JPH0789873A

JPH0789873A - リンパ球抗原ｃｄ２および腫瘍抗原を認識する二特異性トリガー分子

Info

Publication number: JPH0789873A
Application number: JP6181568A
Authority: JP
Inventors: Wolfgang Strittmatter; シュトリットマターヴォルフガング; Silvia Jaeggle Carlota; イエーグレカルロタ−シルビア; Stefan Meuer; モイアーシュテファン; Burkhart Schraven; シュラーフェンブルクハルト; Martin Wild; ヴィルトマルティン
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1993-08-02
Filing date: 1994-08-02
Publication date: 1995-04-04
Anticipated expiration: 2021-09-20
Also published as: KR950005327A; NO942850D0; CA2129183C; DK0637593T3; AU6869894A; ATE199378T1; NO942850L; DE69426743D1; UA40577C2; CA2129183A1; HU218100B; HU9402220D0; CZ180294A3; ES2156587T3; PL176761B1; JP3822653B2; EP0637593A1; KR100347465B1; HUT71309A; PL304510A1

Abstract

(57)【要約】【目的】リンパ球ＣＤ２抗原およびあらゆる可変腫瘍
抗原を認識する高度に有効な新規の二特異性抗原フラグ
メントを提供する。【構成】二特異性抗原フラグメントは、腫瘍細胞のエ
ピトープと結合する第一結合部位およびＣＤ２抗原のエ
ピトープと結合する第二結合部位からなり、ＢＡｂ＜
Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞ＹまたはＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ
２．Ｍ２＞Ｙと表される。但し、ＢＡｂは二特異性抗体
を意味し、Ｘは腫瘍抗原を認識する抗体決定基であり、
ＡＩＣＤ２．Ｍ１、ＡＩＣＤ２．Ｍ２はＣＤ２抗原を認
識するモノクローナル抗体であり、そしてＹは全抗体の
一部分である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、リンパ球ＣＤ２抗原お
よび任意の可変腫瘍抗原を認識する新規の二特異性抗体
フラグメントに関する。好ましくは上皮増殖因子レセプ
ター（ＥＦＧ−Ｒ）の抗原決定基を腫瘍抗原として用い
る。さらに本発明はＡＩＣＤ２．Ｍ１およびＡＩＣＤ
２．Ｍ２と称する二つの新規のモノクローナル抗体およ
びそれらの合わせての腫瘍溶解への正の影響に関し、少
なくともそれらの一つが二特異性抗体フラグメントであ
る。抗体および抗体フラグメントは腫瘍の治療および診
断に有効に使用することができる。

【０００２】

【従来の技術】腫瘍細胞を排除する場合、Ｔリンパ球は
おそらく最も有効な免疫系構成要素である。しかし、ほ
とんどの癌患者は腫瘍細胞と特異的に反応する細胞毒性
Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を充分には保持していない（例え
ば、Ｋｎｕｔｈら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１、３５１１）。ＣＴＬ
の溶解能をすべて活性化するためには、これら細胞が天
然特異性を有しない腫瘍細胞に対することができるよう
に全細胞を処理しなければならない。腫瘍細胞上のある
種の卷く抗原にモノクローナル抗体を結合させることに
よって、Ｔ細胞は活性化されて増殖、サイトカイン分泌
および細胞溶解活性が認められる。

【０００３】腫瘍関連抗原を一方の結合肢で認識してＴ
細胞マーカーをもう一方の結合肢で認識する二特異性抗
体（ＢＡｂ）は、一特異性ＣＴＬと悪性細胞とを架橋す
ることが示された（例えばＳｔａｅｒｚら、１９８５、
Ｎａｔｕｒｅ３１４、６２８）。

【０００４】これら人工的抗体によるＴ細胞活性化はＴ
細胞レセプター（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体を通して起き
得るが、ここでＴＣＲは抗原認識およびＴＣＲ−抗原相
互作用によって生じるシグナルのトランスダクションの
ためのＣＤ３エピトープに関与する（例えば、Ｈ．Ｎｅ
ｌｓｏｎ、ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌｓ、Ｍａｙ１９９
１、１６３の総説およびその引用文献を参照された
い）。

【０００５】エフェクター細胞活性化は、Ｔリンパ球お
よびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に存在する糖タン
パク質であるＣＤ２抗原を介して起きる（例えば、Ｈｕ
ｅｎｉｇら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ３２６、２９
８）。ＣＤ２は、エフェクター細胞と標的細胞上の天然
リガンドＬＦＡ３（ＣＤ５８）との相互作用を支持す
る。三つの機能的に重要なエピトープ（Ｔ１１．１、Ｔ
１１．２およびＴ１１．３）がＣＤ２上に同定された。
抗体結合の際に転形（モジュレーション）を起こすＣＤ
３抗原とは対照的に、ＣＤ２を抗体で標的攻撃した後の
ＣＤ２転形は今までのところ報告されていない。抗ＣＤ
２抗体を活性化に用いた以前の研究によると、ＣＤ２抗
原を介しての二段階活性化が現実的のようである。これ
まで活性化に用いられてきた共働的に作用する抗ＣＤ２
特異性は、抗Ｔ１１．２プラス抗Ｔ１１．１またはＴ１
１．２プラス抗Ｔ１１．３などの抗体によって特徴づけ
られる。Ｔ１１．３は抗Ｔ１１．２による活性化の後に
アクセス可能になる隠れた（ｃｒｙｐｔｉｃ）エピトー
プであることが報告されている。今までのところ用いら
れる抗体のほとんどが、天然ＣＤ２リガンドＬＦＡ−３
と結合を競合することが明かである（例えば、Ｂｏｌｈ
ｉｕｓら、１９９１、ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．
Ｉｍｍｕｎｔｈｅｒ．３４、１およびその引用文献）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】したがって、抗腫瘍抗
体に由来する新規の二特異性抗体、および二段階活性化
の後に影響を受けないＣＤ２／ＬＦＡ３を介して細胞の
正常の交差反応（ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ）を維持しなが
ら細胞毒性を発揮することができる一対の共働的に作用
する抗ＣＤ２抗体を開発することが本発明のねらいであ
った。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明による新規の二特
異性抗体は次のような好ましい性質を有することが見出
だされた。すなわち、腫瘍細胞に対する強い親和性、Ｔ
細胞およびＮＫ細胞に対する強い親和性、ＬＦＡ３に対
する非競合性、ＬＦＡ３との非共働性、非レセプター転
形性、高いＮＫ細胞およびＴ細胞特異性、二段階活性化
を介してのみの有効性（これはそのような一つのＢＡｂ
はＴ細胞活性化および腫瘍細胞溶解にそれぞれ影響しな
いことを意味する）である。

【０００８】したがって本発明の目的は、腫瘍細胞の溶
解に有用な二特異性分子であり、これは腫瘍細胞のエピ
トープと結合する第一結合部位およびＣＤ２抗原のエピ
トープと結合する第二結合部位からなり、ＢＡｂ＜Ｘ、
ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞ＹまたはＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ２．
Ｍ２＞Ｙで表される。但し、ＢＡｂは二特異性抗体を意
味し、Ｘは腫瘍抗原を認識する抗体決定基であり、ＡＩ
ＣＤ２．Ｍ１、ＡＩＣＤ２．Ｍ２はＣＤ２抗原を認識す
る新規のモノクローナル抗体であり、そしてＹは全抗体
の一部分である。

【０００９】ＡＩＣＤ２．Ｍ１およびＡＩＣＤ２．Ｍ２
は新規のモノクローナル抗体であり、これは遺伝子工学
的に作出されたＣＤ２抗原でマウスを免疫して、適当な
マウスハイブリドーマ細胞から抗体を分離して精製する
ことによって得られ（詳細は実施例を参照されたい）、
Ｔ細胞およびＮＫ細胞のＣＤ２抗原に高い特異性を示
す。

【００１０】本発明の目的は、したがって、ＡＩＣＤ
２．Ｍ１と称するモノクローナル抗体であって、これは
ＣＤ２抗原を認識し、ＤＳＭＡＣＣ２１１８のアクセ
ス番号の下に寄託されている細胞系１Ｈ１０からの単離
によって得ることができる。

【００１１】本発明の目的はまた、ＡＩＣＤ２．Ｍ２と
称するモノクローナル抗体であって、これはＣＤ２抗原
を認識し、ＤＳＭＡＣＣ２１１９のアクセス番号の下
に寄託されている細胞系７Ｄ３からの単離によって得る
ことができる。

【００１２】該抗体を産生する新規の細胞系は、ブダペ
スト条約に従って「ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎ
ｇｆｕｅｒＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ」（Ｄ
ＳＭ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ＦＲＧ）に１９９３
年２月２３日に寄託された。

【００１３】本発明はまた、ＡＩＣＤ２．Ｍ１およびＡ
ＩＣＤ２．Ｍ２の天然または人工的な変種または突然変
異体であって、遺伝子的に修飾または操作されたモノク
ローナル抗体に関し、好ましくはヒト遺伝子と結合させ
たものおよびキメラ型が含まれる。

【００１４】本発明による二特異性分子は、ＡＩＣＤ
２．Ｍ１またはＡＩＣＤ２．Ｍ２の結合肢および、任意
の腫瘍抗原を認識する抗体の別の結合肢からなる。抗腫
瘍抗原の選択は、二特異性抗体のＴ細胞活性化および腫
瘍細胞溶解に関する有効性には重要な影響を及ぼさな
い。本発明の好ましい実施態様において、該第二結合肢
はモノクローナル抗腫瘍抗体ＭＡｂ４２５、ＭＡｂ３６
１またはＭＡｂ１５の結合肢に代表されるが、本発明に
よれば、修飾された、好ましくはヒト化されたものまた
はキメラ型および遺伝子操作による最小フラグメントが
含まれる。

【００１５】本発明の目的は、したがって、上記および
請求の範囲に定義された二特異性抗体フラグメントを提
供することにあり、ここでＸはモノクローナル抗体ＭＡ
ｂ４２５、ＭＡｂ３６１またはＭＡｂ１５に由来する抗
体決定基である。

【００１６】ＭＡｂ４２５は、広く公知のヒトＡ４３１
癌腫細胞系（ＡＴＣＣＣＲＬ１５５５）に対して作出さ
れたネズミモノクローナル抗体であって、ヒトＥＧＦ−
Ｒの外側ドメインのポリペプチドエピトープと結合し
て、ＥＧＦの結合を阻害する。ＭＡｂ４２５（ＡＴＣＣ
ＨＢ９６２９）は、インビトロで腫瘍細菌毒性を媒介し
て、類表皮腫および結腸直腸癌腫由来の細胞系の腫瘍細
胞増殖をインビトロで抑制することが見出だされた（Ｒ
ｏｄｅｃｋら、１９８７、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４
７、３６９２）。ＭＡｂ４２５のヒト化およびキメラ型
はＷＯ９２／１５６８３に開示された。

【００１７】ＭＡｂ３６１は、ＩｇＧ２ａネズミモノク
ローナル抗体（ＡＴＣＣＨＢ９３２５）であって、ガン
グリオシドＧＤ２抗原およびＧＤ３抗原に特異的に結合
する。これらガングリオシドは黒色腫に富んでいる（Ｅ
Ｐ０２８０２０９、ＵＳＳＮ０１６９０２）。

【００１８】ＭＡｂ３６１は、ＧＤ２抗原を発現する腫
瘍細胞に対してインビトロで有意なレベルの細胞毒性を
示す（Ｔｈｕｒｉｎら、１９８７、ＣａｎｃｅｒＲｅ
ｓ．４７、１２２９）。

【００１９】ＭＡｂ１５は、ヒト小細胞肺癌細胞ＴＫＢ
−２による免疫で生じたＩｇＧ１ネズミモノクローナル
抗体である（Ｅｎｄｏら、１９８６、ＣａｎｃｅｒＲ
ｅｓ．４６、６３６９）。抗体は早期分化抗原を認識す
る。

【００２０】本発明による二特異性抗体は、全抗体のフ
ラグメントであり、例えば、Ｆ（ａｂ′）２分子または
ミニ抗体（Ｆｖ分子）、好ましくはＦ（ａｂ′）２分子
である。全抗体と対照的に、Ｆ（ａｂ′）２およびミニ
抗体のようなフラグメントは、固体腫瘍の腫瘍実質によ
り容易に浸入して、細胞毒性および腫瘍内部での細胞溶
解力を発揮することができる。さらに、ネズミ起源に由
来するＦ（ａｂ′）２分子およびミニ抗体は通常、低減
したヒト抗マウス抗体応答（ＨＡＭＡ）を示す。

【００２１】したがって本発明の好ましい目的は上記に
定義した二特異性抗体フラグメントを提供することであ
って、ここでＹはＦ（ａｂ′）２分子である。とくに好
ましい実施態様は以下の群から選択される。

【００２２】ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）２ＢＡｂ＜３６１、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２ＢＡｂ＜３６１、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）２ＢＡｂ＜１５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２ＢＡｂ＜１５、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）２完全な抗体またはフラグメントを基にして二特異性抗体
を産生する種々の方法が記述された（例えば、Ｂｒｉｓ
ｓｉｎｃｋら、１９９２、ＤｒｕｇｓｏｆｔｈｅＦ
ｕｔｕｒｅ１７（１１）、１００３の総説を参照され
たい）。二特異性抗体フラグメントを構築する一つの方
法としては、全抗体をタンパク質分解によって（一特異
性）Ｆ（ａｂ′）２分子に変換して、これらフラグメン
トをＦａｂ′分子に分割して、異なる特異性を有するＦ
ａｂ′分子を組み替えて二特異性Ｆ（ａｂ′）２分子に
する方法がある（例えば、ＥＰ０１７９８７２Ｂ１を参
照されたい）。

【００２３】このように、本発明の目的は腫瘍細胞のエ
ピトープへの第一結合部位およびＣＤ２抗原のエピトー
プへの第二結合部位からなる腫瘍細胞の溶解に有用な二
特異性抗体Ｆ（ａｂ′）２フラグメントの調製法を提供
することであって、これは各二つの同一のＬ（軽鎖）−
Ｈ（重鎖）半分子からなっていて一つまたはそれ以上の
ジスルフィド結合によって連結されている二つの異なる
モノクローナル抗体を酵素的変換によって二つのＦ（ａ
ｂ′）２分子にすること、各Ｆ（ａｂ′）２分子を還元
条件下でＦａｂ′チオールへ分割すること、各抗体のこ
れらＦａｂ′分子の一つをチオール活性化剤を用いて誘
導体化することおよび、所望の二特異性抗体Ｆ（ａ
ｂ′）２フラグメントを得るために腫瘍特異性を有する
活性化Ｆａｂ′分子を白血球特異性を有する非活性化Ｆ
ａｂ′分子と（または逆にして）組み合わせることによ
って行うが、これはモノクローナル抗体ＡＩＣＤ２．Ｍ
１およびＡＩＣＤ２．Ｍ２を白血球抗原を認識する抗体
として使用することを特徴とする。

【００２４】抗体をそのＦ（ａｂ′）２分子に変換する
ために適する酵素としては、ペプシンおよびパパインが
用いられる。場合によってはトリプシンまたはブロメリ
ンが適している。しかし、ペプシンが本発明の工程では
好ましく用いられる。ジスルフィド結合の遊離のＳＨ−
基（Ｆａｂ′分子）への変換は、ジチオトレイトール
（ＤＴＴ）、メルカプトエタノールおよびメルカプトエ
チルアミンなどの還元試薬によって行うことができる。
チオール半分子の再結合を防ぐ本発明によるチオール活
性化剤は、５、５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香
酸）（ＤＴＮＢ）、二硫化２、２′−ジピリジン、二硫
化４、４−ジピリジンまたはテトラチオナート／亜硫酸
ナトリウム（Ｒａｓｏら、１９８２、ＣａｎｃｅｒＲ
ｅｓ．４２、４５７およびその引用文献もまた参照され
たい）である。好ましくはＤＴＮＢが本発明による工程
に用いられる。

【００２５】チオール活性化剤を用いる処理は、二つの
Ｆａｂ′フラグメントの一つとのみ行われる。原則的に
は、二つのＦａｂ′のうちのどちらを活性化Ｆａｂ′フ
ラグメント（例えばＦａｂ′ＴＮＢ）に変換しても違い
はない。しかし、一般に、より不安定なＦａｂ′フラグ
メントがチオール活性化剤で修飾される。本発明の場
合、抗腫瘍特異性を有するフラグメントの方がわずかに
より不安定であり、したがって、好ましくはこの工程に
用いられる。二価Ｆ（ａｂ′）２抗体を作出するための
第二Ｆａｂ′分子の遊離ヒンジ−ＳＨ基と活性化Ｆａ
ｂ′誘導体との抱合は、０〜３０℃の温度で自然に起き
る。精製Ｆ（ａｂ′）２抗体の収率は２０〜４０％（全
抗体から出発して）である。

【００２６】上記したように、本発明はまた、二特異性
ミニ抗体を含む。ミニ抗体は二つの一本鎖Ｆｖフラグメ
ント（ｓｃＦｖフラグメントが通常遺伝的にＶ_H−リン
カー−Ｖ_LまたはＶ_L−リンカー−Ｖ_Hとして結合されて
いる）からなる抗体フラグメントであって、これらは自
己凝集によってまたはＣ末端でヒンジ領域と互いに融合
することによって結合されており、（適宜）可変性を提
供するか、そして／または両親媒性ヘリックスを提供し
て二量体形成をする。ヘリックスは、四ヘリックス団デ
ザインまたはロイシンジッパーから得られる（例えば、
ＰａｃｋおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、１９９２、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．３１、１５７９）。上記に定義されたミニ
抗体の調製は、例えばＷＯ９３−０００８２に開示され
ている。

【００２７】本発明による二特異性抗体フラグメント
を、次のような性質に関してインビトロ／エックスビボ
で試験した。すなわち、特異的腫瘍細胞およびＴ細胞へ
の結合能、免疫修飾（Ｔ細胞増殖）および細胞毒性（腫
瘍細胞溶解）である。試験は標準的文献に記載の方法に
よる。詳細および結果は実施例に示す。

【００２８】本発明による二特異性抗体フラグメント
は、ヒト患者に治療のために投与することができる。し
たがって、本発明の目的はまた、活性成分として上記お
よび請求の範囲に定義した二特異性抗体フラグメントの
少なくとも一つを、一つまたはそれ以上の薬物学的に容
認し得る担体、賦形剤または希釈剤と組み合わせて含ん
でなる薬剤調製物を提供することである。

【００２９】多くの場合、本発明の抗体フラグメントは
静脈注射によって非経口的に投与される。一般に、二特
異性抗体フラグメントは所望の腫瘍抑制および腫瘍溶解
効果を生じるのに十分な範囲の用量で投与される。投与
量は、年齢、健康状態、性別および患者の病気の程度に
よって異なるが、０．１ｍｇ／ｋｇから２００ｍｇ／ｋ
ｇの範囲まで変化することができる。１日に１回または
それ以上の投与で０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋ
ｇ／投与で１日または数日の投与が好ましい。

【００３０】非経口投与の調製物には、滅菌水溶液また
は非水溶液、懸濁液およびエマルジョンが含まれる。非
水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエ
チレングリコール、オリーブ油などの植物油およびオレ
イン酸エチルなどの注射可能な有機エステルおよびこれ
らの目的に適した当業者に公知の他の溶媒があげられ
る。本発明の二特異性抗体は、生理学的に容認し得る担
体からなる組成物中に用いることができる。そのような
適当な担体の例としては、生理的食塩水、ＰＢＳ、リン
ゲル液または乳酸塩化リンゲル液などがある。また、保
存剤および抗生物質、抗酸化剤およびキレート剤などの
他の添加剤を薬剤調製物に含ませてもよい。二特異性抗
体フラグメントはまた、それらの細胞毒性を維持するた
めにＩＬ−２などのサイトカインを公知の方法によって
抱合させることができる。

【００３１】本発明の薬剤調製物は、黒色腫、神経膠
腫、癌腫それに循環系の腫瘍および固体腫瘍などのあら
ゆる種類の腫瘍の治療に適している。好ましい調製物
は、一つの結合肢がモノクローナル抗体ＭＡｂ４２５、
ＭＡｂ３６１およびＭＡｂ１５の結合部位を有する二特
異性抗体フラグメントからなる。

【００３２】本発明は、二つの異なる抗体または二特異
性抗体フラグメントをそれぞれ投与することによるきわ
めて効果的な白血球の二段階活性化を開示する。

【００３３】したがって、本発明の目的はまた、二特異
性抗体フラグメントＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｙ
からなる上記または請求の範囲に定義した第一薬剤調製
物（Ｉ）および、ＭＡｂＡＩＣＤ２．Ｍ１またはＭＡ
ｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞ＹまたはＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ
２．Ｍ１＞Ｙからなる第二の別の薬剤調製物（ＩＩ）
［ここでＸおよびＹは既記の意味を有する］からなる薬
剤組成物キット（Ａ）を提供することである。この薬剤
組成物キットにおいて、調製物（Ｉ）はＭＡｂＡＩＣＤ
２．Ｍ２上に、調製物（ＩＩ）はＭＡｂＡＩＣＤ２．Ｍ
１上に見出だされる。

【００３４】あるいはまた、本発明は、調製物（Ｉ）が
ＭＡｂＡＩＣＤ２．Ｍ１に基づき、調製物（ＩＩ）が
ＭＡｂＡＩＣＤ２．Ｍ２に見出だされる組成物キット
（Ｂ）に関する。このように、本発明のさらなる目的
は、二特異性抗体フラグメントＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ
２．Ｍ１＞Ｙからなる第一薬剤調製物（Ｉ）および、Ｍ
ＡｂＡＩＣＤ２．Ｍ２またはＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ
２＞ＹまたはＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｙからな
る第二の別の薬剤調製物（ＩＩ）［ここでＸおよびＹは
既記の意味を有する］からなる薬剤組成物キットを提供
することである。

【００３５】組成物（Ａ）と（Ｂ）との間の違いは、通
常あまり重要ではない。ＭＡｂ４２５の場合は、調製物
（Ｉ）がＭＡｂＡＩＣＤ２．Ｍ１に基づく組成物
（Ｂ）の方がより有効であることが認められた。

【００３６】組成物（Ａ）と（Ｂ）との間の腫瘍結合部
位の違いもまた、あまり重要ではない。しかし、本発明
による薬剤組成物キットの結合能、免疫修飾（白血球増
殖）および細胞毒性に関する有効性は、抗体ＡＩＣＤ
２．Ｍ１およびＡＩＣＤ２．Ｍ２に由来する二特異性抗
体フラグメントの結合部位の影響に依存する。本発明の
好ましい実施態様では同様の性質を示す。

【００３７】調製物（ＩＩ）（あるいはまた、全抗体、
一特異性抗体フラグメントまたはＢＡｂ）に関しての治
療効果の違いはまた、著しく大きくはない。しかし、適
当な一特異性抗体フラグメントからなる調製物（ＩＩ）
が好ましい。

【００３８】薬剤組成物キットは次のようにして用いら
れる。医療処理は本発明による薬剤組成物キットの一つ
である調製物（Ｉ）を患者に注射することによって開始
される。二特異性抗体はその特異性によって腫瘍の表面
のみに結合するのではなく、その小サイズの故に固体腫
瘍塊に浸入する。本発明による二特異性抗体フラグメン
トの投与によって、注射された免疫グロブリンが腫瘍の
局部領域において富化されるが、有意な免疫応答を引き
起こすまでには到らない。数時間から数日のそれぞれの
期間（病気の程度、腫瘍の種類、健康状態、患者の性別
および年齢などによって異なる）の後に、調製物（Ｉ
Ｉ）を投与する。免疫学的応答がだちに誘導される。調
製物（Ｉ）および（ＩＩ）は好ましくは等モル量が投与
される。エックスビボ実験によって、通常は腫瘍に対し
て有意な細胞毒性（細胞溶解）を誘導することができな
い同原および同種の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を該処
理によって高度に活性化することができる（図６ａ、
ｂ，７）。

【００３９】本発明の薬剤組成物キットを使用すること
によって、エックスビボ腫瘍細胞を骨髄調製物中で一掃
することが可能である。細胞毒性効果を強めるために、
外来性Ｔリンパ球を加えることも可能である。

【００４０】したがって、最後に、本発明の目的はま
た、同原骨髄移植において上記および請求の範囲に定義
した薬剤組成物キットを用いて、適宜追加のＴリンパ球
の存在下で、エックスビボで腫瘍細胞を洗浄する方法を
提供することであって、これは最初に細胞を調製物
（Ｉ）で処理して、その後で調製物（ＩＩ）で処理し
て、適宜従来の精製工程を続けて行う。エックスビボの
骨髄洗浄の手法は当業者に自体公知である。

【００４１】

【図面の説明】

［図１］ＢＡｂの合成を示した模式図である。［図２］抗体フラグメントおよびＢＡｂのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥを示した説明図である。

【００４２】１：分子量マーカー２：ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２（ＤＴ
Ｔによる還元前）３：ＭＡｂ＜４２５＞Ｆ（ａｂ′）２（ＤＴＴによる還
元前）４：ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２（ＤＴ
Ｔによる還元およびＤＴＮＢによる誘導体化後）５：ＭＡｂ＜４２５＞Ｆ（ａｂ′）２（ＤＴＴによる還
元およびＤＴＮＢによる誘導体化後）６：ＢＡｂ（精製前）７：ＢＡｂ（精製後）［図３］ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａ
ｂ′）２のヒドロキシアパタイト上のクロマトグラフィ
ー溶出図である。

【００４３】左縦軸：吸光度ＯＤ（２８０ｎｍ）、右縦
軸：燐酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．０）濃度、横軸：溶出時
間（分）。二特異性抗体フラグメントはピークＩＩで示
される。ピークＩおよびＩＩＩは少量不純物である。［図４］ＢＡｂ／ＭＡｂのＥＧＦ−Ｒへの競合的結合を
示す説明図である。

【００４４】縦軸：％吸光度（４９０ｎｍ）、横軸：抗
体フラグメント濃度（ｍｏｌ／リットル、対数目盛
り）。ビオチン標識ＭＡｂ４２５を非標識ＭＡｂ＜４２
５＞Ｆ（ａｂ′）２またはＢＡｂとのＥＧＦ−Ｒへの結
合に対する競合に用いた。

【００４５】● ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞
Ｆ（ａｂ′）２ ▽ ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）
２ □ ＭＡｂ＜４２５＞Ｆ（ａｂ′）２［図５］ヒト末梢血白血球（ＰＢＬ）の増殖を示す説
明図である。

【００４６】縦軸：³Ｈ−チミジンの％取り込み量、横
軸：抗体フラグメント濃度（μｇ／ｍｌ）。

【００４７】● ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞
Ｆ（ａｂ′）２＋ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａ
ｂ′）２ ▽ ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）
２＋ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２ ★ ＢＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）２ □ ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２・ＭＡｂ＜４２５＞Ｆ（ａｂ′）２［図６］ａは、ＢＡｂ誘導腫瘍溶解（エフェクター細胞
としての同種ＴＩＬを使用）を説明するグラフ図であ
る。

【００４８】縦軸：％細胞毒性、横軸：１＝ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａ
ｂ′）２＋ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）２２＝ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２３＝ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）２４＝ＭＡｂ＜４２５＞Ｆ（ａｂ′）２ｂは、ＢＡｂ誘導腫瘍溶解（エフェクター細胞としての
同原ＴＩＬを使用）を説明するグラフ図である。

【００４９】縦軸：％細胞毒性、横軸：１＝ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａ
ｂ′）２＋ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）２２＝ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）
２＋ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２３＝ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２４＝ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）２５＝ＭＡｂ＜４２５＞Ｆ（ａｂ′）２棒グラフの上の線：平均偏差［図７］ＢＡｂ媒介Ｔ細胞標的攻撃および腫瘍細胞溶解
を示す写真図である。

【００５０】図７ＡおよびＢは４０／１のエフェクター
／標的比における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）と同原悪
性細胞の培養物を示す。共培養はＢＡｂ＜４２５、ＡＩ
ＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２＋ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．
Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）２を含まない（図７Ａ、対照）およ
び含む（各２０μｇ／ｍｌ、図７Ｂ）状態で４時間イン
キュベートして行った。ＣＤ２ＢＡｂの存在下で、多数
のＴリンパ球が同原腫瘍細胞に付着して密集し、続いて
黒色腫細胞を傷害する。図７Ｂの矢印はＴＩＬの破壊さ
れた黒色腫との抱合を示す。ＴＩＬと黒色腫細胞との共
培養は、１０％ＦＣＳを含む培養培地中で２４ウェルプ
レート中で行った。顕微鏡写真は逆転顕微鏡（改変位相
差、オリジナルの倍率１００）を用いて行った。

【００５１】

【実施例】以下の実施例によって本発明を詳細に説明す
る。［実施例１］ＭＡｂＡＩＣＤ２．Ｍ１およびＡＩＣＤ２．Ｍ２の調
製：Ｂａｌｂ／Ｃマウスを遺伝子工学的に作出したＣＤ
２によって２週間のうちに４回免疫した。ヒトＣＤ２の
ＤＮＡ配列およびそのクローニングは、Ｓａｙｒｅら
（１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ
８４、２９４１）によって記述されている。ＣＤ２遺伝
子発現は文献（Ｆｒａｓｅｒ１９９２、Ｃｕｒｒｅｎ
ｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１５８、１３１およびその引用文献）によっ
て公知の方法によってバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏ
ｖｉｒｕｓ）系において行った。

【００５２】免疫したマウスの脾臓細胞を分離して、黒
色腫細胞系（Ａｇ８．６５３、ＡＴＣＣＣＲＬ１５８
０）と融合させた。ヒトＴリンパ球（ＣＤ２陽性）上で
増殖しているハイブリドーマの上清を蛍光活性化細胞選
別器（ＦＡＣＳ）を用いて試験することによって、ハイ
ブリドーマを特異的モノクローナル抗体産生についてス
クリーニングした。陽性ハイブリドーマを「限定希釈ク
ローニング」の方法によって回収した。選択されたハイ
ブリドーマの上清を免疫沈降反応およびウエスタンブロ
ット分析によって調べた。選択されたモノクローナル抗
体の単離は、Ｅｙら（１９７８、ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ１５、４２９）による培養上清物の精製に
よって行った。

【００５３】抗体に対するＣＤ２抗原の機能的分析は、
増殖試験（³Ｈ−チミジンの取り込み）によって行っ
た。ＣＤ２抗原と反応する一連のモノクローナル抗体か
ら選択された二つの抗体はＴ細胞の増殖を強く誘導し
た。これらモノクローナル抗体はＡＩＣＤ２．Ｍ１およ
びＡＩＣＤ２．Ｍ２と命名して、ＤｅｕｔｓｃｈｅＳ
ａｍｍｌｕｎｇｆｕｅｒＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｅｎに寄託した。

【００５４】用いた方法はすべて標準法によって行っ
た。その多くは、例えば「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」（Ｈａｒｌｏｗ
およびＬａｎｅ、１９８８、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ）およびその引用文献）に開示されてい
る。［実施例２］ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２の
合成合成は、１０ｍｇの抗体ＡＩＣＤ２．Ｍ１および１０ｍ
ｇの抗体ＭＡｂ４２５から出発した。用いられる抗体は
クエン酸緩衝液（３ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ５．５）中で
前活性化パパイン処理（１０ｍｇ／ｍｌ）した。タンパ
ク質分解の後、Ｆ（ａｂ′）２をタンパク質Ａセファロ
ースカラムの溶出液から回収した。Ｆ（ａｂ′）２の回
収率は通常ほぼ１００％である。０．５ｍＭＤＴＴを
用いて３０℃で４０分間処理することによって両Ｆ（ａ
ｂ′）２フラグメントをそれぞれＦａｂ′フラグメント
に変換した。還元工程後、ゲル濾過（スパーデックス
（登録商標）２００）を介して過剰のＤＴＴを除去して
Ｆａｂ′を回収した。工程の進行中に、ＭＡｂ４２５フ
ラグメントを０．５ｍＭエルマン試薬（５、５−ジチオ
ール−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ））を
用いて４℃で６０分間処理することによってＦａｂ′−
ＴＮＢ誘導体が生じた。過剰のＤＴＮＢをゲル濾過によ
って除去した。６ｍｇのそれぞれの抱合相手（Ｆａｂ′
−ＡＩＣＤ２．Ｍ１およびＦａｂ′−ＴＮＢＭＡｂ４
２５）を抱合相手混合物を４℃で１８時間攪拌すること
によって最終抱合工程に用いた。二特異性抗体を反応混
合物からゲル濾過クロマトグラフィー（スーパーデック
ス（登録商標）２００）によって回収した。合成Ｆ（ａ
ｂ′）２調製物の収量は３〜４ｍｇ（約３０％）であっ
た。ＢＡｂ合成のための一連の操作概要を図１に示し
た。［実施例３］ＢＡｂ＜３６１、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２の
合成実施例２と同様にして、二特異性抗体をＭＡｂＡＩＣ
Ｄ２．Ｍ１およびＭＡｂ３６１から出発して調製した。
ＢＡｂの収率は約３４％であった。［実施例４］ＢＡｂ＜１５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２の合
成実施例２と同様にして、二特異性抗体をＭＡｂＡＩＣ
Ｄ２．Ｍ１およびＭＡｂ１５から出発して調製した。Ｂ
Ａｂの収率は約２３％であった。［実施例５］ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）２の
合成実施例２と同様にして、二特異性抗体をＭＡｂＡＩＣ
Ｄ２．Ｍ２およびＭＡｂ４２５から出発して調製した。
ＢＡｂの収率は約３０％であった。［実施例６］ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞（ｓｃＦｖ）２の
合成ＡＩＣＤ２．Ｍ１およびＭＡｂ４２５のＶ_LおよびＶ_Hド
メインからなる二つの一本鎖タンパク質を分子工学的手
法（Ｗｉｎｔｅｒら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ３４９、
２９３〜２９９）によって調製した。発現プラスミドは
ｐＨＥＮ１（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄＲｅｓ．１９、４１３３〜４１３７）に由
来するものであって、これは抗−ＥＧＦ−Ｒネズミハイ
ブリドーマ（ＭＡｂ４２５）または抗−ＣＤ２ネズミハ
イブリドーマ（ＡＩＣＤ２．Ｍ１）のいずれかに由来す
るＶ_LおよびＶ_Hドメインの構造遺伝子を含む。ＰｅｌＢ
リーダー配列を大腸菌中におけるペリプラズム分泌の媒
介に用いた。ｓｃＦｖをアフィニティークロマトグラフ
ィーによって精製して、二特異性ｓｃＦｖの構築に用い
た。ＥＧＦ−ＲとＣＤ２−特異性ｓｃＦｖの化学的交差
を試薬２−イミノチオランおよびヘテロ二官能基クロス
リンカーＳＰＤＰを用いて行った。１０ｍｇのＭＡｂ＜
４２５＞ｓｃＦｖから出発して、本発明者はＳＰＤＰを
介してｓｃＦｖ分子当たり１分子の２−ピリジルジスル
フィドの統計的取り込み量に近づいた。誘導体の精製を
ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて行った。反応性−
ＳＨ基のＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞ｓｃＦｖへの導入
は１０ｍｇのｓｃＦｖの２−イミノチオランを用いる誘
導体化によって達成された。誘導体の精製をゲル濾過ク
ロマトグラフィーによって行った。等モル量の２−ピリ
ジルジスルフィド活性化ＭＡｂ＜４２５＞ｓｃＦｖおよ
び２−イミノチオラン修飾ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞
ｓｃＦｖを中性ｐＨで一緒にカップリングさせた。カッ
プリング反応をピリジン２−チオンの放出をモニターす
ることによって追跡した。最終二特異性産生物をゲル濾
過クロマトグラフィーで回収して、約５％の収量を得
た。［実施例７］二特異性抗体の特徴づけＢＡｂ合成の各工程を、通常の公知の手法に従ってＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによってモニターした。化学合成の中間体
および最終二特異性産生物を図２に示す。ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析に加えて、ＢＡｂの純度および均質性をヒドロ
キシアパタイトカラム上のクロマトグラフィーによって
評価した。ＢＡｂの溶出を燐酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．
０、０〜０．３モル／リットル）の勾配によって行っ
た。図３は、ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ
（ａｂ′）２のクロマトグラフ溶出図を示す。ＢＡｂは
主要ピークＩＩによって表され、小ピークＩおよびＩＩ
Ｉは少量の混入物である。［実施例８］ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２の
ＥＧＦ−Ｒへの結合特性二特異性抗体の結合特性を競合的ＥＬＩＳＡ分析によっ
て比較した。すなわち、ビオチン標識したＭＡｂ４２５
を非標識抗体またはＢＡｂとのＥＧＦ−Ｒへの結合を競
合させるために用いた。ＥＧＲ−ＲをＡ４３１細胞（Ａ
ＴＣＣＣＲＬ１５５５）から公知の方法によって単離し
た。Ａ４３１細胞はＣＤ２陰性である。検出をＰＯＤ−
抱合ストレプトアビジンおよび基質とインキュベートし
た後に行った。データから阻害曲線を作図した（図
４）。右にシフトした両ＢＡｂの阻害曲線は、二価から
一価の結合に変化したための親和性の欠失を示す。［実施例９］ＢＡｂ＜ＭＡｂ４２５、ＭＡｂＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ
（ａｂ′）２のＥＧＦ−Ｒへの結合特性実施例８と同様にして、二特異性抗体の結合特性を調べ
た（図４）。両ＢＡｂはそれらの抗原標識に対して同じ
親和性を示した。［実施例１０］二特異性および一特異性抗体フラグメントのＣＤ２抗原
への結合特性ジャーカット細胞（ヒト急性Ｔ細胞白血病、ＣＤ２、Ｃ
Ｄ３陽性、ＥＧＦ−Ｒ陰性、ＡＴＣＣＴＩＢ１５２、１
×１０⁶細胞／サンプル）を二特異性／一特異性抗体フ
ラグメントの対数希釈液とともに４℃で１５分間インキ
ュベートした。次いで、細胞を洗浄して、第二段階抗血
清としてのヤギ−抗マウス−κ−ＦＩＴＣとともにイン
キュベートした。細胞を再び洗浄して、免疫蛍光をファ
クスター・プラス（ＦＡＣＳｔａｒｐｌｕｓ、登録商
標）を用いて分析した。単レーザー励起およびリストモ
ードデータ取得をを用いるファクスター・プラスを生細
胞の抗体染色を分析するために使用した。全細胞群の特
異的蛍光強度および抗体反応性細胞の割合を決定した。
第二段階抗血清で染色した細胞の蛍光分布は陰性対照と
してのみ用いられる。

【００５５】ジャーカット細胞上の異なる二特異性／一
特異性抗体フラグメントの結合強度の測定値として、半
飽和濃度を以下に表示する。半飽和濃度値は、滴定曲線
（蛍光強度（直線）対抗体濃度）から読みとられるが、
おおまかな推定値が得られる。抗体フラグメント半飽和濃度ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２.Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２３×１０⁸ ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２.Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２＞１×１０⁷（非飽和）ＢＡｂ＜３６１、ＡＩＣＤ２.Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２１×１０⁷（非飽和）ＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２.Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）２２×１０⁸ ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２.Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）２＞１×１０⁷（非飽和）ＢＡｂ＜１５、ＡＩＣＤ２.Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）２１×１０⁷（非飽和）ＭＡｂ＜４２５＞Ｆ（ａｂ′）２陰性［実施例１１］白血球の精製末梢血単核白血球をＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）およびＩ
Ｌ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）を添加した培地（ＲＰＭＩ
１６４０）中で放射線照射（３０Ｇｙ）した同原腫瘍細
胞とともに共培養した。応答細胞を同原腫瘍細胞を用い
て毎週再刺激した。

【００５６】健康な供血者または黒色腫患者から新鮮に
調製したヒト末梢血白血球（ｈｕＰＢＬ）を９６ウェル
平底マイクロタイタープレート中で２００μｌの最終容
量で１×１０⁵細胞／ウェルの濃度で培養した。細胞を
一特異性または一特異性＋二特異性抗体フラグメントと
指示濃度でインキュベートした。７２時間後、細胞を
０．５μＣｉ³Ｈ−チミジンと混合し、一晩インキュベ
ートして、回収した。³Ｈ−チミジンの取り込みを液体
シンチレーションβプレート計数によって測定して、結
果を平均ｃｐｍで表した。ＭＡｂ４２５に由来する抗体
フラグメントの結果の詳細を図５に見ることができる。
同様の結果がＭＡｂ３６１およびＭＡｂ１５に由来する
抗体フラグメントを用いても得られた。抗体フラグメン
トを組み合わせて投与する場合、それぞれの場合におい
て増殖を有意に誘導する。［実施例１２］ＢＡｂ誘導腫瘍溶解高度に浸入性で自然転移性でＥＧＦ−Ｒ陽性のヒト黒色
腫細胞系の細胞系Ｃ８１６１（Ｗｅｌｃｈら、１９９
１、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４７、２２７およびそ
の引用文献）を、同種および同原腫瘍浸潤Ｔリンパ球
（ＴＩＬ）によるＥＧＦ−Ｒ依存性標的攻撃の標的とし
て用いた。他のＥＧＦ−Ｒ陽性ヒト黒色腫細胞系を用い
ることもできる。ＴＩＬ大量培養は黒色腫標本から確立
された。腫瘍細胞およびＴＩＬの培養条件は既述されて
いる（例えば、Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９９１、Ｃａｎｃ
ｅｒＲｅｓ．５１、６１５３）。

【００５７】安定なＣＴＬクローンの産生をＭＬＴＣ応
答細胞を用いて限定希釈条件下で行った。ＭＴＬＣ応答
Ｔ細胞を１ウェル当たり１細胞の割合でＩＬ−２および
ＩＬ−４添加培地中に支持細胞としての同原刺激細胞お
よび同原ＥＢＶ−変換Ｂ細胞とともに９６ウェルプレー
ト中に接種した。コロニーを同原腫瘍細胞および支持細
胞で毎週再刺激した。

【００５８】新鮮腫瘍生検片からのＴリンパ球を固定化
抗ＣＤ３抗体で活性化して、ＩＬ−２およびＩＬ−４を
添加したＲＰＭＩ中で増殖展開させた。

【００５９】インビトロ細胞毒性分析を⁵¹Ｃｒ−標識腫
瘍細胞を用いて行った。標的細胞を ⁵¹Ｃｒ（１００ｍＣ
ｉ／１０⁷細胞）を用いて約１時間標識して、３回洗浄
した。定常数の標識細胞（２×１０³／ウェル）を、一
特異性または二特異性抗体または両者の組み合わせおよ
びエフェクターＴＩＬ（エフェクター／標識比：７／
１）とともにインキュベートした。ＣＴＬを１００μｌ
の培地中で９６ウェルマイクロタイター中で連続希釈
（各三組）した。標識細胞を加えた後、プレートを１０
％ＣＯ₂中で３７℃で４時間インキュベートした。分析
を遠心分離によって終結させた。上清を集めて、放射性
活性をガイガーカウンターによって測定した。特異性⁵¹
Ｃｒ放出率（％）を次式によって算出した。特異性⁵¹Ｃｒ放出（％)＝１００（実験放出−自然放出)
／(最大放出−自然放出）ＭＡｂ４２５に由来する抗体フラグメントに関する結果
の詳細は、図６ａ、６ｂおよび図７に見ることができ
る。同様の結果が、ＭＡｂ３６１およびＭＡｂ１５に由
来する抗体フラグメントを用いて得られた。抗体フラグ
メントの組み合わせの投与によって、それぞれの場合で
腫瘍溶解が有意に誘導された。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＢＡｂの合成を示した模式図である。

【図２】抗体フラグメントおよびＢＡｂのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥを示した説明図である。

【図３】ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａ
ｂ′）２のヒドロキシアパタイト上のクロマトグラフィ
ー溶出図である。

【図４】ＢＡｂ／ＭＡｂのＥＧＦ−Ｒへの競合的結合を
示す説明図である。

【図５】ヒト末梢血白血球（ＰＢＬ）の増殖を示す説明
図である。

【図６】ａは、ＢＡｂ誘導腫瘍溶解（エフェクター細胞
としての同種ＴＩＬを使用）を説明するグラフ図であ
る。ｂは、ＢＡｂ誘導腫瘍溶解（エフェクター細胞とし
ての同原ＴＩＬを使用）を説明するグラフ図である。

【図７】ＢＡｂ媒介Ｔ細胞標的攻撃および腫瘍細胞溶解
を示す写真図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 16/46 8318−4ＨＣ１２Ｐ 21/08 9161−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｋ 33/531 Ａ 33/574 Ｄ // Ｃ１２Ｎ 15/09 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ヴォルフガングシュトリットマタードイツ連邦共和国 64293 ダルムシュタットフランクフルターシュトラーセ 250 (72)発明者カルロタ−シルビアイエーグレドイツ連邦共和国 64293 ダルムシュタットフランクフルターシュトラーセ 250 (72)発明者シュテファンモイアードイツ連邦共和国 64293 ダルムシュタットフランクフルターシュトラーセ 250 (72)発明者ブルクハルトシュラーフェンドイツ連邦共和国 64293 ダルムシュタットフランクフルターシュトラーセ 250 (72)発明者マルティンヴィルトドイツ連邦共和国 64293 ダルムシュタットフランクフルターシュトラーセ 250

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】腫瘍細胞の溶解に有用な二特異性分子で
あり、これは腫瘍細胞のエピトープと結合する第一結合
部位およびＣＤ２抗原のエピトープと結合する第二結合
部位からなり、ＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｙまた
はＢＡｂ＜Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｙと表される。但
し、ＢＡｂは二特異性抗体を意味し、Ｘは腫瘍抗原を認識する抗体決定基であり、ＡＩＣＤ２．Ｍ１、ＡＩＣＤ２．Ｍ２はＣＤ２抗原を認
識するモノクローナル抗体であり、そしてＹは全抗体の
一部分である。
【請求項２】Ｘがモノクローナル抗体ＭＡｂ４２５、
ＭＡｂ３６１またはＭＡｂ１５に由来する抗体決定基で
ある請求項１に記載の二特異性抗体フラグメント。
【請求項３】ＹがＦ（ａｂ′）２分子である請求項１
または２に記載の二特異性抗体フラグメント。
【請求項４】次の群から選択される請求項１、２また
は３に記載の二特異性抗体フラグメント。ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２ＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）２ＢＡｂ＜３６１、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２ＢＡｂ＜３６１、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）２ＢＡｂ＜１５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）２ＢＡｂ＜１５、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）２
【請求項５】腫瘍細胞のエピトープとの第一結合部位
および抗原ＣＤ２のエピトープとの第二結合部位からな
る腫瘍細胞の溶解に有用な二特異性抗体Ｆ（ａｂ′）２
フラグメントの調製法であって、これはそれぞれ二つの
同一のＬ（軽鎖）−Ｈ（重鎖）半分子からなり一つまた
はそれ以上のジスルフィド結合によって連結されている
二つの異なるモノクローナル抗体を二つのＦ（ａｂ′）
２分子に酵素的変換すること、それぞれのＦ（ａｂ′）
２分子を還元条件下でＦａｂ′チオールへ分割するこ
と、各抗体のこれらＦａｂ′分子の一つをチオール活性
化剤を用いて誘導体化することおよび、所望の二特異性
抗体Ｆ（ａｂ′）２フラグメントを得るために腫瘍特異
性を有する活性化ａｂ′分子を白血球特異性を有する一
つの非活性化Ｆａｂ′分子と（または逆にして）組み合
わせることによるが、これはモノクローナル抗体ＡＩＣ
Ｄ２．Ｍ１およびＡＩＣＤ２．Ｍ２を白血球抗原を認識
する抗体として使用することを特徴とする。
【請求項６】ＭＡｂ４２５、ＭＡｂ３６１またはＭＡ
ｂ１５を腫瘍細胞抗原を認識する抗体として用いること
を特徴とする請求項５に記載の二特異性抗体フラグメン
トの調製法。
【請求項７】ＤＳＭＡＣＣ２１１８の寄託番号下で
寄託された細胞系１Ｈ１０からの単離によって得られる
抗原ＣＤ２を認識するモノクローナル抗体ＡＩＣＤ２．
Ｍ１。
【請求項８】ＤＳＭＡＣＣ２１１９の寄託番号下で
寄託された細胞系７Ｄ３からの単離によって得られる抗
原ＣＤ２を認識するモノクローナル抗体ＡＩＣＤ２．Ｍ
２。
【請求項９】活性成分としての請求項１〜４のいずれ
か１項に記載の少なくとも一つの二特異性抗体フラグメ
ント、および一つまたはそれ以上の薬物学的に容認し得
る担体、賦形剤または希釈剤を組み合わせてなる薬剤調
製物。
【請求項１０】二特異性抗体フラグメントＢＡｂ＜
Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｙからなる請求項９に記載の第
一薬剤調製物（Ｉ）および、ＭＡｂＡＩＣＤ２．Ｍ１
またはＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞ＹまたはＢＡｂ＜
Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｙからなる第二の別の薬剤調製
物（ＩＩ）［ここでＸおよびＹは既記の意味を有する］
からなる薬剤組成物キット。
【請求項１１】二特異性抗体フラグメントＢＡｂ＜
Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｙからなる請求項９に記載の第
一薬剤調製物（Ｉ）および、ＭＡｂＡＩＣＤ２．Ｍ２
またはＭＡｂ＜ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞ＹまたはＢＡｂ＜
Ｘ、ＡＩＣＤ２．Ｍ２＞Ｙからなる第二の別の薬剤調製
物（ＩＩ）［ここでＸおよびＹは既述の意味を有する］
からなる薬剤組成物キット。
【請求項１２】調製物（Ｉ）が二特異性抗体フラグメ
ントＢＡｂ＜４２５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａｂ′）
２またはＢＡｂ＜３６１、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ（ａ
ｂ′）２またはＢＡｂ＜１５、ＡＩＣＤ２．Ｍ１＞Ｆ
（ａｂ′）２からなり、調製物（ＩＩ）がＭＡｂ＜ＡＩ
ＣＤ２．Ｍ２＞Ｆ（ａｂ′）２からなる請求項１１に記
載の薬剤組成物キット。
【請求項１３】同原骨髄移植において請求項１０また
は１２に記載の薬剤組成物キットを用いて、適宜追加の
Ｔリンパ球の存在下で、エックスビボで腫瘍細胞を洗浄
する方法であって、これは最初に細胞を調製物（Ｉ）で
処理した後で調製物（ＩＩ）で処理して、適宜従来の精
製工程を続けることによって行われる。
【請求項１４】請求項１〜４のいずれか１項に記載の
二特異性抗体フラグメントのヒト腫瘍の治療のための薬
物の調製のための使用。