮＡｉＮを用い、アグロバクテリウム法によりトマト形質転換体を作出した。具体的には、アグロバクテリウム法（参考文献：Sun et al., 2006, Plant Cell Physiol. 47: 426-431）を用いて、トマト品種「Ailsa Craig」の子葉にバイナリーベクターを保有するアグロバクテリウムを感染させ、カナマイシン含有培地上で培養及び選抜し、再分化植物を得た。再分化植物の遺伝子導入の成否をマーカー遺伝子GFPによる蛍光発現および導入遺伝子のＰＣＲによる確認によって判断し、形質転換当代の形質転換植物を得た。

＜トマト形質転換体の単為結果性の検討＞
上記の選抜によって得られたトマト形質転換体の個体を栽培し、開花前に柱頭を除去して単為結果性を調査した。また、トマト原品種「Ailsa Craig」の非形質転換体（コントロール）についても同時に栽培し、同様の柱頭除去処理を行いコントロールとした。さらに、トマト形質転換体については通常の放任受粉を行った果実の肥大成熟状態の観察を行った。その結果を図１４に示す。図１４に示されているように、非形質転換体のトマト品種「Ailsa Craig」は、柱頭除去をした場合、全く肥大果実が形成されなかった。これに対し、ＣａＭＶ３５ＳプロモータによるＲＮＡｉ誘導によりｔＡ遺伝子の発現が抑制された形質転換体（個体番号１２２０−４）では、柱頭除去果は放任受粉し種子形成した果実と同様の肥大成長を示し、種子のない成熟果実が得られた。また、遺伝子ｔＡプロモータを用いた場合（個体番号０７１６−１８）についても、柱頭除去果は肥大成長と成熟果実形成を示した。以上のことから、ｔＡ遺伝子の発現抑制を人為的に誘導することにより、トマトに単為結果性を付与することができることが明らかとなった。

上述のトマト形質転換体（個体番号１２２０−４）およびその原品種「Ailsa Craig」の非形質転換体（コントロール）の開花前の花芽から全ＲＮＡを抽出し、この全ＲＮＡを鋳型として、Superscript VILO cＤＮＡ合成キット（ライフテクノロジーズ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、配列番号６５および配列番号６６に示すオリゴヌクレオチドをプライマーに用いた定量ＰＣＲによって、遺伝子ｔＡのｍＲＮＡ蓄積量を調査した。定量値を標準化するため、上述のｃＤＮＡを同じく鋳型として、内部標準遺伝子の定量も行った。内部標準遺伝子としては、トマト遺伝子Ｓｏｌｙｃ０４ｇ０４９１８０．２．１（データセット名ITAG2.30、ウェブサイトhttp://solgenomics.net）を用いた。これは、発明者等がトマトで構成的に発現することを見いだしている遺伝子である。また、内部標準遺伝子増幅用のプライマーとして、配列番号６７および配列番号６８に示すプライマー対を用いた。その結果を図１５に示す。図１５に示されているように、原品種Ailsa Craigの非形質転換体と比較して、形質転換体では開花直前の花芽における遺伝子ｔＡの発現は大きく抑制されていることが確認された。

＜ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析による、遺伝子ｔＡの抑制形質転換トマト系統１２２０-４におけるインドール酢酸（ＩＡＡ）濃度の定量＞
次に、トマトの遺伝子ｔＡの抑制形質転換体１２２０-４の花芽からＩＡＡを抽出し定量分析を行った。なお、上述の実施例１のナスの場合と同様の手法を用いて、ＩＡＡの抽出および精製方法、ならびに分析を行った。結果を図１６に示す。抑制形質転換体では非形質転換体（品種「Ailsa Craig」）に比べ、約３倍程度の高い内生ＩＡＡ濃度が観察された。

以上の結果から、ナス単為結果性遺伝子Ａのホモログであるトマト遺伝子ｔＡの発現抑制により、トマトにおいても単為結果が誘導されることが明らかとなった。

〔実施例３：トウガラシ由来の単為結果原因遺伝子ｐＡ〕
（１．トウガラシ由来の単為結果原因遺伝子ｐＡの同定および解析）
＜ＥＭＳ処理による遺伝子ｐＡ機能欠損型変異体の作出＞
実施例１の＜遺伝子Ａ産物の推定アミノ酸配列の解析および相同配列の探索＞の項目において前述したように、遺伝子Ａに最も配列同一性の高いトウガラシのホモログ遺伝子として、ＴＣ１９３３０（データセット名DFCI Pepper Gene Index ver. 4.0、参考文献：Quackenbuch et al.(2001) Nucl. Acid. Res. 29: 159-164、ウェブサイトhttp://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html）を見いだした（配列番号３５）。この遺伝子を以降遺伝子ｐＡと記す。トウガラシ（Capsicum annuum）の種子（品種「Maor」）を、汎用されている化学変異原である、ＥＭＳ（ethyl methane sulfonate：エチルメタンスルホン酸）の水溶液に浸漬して変異誘導処理を行い、遺伝子ｐＡの人為突然変異体の誘発を行い、続いて変異体のスクリーニングを行った。スクリーニングは、KeyPoint法（参考文献：Rigola et al., 2009, PLoS One 4: e4761.）を用いて行った。KeyPoint法とは、変異誘導処理当代の種子を播種し、出芽した植物体から抽出したＤＮＡサンプルを用い、多数サンプルからのゲノムＤＮＡを多次元に混合したサンプルを、第２世代シーケンサによって解析し、変異を検出することによって、遺伝子ｐＡのコード領域に変異を持つ個体を検索する方法である。その結果、遺伝子ｐＡのコード領域において、読み枠の合致した終止コドンが生じた、いわゆるナンセンス変異を有する変異体１および変異体２を見出した。配列番号３５の野生型配列と比較して、変異体１においては第１２５番目の塩基がＧからＡに変異しており、４２番目のコドンがＴｒｐをコードするＴＧＧから終止コドンＴＡＧへと変異していた。また、変異体２では、第１２７番目の塩基がＣからＴに変異しており、４３番目のコドンがＧｌｎをコードするＣＡＡから終止コドンＴＡＡへと変異していた。したがって、変異体１および変異体２では、配列番号３４に示す３９４アミノ酸からなるタンパク質をコードしているｐＡ遺伝子に変異が生じ、Ｎ末端側の４１アミノ酸または４２アミノ酸のみからなる不完全なタンパク質が生成されるものと推定された。

＜トウガラシ遺伝子ｐＡ機能欠損型変異体の単為結果性の検討＞
得られた誘発突然変異当代の変異体１および変異体２は変異遺伝子をヘテロに有しているため、それぞれ自殖第２世代の種子を採種して、解析を進めた。自殖第２世代において、変異部位が野生型ホモを示す個体および変異型ホモを示す個体を栽培し、それぞれ開花前に葯を除去して単為結果性を検定した。また、同時に、通常の放任受粉を行った、変異部位が変異型ホモを示すトウガラシの遺伝子ｐＡ機能欠損型変異体および野生型ホモを示す個体についても同時に栽培し、同様の処理および果実の成熟状態の観察を行い、コントロールとした。その結果を図１７に示す。図１７に示すように、変異体１および変異体２の自殖第２世代において、除雄を行なった野生型ホモ個体では一般的なトウガラシと同様に全く果実が肥大しなかった。一方、変異体１および変異体２の自殖第２世代から得られた変異型ホモ個体では、除雄により受粉が妨げられた場合も、明瞭な肥大果実の形成が観察された。

また、変異型ホモ個体において、除雄花から形成された肥大果実の内部には種子の形成は全く認められなかった。一方、野生型ホモ個体および変異型ホモ個体のいずれにおいても自家受粉した花からは正常な種子を有する肥大果実が形成された。

このことから、変異体ホモ個体に着生した肥大果実は単為結果により形成されたものであることが確認された。

以上の結果から、ナス単為結果性遺伝子Ａのホモログであるトウガラシの遺伝子ｐＡの能欠損により、トウガラシにおいても明瞭な単為結果が誘導されることが明らかとなった。また、遺伝子Ａおよびそのホモログ遺伝子に変異を持つ個体をスクリーニングすることにより、単為結果性を示す植物体を得ることができることが示された。

（３．トウガラシ由来の遺伝子ｐＡ変異体の内生ＩＡＡ濃度の定量）
上述のトウガラシ変異体１の自殖第２世代から、遺伝子ｐＡに見いだされたナンセンス変異部位が変異型ホモであり単為結果性を示す個体３５５−１Ｐおよび３５５−８Ｐ、当該遺伝子ｐＡに見いだされたナンセンス変異部位が野生型ホモであり単為結果性を示さない個体３５５−１Ｗおよび３５５−８Ｗをそれぞれ選抜して栽培した。ここで、３５５−１Ｐと３５５−１Ｗと、および、３５５−８Ｐと３５５−８Ｗとは、それぞれ同一の変異体１の自殖第１世代個体に由来する兄弟個体である。同様にトウガラシ変異体２の自殖第２世代から、遺伝子ｐＡに見いだされたナンセンス変異部位が変異型ホモであり単為結果性を示す個体３５６−３Ｐ、当該遺伝子ｐＡに見いだされたナンセンス変異部位が野生型ホモであり単為結果性を示さない個体３５６−２Ｗを選抜し、栽培した。ここで、３５６−３Ｐと３５６−２Ｗとは変異体２の異なる自殖第１世代個体に由来する個体である。それぞれの個体から開花直前の蕾を採取し、子房の内生ＩＡＡ濃度を測定した。結果を図１８に示す。図１８に示すように、遺伝子ｐＡ変異型個体では野生型個体に比べて顕著に高濃度の内生ＩＡＡが蓄積していることが明らかとなった。変異体１では変異型ホモ個体（３５５−１Ｐおよび３５５−８Ｐ）はそれぞれの野生型ホモ（３５５−１Ｗおよび３５５−８Ｗ）の兄弟個体に比べて３倍程度、変異体２では変異体ホモ（３５６−３Ｐ）は野生型ホモ（３５６−２Ｗ）の１．８倍程度の内生ＩＡＡ量の上昇が見られた。このことから、ナス単為結果性遺伝子Ａのホモログであるトウガラシ遺伝子ｐＡのナンセンス変異によって誘導された単為結果性系統でも、ナスの場合と同様に子房における内生ＩＡＡ含量が顕著に上昇していること、遺伝子ｐＡがナス遺伝子Ａと同じ生理学的機能に基づいてトウガラシの単為結果性を制御することが明らかとなった。

〔実施例４：ナス単為結果遺伝子Ａの詳細解析〕
（１．ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子を用いた単為結果遺伝子Ａのプロモータ解析）
図６（ａ）に示す発現カセットＰｇｅｎｅＡＧＮをバイナリーベクターｐＺＫ３ＢＧＦＰのＡｓｃＩ認識部位に挿入したバイナリーベクターｐＺＫ３ＢＧＦＰ−ＰｇｅｎｅＡＧＮを構築し、アグロバクテリウム法を用いてナス品種「中生真黒」に導入し、形質転換植物を得た。さらに、この形質転換体の自殖第１世代において導入遺伝子をホモに持つ個体を選抜した。この選抜によって得られたナス形質転換体の個体（１２０２３−３_ホモ）に着生した花を開花２日前に採取し、Kosugiらの方法（参考文献：Kosugi et al. (1990) Plant Sci. 70: 133-40）に従ってＸ−Ｇｌｕｃを基質としたレポーター遺伝子（ＧＵＳ）の活性を組織化学的に検出した。その結果、図１９に示すように、明瞭なＧＵＳの活性が子房組織全体、葯、花柱、および花弁基部に認められた。ここで、オーキシンの人為的施用は果実の肥大を誘導することが知られている。また、上述のように、遺伝子Ａは、ＩＡＡの生合成に対して負の機能を有することが示唆されている。これらのことを考慮すると、遺伝子Ａが子房組織全体で発現していることは、遺伝子Ａが子房組織内のＩＡＡ濃度を低く保つことによって果実の肥大を抑制する機能を有すること、および遺伝子Ａの欠損による、この果実の肥大を抑制する機能の欠損が、単為結果性を誘導する原因であるということを強く示唆するものである。

（２．実施例１に係るナス形質転換体とは独立に作出されたナス形質転換体の単為結果性の検討）
上述の実施例１における＜ＲＮＡｉによるナス形質転換体の作出＞に記載の方法と同様の方法によって、実施例１において得られたナス形質転換体（１２０１２-１_ホモ）とは独立した実験系において、新たな遺伝子Ａの発現抑制形質転換体１２０１２−４_ホモおよび１２０１４−１０_ホモを作出および育成した。また、遺伝分離によって導入遺伝子を失った、兄弟個体である１２０１２−４_ヌルおよび１２０１４−１０_ヌルを作出および育成した。これらの形質転換体の単為結果性を上述の実施例１における＜ナス形質転換体の単為結果性の検討＞に記載した方法の同様の方法を用いて検討した。すなわち、これらすべての形質転換体について、同時に栽培し、同様の処理を行った場合について、果実の肥大成長の観察および比較を行った。結果を図２０に示す。図２０の（ａ）および（ｃ）に示されているように、開花前に柱頭を除去し受粉を妨げた場合でも、２つの遺伝子導入個体に着生した果実は単為結果性を示し、その果実内部には種子の形成は見られなかった。一方、図２０の（ｂ）および（ｄ）に示すように、導入遺伝子を失った２つのヌル系統１２０１２−４_ヌルおよび１２０１４−１０_ヌルでは、柱頭を開花前に除去された花器官から肥大果実の形成は認められなかった。以上の結果から、実施例１における形質転換体の結果と併せて、独立な異なる形質転換イベントによって作出および育成された、３つの異なる形質転換体系統において明確な単為結果性が誘導されることが確認された。

また、実施例１における＜ナス形質転換体の単為結果性の検討＞に記載の方法と同様の方法によって、本実施例において新たに得た２つの形質転換体１２０１２−４_ホモおよび１２０１４−１０_ホモの遺伝子ＡのｍＲＮＡ蓄積量を調査した。結果を図２1の（ａ）に示す。図２１の（ａ）に示すように、単為結果性を示す形質転換体１２０１２−４_ホモおよび１２０１４−１０_ホモでは、開花当日の子房における遺伝子Ａの発現は導入遺伝子を失った２つのヌル系統と比較して約１／４から１／６程度に大きく抑制されていた。

さらに、１２０１２−４_ホモにおいて、開花当日の子房における内生ＩＡＡ量を測定した。測定方法は、実施例１における、（４．単為結果性ナス系統ＰＣＳＳにおけるインドール酢酸（ＩＡＡ）濃度およびＩＡＡ代謝産物濃度の定量）に記載の方法と同様の方法を用いた。結果を図２１の（ｂ）に示す。図２１の（ｂ）に示すとおり、導入遺伝子をホモに持ち、遺伝子Ａの発現が抑制されている１２０１２−４_ホモでは、導入遺伝子を失っており、遺伝子Ａの発現が抑制されていない兄弟系統である１２０１２−４_ヌルに比べ、３倍を越える顕著なＩＡＡ濃度の上昇が確認された。以上の結果から、単為結果性遺伝子Ａの遺伝子機能の発現を抑制することによってナス科植物に単為結果性を呈することがさらに強く示唆された。

（３．野生型遺伝子Ａの導入による遺伝子Ａの機能相補性検定）
＜単為結果性ナス系統「Ｍ３Ａ」の作出＞
実施例１における＜単為結果性の詳細マッピング＞および図３に示す手順で育成した系統ＰＣＳＳと非単為結果性ナス系統ＴＮ−４５のＦ５世代において、P34F3_497_55_139を選抜し、その自殖後代を「系統Ｍ３Ａ」と命名した。この「系統Ｍ３Ａ」はゲノム全体に分布する９６個の一塩基多型マーカー（参考文献：Hirakawa et al. (2014) DNA Res.21: 649-660）の遺伝子型について、全てがホモ接合であった。また、上述の配列番号４９〜５２に示す４つのプライマーを用いたＰＣＲによって、系統ＰＣＳＳに由来する遺伝子Ａの変異型の遺伝子をホモ接合で有することが確認された（図示せず）。以上のことから、「系統Ｍ３Ａ」は遺伝的に純系であると判断した。

以下、上述の「系統Ｍ３Ａ」を用いて、ナス形質転換体を作出し、遺伝子Ａの詳細な機能解析を行った。

＜Ｍ３Ａ系統におけるナス形質転換体の作出＞
ナス品種「中生真黒」のゲノムにおける、遺伝子Ａのプロモータ領域、第１エクソンおよび第１イントロンの一部を含む配列を、配列番号７０および配列番号７１に示すプライマーを用いた「中生真黒」のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行うことによって増幅し、配列番号７２に示す２３１３塩基対の断片を得た。この断片は５’末端から３塩基目から８塩基目において制限酵素ＸｂａＩ、および３’末端から３塩基目から８塩基目においてＸｍａＩの制限酵素認識部位をそれぞれ有している。なお、この断片は、翻訳開始点から１４塩基下流の第１エクソン上に制限酵素ＢｓｍＩの認識部位を有する。この断片をプラスミドベクターｐＨＳＧ３９８（タカラバイオ株式会社）のＸｂａＩ−ＸｍａＩサイトに挿入してクローニングした。得られたクローンについて、塩基配列を確認して、塩基配列中にＰＣＲ増幅に由来する変異を有していない、目的の塩基配列を有するクローンｐＨＳＧ３９８−ＰｇｅｎｅＡｅｘ１ｉｎｔ１を選択した。これを制限酵素ＸｂａＩで完全消化したのち、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈキット（東洋紡株式会社）を用いて平滑化し、さらにＸｍａＩで完全消化することによって、クローン化した目的の断片を切り出した。一方、実施例１における＜遺伝子Ａのプロモータの単離＞に記載したｐＵＣ１９８ＡＡ−ＣＧＮを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全消化したのち、上記と同様に平滑化し、さらにＸｍａＩで完全消化することによって、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータを切り出し、そこにｐＨＳＧ３９８−ＰｇｅｎｅＡｅｘ１ｉｎｔ１から切り出した上記の断片を挿入した。得られたクローンをＢｓｍＩおよびＳａｃＩで完全消化して遺伝子Ａの第１エクソンのＢｓｍＩ認識部位の下流、第１イントロンの一部およびｐＵＣ１９８ＡＡ−ＣＧＮに由来するＧＵＳ遺伝子を含む断片を切り出した。そこに、実施例１における＜植物体の各部位の各生育段階における遺伝子Ａの発現量の解析＞に記載の方法と同様に方法で得た遺伝子Ａのタンパクコード全体を含むクローンをＢｓｍＩおよびＳａｃＩで消化した断片を挿入した。以上の方法で得られたクローンは、野生型の遺伝子Ａの発現カセット（遺伝子Ａのプロモータ領域から翻訳開始点を経て遺伝子Ａのコード全体を含むｃＤＮＡ配列、およびｐＵＣ１９８−ＣＧＮに由来するＮＯＳターミネータ配列から構成される）を有している。この発現カセットを制限酵素ＡｓｃＩで切り出し、バイナリーベクターｐＺＫ３ＢＧＦＰのＡｓｃＩ認識部位に挿入したバイナリーベクターｐＺＫ３ＢＧＦＰ−ＰｇｅｎｅＡ-ＯＲＦｇｅｎｅＡＮを構築した。その構造を図２２に示す。このバイナリーベクターを実施例１における＜ＲＮＡｉによるナス形質転換体の作出＞に記載に方法と同様の方法によって「系統Ｍ３Ａ」に導入して形質転換個体１３０１１−３を作出した。さらにその自殖第１世代において、導入遺伝子Ａをホモに有する個体１３０１１−３_ホモおよび導入遺伝子Ａを遺伝分離によって失った個体１３０１１−３_ヌルを選抜した。

＜系統Ｍ３Ａの形質転換体における単為結果性の検討＞
上述の選抜によって得られた個体を、対照としての非形質転換体の原系統「Ｍ３Ａ」と同時に栽培した。実施例１における＜ナス形質転換体の単為結果性の検討＞に記載の方法と同様の方法によって、開花前の花の柱頭を除去して受粉を妨げ、その後の果実肥大を観察することによって単為結果性を評価した。結果を図２３に示す。図２３の（ａ）に示すように非形質転換体の原系統Ｍ３Ａは明瞭な単為結果性を示したのに対し、図２３の（ｂ）に示すように、１３０１１−３_ホモは、開花前の柱頭除去によって果実肥大が著しく抑制され、原系統Ｍ３Ａの有する単為結果性は失われていた。一方、図２３の（ｃ）に示すように、導入遺伝子を失った１３０１１−３_ヌルは原系統である系統Ｍ３Ａと同様に、明瞭な単為結果性を示した。また、観察された果実肥大が単為結果性によるものであることは、これらの果実の内部に種子の形成が認められないことにより確認した。

＜系統Ｍ３Ａの形質転換体における内生のインドール酢酸（ＩＡＡ）量の定量＞
上述の系統Ｍ３Ａの形質転換体における内生のＩＡＡ量を定量するために、開花約２日前の子房における内生ＩＡＡ濃度を測定した。測定方法は、実施例１における、（４．単為結果性ナス系統ＰＣＳＳにおけるインドール酢酸（ＩＡＡ）濃度およびＩＡＡ代謝産物濃度の定量）に記載の方法と同様の方法を用いた。結果を図２４に示す。図２４に示すとおり、原系統Ｍ３Ａと比較して、１３０１１−３_ホモでは顕著な内生ＩＡＡ濃度の低下が観察された。また、導入遺伝子を失った１３０１１−３_ヌルでは系統Ｍ３Ａとほぼ同じ濃度まで、内生ＩＡＡ濃度が回復していることが明らかとなった。

以上の結果から、野生型の正常な遺伝子Ａを遺伝子Ａプロモータによって発現させることにより系統Ｍ３Ａの単為結果性が失われ、野生型と同様の非単為結果性が回復すること、および、単為結果性系統の子房で特徴的に見られる高い内生ＩＡＡ濃度が著しく低下することが明らかとなった。このように野生型の遺伝子Ａの発現により系統ＰＣＳＳに由来する単為結果性が失われ野生型の形質が回復されることから、遺伝子Ａの機能欠損が系統ＰＣＳＳの単為結果性の原因遺伝子であることがさらに明確に示された。

（４．準同質遺伝子系統を用いたナス単為結果性の詳細な検定）
＜準同質遺伝子系統を用いた果実重量の測定＞
実施例１における＜単為結果性の詳細マッピング＞および図３に示す手順で育成したＦ８世代のP43F3_316_7_31_F_E10_10およびP43F3_316_7_31_F_E10_04は、単一のＦ７世代個体P43F3_316_7_31_F_E10の自殖により得られた兄弟個体のうちの２個体である。この兄弟個体について、実施例４における＜単為結果性ナス系統「Ｍ３Ａ」の作出＞に記載の方法と同様に、ゲノム全体に分布する９６個の一塩基多型マーカーの遺伝子型を調査し、調査した全てのマーカー遺伝子座が、両者で同じ対立遺伝子型に固定した系統である、「系統０３９」および「系統０８９」を育成した。さらに、系統０３９は系統ＰＣＳＳに由来する遺伝子Ａの変異型をホモに有しており、系統０８９は系統ＴＮ−４３に由来する遺伝子Ａの野生型をホモに有している。したがって、両系統は互いに、遺伝子Ａのみが変異型または野生型であり、他のゲノム領域はほぼ同じ遺伝背景に固定した、準同質遺伝子系統であると考えられる。この系統０３９および系統０８９を同時に栽培し、通常の放任受粉または開花前の柱頭切除を両系統においてそれぞれ施し、開花後３０日後の果実を収穫してその重量を測定した。結果を図２５に示す。図２５に示すように、系統ＰＣＳＳと同じ変異型の遺伝子Ａを有する系統０３９においては、通常受粉した花と柱頭切除して受粉を妨げた花とはいずれも、３００ｇ前後の、通常の大きさに肥大した果実を着生した。一方、系統０８９では、通常受粉した場合は系統０３９と同等の３００ｇ程度の重量を示す正常肥大果が着生したが、柱頭切除して受粉を妨げた場合には、５０ｇ以下の肥大不良果が着生するのみであり、正常肥大果は全く着生しなかった。ここで、上述したように、系統０８９は、系統０３９と同じ遺伝背景を有するが、遺伝子Ａについては変異型ではなく野生型であるという性質を有する、系統０３９の準同質遺伝子系統である。以上の結果から、単為結果性の発現は、変異型遺伝子Ａをホモに有するか、野生型遺伝子Ａをホモに有するか、という違いのみによって制御されており、他の遺伝因子による影響を受けないことが示された。さらに、変異型遺伝子Ａをホモで有する場合は、受粉を妨げても正常に受粉した場合と同等の重量を有する正常肥大した果実が着生することが明瞭に示された。

（５．大腸菌で発現させた遺伝子Ａタンパク質の活性測定）
＜大腸菌で遺伝子Ａを発現させるためのベクターの構築＞
配列番号３で示した遺伝子ＡのｃＤＮＡ配列の塩基番号８２から１２６６までの１,１８５塩基は、配列番号１に示した遺伝子Ａ産物のコード配列と終止コドンからなる。この１,１８５塩基の配列の終止コドン直前に、実施例１における（５．遺伝子Ａのコードするタンパク質Ａの活性測定）＜組換えタンパク質を用いた遺伝子Ａのコードするタンパク質Ａの機能解析＞に記載の方法と同様に、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ配列をコードする２４塩基からなる配列（配列番号６９）を読み枠を合致させて挿入した配列データ（配列番号７３）を作成した。これを入力配列データとして、最適化プログラム「GENEius」（ユーロフィンジェネティクス社）を用いて大腸菌で発現させるために最適なコドン使用頻度となるように配列を変換した。変換後のＤＮＡ配列を配列番号７４に示す。この配列番号７４のコードする推定アミノ酸配列は、配列番号１に示した遺伝子Ａ産物の推定アミノ酸配列のＣ末端にＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ配列が付加されたものと同一である。さらに、配列番号７４で示す配列の５’末端に配列番号７５からなる１６ｂｐの配列を、３’末端に配列番号７６からなる１７ｂｐの配列をクローニング操作のためそれぞれ付加した全長１，２４２ｂｐのＤＮＡ断片を外部委託（ユーロフィンジェネティクス社）によって合成した。このＤＮＡ断片（配列番号７７）を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで処理した大腸菌発現ベクターｐＰＡＬ７（バイオ・ラッド社）と混合し、両断片の末端の相同性を利用したＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法（クロンテック社）によってｐＰＡＬ７に挿入した。得られた組換えベクターｐＰＡＬ７−ｇｅｎｅＡ＿ｓｔｒｅｐ＿ｅｃの構造を図２６に示す。このベクターが導入された大腸菌の細胞中では、Ｔ７／ｌａｃプロモータにより下流の遺伝子の発現が誘導され、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅＸａｃｔタグをＮ末端、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩタグをＣ末端にそれぞれもつ遺伝子Ａ産物（タンパク質Ａ）が産生される。

＜大腸菌におけるタンパク質Ａの発現＞
上述の方法で得られたベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換し、得られたクローンを０．３ｍＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ培地で２０℃、１６時間培養後、集菌してＢ−ＰＥＲタンパク抽出液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて粗タンパク質を抽出した。粗タンパク質抽出後のタンパク質の精製過程における画分を図２７の（ａ）および（ｂ）に示す。図２７の（ａ）は、ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ Ｆｒｅｅゲル（バイオ・ラッド社）を用いた電気泳動の結果を示している。また、図２７の（ｂ）は、図２７の（ａ）に示しているゲルと同一のゲルに対するＳｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩ抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果を示している。以下、レーン番号の注釈は図２７の（ａ）および図２７の（ｂ）において共通である。まず、粗タンパク質を不溶性画分と可溶性画分に分離した。レーン１は、抽出された粗タンパク質のうちの可溶画分である。レーン２は不溶画分である。次に、可溶画分をＰｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅＸａｃｔ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎカラム（バイオ・ラッド社）（スブチリシンプロテアーゼを機能的リガンドとするカラム）に通し、その後カラムを洗浄バッファーで２回洗浄した。レーン３は、カラムに結合せずに当該カラムを素通りした画分である。レーン４は、１回目のカラム洗浄画分である。レーン５は、２回目のカラム洗浄画分である。次いで、フッ化ナトリウムを含む溶出液で溶出することによって、スブチリシンプロテアーゼのプロドメインであるＰｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅＸａｃｔタグが切断され、目的タンパクであるタンパク質Ａがカラムから溶出した。このタンパク質Ａを含む溶出画分がレーン６である。ここで、得られたタンパク質ＡはそのＮ末端にｐＰＡＬ７に由来する配列番号７８の７アミノ酸残基からなるスペーサー配列を有する。図２７（ａ）および（ｂ）のレーン６に示すように、ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ Ｆｒｅｅゲル（バイオ・ラッド社）を用いた電気泳動法による全タンパク質の蛍光検出（図２７の（ａ））でも、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩ抗体を用いた、組換えタンパク質特異的なウェスタンブロッティング法による検出（図２７の（ｂ））においても、得られた精製タンパク質はほぼ単一のバンドとして検出された。このことから、得られた精製タンパク質は、高純度に精製されていることが確認できた。

また、コントロールとして、遺伝子Ａの代わりに、大腸菌由来のＧＵＳ遺伝子組み込んだベクター構築物を作製した。すなわち、大腸菌由来のＧＵＳ遺伝子を遺伝子Ａと同様にＰｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅＸａｃｔタグをＮ末端、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩタグをＣ末端にそれぞれ融合した形で発現するようにｐＰＡＬ７へ組み込み、同様の手順で組換えタンパク質を調製した。そこで得られたＰｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅＸａｃｔタグが切断されたＧＵＳタンパク質は、タンパク質Ａの場合と同様に配列番号７８に示す、７アミノ酸残基からなるスペーサー配列をＮ末端に有する。タンパク質Ａの場合と同様に、この方法で得られた組換えＧＵＳタンパク質も高純度に精製されていることがゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング法により確認された（図示せず）。

＜大腸菌発現タンパク質Ａの活性測定＞
得られた組み換えタンパク質Ａ溶液および組み換えＧＵＳタンパク質溶液（ぞれぞれ０．５μｇ／μＬ）に対し、Ｌ−メチオニン（５０ｍＭ）、ピリドキサールリン酸、ＩＰｙＡ（１ｍＭ）を加えて５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．５）中で３７℃、１時間反応させた後、反応液をOASIS HLBカラムで精製し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分析した。その結果、図２７の（ｃ）に示すように、組換えタンパク質ＡはメチオニンからＩＰｙＡへのアミノ基転移反応により１μｇあたり１時間に９．７ｎｇのトリプトファンを産生する活性があることが明らかとなった。一方、組換えタンパク質Ａの代わりに組換えＧＵＳタンパク質を用いた対照実験では、トリプトファンの産生活性は検出限界以下（Ｎ．Ｄ．）であった。このことは、組換えタンパク質Ａに依存してトリプトファンが産生されること、Ｎ末端のスペーサー配列およびＣ末端のＳｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩ配列は、組換えタンパク質Ａが有するＩＰｙＡを基質とするトリプトファン合成活性に対し無関係であり、トリプトファン合成活性には何ら影響を及ぼしていないことを強く示唆する。

上記結果は、実施例１における（５．遺伝子Ａのコードするタンパク質Ａの活性測定）に記載の結果とともに、遺伝子Ａのコードするタンパク質Ａがアミノ基転移酵素であること、およびＩＡＡの前駆体であるＩＰｙＡを基質としてトリプトファンを合成する活性を有することをさらに証明した。また、その際、少なくともメチオニンからＩＰｙＡへのアミノ基転移反応を触媒し得ることが示された。

以上の結果に基づき、得られた結論は以下の通りである。

ナス系統ＰＣＳＳの単為結果性の原因は遺伝子Ａの欠失変異である。遺伝子ＡはＩＡＡの前駆物質であるＩＰｙＡを基質とし、トリプトファンを合成するアミノ基転移酵素をコードする遺伝子である。ここで、当該アミノ基転移酵素は、アミノ酸のアミノ基をインドールピルビン酸（ＩＰｙＡ）に転移してトリプトファンを合成する反応を触媒する。本発明に係る遺伝子Ａは、少なくともメチオニンのアミノ基をインドールピルビン酸（ＩＰｙＡ）に転移してトリプトファンを合成する反応を触媒し得る。そして、開花前の蕾における子房の発達に伴って発現が上昇すること、およびこの遺伝子の機能欠損によりＩＡＡの内生量が顕著に上昇することから、遺伝子Ａは子房における内生ＩＡＡ含量を一定以下に抑制する機能を担っていることが推測された。この遺伝子Ａの機能欠損により、開花前後の子房におけるＩＡＡ蓄積量の上昇が引き金となって農業生産上実用的な水準の単為結果性がもたらされる。この内生ＩＡＡ量の上昇は、茎（節間）または成長点では観察されず、子房または葯などに特異的に観察される。

さらに、遺伝子Ａと９０％以上のアミノ酸配列の配列同一性を有するトマトホモログ遺伝子ｔＡの発現および機能をＲＮＡｉ誘導より抑制することによりトマトにおいてもナスと同様に単為結果性が誘導できた。また、同様に、遺伝子Ａと９０％以上のアミノ酸配列の配列同一性を有するトウガラシホモログ遺伝子ｐＡについて、ＥＭＳ処理による機能欠損型変異により、トウガラシにおいてもナスおよびトマトと同様に単為結果性が誘導できた。さらには、トマトおよびトウガラシにおいてもナスと同様に、それぞれトマトホモログ遺伝子ｔＡおよびトウガラシホモログ遺伝子ｐＡの機能欠損によりＩＡＡの内生量が顕著に上昇することが分かった。したがって、トマト遺伝子ｔＡおよびトウガラシ遺伝子ｐＡもナス遺伝子Ａと同様の機構によって単為結果性を誘導すると結論した。

本発明によれば、単為結果性を有する新品種の植物を得ることができる。また、本発明は、農業または園芸等の分野に利用することができる。

ＦＥＲＭ ＢＰ−２２２５７

Claims (19)

1. 植物において、以下の（１）〜（３）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されているかを検査する検査工程を含む、植物の単為結果性の判定方法。
   （１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
   （２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
   （３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜３９個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
2. 上記検査工程において、上記単為結果制御活性を有するポリペプチドの配列、上記単為結果制御遺伝子の塩基配列、当該単為結果制御遺伝子の発現量もしくは当該単為結果制御遺伝子の転写産物の量を検査する、請求項１に記載の判定方法。
3. 上記検査工程において、上記単為結果制御遺伝子の発現が抑制されている植物、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されている植物を、単為結果性を示す植物として選抜する、請求項１または２に記載の判定方法。
4. 請求項１〜３の何れか一項に記載の判定方法を行い、単為結果性を示す植物を選抜する工程を含む、単為結果性の形質を示す植物の生産方法。
5. 植物において、以下の（１）〜（３）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現を抑制するか、または当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能を阻害する工程を含む、単為結果性の形質を示す植物の生産方法。
   （１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
   （２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
   （３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜３９個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
6. 上記工程において、上記単為結果制御遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを植物に導入するか、上記単為結果制御遺伝子を破壊する、請求項５に記載の生産方法。
7. 上記植物がナス科の植物である請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
8. 上記植物がナスである請求項７に記載の方法。
9. 請求項５〜８の何れか一項に記載の生産方法により生産された、単為結果性の形質を示す植物。
10. 以下の（１）〜（５）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子。（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９６％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜１５個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （４）配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （５）配列番号３５に記載の塩基配列に対して９５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリヌクレオチド。
11. 以下の（１）〜（５）の何れかに記載のポリペプチド。
    （１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
    （２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９６％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド、
    （３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜１５個の置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチド、
    （４）配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
    （５）配列番号３５に記載の塩基配列に対して９５％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、単為結果制御活性を有するポリペプチド。
12. 以下の（１）〜（３）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む単為結果制御遺伝子の発現が抑制されているか、当該単為結果制御遺伝子がコードするポリペプチドの機能が阻害されており、単為結果性を示す植物。
    （１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    （３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１〜３９個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有し、単為結果制御活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
13. 上記ポリペプチドの機能としての、アミノ酸のアミノ基をインドールピルビン酸（ＩＰｙＡ）に転移してトリプトファンを合成する反応を触媒する活性（アミノ基転移酵素活性）が低下しているか欠損している、請求項１２に記載の植物。
14. 上記ポリペプチドのアミノ酸配列において、アミノ基転移酵素活性の低下または欠損をもたらすアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加が生じている、請求項１３に記載の植物。
15. 上記アミノ酸のアミノ基をインドールピルビン酸（ＩＰｙＡ）に転移してトリプトファンを合成する反応において、アミノ基転移の生じるアミノ酸の少なくとも一つはメチオニンである、請求項１３または１４に記載の植物。
16. ナス科の植物である、請求項１２〜１５の何れか一項に記載に記載の植物およびその後代植物。
17. 上記ナス科の植物が、ナス、トマトまたはトウガラシである、請求項１６に記載の植物およびその後代植物。
18. 上記植物が、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２２２５７で特定される植物またはその後代植物である、請求項１７に記載の植物。
19. 植物体、当該植物体の部分または種子である、請求項１２〜１８の何れか一項に記載の植物。