JP2966924B2 - キメラ抗―ｃｅａ抗体 - Google Patents
キメラ抗―ｃｅａ抗体Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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Description
【発明の詳細な説明】 本出願は、1989年７月26日に出願された係属中の米国
特許07385,102号の継続出願である。
特許07385,102号の継続出願である。
癌胎児抗原（CEA）はヒト大腸癌（colon adenocarci
noma）のインビトロ免疫診断に広く使用されている。本
発明はキメラ抗−CEA抗体に関する。
noma）のインビトロ免疫診断に広く使用されている。本
発明はキメラ抗−CEA抗体に関する。
発明の背景 CEAはヒト腫瘍関連抗原の中で最も性質が解明されて
いるもので、ヒト大腸癌のインビトロ診断に最も広く使
用されている腫瘍マーカーである。しかしながら、CEA
は定常交叉−反応性抗原（NCA）および胆汁グリコプロ
テイン（BGPI）を含む、密接に関連した遺伝子のファミ
リーの一つである。
いるもので、ヒト大腸癌のインビトロ診断に最も広く使
用されている腫瘍マーカーである。しかしながら、CEA
は定常交叉−反応性抗原（NCA）および胆汁グリコプロ
テイン（BGPI）を含む、密接に関連した遺伝子のファミ
リーの一つである。
腫瘍マーカーに対する多くの抗体は、関連抗原と交叉
反応する。従って、インビトロおよびインビボ診断およ
び治療のための抗原−特異的モノクローナル抗体（MA
B）の開発のためには、関連交叉−反応性抗原の数、性
質および生物学的分布に関する十分な知識が要求され
る。この要求のために、許容できる腫瘍マーカー（大腸
癌の場合には、CEA、CA、17−1AおよびTAG−72を含む）
の数は制限されていた。
反応する。従って、インビトロおよびインビボ診断およ
び治療のための抗原−特異的モノクローナル抗体（MA
B）の開発のためには、関連交叉−反応性抗原の数、性
質および生物学的分布に関する十分な知識が要求され
る。この要求のために、許容できる腫瘍マーカー（大腸
癌の場合には、CEA、CA、17−1AおよびTAG−72を含む）
の数は制限されていた。
使用すべきMABについて、標的抗原および関連抗原に
対するその特異性及び親和性に関する、細心な免疫化学
的同定が要求される。重篤な副作用の可能性の危険を防
止するために、関連抗原と交叉反応性のモノクローナル
抗体の全身的投与は避ける必要がある。
対するその特異性及び親和性に関する、細心な免疫化学
的同定が要求される。重篤な副作用の可能性の危険を防
止するために、関連抗原と交叉反応性のモノクローナル
抗体の全身的投与は避ける必要がある。
ネズミMAB T84.66（ATCC受託番号No.HB 8747）IgG1,
kは高い親和定数（2.6×1010M-1）を示し、CEA遺伝子フ
ァミリーの他のメンバーとの交叉反応性を有しない。従
って、T84.66は免疫検出および免疫治療の研究に理想的
である。
kは高い親和定数（2.6×1010M-1）を示し、CEA遺伝子フ
ァミリーの他のメンバーとの交叉反応性を有しない。従
って、T84.66は免疫検出および免疫治療の研究に理想的
である。
T84.66を含めて、ヒトの腫瘍の検出および治療へのネ
ズミMABの使用は、患者が異種イムノグロブリンに対す
る免疫応答のために制限される。ヒト抗−マウス抗体
（HAMA）の生産が、MABの効果の減少および患者の急性
および慢性アレルギー症状の発生の可能性につながる。
Levyら,Ann.Rev.Med.34:107−116（1983）;Houghtonら,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:1242−1246（1985）および
Searsら,J.Biol.Resp.Modifiers,3:138−150（1984）参
照。
ズミMABの使用は、患者が異種イムノグロブリンに対す
る免疫応答のために制限される。ヒト抗−マウス抗体
（HAMA）の生産が、MABの効果の減少および患者の急性
および慢性アレルギー症状の発生の可能性につながる。
Levyら,Ann.Rev.Med.34:107−116（1983）;Houghtonら,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:1242−1246（1985）および
Searsら,J.Biol.Resp.Modifiers,3:138−150（1984）参
照。
組換えDNA技術は、キメラヒト／非ヒト遺伝子から、
上記問題を克服するために有用なMABを生産する魅力的
方法を提供する。さらに、組換え抗体遺伝子は、更に遺
伝子工学処理して親和定数やエフェクター機能を変更す
ることの可能な、修飾可能な抗体源を提供する。種々の
方法を用いて、腫瘍関連抗原に対する抗体キメラをコー
ドする数々の抗体遺伝子およびその誘導体が製造され
た。Sahagenら,J.Immunol.,137:1066−1074（1986）;Su
nら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:214−218（1987）;Nis
himuraら,Cancer Research,47:999−1005（1987）;Liu
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:3439−3443（1987）。
上記問題を克服するために有用なMABを生産する魅力的
方法を提供する。さらに、組換え抗体遺伝子は、更に遺
伝子工学処理して親和定数やエフェクター機能を変更す
ることの可能な、修飾可能な抗体源を提供する。種々の
方法を用いて、腫瘍関連抗原に対する抗体キメラをコー
ドする数々の抗体遺伝子およびその誘導体が製造され
た。Sahagenら,J.Immunol.,137:1066−1074（1986）;Su
nら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:214−218（1987）;Nis
himuraら,Cancer Research,47:999−1005（1987）;Liu
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:3439−3443（1987）。
Beidlerら,J.Immunol.,141:4053−4060（1988）は、C
EAに特異的なネズミハイブリドーマCEM231.6.7の可変軽
鎖および可変重鎖領域を用いたネズミ／ヒトキメラ抗体
の構築を報告した。親のハイブリドーマは５×109M-1の
アフィニティーで抗原に結合し、キメラのサブクローン
は２×1010M-1のアフィニティーおよび１×1010M-1のア
フィニティーで抗原に結合した。この報告においては交
叉反応性の欠如を含めてのキメラの臨床的有用性は証明
されていない。
EAに特異的なネズミハイブリドーマCEM231.6.7の可変軽
鎖および可変重鎖領域を用いたネズミ／ヒトキメラ抗体
の構築を報告した。親のハイブリドーマは５×109M-1の
アフィニティーで抗原に結合し、キメラのサブクローン
は２×1010M-1のアフィニティーおよび１×1010M-1のア
フィニティーで抗原に結合した。この報告においては交
叉反応性の欠如を含めてのキメラの臨床的有用性は証明
されていない。
発明の概要 本発明はMAB T84.66、をコードする遺伝子のクロー
ニングおよび該遺伝子、軽鎖および重鎖の可変領域のア
ミノ酸配列決定、並びにT84.66可変領域遺伝子およびヒ
ト定常領域遺伝子を用いたマウス／ヒトキメラIgG−１
抗体遺伝子の構築に関する。この遺伝子構築物は、エレ
クトロフォレーションによりネズミミエローマ細胞（Sp
2/0）に、そしてリポフェクション（lipofection）によ
ってCHO細胞にトランスフェクションされた。このキメ
ラ抗体は、ネズミハイブリドーマ細胞ラインにより産生
されるT84.66免疫グロブリンのそれと類似の特異性およ
び親和性をCEAに対して示した。
ニングおよび該遺伝子、軽鎖および重鎖の可変領域のア
ミノ酸配列決定、並びにT84.66可変領域遺伝子およびヒ
ト定常領域遺伝子を用いたマウス／ヒトキメラIgG−１
抗体遺伝子の構築に関する。この遺伝子構築物は、エレ
クトロフォレーションによりネズミミエローマ細胞（Sp
2/0）に、そしてリポフェクション（lipofection）によ
ってCHO細胞にトランスフェクションされた。このキメ
ラ抗体は、ネズミハイブリドーマ細胞ラインにより産生
されるT84.66免疫グロブリンのそれと類似の特異性およ
び親和性をCEAに対して示した。
図面の説明 第１図Ａは、T84.66モノクローナル抗体のカッパ軽鎖
の配列である。
の配列である。
第１図ＢはT84.66モノクローナル抗体のガンマ重鎖の
配列である。
配列である。
第２図ＡはキメラT84.66カッパ遺伝子の直接発現のた
めのプラスミドの構築を示す。
めのプラスミドの構築を示す。
第２図ＢはキメラT84.66ガンマ遺伝子の直接発現のた
めのプラスミドの構築を示す。
めのプラスミドの構築を示す。
第３図は分泌されたキメラ抗−CEA抗体の非還元条件
下でのSDS PAGEのウェスタンブロットである。パネル
ＡはCHO細胞上清であり、レーン１はヒトIgGスタンダー
ド；レーン２はCHO上清である。パネルＢはSp2/0トラン
スフェクトーマの上清であり、レーン１はクローン1Fの
腹水；レーン２は組織培養のクローン1Fの上清である。
検出に用いた抗体は抗−ハイマン（hyman）Fc抗体−酵
素コンジュゲートである。パネルＢのレーン３はクロー
ン1Fの腹水のコマジーブルーによる染色結果である。
下でのSDS PAGEのウェスタンブロットである。パネル
ＡはCHO細胞上清であり、レーン１はヒトIgGスタンダー
ド；レーン２はCHO上清である。パネルＢはSp2/0トラン
スフェクトーマの上清であり、レーン１はクローン1Fの
腹水；レーン２は組織培養のクローン1Fの上清である。
検出に用いた抗体は抗−ハイマン（hyman）Fc抗体−酵
素コンジュゲートである。パネルＢのレーン３はクロー
ン1Fの腹水のコマジーブルーによる染色結果である。
第４図は分泌されたキメラ抗−CEA抗体の還元条件下
でのSDS PAGEのウェスタンブロットである。パネルＡ
のレーン１はクローン1Fの腹水；レーン２はクローン9H
の腹水；レーン３はクローン1Fの上清であり、ブロット
は抗−ヒトk,gポリクローナル抗体を用いて染色した。
パネルＢはゲルのコマジーブルー染色の結果であり；レ
ーン１はクローン1Fの腹水であり、レーン２はクローン
9Hの腹水である。
でのSDS PAGEのウェスタンブロットである。パネルＡ
のレーン１はクローン1Fの腹水；レーン２はクローン9H
の腹水；レーン３はクローン1Fの上清であり、ブロット
は抗−ヒトk,gポリクローナル抗体を用いて染色した。
パネルＢはゲルのコマジーブルー染色の結果であり；レ
ーン１はクローン1Fの腹水であり、レーン２はクローン
9Hの腹水である。
材料および方法 ゲノムライブラリーの構築 ハイブリドーマDNAは標準的方法で抽出し（マニアチ
ス T.ら，「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラ
トリー・マニュアル（Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual）」〔コールド・スプリング・ハーバー（Co
ld Spring Harbor），ニューヨーク,1982〕；および
メーゼ（Meese）,E.ら,Gene Anal.Techn.4:45−49（19
87）を参照）、Mbo Iでの部分消化またはEcoR Iでの完
全な制限消化を行った。部分消化したDNAは蔗糖濃度勾
配で分画し（上記メーゼらのGene Anal.Techn.を参
照）、15−20kbのフラグメントをΛ−FIX（ストラタジ
ーン（Stratagene），サンジエゴ,CA）中に、製造元の
指示に従ってクローン化した。EcoR I消化DNAは、調製
用0.7％LMTアガロースゲル（BRL）で泳動した。適当なD
NAフラグメントを熱フェノール/CHCl3でゲルから抽出し
て精製し、次にラムダ−ZAP（ストラタジーン）のEcoR
I部位に連結した。インビトロパッケージング反応は、
ギガパックパッケージグエクストラクツ（Gigapack pa
ckaging extracts）（ストラタジーン）を用いて行っ
た。
ス T.ら，「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラ
トリー・マニュアル（Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual）」〔コールド・スプリング・ハーバー（Co
ld Spring Harbor），ニューヨーク,1982〕；および
メーゼ（Meese）,E.ら,Gene Anal.Techn.4:45−49（19
87）を参照）、Mbo Iでの部分消化またはEcoR Iでの完
全な制限消化を行った。部分消化したDNAは蔗糖濃度勾
配で分画し（上記メーゼらのGene Anal.Techn.を参
照）、15−20kbのフラグメントをΛ−FIX（ストラタジ
ーン（Stratagene），サンジエゴ,CA）中に、製造元の
指示に従ってクローン化した。EcoR I消化DNAは、調製
用0.7％LMTアガロースゲル（BRL）で泳動した。適当なD
NAフラグメントを熱フェノール/CHCl3でゲルから抽出し
て精製し、次にラムダ−ZAP（ストラタジーン）のEcoR
I部位に連結した。インビトロパッケージング反応は、
ギガパックパッケージグエクストラクツ（Gigapack pa
ckaging extracts）（ストラタジーン）を用いて行っ
た。
プローブ、プライマーおよび配列決定 T84.66のカッパ軽鎖遺伝子のプラックスクリーニング
（Benton,W.D.ら,Science,196:180−182（1977））は、
ネズミCk領域遺伝子を代表するpK94からの800pb Pst I
cDNAフラグメントを用いて行った。
（Benton,W.D.ら,Science,196:180−182（1977））は、
ネズミCk領域遺伝子を代表するpK94からの800pb Pst I
cDNAフラグメントを用いて行った。
ネズミ重鎖遺伝子のスクリーニングは、マウスエンハ
ンサー領域からの991塩基対（bp）のXba Iフラグメント
（Gilliesら,Cell,33:717−728（1983）を参照）、ハイ
ブリドーマCEA.66−E3の重鎖定常領域遺伝子の1.5キロ
ベース（kb）のcDNAフラグメント（Cabillyら,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,81:3273−3277（1984））、およびSp2/
0からの錯誤を含んで再配列された重鎖を含む5.5kbのEc
oR Iフラグメントを用いて行った。
ンサー領域からの991塩基対（bp）のXba Iフラグメント
（Gilliesら,Cell,33:717−728（1983）を参照）、ハイ
ブリドーマCEA.66−E3の重鎖定常領域遺伝子の1.5キロ
ベース（kb）のcDNAフラグメント（Cabillyら,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,81:3273−3277（1984））、およびSp2/
0からの錯誤を含んで再配列された重鎖を含む5.5kbのEc
oR Iフラグメントを用いて行った。
陽性クローンを第１表に示すＪ−領域オリゴヌクレオ
チドのパネルへのハイブリダイゼーションによりさらに
同定した。
チドのパネルへのハイブリダイゼーションによりさらに
同定した。
オリゴヌクレオチドＪκ１ないしＪκ５は、ネズミカ
ッパ軽鎖遺伝子における特異的VJ再配列の同定のために
用い、そしてＪκrearrは活性およびジャームラインコ
ンフィギュレーション遺伝子（GENbank entry J022
8）の識別のために用いた。オリゴヌクレオチドκ138
は、T84.66融合相手細胞ラインSp2/0中の、錯誤再配列
されたカッパ遺伝子κ138（Cabillyら,Gene,40:157−16
1（1985））のスクリーニングのために用いた。オリゴ
ヌクレオチドＪγ１ないしＪγ４は、ネズミ重鎖遺伝子
のVDJ再配列を同定するために用いられ、プローブＪγr
earrは活性コンフィギュレーションとジャームラインコ
ンフィギュレーション（GENbank entry J00440）との
識別のために用いた。さらに、いくつかのオリゴヌクレ
オチドプローブを、両T84.66遺伝子のＮ末端について、
DNA配列決定データに従って、プロモーター領域の上流
の同定を可能にするように設計した。カッパ鎖遺伝子お
よびラムダ鎖遺伝子に対するこれらの配列は、それぞ
れ、５′TGGGTCAGCACAATGTCおよび５′CTGCTGCAGCTGAAC
CTCであった。
ッパ軽鎖遺伝子における特異的VJ再配列の同定のために
用い、そしてＪκrearrは活性およびジャームラインコ
ンフィギュレーション遺伝子（GENbank entry J022
8）の識別のために用いた。オリゴヌクレオチドκ138
は、T84.66融合相手細胞ラインSp2/0中の、錯誤再配列
されたカッパ遺伝子κ138（Cabillyら,Gene,40:157−16
1（1985））のスクリーニングのために用いた。オリゴ
ヌクレオチドＪγ１ないしＪγ４は、ネズミ重鎖遺伝子
のVDJ再配列を同定するために用いられ、プローブＪγr
earrは活性コンフィギュレーションとジャームラインコ
ンフィギュレーション（GENbank entry J00440）との
識別のために用いた。さらに、いくつかのオリゴヌクレ
オチドプローブを、両T84.66遺伝子のＮ末端について、
DNA配列決定データに従って、プロモーター領域の上流
の同定を可能にするように設計した。カッパ鎖遺伝子お
よびラムダ鎖遺伝子に対するこれらの配列は、それぞ
れ、５′TGGGTCAGCACAATGTCおよび５′CTGCTGCAGCTGAAC
CTCであった。
プローブの32P標識およびサザンブロットおよびドッ
トブロットハイブリダイゼーションは、マニアチス T.
らにより「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラト
リー・マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory
Manual）」〔コールド・スプリング・ハーバー（Cold
Spring Harbor），ニューヨーク,1982〕に、およびF
einberg,A.P.らによりAnal.Biochem.132:6−13（1983）
に記載されたようにして行った。両ストランドの可変領
域遺伝子のDNA配列分析は、Sangerのダイデオキシヌク
レオチド鎖停止法により、両ストランドについて行っ
た。
トブロットハイブリダイゼーションは、マニアチス T.
らにより「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラト
リー・マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory
Manual）」〔コールド・スプリング・ハーバー（Cold
Spring Harbor），ニューヨーク,1982〕に、およびF
einberg,A.P.らによりAnal.Biochem.132:6−13（1983）
に記載されたようにして行った。両ストランドの可変領
域遺伝子のDNA配列分析は、Sangerのダイデオキシヌク
レオチド鎖停止法により、両ストランドについて行っ
た。
第１図ＡおよびＢは軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子の配
列の結果である。
列の結果である。
第１図ＡおよびＢにおいて下線を引いたヌクレオチド
は、プロモーター領域である可能性の部分である。Berg
manら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:7041−7045（1984）
およびEatonら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7634−7638
（1987）を参照。開始コドンは太字で示されている。下
線を引いたアミノ酸は蛋白質配列データをトリプシン消
化ペプチドの分析から得た部分を示す。二重線を引いた
部分は補体決定領域である。
は、プロモーター領域である可能性の部分である。Berg
manら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:7041−7045（1984）
およびEatonら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7634−7638
（1987）を参照。開始コドンは太字で示されている。下
線を引いたアミノ酸は蛋白質配列データをトリプシン消
化ペプチドの分析から得た部分を示す。二重線を引いた
部分は補体決定領域である。
キメラカッパ遺伝子の構築 ラムダ−FIXライブラリーからの陽性クローンは、ブ
ルースクライブ（Bluescribe）プラスミドおよびブルー
スクリプト（Bluescript）プラスミド（ストラタジー
ン）にサブクローニングした。キメラカッパ遺伝子の構
築のため、ブルースクリプトベクターは、ミュータジー
ンシステム（MutaGene System）（バイオラッド）を用
いて、部位特異的突然変異により修飾した。具体的に
は、アンピシリン耐性遺伝子中に存在する唯一のXmn I
部位を、サイレントミューテーションによってベクター
から削除した。この突然変異オリゴヌクレオチドの配列
は、５′GAAGAＧCGTTTTCCAATGであった。ここでの置換
された塩基は太字と下線で示されている。ブルースクリ
プト中での組み立てののち（第２図Ａ）、完成したキメ
ラ遺伝子は発現ベクターpcDneo（Chen,C.ら,Mol.Cell.B
iol.,7:2745−2752（1987）参照）中に移した。トラン
スフェクションに使用したDNAは、ToneguzzoらによりPr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,83:3496−3499（1986）に記載さ
れたようにして精製し、スーパーコイル状DNAとしてま
たはCla Iでの制限消化ののちにトランスフェクション
に用いた。
ルースクライブ（Bluescribe）プラスミドおよびブルー
スクリプト（Bluescript）プラスミド（ストラタジー
ン）にサブクローニングした。キメラカッパ遺伝子の構
築のため、ブルースクリプトベクターは、ミュータジー
ンシステム（MutaGene System）（バイオラッド）を用
いて、部位特異的突然変異により修飾した。具体的に
は、アンピシリン耐性遺伝子中に存在する唯一のXmn I
部位を、サイレントミューテーションによってベクター
から削除した。この突然変異オリゴヌクレオチドの配列
は、５′GAAGAＧCGTTTTCCAATGであった。ここでの置換
された塩基は太字と下線で示されている。ブルースクリ
プト中での組み立てののち（第２図Ａ）、完成したキメ
ラ遺伝子は発現ベクターpcDneo（Chen,C.ら,Mol.Cell.B
iol.,7:2745−2752（1987）参照）中に移した。トラン
スフェクションに使用したDNAは、ToneguzzoらによりPr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,83:3496−3499（1986）に記載さ
れたようにして精製し、スーパーコイル状DNAとしてま
たはCla Iでの制限消化ののちにトランスフェクション
に用いた。
キメラガンマ遺伝子の構築 ラムダ−ZAPライブラリーからの陽性クローンをサブ
クローニングし、さらにプライマーとしてＪγ４−およ
びＮ末端重鎖オリゴヌクレオチドを用いたDNA配列決定
で同定した。キメラT84.66重鎖遺伝子は、ブルースクリ
プト中で組み立て、そしてXho I/Not Iフラグメントと
してpcDneoのSal I部位に、ブラント末端ライゲーショ
ンで、再クローニングした。トランスフェクションはス
ーパーコイル状DNAまたはCla I制限消化DNAとして行っ
た。
クローニングし、さらにプライマーとしてＪγ４−およ
びＮ末端重鎖オリゴヌクレオチドを用いたDNA配列決定
で同定した。キメラT84.66重鎖遺伝子は、ブルースクリ
プト中で組み立て、そしてXho I/Not Iフラグメントと
してpcDneoのSal I部位に、ブラント末端ライゲーショ
ンで、再クローニングした。トランスフェクションはス
ーパーコイル状DNAまたはCla I制限消化DNAとして行っ
た。
Sp2/0細胞およびCHO細胞のトランスフェクションおよび
培養 キメラの軽鎖および重鎖発現プラスミドは、エレクト
ロポレーション（Potter,H.,Anal.Biochem.174:361−37
3（1988）参照）によりSp2/0細胞中へ、そしてリポフェ
クション（Felgnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7413
−7417（1987）参照）によりCHO細胞中へ、コトランス
フェクションさせた。線状化した各プラスミド20μｇ
を、容量0.8mlで、0.7mMリン酸ナトリウム/20mM HEPES
/6mMグルコース中の1.5×106のSp2/0細胞に加えた。細
胞を４℃で10分間インキュベートし、200Vおよび900μ
Ｆにおける100μ秒のパルス１回でエレクトロポレーシ
ョンを行った。エレクトロポレーションを行った細胞を
５％CO2中で37℃において、10％FCSを添加したOpti−ME
M培地（Gibco）中で48時間インキュベートし、続いて80
0μg/mlの（G418）（Gibco）を含む選択条件下で２週間
増殖させた。20μｇのスーパーコイル状プラスミドを、
Lipofectin（BRL）を用いて製造元の指示書に従ってCHO
細胞に、コトランスフェクションさせた。細胞を37℃お
よび５％CO2で、ハムF12培地中で24時間インキュベート
し、そののち10％FCSを含有する培地を添加した。さら
に48時間ののち、細胞をG418を800μg/ml含む選択培地
（ハムF12）に移した。２週間の選択の後、細胞上清の
抗体生産をEIAによりスクリーニングした。
培養 キメラの軽鎖および重鎖発現プラスミドは、エレクト
ロポレーション（Potter,H.,Anal.Biochem.174:361−37
3（1988）参照）によりSp2/0細胞中へ、そしてリポフェ
クション（Felgnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7413
−7417（1987）参照）によりCHO細胞中へ、コトランス
フェクションさせた。線状化した各プラスミド20μｇ
を、容量0.8mlで、0.7mMリン酸ナトリウム/20mM HEPES
/6mMグルコース中の1.5×106のSp2/0細胞に加えた。細
胞を４℃で10分間インキュベートし、200Vおよび900μ
Ｆにおける100μ秒のパルス１回でエレクトロポレーシ
ョンを行った。エレクトロポレーションを行った細胞を
５％CO2中で37℃において、10％FCSを添加したOpti−ME
M培地（Gibco）中で48時間インキュベートし、続いて80
0μg/mlの（G418）（Gibco）を含む選択条件下で２週間
増殖させた。20μｇのスーパーコイル状プラスミドを、
Lipofectin（BRL）を用いて製造元の指示書に従ってCHO
細胞に、コトランスフェクションさせた。細胞を37℃お
よび５％CO2で、ハムF12培地中で24時間インキュベート
し、そののち10％FCSを含有する培地を添加した。さら
に48時間ののち、細胞をG418を800μg/ml含む選択培地
（ハムF12）に移した。２週間の選択の後、細胞上清の
抗体生産をEIAによりスクリーニングした。
トランスフェクトーマのクローンを５％CO2中で、10
％FCSを含むOpti−MEM中で37℃で培養した。いくつかの
クローンを血清不含培地（Excell−300,J.R.Scientifi
c）に訓化させた。CHO細胞は10％FCSを含有するハムF12
培地（Gibco）中で、５％CO2および37℃の下に培養し
た。Opti−MEM中の細胞５×106をヌードマウスに腹腔内
注射して、腹水癌を生じさせ;3〜４週間後に腹水を収穫
し、抗体をプロテインＡ−セファロースカラム（バイオ
ラッド）で精製した。
％FCSを含むOpti−MEM中で37℃で培養した。いくつかの
クローンを血清不含培地（Excell−300,J.R.Scientifi
c）に訓化させた。CHO細胞は10％FCSを含有するハムF12
培地（Gibco）中で、５％CO2および37℃の下に培養し
た。Opti−MEM中の細胞５×106をヌードマウスに腹腔内
注射して、腹水癌を生じさせ;3〜４週間後に腹水を収穫
し、抗体をプロテインＡ−セファロースカラム（バイオ
ラッド）で精製した。
キメラ抗体発現のEIA マイクロタイターウエル（Costar 2596）を炭酸バッ
ファー中の２μg/mlのCEA液0.1mlで、37℃で４時間コー
ティングし、0.075Mのリン酸緩衝化食塩水（PBS）で洗
浄し、PBS中の１％ウシ血清アルブミン（BSA）で、室温
にて一夜ブロックし、そしてPBSで洗浄した。細胞上清5
0μｌを各ウェルに添加し、37℃で90分間インキュベー
トし、洗浄し、そして100μｌのヤギ抗−ヒトγ鎖−ア
ルカリホスファターゼ結合物（TAGO＃4600）、ヤギ抗−
ヒトκ鎖結合物（TAGO＃2496）または抗−ヒトγ，κ−
鎖結合物（TAGO＃4600）とともにインキュベートした。
このプレートを37℃90分間インキュベートしたのち、エ
タノールアミンバッファーで洗浄し、100μｌのｐ−ニ
トロフェニルホスフェート基質（Sigma）とともに37℃
で30分間インキュベートした。反応は3NのNaOHを20μｌ
加えて停止させ、吸収は410nmで読み取った。
ファー中の２μg/mlのCEA液0.1mlで、37℃で４時間コー
ティングし、0.075Mのリン酸緩衝化食塩水（PBS）で洗
浄し、PBS中の１％ウシ血清アルブミン（BSA）で、室温
にて一夜ブロックし、そしてPBSで洗浄した。細胞上清5
0μｌを各ウェルに添加し、37℃で90分間インキュベー
トし、洗浄し、そして100μｌのヤギ抗−ヒトγ鎖−ア
ルカリホスファターゼ結合物（TAGO＃4600）、ヤギ抗−
ヒトκ鎖結合物（TAGO＃2496）または抗−ヒトγ，κ−
鎖結合物（TAGO＃4600）とともにインキュベートした。
このプレートを37℃90分間インキュベートしたのち、エ
タノールアミンバッファーで洗浄し、100μｌのｐ−ニ
トロフェニルホスフェート基質（Sigma）とともに37℃
で30分間インキュベートした。反応は3NのNaOHを20μｌ
加えて停止させ、吸収は410nmで読み取った。
キメラMABの定量 マイクロタイタープレートを、HPBS中の10μg/mlのヤ
ギ抗−ヒトFc（Cappel 0601−0101）で、37℃にて４時
間コーティングし、PBS中の10％BSAで、室温にて一夜ブ
ロックした。50μｌの細胞懸濁液を各ウェルに添加し、
37℃で90分間インキュベートし、洗浄し、そして100μ
ｌのヤギ抗−ヒトFc（Cappel 8601−0121）とともにイ
ンキュベートした。アッセイの他の条件は上記同様であ
る。ヤギ抗−ヒトFc結合物は、予めマウスIgGアフィニ
ティーカラム（Cappel 7011−080）を通過させて吸収
した。標準曲線のためのヒトIgGは２−1000ng/mlの範囲
で用いた。
ギ抗−ヒトFc（Cappel 0601−0101）で、37℃にて４時
間コーティングし、PBS中の10％BSAで、室温にて一夜ブ
ロックした。50μｌの細胞懸濁液を各ウェルに添加し、
37℃で90分間インキュベートし、洗浄し、そして100μ
ｌのヤギ抗−ヒトFc（Cappel 8601−0121）とともにイ
ンキュベートした。アッセイの他の条件は上記同様であ
る。ヤギ抗−ヒトFc結合物は、予めマウスIgGアフィニ
ティーカラム（Cappel 7011−080）を通過させて吸収
した。標準曲線のためのヒトIgGは２−1000ng/mlの範囲
で用いた。
抗CEA活性は、T84.66E3抗体酵素結合物を用いた、改
良二重MABEIA（Roche）で定量した。CEA標準品は、T84.
66抗体酵素結合物の添加前に、次第に増加する量のT84.
66E3抗体と、予備インキュベートした。得られたインヒ
ビションカーブ（第５図）を、キメラ発現系での抗−CE
A活性の量の定量に用いた。
良二重MABEIA（Roche）で定量した。CEA標準品は、T84.
66抗体酵素結合物の添加前に、次第に増加する量のT84.
66E3抗体と、予備インキュベートした。得られたインヒ
ビションカーブ（第５図）を、キメラ発現系での抗−CE
A活性の量の定量に用いた。
キメラMABの蛋白質同定 血清不含培地からの培養上清を、セントリコン（cent
ricon−10）（Amicon）で５〜10倍に濃縮した。濃縮上
清または腹水からの精製MABを、SDSゲル電気泳動（Laem
li,U.K.,Nature 227:680−685（1970）を参照）によ
り、４〜20％グラジエントゲル上で、還元条件（10％メ
ルカプトエタノール）および非還元条件で分析した。サ
ンプルは分析前に、解離バッファー中で５分間煮沸し
た。ゲルはコマジーブルーで染色するかまたはニトロセ
ルロース（Millipore HAHY 305 FQ）に300mAで2.5時
間転写した（Towbinら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:435
0−4354（1979））。キメラMABの検出は、前記のように
してマウスIgGカラムでアフィニティー精製したヤギ抗
−ヒトIgGペルオキシダーゼ結合物（バイオラッド 172
−1050）を用いて行った。
ricon−10）（Amicon）で５〜10倍に濃縮した。濃縮上
清または腹水からの精製MABを、SDSゲル電気泳動（Laem
li,U.K.,Nature 227:680−685（1970）を参照）によ
り、４〜20％グラジエントゲル上で、還元条件（10％メ
ルカプトエタノール）および非還元条件で分析した。サ
ンプルは分析前に、解離バッファー中で５分間煮沸し
た。ゲルはコマジーブルーで染色するかまたはニトロセ
ルロース（Millipore HAHY 305 FQ）に300mAで2.5時
間転写した（Towbinら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:435
0−4354（1979））。キメラMABの検出は、前記のように
してマウスIgGカラムでアフィニティー精製したヤギ抗
−ヒトIgGペルオキシダーゼ結合物（バイオラッド 172
−1050）を用いて行った。
T84.66ガンマ重鎖およびカッパ軽鎖の蛋白質配列分析 T84.66 MAB（5mg）を、1mlの0.5Mトリス塩酸（pH8.
0）,1mM EDTA中の30mM DTTで２時間還元し、60μＭの
ヨード酢酸により30分間窒素下の暗所での非変性条件下
でアルキル化した。溶液を1M酢酸に対して透析し、セフ
ァデックスＧ−100カラム（1.5×50cm）により鎖を分離
した。分離した鎖は、SDSゲル電気泳動上でそれぞれ25
および50kDaの単一バンドを示し、それぞれのアミノ末
端配列も単一であった。重鎖および軽鎖を還元し、そし
て6MグアニジンHCl中の変性条件下で実質的に上記した
ようにアルキル化した。このサンプルを0.2M炭酸水素ア
ンモニウム（pH7.8）に対して透析し、トリプシン（1/5
0重量）で37℃にて18時間消化した。トリプシン処理ペ
プチドを、Vydac Ｃ−18カラムの逆相HPLCにより、ト
リフルオロ酢酸−アセトニトリル勾配系を用いて分離し
た。これらのペプチドを微量配列決定および迅速原子衝
撃／マススペクトロメトリー分析に付した。
0）,1mM EDTA中の30mM DTTで２時間還元し、60μＭの
ヨード酢酸により30分間窒素下の暗所での非変性条件下
でアルキル化した。溶液を1M酢酸に対して透析し、セフ
ァデックスＧ−100カラム（1.5×50cm）により鎖を分離
した。分離した鎖は、SDSゲル電気泳動上でそれぞれ25
および50kDaの単一バンドを示し、それぞれのアミノ末
端配列も単一であった。重鎖および軽鎖を還元し、そし
て6MグアニジンHCl中の変性条件下で実質的に上記した
ようにアルキル化した。このサンプルを0.2M炭酸水素ア
ンモニウム（pH7.8）に対して透析し、トリプシン（1/5
0重量）で37℃にて18時間消化した。トリプシン処理ペ
プチドを、Vydac Ｃ−18カラムの逆相HPLCにより、ト
リフルオロ酢酸−アセトニトリル勾配系を用いて分離し
た。これらのペプチドを微量配列決定および迅速原子衝
撃／マススペクトロメトリー分析に付した。
実験結果 T84.66カッパ軽鎖遺伝子 Mbo I部分消化ライブラリーから、完全T84.66カッパ
遺伝子がクローニングされた。約100万個のプラークを
ネズミ定常領域プローブで一次スクリーニングして、５
個の陽性クローンが得られた。これらのクローンをさら
に、Ｊ−領域オリゴヌクレオチドを用いたドットブロッ
トハイブリダイゼーションパターンによって、VJ−再配
列に関して同定した。一つのクローンのみがＪκ２−再
配列パターンを示し（第１表参照）、これについて更に
分析した。適当な合成プローブへのハイブリダイゼーシ
ョンは、2.8kbのSst Iフラグメントおよび5.2BamH Iフ
ラグメントについて生じた。これらの二つのフラグメン
トをブルースクライブ中およびブルースクリプト誘導体
（Ampr遺伝子からXmn I部位を削除したもの）中へサブ
クローニングして、それぞれクローンBbe2.8およびBpt
5.2を得た。クローンBbe2.8は、完全T84.66可変領域遺
伝子を含み、そのDNA配列は第１図Ａに示されている。
公表されているデータとの比較から、T84.66カッパ鎖は
サブグループ３に属する（Kabatら，免疫学的に興味あ
る蛋白質の配列，米国保健および公衆サービス局（Sequ
ences of proteins in immunological interest,
U.S.Department of Health and Human Service
s）,NIH第４版（1987）を参照）。可変領域の演繹アミ
ノ酸配列を、T84.66の精製軽鎖のトリプシン消化ペプチ
ドから得られた蛋白質配列データと比較した。配列決定
した可変領域ペプチドと100％の同一性が、補体決定領
域も含めて観察された（第１図Ａ）。
遺伝子がクローニングされた。約100万個のプラークを
ネズミ定常領域プローブで一次スクリーニングして、５
個の陽性クローンが得られた。これらのクローンをさら
に、Ｊ−領域オリゴヌクレオチドを用いたドットブロッ
トハイブリダイゼーションパターンによって、VJ−再配
列に関して同定した。一つのクローンのみがＪκ２−再
配列パターンを示し（第１表参照）、これについて更に
分析した。適当な合成プローブへのハイブリダイゼーシ
ョンは、2.8kbのSst Iフラグメントおよび5.2BamH Iフ
ラグメントについて生じた。これらの二つのフラグメン
トをブルースクライブ中およびブルースクリプト誘導体
（Ampr遺伝子からXmn I部位を削除したもの）中へサブ
クローニングして、それぞれクローンBbe2.8およびBpt
5.2を得た。クローンBbe2.8は、完全T84.66可変領域遺
伝子を含み、そのDNA配列は第１図Ａに示されている。
公表されているデータとの比較から、T84.66カッパ鎖は
サブグループ３に属する（Kabatら，免疫学的に興味あ
る蛋白質の配列，米国保健および公衆サービス局（Sequ
ences of proteins in immunological interest,
U.S.Department of Health and Human Service
s）,NIH第４版（1987）を参照）。可変領域の演繹アミ
ノ酸配列を、T84.66の精製軽鎖のトリプシン消化ペプチ
ドから得られた蛋白質配列データと比較した。配列決定
した可変領域ペプチドと100％の同一性が、補体決定領
域も含めて観察された（第１図Ａ）。
T84.66ガンマ重鎖遺伝子 部分消化Mbo Iライブラリーを、991bpのXba Iネズミ
重鎖エンハンサー領域プローブでスクリーニングして、
多数の陽性クローンが得られたが、T84.66可変領域を含
むクローンは認められなかった。そのかわりに、本発明
者らはこのプローブに陽性のクローンは、ジャームライ
ン（胚細胞ライン）のコンフィギュレーションを持つ
か、または５′末端が欠失するかまたは錯誤再配列の重
鎖遺伝子をもつことを見出した。プライマーとして重鎖
特異的Ｊ−領域オリゴヌクレオチドであるＪγ２および
Ｊγ３を用いて、錯誤再配列の重鎖遺伝子のDNA配列分
析を行ったところ、この遺伝子はDq52およびＪγ２ミニ
遺伝子が結合し、続いてこれがＪγ３へ頭部−頭部結合
して生じたものであることが判明した。これとおなじ錯
誤遺伝子の存在は、異なるハイブリドーマ細胞ラインに
報告されており（Liu,z−q.ら,Nucl.Acid Res.,15:468
8（1987））、この遺伝子がSp2/0融合相手によってT84.
66ハイブリドーマに与えられたことを示唆する。
重鎖エンハンサー領域プローブでスクリーニングして、
多数の陽性クローンが得られたが、T84.66可変領域を含
むクローンは認められなかった。そのかわりに、本発明
者らはこのプローブに陽性のクローンは、ジャームライ
ン（胚細胞ライン）のコンフィギュレーションを持つ
か、または５′末端が欠失するかまたは錯誤再配列の重
鎖遺伝子をもつことを見出した。プライマーとして重鎖
特異的Ｊ−領域オリゴヌクレオチドであるＪγ２および
Ｊγ３を用いて、錯誤再配列の重鎖遺伝子のDNA配列分
析を行ったところ、この遺伝子はDq52およびＪγ２ミニ
遺伝子が結合し、続いてこれがＪγ３へ頭部−頭部結合
して生じたものであることが判明した。これとおなじ錯
誤遺伝子の存在は、異なるハイブリドーマ細胞ラインに
報告されており（Liu,z−q.ら,Nucl.Acid Res.,15:468
8（1987））、この遺伝子がSp2/0融合相手によってT84.
66ハイブリドーマに与えられたことを示唆する。
この錯誤遺伝子を知ることによって、T84.66可変領域
を含む制限フラグメントの同定が可能になった。EcoR I
消化したT84.66DNAのサザンブロットを、エンハンサー
フラグメントおよび又錯誤再配列Sp2/0遺伝子を含む5.4
kbEcoR Iフラグメントでプローブした。両プローブ共に
約6.6kbおよび3.3kbの大きさのバンドとハイブリダイズ
したが、これらのバンドは夫々胚細胞ラインコンフィギ
ュレーション状態の重鎖遺伝子（Kataokaら,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,77−919−923（1980））およびその再配
列型に相当した（データは示されていない）。3.3kbフ
ラグメントをLambda−ZAP中にクローニングした。サブ
クローニングののち、陽性クローンの一つの特性を、先
ずＪ−領域オリゴヌクレオチドプローブを用いたドット
ブロットにより、次いでDNA配列決定により更に調べ
た。T84.66重鎖可変領域遺伝子のヌクレオチド配列を第
１図Ｂに示す。T84.66重鎖遺伝子Ｊγ４への均等結合に
より生じ、公表されている配列との比較からサブクルー
プ2cと決定された（上記Kabat参照）。演繹されたアミ
ノ酸配列は、直接の蛋白質配列決定データと完全に一致
した。
を含む制限フラグメントの同定が可能になった。EcoR I
消化したT84.66DNAのサザンブロットを、エンハンサー
フラグメントおよび又錯誤再配列Sp2/0遺伝子を含む5.4
kbEcoR Iフラグメントでプローブした。両プローブ共に
約6.6kbおよび3.3kbの大きさのバンドとハイブリダイズ
したが、これらのバンドは夫々胚細胞ラインコンフィギ
ュレーション状態の重鎖遺伝子（Kataokaら,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,77−919−923（1980））およびその再配
列型に相当した（データは示されていない）。3.3kbフ
ラグメントをLambda−ZAP中にクローニングした。サブ
クローニングののち、陽性クローンの一つの特性を、先
ずＪ−領域オリゴヌクレオチドプローブを用いたドット
ブロットにより、次いでDNA配列決定により更に調べ
た。T84.66重鎖可変領域遺伝子のヌクレオチド配列を第
１図Ｂに示す。T84.66重鎖遺伝子Ｊγ４への均等結合に
より生じ、公表されている配列との比較からサブクルー
プ2cと決定された（上記Kabat参照）。演繹されたアミ
ノ酸配列は、直接の蛋白質配列決定データと完全に一致
した。
キメラ遺伝子および発現ベクターの構築 第２図Ａに説明したとおり、ネズミカッパ定常領域遺
伝子エクソンを、T84.66カッパ遺伝子から、Bpt 5.2の
Xmn Iによる制限酵素処理で取り除き、完全ヒトカッパ
定常領域を含む2.5kbのブラント末端EcoR Iフラグメン
ト（Phil Leder博士から贈与）に置き代えて、Bpt 5.
2 U515クローンを得た。最終のキメラT84.66カッパ遺
伝子の組み立ては、クローンBbe 2.8からの2.6kbのEco
R I/Xba Iフラグメントを、予めEcoR Iおよび部分的Xba
I消化で切断したBpt 5.2 U515に挿入することにより
行った。引き続いて、完成した構築物をXho I/Not Iフ
ラグメントにして、ブラント末端ライゲーションによ
り、発現プラスミドpcDneoのSal I部位に移した。得ら
れたクローンをpcDneo M5と命名した。
伝子エクソンを、T84.66カッパ遺伝子から、Bpt 5.2の
Xmn Iによる制限酵素処理で取り除き、完全ヒトカッパ
定常領域を含む2.5kbのブラント末端EcoR Iフラグメン
ト（Phil Leder博士から贈与）に置き代えて、Bpt 5.
2 U515クローンを得た。最終のキメラT84.66カッパ遺
伝子の組み立ては、クローンBbe 2.8からの2.6kbのEco
R I/Xba Iフラグメントを、予めEcoR Iおよび部分的Xba
I消化で切断したBpt 5.2 U515に挿入することにより
行った。引き続いて、完成した構築物をXho I/Not Iフ
ラグメントにして、ブラント末端ライゲーションによ
り、発現プラスミドpcDneoのSal I部位に移した。得ら
れたクローンをpcDneo M5と命名した。
ヒト／マウスキメラ重鎖構築物（第２図Ｂ）を造成す
るため、ヒトゲノムIgG1定常領域遺伝子（Phil Leder
博士から贈与）をHind IIIフラグメントにしてブルース
クリプトポリリンカー中に再クローニングし、さらに別
の構築物へ操作するための５′EcoR I部位を生じさせ
た。次に、2.2kbのEcoR I/Stu Iサブフラグメントを、
ブルースクリプト（Bpt＃5rec）のEcoR I/Sma Iポリリ
ンガー部位にサブクローニングした。最後に、T84.66重
鎖可変領域遺伝子、そのプロモーター、およびネズミ重
鎖転写エンハンサーを含む3.3kbのEcoR Iフラグメント
を、予めEcoR I部位で直線状にしたクローン＃5recと連
結した。得られたクローンBpt（−）R2からのキメラT8
4.66重鎖遺伝子を、Xho I/Not Iフラグメントとして、
ブラント末端ライゲーションによりpcDneoのSal I部位
に再クローニングし、pcDneo R2を得た。
るため、ヒトゲノムIgG1定常領域遺伝子（Phil Leder
博士から贈与）をHind IIIフラグメントにしてブルース
クリプトポリリンカー中に再クローニングし、さらに別
の構築物へ操作するための５′EcoR I部位を生じさせ
た。次に、2.2kbのEcoR I/Stu Iサブフラグメントを、
ブルースクリプト（Bpt＃5rec）のEcoR I/Sma Iポリリ
ンガー部位にサブクローニングした。最後に、T84.66重
鎖可変領域遺伝子、そのプロモーター、およびネズミ重
鎖転写エンハンサーを含む3.3kbのEcoR Iフラグメント
を、予めEcoR I部位で直線状にしたクローン＃5recと連
結した。得られたクローンBpt（−）R2からのキメラT8
4.66重鎖遺伝子を、Xho I/Not Iフラグメントとして、
ブラント末端ライゲーションによりpcDneoのSal I部位
に再クローニングし、pcDneo R2を得た。
キメラ遺伝子のトランスフェクション キメラ遺伝子pcDneo M5（カッパ）およびpcDneo R2
（ガンマ）を、単一のCla I部位で直線状態とし、エレ
クトロポレーションでSp2/0細胞に、またはリポフェク
ションでCHO細胞にコトランスフェクトした。G418中で
の２週間の選択ののち、約900クローンの上清の抗体産
生をスクリーニングし、産生の多いものをサブクローニ
ングした。Sp2/0の形質転換体（トランスフェクタン
ト）に関しては、クローンのいくつかをヌードマウスの
腹水中で増殖させ、抗体のレベルを定量した（表II）。
腹水をBalb/cマウスで増殖させようとした最初の試みは
失敗したが、これはキメラ抗体を産生する細胞に対する
免疫応答のためであろう。この問題は後にBalb/cマウス
のプリスチン（pristine）による予備処理によって克服
された。
（ガンマ）を、単一のCla I部位で直線状態とし、エレ
クトロポレーションでSp2/0細胞に、またはリポフェク
ションでCHO細胞にコトランスフェクトした。G418中で
の２週間の選択ののち、約900クローンの上清の抗体産
生をスクリーニングし、産生の多いものをサブクローニ
ングした。Sp2/0の形質転換体（トランスフェクタン
ト）に関しては、クローンのいくつかをヌードマウスの
腹水中で増殖させ、抗体のレベルを定量した（表II）。
腹水をBalb/cマウスで増殖させようとした最初の試みは
失敗したが、これはキメラ抗体を産生する細胞に対する
免疫応答のためであろう。この問題は後にBalb/cマウス
のプリスチン（pristine）による予備処理によって克服
された。
キメラMABの分析 トランスフェクションされた細胞からの上清をCEAで
コートしたマイクロタイタープレートのウェルに吸着さ
せて、免疫複合体を抗ヒトカッパもしくはガンマ抗体−
酵素結合物で検出した。Sp2/0のトランスフェクション
によって比較的高レベルの生産性を示す５個のクローン
が、そしてCHO細胞のコトランスフェクションによって
６個のクローンが得られた。サブクローニングののち、
Sp2/0クローンの一つはIg産生能を消失した。上清につ
いて抗−ヒトIgGおよび抗−CEA活性を定量アッセイし
た。結果を表IIに示す。
コートしたマイクロタイタープレートのウェルに吸着さ
せて、免疫複合体を抗ヒトカッパもしくはガンマ抗体−
酵素結合物で検出した。Sp2/0のトランスフェクション
によって比較的高レベルの生産性を示す５個のクローン
が、そしてCHO細胞のコトランスフェクションによって
６個のクローンが得られた。サブクローニングののち、
Sp2/0クローンの一つはIg産生能を消失した。上清につ
いて抗−ヒトIgGおよび抗−CEA活性を定量アッセイし
た。結果を表IIに示す。
各クローン（12H以外）はヒトIgGアッセイにおいてよ
りも、CEAアッセイにおいて高い活性を示した。クロー
ン1Fからの精製キメラ抗体をCEAアフィニティーカラム
に通過させて、未結合抗体をヒトIgG活性についてアッ
セイしたところ、活性の比率は12H以外の全てのクロー
ンについて同程度であった。何も観察されなかった。コ
ントロール実験において、ヒトIgGをCEAアフィニティー
アカラムに通過させたとき、100％の活性が回収され
た。
りも、CEAアッセイにおいて高い活性を示した。クロー
ン1Fからの精製キメラ抗体をCEAアフィニティーカラム
に通過させて、未結合抗体をヒトIgG活性についてアッ
セイしたところ、活性の比率は12H以外の全てのクロー
ンについて同程度であった。何も観察されなかった。コ
ントロール実験において、ヒトIgGをCEAアフィニティー
アカラムに通過させたとき、100％の活性が回収され
た。
抗体生産性Sp2/0トランスフェクトーマクローンを接
種した30匹のマウスの抗体生産の範囲は56−960μg/ml
であった（表II）。SDS PAGEおよびウェスターンブロ
ット分析のため、キメラ抗体を産生する細胞を血清不含
培地に訓化させ、上清を濃縮し、IgGをプロテイン Ａ
−セファロースアフィニティークロマトグラフィーで精
製した。腹水中で増殖したトランスフェクトーマからの
抗体を同様に精製および分析した。Sp2/0細胞またはCHO
細胞からのキメラ抗体は、ニトロセルロースに転写して
抗−ヒトFc抗体酵素結合物で染色したところ、150kdに
主要バンドを示した（第３図）。腹水から精製したIgG
のコマジーブルー染色もまた、150kDaに主要バンドを示
した。還元条件下においては、トランスフェクトーマが
生産したIgGは、コマジーブルー染色または特異的抗−
ヒトκ，γ鎖染色で染めると、50kdおよび25kdの重鎖お
よび軽鎖バンドを与えた（第４図）。キメラ抗体はウェ
スタンブロット上でのCEA−特異的結合に関しても調べ
た。CEAおよび正常交叉反応抗原（NCA）を７％SDSゲル
で泳動し、ニトロセルロース膜に転写し、キメラ抗−CE
Aと共にインキュベートし、そして抗−ヒトFc抗体酵素
結合物で検出した。結果（図示せず）は、キメラ抗体が
CEAに対するその特異性を保持しており、NCAとは反応し
ないことを証明した。
種した30匹のマウスの抗体生産の範囲は56−960μg/ml
であった（表II）。SDS PAGEおよびウェスターンブロ
ット分析のため、キメラ抗体を産生する細胞を血清不含
培地に訓化させ、上清を濃縮し、IgGをプロテイン Ａ
−セファロースアフィニティークロマトグラフィーで精
製した。腹水中で増殖したトランスフェクトーマからの
抗体を同様に精製および分析した。Sp2/0細胞またはCHO
細胞からのキメラ抗体は、ニトロセルロースに転写して
抗−ヒトFc抗体酵素結合物で染色したところ、150kdに
主要バンドを示した（第３図）。腹水から精製したIgG
のコマジーブルー染色もまた、150kDaに主要バンドを示
した。還元条件下においては、トランスフェクトーマが
生産したIgGは、コマジーブルー染色または特異的抗−
ヒトκ，γ鎖染色で染めると、50kdおよび25kdの重鎖お
よび軽鎖バンドを与えた（第４図）。キメラ抗体はウェ
スタンブロット上でのCEA−特異的結合に関しても調べ
た。CEAおよび正常交叉反応抗原（NCA）を７％SDSゲル
で泳動し、ニトロセルロース膜に転写し、キメラ抗−CE
Aと共にインキュベートし、そして抗−ヒトFc抗体酵素
結合物で検出した。結果（図示せず）は、キメラ抗体が
CEAに対するその特異性を保持しており、NCAとは反応し
ないことを証明した。
キメラ抗−CEAの親和定数 トランスフェクトーマのクローンF1の腹水からの精製
抗体を、非競合法のEIAで分析し、親和定数を測定し
た。クローンF1からの抗体はCEAに対して、親T84.66ハ
イブリドーマに匹敵する値の５×1010M-1の親和定数を
有していた。Wagener,C.ら,J.Immunol.,130:2302−2307
（1983）を参照。
抗体を、非競合法のEIAで分析し、親和定数を測定し
た。クローンF1からの抗体はCEAに対して、親T84.66ハ
イブリドーマに匹敵する値の５×1010M-1の親和定数を
有していた。Wagener,C.ら,J.Immunol.,130:2302−2307
（1983）を参照。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ノイマイアー，ミヒャエル ドイツ連邦共和国2000 ハンブルク 20 ―08，マルティーニシュトラーセ 52, ウニヴェアジテート・ハンブルク，アプ ト・エフ・クリン・ヒェミー (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 5/00 C12P 21/08 C07K 16/28 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (13)
- 【請求項１】癌胎児性抗原またはその生物学的に活性な
フラグメントに対するT84.66モノクローナル抗体（ATCC
受託番号No.HB 8747）の第１図Ａに示される配列を含む
カッパ鎖遺伝子をコードする、単離されたDNA。 - 【請求項２】癌胎児性抗原またはその生物学的に活性な
フラグメントに対するT84.66モノクローナル抗体の第１
図Ｂに示される配列を含むガンマ鎖遺伝子をコードす
る、単離されたDNA。 - 【請求項３】第１図Ａまたは第１図Ｂに示される配列を
含む合成もしくは精製された天然のDNA分子。 - 【請求項４】第１図Ａに示される配列を含むネズミT84.
66モノクローナル抗体の可変領域およびヒト定常領域を
有する、キメラネズミ−ヒト抗体のカッパ鎖遺伝子。 - 【請求項５】第１図Ｂに示される配列を含むネズミT84.
66モノクローナル抗体の可変領域およびヒト定常領域を
有する、キメラネズミ−ヒト抗体のガンマ鎖遺伝子。 - 【請求項６】第１図Ａに示される配列を含むネズミT84.
66抗体の可変領域遺伝子およびヒト定常領域遺伝子を有
する、キメラマウス／ヒトIgG−１抗体カッパ鎖遺伝
子。 - 【請求項７】第１図Ｂに示される配列を含むネズミT84.
66抗体の可変領域遺伝子およびヒト定常領域遺伝子を有
する、キメラマウス／ヒトIgG−１抗体ガンマ鎖遺伝
子。 - 【請求項８】請求項６または７で定義したキメラ抗体遺
伝子をコードするベクター。 - 【請求項９】請求項８で定義したキメラ抗体をコードす
るベクターで形質転換された、多細胞生物由来の細胞。 - 【請求項１０】ほ乳類細胞である、請求項９記載の細
胞。 - 【請求項１１】請求項９で定義した細胞を栄養培地中で
培養し、培養物中にキメラ抗体を蓄積せしめ、そして該
培地からキメラ抗体を回収することよりなる方法。 - 【請求項１２】第１図Ａに示される配列を含むネズミT8
4.66抗体カッパ鎖可変領域遺伝子およびヒトカッパ鎖定
常領域遺伝子を含む、クローン構築物pcDneo M5。 - 【請求項１３】第１図Ｂに示される配列を含むネズミT8
4.66抗体ガンマ鎖可変領域遺伝子およびヒトガンマ鎖定
常領域遺伝子を含む、クローン構築物pcDneo R2。
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-
1989
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1990
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- 1990-07-19 CA CA002035899A patent/CA2035899C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-07-19 DE DE69018801T patent/DE69018801T2/de not_active Expired - Fee Related
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- 1990-07-19 AU AU63447/90A patent/AU629401B2/en not_active Ceased
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