JPH05502587A

JPH05502587A - Ｃｄｒグラフト抗―ｃｅａ抗体およびその製造方法

Info

Publication number: JPH05502587A
Application number: JP3512027A
Authority: JP
Inventors: アダイアー，ジョン，ロバート; ボドマー，マーク，ウィリアム; マウンテン，アンドリュー; オーウェンズ，レイモンド，ジョン
Original assignee: セルテック　リミテッド
Priority date: 1990-07-05
Filing date: 1991-07-05
Publication date: 1993-05-13
Also published as: KR920702425A; AU8200591A; CA2065325C; EP0491031A1; EP0491031B1; GB2251859A; CA2065325A1; GB2251859B; AU651984B2; GB9014932D0; DE69119211D1; US5877293A; WO1992001059A1; DE69119211T2; GB9204803D0; ATE137534T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＣＤＲグラフト抗−ＣＥＡ抗体およびその製造方法発明の分野本発明は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対して特異的な大化抗体分子（ＨＡＭ）および組換えＤＮＡ技術を用いるその製造方法に関する。

「人化抗体分子Ｊ　（ＨＡＭ）の語は、非ヒト種がらの免疫グロブリンに由来する広原結合部位を有し、分子の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンに由来する分子を意味して使用される。抗原結合部位は、ヒト定常ドメインに融合した完全な可変領域まだは可変ドメインにおける適当なヒトフレームワーク領域上にグラフトされた相補性決定部（Ｉｆｆ　（ＣＤＲ）のみのいずれからなるものであってもよい。ｒＭＡｂＪの略号はモノクローナル抗体を指して使用される。

以下の記述中、刊行物を番号によって引用するが、これらの刊行物は文末に番号順の一覧表とする。

発明の背景天然の免疫グロブリンは、酵素切断で誘導できるＦａｂ、（Ｆａｂ′）　およびＦｃフラグメントのような多様なフラグメントを有するものとして、古くがら知られている。天然の免疫グロブリンは一般に、Ｙ型の分子で、各上腕の外方端に向けて抗原結合部位を有する。構造の残部、とくにＹ構造の幹部分は、免疫グロブリンに伴うエフェクター機能を仲介する。

天然の免疫グロブリンは、検定、診断、そしてもつと限られた範囲ではあるが、治療にも用いられてきた。しかしながら、このような、とくに治療における使用は、天然の免疫グロブリンのポリクローナル牲によって阻まれてきたのである。

免疫グロブリンの治療剤としての可能性の実現に向けての重要な工程は、特定の特異性を有するモノクローナル抗体の製造方法の発見にあっだ（１）。しかしながら、大部分のＭＡｂは、げつ菌類肺臓細胞とげつ歯頚ミエローマ細胞との融合体であるハイブリドーマによって製造されてきた。したがって、得られるＭＡｂは本質的にげつ菌類蛋白質である。ヒトＭＡｂの製造の報告はほとんどない。

大部分の入手可能なＭＡｂはげつ菌類起源であることから、それらは元来ヒトに広原性で、したがって、ＨＡＭＡ　（ヒト抗−マウス抗体）反応と呼ばれる望ましくない免疫応答を生じることがある。すなわち、げつ菌類ＭＡｂのヒトにおける治療剤としての使用には、ＭＡｂに対する免疫応答を増大させ、その有効性の完全に消失または少なくとも減弱を招くという事実による固有の制限が生じる。

しだがって、ヒトに対する抗原性を低下させた非ヒトＭＡｂを作成することの提案がなされできた。このような技術は一般的に「入信」と呼ぶことができる。

これらの技術には一般に、抗体分子のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作する組換えＤＮＡ技術が使用される。

ＭＡｂを入信する初期の方法は、ある抗体の完全な可変ドメインを第二の抗体由来の定常ドメインに融合してなるキメラ抗体の製造に関するものであった。このようなキメラ化操作の実施方法は、ＥＰＯ１２０６９４（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ）、　ＥＰＯ１２５０２３（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ　ｌ　ｎｃ、　）、　ＥＰ−Ａ−０１７１４９６（Ｒｅｓ、　Ｄｅｖ、　Ｃｏｒｏ、　Ｊａｐａｎ）、εＰ−Ａ−０１V３４９４（ＳｔａｎｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ＞およびＥＰ−Ａ−０１９４２７６（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ）に記載があるｏ　Ｃｅ１ｌｔｅｃｈのＥＰ−Ａ−０１９４２７６の出願には、マウスＭＡｂがらの可変ドメインとヒト免疫グロブリンからの定常ドメインを有する抗体分子の製造方法が開示されている。また、マウスＭＡｂの可変ドメイン、ヒト免疫グロブリンのＣＨＩおよびＣＬドメイン、ならびにヒト免疫グロブリンのＦｃ蛋白質の代わりに非ヒト免疫グロブリン誘導蛋白質からなる抗体分子の製造方法も記載されている。

その後、キメラ抗体に関してはさらに多数の特許出願が公にされ、それには腫瘍特異的なキメラ抗体（たとえば、ＷＯ８７１０２６７１，Ｉｎｔ、　Ｇｅｎ、Ｅｎｇ、　Ｉｎｃ、　；　ＥＰＯ２５６６５４゜Ｃｅｎｔｏｃｏｒ；　ＥＰＯ２６６６６３，Ｉｎｔ、　Ｇｅｎ、　Ｅｎｇ、　Ｉｎｃ、　＆　Ｏｎｃｏｇｅｎ；　ＷＯ８９１００９９９，Ｉ獅煤A　Ｇｅｎ、　Ｅｎｇ。

ＩｎｃおよびＥＰＯ３３２４２４，Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、　）も含まれている。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ　（ＥＰＯ１２５０２３）およびＨｙｂｒ　ｉ　ｔｅｃｈ　（ＥＰＯ３３２４２４）の特許出願は、抗−癌胎児性抗原（抗−ＣＥＡ）キメラ抗体に関するものである。

しがしながら、このまうな人生キメラ抗体は、まだがなりの部分の非ヒトアミノ酸配列、すなわち、完全な可変領域ドメインを含有する。そのため、このような大化抗体は、ある種のＨＡＭＡ応答を、とくに長期間にわたって投与された場合に、誘発することがある［Ｂｅｇｅｎｔ　ｅｔ　ａｔ　（２）］。

］ＥＰ−Ａ−ＤＺｊ７Ｆ＃６Ｗｉｎｔｅｒ）に記載されている別のアプローチでは、マウスＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、長いオリゴヌタレオチドを用いる特定部位の突然変異誘発によって、ヒト免疫グロブリンの可変ドメインのフレームワーク領域にグラフトされている。このようなＣＤＲグラフト人化人体抗体、含まれる非ヒトアミノ酸配列の割合が低いことがらみて、人生キメラ抗体よりもＨＡＭＡ応答の誘発は少ないようである。重鎖および軽鎖の可変領域にはそれぞれ３つのＣＤＲ（ＣＤＲＩ、ＣＤＲ２およびＣＯＲ５）がある。

ＣＤＲグラフト人化人体ｂに関する初期の研究は、合成抗原、たとえばＮＰまたはＮＩＰ抗原を認識するＭＡｂについて行われた。しかしながら、最近では、リゾチームを認識するマウスのＭＡｂおよびヒトＴ細胞上の抗原を認識するラットＭＡｂ、それぞれの大体例が、Ｖ６ｒｈｏｅｙｅｎ　ｅｔ　ａｌ　（３）およびＲｉｅｃｈｍａｎ　ｅｔ　ａｌ　（４）によって報告されている。ヒトＴ細胞上の抗原に対するＣＤＲグラフト抗体の製造もまた、Ｗｏ　８９１０７４５２（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｕｎｃｉｔ）にも記載されでいる。さらに最近になって、Ｑｕｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ　（５）は、インターロイキン２受容体に結合する人体ＣＤＲグラフト抗体の製造を報告している。

免疫グロブリン、およびとくにＭＡｂが、癌の診断および処置に極めて有用である可能性は、広範囲に示唆されてきだ（６，７）。したがって、腫瘍特異的抗原に向けられた免疫グロブリンまたはＭＡｂを製造する試みが、極めて活発に行われてきだのである。現在までに、様々なヒト癌に対する百種以上ものＭＡｂが、腫瘍の診断および処置の様々な局面で使用されてきた（８）。

細胞表面抗原を認識するキメラモノクローナル抗体の製造に関して、多数の死文が発表されてきた。たとえば、Ｓａｈａｇａｎ　ｅｔ　ａｌ　（９）は、腫瘍関連抗原に対する特異性を維持する、遺伝子操作マウス／ヒトキメラ抗体を開示している。さらに、ＮｉｓｈＮ１５ｈｉ　ｅｔ　ａｌ　（１０）は、共通急性リンパ性白血病抗原に対して特異的な組換えマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体を開示している。

本発明者らは、今回、抗−ＣＥＡマウスＭＡｂ、Ａ３８７（１１）がら誘導される、癌胎児性抗原に対する大体抗体を製造した。

本発明者らの係属中の国際特許出願ＰＣＴ／Ｇ３９Ｑ１０２０１７は、一般的な抗体のＣＯＲグラフティングに関し、とくに、そこに記載された操作にまって、ＣＥＡのまうな癌マーカーに対する特異性を有する抗体、たとえばＡ３８７モノクローナル抗体のＣＯＲグラフティングに成功したことが記載されでいる。

発明の要約本発明は人体折体分子（ＨＡＭ）を提供するものであり、この人生抗体分子は癌胎児性抗原に対して特異性を有し、可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一つはマウスモノクローナル抗体Ａ３Ｂ７　（Ａ５Ｂ７ＭＡｂ）に由来し、ＨＡＭの残りの免疫グロブリン部分はヒト免疫グロブリンに由来する、抗原結合部位を有する。

発明の詳細な説明ＨＡＭは、キメラ人体坑体からまたはＣＤＲグラフト人化抗体から人体される。

ＨＡＭがＣＤＲグラフト人化抗体から人体さ机る場合は、重鎖および／または軽鎖可変ドメインは、１個まだは２個のみがＡ３Ｂ７由来ＣＤＲであってもよいが、すべての３個の重鎖および軽鎖ＣＤＲがＡ３Ｂ７に由来するものであることが好ましい。

Ａ５Ｂ７ＭＡｂは、予め８５℃に３５分間加熱して変性した精製ＣＥＡに対して励起されたｌ　ｇＧｌ−カッパ型のマウスＭＡｂである。Ａ５Ｂ７ＭＡｂはＣｈａｒｉｎｇＣｒｏｓｓ　Ｈｏ５ｃ＋１ｔａ１．　Ｌｏｎｄｏｎ、　ＵＫにおいて広範に研究されている（１１）、免疫組織学的検討により、Ａ５Ｂ７ＭＡｂはＣＥＡ産生腫瘍と反応することが明らかにされでいる。その分布は、細胞質における悪性課内、細胞表面および壊死湯中である。しかじながら、広いスペクトルの正常ヒト組織とは、有意な交差反応性は示さない。

Ａ３Ｂ７重鎖および軽鎖ｃＤＮＡの分子クローニングおよび配列決定は以下に記載し、、およびＶＨＣＤＮＡおよび帰納されるアミノ酸配列は図１に示す。

驚くべきことに、Ａ５８７ＭＡｂは、とくにＣＯＲグラフティングで人化しでも、その結合活性は実質的に有害な影響を受けないこと、この操作である種の癌の治療おまび診断の両者に柵めて有用なＨＡＭが生成されることが見出されだのである。

本発明のＨＡＭは、好ましくは、組換えＤＮＡ技術によって製造される。

本発明のＨＡＭは、完全長の重鎮および軽鎖を有する完全な抗体分子：そのフラグメントたとえばＦａｂ、Ｆａｂ’　、　（Ｆ　ａ　ｂ′）　２またはＦＶ’フラグメント１単一鎖抗体フラグメントたとえば単一鎖ＦＶ、旺鎖または重鎖モノマーまたはダイマー：ならびにＡ３Ｂ７坑体と同じ特異性を有する任意のこれらのまだは他分子のフラグメントがら構成されることができる。

本発明のＩ−ＩＡＭは、それに結合したエフェクターまたはレポーター分子をもっていてもまい。たとえば、ＨＡＭは、重金属原子をキレートするだめの巨大環、またはそれに結合したトキシンたとえばりシンをもっていてもよい。また、組換えＤＮＡ技術の操作を用いて、完全な抗体分子のＦｃフラグメント、ＣＨ３またはＣＨ４ドメインが、機能性非免疫グロブリン蛋白質、たとえば酵素またはトキシン分子で置換されているが、まだはそれにペプチド連鎖によって結合しているＨＡＭを製造することもできる。

ＨＡＭの残りの非Ａ３Ｂ７、免疫グロブリン由来部分は、任意の適当なヒト免疫グロブリンから誘導できる。たとえば、ＲＡＭがＣＤＲグラフトＨＡＭである場合には、抗原結合領域が誘導されたＡ３Ｂ７ドナ一抗体のクラス／タイプに関連して適当な可変領域フレームワーク配列が使用できる。使用されるヒトフレームワークのタイプは、ドナー抗体のクラスまたはタイプと同一または類似のものであることが好ましい（Ａ５Ｂ７はｌ　ｇＧｌ−カッパである）。フレームワークは、ドアー抗体配列、とくにそのＣＤＲと空間的に近接または隣接した位置の配列とのホモロジ〜を最大にまたは至適化するように選択されるのが有利である。

ＣＤＲグラフトＨＡＭの構築に使用できるヒトフレームワークの例には、ＬＡＹ。

ＰＯＭ、ＴＵＲ，ＴＥｌ、ＫＯＬ、ＮＥＷＭＸＲＥ＋およびＥＵがある。たとえば、重鎖のＫＯＬおよびＮＥＷＭ、軽鎖のＲＥＩならびに重鎖および軽鎖両者のＥＵである。Ａ３Ｂ７との高レベルのホモロジーの点がら、好ましくは、ＬＡＹフレームワークが重鎖おまび軽鎖両者の可変ドメインのヒトフレームワークとして用いられる。

まだ、ＨＡＭのヒト定常領域ドメインは、抗体に企図される機能、とくに要求されるエフェタ−機能を考慮して選択される。たとえば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたは１ｇＭドメインとすることができる。ＨＡＭに治療目的が意図され、抗体エフェクター機能が要求される場合には、とくに、ＩｇＧヒト定常領域ドメイン、とくにｌ　ｇＧｌおよびｌ　ｇＧ３アイソタイプが使用できる。また、ＨＡＭに抗体エフェクター機能が要求されない、たとえば、造影、診断まだは細胞傷害標的化の目的では、Ｉ　ｇＧ２およびｌ　ｇＧ４アイソタイプも使用できる。

しがしながら、ＨＡＭの残部は、ヒト免疫グロブリンからの蛋白質配列のみからなる必要はない。たとえば、ヒト免疫グロブリン鎖のＤＮＡ配列をコードする部分が、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に融合している遺伝子を構築しることもできる。

本発明は、その第二の態様によれば、（ａ）可変ドメインＣＤＲの少なくとも１個がＡ５Ｂ７ＭＡｂから誘導され、抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンから誘導される可変ドメインよりなる抗体重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを、発現ベクター中に生成させ、（ｂ）可変ドメインＣＤＲの少なくとも１個がＡ５Ｂ７ＭＡｂから誘導され、抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンから誘導される可変ドメインよりなる相補性抗体軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを、発現ベクター中に生成させ、（Ｃ）宿主細胞をそのまだは各ベクターでトランスフェクトし、ついで（ｄ）８ランスフエクトされた細胞系を培養して）−ＩＡＭを生成させる、ことからなる、本発明の第一の態様のＲＡＭの製造方法を提供するものである。

細胞系は、軽鎖由来のポリペプチドをコードするオペロンを含有する第一のベクターと重鎖由来のポリペプチドをコードするオペロンを含有する第二のベクターの２つのベクターでトランスフェクトすることができる。両ベクターは、可能な限り各ポリペプチドが同等に発現されることが保証されるまうに、コード配列と選択マーカーの関連する範囲を除いて、同一であることが好ましい。

また、軽鎖および重鎖の両者由来ポリペプチドをコードする配列を包含する単一のベクターを使用することもできる。

したがって本発明はまだ、さらに他の態様として、重鎖および軽鎖をコードす一 ’Ｆｒ）ＮＡ配列、そのＤＮＡ配列を含有するクローニングおまび発現ベクター、そのＤ　ＩＮ　Ａ配列で形質転換された宿主細胞、ならびに形質転換された宿主細胞中でそのＤＮＡ配列を発現させることからなるベクター重鎖および／まだは軽鎖ならびに抗体分子を製造する方法を包含する。

ベクターの構築の一般的方法、トランスフェクション法おまび培養方法、それ自体はよく知られている。これらの方法は、だとえば参考文献１２および１３に示されている。

Ａ３Ｂ７アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、本技術分野においてよく知られている方法で得られる。たとえば、Ａ５Ｅ１７コード配列は、ゲノムクローニン久またはＡ３Ｂ７ハイブリドーマ細胞系からのＣＤＮＡクローニングによって得ることができる。陽性クローンは、問題のＭ鎖おまび軽鎖遺伝子に対する適当なプローブを用いてスクリーニングできる。ＰＣＲクローニングも使用できる。

ヒト免疫グロブリン配列をコードするＤＮＡは任意の適当な方法で得ることができる。たとえば、ＬＡＹ、ＰＯＭ、ＫＯＬ、ＲＥ　ｌ、ＥＵ、ＴＵＲ，ＴＥｌおよびＮＥＷＭのような好ましいヒトアクセプターフレームワークは、本技術分野の研究者には広範囲に入手可能である。

ＣＤＲグラフト生成物をニードするＤＮＡ配列の調製には、分子生物学における標準技術が使用できる。所望のＤＮＡ配列は、すべてをまたは部分的に、オリゴヌクレオチド合成法を用いて合成することができる。特定部位の突然変異おまびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術も適宜利用できる。たとえば、Ｊｏｎｅｓ　ｅｔａｌ（１４）によって報告された特定オリゴヌクレオチド合成を使用することができる。

また、たとえばＶｅｒｈｏｅｙｅｎ　ｅｔ　ａｌ　（３）およびＲｉｅｃｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ　（４）によって報告されでいるような、既存可変領域の特定オリゴヌクレオチドの突然変異も使用できる。さらに、たとえばＱｕｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ　（Ｓ）によって報告されている、Ｔ４ポリメラーゼを用いる、オリゴヌクレオチドのギャップの、酵素的充填も使用できる。

キメラＣＤＲグラフト重鎖おまび軽鎖をコードするＤＮＡ配列の発現には、任意の適当な宿主細胞／ベクター系が使用できる。とくに、抗体フラグメント、たとえばＦ、ＦａｂおまびＦａｂ′フラグメント、ならびに単一鎖抗体フラグメントだとえば単一鎖Ｆの発現には、細菌たとえば大腸菌および他の微生物系が使用できる。完全な抗体分子を含めた、より大きなＣＤＲグラフト抗体生成物の製造には、真核生物たとえば晴乳動物宿主細胞発現系が使用できる。適当な涌乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ細胞およびミエローマまたはハイブリドーマ細胞系が包含される。

本発明はまだ、本発明のＩ−ＩＡＭを含有する治療おまび診断用組成物、ならびにこの様な組成物の治療および診断における使用を包含する。

このような治療および診断組成物は通常、本発明のｌ−ＩＡＭを、たとえば、１ｎｖｉｖｏで使用するだめの医薬的に許容される賦形希釈剤まだは担体と配合してなるものである。治療および診断的使用は通常、本発明のｌ−ｆＡＭの有効量をヒト対象に投与することからなる。

本発明の第一の態様のＨＡＭならびに本発明の第二の態様の方法においては、ＨＡＭの重鎖および軽鎖可変ドメインは、Ａ５Ｂ７ＭＡｂの全可変ドメインから、まだはＡ５Ｂ７ＭＡｂのＣＤＲの一つ、一部もしくはすべてがグラフティングされたヒト可変ドメインのフレームワーク領域から構成される。すなわち、ＲＡＭは、キメラ人体抗体またはＣＤＲグラフト人化抗体から人体ものである。

ＨＡＭがＣＤＲグラフト人化坑体であ人体合には、ＣＤＲに加えて、特異的可変領域フレームワーク残基は、非ヒトすなわちＡ３Ｂ７マウス残基に相当してもよい。本発明のＣＤＲグラフト人化坑体は、人体明者らの係属中の国際特許出願ＰＣＴ／Ｇ３９０１０２０１７に定義されたＣＤＲグラフト人化抗体を包人体ることが好ましい。

ＰＣＴ／ＧＢ９Ｑ１０２０１７における開示を参考として本明細書に導入する。

軽鎖のＣＤＲは、ＣＤＲ１（位置２４〜３４）およびＣＤＲ２（位＠印〜５６）にお（ブるＫａｂａｔＣＤＲならびに構造ルーフ残基（位置引〜９６）またはＣＯＲ３におけるＫａｂａｔＣＤＲ残基（位１１８ｇ〜９７）に相当するのが好ましい。さらに、軽鎖は、位置１．２および／または３．４６．４７．４９、釦、７０．８４．８５および８７の１または２以上にマウス残基をもってもよく、少なくとも位置４６および４７にマウス残基をもつことが好ましい。

ＣＣ）Ｒに加えて、ＨＡＭ重鎖は、位置２３および／まだは２４ならびに７１および／または７３にマウス残基をもつことが好ましい。さらに、重鎖は、位置４８および／または４９、（至）、７６および／まだは７８．８０．８８および／まだは９１ならびに６の一つ、一部またはすべてに、マウス残基をもっていてもよい。まだ好ましくは、重鎖のＣＤＲは、たとえば用いられるヒト可変領域フレームワークがＫＯＬの場合には、Ｃ０Ｒ２においてＫａｂａｔＣＤＲ（位置５０〜６５）　、ＣＤＲ３において構造ループ残基（位！９５〜１００　）　、ならびにＣＤＲ１においてＫａｂａｔおよび構造ループ残基の両者（位置２４〜３５ンに相当する。まだ、重鎖のＣＤＲは、たとえば使用されるヒト可変領域フレームワークが巳Ｕの場合には、ＣＤＲ１の位置２６〜３５、Ｃ０Ｒ２の位置５０〜６５およびＣＤＲ３の位！９４〜１００において、マウス残基であってもよい。

さらにＥＵは、残基１０３がら１１３の間にとくに特異形質のＪ領域を有し、そして残基１０３〜１１３に、マウスアミノ酸、もしくはコンセンサスひとＪ領域、または両者の適当な組合わせを包含することが有用である。

とくに好ましい実施態様においては、ＣＤＲグラフト重鎮および軽鎖の両者に、ＬＡＹヒト可変領域フレームワークが用いられる。この場合、軽鎖は、可変領域フレームワークの位置１．２．３．４．４６および４７において、同時にとくに位置２１．４７および７３も、マウスＡ３Ｂ７残基からなることが好ましい。同様に、重鎮は、可変領域フレームワークの位置１．２４．４８．４９．７２．７３．７６および９３において、同時にとくに位ｔ１８２ｂおよび８６も、マウスＡ３８７残基からなることが好ましい。ＬＡＹヒト可変領域フレームワークが用いられる場合にはまた、可変領域は、軽鎖については、残基２４〜３４　（ＣＤＲＩ　”）　、印〜５６　（ＣＤＲ２）および８９〜９７　（ＣＤＲ３）において、まだ重鎖については、残Ｍ２６〜３５　ＣＣＤＲ１）　、田〜６５　（ＣＤＲ２）および９５〜１０２　（ＣＤＲ３）においてＡ３Ｂ７マウスＣＯＲからなることが好ましい。

上述のまた本願に関連して以後用いられる残基符号は、Ｋｏｂａｔ　（１５）の符号法によったものである。

図面の簡単な説明本発明を次に、添付の図１〜］６を参照しながら、例示のみの目的の以下の実施例によって説明する。図中、図７は、ｃＤＮＡクローンの配列決定にまって得られた、Ａ５Ｂ７ＭＡｂの非処理可変領域をコードするＤＮＡ配列を、予想されるアミノ酸配列とともに示す。

図２は、キメラ重鎖遺伝子の、制限酵素処理およびリゲーションによる構築の模式図である。

図３は、キメラ軽鎖遺伝子の特定部位の突然変異、制限酵素処理およびリゲーションによる構築の模式図である。

図４は、ＣＯ３−細胞トランスフエクタント上溝のＥＬＩＳＡによる分析を示す。ＣＯ３−細胞トランスフエクタントの上溝中の抗原結合能のレベルを以下に記載するように分析した。希釈曲線は色の変化の光学密度に対してプロットした。

図５は、プラスミドｐＢＧ７．１ｍ）　ＢＧｌｌ、１）ＢＧ１４、ｐＨＭｃ１９、ｐＨＭＣ２０おまびｌ）ＨＭＣ２＋について、プラスミドダイアグラムを示す。

図６は、プラスミドｐＨＭＣ２９、ρ）−ＩＭｃ３ＱおまびｐＨＭＣ２０について、プラスミドダイアグラムを示す。

図７は、還元および非還元の両条件下における、キメラＦａｂ′おまびキメラＤＦＭ生成物の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。

図８は、Ａ３Ｂ７グラフト軽鎖、ｇし一］可変領域についてのＤＮＡおまび蛋白質配列を示す。

図９は、Ａ３８７グラフト軽鎖８Ｌ−２、可変領域についての同じ配列を示す。

図１０は、Ａ３Ｂ７グラフト重鎖ｇＨ１、可変領域についての同じ配列を示す。

図１１は、Ａ３Ｂ７グラフト重鎖ｇＨ２、可変領域についての同じ配列を示す。

図１２はプラスミドｐＭＲＲＯ１０、ｐＭＲＲＯ１４、ｐＡＬ４３、ｐＡＬ４４、ＤＡＬ漏およびｐＡＬ４６について、プラスミドダイアグラムを示す。

図１３は、キメラ／グラフトハイブリッドおよびキメラ／キメラ標準の一時的発現からの上清についての、直接ＣＥＡ結合ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

図１４は、グラフト／グラフトトランスフェクションならびにキメラ／キメラ標準についての、同様のグラフを示す。

図１５は、プラスミドｐＭＲＲＯ２０、ｐＡＬ４５、ｐＡＬ４６、ｐＡＬ４９、およびｐＡＬ６０についてのプラスミドダイアグラム、とくに後二者のプラスミドの誘導を示す。

図１６は、各種プラスミドすなわちプラスミドｐＨＭＣ４３、ＯＨＭＣ４４、ｐＡＬ＆およびｐＡＬ５４についての誘導を指示するプラスミドダイアグラムを示す。

図１７は、ｐＡＣｔａｃ　、ｐＨＭＣ２０および０ＭＭＲ４５についてのプラスミドダイアグラムを示す。

図１８は、Ａ３Ｂ７キメラＦａｂ′を含有する大腸菌上溝についての、ＣＥＡ結合ＥＬＩＳＡのグラフを示す。

図１９は、Ａ３Ｂ７グラフトＦａｂ’についての同様なグラフを示す。

Ａ３８７ハイブリドーマ細胞系から、グアニジニウムイソチオシアネート／塩化リチウム法（１２〕を用いて、ポリアデニル化ＲＮＡを単離した。二本鎖ｃＤＮＡを合成しく１６）、ＥｃｏＲＩリンカ−を使用してプラスミドｐｓＰ６４（１７）ベクター中にｃＤＮＡライブラリーを構築した。マウス免疫グロブリン重鎖および軽鎖定常領域に相補性の２つのスクリーニングプローブを合成した。重鎖プローブは、マウスγ１配列のＣＨ１ドメイン中の残基］１５〜１３３に相補性の１９マーとしだ（１８）。

軽鎖プローグはゲノムマウスＣＫ配列の残基４６５８〜４６７７に相補性の２０マーとした（１９）。プローブは５′末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒ−ｎａｔｉｏｎａｌ）を用いてＣγ３２ＰコＡＴＰで放射標識し、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用した。

重鎮および軽鎖、両者の完全なリーダー、可変および定常領域を含有するクローンが単離され、ｐＢＧｌおよびｐＢＧ２と命名された。連鎖伸長停止法（２０）によってヌクレオチド配列分析を実施しだ。

ｐＢＧｉ中９５０塩基対ＥｃｏＲＩ挿入体の配列が完全に決定された。ｐＢＧｌ中のＥｃｏＲＩ挿入体は、アガロースゲル電気泳動で約１７００塩基対からなることが明らかにされた。クローンの３′末端であった可変ドメインおよびＣＨ１ドメインの５′領域が配列決定され、正しいマウスγ１終結配列の存在が確認された。ｐＢＧｌおよびｐＢＧ２の非処理可変領域のＤＮＡ配列および予測されるアミノ酸配列を図１に示す。

図１において、パネルＡはＶＬ領領域コードする配列おまび予測されるアミノ酸配列を示している。パネルＢはＶＨ領領域コードする配列および予測されるアミノ酸配列を示しでいる。シグナルペプチドの切断の候補部位は矢印で示す。誘導されるアミノ酸配列を調べだ結果、他の特性が知られている免疫グロブリン遺Ｅ子とのがなりのホモロジーが明らかにされ、リーダー、可変および定常ドメインの範囲の正確な決定が可能になった。さらに、Ａ５Ｂ７ＭＡｂはＩｇＧｌＫｆｆｉ体であることが確認された。

キメラ抗体の製造および試験一連のヒト定常領域アイソタイプ含有ベクターｐＲ８１８（ｌ　ｇＧｌ）　、ｐＲＢ２６　（Ｉ　ｇＧ２）　、ρＲ８２０（ｌ　ｇＧ３）およびｐＲ８２１（１ｇＧ４）の構築は公にされた国際特許出願Ｗ０８９１０１７８３に記載されている。Ａ３Ｂ７ＶＨＣＩＮＡ配列は巳ｃｏＲＩ　−Ｂａｎ　Ｉフラグメントとして単離され、下記の連結オリゴヌクレオチドにリゲートされてＥｃｏＲニーＨｉｎｄＩＩＩＨフラグメントを与えた（図７）。

Ｒ１１２０５’ＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＣＲ１１２１ＧＴＣＡＣＡＧ’Ｉ’ＧＧＣＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡ５’このフラグメントをρＡＴＴ５３中にクローン化したヒトＩｇＧ１．２．３および４遺伝子のＥｃｏＲＩ− ８ＱｍＩ含有フラグメントにリゲートし、ｐＢＧ３．４．５および６が得られた。

キメラ重鎖遺伝子を、ｐＡＴｌ　ｇＧプラスミドからＥｃｏＲニーＢａｍ　エフラグメントとして単離し、ＥｃｏＲＩおよびＢｃｌ工で切断したｐＥＥ６ベクター（２１）にクローン化し、プラスミドｐ８Ｇ７．８．９おまび１Ｑを得た。ρ εε６ブラスミドは、ＥｃｏＲ１部位の上流の唯一のＨｉｎｄｕ部位に挿入された、ヒトサイトメガロウィルス即時初期遺伝子（ｈＣＭＶ−Ｉ　Ｅ）がらの強力なプロモーター／エンハンサ−および転写調節要素を含有し、公にされた国際特許出願ＷＯ３９１０１０３６に詳細に記載されている。さらに、ＳＶ４０複製起源は、選択可能マーカー遺伝子とじて唯一のＢａｍＨ工部位に挿入されるグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｆ）ｔ）を駆動する、ＳＶ４０初期プロモーターフラグメントによって与えられる。このプラスミドはまだ、アンピシリン抵抗牲遺伝子も含有し、細菌宿主中での選択および増殖を可能にする。

Ｂ６　キメラマウス−ヒト軽鎖遺伝子の構築マウス軽ｊｉｌｌｃ　ＤＮＡクローン、ｐＢＧｌに、以下のオリゴヌクレオチド５’　ＴｆｆＣＡｆｆｌ’ＣＭＧＣ ’！％ＧＴＧＣ３’を用いた特定部位の突然変異（２３）によって、ＨｉｎｄＩ［Ｉ制限酵素処理を導入した。

このＨｉｎｄｌＩＩ部位の導入は、ＤＮＡ配列決定によって証明された。Ａ３Ｂ７Ｌ配列は、ＥｃｏＲＩ　／Ｈｉｎｄ　Ｉ［フラグメントとして単離された。これは、ヒトＣｋ定常領域からなるＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントと結合させ、ｐＥＥ６の唯一のＥｃｏＲＩ部位にリゲートされた（図３）。この得られたプラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にネオマイシン抵折性遺伝子（ｎｅｏ）も含有する。

Ｃトランスフェクションおよび抗体産生のＥＬＩＳＡ分析上述の４種のキメラ重鎖発現構築体をキメラ軽鎖とともに、キメラ生成物の一時的発現のだめ、Ｃ０９ −１細胞（２４月ごトランスフェクトした。細胞をＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン溶液中で６時間インキュベートさせ、ついでＨＥＰＥＳ−緩衝食塩溶液中１０％ＤＭＳ○で２分間ショックを与えた。細胞を洗浄し、１０％ウシ胎児血清含有培地中で７２時間インキュベートしだ。

３２°Ｃで７２時間インキュベートしだのち、細胞上清を、重鎖および軽鎖のの生成ならびに抗原の結合について、ＥＬＩＳＡで分析した。

培地（１０５細胞あたり５００μｍ）はＥＬＩＳＡ分析のだめに分離した。

組み立てられた抗体生成物を定量するだめに、マイクロタイタープレートを各ウェルあだり、重鎖および軽鎖上のヒト特異的エピトープに対して反応性のヒツジ抗体０２５μｇを用いて被覆した。トランスフェクトしたＣＯ５細胞からの上清または溶菌物を、０．１Ｍトリス塩酸塩ｐＨ７，０，０，１Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ツイーン２０および０２％カゼインを含有するサンプル接合緩衝液で、それぞれ１２または１４に希釈した。各希釈サンプル１００μ［を各ウェルに加え、穏やかに攪拌しながら室温で１時間インキュベートした。洗浄緩衝液（０，２％ツイーン２０、ｔ）Ｈ７，２含有リン酸緩衝食塩溶液）で６回洗浄したのち、標準西洋ワサビペルオキシダーゼを接合したヒト特異的エピトープに対して反応性の抗体の１５０００希釈液１００μ）を各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベーション、で洗浄緩衝液で６回洗浄した。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）０．１ｍｇ／ｍｔ　、０．１　Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ６，０および０．００５％Ｈ２Ｏ２を含有する基質緩衝液１００μｍを各ウェルに加え、発色させた。反応は、２〜３分後に１．５Ｍ硫酸で溶液のＯＨを１０に調整して終結させた。各ウェルについて、Ｄｙｎａｔｅｃｈｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　ＭＲ６００マイクロタイターリーダーを用いて、４５０　ｎｍにおける光学密度を測定した。既知濃度の適当なヒト免疫グロブリンを用いて、標準曲線を作成した。

抗原結合アッセイも同様の方法で実施しだ。マイクロタイタープレートを各ウェルあたり０２５μｇの精製ＣＥＡで被覆しだ。洗浄緩衝液で６回洗浄したのち、ＣＯ８細胞トランスフェクションがらのサンプルを前述の場合と同様に添加し、第二の抗体としてＨＲＰに連結したヤギ抗−マウスまたは−ヒトＦ　（ａｂ′）　２を用いて以後の操作を同様に実施した。

会合したポリペプチド鎖の存在を検出する集合体アッセイにより、少なくとも一つの重鎖おまび一つの軽鎖を含有するマルチマーの形成が、両遺伝子でコトランスフエクトした場合、明らかにされた。抗原結合アッセイ（上記参照）では、キメラ重鎖およびキメラ軽鎖コトランスフエクションにより、抗原を認識できる抗体分子の生成が証明された。抗原結合ＥＬＩＳＡの一実験のデータを図４に示す。これらの実験がら、抗体分子のキメラ化はその抗原認識能に有意の影響を与えないことが明らかである。

トランスフェクション後、ＣＯ８細胞は１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ中で、２４時間回復させた。ついで、培地をメチオニンを含まないＤＭＥＭに換え、これには予め［””Ｓ］メチオニン（ＮＥＮ）１００μＣｉ／ｍｌを添加した。細胞を４８時間代謝的に榎識した。抗体分子の集合および分泌の分析は、プロティンＡ−セファロースに結合した抗−ヒトＦ　（ａｂ′）２を用いる免疫沈降によって実施した。

ヒトｌ　ｇＧＦ　（ａｂ’　）　２に対するアフィニティー精製ウサギ抗体を、プロティンＡ−セファロースにカップリング後、免疫沈降に使用した。分泌された抗体は、還元および非還元条件下に５Ｏ８−１０％ＰＡＧＥ系上で分析した。

ゲルをオートラジオグラフィーエンハンサ−で処理し、乾燥し、Ｆｕｊｉ　ＲＸフィルムに暴露した。

抗血清は、それぞれ免疫グロブリン重鎖および軽鎖に相当する見掛けの分子鳳５５におよび２８にの蛋白質を免疫沈降させた。還元および非還元５Ｏ８−ＰＡＧＥによって分析された免疫沈降の比較から、重鎖および軽鎖は正しいテトラマー分子として組み立てられていることが指示された。

例３キメラ全抗体およびＦａｂ’生成物の製造および比較キメラ全抗体およびＦａｂ ’　生成物を発現する安定細胞系を確立し、キメラ全抗体、Ｆａｂ′、Ｆ　（ａｂ’　”）　２および合成的に架橋したＤＦＭ　（ジＦａｂ’マレイミド）生成物を調製し、試験した。

しかしながら、まず最初に、キメラＦａｂ′をコードするＤＮＡ配列とこの配列の発現のだめのベクターの構築が必要であった。

Ａ　キメラマウス／ヒト重鎖遺伝子およびＦａｂ’発現用ベクターの溝築Ａ３Ｂ７キメラ重鎖、ｌ　ｇＧ４を含むプラスミド（ＤＢＧｌｏ）をＢｓｔＥＩ［およびＢｇｌＩ［で制限酵素処理した。ｈＣＭＶプロモーター、およびＡ３Ｂ７ＶＨプラスＣＨＩドメインの５′部分を含む犬ぎい方のベクターフラグメントを単離した。

プラスミドｐＪＡ１１５（国際特許出願ＷＯ３９１０１９７４Ｃ記載）　ヲ８ｓｔＥＩｒ＆Ｌ：ヒＢｇｌｌＩで切断しだ。ＣＨｌの３′末端プラスＣｙｓのＡｌａへの変化を含有するｌ　ｇＧ４蝶番部を含むフラグメントを単離し、ｐＢＧ１０ベクターにリゲートした。

得られたベクター、ｐＢＧｌ４は、Ａ３Ｂ７Ｆｄ′重鎖ｌ　ｇＧ４　（Ｃｙｓ− Ａｌａ＞を含有する。

本例および以下の例で使用したアッセイ操作は次の通りである。

集合体ＥＬＩＳＡ全抗体の数案を測定するＥＬＩＳＡには、ヤギＦ　（ａｂ′）　２１　ｇＧＦｃで被覆したマイクロウェルプレートを用いた。培養上清サンプルとのインキュベーション後の結合人体１ｇＧは、西洋ワサビベルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合マウス抗−ヒトカッパ鎖抗体で顕現された。サンプル中のキメラまだはＣＤＲグラフト全抗体の濃度は、精製キメラＡ３Ｂ７　ｌ　ｇＧｌの希釈系列より作成した検量白線がら内挿した。

Ｆａｂ′の収率を測定するＥＬＩＳＡには、マウス抗−ヒトｌ　ｇＧＦｄで被覆したマイクロウェルプレートを用いた。サンプルとのインキュベーション後、結合人体Ｆａｂ′は、集合体ＥＬＩＳＡの場合と同様にして顕現された。サンプル中キメラまたはＣＤＲグラフトＡ３Ｂ７Ｆａｂ’は精製キメラＡ３Ｂ７Ｆａｂ’ の希釈系列より作成した検量白線がら内挿しだ。

直接ＣＥＡ結合εＬＩＳＡには、ＣＥＡで被覆したマイクロウェルプレートを用いた。培養上清サンプルの希釈系列とのインキュベーション後、結合１８Ｇまたはフラグメントを集合体ＥＬＩＳＡの場合と同様にして顕現した。結合対希釈白線を集合体アッセイによる測定の場合と同様にして、抗体濃度に対して標準化した。

抗−ＣＥＡ活性についての競合的ＲＩＡでは、一連の　１−標識マウスまだはキメラＡ３Ｂ７１８Ｇ１の、培養上清サンプルからの大体１ｇＧまだはフラグメントとの、ＣＥＡ被覆ビーズへの結合における競合を調べだ。結合活性は、ビーズに会合した放射能を測定することによって測定した。アッセイは、キメラまたはマウスＡ３８７１８Ｇ１の標準プレバレージョンとの競合によって検量し、％結合ｃｐｍ対折体濃度をプロットした。未知サンプルについての内挿された見掛けのＡ３Ｂ７濃度を集合体アッセイの結果で除して標準化し、比活性をめた。

最後に、比活性を、同一の実験の間に生成された陽性対照キメラＡ３Ｂ７培養上清がら得られた値と比較して、％相対強度として表した。

精製マウスおまびキメラＡ３８７Ｆａｂ′おまびＦ　（ａ　ｂ′）　２フラグメントならびにマウスＩｇＧの相対強度を、競合的ＲＩＡを用いて検討した。さらに、相対強度の確認のだめ、試験標本をマウスＡ３Ｂ７　ｌ　ｇＧｌとコインキュベートして、競合様式で、直接結合ＥＬ　Ｉ　ＳＡを行った。

キメラＡ３Ｂ７Ｆａｂ’　を、０ＥＡＥ−セファロース上イオン交換クロマトグラフィ一ついでイタチル−セファロース上疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製した。架橋剤として１，６−ビスマレイミドヘキサンを用い、標準のワンポット法により、架橋剤０．９　ｍｇ／ｍｌに対しでＦａｂ’２．２倍過剰で、架橋を寞施しだ。実験の規模が小さいため、精製はＨＰＬＣゲル濾過（ＧＦ −２５１ＤＸＬ）によって実施した。これにより、Ａ３Ｂ７キメラＤＦＭ　（ジＦａｂ′マレイミド）生成物キメラＡ３Ｂ７１　ｇＧ１全抗体およびキメラｌ　ｇＧ４Ｆａｂ′デルタＣｙｓを発現する、増幅性おまび非増幅性の２種類のＣＨＯ細胞細胞間発した。キメラＡ３Ｂ７　ｌ　ｇＧ１全抗体は、アッセイ開発の標準として、また担癌マウスにおけるキメラおよグラフト抗体の生体内分布および治療研究での比較対照に使用された。

キメラ全抗体およびＦａｂ’のための非増幅性細胞系が最初に構築された。このような細胞系は、収率は比較的低いが、その製造は容易がつ迅速で、精製およびアッセイのだめの操作の開発用の材料の迅速な作成に使用された。ｐＨＭＣ１９（例２参照）は、キメラＡ３８７軽鎖３′からｈＣＭＶプロモーターまでを含有するプラスミドである。このプラスミドをＣＨＯ−に１細胞にトランスフェクトし、ネオマイシン抵抗性で選択し、抗−ヒトカッパ抗体で３０のトランスフェクトントについてスポットアッセイを実施して、最良の産生クローンを同定した。

代表的細胞系を同じ抗体でアッセイして、キメラＡ３Ｂ７軽鎖を特異的産生率１〜２ｕｇ／ｍｌ　／１０６細胞で分泌する安定な細胞系が同定され、ＨＣＮ１．３７と命名した。

この細胞系を、ｐＥＥ６ｈＣＭＶｇｐｔベクター（図５参照）中にそれぞれキメラＡ３Ｂ７１８Ｇ１おまびキメラＩｇＧ４Ｆａｂ′デルタＣｙｓの重鎖遺伝子をもつプラスミドｐＢＧ７およびρＢＧ１４で、前述のように再トランスフェクトした。

精製後、約１６ｍｇ／ｌのキメラＩ　ｇＧｌを産生する細胞系（ＨＣＮ１．３７／ｇ１．１およびｇｌ、７と命名）および約５ｍｇ／ｌのキメラＦａｂ’　を産生する細胞系（ＨＣＮ１、３７／デルタＣｙｓ３と命名）が、上述の再トランスフェクトントの中がら、集合体および直接ＣＥＡ結合アッセイによって同定された。これらの細胞系を用いて試験量のキメラ全抗体およびＦａｂ’　を作成した。

増幅性細胞系ＧＳベクター系による増幅が可能であり、最終的製造に適当なキメラＡ３８７Ｆａｂ’　デルタＣｙｓの生成用に予定された細胞系をついで構築した。ｈＣＭＶプロモーターおよびキメラＡ３Ｂ７軽鎖遺伝子をもつｐＢＧＩＩのＣ１ａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをまず、０ＥＥ１２（２２）の、Ｃ１ａＩおよびＥｃｏＲ工部位の間にクローン化し、プラスミドｐＨＭｃ２０を作成した（図５参照）。

キメラ軽鎖およびキメラｌ　ｇＧ４Ｆａｂ’デルタＣｙｓ重鎖の両者の遺伝子をもつプラスミドｐＨＭｃ３０（図６参照）は、ρ）−１ＭＣ２０のＮａｅＩ−Ｆｓｏ工大フラグメント（軽鎖遺伝子を有する）をｇｐｔ遺伝子がＢａｍＨＩ部位がら除去されているＤＢＧ１４の誘導体であるｐＨＭＣ２ＢのＥｃｏＲＶ−ＦｓｏＩフラグメントにリゲートして構築した。ｐＨＭＣ３０は、宿主細胞系としてマウスミエローマ細胞系ＮＳＯを用い、トランスフエクタントの選択のためのＧＳｃＤＮＡを含有するのでＡ３Ｂ７Ｆａｂ’　を発現する、増幅可能な細胞系の開発に適当な二重遺伝子プラスミドである。ＣＨｏ細胞中でのトランスフエクタントの選択および増幅は、ｃＤＮＡｃＪ：りもむしろＧＳミニ遺遺伝子発現を要求する。増幅可能なＣＨＯ細胞細胞間発に適当な二重遺伝子は、キメラ軽鎖および重鎖発現単位の両者を含有するｐＨＭＣ３０のＭｌｕニーＦＳＤＩフラグメントをｐＥＥ１４（２５）のＧＳミニ遺伝子含有フラグメントとリゲーションしで構築された。得られた、ｐＨＭＣ３０と命名されたプラスミド（図６参照）を、ＣＨＯ−に７細胞系にトランスフェクトし、２５μＭのＭＳＸ上で選択した。これらのトランスフエクタントにつき特異的産生率を測定し、７つを選んで増幅した。

これらの７つのトランスフエクタントの増幅前の特異的産生率は、次の通りであつだ。ＨＯ３，３６，１，３：ＨＯ３，２１，０１６５：　［−１ｃ３．３３．０．６５：　ＨＯ２，１９，０，１４：　ＨＯ２，２４，３，４：ＨＯ２，３３，３，７，ＨＯ２，３９，０，３５゜挿入プラスミド配列の高いコピー数をもつ可能性のある細胞の選択は、ＭＳＸの濃度をｌ０ＣＩ〜１０００μＭに増大させ、生存細胞系をスクリーニングし、特異的産生率を測定することにより達成された。

特異的コピー数の評価は行わなかった。

Ｃ，キメラＡ３Ｂ７１８Ｇ１の精製キメラｌ　ｇＧｌの精製は、Ｃｏ１ｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ　（２６）により、８７２．３について報告された方法の改良法によって精製した。ＣＨＯ細胞上清をらせんカートリッジ限外濾過によって濃縮し、ついでプロティンＡセファロース上アフィニティータロマドグラフィ〜に付し、ｐＨ３で溶出して精製した。還元ならびに非還元５ＯＳ−ＰＡＧＥにより、精製抗体は完全に組み立てられていて、純度〉９５％であることが明らかにされた。

Ｄ　キメラＡ３Ｂ７Ｆａｂ’の精製および架橋キメラＡ３８７Ｆａｂ′は、０ＥＡＥ−セファロース上イオン交換クロマトグラフィ一ついでオクチル−セファロース上疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製した。Ａ３Ｂ７Ｆａｂ′ を含有するＣＨＯ細胞培養上清を限外濾過によって１０分の１に濃縮し、１０ｍ１ｖｌトリスｐＨ７，５で元の容量に希釈して、伝導度を＜４ｍＳに低下させた。この物質をついで、予め１０ｍＭトリスｐＨ７，５で平衡化しだＤＥＡＥ−セファロースカラムに適用し、Ｆａｂ′を含む通過液を集めた。

０ＥＡＥ−セファロースカラムからの通過液を、ついで限外濾過によって濃縮し、硫酸アンモニウムを２Ｍになるように加えた。沈殿を生じたならば遠心分離で除去し、サンプルを次に２Ｍ硫酸アンモニウム含有１０ｍＭトリスｐＨ７，５で予め平衡化したオクチル−セファロースカラムに適用した。カラムに結合したＦａｂ′を平衡化緩衝液で洗浄し、硫酸アンモニウム濃度を１Ｍに低下させて溶出した。

次に、溶出液を１００ｍＭ酢酸／クエン酸ナトリウムｐＨ６中に透析呟限外濾過によって濃縮した。

精製Ｆａｂ′は、まず蝶番部に遊離のチオールを発生させ、ついで１，６−ビスマレイミドヘキサンを用いて架橋した。遊離のチオールを発生させる部分還元は、Ｆａｂ′を４．５ｍＭβ−メルカプトエチルアミンと３７℃で３０分間インキュベートすることにより達成された。ついで還元剤を、セファデックスＧ−２５のカラム上での脱塩によって除去し、還元されだＦａｂ’　は直ちに、１．６− ビスマレイミドヘキサンとともに、ビスマレイミドヘキサン　Ｆａｂ′のモル比１：２．２　、Ｆａｂ′濃度０．９　ｍｇ／ｍｌでインキュベートして、架橋した。−夜３７°Ｃでインキュベーション後、架橋物質を０．２Ｍリン酸塩ｐＨ７，０中ＤｕＰｏｎｔ　Ｚｏｒｂａｘ　ＧＦ−２５０ＸＬカラムを用い、ＨＰＬＣゲル濾過によって精製した。架橋収率は約５８％であつだ。

精製Ｆａｂ’および架橋ジＦａｂ　（ＤＦＭ）は、還元ならびに非還元条件下に５ＯＳ−ＰＡＧＥで分析した（図７）。精製Ｆａｂ’　は、非還元条件下には、期待されたまうに約５０　ＫＤａの分子量で移動し、Ｆｄ’　と２５　ＫＤａの軽鎖に還元された。

精製架橋ジＦａｂは、期待されたように非還元ダイマーの約＋００　ＫＤａの分子量を示し、約５０　ＫＤａの架橋Ｆｄ’　と約２５　ＫＤａの軽鎖に還元された。

Ｅ　キメラＡ３Ｂ７１　ｇＧｌ、Ｆａｂ′およびＤＦＭの抗原結合活性マウスおよびキメラＩｇＧおよびフラグメントの相対強度は、競合ＲＩＡで測定した。結果は表１に示す。キメラＤＦＭを含めて、すべての２価の種は、マウスＡ３Ｂ７１８Ｇの場合と同等の強度を与えた。マウスＦａｂ’　をアルキル化して１価にすると、結合活性がら考えて予測されるように、強度は１０分の１に低下した。

しかしながら、１価のキメラＦａｂ’　は中間の強度を示した。競合様式での直接結合ＥＬＩＳＡを用いて、同一サンプルについての結合活性の測定でも填めて頴似した結果を与え、この場合もキメラＦａｂ’は中間の強度を示しだ。キメラＦａｂ′はアルキル化されながつだので、マウスＦａｂ’に比較してその高い結合活性は、その一部は抗原誘導ダイマー化によるものと考えられる。

！筆体　％相対強度キメラ　Ｄ乃　１０４　＋　２８マウス　Ｆ［ａｂ）２　９７　＋　２２キメラ　’Ｅ’ａｂ・　２０　＋　１５マウスＦＩＬｂ’　８”５氾Ａ３Ｂ７の人体ＣＤＲグラフト型も調製した。

ＣＤＲグラフトＡ３Ｂ７遺伝子の構築および発現図１には、Ａ３Ｂ７についでのＶ８およびＶＬドメインのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す、、、ＣＤＲグラフト、およびヮしドメインは、寞質的に国際特許出願ＰＣＴ／Ｇ３９０１０２０１７に記載されているように設計した。Ａ３８７、のアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ　（Ｔ５）が報告しているように、ヒトｖＨＩＩＩサブグループのコンセンサス配列に対してかなりのホモロジーを示し、一方ＶＬ配列はヒト■およびエサブグループの配列とがなりのホモロジーを示した。これらのサブグループ内で利用可能なヒトフレームワークには、ＬＡＹ　（ｖ　）、ＰＯＭ（ＶＨＬＵＲ（Ｖ　）　：ＲＥｌ　（）　、　ＴＵＲ（Ｖ　）　：ＥＵ（Ｖ　）　、　ＴＥＩ　（ＶＨ）ＨＬ　ＨＬ：ＲＥ　ｌ　（ＶＬ）　、ＴＥｌ　（ＶＨ）：　ＥＵ　（）がある。これらの中でＬＡＹしがＡ３Ｂ７に対して最高のホモロジーを有し、まだマツチした８およびＶＬ鎖の利点が考えられることから、それをヒトフレームワークどして選んだ。ＣＤＲ配列および抗原結合に重要性が考えられる他の残基は、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９０１０２０１７に記載されているようにして同定し、各Ｖ領域につき２つの構築体を組み立てた。第一の構築体、ｇＬｌおよびｇＨｌは、ＣＯＲおよび抗原結合に重要性が考えられ、ヒトとＡ３Ｂ７の配列が異なる他の位置に、マウスの配列を含有する。ｇＬ１軽鎖は、残基２４〜３４　（ＣＤＲＩ）　、関〜５６　（ＣＤＲ２）および８９〜９７（ＣＤＲ３）にマウスＣＤＲを、まだフレームワーク内の残基１．２．３．４、料、および７１にマウス残基を含有する。ｇＨ１重鎖は、残基２６〜３５　（ＣＤＲ１）、５０〜６５（ＣＤＲ２）および９５〜１０２　（ＣＤＲ３）にマウスＣＤＲを、さらにフレームワーク内の残基１．４８．４９．７２．７３．７６および９３のにマウス残基を有する。

第二の構築体、ｇＬ２およびｇＨ２はさらに保存性が高く、第一の構築体に存在するマウス配列に加えて、　にはさらに３つのマウス残基、ｖＨには２つのしマウス残基を含有する。ｇＬ２では、これらの残基（Ｋｏｂａｔの番号のつけ方で位置２１．４７および７３）はドメインのバッキングに開会している可能性がある。ｇＨ２では、ＬＡＹがヒトＶＨ配列には珍しいアミノ酸を有し、Ａ３Ｂ７はヒトｖＨにもつと共通に存在する残基を有する位置（８２ｂおよび８６）に、さら（こマウス残基が存在する。

図８．９．１０＆Ｊ：び１１ニハ、それぞれｇＬｌ、ｇＬ２、ｇＨｌおよびｇＨ２のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。これらの図中、アミノ酸配列の下部（こ付した単一文字は、相当するマウス残基に変化させた、フレームワーク内の残基を指示する。また、これらの図ではアミノ酸配列の下部に付した実細線はＣＤＲ残基を指示する。これらのＤＮＡ配列は、センスおよびアンチセンス鎖を交替する約８０塩基のオリゴヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ＰＣＲ重複組立て法により、オリゴヌクレオチド（各図に二重下線で示しだ）から組立てられた。オリゴヌクレオチドは、アニーリングにより部分二重鎖分子が形成されるように２０塩基まで重複させた。ギャップをＴａａポリメラーゼで充填し、二重鎖物質を、重鎖の５′末端の配列に相当する短いオリゴヌクレオチドをアンブリファイヤーを用いるＰＣＲにより増幅した。増幅したフラグメントを適当な制限酵素で消化して、クローニングのだめの制限部位を露出させた。

適当なサイズに増幅したフラグメントを、ＶＨについてはＨｉｎｄｆｆｌとＡｃ＋ａ　Ｉ、■　についてはＢｓｔＩとＳρ目で消化して、クローニングのだめの制限部位を露り出させた。Ｖ　フラグメントはベクターｐＭＲＲＯ１４に、ＶＬフラグメントはｐＭＲＲｏｌｏにクローン化した。ｐＭＲＲＯｌｏおよびｌ）ＭＲＲＯ１４はｈＣＭ発現ベクターで、人体領域を受け入れて、ＣＨＯまだはＣＯ８細胞中で容易に一時的に発現し、ついでＮＯ８細胞中に安定な発現と遺伝子増幅が可能な単一ペクタ−を与えるように容易に再構築できるように設計されたものである。これにより図１２に示すように、プラスミドｐＡＬ４３　（ｇＬ１含甫）　、ｐＡＬ４４　（ｇＬ２＞、ｐＡＬ４５　（ｇＨｌ）およびｐＡＬ４６　（ｇＨ２）が得られた。これらのプラスミドは、ＣＨＯ細胞中での発現に適するコンフィギユレーションで完全長ののＣＤＲグラフト抗体遺伝子（重鎖についてはｌ　ｇＧｌ　、軽鎖についてはカッパ）を含有する。正しい配列を含有するクローンはＤＮＡ配列決定により同定した。

グラフト鎖共発現のＣＥＡ結合活性を評価するだめには、一時的ＣＨＯ細胞システム中での実験をまずキメラパートナ−とともに寞施しだ。すなわちρＡＬ４３およびｐＡＬ４４は、ＣＨＯＬ７６１ｈ細胞系に、キメラＡ３Ｂ７重鎖発現プラスミドｐＢＧ７とともにコトランスフエクトし、一方１）ＡＬ４５およびｐＡＬ４６は軽鎖発現プラスミドｏＢＧ１７とコトランスフエクトした。キメラ／グラフトハイブリッドの活性を比較するキメラ／キメラ標準を得るだめに、ｐＢＧ７とｐＨＭＣ１９のコトランスフェクションも実施した。図１３は、これらのトランスフェクションがら得られた粗上清に対する直接ＣＥＡ結合ＥＬＩＳＡの結果で、すべてのグラフト／キメラハイブリッドがキメラ／キメラ標準の場合と類似の結合活性を示すことが明らかである。各種ハイブリッドの間には、抗体の収率でがなりの変動が認められた。この変動は、グラフト／グラフトコトランスフェクションを実施した場合にも、極めて明白であった。実際、ｇＬ１／ｇＨ１およびｇＬ２／ｇＨ１について認められた収率は低すぎて、ＣＥＡ結合活性の信頼できる評価は不可能であった。しかしながら、ｇＬ１／ｇＨ２およびｇＬ２／ｇＨ２の組合わせはいずれも、直接結合アッセイにおいて、二重キメラ抗体と同様のほぼ６０％でＣＥＡを結合した（図１４＞　。ｇＬ１／ｇＨ２およびｇＬ２／ｇＨ２では粗ＣＨ○細ＩＪについで、競合的ＲＩＡも行った。表２に示した結果は、これらのグラフト変異体が、これらのさらに緊縮なアッセイでそれぞれキメラの約４２％おまび４７％の強度を示し、ｇＬ２／ｇＨ２がｇＬ１／ｇＨ２より乞わずがながら強いことを示している。

トランスフェクトしたＣＨＯ細胞上清中Ａ３８７のグラフト変異体の抗ＣＥＡ活性の競合ＲＩＡによる評価構築体　非希釈比活性　相対強度キメラＡ３Ｂ７　１１７　１００±６グラフトＡ５８７ｇＬ１／ｇＨ２０，４９４２±４グラフトＡ５Ｂ７ｇＬ２／ｇＨ２０，５５４７±３例５同様に、ＣＤＲフラグメントＢ７Ｆａｂ’遺伝子を構築し、発現させた。

Ａ、ＣＤＲフラグメントＥ３７Ｆａｂ’遺云子の構築ｐＭＲＲＯ２０は、ヒトｌ　ｇＧ４ｃＨ１およびデルタＣｙｓ　（すなわち単一システィン変異体）蝶番部ドメインのコード配列を含む制限部位を有するｐＥＥ６　ｇｏｔ発現プラスミドである（図１５）。これらの２つのドメインを含有するフラグメントは、以下に示すような、正方向プライマーとしでオリゴヌクレオチドＲ１０５３および逆方向プライマーとしてＲ２３７１を用いてｐＭＲＲＯ２０上にＰＣＲ反応を実施して単離された。

Ｒ１０５３５’　ＧＴＣＣＡＣＡＣＡＣＴＭＣＡＣＡＣＴＧＴＴＣＣ３’後者のプライマーの使用により、蝶番部コード領域内の不便なＡｐａ　工部位を除去することもできだ。ＰＣＲ反応で３２０　ｂｏのフラグメントが生成し、これを、ｐＡＬ４５およびｐＡＬ４６にクローン化して、完全長のＣＤＲグラフトＦｄデルタＣｙｓ遺伝子を有する、ｐＡＬ４９およびｐＡＬ５０が、それぞれ得られた（図１５）。

ＣＨｌおまび蝶番部ドメインならびにクローニング連結領域の配列決定を行い、第二の突然変異がないことを確認した。

Ｂ、ＣＤＲフラグメントＢ７１　ｇＧ１全抗体、およびＣＤＲグラフトＡ３９７１　ｇＧ１Ｆａｂ′デルタＣｙｓｌｔ伝子を発現するＣＨＯ細胞細胞間発ＣＤＲフラグメントＢ７１８Ｇ１全坑体重ならびにＣＤＲグラフトＦａｂ’　を発現する安定な細胞系を作成するために、ｇＬｌおよびｇＬ２遺伝子をｐＡＬ４３およびｐＡＬ４４がらＣ１ａニーＥｃｏＲＩフラグメントとしてまず単離し、ｌ：）ＥＥ７４の誘導体であるベクターＤＭＲＲＯ１７に、ＢａｍＨＩ部位に挿入された有用なポリリンカーとともにクローン化し、それぞれプラスミドｐＨＭＣ３６およびｐＨＭＣ３７を得た（図１６）。ｇＨｌ　（ｔ　ｇＧｌ）　、ｇＨ２（ＩｇＧ１）　、ｇＨｌ　（ＦｄデルタＣｙｓ）おまびｇＨ２（ＦｄデルタＣｙｓ）遺伝子は、それぞれｐＡＬ４５．４６、罷および田がらのＨｉｎｄＩ］Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメントとして単離され、ｐＨＭＣ３６のＥｃｏＲ工およびＢａｍＨ１部位の間のＳＶ４０ポリＡおよびｈＣＭプロモーターを有するＥｃｏＲニーＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとともにクローン化し、それぞれプラスミドｐｌ−ＩＭｃ４．３　（ｇＬｌ−ｇＨｌ）　、ｐＨＭＣ４４（ｇＬｌ−ｇＨ２）　、ｐＡＬ５３　（ｇＬｌ　−ｇＨＩ　ＦｄデルタＣｙｓ）およびｐＡＬ５４　（ｇＬｌ −ｇｌ−（２ＦｄデルタＣｙｓ）を得だ。これらのＧＳ二重鎖遺伝子発現プラスミド（図１６）をＣＨＯ−に１細胞にトランスフェクトし、前例の記載と実質的に同様にして、ＣＤＲフラグメントｇＧ１全抗体、およびＣＤＲグラフトＦａｂ ’産生細胞系が得られた。

Ａ６大腸菌でのＡ３Ｂ７抗体フラグメントの製造キメラおよびＣＤＲフラグメントＢ７Ｆａｂ’　フラグメント（ｇＬｌ　ｇＨ２−ＣＤＲグラフト変異体を使用した）を、抗体フラグメントの大規模生産に好ましい宿主である大腸菌分泌系でも発現させた。

大腸菌内での発現および分泌には、まず、Ａ３Ｂ７重鎖および軽鎖の天然のシグナル配列を、大腸菌外膜蛋白質ｏｍｐＡ（Ｍｏｗａ　ｅｔ　ａｌ、２８）のシグナル配列と置換した。ｏｍｏＡシグナル配列をコードし、ａｍｐ　Ａ翻訳開始領域を包含する９２塩基対フラグメントをオリゴヌクレオチドから組立て、ファージミドベクターｐＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓより）のＸｈｏＩとＨｉｎｄＩ［［部位の間にクローニングした。９２塩基対フラグメントのＤＮＡおまびアミノ酸配列は次の通りであった。

ｍｅｔｌｙｓｌｙｇｔｈｒａｌａｉｌｅａｌａｉｌｅａｌａｖａｌａｌａＴＣＧＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＧＡＧＧＣＧＴＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴ　ＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＡＡＣＡＴＣＴＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＡ５ＣＴＴｒＴＴＣＴＧＴαａＴＡＧｃＧｃＴＡＡｃＧＴｃＡｃｃＧＴｌｅｕａｌａｇｌｙｐｈｅａｌａｔｈｒｖａｌａｌａｇｌｎａｌａｐＳＫ＋中に上記配列をもつことがＤＮＡ配列決定で明らかにされたクローンをｐＳＫ　ｏｍｐＡと命名した。

キメラＡ３Ｂ７軽鎖の場合は、大部分のＶＬとすべてのＣカッパをコードする６閏塩基対の５ａｃＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＨＭＣ１９がら単離した。キメラ軽鎖のｏ＋ｎｐＡシグナル配列への正確な融合は、ＨｉｎｄＩ［ＩとＥｃｏＲＩで消化されたｐＳＫ　ｏｍｐＡ中に、この５ａｃＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、オリゴヌクレオチドから組立てら粗ｏｍｐＡシグナル配列の３′領域とＡ３８７Ｖ、の５′領域をコードするＤＮＡからなる５４塩基対のＨｉｎｄＩ［ｌ −９ａｃＩフラグメントとともにリゲーションを行い作成した。９２塩基対フラグメントの配列は次の通りであった。

５’　ＡＧＣＴＣＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣ３’正しい配列を含むクローンをＤＮＡ配列決定で同定し、ｐＳＫ　ｏｍｐＡ−ｃＬｃと命名した。

キメラＡ３Ｂ７重鎖の場合は、大部分の８と、すべてのＣＨＩおまび（デルタＣＹＳ）蝶番部ドメインをコードする５８０塩基対のＡｖａ：［−ＥｃｏＲエフラグメントをｐＢＧ１４から単離した。キメラ重鎖のｏｍｐ　Ａシグナル配列への正確な融合は、ＡｖａＩ［とＥｃｏＲＩで消化されたｐＳＫ　ｏｍｏＡ中に、このＡｖａＩＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメントを、オリゴヌクレオチドがら組立てられ、ｏｍｐＡシグナル配列の３゛領域とＶ　の５′領域をコードするＤＮＡからなる１２０塩基対フラグメントとともにリゲーションを行い作成した。１２０塩基対フラグメントの配列は次の通りであった。

３　’　ＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＡＡＣＡＣＣＴＣＡＧＡＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＡＣユＴ訂Ｃα込ＣＣＣＣロ動ωいＣＴ正しい配列を含ξクローンをＤＮＡ配列決定で同定し、ｐＳＫ　ｏｍｐＡ−ｃＦｄと命名した。

キメラＦａｂ’の発現には、ｏｍｏＡ−ｃＬｃ融合体をｐｓＫｏｍｏＡがらＸｈＯ■−ＥｃｏＲエフラグメント上で取り出し、５ｌａＩと部分的にＥｃｏＲＩで消化した発現ベクター０ＡＣｔａＣ中にクローン化したく図１７）。ρＡＣｔａｃは、発現プラスミドｐＴＴＱ９（Ａ＋＋＋ｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｗｎａｔｉｏｎａｌ＞のＡｍｐ　選択マーカーおまび１）ＵＣｌ３−誘導複製機能をｏＡＣＹＣ１８４（Ｃｈａｎｇ　ｇ　Ｃｏｈｅｎ、　１９７８．　Ｊ、ＢａｃｔｅｒＩｏｌ、　＋３４：　１１４１−１１５６）のＣｍ　選択マーカーおまび複製機能で置換して構築した（ｐＡＣＴＡＣはＣｍｒ遺云子中に第二のＥｃｏＲ１部位を含むので、部分ＥｃｏＲＩ消化が必要である）。ｔａｃプロモーターに隣接して挿入されだ０ｍ０Ａ−ＣＬＣをもつプラスミドを、制限酵素マツピングとＤＮＡ配列決定によって同定し、ρＭＲＲＯ２４と命名した。

ｏｍｐＡ−ｃＦｄはｐｓＫｏｍｐＡからＸｈｏ　ニーＳｍａ　Ｉフラグメント上で取り出し、５ｌａＩトＰｖｕＩ［で消化した発現ベクターｐＳＰ７３（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中にクローン化し、ρ７に！ＲＯ２７と命名したプラスミドを得た。ついで、ｏｍｐＡ−ｃＦｄ融合体をｐＭＲＲＯ２７からＥｃｏＲＩフラグメントとして取り出し、ＥｃｏＲＩで部分消化したｐＭＲＲＯ２７中にクローン化した。ｔａｃプロモーターからの転写方向に（ｏｍｐＡ− ｃＬｃとともに）ｏｍｐＡ−ｃＦｄをもつクローンを制限酵素マツピングとＤＮＡ配列決定によって同定し、ＤＭＲＲＯ２８と命名した。

ｐＭＲＲＯ２８を大腸菌株ｗ３１１０　＜ＡＴＣＣ株２７３２５）にトランスフオームしだ。

株ｗ３１１０　（ｐＭＲＲＯ２８）は、ｉ、ＳＬのファーメンタ−を用い、選択を維持するためにクロラムフェニコールを加えた培地中で成育させて、プラスミドを保持した。培養液の６００　ｎｍにおける０Ｄ１０において、インデューサーＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように加え、Ａ３Ｂ７Ｆａｂ’遺伝子のｔａｃプロモーターがらの発現を誘発した。この培養液から、誘発後０．３．４．５．６．７および８時間の時点で粗培養上清サンプルを採取し、直接ＣＥＡ結合アッセイを実施しだ。これらのアッセイの結果は、晴乳動物細胞から作成し精製した標準キメラＡ３８７Ｆａｂ′での結果とともに、図１８に示す。大腸菌培養培地中へのキメラＡ３８７Ｆａｂ′の蓄積が明らかである。同一の粗培養培地サンプルについての５Ｏ９−ＰＡＧＥ分析では、Ｆａｂ′重鎖およびＧ鎖（二期待されるサイズの移動性を示す蛋白質が認められた。これらの蛋白質についてのＮ末端アミノ酸配列決定によって、成熟Ａ３Ｂ７重鎖および軽鎖のＮ末端アミノ酸配列を明らかにしたこころ、ｏｍｏＡシグナル配列は両者から正確に切断されていたことを示した。大腸菌培養培地中のキメラＦａｂ’についての評価（０，０，２８０ｎｍの測定、および５ＯＳ−ＰＡＧＥ）を実施したところ、結果は、精製後の収率、３０　ｍｇ／Ｌ以上であることが示唆された。

ＣＤＲグラフトＡ３Ｂ７Ｆａｂ’軽鎖の場合は、大部分の、とｇＬ１変異体およびすべてのＣカッパをコードする６２０塩基対のＨｏｈＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＡＬ４３がら単離しだ。グラフティングされだ軽鎖のｏｍｐ△シグナル配列への正確な融合は、ＨｐｈＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化されだｐＳＫＯｍｆ）Ａ中に、オリゴヌクレオチドから組立てられ、ｏｍｐＡシグナル配列の３′末端とＣＤＲグラフトＶＬの５′末端をコードする６２塩基対フラグメントとともにリゲーションを行い作成した。合成フラグメントの配列は次の通りであった。

ＡＧＣＴＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＡＣ−スＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＧＴＣＴＣＡＧＴＧＴＡＡＧＴＧＴＡＧＧＴＣＡＴＡＧＧＧＴＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＴＧＡＧＴＧＡＧＴＣＴＣＡＧＧＴＴＣＡＴＣＡＧＡＧＴＣＡＣＡＴＴＣＡＣＡＴこＣＡＣＴＡＴＣＣＣＡＴ正しい配列を含むクローンをＤＮＡ配列決定で同定し、ｐＭＲＲＯ３４と命名した。

ＣＤＲグラフトＡ３Ｂ７Ｆａｂ’重鎖遺伝子の場合は、ｇＨ２変異体についでの大部分のＶ　とすべてのＣＨｌおよび（デルタＣＹＳ）蝶番部ドメインをコードする７２０塩基対のＰｖｕ［−ＥｃｏＲエフラグメントをＤＡＬ５０がら単離しだ。このグラフティングされた重鎖のｏｍｏＡシグナル配列への正確な融合は、このＡｖａ、ＴＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ＨｉｎｄｕとＥｃｏＲＩで消化されたｐｓＫｏｍｏＡ中に、オリゴヌクレオチドがら組立てられ、ｏｍｏＡシグナル配列の３′末端とＣＤＲグラフト　の５′末端をコードする極めて短いフラグメントとともにリゲーションを行い作成した。短いアダプターフラグメントの配列は次の通りであった。

５’　ＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧ　３’３′　ＣＴＣＣＡＣＧＴＣ５’ 正しい配列を含むクローンをＤＮＡ配列決定で同定し、ｐＭＲＲＯ３７と命名した。

ＣＤＲグラフトＦａｂ’の発現には、ｏｍｐＡ−ｇＬ１融合体をｐＭＲＲＯ３４からＸｈｏ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩフラグメントとして取り出して、５ｌａＩと部分的にＥｃｏＲＩで消化したｐＡＣｔａｃ中にクローン化した。ｉａＣプロモーターに隣接した。ｍｐＡ　−ｇＬｌをもつクローンを、制限酵素マツピングとＤＮＡ配列決定によって同定して、ｐＭＲＲＯ３８と命名した。ｏｍｏＡ−ｇＨ２融合体はｐＭＲＲＯ３７からＸｈａニーＳｍａ１つラグメントとして取り出し、ＰｖｕＩ［とＥｃｏＲＩで二重消化したｐＳＰ７３中にクローン化し、得られただプラスミドをｐＭＲＲＯ４１と命名した。ついで、ｏｍｐＡ−ｇＨ２融合体をｐＭＲＲＯ４１からＥｃｏＲエフラグメントとして取り出し、ＥｃｏＲ工で部分消化したｐＭＲＲＯ３８中にクローン化した。ｔａｃプロモーターからの転写方向に（ｏｍｏＡ−ｇＬｌとともに）ｏｎ＋ｃ＋Ａ−ｇＨ２融合体をもつクローンを制限酵素マツピングとＤＮＡ配列決定によって同定し、ｐＭＲＲＯ４５と命名した。

ｐＭＲＲ０４５を大腸菌株ｍｌ］１０中にトランスフオームして、得られたｗ３１１０株（ｐＭＲＲＯ４５）を１．ＳＬのファーメンタ−中において成育させた。ＣＤＲグラフトＦａｂ’遺伝子の発現は、キメラＦａｂ’遺伝子についての上述の記載と同様にして誘発した。この培養液から、誘発後１．４．５．６．１１および２２時間の時点で粗培養上清サンプルを採取し、直接ＣＥＡ結合アッセイと収率の評価に使用した。ＣＥＡ結合アッセイの結果は図１９に示す。広原結合において活性な物質の蓄積が認められた。これらの上溝サンプルの０８−ＰＡＧＥ分析では、期待されたサイズの蛋白質の存在が明らかにされ、３０　ｍｇ／Ｌ以上の収率が示唆された。

参考文献ユ、　Ｋｏｈｌ＝　＆　：江１ｓｔａｉｎ、Ｎａｔｕｒａ、２６５，４９５−４９７．　叡７Ｓ。

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３、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｓｃ工ｅｎｃｅ、　２３９．１５３４ −１５３６．１９８８゜４、ＲｉｅｃｈＩ！１ａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａヒｕｒｅ、　３３２．３２３−３２４．１９８８゜５−　Ｑｕｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ主、、　ＵＳＡ、　８６：１００２９−１００３３．１９Ｅ１９紅ｄ誓ｏ　９０１０７８６１゜６、Ｅｈｒｌｉｃｈ、　Ｐ、、　Ｃｏ１１ｅｃｔｅｄ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ工ｍｏｒｕｎｉｔｙ、　！、　ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９０６゜９、　Ｓａｈａｇａｎ　ｅｔ　ａ、１．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、ｌコア、３　１０６６−１０７４゜１０、Ｎ１５ｈｉｘｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５−、４７９９９−１００５．１９８７゜１１、日ａｒｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、互４．　７５−８２．　１９８６゜１４、Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔばｅ、　５４．７５−８２．１９８６゜１７、Ｍｅｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１２．７０３５−７０５６．１９８４゜工ｅ１．　Ｈｏｎうｏ　ｅｔ　ａｌ、Ｃ＝１．Ｌ、ｌ旦、５５９−５ＧＢ、１つ７９゜１９、　Ｍａｘ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｂｉｏｌ−Ｃｈｅｍ、、２互６．　５１１６−５１２０．　１９日１゜２０、Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　ＰＲＡＳ、　７４．５４６３−５４６７、１９７７゜２１．５ｔｅｐｈｅｎｓ　ａｎｄ　Ｃｏｃｋｅｔｔ、　ＮｕＣｌ−Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５−ｔ　１７．７１１０７１９Ｂ９２２、Ｘｒａｗｉｎｋｅｌ　ａｎｄ　ＲａＪ）ｂｉｔｓ、　ＥＫＢＯＪ、、　Ａ、　４０３−４０７．１９８２゜２二！、！’：ｒａ１Ｊ】１ｅｒｅｔａｌ、：コＵＣＬ−Ａｃｘｄｓｎ、ｈ２−ｒ≦’− ２，９４４ｍ−９４４６，−９９！−２４、Ｗｈｉｔｔｌｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｔ、Ｅｎｇ、、１．　６．　４９９−５０５．　１９日７゜２６、Ｃｏ１ｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９Ｂ９）、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４９．１７３Ｂ−１７４５゜２７、Ｃｏｃｋｓｔｔ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、、旦、　３１９−３２５゜２Ｂ、Ｍｏｖｖａ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｍ、、　２５５．２７−２９．１９８０−浄書（内容に変更なし）Ｖ（ドメインのＤＮＡ？３よび蛋白質配デＩＲＧＱ　τ　ｖＬｓＱｓＰＡＩＬｓＡ５ＰＧＥＫＡＲＦＳＧＳＧ５ＧＴＳＹＳＬ丁ｌ５ＲＶＺＡ５Ｂ７キメラ重鎖遺伝子の構築Ｅ　＝　ＥｃｏＲＩ８　＝　ＢａｍＨＩＨ−ＨＩｎｄｌｌｌＢａ　＝　８ａｎｌＡ３Ｂ７キメラ軽鎖遺伝子の構築Ｆｉｇ、　４ｍＬｃ＝　マつス軽鎖ｃＡ５Ｂ７発現用ベクターｃＡ５Ｂ７１ｇＧＪおよびｃＡ５Ｂ７Ｆａｂ’のためのＧＳベクターＡ３Ｂ７ｃＦａｂ’の精製および架橋１１分子量マーカー、非還元２、　Ａ３Ｂ７　ｃＤＦＭ、非還元３、　Ａ３Ｂ７　ｃＦａｂ’、非還元４、　Ａ３Ｂ７　ｃＦａｂ’、還元５、　Ａ５Ｂ７ｃＤＦＭ、還元１０’−２０％アクリルアミド勾配ゲル、ターマシーブルー染色ｉｎ　７ −ｌ　ロ　Ｏ。

（１。　。　。

ＣＥＡ結合Ａ３Ｂ７キメラ／グラフトハイフリットＣＥＡ結合Ａ５８７ｇＨｇＬｇＡ５８７Ｆａｂ’発現用ベクターｇＡ５８７Ｃ）ｔＯ細胞発現用ベクターポリリンカーＡ３８７Ｆａｂ’大腸菌発現プラスミドの地図Ａ３Ｂ７キメラＦａｂ’含有大ｌｌ！菌上清のＣＥＡ結合アッセイ希釈係数Ｆｉｇ、　１８希釈係数Ｆｉｇ、　１９要約書本発明は、大体抗体分子（ＨＡＭ）において、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対しで特異性を有し、可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一つはマウスモノクローナル抗体Ａ３８７　（Ａ５Ｂ７ＭＡｂ）に由来し、ＲＡＭの残りの免疫グロブリン部分はヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を有する大体抗体を提供する。ＨＡＭは、キメラ人体抗体であってもＣＤＲグラフト人化人体折体ってもよく、好ましくは組換えＤＮＡ技術によって製造される。ＨＡＭは１ｎｖｉｖｏ診断または治療に有用である。

１−事件の表示ＣＤＲグラフト抗−ＣＥＡ抗体およびその製造方法３、補正をする者ｍ　ｓ＋　ａ　′）ｍ係　特許出願人氏名（名称）セルチック　リミテッド４ｏ代理人６、−ＰＰＭ正により土曽カロする言胃求項の数７−補正の対象図面の翻訳文国際調査報告１Ｎ１１１１１１１１゜、、、□。ｐｌｉ＋＋＋ｉ。、。ＰＣＴ／ＧＢ　９１１０１１０８国際調査報告ＰＣＴ／ＧＢ　９１１０１１０８

Claims

【特許請求の範囲】

１．人化抗体分子（ＨＡＭ）におして、癌胎児性抗原に対して特異性き有し、可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくこも一つはマウスモノクローナル抗体Ａ５Ｂ７（Ａ５Ｂ７ＭＡｂ）に由来し、ＨＡＭの残りの免疫グロブリン部分はヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合部位き有する人化抗体。
２．キメラ人化抗体である「請求項１」記載のＨＡＭ。
３．ＣＤＲグラフト人化抗体である「請求項１」記載のＨＡＭ。
４．相換えＤＮＡ技術によつて製造される「請求項１〜３」のいずれかに記載のＨＡＭ。
５．完全な抗体分子、またはＦａｂ、Ｆａｂ′、（Ｆａｂ′）２もしくはＦＶフラグメント、または単一鎖抗体フラグメントから構成される「請求項１〜４」のいずれかに記載のＨＡＭ。
６．それにエフェクターまたはレポーター分子が結合した「請求項１〜５」のいずれかに記載のＨＡＭ。
７．重鎖および／または軽鎖は、ＬＡＹ、ＰＯＭ、Ｔ∪Ｒ、ＴＥＩ、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩまたはＥＵ可変領域フしームワーク配列から構成される「請求項３〜６」のいずれかに記載のＣＤＲグラフトＨＡＭ。
８．重鎖および軽鎖両者において、ＬＡＹ可変領域フレームワーク配列から構成される「請求項７」記載のＣＤＲグラフトＨＡＭ。
９．軽鎖可変領域の位置２４〜３４（ＣＤＲ１）、５０〜５６（ＣＤＲ２）および９２〜９６または８９〜９７（ＣＤＲ３）にＡ５Ｂ７ＣＤＲを有する「請求項３〜８」のいずれかに記載のＣＤＲグラフトＨＡＭ。
１０．軽鎖可変領域の位置１、２および／または３、４６、４７、４９、６０、７０、８４、８５および８７の１つまたは２以上好ましくは少なくとも位置４６および４７にＡ５Ｂ７残基を有する「請求項３〜９」のいずれかに記載のＣＤＲグラフトＨＡＭ。
１１．重鎖可変領域の位置２４〜３５または２６〜３５（ＣＤＲ１）、５０〜６５（ＣＤＲ２）および９５〜１００または９４〜１００（ＣＤＲ３）におして、Ａ５Ｂ７ＣＤＲを有する「請求項３〜１０」のいずれがに記載のＣＤＲグラフトＨＡＭ。
１２．重鎖可変領域の位置２３および／または２４、７１および／または７３、４８および／または４９、６９、７６および／または７８、８０、８８および／または９１ならびに６の１つまたは２以上にＡ５Ｂ７残基を有する「請求項３〜１１」のいずれかに記載のＣＤＲグラフトＨＡＭ。
１３．軽鎖の位置１、２、３、４、４６および７１、同時にとくに位置２１、４７および７３、重鎖の位置１、２４、４８、４９、７２、７３、７６および９３、同時にとくに位置８２ｂおよび８６においてＡ５Ｂ７残基からなる「請求項８」記載のＣＤＲグラフトＨＡＭ。
１４．軽鎖の位置２４〜３４（ＣＤＲ１）、５０〜５６（ＣＤＲ２）および８９〜９７（ＣＤＲ３）、ならびに重鎖の位置２６〜３５（ＣＤＲ１）、５０〜６５（ＣＤＲ２）および９５〜１０２（ＣＤＲ３）において、Ａ５Ｂ７ＣＤＲを有する「請求項８」記載のＣＤＲグラフトＨＡＭ。
１５．「請求項１〜１４」のいずれかに記載のＨＡＭを医薬的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と配合してなる治療または診断用組成物。
１６．「請求項１５」記載の治療または診断用組成物の有効量をヒト対象に投与することからなる治療または診断方法。
１７．「請求項１〜１４」のいずれかに記載のＨＡＭの製造方法において、（ａ）可変ドメインＣＤＲの少なくとも１個がＡ５Ｂ７ＭＡｂから誘導され、抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンから誘導される可変ドメインよりなる抗体重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを、発現ベクター中に生成させ、（ｂ）可変ドメインＣＤＲの少なくとも１個がＡ５Ｂ７ＭＡｂから誘導され、抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンから誘導される可変ドメインよりなる相補性抗体軽鎖または重鎖きコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを、発現ベクター中に生成させ、（ｃ）そのベクターまたは各ベクターで宿主細胞をトランスフエクトし、ついで（ｄ）トランスフエクトした細胞系を培養してＨＡＭを産生させることを特徴とする方法。
１８．重鎖および軽鎖コード配列は同一のベクター上に存在する「請求項１７」記載の方法。
１９．重鎖および軽鎖コード配列は別個のベクター上に存在する「請求項１７」記載の方法。
２０．抗体フラグメントを産生させる宿主細胞は細菌宿主細胞である「請求項１７〜１９」のいずれかに記載の方法。
２１．宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である「請求項１７〜１９」のいずれかに記載の方法。