JP4977156B2 - 17−1a抗原に対する結合活性を有する結合部位ドメイン又は融合蛋白 - Google Patents
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Description
(a) 所定のエピトープへ結合するための融合蛋白の部分として生物学的表示系の表面上に表示された結合部位ドメインのパネルを試験する段階。但し前記融合蛋白は前記結合部位ドメインのN末端に位置する追加のドメイン及び融合蛋白の前記表示系の表面への固定(anchoring)をもたらすアミノ酸配列を含む;
(b) 前記の所定のエピトープと結合する結合部位ドメインを同定する段階。
前もって選択された抗原決定因子(determinant)へ結合することができる結合部位は、前記の前もって選択されたエピトープへ結合することができる免疫グロブリン分子の可変領域と相同的なアミノ酸配列を含む。
本発明によって使用される際の“パネル”という用語は、列挙された(recited)ドメインの2つ以上の対を指し示す。好ましくは、前記パネルはcDNAライブラリのようなライブラリに、又は、より好ましくは例えば、VH/VL鎖の組み合せライブラリに由来する。
融合蛋白中に存在する追加の(additional)ドメインは、ポリペプチドリンカーによって結合部位ドメインへ結合されることもある。その上、前記の追加のドメインは、予定された(predefined)特異性又は機能を有することもある。例えば、文献は、悪性細胞を破壊し、若しくはその位置を特定するため、又は局在化された薬剤又は酵素の効果を誘発させるための体内の特異点に対して薬剤、毒素、及び酵素のような生物活性物質をターゲッティングする概念を示すホストを含む。モノクローナル抗体へその生物活性物質を複合することによりこの効果を達成することが提案されている(例えば、N.Y.オクスフォード大学プレス;及びゴーセ(Ghose)、(1978)J. Natl. Cancer Inst. 61:657-676)。しかし、対応するターゲッティングされた多抗原特異(multifunctional)蛋白を構成することは、キメラ蛋白が、余剰の(extra)配列の存在によりそれらの結合親和力及び/又は特異性を失うという事実及びこの障害を治すには不十分であることが判明した推量(guess work)により妨げられる。
本発明の方法の好ましい態様において、結合部位ドメイン及び前記の追加のドメインは、前記結合部位及び前記の追加のドメインの間に配置されたポリペプチドリンカーにより結合され、前記ポリペプチドリンカーは、複数の親水性ペプチド結合アミノ酸を含み、かつ前記結合部位のN末端及び前記の追加のドメインのC末端に結合する。
周知のように、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体フラグメントであるFvは、非共有結合した1つの重鎖及び1つの軽鎖可変ドメイン(VH及びVL)の二量体から成る。この構造において、各可変ドメインの3つの相補性決定領域(CDR類)が相互作用して、VH-VL二量体の表面上の抗原結合部位を定義する。6つのCDRは、共通して抗体へ抗原結合特異性を与える。CDRの側面に位置するフレームワーク(frameworks)(FR類)は、ヒトとマウスとで異なる種の天然の免疫グロブリンにおいて本質的に保存される第三(tertiary)構造を有する。これらのFRは、それらの適当な配向(orientation)にCDRを保持するために働く。これらの定常ドメインは、結合機能は要求されないが、VH-VL相互作用を安定化させる際に助けとなり得る。全結合部位よりも低い親和力にあるにもかかわらず、単一可変ドメイン(又は一つの抗原に対して特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)でさえ、抗原を認識しそして結合する能力を有する(Painter (1972) Biochem. 11:1327-1337)。
それ故、本発明の方法の特に好ましい態様において、前記結合部位ドメインは、同種の又は異種の免疫グロブリンのいずれかのVH-VL、VH-VH、又はVL-VLドメイン対である。
驚くべきことに、ファージ表示技術に基づく新規なインビトロ選択法を用いることにより(実施例11)、2抗原特異単一鎖融合蛋白内のそれらの位置に依存せずに結合するscFv-フラグメントが、実施例の手法により組み合せ抗体ライブラリから単離できることがここで本発明により見出された(実施例5及び6)。
ファージを用いてトランスフェクトされた細菌に関しては、その細菌は大腸菌であることが好ましい。
好ましくは、前記の追加のドメインは、ファージ粒子の表面上に表示される際に、ファージ伝染力(infectivity)をもたらすのに十分ではない。
好ましくは、前記のエフェクター蛋白は、酵素、毒素、レセプター、結合部位、生合成抗体結合部位、成長因子、細胞識別因子、リンフォカイン(lymphokine)、 サイトカイン(cytokine)、ホルモン、間接的に検出可能な部分(remotely detectable moiety)、又は代謝拮抗物質(anti-metabolite)である。
その上、イオンを隔離することが可能な前記配列は、カルモデュリン(calmodulin)、メタロチオネイン(methallothionein)、それらのフラグメント、又はグルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、及びアルギニンの少なくとも1種の含有量の多いアミノ酸配列から好ましくは選択される。
更に、固体支持体へ選択的に結合することが可能な前記のポリペプチド配列は、プラスに又はマイナスに帯電したアミノ酸配列、システイン含有アミノ酸配列、アビジン(avidin)、ストレプトアビジン(streptavidin)、又はスタフィロコッカス(Staphylococcus)蛋白Aのフラグメントであり得る。
(a) 融合蛋白のファージ表面への固定をもたらす前記アミノ酸配列を前記融合蛋白から除去する段階;
(b) 細菌中の前記融合蛋白の残部をコードする核酸分子のペリプラズミカルな発現段階;及び
(c) 前記結合部位ドメインが前記の所定のエピトープへ結合するか否かを確認する段階。
(a) 上記の組換え体ベクター又は上記の態様において定義されたような融合蛋白のパネルをコードする組換え体ベクターのパネル;及び/又は
(b) 上記のホスト細胞又は(a)において定義されたようなベクターのパネルを用いてトランスフェクトされた細菌ライブラリ。
本発明の方法により同定された結合部位ドメイン若しくは融合蛋白又はそこから由来する少なくとも1つのCDRが、所望の特異性及び生物学的機能を有する他のポリペプチド若しくは抗体の構築のために使用され得ることは当業者に容易に認識されるであろう。よって、本発明はまた、本発明の結合部位ドメイン又は融合蛋白を含むポリペプチド又は抗体にも関する。好ましくは、前記ポリペプチド又は抗体は、図6.3〜6.10及び7のいずれか1つに記載されたようなアミノ酸配列を含む。上記の結合部位又はCDRを使用する場合に、抗体が、例えばEP-A1 0 451 216及びEP-A1 0 549 581に記載されたような当分野において既知の方法により生成され得ることは、当業者に容易に認識されるであろう。
1.1 短(Gly4Ser1)1リンカーを有するCD80-M79scFv(VL/VH)構築物
蛋白は、(Gly4Ser1)1リンカーにより連結されたネズミアンチ17-1A抗体M79の単一鎖Fvフラグメント(scFv)とヒト コスティミュラトリー蛋白CD80(B7-1)の細胞外部分からなるように構築された(図1.1)。M79抗体は、Goettlinger(1986)Int.J.Cancer:38、47-53に記載されているように得られた。M79 scFvフラグメントは、Mack. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92 (1995) 7021-7025に記載されているようにクローン化された。完全なプラスミドは、幾つかの段階でクローン化された。第一に、CTIと呼ばれるポリリンカーは、制限酵素切断部位、Xbal及びSall(ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim))を用いて、Bulescript KSベクター(ゲンバンク(GenBank)(登録商標)取得番号X52327)へ挿入された。ポリリンカーCTIの導入は、図1.2に示されているように(Gly4Ser1)1リンカーの6アミノ酸ヒスチジンタグ及び終止コドンをコードする配列に加えて、追加の切断部位を提供する。ベクターBluescript KS + CTIは、EcoRV及びBspEI(ニューイングランド・バイオラボズ(New England Biolabs)により切断されたM79 scFvフラグメントとそれ(T4 DNA、リガーゼ・ベーリンガー・マンハイム(Ligase Boehringer Mannheim))をライゲイションするために、制限酵素EcoRV及びXmal(ベーリンガー・マンハイム及びニューイングランド・バイオラボズ)による切断により調製された。得られたベクターBluescript KS+CTI+M79 scFvは、予め同じ酵素を用いて調製されたCD80 DNAフラグメントを挿入するために、もう一度EcoRI(Boehringer Mannheim)及びBspEIにより切断された。サブクローニングの前に、CD80フラグメントは、CD80の細胞外部分をコードするヌクレオチド配列(Freeman G.Jら、J.Immunol.143、(1989)2714-2722.)の5'及び3'末端に相補的である特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により得られた。これらのプライマーは、EcoRI及びBspEI制限酵素部位((5'CD80プライマー: 5'GCA GAA TTC ACC ATG GGC CAC ACA CGG AGG CAG 3'; 3'CD80プライマー: 5'TGG TCC GGA GTT ATC AGG AAA ATG CTC TTG CTT G 3')も導入した。このPCRに使用されたcDNA鋳型は、標準の手順(Sambrook、 Molecular Cloning; A Laboratory Manual、 2nd Edition、 Cold Spring Harbour Laboratory Press、cold Spring Habour、 New York (1989))によりバーキットリンパ腫細胞系Rajiから調製された全RNAの逆転写により調製された。
17-1A-抗原への結合は、終止コドンが続くGA 733-2として知られている17-1A抗原の最初の264アミノ酸をコードするDNA(Szala, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (1990) 3542-3546)のCHO細胞中での安定な発現により、説明されたように(Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995) 7021-7025)得られた可溶性17-1A-抗原を用いて分析された。抗原は、50 μg/mlの濃度のリン酸バッファー化生理食塩水PBSにより、96ウェルU底ELISAプレート(nunc maxisorb)上で固定化された。被覆は、4°Cで12時間50μlで行われ、続いて(PBS) 0.05%トゥイーンにより一度洗浄された。ELISAは、その後PBS/3%ウシ血清アルブミン(BSA)と共に1時間遮断され、もう一度洗浄された。次に、細胞培養物上清は希釈されずに添加され、数回希釈され、2時間インキュベートされた。検出システムとして、1:200で希釈されたネズミIgG1アンチ His-タグ抗体(ディアノバ(dianova)ハンブルグ)とぺルオキシダーゼ複合ポリクローナルヤギアンチネズミ IgG (Fc) (dianova, Hamburg) 抗体は、順番に適用された。ELISAは、実施例8に記載されているようにABTS-基質溶液(2'2アジノ(Azino)-ビス (3エチルベンズチアゾリン(Ethlbenzthiazoline)-6-スルホン酸)、シグマ(SIGMA) A-1888、スタンハイム(Steinheim))の添加により行われた。結果は、OD 405 nmにおいてELISA読み取り機により測定された;結果は、図1.4.に示されている。結合活性ははっきりと測定することはできなかった。陰性参照として、プレートは、抗体構築物の代りにPBSを用いてインキュベートされた。陽性参照としては、前記アンチ-17-1A/アンチ-CD3 2特異性-単一鎖抗体(Mack、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995) 7021-7025)が用いられた。
17-1A-抗原の固定化、ブロッキング、及び細胞培養上清のインキュベーションは、上記のように行われた。検出は、1:1000に希釈されたネズミIgG1アンチ-CD80-抗体 (ディアノバ(dianova)、ハンブルグ)、続いて1:5000に希釈されたぺルオキシダーゼ複合ポリクローナルヤギアンチ-ネズミIgG (Fc)-抗体 (ディアノバ(dianova)、ハンブルグ)を用いて行われた。ELISAは、ABTS基質を用いて行われ、OD値は上記のように測定されたが、この場合も17-1A-結合活性は検出することができなかった。陽性参照としては、アンチ-17-1A/アンチ-CD3 2特異性-単一鎖抗体(Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995) 7021-7025)が使用され、記載されたアンチ-His-タグ抗体により検出された。結果は、図1.5に示されている。
特異的抗原結合を検出する細胞培養上清のELISAはすべて陰性であったため、組換え体蛋白は上清中に分泌されていないと言う可能性を除外するために、ローラーボトル培養物の上清(300ml)からの蛋白精製により、可溶性CD80-M79scFvが得られた。精製は、記載されているように(Mack、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995) 7021-7025) ニッケル-NTA-カラムを用いて行われた。2抗原特異CD80-M79scFv-構築物の検出は、その17-1A-抗原結合活性について、個々に、それぞれアンチ-マウスIgG(Fc)抗体がそれぞれ続くアンチ-CD80抗体(実施例1.1.2.参照)とアンチHis-タグ抗体(実施例1.1.1.参照)のどちらかを用いて別々の実験において行われた。OD値の測定と同様にELISAの操作は、上記のように行われた。結果は図1.6に示されており、細胞培養上清中にCD80-M79scFv-構築物の存在を確認した。
M79scFvフラグメント内のVL/VHからVH/VLのIg可変領域の配列を変化させるため、Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995) 7021-7025に記載されている方法(実施例2.1も参照)により、オリゴヌクレオチドプライマー5'VHB5RRV:AGG TGT ACA CTC CGA TAT C(A,C)A (A,G)CT GCA G(G,C)A GTC (A;T)GG、 3'VHGS15、 5'VLGS15 、3'VLBspE1 (最後の3つのオリゴヌクレオチドの配列は実施例2.1を参照)を用いた2段階融合PCRが行われた。VH/VL-scFv-フラグメントをコードするPCRフラグメントは、制限酵素EcoRV/BspEIにより切断され、EcoRV/XmaIによる切断により予め調製されたベクターBluescript KS + CTI(実施例1.1.参照)に挿入された。次に、転換されたM79scFv (VH/VL)フラグメントは、制限酵素BspEI/SalIにより除去され、BspEI/SalIを用いてプラスミドpEF-DHFR+CTI + CD80-M79scFv (VL/VH)に導入され、M79scFv- VL/VHフラグメントを置換した(図1.3.2.参照)。トランスフェクション及び細胞培養の手順は、上記のように行われた。抗原結合の分析は、記載された17-1A-ELISA(実施例1.1.2.)を用いて行われた。しかし、代りに配置されたCD80-M79scFv-構築物の17-1A結合活性は、検出することができなかった。結果は図1.7.に示されている。
初めに、M79scFv (VH/VL)フラグメントは、実施例1.2.に記載されたように2段階融合PCRにより得られた。VH/VL-scFv-フラグメントをコードするPCRフラグメントは、制限酵素EcoRV/BspEIにより切断され、EcoRV/XmaIで切断されたBluescript KS +CTIベクターにサブクローン化された(実施例1.1.参照)。更なる段階においては、15アミノ酸からなる長グリシン-セリンリンカー(Gly4Ser1)3が導入された。従って、(Gly4Ser1)3リンカーをコードするために、かつ、BspEI及びBamHIと適合する張り出しを提供するためにデザインされた他方のオリゴヌクレオチドリンカー(ACCGS15BAM)は、Bluescript KS + CTI + M79 scFv (VH/VL)に挿入される必要があった(実施例1.2.参照)。このリンカーのヌクレオチド配列は、図1.8.に示されている。
(Gly4Ser1)リンカーで連結されたアンチ17-1A抗体M74の単一鎖Fvフラグメント(scFv)及びコスティミュラトリー蛋白CD80からなる蛋白が構築された(図1.1)。M74抗体は、Goettlinger (1986) Int. J. Cancer: 38, 47-53.に記載されているように得られた。M74のVL及び VHは、Orlandi (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3833-3837に記載されているようにハイブリドーマ細胞系に対応する全RNAからクローン化され、配列決定が行われた。M74抗体のVL及び VHを含むプラスミドは、2段階融合PCRのための鋳型としてそれぞれ使用され、その結果、ドメイン配列がVL/VHであるか、又は、その代りの配列VH/VLのどちらかであるM74 scFv-フラグメントを得た。VL/VH配列については、M74 VLのプライマーは、5'VLB5RRV (5'AGG TGT ACA CTC CGA TAT CCA GCT GAC CCA GTC TCC A3')及び3'VLGS15 (5'GGA GCC GCC GCC GCC AGA ACC ACC ACC ACC TTT GAT CTC GAG CTT GGT CCC3')であり、M74 VHについては、5'M74VHGS15 (5'GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGT TCT CAG GT(GC) (AC)A(AG) CTG CAG (GC)AG TC(AT) GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCA GTG AAG ATT TCC TGC 3')及び3'VHBspEI (5'AAT CCG GAG GAG ACG GTG ACC GTG GTC CCT TGG CCC CAG3`)であった。VH/VL-配列については、M74 VHのプライマーは、5'M74VHEcoRV (5'TCC GAT ATC (AC)A(AG) CTG CAG (GC)AG TC(AT) GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGG GCT TCA GTG AAG ATT TCC TGC 3')及び3`VHGS15 (5'GGA GCC GCC GCC GCC AGA ACC ACC ACC ACC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G 3')であり、M74 VLについては5'VLGS15 (5'GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGT TCT GAC ATT CAG CTG ACC CAG TCT CCA3')及び3'VLBspEI (5'AAT CCG GAT TTG ATC TCG AGC TTG GTC CC3')であった。第一のPCR段階では、対応するVH-及び-VLフラグメントは、以下のPCRプログラムを用いて得られた:変性94℃で5分間、アニーリング37℃で2分間、伸長72℃で1分間、第一サイクル;変性94℃で1分間、アニーリング37℃で2分間、伸長72℃で1分間、6サイクル;変性94℃で1分間、アニーリング55℃で1分間、伸長72℃で45秒間、及び18サイクル;最終伸長 72℃で2分間。VH及びVLの精製されたPCRフラグメントは、その後、M74 scFV VH/VLのための5'M74VHEcoRV及び3'VLBspEIと同様に、以下のM74 scFv VL/VHのプライマー 5'VLB5RRV及び3'VH BspEIを用いる融合PCRの第二段階のために使用された。下記のPCRプログラムが使用された:94℃で5分間、一回;変性94℃で1分間、アニーリング55℃で1分間、伸長72℃で1時間30分間、及び8サイクル;最終伸長72℃で2分間)。次の段階は、フラグメントをEcoRV/BspEIにより切断し、ベクターをEcoRV/XmaIで切断することにより、両方のM74 scFv配列をプラスミドBluescript KS+CTI(実施例1参照)にクローン化するためのものであった。下記の操作法が異なる長さのリンカーを有する構築物を得るために使用された:
更なる実施例においては、組合わせ抗体ライブラリからファージ表示法によりインビトロで選択されたヒトアンチ-17-1A抗体(VD4.5VK8)が、実施例1、2及び4並びに図1.1に例示されているように2抗原特異単一鎖構築物のC末端におけるその抗原結合活性を分析するために選ばれた。VD4.5VK8のVH -及びVL-鎖は、公知のヌクレオチド配列(図3.1及び3.2)を有するクローン化されたDNAフラグメントの形態で利用可能であり、以下のプライマーを用いたPCRの鋳型分子として用いられた:VHには: 5'VH1357 5'-AGG TGC AGC TGC TCG AGT CTG G-3及び3'huVHBstEII 5'-CTG AGG AGA CGG TGA CC'-3; VLには:5'VK3 GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG (AT)TG AC(AG) CAG TCT CC-3'及び3'huVkBsiWI/SpeI 5'-GAA GAC ACT AGT TGC AGC CAC CGT ACG TTT (AG)AT-3')。それぞれVH-と VL-鎖(VH-respectively VL-chains)は、実施例5に記載されているpComb3H5Bhisと呼ばれる新たに構築されたベクターに導入された。VD4.5VK8 VHは、XhoI及びBst EIIにより、VD4.5VK8 VLは、SacI及びSpeIによりサブクローン化され、その結果プラスミドpCOMB3H5BHis+VD4.5VK8 VH+VLを得た。pComb3H5BHis-ベクターを用いることにより、融合PCRは、ドメイン配列VH/VLを有するscFv-抗体フラグメントを得るためにもはや必要ではなくなった。
Goettlinger (1986) Int. J. Cancer:38, 47-53.に記載された方法により得られた他のネズミアンチ-17-1A抗体(MACH)は、2抗原特異単一鎖構築物のC末端におけるそのscFv-フラグメントの抗原結合活性に関して分析された。対応する免疫グロブリン可変領域VL及びVHは、Orlandi、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86, 3833-3837によるRT-PCRにより、ハイブリドーマ細胞系から調製された全RNAからクローン化され、続いてOrlandi (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.: 86, 3833-3837により、ヒトIgG1kappa -Isotypeのキメラ抗体として哺乳類細胞において発現された。組換え体抗体は、トランスフェクトされた細胞系、及びハイブリドーマ細胞系それぞれの培養物上清を用いて17-1A-ELISAにより決定されたようにそのネズミ親抗体を集合させ、17-1A抗原に結合すると証明された。結合した抗体の検出は、アンチ-ヒト-又はアンチ-ネズミ免疫グロブリン抗体それぞれを用いて行われた。ELISAの操作及びOD値の測定は、実施例8に記載されたように行われた。結果は、図4に示されている。
本発明の方法による抗体フラグメントのインビトロ選択のために適したファージ表示ベクターのための出発点は、pComb3の誘導体であるベクターpComb3H(Barbas、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (1991) 7978-7982)が使用され(クローン化部位については図5.1参照)、下記を提供する:
・陽性形質転換及び組換え体ファージ粒子による感染のためのカルベニシリン耐性選択を可能にするbla遺伝子
・細菌性ぺリプラズムへの機能性(抗原特異)抗体フラグメントの蛋白分泌のための原核生物リーダー配列
・高い蛋白生成度のための誘導可能なlacプロモーター
・繊維状ファージ(ファージ表示)表面上の抗体フラグメントの固定のために必要なM13ファージ遺伝子III生成物の被覆ドメインCT
pComb3Hベクターは、NheIにより切断され、適当な末端を持つ二本鎖オリゴヌクレオチドはライゲイションにより挿入された。6つのHis残基をコードする二本鎖オリゴマーは2つの5'-リン酸化プライマーHis6s及びHis6asのアニーリング(94°Cで10分間; 65 °Cで30分間; 52 °C 30分間及び30°C 10分間)を介して生成された。
His6as: 5'-CTAGTGTGATGGTGATGGTGATGG-3'
挿入部は、配列決定され、クローニングの性高及びpComb3HHisと呼ばれる新規ベクターが確認された。
5BFors:
5'-GCAGCTGGTCGACAAATCCGGAGGTGGTGGATCCGAGGTGCAGCTGC-3'
5BForas:
5'-TCGAGCAGCTGCACCTCGGATCCACCACCTCCGGATTTGTCGACCAGCTGCAGCT-3'
5BBacks:
5'-TCGAGCCCGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGAGCTCGGGA-3'
5BBackas:
5'-CTAGTCCCGAGCTCAGAACCACCACCACCGGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCTGAGGAGACGGTGACCGGGC-3'
バクテリオファージfdの遺伝子III生成物のアミノ酸87から217に対応するM13遺伝子IIIドメインN2(Beck、 Nucl. Acid. Res. 5 (1978), 4495-4503)は、scFv-フラグメントのN末端へ融合するべき適切な蛋白として選択された。完全な遺伝子III生成物と異なり、N2-ドメインはファージ伝染力をもたらさなかった。
5' N2 SalI : 5'-GGTGTCGACACTAAACCTCCTGAGTACGG-3'
3'N2 BspEI : 5'-GCCTCCGGAAGCATTGACAGGAGGTTGAGG-3'
その多クローン化部位の配列は、図5.2に示されている。
図5.3は、クローン化されたscFv- 抗体-フラグメントを有するpComb3H5BHisのプラスミドマップを示している。
特に記載されていなければ、Sambrook, Molecular Cloning, 'A Laboratory Manual', 2nd Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY (1989)に記載されている手順 に従う。
免疫化のために、100 μl PBS中の25 μgの可溶性17-1A抗原は、100 μlの不完全フロイントアジュバント(Freunds Adjuvance)(IFA)と混合され、1匹のマウスに皮下注射された。2及び5週間の後、注射は、同じ容量(100 μl)のIFAにそれぞれ混合された同量の抗原を用いて繰り返された。初めの注射から4週間後、成功した免疫化は、1:5、1:50、及び1:500に希釈されたマウス血清、続いてぺルオキシダーゼ複合アンチ-マウスIg-抗体を用いて、17-1A ELISA(実施例8)により分析された。陰性及び交差反応参照と比較して、強いシグナルが全ての濃度において得られた。
ネズミ免疫グロブリン(Ig)軽鎖カッパー可変領域(VK)及びIg重鎖可変領域(VH)のDNAフラグメントのライブラリは、VK-及びVH特異的プライマーを用いて、ネズミ脾臓RNAにおけるPT-PCRにより構築された。cDNAは、標準プロトコル(Sambrook、 Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989, second edition)により合成された。
VH DNA-フラグメントのPCR増幅のために、8つの異なる5'-VH-族特異的プライマーは、それぞれ1つの3'-VHプライマーと組み合わされた;VK鎖フラグメントのPCR増幅のために、7つの異なる5'-VK族特異的プライマーは、それぞれ1つの3'-VKプライマーと組み合わされた。VH-及びVK-DNA-フラグメント (5'から3')の増幅のためのプライマーセットは、表1に示されている。
細胞は、その後、遠心分離により回収され、プラスミド調製は市販のプラスミド調製キット(キアゲン(Qiagen))を用いて行われた。
1時間の表現型発現の後、陽性形質転換は、カルベニシリン耐性によって選択された。
この適合化の後、これらのクローンは、ヘルパーファージVCSM13感染性分量の1×1012粒子により感染され、その結果ネズミscFvフラグメントをコードし、かつファージ被覆蛋白IIIへの翻訳性融合(ファージ表示は図6.2参照)としてファージ表面上のN2ドメインに融合した対応するscFv蛋白を表示する一本鎖pComb3H5BHis-DNAをそれぞれ含む単一鎖繊維状ファージが生成され、かつ分泌された。
可溶性抗体フラグメントのぺリプラズミカルな発現と同様に、このインビトロでの選択手順は、Burton,μ、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991)、 10134-10137に記載されているように行われた。
固定化された可溶性17−1A抗原に結合したN2-scFv-フラグメントの検出は、アンチ-His-タグ抗体(1 μg/ml PBS)を用いて行われ、ホースラディッシュ ぺルオキシダーゼ複合ポリクローナルアンチマウス抗体(1 μg/ml PBS)により検出された。信号は、実施例8に記載されているようにABTS基質溶液の添加により発生し、波長405 nmで検出された。
抗原選択の前のクローンとの比較において、3、4、及び5回の選別後の多くのクローンは、図6.2に示される17-1A結合活性を示した。
特に記載されていない場合は、Sambrook、 Molecular Cloning、 'A Laboratory Manual'、 2nd Edition、 Cold Spring Harbour Laboratory Press、 Cold Spring Harbour NY (1989)に記載されている手順に従う。
下記の9つの17-1A特異的scFv構築物は、実施例6に記載された手順により得られた。
p-Comb3H-5B-His中の 17-1A 3-1
p-Comb3H-5B-His中の 17-1A 3-5
p-Comb3H-5B-His中の 17-1A 3-8
p-Comb3H-5B-His中の 17-1A 4-1
p-Comb3H-5B-His中の 17-1A 4-4
p-Comb3H-5B-His中の 17-1A 4-7
p-Comb3H-5B-His中の 17-1A 5-3
p-Comb3H-5B-His中の 17-1A 5-10
p-Comb3H-5B-His中の 17-1A 5-13
は、CHO細胞内の安定な発現のためにベクターpEF-DHFRへサブクローン化された。この段階において、N2-ドメインは、ヒトCD80(= B7-1)の2つの細胞外ドメインにより置換された。
5' B7-1 5'- GCA GAA TTC ACC ATG GGC CAC ACA CGG AGG CAG-3'
3' mu VK 5'-TGG TGC ACT AGT CGT ACG TTT GAT CTC AAG CTT GGT CCC-3'
これら構築物の発現は、説明されたように(Kaufmann, Methods Enzymol. 185 (1990), 537-566)、最終濃度が20 nMになるようなDHFR阻害剤メトトレキセート(MTX)の添加により誘導された遺伝子増幅により増加された。
一次選択及び第一増幅段階から誘導されたこれらのトランスフェクトされた細胞系の培養物上清は、ELISAにより試験された。従って、組換え体可溶性17-1A(Mack、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995)、 7021-7025)はリン酸バッファー化生理食塩水(PBS) (Nunc maxisorb) (50 μg/ml 50 μl/ウェル)中において、96ウェルU底ELISAプレートに被覆された。被覆は終夜4℃で行われた、ブロッキングはPBS中の3%ウシ血清アルブミン(BSA)を用いて1時間室温で行われた。一次選択(PS)(図8.1及び8.2)及び第一増幅段階(1. Amp.)(図8.3及び8.4)による培養物上清としての抗体構築物は、それぞれ添加され、一時間室温で1% BSAを含むPBSによる異なる希釈においてインキュベートされた。
図8.1及び8.2に示されているように、全てのクローンは、様々な結合強度で17-1A抗原に結合していることが証明された。
9つの17-1A 2抗原特異CD80-scFv-構築物(実施例7)のうちの1つをそれぞれ含む第一遺伝子増幅段階から得られた培養物上清は、フローサイトメトリーにより17-1AによりトランスフェクトされたCHO細胞において試験された。これらのトランスフェクトされた細胞系は、標準手順(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Habour, NY (1989))による真核性発現ベクターpEF-DHFR内への GA733-2(Szala, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (1990), 3542-3546)として知られている17-1A抗原の完全なアミノ酸配列をコードするDNAフラグメントのサブクローニングにより生成され;得られたプラスミドの制限酵素Nde Iを用いた線状化及び続くDHFR欠損CHO細胞への安定なトランスフェクションは、実施例7に記載されているように行われた。トランスメンブラン17-1Aの発現は、濃度段階20 nMから100 nMの間で、最終濃度500 nMになるようにDHFR阻害剤メトトレキセート (MTX)の増加する濃度の継続添加(Kaufmann、 Methods Enzymol. 185 (1990)、 537-566)により誘導される段階的な遺伝子増幅により増された。
この目的のために、粘着性非トランスフェクト、及び17-1AトランスフェクトCHO細胞は、0.05%のトリプシンを含むPBSを用いてそれぞれ分離された。5×105の細胞は、希釈されていない対応する2抗原特異構築物(図9.1)を含む50 μlの培養物上清中、氷上で30分間インキュベートされた。結合した2抗原特異CD80-scFv構築物は、50 μlのPBSにより1:20に希釈されたモノクローナルアンチ-CD80抗体(Immunotech. Cat. No: 1449)により検出された。インキュベート条件は、上記と同様である。結合したCD80-抗体は、PBSで1:100に希釈されたフルオレセイン複合ポリクローナル ヤギアンチマウスIgG+ IgM (H+L)抗体により最終的に検出された。インキュベイションは、再度30分間氷上で行われた。フルオレセインラベル細胞の固定のために、1%パラホルムアルデヒド含有PBSが使用された。
本発明の方法により得られたscFv-抗体への特異的17-1A抗原の結合が、特に更なる2抗原特異単一鎖構築物内のN末端ドメインに依存していないことを確認するために、実施例7-9に説明される組換え体単一鎖蛋白のN末端領域を形成する細胞外部分は、それぞれCD54、CD58及びCD86に置換された。異なる2抗原特異単一鎖構築物の構築は以下に説明されている。
ICAM-1(細胞内吸着分子-1)として知られているCD54は、Igスーパーファミリーに属している。それは、多くのリンパ球、例えば、樹状細胞において発現される高度に糖化された蛋白である。より詳細な説明は、Simmons D.らのNature 331 (1987) 624-626により出版されている。cDNA鋳型は、TPA刺激HL-60細胞から調製された全RNAの逆転写により得られた。CD54の細胞外領域を増幅するために、5'及び3'の特異的プライマーが使用された。これらのプライマーは、更に、制限酵素切断部位EcoR1及びBspE1(5' ICAM: CTC GAA TTC ACT ATG GCT CCC AGC AGC CCC CG及び3'ICAM: GAT TCC GGA CTC ATA CCG GGG GGA GAG CAC )もまた導入した。
LFA-3(リンパ球機能結合抗原(Lymphocyte Function-Associated Antigen))としても知られているCD58は、Ig-スーパーファミリーに属している蛋白であり、CD2のカウンターレセプターである。より詳細な説明は、Wallner B.P. らのJ.Exp.Med 166 (1987) 923-932として出版されている。cDNA鋳型は、U937細胞から調製された全RNAの逆転写により得られた。CD58の細胞外領域を増幅し、かつ、制限酵素切断部位Xba1及びBspE1を導入するために、特異的5'及び3'プライマー(5`LFA-3 AA TCT AGA ACC ATG GTT GCT GGG AGC GAC G and 3'LFA-3 AAG TCC GGA TCT GTG TCT TGA ATG ACC GCT GC)が使用された。更なるクローニング及び発現手順は、CD58-DNA-フラグメント内の内在EcoRI部位のため、EcoRIの代りにXbaIが使用されたこと、及び、重複するdam部位のため、CD58フラグメントの3'末端におけるBspEIのブロッキングを防ぐために、dam-メチラーゼ欠損大腸菌株を使用したこと除いては、上記CD54について記載されているのと同様である。最終的に得られたトランスフェクトされたCHO細胞(pEF-DHFR-CTI-CD58- アンチ17-1A 4-7、pEF-DHFR-CTI-CD58- アンチ17-1A 5-3及び pEF-DHFR-CTI-CD58- アンチ17-1A 5-10)は、10%の透析されたFCS及び2 mMのL-グルタミンにより補充されたヌクレオシドを含まないα-MEN培地において選択のために培養された。これら構築物の発現は、続いて、説明されているように(Kaufman、 Methods Enzymol. 185 (1990), 537-566)、最終濃度が20 nMになるようにDHFR-阻害剤メトトレキセート(MIX)の添加により誘導された遺伝子増幅により増加された。
B7-2としても知られているCD86コスティミュラトリー蛋白は、Igスーパーファミリーに属している。それは、306アミノ酸からなる高度に糖化された蛋白である。より詳細な説明は、 Freeman G.J.らのScience 262 (1993) 909-911において出版されている。cDNA鋳型は、バーキットリンパ腫細胞系Rajiから調製された全RNAの逆転写により得られた。CD86の細胞外領域の増幅のために、特異的5'及び3'プライマー(5'B7-2: 5'AAG TCT AGA AAA TGG ATC CCC AGT GCA CTA TG 3'、3'B7-2: 5'AAT TCC GGA TGG GGG AGG CTG AGG GTC CTC AAG C '3)が使用された。これらのプライマーは、CD86 PCRフラグメントをベクターBluescript KS-CTI-M79scFv (VL/VH)へクローン化するために(実施例1参照)使用されるXba1及びBspE1切断部位をも導入する。更なるクローニング及び発現手順は、CD86-DNAフラグメント内に内在するEcoRI-部位のため、EcoRIの代りにXbaIが使用されることを除いては、D54構築物について上記と同様である。最終的に得られたトランスフェクトされたCHO細胞(pEF-DHFR-CTI-CD86- アンチ17-1A 4-7、 pEF-DHFR-CTI-CD86- アンチ17-1A 5-3及びpEF-DHFR-CTI-CD86- アンチ17-1A 5-10)は、10% の透析されたFCS及び2 mMのL-グルタミンにより補充されたヌクレオシドを含まないα-MEN培地において選択のために培養された。これらの構築物の発現は、続いて、記載されているように(Kaufman、 Methods Enzymol. 185 (1990)、 537-566)、最終濃度が20 nMになるようなDHFR-阻害剤メトトレキセート(MTX)の添加により誘導された遺伝子増幅により増加された。
ネズミV重鎖:
5'プライマー
MVH1 5'-(GC)AGGTGCAGCTCGAGGAGTCAGGACCT-3'
MVH2 5'-GAGGTCCAGCTCGAGCAGTCTGGACCT-3'
MVH3 5'-CAGGTCCAACTCGAGCAGCCTGGGGCT-3'
MVH4 5'-GAGGTTCAGCTCGAGCAGTCTGGGGCA-3'
MVH5 5'-GA(AG)GTGAAGCTCGAGGAGTCTGGAGGA-3'
MVH6 5'-GAGGTGAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGT-3'
MVH7 5'-GAAGTGAAGCTCGAGGAGTCTGGGGGA-3'
MVH8 5'-GAGGTTCAGCTCGAGCAGTCTGGAGCT-3'
3'プライマー
MUVHBstEII 5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3'
ネズミVカッパー鎖:
5'プライマー
MUVK1 5'-CCAGTTCCGAGCTCGTTGTGACTCAGGAATCT-3'
MUVK2 5'-CCAGTTCCGAGCTCGTGTTGACGCAGCCGCCC-3'
MUVK3 5'-CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA-3'
MUVK4 5'-CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA-3'
MUVK5 5'-CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA-3'
MUVK6 5'-CCAGATGTGAGCTCGTCATGACCCAGTCTCCA-3'
MUVK7 5'-CCAGTTCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCA-3'
3'プライマー
MUVKHindIII/BsiWI 5'-TGGTGCACTAGTCGTACGTTTGATCTCAAGCTTGGTCCC-3'
Claims (8)
- 配列番号61、63、65、67、69、71、73、75及び77のいずれか1つに示されたscFvフラグメントの相補性決定領域(CDR)の全てを含み、かつ17−1A抗原に対する結合活性を有する結合部位ドメイン又は融合蛋白。
- 配列番号61、63、65、67、69、71、73、75及び77のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を有する請求項1に記載の結合部位ドメイン又は融合蛋白。
- 請求項1又は2の結合部位ドメイン又は融合蛋白を少なくとも1つ含有し、かつ17−1A抗原に対する結合活性を有するポリペプチド又は抗体。
- 請求項3のポリペプチド又は抗体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項4のポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトされた細胞。
- ポリペプチドの発現のために適当な条件下で請求項5の細胞を培養すること、及び細胞培養培地から前記ポリペプチドを単離することを含む請求項3のポリペプチド又は抗体の調製方法。
- 請求項3のポリペプチド又は抗体及び任意に薬学的に適用可能なキャリアーを含む薬学的組成物。
- 請求項3のポリペプチド又は抗体及び任意に検出のために適当な手段を含む診断用組成物。
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