KR20210065991A - 설포말레이미드계 링커 및 상응하는 컨쥬게이트 - Google Patents

설포말레이미드계 링커 및 상응하는 컨쥬게이트 Download PDF

Info

Publication number
KR20210065991A
KR20210065991A KR1020217012389A KR20217012389A KR20210065991A KR 20210065991 A KR20210065991 A KR 20210065991A KR 1020217012389 A KR1020217012389 A KR 1020217012389A KR 20217012389 A KR20217012389 A KR 20217012389A KR 20210065991 A KR20210065991 A KR 20210065991A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
group
seq
alkyl
integer
Prior art date
Application number
KR1020217012389A
Other languages
English (en)
Inventor
미쉘 쁘르
프레데릭 마리옹
쟝-프랑끄와 아오
씨리으 드르이퓌
Original Assignee
피에르 파브르 메디카먼트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 피에르 파브르 메디카먼트 filed Critical 피에르 파브르 메디카먼트
Publication of KR20210065991A publication Critical patent/KR20210065991A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/65—Tetracyclines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D275/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-thiazole or hydrogenated 1,2-thiazole rings
    • C07D275/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-thiazole or hydrogenated 1,2-thiazole rings not condensed with other rings
    • C07D275/03—Heterocyclic compounds containing 1,2-thiazole or hydrogenated 1,2-thiazole rings not condensed with other rings with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D498/18—Bridged systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06052—Val-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06156—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Trp-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0808—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 하기 화학식 (I) 또는 이의 염의 링커 (I)에 관한 것이다:
Figure pct00218
.
본 발명은 하기 화학식 (Ⅱ) 또는 이의 염의 링커-약물 컨쥬게이트 (Ⅱ)에 관한 것이다:
Figure pct00219
.
또한, 본 발명은 하기 화학식 (Ⅲ) 또는 (Ⅳ) 또는 이들의 염의 항체-약물 컨쥬게이트와 같은 결합 단위-약물 컨쥬게이트, 뿐만 아니라 이러한 결합 단위-약물 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물 및 암의 치료에서 이의 용도에 관한 것이다:
Figure pct00220
,
Figure pct00221
.

Description

설포말레이미드계 링커 및 상응하는 컨쥬게이트
본 발명은 유리하게 항체인 결합 단위에 약물 분자(들)을 공유 결합시킴으로써 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)와 같은 컨쥬게이트의 제조에 유용한 설포말레이미드계 링커에 관한 것이다.
ADC는 상이한 약물 로딩된 종 (0개 내지 8개의 항체 당 약물 분자 = DAR)의 전체 제어된 혼합물이고, 3.5 또는 4의 전형적인 평균 DAR를 갖는다. 일반적으로 컨쥬게이션되지 않은 종은 활성을 갖지 않고, 약물-로딩된 종과 항원에 대한 결합을 경쟁하지 않는다. 또한, 4 이상의 DAR을 갖는 종은 더 낮은 내성도, 더 높은 혈장 제거율 및 효능 감소를 유도하는 것으로 관찰되었다. 현재 시판 및 임상 시험이 진행되는 대부분의 ADC는 티오숙신이미드 결합과 같은 공통적인 구조적 특징을 공유하고, 이는 티올과 알킬 말레이미드의 반응에 의해 형성된다. 이러한 유형의 화학은 말레이미드와 티올의 반응이 생리학적 조건 하에 매우 신속하고, (아주 과량의 최초의 종 둘 다가 없이도) 정량적이기 때문에 널리 사용된다. 그러나, 티오숙신이미드의 형성은 생리학적 조건 하에 느리게 가역적이다. 알킬말레이미드를 포함하는 ADC는 연장된 순환 과정 동안 측정가능한 약물 손실을 유발할 수 있다. ADC로부터 이러한 말레이미드 제거 (역-마이클 반응에 의함)의 약학적 결과는 약물 항체-컨쥬게이션된 형태의 노출 감소로 인한 항종양 활성 저하 그리고 약물과 링커의 표적화되지 않은 방출로부터 생기는 독성 증가를 수반한다. 이것은 티오에스테르 링커 SMCC (숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실에이트)를 통해 시스테인 연결된 ADC 및 라이신 연결된 ADC 둘 다의 경우에 기술되어 왔다.
본 발명은 따라서 결합 단위에 대한 약물의 컨쥬게이션에 유용한 화합물에 관한 것이고, 획득된 컨쥬게이트는 더욱 안정하고, 더욱 효율적이다.
따라서, 본 발명은 하기 화학식 (I)
Figure pct00001
,
바람직하게 하기 화학식 (Ia)
Figure pct00002
또는 이들의 염의 링커로서,
여기서 X1 및 X2는 서로 독립적으로 H, 할로겐 원자, (C1-C6)알콕시, 선택적으로 치환된 아릴옥시 또는 -O-(CH2CH2O)rH (-O-PEG)를 나타내고, 단 X1 및 X2가 동시에 H를 나타내지 않으며;
L1은 화학식 L1'-(CO-Z')z'의 기를 나타내고, L1'이 -(CH2)n-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 시클로알칸디일, -(CH2)n-아릴렌-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-, -(CH2)n-시클로알칸디일-, -아릴렌-(CH2)p-, -헤테로아릴렌-(CH2)p-, -시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2)n-아릴렌-(CH2)p-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-(CH2)p-, -(CH2)n-시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-아릴렌-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-헤테로아릴렌-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2)n-아릴렌-CH2-CH2-(OCH2CH2)m-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-CH2-CH2-(OCH2CH2)m- 또는 -(CH2)n-시클로알칸디일-CH2-CH2-(OCH2CH2)m-이며;
각각의 W는 독립적으로 아미노산 단위를 나타내고;
Y는 PAB-CO-(Z)z-이고, PAB가
Figure pct00003
이고 (PAB 단위의 산소가 CO-(Z)z에 연결됨);
Z는 -NR4-(CH2)u-NR5- 또는 -NR4-(CH2)u-NR5-CO-, 또는 -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v- 또는 -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v-CO-이고 (NR4 기가 PAB-CO의 CO 기에 연결됨);
Z'는 -NR4-(CH2)u-NR5- 또는 -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v-이고 (NR4 기가 CO-Z'의 CO 기에 연결됨);
R4 및 R5는 독립적으로 H 또는 (C1-C6)알킬기이고;
c는 0 또는 1, 바람직하게 1이고;
m은 1 내지 15의 정수이고;
n은 1 내지 6의 정수이고;
p는 1 내지 6의 정수이고;
q는 0, 1 또는 2, 바람직하게 2이고;
r은 1 내지 24, 명확하게 1 내지 12의 정수이고;
u는 1 내지 6의 정수이고;
v는 1 내지 6의 정수이고;
w는 0 또는 5의 정수, 바람직하게 0 또는 2이고;
y는 0 또는 1이고 (바람직하게 w가 0일 때 y는 0이고, w가 1 내지 5의 정수 일 때 y는 0 또는 1임);
z는 0 또는 1이고;
z'는 0 또는 1, 명확하게 0이고;
X3은 y = z = 1, Z가 -NR4-(CH2)u-NR5-일 때, 또는 c = w = y = 0, z'　= 1, Z'가 -NR4-(CH2)u-NR5-일 때 H를 나타내고, 나머지 경우에 X3는 OH, NH2 또는 이탈기를 나타내는, 링커에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 이탈기는 할로겐 원자, 화학식 -OSO2-RLG의 N-숙신이미딜옥시, 4-니트로-페닐옥시, 펜타플루오로펜옥시 또는 N-벤조트리아졸옥시이고, RLG가 (C1-C6)알킬, 아릴, 아릴-(C1-C6)알킬 또는 (C1-C6)알킬-아릴기를 나타내고, 상기 기가 1개 또는 여러 개의 불소 원자와 같은 할로겐 원자로 선택적으로 치환된다.
바람직하게, 화학식 (I)의 화합물은
X1이 Cl이고, X2가 H이고, q가 0이고, L1이
Figure pct00004
이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
X1이 Cl이고, X2가 Cl이고, q가 0이고, L1이
Figure pct00005
이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
X1이 Cl이고, X2가 H이고, q가 0이고, L1이
Figure pct00006
이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
X1이 Cl이고, X2가 H이고, q가 0이고, L1이
Figure pct00007
이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
X1이 Cl이고, X2가 H이고, q가 0이고, L1이
Figure pct00008
이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
X1이 Cl이고, X2가 H이고, q가 0이고, L1이
Figure pct00009
이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Br이거나;
X1이 Cl이고, X2가 H이고, q가 0이고, L1이
Figure pct00010
이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 I이거나;
X1이 H이고, X2가 Cl이고, q가 0이고, L1이
Figure pct00011
이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
X1이 H이고, X2가 Br이고, q가 0이고, L1이
Figure pct00012
이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
X1이 H이고, X2가 Br이고, q가 0이고, L1이
Figure pct00013
이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
X1이 Cl이고, X2가 Cl이고, q가 0이고, L1이
Figure pct00014
이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
X1이 Cl이고, X2가 Cl이고, q가 0이고, L1이
Figure pct00015
이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
X1이 Cl이고, X2가 Cl이고, q가 0이고, L1이
Figure pct00016
이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
X1이 Cl이고, X2가 Br이고, q가 0이고, L1이
Figure pct00017
이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
X1이 Cl이고, X2가 Br이고, q가 0이고, L1이
Figure pct00018
이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이고;
X1이 Cl이고, X2가 Br이고, q가 0이고, L1이
Figure pct00019
이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
X1이 Br이고, X2가 Br이고, q가 0이고, L1이
Figure pct00020
이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl인, 화학식 (I)의 화합물이 아니고,
여기서 점선은
Figure pct00021
의 질소 원자에 대한 L1의 부착점을 표시하고, 물결선은 X3에 대한 L1의 부착점을 표시한다.
이들 화합물은 국제특허출원 WO 2007/001932 또는 미국 특허 US 4,127,687에 개시되어 있지만, 보다 구체적으로 ADC와 같은 컨쥬게이트의 제조를 의도하는 링커로서는 아니다.
또한 본 발명은 하기 화학식 (Ⅱ)
Figure pct00022
,
바람직하게는 하기 화학식 (Ⅱa)
Figure pct00023
또는 이들의 염의 링커-약물 컨쥬게이트로서,
여기서 X1 및 X2는 서로 독립적으로 H, 할로겐 원자, (C1-C6)알콕시, 선택적으로 치환된 아릴옥시 또는 -O-(CH2CH2O)rH를 나타내고, 단 X1 및 X2는 동시에 H를 나타내지 않으며;
L1은 화학식 L1'-(CO-Z')z'의 기를 나타내고, L1'이 -(CH2)n-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 시클로알칸디일, -(CH2)n-아릴렌-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-, -(CH2)n-시클로알칸디일-, -아릴렌-(CH2)p-, -헤테로아릴렌-(CH2)p-, -시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2)n-아릴렌-(CH2)p-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-(CH2)p-, -(CH2)n-시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-아릴렌-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-헤테로아릴렌-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2)n-아릴렌-CH2-CH2-(OCH2CH2)m-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-CH2-CH2-(OCH2CH2)m- 또는 -(CH2)n-시클로알칸디일-CH2-CH2-(OCH2CH2)m-이며;
각각의 W는 독립적으로 아미노산 단위를 나타내고;
Y는 PAB-CO-(Z)z-이고, PAB가
Figure pct00024
이고 (PAB 단위의 산소는 CO-(Z)z에 연결됨);
Z는 -NR4-(CH2)u-NR5- 또는 -NR4-(CH2)u-NR5-CO-, 또는 이외에도 -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v- 또는 -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v-CO-이고 (NR4 기가 PAB-CO의 CO 기에 연결됨);
Z'는 -NR4-(CH2)u-NR5- 또는 -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v-이고, (NR4 기가 CO-Z'의 CO 기에 연결됨);
R4 및 R5는 독립적으로 H 또는 (C1-C6)알킬기이고;
Q는 약물 모이어티를 나타내고;
c는 0 또는 1, 바람직하게 1이고;
m은 1 내지 15의 정수이고;
n은 1 내지 6의 정수이고;
p는 1 내지 6의 정수이고;
q는 0, 1 또는 2, 바람직하게 2이고;
r은 1 내지 24, 명확하게 1 내지 12의 정수이고;
u는 1 내지 6의 정수이고;
v는 1 내지 6의 정수이고;
w는 0 또는 5의 정수, 바람직하게 0 또는 2이고;
y는 0 또는 1이고 (바람직하게 w가 0일 때 y는 0이고, w가 1 내지 5의 정수 일 때 y는 0 또는 1임);
z는 0 또는 1이고;
z'는 0 또는 1, 명확하게 0인, 링커-약물 컨쥬게이트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 (Ⅲ) 또는 (Ⅳ) 또는 이의 염, 바람직하게 이들의 약제학적으로 허용가능한 염의 결합 단위-약물 컨쥬게이트로서,
Figure pct00025
,
Figure pct00026
여기서 상기 결합 단위는 펩티드, 단백질 (예로, 조작된 단백질), 항체 (예로, 단일클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이고;
L1은 화학식 L1'-(CO-Z')z'의 기를 나타내고, L1'가 -(CH2)n-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 시클로알칸디일, -(CH2)n-아릴렌-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-, -(CH2)n-시클로알칸디일-, -아릴렌-(CH2)p-, -헤테로아릴렌-(CH2)p-, -시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2)n-아릴렌-(CH2)p-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-(CH2)p-, -(CH2)n-시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-아릴렌-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-헤테로아릴렌-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2)n-아릴렌-CH2-CH2-(OCH2CH2)m-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-CH2-CH2-(OCH2CH2)m- 또는 -(CH2)n-시클로알칸디일-CH2-CH2-(OCH2CH2)m-이며;
각각의 W는 독립적으로 아미노산 단위를 나타내고;
Y는 PAB-CO-(Z)z-이고, PAB가
Figure pct00027
이고 (PAB 단위의 산소가 CO-(Z)z에 연결됨);
Z는 -NR4-(CH2)u-NR5-, -NR4-(CH2)u-NR5-CO-, 또는 이외에도 -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v- 또는 -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v-CO-이고 (NR4 기가 PAB-CO의 CO 기에 연결됨);
Z'는 -NR4-(CH2)u-NR5- 또는 -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v-이고 (NR4 기가 CO-Z'의 CO 기에 연결됨);
R4 및 R5는 독립적으로 H 또는 (C1-C6)알킬기이고;
Q는 약물 모이어티를 나타내고;
c는 0 또는 1, 바람직하게 1이고;
m은 1 내지 15의 정수이고;
n은 1 내지 6의 정수이고;
p는 1 내지 6의 정수이고;
s는 1 내지 8의 정수이고;
u는 1 내지 6의 정수이고;
v는 1 내지 6의 정수이고;
w는 0 또는 5의 정수, 바람직하게 0 또는 2이고;
y는 0 또는 1이고 (바람직하게 w가 0일 때 y는 0이고, w가 1 내지 5의 정수 일 때 y는 0 또는 1임);
z는 0 또는 1이고;
z'는 0 또는 1인, 결합 단위-약물 컨쥬게이트에 관한 것이다.
바람직한 구현예에 따르면, 결합 단위는 IGF-1R 항체 또는 HER2 항체 (예로, 트라투주맙) 또는 이들의 항원 결합 단편이다.
또한, 본 발명은 항체 (예로, 단일클론 항체) 및 이의 항원 결합 단편과 같은 결합 단위에 약물을 공유 결합하는데 사용되는, 화학식 (I)의 링커 또는 화학식 (Ⅱ)의 약물-링커 컨쥬게이트로서, 바람직하게 q = 2인, 링커 또는 약물-링커 컨쥬게이트에 관한 것이다.
따라서, 바람직하게 q = 2인 화학식 (I) 또는 (Ⅱ)의 화합물은 항체 (예로, 단일클론 항체) 및 이의 항원 결합 단편과 같은 결합 단위에 약물을 공유 결합하는데 유용하다.
또한, q = 0 또는 1인 화학식 (I) 또는 (Ⅱ)의 화합물은 q = 2인 화학식 (I) 또는 (Ⅱ)의 화합물을 제조하는데 합성 중간물로서 사용될 수 있다. 결론적으로, 본 발명은 또한 합성 중간물로서, 상기 정의된 바와 같은 q = 1 또는 2인 화학식 (I) 또는 (Ⅱ)의 화합물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 화학식 (I)의 링커 또는 화학식 (Ⅱ), (Ⅲ) 또는 (Ⅳ)의 컨쥬게이트를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 화학식 (Ⅲ) 또는 (Ⅳ)의 결합 단위-약물 컨쥬게이트 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 암의 치료에 사용되는, 화학식 (Ⅲ) 또는 (Ⅳ)의 결합 단위-약물 컨쥬게이트 또는 화학식 (Ⅲ) 또는 (Ⅳ)의 결합 단위-약물 컨쥬게이트 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 암의 치료에 사용하려고 의도된 약제의 제조를 위한, 화학식 (Ⅲ) 또는 (Ⅳ)의 결합 단위-약물 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 암을 치료하는 방법으로서, 화학식 (Ⅲ) 또는 (Ⅳ)의 결합 단위-약물 컨쥬게이트 또는 화학식 (Ⅲ) 또는 (Ⅳ)의 결합 단위-약물 컨쥬게이트 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 치료가 필요한 사람에게 투여하는 것을 포함하는, 방법에 관한 것이다.
정의
본 발명의 목적으로, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 약제학적 조성물의 제조에 유용한 것 및 일반적으로 약제학적 용도를 위해 안전하고 비-독성인 것을 의미하려고 의도된다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 본 발명의 본 발명의 맥락에서 상기에 정의된 바와 같이 약제학적으로 허용가능하고, 상응하는 화합물의 약학적 활성을 소유하는 화합물의 염을 의미하려고 의도된다.
약제학적으로 허용가능한 염은
(1) 무기산, 예컨대 염산, 브롬산, 황산, 질산 및 인산 등으로 형성되거나, 유기산, 예컨대 아세트산, 벤젠설폰산, 푸마르산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 히드록시나프토산, 2-히드록시에탄설폰산, 락트산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄설폰산, 뮤콘산, 2-나프탈렌설폰산, 프로피온산, 숙신산, 디벤조일-L-타르타르산, 타르타르산, p-톨루엔설폰산, 트리메틸아세트산 및 트리틀루오로아세트산 등으로 형성된 산 부가염; 및
(2) 화합물에 존재하는 산 양성자가 금속 이온, 예컨대 알칼리 금속 이온, 알칼리성 토금속 또는 알루미늄 이온에 의해 치환될 때 형성된 또는 유기 염기 또는 무기 염기로 배위된 염을 포함한다. 허용가능한 유기 염기는 디에탄올아민, 에탄올아민, N-메틸글루카민, 트리에탄올아민 및 트로메타민 등을 포함한다. 허용가능한 무기 염기는 수산화 알루미늄, 수산화 칼슘, 수산화 칼륨, 탄산화 나트륨 및 수산화 나트륨을 포함한다.
용어 "할로겐"은 본 발명에 사용된 바, 불소, 브롬, 염소 또는 요오드 원자를 말한다.
용어 "(C1-C6)알킬"은 본 발명에 사용된 바, 1개 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 1가의 직선상 또는 분지상 포화 탄화수소 사슬을 말하고, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, 세크-부틸, t-부틸, n-펜틸 및 n-헥실 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
용어 "(C1-C6)알콕시"는 본 발명에 사용된 바, 산소 원자에 의해 분자에 결합된 상기 정의된 바와 같은 (C1-C6)알킬기를 말하고, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소-프로폭시, n-부톡시, 이소-부톡시, 세크-부톡시, t-부톡시, n-펜톡시 및 n-헥소시 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
용어 "(C2-C6)알케닐"은 본 발명에 사용된 바, 2개 내지 6개의 탄소 원자를 포함하면서 적어도 하나의 이중 결합을 포함하는 직선상 또는 분지상 1가의 불포화 탄화수소 사슬을 말하고, 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐 및 헥세닐 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
용어 "시클로알칸디일"은 본 발명에 사용된 바, 유리하게 4개 내지 10개의 탄소 원자, 명확하게 5개 또는 6개의 탄소 원자를 포함하는 2가의 포화 탄화수소 고리를 말하고, 시클로펜타디일 및 시클로헥산디일 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, 이것은 시클로헥산디일 기이다.
용어 "아릴"은 본 발명에 사용된 바, 바람직하게 6개 내지 10개의 탄소 원자를 포함하고, 예를 들면 페닐 또는 나프틸 기와 같은 하나 이상의 융합된 고리를 포함하는 1가의 방향족 탄화수소 기를 말한다. 유리하게, 이것은 페닐기일 것이다.
용어 "아릴-(C1-C6)알킬"은 본 발명에 사용된 바, 상기 정의된 바와 같은 아릴기로 치환된 상기 기술된 바와 같은 (C1-C6)알킬기를 말한다. 구체적으로, 이것은 벤질기일 수 있다.
용어 "(C1-C6)알킬-아릴"은 본 발명에 사용된 바, 상기 기술된 바와 같은 (C1-C6)알킬기로 치환된 상기 기술된 바와 같은 아릴기를 말한다. 구체적으로, 이것은 토릴기 (CH3Ph)일 수 있다.
용어 "아릴옥시"는 본 발명에 사용된 바, 산소 원자에 의해 분자에 결합된 상기 기술된 바와 같은 아릴기를 말하고, 페닐옥시를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "아릴렌"은 본 발명에 사용된 바, 바람직하게 6개 내지 10개의 탄소 원자를 포함하고, 예를 들면, 페닐렌 또는 나프틸렌 기와 같은 하나 이상의 융합된 고리를 포함하는 2가의 방향족 탄화수소를 말한다. 유리하게, 이것은 페닐렌 기일 것이다.
용어 "헤테로아릴렌"은 본 발명에 사용된 바, 1개 또는 여러 개, 명확하게 1개 또는 2개의 융합된 탄화수소 고리를 포함하는 2가의 방향족 기로서, 1개 또는 여러 개, 명확하게 1개 내지 4개, 유리하게 1개 내지 3개의 탄소 원자 각각이 황 원자, 산소 원자 및 질소 원자로부터 선택되고, 바람직하게 산소 원자 및 질소 원자, 더욱 바람직하게 질소 원자로부터 선택되는 헤테로원자로 치환되었던, 2가의 방향족 기를 말한다. 유리하게, 이것은 2가의 1,2,3-트리아졸, 예컨대 2가의 1H-1,2,3-트리아졸이다.
용어 "이탈기"는 본 발명에 사용된 바, 친핵성 치환 반응 동안 친핵체 (예컨대 작용기 NH 또는 OH를 각각 보유한 아민 또는 알코올)로 용이하게 치환될 수 있는 화학기를 말한다. 이러한 이탈기는 구체적으로 할로겐 원자, 설포네이트, N-숙신이미딜옥시, 4-니트로-페닐옥시, 펜타플루오로펜옥시 또는 N-벤조트리아졸옥시일 수 있다. 설포네이트는 구체적으로 -OSO2-RLG 기이고, RLG가 (C1-C6)알킬, 아릴, 아릴-(C1-C6)알킬 또는 (C1-C6)알킬-아릴 기를 나타내며, 상기 기가 1개 또는 여러 개의 불소 원자와 같은 할로겐 원자로 선택적으로 치환된다. 설포네이트는 명확하게 메실레이트 (OMs, CH3-S(O2)O-), 트리플레이트 (OTf, CF3-S(O)2O-) 또는 토실레이트 (OTs, p-Me-C6H4-S(O)2O-)일 수 있다. 이탈기는 구체적으로 Cl, Br, I, OTf, OMs, OTf, N-숙신이미딜옥시, 4-니트로-페닐옥시 또는 N-벤조트리아졸옥시일 수 있다.
용어 "트리알킬시릴기"는 본 발명에 사용된 바, -SiAlk1Alk2Alk3 기로서, 동일한 또는 상이한 Alk1, Alk2 및 Alk3는 상기 정의된 바와 같은 (C1-C6)-알킬기를 나타내는, 기를 말한다. 예를 들면, 이것은 트리메틸시릴 또는 트리에틸시릴 기일 수 있다.
용어 분자의 "보호된 형태"는 상기 분자에 존재하는 적어도 OH 또는 NH 기능이 O-보호기 또는 N-보호기로 보호되는 것을 의미한다.
용어 "보호기"는 본 발명에 사용된 바, 다중기능성 화합물에서 반응성 분위를 선택적으로 차단하여 또 다른 보호되지 않은 반응성 부위에서 화학 반응을 선택적으로 수행하도록 하는 화학기를 말한다.
용어 "O-보호기"는 본 발명에 사용된 바, 합성 절차 동안 바람직하지 않은 반응에 대항하는 히드록실기 (OH)를 보호하는 치환기, 예컨대 "Greene's Protective Groups In Organic Synthesis", 제 4판, 2007, John Wiley & Sons, Hoboken, New Jersey에 개시된 이들 O-보호기를 말한다. O-보호기에 의해 보호되는 히드록실기는 예를 들면 에테르, 에스테르, 카보네이트 및 아세탈 등일 수 있다. 구체적으로, O-보호기는 1개 또는 여러 개 (명확하게 1개 내지 3개)의 할로겐 원자 (예컨대 염소 원자)로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 터르-부틸 또는 2,2,2-트리클로로에틸; 아릴 모이어티가 1개 또는 여러 개의 메톡시 기로 선택적으로 치환된 벤질과 같은 아릴-(C1-C6)알킬, 예컨대 벤질 (Bn) 또는 p-메톡시벤질 (PMB); 화학식 -CAr1Ar2Ar3의 트리틸 유도체, 예컨대 트리페닐메틸 (트리틸 - Tr로도 불림), (4-메톡시페닐)디페닐메틸 (메톡시트리틸 - NMT로도 불림) 또는 비스-(4-메톡시페닐)페닐메틸 (디메톡시트리틸 - DMT로도 불림); 화학식 -CH2ORGP2 또는 -CH2SRGP2 (구체적으로 -CH2ORGP2)의 치환된 메틸기, 예를 들면 메톡시메틸 (MOM), 벤질옥시메틸, 2-메톡시에톡시메틸 (MEM), 2-(트리메틸시릴)에톡시메틸 또는 메틸티오메틸; 화학식 -CH2CH2ORGP2 또는 -CH2CH2SRGP2 (구체적으로 -CH2CH2ORGP2), 예를 들면 에톡시에틸 (EE); 화학식 -SiRGP3RGP4RGP5의 시릴기, 예를 들면 트리메틸시릴 (TMS), 트리에틸시릴 (TES), t-부틸디메틸시릴 (TBS 또는 TBDMS) 및 t-부틸디페닐시릴 (TBDPS); 화학식 -CO-RGP6의 카보닐화된 기, 예컨대 아세틸 (Ac), 피발로일 (Piv 또는 Pv) 또는 벤조일 (Bz), 또는 화학식 -CO2-RGP7의 카보닐화된 기, 예컨대 알릴옥시카보닐 (Alloc) 또는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐 (Fmoc); 또는 테트라히드로피라닐 (
Figure pct00028
)(THP) 또는 테트라히드로퓨라닐 (
Figure pct00029
)기일 수 있고, Ar1, Ar2 및 Ar3가 서로 독립적으로 1개 또는 여러 개의 메톡시로 선택적으로 치환된 페닐과 같은 아릴을 나타내고; RGP2가 아릴 (예컨대 페닐), (C1-C6)알콕시 (예컨대 메톡시) 또는 트리알킬시릴기 (예컨대 SiMe3)로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬 (예컨대 메틸 또는 에틸)을 나타내고; RGP3, RGP4 및 RGP5가 서로 독립적으로 (C1-C6)알킬 또는 아릴 (예컨대 페닐)기를 나타내고; RGP6 및 RGP7가 서로 독립적으로 (C1-C6)알킬, (C2-C6)알케닐, 아릴, 아릴-(C1-C6)알킬 또는 9-플루오레닐메틸 기를 나타낸다.
용어 "N-보호기"는 본 발명에 사용된 바, 합성 절차 동안 바람직하지 않은 반응에 대항하는 아민 기능 (명확하게 일차 아민 기능)을 보호하려고 의도된 이들 기를 말한다. 공통적으로 사용된 N-보호기는 "Greene's Protective Groups In Organic Synthesis", 제 4판, 2007, John Wiley & Sons, Hoboken, New Jersey에 개시된다. N-보호기에 의해 보호되는 아민 기능은 카바메이트, 아미드, 설폰아미드, N-알킬 유도체, 아미노 아세탈 유도체, N-벤질 유도체, 이민 유도체, 엔아민 유도체 또는 N-헤테로원자 유도체일 수 있다. 구체적으로, N-보호기는 포르밀; 1개 또는 여러 개 메톡시로 선택적으로 치환된 페닐과 같은 아릴, 예컨대 p-메톡시페닐 (PMP); 아릴 모이어티가 1개 또는 여러 개의 메톡시 기로 선택적으로 치환된 벤질과 같은 아릴-(C1-C6)알킬, 예컨대 벤질 (Bn), p-메톡시벤질 (PMB) 또는 3,4-디메톡시벤질 (DMPM); -CO-RGP1 예컨대 아세틸 (Ac), 피발로일 (Piv 또는 Pv), 벤조일 (Bz) 또는 p-메톡시벤질카보닐 (Moz); -CO2-RGP1 예컨대 t-부틸옥시카보닐 (Boc), 트리클로로에톡시카보닐 (TROC), 알릴옥시카보닐 (Alloc), 벤질옥시카보닐 (Cbz 또는 Z) 또는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐 (Fmoc); 그리고 -SO2-RGP1 예컨대 페닐설포닐, 토실 (Ts 또는 Tos) 또는 2-니트로벤젠설포닐 (노실 - Nos 또는 Ns로도 불림) 등일 수 있고, RGP1이 1개 또는 여러 개의 F 또는 Cl과 같은 할로겐 원자로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬; 알릴과 같은 (C2-C6)알케닐; OMe (메톡시) 및 NO2 (니트로) 중에서 선택된 1개 또는 여러 개의 기로 선택적으로 치환된 페닐과 같은 아릴; 아릴 모이어티가 1개 또는 여러 개의 메톡시 기로 선택적으로 치환된 벤질과 같은 아릴-(C1-C6)알킬; 또는 9-플루오레닐메틸 기를 나타낸다.
용어들 "항체", "항체들", "ab, "Ab", "MAb" 또는 "면역글로불린"은 가장 넓은 의미에서 상호교환적으로 사용되고, 단일클론 항체, 단리된, 조작된 또는 재조합 항체 (예로, 전장의 또는 온전한 단일클론 항체), 다중클론 항체, 다가의 항체 또는 다중특이적 항체 (예로, 이중특이적 항체) 및 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이들의 항체 단편도 역시 포함한다.
용어 "재조합 항체"는 살아있는 세포 내에서 재조합 DNA의 발현으로부터 생성되는 항체를 말한다. 본 발명에 따른 재조합 항체는 당업자에게 잘 숙지되어 있고, 생물학적 유기체에서 발견되지 않을 DNA 서열을 생성하는 유전적 재조합의 연구실 방법을 사용하여 획득된다.
본 발명에 따른 항체의 "항원 결합 단편"은 항체의 표적 (일반적으로 항원으로도 지칭됨)에 결합하는 능력을 보유하는 임의의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 가리키려고 의도된다.
"결합하는" 또는 "결합하다" 등에 의하여, 항체, 또는 이의 임의의 항원 결합 단편은 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성하는 것으로 의도된다. 특이적 결합은 적어도 약 1 × 10-6 M의 평형 해리 상수를 특징으로 할 수 있다. 2개의 분자가 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면 평형 투석법, 표면 플라스몬 공명법, 방사선 표지된 검정법 등을 포함한다. 명확하게, 상기 항체가 또 다른 항원과 낮은 수준으로 결합 또는 간섭할 수 없음을 의미하지는 않는다. 그럼에도 불구하고, 일 구현예로서, 상기 항체는 상기 항원에만 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 표현 "IGF-1R 항체"는 "항-IGF-1R 항체"와 유사한 것으로서 해석되어야 하고, IGF-1R에 결합할 수 있는 항체를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 표현 "HER2 항체"는 "항-HER2 항체"와 유사한 것으로서 해석되어야 하고, HER2에 결합할 수 있는 항체를 의미한다.
용어 최대의 절반 유효 농도 (EC50)는 일정 특정된 노출 시간 이후에 기저값 및 최대값 사이의 절반의 반응을 유도하는 약물, 항체 또는 독물의 농도에 해당한다. 이것은 약물의 효능의 척도로서 공통적으로 사용된다. 따라서 등급화된 용량 반응 곡선의 EC50은 이의 최대 효과의 50%가 관찰되는 화합물의 농도를 나타낸다. 양적 용량 반응 곡선의 EC50은 특정된 노출 지속 이후에 집단의 50%가 반응을 나타내는 화합물의 농도를 나타낸다. 농도 측정은 전형적으로 S자형 곡선을 따르고, 농도의 비교적 작은 변화를 거쳐서 신속하게 증가한다. 이것은 최고-피팅 선의 유도화에 의해 수학적으로 결정될 수 있다.
바람직한 구현예로서, 본 발명에서 결정된 EC50은 인간 종양 세포 위에 노출된 IGF-1R ECD 상에 결합하는 항체 효능을 특성화한다. EC50 매개변수는 FACS 분석을 사용하여 결정된다. EC50 매개변수는 인간 종양 세포에서 발현된 인간 IGF-1R 상의 최대 결합의 50%가 획득되는 항체 농도를 반영한다. 각각의 EC50 값은 4개-매개변수 회귀 곡선 피팅 프로그램 (프리즘 소프트웨어)을 사용하여 용량 반응 곡선의 중간점으로서 계산되었다. 이러한 매개변수는 생리학적/병리학적 병태를 예시하는 것으로서 선택되었다.
용어 "에피토프"는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다. 에피토프는 구조적 또는 기능적인 것으로서 정의될 수 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 부분 집합이고, 상호작용의 친화도에 직접적으로 기여하는 이들 잔기를 포함한다. 또한, 에피토프는 입체형태를 갖고, 즉 비-선형의 아미노산으로 구성될 수 있다. 특정 구현예에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 기, 또는 설포닐 기와 같은 분자의 화학적으로 활성을 갖는 표면 군집화인 결정기를 포함할 수 있고, 특정 구현예에서, 특이적인 삼차원 구조적 특징들 및/또는 특이적인 전하 특징들을 갖을 수 있다.
용어 "단일클론 항체" 또는 "Mab"는 본원에 사용되는 바, 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 획득되고, 즉 집단의 개별 항체는 소량들로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이들을 제외하고는 동일하다. 단일클론 항체는 매우 특이적이고, 단일 에피토프에게로 유도된다. 이러한 단일클론 항체는 B 세포 또는 하이브리도마의 단일 클론에 의해 생산될 수 있다. 또한, 단일클론 항체는 재조합일 수 있고, 즉 단백질 공학 또는 화학적 합성에 의해 생산된다. 또한, 단일클론 항체는 파지 항체 라이브러리로부터도 단리될 수 있다. 또한, 전형적으로 다양한 결정기 또는 에피토프에게로 유도되는 다양한 항체를 포함하는 다중클론 항체의 제조와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원의 단일 에피토프에게로 유도된다. 본원에서의 단일클론 항체는 마우스, 키메라 및 인간화 항체를 포함한다.
용어 "키메라 항체"는 주어진 종의 항체로부터 유래한 천연 가변 영역 (경쇄 및 중쇄)을 상기 주어진 종에 대한 이종유래의 종의 항체 경쇄 및 중쇄의 불변 영역과 조합하여 포함하는 항체를 말한다. 키메라 항체는 재조합 유전학의 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 키메라 항체는 프로모터 및 비-인간 명확하게 마우스 단일클론 항체의 가변 영역을 코딩하는 서열 및 이종유래 종 바람직하게 인간 항체 불변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 DNA를 클로닝함으로써 생산될 수 있다. 이러한 재조합 유전자 하나에 의해 코딩되는 본 발명에 따른 키메라 항체는 예를 들면 마우스-인간 키메라일 수 있고, 이러한 항체의 특이성이 마우스 DNA로부터 유래한 가변 영역에 의해 결정되고, 이의 이소형이 인간 DNA로부터 유래한 불변 영역에 의해 결정된다.
용어 "인간화 항체"는 비-인간 기원의 항체로부터 유래한 CDR 영역을 포함하는 항체를 말하고, 항체 분자의 나머지 부분은 하나의 (또는 여러) 인간 항체로부터 유래한다. 또한, 일정 골격 분절 잔기들 (FR으로 불림)은 결합 친화도를 보존하도록 변형될 수 있다. 인간화 항체 또는 이의 단편은 당업자에게 알려진 기법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 인간화 항체는 시험관내 진단 또는 생체내 예방적 및/또는 치료제 치료가 관여하는 방법에 사용하는데 바람직하다. 또한, 다른 인간화 기법도 예를 들면 유럽 특허 EP 0　451 261, EP 0　682 040, EP 0　939 127, EP 0　566 647, 미국 특허 US 5,530,101, US 6,180,370, US 5,585,089 및 US 5,693,761에서 PDL에 의해 기술된 "CDR 접합 (CDR grafting)" 기법과 같은 기술분야의 당업자에게 숙지되어 있다. 미국 특허 US 5,639,641, US 6,054,297, US 5,886,152 및 US 5,877,293도 인용될 수 있다.
본 명세서에서 반박하는 명시가 없어도, 상보성 결정 영역 또는 CDR은 IMGT 번호매김 체계에 따라 정의된 바와 같이 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 과다가변 영역을 의미한다.
그럼에도 불구하고, CDR은 카밧 번호매김 체계에 따라 또한 정의될 수 있다 (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 제 5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, 및 후속 개정판). 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR가 존재한다. 본원에서, 용어 "CDR" 및 "CDR들"은 경우에 따라서 인식하는 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합 친화도를 부여하는 대부분의 아미노산 잔기를 포함하는 하나 이상 또는 심지어 모든 영역을 가리키는데 사용된다. 본 출원의 해석을 단순화하기 위하여, 카밧에 따른 CDR은 정의되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 당업자에게 IMGT에 따른 CDR의 정의를 사용하여 카밧에 따른 CDR을 정의하는 것은 자명할 것이다.
본 발명의 의미에서, 2개의 핵산 또는 아미노산의 서열 사이의 "동일성 (identity)" 또는 "동일성 백분율"은 최적의 정렬 이후에 획득되어 비교되는 2개 서열 사이에 일치하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 백분율을 의미하고, 이러한 백분율은 순수하게 통계적이며, 2개 서열 사이의 차이는 이들의 길이를 따라 무작위로 분포한다. 두 개의 핵산 또는 아미노산 서열 간의 비교는 통상적으로 최적으로 정렬시킨 이후 서열을 비교함으로써 수행되고, 상기 비교가 분절마다 또는 "정렬창"을 사용하여 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 수동적인 비교와 더불어 스미스 및 워터맨의 로칼 상동성 알고리즘 [Smith and Waterman (1981) Ad. App. Math. 2: 482]에 의해, 네들만 및 운쉬의 로칼 상동성 알고리즘 [Neddleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443]에 의해, 피어슨 및 립만의 유사도 탐색 방법 [Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444]에 의해, 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어에 의해 (위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지, 유전학 컴퓨터 그룹, 575 Science Dr., Madison, WI에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 또는 비교 소프트웨어 BLAST N 또는 BLAST P에 의해) 수행될 수 있다.
동일성 백분율은 아미노산 뉴클레오티드 또는 잔기가 두 개 서열 사이에, 바람직하게 두 개의 완전한 서열 사이에 일치하는 위치들의 수를 결정하고, 동일한 위치의 수를 정렬창의 총 위치의 수로 나누고, 결과를 두 개 서열 간의 동일성 백분율을 획득하도록 100으로 곱함으로써 계산된다.
예를 들면, 웹 사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html 상에서 입수가능한 BLAST 프로그램 "BLAST 2 서열" (Tatusova et al., "Blast 2 서열- 단백질 및 뉴클레오티드 서열을 비교하기 위한 새로운 도구", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174: 247-250)은 디폴트 매개변수 (명확하게, 매개변수의 경우 "오픈 갭 페널티 (open gap penalty)": 5, 및 "연장 갭 페널티 (extension gap penalty)": 2; 선택된 매트릭스가 예를 들면 프로그램에 의해 제시되는 "BLOSUM 62" 매트릭스일 수 있음)와 함께 사용될 수 있고, 비교될 두 개의 서열 간의 동일성 백분율은 프로그램에 의해 직접 계산될 수도 있다.
용어 표현 "역-돌연변이" 또는 "역돌연변이"는 마우스 서열에 초기에 존재하는 상응하는 잔기로 생식계열에 존재하는 인간 잔기의 돌연변이 또는 치환을 의미한다.
본 발명의 상세한 설명에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "핵산", "핵 서열 (nucleic sequence)", "핵산 서열 (nucleic acid sequence)", "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드 서열" 및 " 뉴클레오티드 서열"은, 변형 여부와 상관없이 핵산의 단편 또는 영역을 정의하고, 비-천연 뉴클레오티드를 포함하기도 하고, 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA 또는 상기 DNA들의 전사 산물 중 어느 하나로 존재하는 뉴클레오티드의 정확한 서열을 의미한다.
용어 "펩티드"는 펩티드 (아미드) 결합에 의해 서로 연결된 아미노산 단량체의 사슬에 관한 것이다. 공유 펩티드 결합 (아미드)는 하나의 아미노산의 카르복실기 (COOH)를 또 다른 아미노산의 아미노기 (NH2)와 반응시킴으로써 형성된다.
용어 "단백질"은 번역후 변형 및 단백질 폴딩을 거쳐서 생물학적으로 기능적인 방식으로 배열되는 상기 정의된 바와 같은 1개 또는 여러 개의 펩티드의 조립체이다.
용어 "아미노산"은 본 발명에 사용되는 바, D 또는 L 형태의 천연 α-아미노산 (예로, 알라닌 (Ala), 아르기닌 (Arg), 아스파라진 (Asn), 아스파라긴산 (Asp), 시스테인 (Cys), 글루타민 (Gln), 글루탐산 (Glu), 글리신 (Gly), 히스티딘 (His), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 라이신 (Lys), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 트립토판 (Trp), 타이로신 (Tyr) 및 발린 (Val)), 뿐만 아니라 비-천연 아미노산 (예로, β-알라닌, 알릴글리신, 터르-류신, 3-아미노-아디프산, 2-아미노벤조산, 3-아미노벤조산, 4-아미노벤조산, 2-아미노부탄산, 4-아미노-1-카르복시메틸 피페리딘, 1-아미노-1-시클로부탄카르복실산, 4-아미노시클로헥산아세트산, 1-아미노-1-시클로헥산카르복실산, (1R,2R)-2-아미노시클로헥산카르복실산, (1R,2S)-2-아미노시클로헥산카르복실산, (1S,2R)-2-아미노시클로헥산카르복실산, (1S,2S)-2-아미노시클로헥산카르복실산, 3-아미노시클로헥산카르복실산, 4-아미노시클로헥산카르복실산, (1R,2R)-2-아미노시클로펜탄카르복실산, (lR,2S)-2-아미노시클로펜탄카르복실산, 1-아미노-1-시클로펜탄카르복실산, 1-아미노-1-시클로프로판카르복실산, 4-(2-아미노에톡시)-벤조산, 3-아미노메틸벤조산, 4-아미노메틸벤조산, 2-아미노부탄산, 4-아미노부탄산, 6-아미노헥산산, 1-아미노인단-1-카르복실산, 4-아미노메틸-페닐아세트산, 4-아미노페닐아세트산, 3-아미노-2-나프트산, 4-아미노페닐부탄산, 4-아미노-5-(3-인돌릴)-펜탄산, (4R,5S)-4-아미노-5-메틸헵탄산, (R)-4-아미노-5-메틸헥산산, (R)-4-아미노-6-메틸티오헥산산, (S)-4-아미노-펜탄산, (R)-4-아미노-5-페닐펜탄산, 4-아미노페닐프로피온산, (R)-4-아미노피메르산, (4R,5R)-4-아미노-5-히드록시헥산산, (R)―4-아미노-5-히드록시펜탄산, (R)-4-아미노-5-(p-히드록시페닐)-펜탄산, 8-아미노옥탄산, (2S,4R)-4-아미노-피롤리딘-2-카르복실산, (2S,4S)-4-아미노-피롤리딘-2-카르복실산, 아제티딘-2-카르복실산, (2S,4R)-4-벤질-피롤리딘-2-카르복실산, (S)-4,8-디아미노옥탄산, 터르-부틸글리신산, γ-카르복시글루타메이트, β-시클로헥실알라닌, 시트룰린, 2,3-디아미노 프로피온산, 히푸르산, 호모시클로헥실알라닌, 호모류신, 호모페닐알라닌, 4-히드록시프롤린, 인돌린-2-카르복실산, 이소니페코트산, α-메틸-알라닌, 니코페트산, 노르류신, 노르발린, 옥타히드로인돌-2-카르복실산, 오르니틴, 페니실라민, 페닐글리신, 4-페닐-피롤리딘-2-카르복실산, 피페콜산, 프로파질글리신, 3-피리디닐알라닌, 4-피리디닐알라닌, 1-피롤리딘-3-카르복실산, 사르코신, 스타틴, 테트라히드로이소퀴놀린-1-카르복실산, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산, 또는 트라넥삼산)를 말한다.
상세한 설명
링커 모이어티
본 발명에 따른 링커 모이어티는 항체를 적어도 하나의 약물 모이어티에 공유 결합하는 것이 가능하게 한다.
링커 모이어티는 "절단 불가능한" 또는 "절단가능한"일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 이것은 세포에서 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한" 링커 모이어티로 구성된다.
예를 들면, 일정 구현예에서, 링커는 세포내 환경에 (예로, 리소좀 또는 엔도좀 또는 함몰 소포 (caveolea) 내에) 존재하는 절단화제에 의해 절단가능하다. 링커는 예를 들면, 이에 제한되지 않지만 리소좀 또는 엔도좀 프로테아제를 포함하는 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 전형적으로, 펩티딜 링커는 적어도 2개의 연속적 아미노산 또는 적어도 3개의 연속적 아미노산을 포함한다. 절단화제는 카텝신 B, D 및 플라스민을 포함할 수 있고, 이 모두는 디펩티드 약물을 가수분해하여 표적 세포 내에 활성 약물의 방출을 생성하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 암성 조직에서 높게 발현되는 티올-의존성 프로테아제 카텝신 B에 의해 절단가능한 펩티딜 링커가 사용될 수 있다 (예로, Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly를 포함하는 링커). 상세한 구현예에서, 세포내 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티딜 링커는 Val-Cit, Phe-Lys 또는 Val-Ala이거나, 이를 포함한다. 약물의 세포내 단백질 분해 방출을 사용하는 하나의 장점은 약물이 전형적으로 컨쥬게이션될 때 약화되고, 컨쥬게이트의 혈청 안정성도 전형적으로 높은 것이다.
-L1-(CO)c-기는 반드시 존재하는 링커 모이어티의 스트레쳐 단위를 나타낸다. -L1-(CO)c-기는 화학식 -L1'-(CO-Z')z'-(CO)c-의 기이고, z' 및 c가 0 또는 1, 예컨대 z'이 0일 때 -L1'-(CO)c- 기이다. 바람직하게, w 및 y 중 적어도 하나가 0이 아닐 때, 다음으로 z'는 0이고, 나머지 경우에는 z'가 0 또는 1이다.
L1'은 -(CH2)n-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 시클로알칸디일, -(CH2)n-아릴렌-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-, -(CH2)n-시클로알칸디일-, -아릴렌-(CH2)p-, -헤테로아릴렌-(CH2)p-, -시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2)n-아릴렌-(CH2)p-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-(CH2)p-, -(CH2)n-시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-아릴렌-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-헤테로아릴렌-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2)n-아릴렌-CH2-CH2-(OCH2CH2)m-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-CH2-CH2-(OCH2CH2)m- 또는 -(CH2)n-시클로알칸디일-CH2-CH2-(OCH2CH2)m-을 나타낸다. 보다 구체적으로, 아릴렌은 페닐렌이고, 시클로알칸디일은 파라-시클로헥산디일과 같은 시클로헥산디일이고, 헤테로아릴렌은 2가의 1H-1,2,3-트리아졸과 같은 2가의 1,2,3-트리아졸이다.
구체적인 구현예에 따르면, L1'은 -(CH2)n-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-, 아릴렌, -시클로알칸디일-, -(CH2)n-아릴렌-, -아릴렌-(CH2)n-, -(CH2)n-시클로알칸디일-, -시클로알칸디일-(CH2)n-,
Figure pct00030
를 나타낸다. 보다 구체적으로, 아릴렌은 페닐렌이고, 시클로알칸디일은 시클로헥산디일 예컨대 파라-시클로헥산디일이다.
또 다른 구체적인 구현예에 따르면, L1'은 -(CH2)n- 또는 -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-, 명확하게 -(CH2)5-와 같은 -(CH2)n- 를 나타낸다.
L1' 스트레쳐 단위 모이어티는 스트레쳐 단위 모이어티 CO-Z'로서, Z'가 z' = 1일 때 -CO-NR4-(CH2)u-NR5- 또는 -CO-NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v-인 것으로 완성될 수 있다. R4 및 R5은 독립적으로 H 또는 (C1-C6)알킬, 예컨대 H 또는 Me이고, u 및 v는 독립적으로 1 내지 6, 예컨대 1 내지 4의 정수, 명확하게 1 또는 2, 예로 2이다.
(W)w는 링커의 아미노산 단위를 나타낸다.
링커의 아미노산 단위는 이에 한정되지 않는 종양 관련 프로테아제를 포함하는 효소에 의해 효소적으로 절단되어 약물을 방출할 수 있다.
아미노산 단위는 특정한 종양 관련 프로테아제에 의한 효소적 절단에 대한 이의 선택도에서 설계되고, 최적화될 수 있다. 적합한 단위는 프로테아제, 카텝신 B, C, D 및 플라스민 프로테아제에 의해 이의 절단이 촉매화되는 단위이다.
(W)w는 부재하거나 (w = 0), 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 또는 펜타펩티드 단위일 수 있고, 여기서 펩티드를 형성하는 아미노산은 서로 상이할 수 있다.
따라서 (W)w는 화학식: (W1)w1(W2)w2(W3)w3(W4)w4(W5)w5으로 나타낼 수 있고, 여기서 W1 내지 W5 각각은 서로 독립적으로 아미노산 단위를 나타내고 w1 내지 w5 각각은 0 또는 1이다.
일정 구현예에서, 아미노산 단위 (W)w는 자연 발생 아미노산과 같은 아미노산 잔기, 뿐만 아니라 시트룰린과 같은 소수의 아미노산 및 비-자연 발생 아미노산 유사체를 포함할 수 있다.
아미노산 단위 (W)w의 아미노산 잔기는 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 아세틸 또는 포르밀로 보호되거나 보호되지 않는 라이신, 아르기닌, 토실 또는 니트로 기들로 보호되거나 보호되지 않는 아르기닌, 히스티딘, 오르니틴, 아세틸 또는 포르밀로 보호되거나 보호되지 않는 오르니틴 및 시트룰린을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 아미노산 링커 구성성분은 바람직하게 디펩티드 또는 트리펩티드를 포함한다.
예시적인 디펩티드는 Val-Cit, Ala-Val, Ala-Ala, Val-Ala, Lys-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Phe, Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg 및 Phe-N9-니트로-Arg, 바람직하게 Val-Cit 또는 Val-Ala을 포함한다.
예시적인 트리펩티드는 Val-Ala-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Phe-Phe-Lys, Gly-Gly-Gly, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys을 포함한다.
예시적인 테트라펩티드는 Gly-Phe-Leu-Gly (서열번호 53), Ala-Leu-Ala-Leu (서열번호 54)을 포함한다.
예시적인 펜타펩티드는 Pro-Val-Gly-Val-Val (서열번호 55)을 포함한다.
구체적인 구현예에 따르면, (W)w는 Val-Cit 또는 Val-Ala, 바람직하게 Val-Cit와 같은 디펩티드 (즉, w = 2)일 수 있거나, 링커가 아미노산 단위를 결여한다 (w = 0). 링커가 아미노산 단위를 결여할 때, 바람직하게 스페이서 단위 Y도 결여한다 (y = 0).
바람직한 구현예에 따르면, w = 0 (즉, (W)w가 단일 결합임) 또는 w = 2 (즉, (W)w가 디펩티드임)이고, 따라서 (W)w는
Figure pct00031
로부터 선택되고, 구체적으로 Val-Cit이고,
여기서 별표는 스페이서 단위 (Y)y에 대한 부착점을 표시하고, 물결선은 -L1-(CO)c- (c = 1인 경우 CO 또는 C = 0인 경우 L1)에 대한 부착점을 표시한다.
Y는 링커의 스페이서 단위를 나타낸다.
스페이서 단위들은 2가지 일반적인 유형을 갖는다: 자가-희생 및 비-자가-희생. 비-자가-희생적 스페이서 단위는 스페이서 단위의 일부 또는 전부가 항체-약물 컨쥬게이트로부터 아미노산 단위의 효소적 절단 이후에 약물에 대한 결합이 남는다. 비-자가-희생적 스페이서 단위의 예는 (글리신-글리신) 스페이서 단위 및 글리신 스페이서 단위를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 약물을 방출하기 위하여, 독립적인 가수분해 반응이 표적 세포 내에서 발생하여 글리신-약물 단위 결합을 절단한다.
자가-희생 스페이서 단위는 별도의 가수분해 단계를 필요로 하지 않고도 약물을 방출할 수 있다. 이들 구현예에서, (Y)는 PAB 기의 질소 원자를 통해 (W)w에 연결되고, 에스테르, 카보네이트, 카바메이트 또는 에테르 기를 통해 약물에 직접 연결되는 p-아미노벤질 알코올 단위 (PAB)의 잔기이다.
본 발명에서, 스페이서 단위 (Y)는 -PAB-CO-(Z)z-이고, PAB가 파라-아미노벤질-O-CO-로도 불리는
Figure pct00032
(PAB 단위의 산소가 카르보닐에 연결됨)이고, y = 1 또는 링커가 스페이서 단위를 결여한다 (y = 0).
스페이서 -파라-아미노벤질-O-CO-는 z = 1일 때 -NR4-(CH2)u-NR5- 또는 -NR4-(CH2)u-NR5-CO- 또는 심지어 -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v- 또는 -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v-CO-인 스페이서 Z와 함께 완성될 수 있다. R4 및 R5은 독립적으로 H 또는 (C1-C6)알킬, 예컨대 H 또는 Me이다. u 및 v는 독립적으로 1 내지 6, 예컨대 1 내지 4의 정수, 명확하게 1 또는 2, 예로 2이다.
유리하게, w가 0일 때 y는 0이거나, w가 1 내지 5의 정수일 때 y는 0 또는 1이고, 스페이서 단위 Y가 아미노산 단위 W가 존재할 때만 존재할 수 있음을 의미한다.
바람직하게, w가 0일 때 y는 0이고, w가 1 내지 5의 정수일 때 y는 1이고, 스페이서 단위 Y가 아미노산 단위 (W)w가 존재할 때 존재하고, 아미노산 단위 (W)w가 부재할 때 부재함을 의미한다.
구체적인 구현예에 따르면, -L1-(CO)c-(W)w-(Y)y- 기는 -(CH2)n-, -(CH2)n-CO-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-CO-, -CH2-파라-시클로헥실-CO-, -아릴-(CH2)n-, -(CH2)n-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-, -(CH2)n-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-, -CH2-파라-시클로헥실-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-, -아릴-(CH2)n-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-, -아릴-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-, -(CH2)n-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-, -(CH2)n-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-, -CH2-파라-시클로헥실-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-, -아릴-(CH2)n-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-, -아릴-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-, -(CH2)n-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -(CH2)n-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -CH2-파라-시클로헥실-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -아릴-(CH2)n-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -아릴-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -(CH2)n-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -(CH2)n-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -CH2-파라-시클로헥실-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -아릴-(CH2)n-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -아릴-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -(CH2)n-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -(CH2)n-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -CH2-파라-시클로헥실-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -아릴-(CH2)n-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -아릴-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -(CH2)n-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -(CH2)n-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -CH2-파라-시클로헥실-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -아릴-(CH2)n-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -아릴-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-,
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
를 나타낸다.
또한, -L1-(CO)c-(W)w-(Y)y- 기는 -(CH2)n-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -(CH2)n-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -CH2-파라-시클로헥실-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -CH2-파라-시클로헥실-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -아릴-(CH2)n-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -아릴-(CH2)n-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -(CH2)n-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-, -(CH2)n-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -CH2-파라-시클로헥실-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-, -CH2-파라-시클로헥실-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -아릴-(CH2)n-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-, -아릴-(CH2)n-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-, -아릴-(CH2)n-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -(CH2)n-CO-NH-(CH2)u-NH-, -(CH2)n-CO-NH-(CH2)u-NH-CO-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-CO-NH-(CH2)u-NH-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-CO-NH-(CH2)u-NH-CO-, -CH2-파라-시클로헥실-CO-NH-(CH2)u-NH-, -CH2-파라-시클로헥실-CO-NH-(CH2)u-NH-CO-, -아릴-(CH2)n-CO-NH-(CH2)u-NH-, -아릴-(CH2)n-CO-NH-(CH2)u-NH-CO-, -(CH2)n-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -(CH2)n-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -(CH2)n-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -(CH2)n-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -CH2-파라-시클로헥실-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -CH2-파라-시클로헥실-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -아릴-(CH2)n-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -아릴-(CH2)n-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -아릴-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -아릴-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -(CH2)n-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -(CH2)n-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -(CH2)n-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -(CH2)n-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -CH2-파라-시클로헥실-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -CH2-파라-시클로헥실-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -아릴-(CH2)n-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -아릴-(CH2)n-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -아릴-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v- 또는 -아릴-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-를 나타낼 수 있다.
또 다른 구체적인 구현예에 따르면, -L1-(CO)c-(W)w-(Y)y- 기는 -(CH2)n-, -(CH2)n-CO-, -(CH2)n-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-, -(CH2)n-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-, -(CH2)n-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-, -(CH2)n-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-, -(CH2)n-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -(CH2)n-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -(CH2)n-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -(CH2)n-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -(CH2)n-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -(CH2)n-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -(CH2)n-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO- 또는 -(CH2)n-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-를 나타내고, n 및 u가 이전에 정의된 바와 같고, 명확하게 n = 5 및 u = 2이다.
또한, -L1-(CO)c-(W)w-(Y)y- 기는 -(CH2)n-CO-NH-(CH2)u-NH-, -(CH2)n-CO-NH-(CH2)u-NH-CO-, -(CH2)n-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-, -(CH2)n-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -(CH2)n-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -(CH2)n-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -(CH2)n-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -(CH2)n-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -(CH2)n-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -(CH2)n-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -(CH2)n-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -(CH2)n-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -(CH2)n-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v- 또는 -(CH2)n-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-를 나타내고, n, u 및 v가 이전에 정의된 바와 같고, 명확하게 n = 5 및 u = v = 2이다.
바람직한 구현예에 따르면, -L1-(CO)c-(W)w-(Y)y- 기는 -(CH2)n-CO-, -(CH2)n-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-, -(CH2)n-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-, -(CH2)n-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -(CH2)n-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NH-(CH2)u-NH-, -(CH2)n-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO- 또는 -(CH2)n-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-를 나타내고, n 및 u가 이전에 정의된 바와 같고, 명확하게 n = 5 및 u = 2이다.
또한, -L1-(CO)c-(W)w-(Y)y- 기는 -(CH2)n-CO-NH-(CH2)u-NH-, -(CH2)n-CO-NH-(CH2)u-NH-CO-, -(CH2)n-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-, -(CH2)n-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-, -(CH2)n-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -(CH2)n-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -(CH2)n-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-, -(CH2)n-CO-Val-Cit-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-, -(CH2)n-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v- 또는 -(CH2)n-CO-Val-Ala-파라-아미노벤질-O-CO-NCH3-(CH2)u-NCH3-CO-(CH2)v-CO-를 나타낼 수 있고, n, u 및 v가 이전에 정의된 바와 같고, 명확하게 n = 5 및 u = v = 2이다.
Figure pct00037
기, 바람직하게
Figure pct00038
는 항체와 같은 결합 단위와 반응하여 상기 결합 단위 상에 존재하는 설프히드릴 기 덕분에 이에 약물 모이어티를 부착시킬 작용기이다. 설프히드릴 기는 구체적으로 항체에서, 존재하는 경우 결합 단위의 분자간 디설파이드 결합의 환원에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 설프히드릴 기는 2-이미노티올란 또는 다른 설프히드릴 생성 시약과 결합 단위의 라이신 모이어티의 아미노기의 반응에 의해 생성될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 항체와 같은 결합 단위는 하나 이상의 라이신을 보유하도록 조작된다. 더욱 바람직하게, 항체와 같은 결합 단위는 하나 이상의 시스테인 (예로, 티오 Mab)을 보유하도록 조작될 수 있다.
X1 및 X2는 서로 독립적으로 H, Cl 또는 Br과 같은 할로겐 원자, (C1-C6)알콕시, 선택적으로 치환된 아릴옥시 또는 -O-(CH2CH2O)rH를 나타내고, 단 X1 및 X2는 동시에 H를 나타내지 않는다. 보다 구체적으로, 아릴옥시는 할로겐, CN, NO2 및 1개 또는 여러 개의 불소 원자와 같은 할로겐 원자로 선택적으로 치환된 아릴옥시 (예로, 펜옥시)로부터 선택된 1개 또는 여러 개 (예로, 1개)의 기로 선택적으로 치환된다. 구체적으로, 아릴옥시는 CN, NO2 및 펜타플루오로페닐옥시로부터 선택된 1개 또는 여러 개 (예로, 1개)의 기로 선택적으로 치환되고, 명확하게 CN으로 선택적으로 치환된다. 아릴옥시는 구체적으로 페닐옥시일 수 있다.
구체적인 구현예에 따르면, X1 및 X2는 서로 독립적으로 H, Cl 또는 Br과 같은 할로겐 원자, (C1-C6)알콕시, 선택적으로 치환된 아릴옥시를 나타내고, 단 X1 및 X2가 동시에 H를 나타내지 않는다. 보다 구체적으로, 아릴옥시는 할로겐, CN, NO2 및 1개 또는 여러 개의 불소 원자와 같은 할로겐 원자로 선택적으로 치환된 아릴옥시 (예로, 펜옥시)로부터 선택된 1개 또는 여러 개 (예로, 1개)의 기로 선택적으로 치환된다. 구체적으로, 아릴옥시는 CN, NO2 및 펜타플루오로페닐옥시로부터 선택된 1개 또는 여러 개 (예로, 1개)의 기로 선택적으로 치환되고, 명확하게 CN으로 선택적으로 치환된다. 아릴옥시는 구체적으로 페닐옥시일 수 있다.
또 다른 구체적인 구현예에 따르면, X1 및 X2는 서로 독립적으로 H, Cl, Br, 메톡시 또는 CN 명확하게 H, Cl 또는 Br로 치환된 페닐옥시를 나타내고, 단 X1 및 X2가 동시에 H를 나타내지 않는다.
유리하게, X1 및 X2는 동일하고, H가 아니거나, X1 및 X2 중 하나는 H이고, 나머지는 H가 아니다. X1 및/또는 X2가 H가 아닐 때, 이것은 Cl 또는 Br와 같은 할로겐 원자, (C1-C6)알콕시, 선택적으로 치환된 아릴옥시 또는 -O-(CH2CH2O)rH이고, 구체적으로 Cl 또는 Br와 같은 할로겐 원자, (C1-C6)알콕시 또는 바람직하게 Cl, Br, 메톡시 또는 CN으로 치환된 페닐옥시로 치환된 아릴옥시이고, 구체적으로 Cl 또는 Br이다.
q는 0, 1 또는 2를 나타낸다. 바람직하게, q는 2를 나타낸다.
X3은 항체와 같은 결합 단위에 궁극적으로 약물을 공유 결합시키기 위하여, 약물 (QH 또는 Q-OH)과 반응을 목적으로 하는 작용기 (선택적으로 y = z = 1, Z가 -NR4-(CH2)u-NR5-일 때 Z의 말단 질소를 갖거나, c = w = y = 0, z' = 1, Z'가 -NR4-(CH2)u-NR5-일 때 Z'의 말단 질소를 갖음)를 나타낸다.
또한, 설포말레이미드 기능을 보유하는 스트레쳐 단위를 연결하기 이전에, 먼저 스페이서 단위 Y 및 아미노산 단위 (W)w를 존재하는 경우 약물 모이어티 상에 도입하는 것이 고려될 수 있다. 이 경우에, w = y = 0 (즉, 스트레쳐 단위 및 설포말레이미드 기능만을 포함함)인 화학식 (I)의 화합물이 사용될 것이고, 이 경우에 X3는 약물 단위에 이미 부착된 아미노산 단위 (W)w 또는 스페이서 단위 Y와 반응할 작용기를 나타낸다.
X3은 y = z = 1, Z가 -NR4-(CH2)u-NR5-일 때 또는 c = w = y = 0, z'　= 1, Z'가 -NR4-(CH2)u-NR5-일 때 H를 나타내고 (Z 또는 Z' 기의 말단 질소를 갖는 NH 작용기를 형성함), 나머지 경우에 X3은 OH, NH2 또는 이탈기, 예컨대 OH 또는 이탈기를 나타낸다. 이탈기는 할로겐 원자 (예로, Cl, Br, I),설포네이트 (예로, OTf, OMs, OTs), N-숙신이미딜옥시, 4-니트로-페닐옥시, 펜타플루오로페닐옥시 또는 N-벤조트리아졸옥시일 수 있다. 구체적으로, X3은 y = z = 1, Z가 -NR4-(CH2)u-NR5-일 때 또는 c = w = y = 0, z'　= 1, Z'가 -NR4-(CH2)u-NR5-일 때 H를 나타내고, 나머지 경우에 X3은 보다 구체적으로 OH, Cl 또는 N-숙신이미딜옥시를 나타낸다.
약물 모이어티
약물 모이어티 (Q)는 약물 QH 또는 약물 Q-OH의 잔기이다.
본 발명에 따른 약물은 인간 또는 수의 요법에, 명확하게 암의 치료에 유용한 임의의 약물일 수 있다. 이것은 특히 세포독 제제일 수 있다. 유리하게, 이러한 약물은 링커 모이어티에 이 약물을 연결할 수 있도록 작용기를 포함한다. 또한, 이러한 작용기를 약물 상에 부가하여 연결을 수행하는 것이 고려될 수 있다. 이 작용기는 예를 들면 OH, SH, NH 또는 COOH일 수 있고, 링커의 X3 말단과 반응하여 링커 모이어티에 약물을 연결할 것이다. 커플링 반응은 예를 들면 친핵성 치환 (예로, X3 = 이탈기와 OH, SH, NH 또는 COOH의 반응), 펩티드 커플링 (예로, X3 = NH2 또는 NH로 끝나는 ZX3 또는 Z'X3와 COOH의 반응), 에스테르화 (COOH 및 OH 사이의 반응), 미쯔노부 반응 등일 수 있다.
약물 모이어티 Q는 예를 들면
- 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF) (이의 말단 NH 또는 COOH 기에 의해 연결됨), 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) (이의 말단 NH 또는 OH 기에 의해 연결됨), 모노메틸 돌라스타틴-10 (이의 말단 NH 기에 의해 연결됨)의 잔기 또는 하기에 정의된 바와 같은 화학식 (C)의 약물 모이어티와 같은 이의 유도체와 같은 아우리스타틴 유도체의 잔기;
Figure pct00039
- 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신 또는 이다루비신 (-COCH2OH의 NH2 기 또는 OH 기에 의해 연결됨), 또는 2-피롤로독소루비신 또는 프로-2-피롤로독소루비신 (-COCH2OH의 OH 기에 의해 연결됨)와 같은 이의 유도체, 또는 PNU-159682 (-COCH2OH의 OH 기에 의해 연결됨) 또는 이의 유도체의 잔기와 같은 안트라사이클린의 잔기; 구체적으로, 명확하게 하기에 도시된 바와 같은 독소루비신 (-COCH2OH의 NH2 기 또는 OH 기에 의해 연결됨), 2-피롤로독소루비신, 프로-2-피롤로독소루비신 (-COCH2OH의 OH 기에 의해 연결됨) 또는 PNU-159682 (-COCH2OH의 OH 기에 의해 연결됨)의 잔기 또는 PNU-159682 유도체의 잔기; 바람직하게 하기에 도시된 바와 같은 PNU-159682 (-COCH2OH의 OH 기에 의해 연결됨)의 잔기 또는 PNU-159682의 유도체 (COOH에 의해 연결됨)의 잔기;
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
- 캄프토테신 또는 SN-38 (이의 OH 기에 의해 연결됨)과 같은 이의 유도체의 잔기;
Figure pct00043
- 튜불린 A, 튜불린 B, 튜불린 C 또는 튜불린　D과 같은 튜불린 (존재할 때 COOH 기 또는 OH 기에 의해 연결됨)의 잔기;
Figure pct00044
- 에스퍼라미신 또는 칼리케아미신 γ1과 같은 칼리케아미신 또는 N-아세틸 디메틸 히드라지드 칼리케아미신 (이의 히드라지드 모이어티에 의해 연결됨)과 같은 이의 유도체의 잔기;
Figure pct00045
- 메이탄신 (메이탄신으로도 불림)과 같은 메이탄시노이드 또는 DM1 또는 DM4 (SH 기에 의해 연결됨)과 같은 이의 유도체의 잔기; 구체적으로 DM1 또는 DM4 (SH 기에 의해 연결됨)의 잔기;
Figure pct00046
- 듀오카마이신 A, 듀오카마이신 B1, 듀오카마이신 B2, 듀오카마이신 C1, 듀오카마이신 C2, 듀오카마이신 D 듀오카마이신 SA 또는 CC-1065 (CONH2 기에 의해 연결됨)와 같은 듀오카마이신의 잔기; 구체적으로, CC-1065 (CONH2 기에 의해 연결됨)의 잔기;
Figure pct00047
- α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴 또는 ε-아마니틴과 같은 아마니틴 (OH, NH, COOH 또는 CONH2 기, 구체적으로 OH 기에 의해 연결됨)의 잔기; 구체적으로 α-아마니틴 (명확하게, CH2OH 기에 의해 연결됨)의 잔기;
Figure pct00048
Figure pct00049
- 안트라마이신 (이의 OH 또는 NH2 기에 의해 연결됨) 또는 SGD-1882 (이의NH2 기에 의해 연결됨)과 같은 피롤로벤조디아제핀 (PBD)의 잔기; 구체적으로 SGD-1882 (이의 NH2 기에 의해 연결됨)의 잔기;
Figure pct00050
- STING (인터페론 유전자의 자극인자) 작동제, 유리하게 하기에 정의된 바와 같은 화학식 (D) (OH, SH 또는 NH에 의해 연결됨)의 잔기 또는 에파카도스타트 (INCB024360) 또는 BMS-986205와 같은 IDO (인돌아민 2,3-디옥시게나제) 저해제의 잔기와 같은 면역 체크포인트의 활성인자의 잔기일 수 있다.
유리하게, 약물 모이어티 Q는
- MMAF (이의 말단 NH 또는 COOH 기에 의해 연결됨), MMAE (이의 말단 NH 또는 OH 기에 의해 연결됨), 모노메틸 돌라스타틴-10 (이의 말단 NH 기에 의해 연결됨)의 잔기 또는 하기에 정의된 바와 같은 화학식 (C)의 약물 모이어티와 같은 아우리스타틴 유도체의 잔기;
- STING 작동제, 명확하게 하기 정의된 화학식 (D)의 잔기; 또는
- 상기 정의된 바와 같은 안트라사이클린의 잔기, 바람직하게 하기 도시된 바와 같은 PNU-159682 또는 이의 유도체의 잔기이다.
Figure pct00051
약물 모이어티 Q는 구체적으로 상기 정의된 바와 같은 안트라사이클린의 잔기, 바람직하게 하기 도시된 바와 같은 PNU-159682 또는 이의 유도체의 잔기이다.
Figure pct00052
제 1 구현예에 따르면, 아우리스타틴 유도체의 잔기는 하기 화학식 (C)를 갖고,
Figure pct00053
여기서 R1은 H 또는 OH이고,
R2는 (C1-C6)알킬 (예로, 메틸), COOH, COO-((C1-C6)알킬) (예컨대 COOMe) 또는 티아졸릴 (예컨대, 티아졸-2-일)이고,
R3는 H 또는 (C1-C6)알킬 (예컨대 메틸), 구체적으로 (C1-C6)알킬기이고,
X4는 O 또는 NR9이고,
R9는 H 또는 (C1-C6)알킬 (예컨대 메틸)이고,
t는 1 내지 8, 구체적으로 1 내지 6, 유리하게 1 내지 4의 정수, 바람직하게 1 또는 2이다.
구체적인 구현예에 따르면,
R1은 OH이고, R2는 메틸과 같은 (C1-C6)알킬이거나;
R1은 H이고, R2는 티아졸-2-일과 같은 티아졸릴, COOMe와 같은 COO-(C1-C6)알킬 또는 COOH이다.
유리하게, R1은 H이고, R2는 티아졸-2-일과 같은 티아졸릴, COOMe와 같은 COO-(C1-C6)알킬 또는 COOH이다. 바람직하게, R1은 H이고, R2는 COOH 또는 COOMe, 구체적으로 COOH이다.
t는 1 내지 8, 구체적으로 1 내지 6, 유리하게 1 내지 4의 정수, 바람직하게 1 또는 2이다.
유리하게, R3는 (C1-C6)알킬이고, 바람직하게 메틸기이고,
구체적인 구현예에 따르면, R1은 H이고, R2는 COOH 또는 COOMe (바람직하게 COOH)이고, R3는 메틸이고, t는 1 또는 2이다.
유리하게, X4는 NR9이고, R9가 H 또는 (C1-C6)알킬이고, 바람직하게 H 또는 메틸이다.
바람직한 구현예에서,
R1은 H이고, R2는 COOH이고, R3는 메틸이고, X4는 NR9이고, R9는 메틸이고, t는 1 또는 2이거나,
R1은 H이고, R2는 COOH이고, R3는 메틸이고, X4는 NR9이고, R9는 H이고, t는 1 또는 2이다.
바람직한 구현예에 따르면, X4 기는 (CH2)t 기와 관련하여 파라 위치의 페닐 고리 상에 위치한다.
유리하게, 화학식 (C)의 아우리스타틴의 잔기는 하기의 모이어티로부터 선택된다:
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
.
이러한 아우리스타틴 유도체의 제조는 예를 들면 국제특허출원 WO 2014/174064 또는 WO 2015/162293에 개시되어 있다.
제 2 구현예에 따르면, STING 작동제는 하기 화학식 (X)를 갖고,
Figure pct00057
여기서 X11 및 X21은 독립적으로 O 또는 S, 바람직하게 O이고,
X12 및 X22은 독립적으로 OH 또는 SH, 바람직하게 SH이고,
A11 및 A21은 독립적으로 하기 화학식의 기이고,
Figure pct00058
;
바람직하게
Figure pct00059
이고, 여기서
● Z1은 OR11 또는 NR11R12이고, R11 및 R12가 독립적으로 H, R13 또는 COR13이고, R13이 (C1-C6)알킬, 아릴 또는 아릴(C1-C6)알킬이고,
● Z2는 H 또는 NR21R22이고, R21 및 R22가 독립적으로 H, R23 또는 COR23이고, R23이 (C1-C6)알킬, 아릴 또는 아릴(C1-C6)알킬이고,
● Z3은 N 또는 CR33, 바람직하게 N이고, R33은 H 또는 F 또는 Cl과 같은 할로겐 원자이고,
● Z4는 H 또는 (C1-C6)알킬이고,
A12 및 A22는 독립적으로 H, OH 또는 F이고,
A2는 H이거나, A2 및 A22는 다함께 연결되고, A2가 CH2이고, A22가 O이다.
Z1 이 OH이거나, Z4가 H일 때, 하기의 호변체가 획득될 수 있다:
Figure pct00060
구체적인 구현예에 따르면, STING 작동제는 하기 화학식 중 하나를 갖고,
Figure pct00061
여기서 X11, X21, X12, X22, A11, A21, A12, A22 및 A2는 상기 또는 하기에 정의된 바와 같다.
구체적인 구현예에 따르면, STING 작동제는 하기 화학식 중 하나를 갖고,
Figure pct00062
여기서 X11, X21, X12, X22, A11, A21, A12, A22 및 A2은 상기 또는 하기에 정의된 바와 같다.
유리하게, X11 및 X21은 둘 다 O이다. 유리하게, X11 및 X21 중 적어도 하나는 SH이고, 바람직하게 X11 및 X21은 둘 다 SH이다. 바람직하게, X11 및 X21은 둘 다 O이고, 바람직하게 X11 및 X21은 둘 다 SH이다.
구체적으로, 바람직하게 X11 및 X21은 둘 다 H이고, 유리하게 R11, R12, R21 및 R22 각각은 H이다.
Z3는 구체적으로 N이다. 유리하게, Z1은 OH 또는 NH2이고, Z2는 H 또는 NH2이고, Z3는 N이고, Z4는 H이다.
바람직하게, A11 및 A21은 독립적으로
Figure pct00063
로부터 선택되고, 더욱 바람직하게 시토신, 아데닌, 아데닌-6-벤즈아미드, 2,6-디아미노퓨린, 하이폭산틴, 구아닌 및 구아닌-2-이소부티르아미드로부터 선택되고, 가장 바람직하게 아데닌, 하이폭산틴 및 구아닌으로부터 선택된다.
구체적으로, 이것은 하기 화학식의 ADU-S100일 수 있다:
Figure pct00064
.
대안적으로, 이것은 구체적으로 Lioux et al. J. Med. Chem., 2016, 59 (22), pp 10253-10267에 구체적으로 개시된 하나의 화합물일 수 있다.
이러한 STING 작동제는 예를 들면 국제특허출원 WO 2014/179335, WO 2016/096174, WO 2016/145102, WO 2017/106740 또는 WO 2018/100558에 개시되어 있다.
상기 STING 작동제는 링커 모이어티에 분자 상에 존재하는 SH, OH 또는 NH 기에 의해, 즉 X12 (OH 또는 SH), X22 (OH 또는 SH), R21 및 R22 중 적어도 하나가 H (OH, NHR21 또는 NHR22)일 때 Z1 또는 R21 및 R22 중 적어도 하나가 H (NHR21 또는 NHR22)일 때 Z2 기에 의해 연결된다. 바람직하게, R21 및 R22 중 적어도 하나가 SH이고, STING 작동제는 SH 기에 의해 연결된다.
결론적으로, STING 작동제의 잔기는 유리하게 하기 화학식 (D), (D-1), (D-2), (D-3), (D-1a), (D-2a) 또는 (D-3a)를 갖고,
Figure pct00065
Figure pct00066
여기서 X11 및 X21은 상기 정의된 바와 같고,
X12 및 X22은 상기 정의된 바와 같거나, O 또는 S이고,
A11 및 A21은 상기 정의된 바와 같고, 즉 독립적으로 하기 화학식의 기이고,
Figure pct00067
;
바람직하게
Figure pct00068
이고, 여기서
● Z1은 상기 정의된 바와 같거나, O 또는 NR11이고,
● Z2은 상기 정의된 바와 같거나, R21이고,
● Z3은 상기 정의된 바와 같고,
● Z4는 상기 정의된 바와 같고,
A12 및 A22는 상기 정의된 바와 같고,
A2는 상기 정의된 바와 같고,
여기서
■ X12가 O 또는 S일 때, 다음으로 X22는 O이 아니고, S가 아니며, Z1은 O가 아니고, NR11이 아니며, Z2는 NR21이 아니고, STING 작동제의 잔기는 X12에 의해 분자의 잔여부에 연결되고;
■ X22가 O 또는 S일 때, 다음으로 X12는 O이 아니고, S가 아니며, Z1은 O가 아니고, NR11이 아니며, Z2는 NR21이 아니고, STING 작동제의 잔기는 X22에 의해 분자의 잔여부에 연결되고;
■ Z1이 O 또는 NR11일 때, 다음으로 X12는 O이 아니고, S가 아니며, X22는 O가 아니고, S가 아니며, Z2는 NR21이 아니고, STING 작동제의 잔기는 Z1에 의해 분자의 잔여부에 연결되고;
■ Z2가 NR21일 때, 다음으로 X12는 O이 아니고, S가 아니며, X22는 O가 아니고, S가 아니며, Z1은 O이 아니고, NR11이 아니며, STING 작동제의 잔기는 Z2에 의해 분자의 잔여부에 연결된다.
결합 단위 모이어티
결합 단위는 펩티드, 단백질 (예로, 조작된 단백질), 항체 (예로, 단일클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이다.
바람직하게, 본 발명에 따른 결합 단위는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 따라서, 본 발명에 따른 결합 단위-약물 컨쥬게이트는 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)이다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 재조합 항체로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 ADC의 항체는 화학적으로 합성된 항체로 구성된다.
보다 구체적으로, 이러한 분자는 디설파이드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)을 포함하는 당단백질로 구성된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (또는 도메인) (본원에서 HCVR 또는 VH으로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 LH으로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 또한 구조틀 영역 (FR)으로 명명되는 더욱 보존된 영역과 함께 산재되어 있는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명되는 과다가변성의 영역으로 소분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단부터 카복시-말단까지 다음의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예로, 효과기 세포) 및 고전적인 보체계의 첫 번째 구성성분 (Clq)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자와 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
일 구현예에서, 이러한 "항원 결합 단편"은 Fv, scFv (단일 사슬의 sc), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc 단편 또는 다이아체, 또는 폴리(에틸렌)글리콜 ("PEG화")(Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG 또는 Fab'-PEG라고 불리는 PEG화된 단편들) (폴리(에틸렌)글리콜의 "PEG")과 같은 폴리(알킬렌)글리콜의 첨가와 같은 화학적 변형, 또는 리포좀 내로 혼입에 의해 반감기가 증가되었던 임의의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 단편이 본 발명에 따른 항체의 특징적인 CDR 중 적어도 하나를 갖는다. 바람직하게, 상기 "항원 결합 단편"은 이들이 유래한 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 사슬의 부분적 서열로 구성될 것이거나 이를 포함할 것이고, 상기 부분적 서열이 표적과 관련하여 이것이 유래한 항체와 동일한 결합 특이도 및 충분한 친화도, 바람직하게는 이것이 유래한 항체의 친화도의 적어도 1/100 이상, 더욱 바람직한 방식으로 적어도 1/10 이상의 친화도를 보유하기에 충분하다. 더욱 바람직하게, 상기 "항원 결합 단편"은 이들이 유래한 중쇄 가변 사슬의 적어도 3개 CDR, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 및 경쇄 가변 사슬의 3개 CDR, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3로 구성될 것이거나 이들을 포함할 것이다.
바람직한 구현예에 따르면, 결합 단위는 IGF-1R 항체, HER2 항체 또는 이들의 항원 결합 단편이다.
HER2 항체는 보다 구체적으로 트라스투주맙이다.
본 발명의 구현예에서, 항체는 IGF-1R 항체이고, 항체의 에피토프는 바람직하게 인간 IGF-1R의 세포외 도메인 (IGF-1R ECD로도 지칭됨) 내에 국소화된다.
구체적인 구현예에서, 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편은 10 × 10-10 내지 1 × 10-10 M, 더욱 바람직하게는 8 × 10-10 내지 2 × 10-10 M에 포함되는 EC50으로 IGF-1R에 결합할 수 있다.
IGF-1R에 대한 결합의 경쟁은, 이에 한정되는 것은 아니지만 방사능 활성, 비아코아 (Biacore), 엘라이자 (ELISA), 유세포 측정법 등과 같은 당업자에게 숙지된 임의의 방법 또는 기법에 의해 결정될 수 있다. "IGF-1R에 대한 결합을 경쟁하는"은 적어도 20%, 바람직하게 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%의 경쟁을 의미한다.
동일한 에피토프에 대한 결합의 결정은, 이에 한정되는 것은 아니지만 방사능 활성, 비아코아, 엘라이자, 유세포 측정법 등과 같은 당업자에게 숙지된 임의의 방법 또는 기법에 의해 결정될 수 있다. "IGF-1R의 동일한 에피토프에 결합하는"은 적어도 20%, 바람직하게 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%의 경쟁을 의미한다.
상기 언급된 바와 같이, 그리고 일반 지식과는 정반대로, 본 발명은 IGF-1R 결합 이후에 내재화될 높은 능력을 제시하는 특이적인 IGF-1R 항체에 중점을 두고 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, "내재화되는" 또는 "내재화된" (두 가지 용어 표현은 유사함) 항체는 포유동물 세포에서 IGF-1R에 결합 시 세포에 의해 흡수되는 ("진입하는" 것을 의미함) 항체이다. 이러한 항체는 ADC의 부분로서 흥미롭고, 따라서 표적화된 암 세포 내로 연결된 세포독을 어드레스하거나 안내한다. 일단 내재화되는 경우, 세포독은 암 세포의 사망을 촉발시킨다.
유리하게, 본 발명에 따른 IGF-1R 항체는 모두 CDR-H2, CDR-H3 및 CDR-L2에 대한 동일한 서열을 제시하고 있으며, 나머지 3개의 CDR이 상이하다. 이러한 관찰은 항체의 결합 특이도에 관하여 CDR-H3가 에피토프의 인식에서 가장 중요하고 가장 관련있는 것으로 기술된 일반적인 지식과 부합하는 것 같다.
ADC 요법으로 성공하는 중요한 핵심은 표적 항원 특이도 및 암 세포 내로 항원-항체 단백질 복합체의 내재화인 것으로 생각된다. 명백하게, 내재화되지 않는 항원은 세포독 제제를 전달하는데 내재화 항원들보다 덜 효과적이다. 내재화 공정은 항원 사이에 다양하고 항체에 의해 영향을 받을 수 있는 다수의 매개변수에 의존한다.
ADC에서, 약물 모이어티는 세포독 활성을 부여하고, 사용된 항체는 암 세포에 대한 특이성, 뿐만 아니라 세포 내로 진입하는 벡터가 세포독을 정확하게 어드레싱하는 것을 책임을 진다. 따라서, ADC를 개선하도록, 항체가 표적화된 암 세포들 내로 내재화하는 높은 능력을 나타낼 수 있다. 항체가 내재화를 매개하는 효율은 표적화된 에피토프에 따라 상당히 달라진다. 강력한 내재화 IGF-1R 항체의 선별은 IGF-1R 하향조절, 뿐만 아니라 이어지는 세포 내로 IGF-1R 항체의 내재화를 연구한 다양한 실험적 데이타를 요구한다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 ADC의 항체 내재화는 면역형광법 또는 FACS (유세포 측정법) (본 출원에서 하기 예시되는 바와 같음) 또는 내재화 기작에 특이적인 당업자에게 숙지된 임의의 방법 또는 공정에 의해 평가될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 ADC의 항체는 IGF-1R에 대한 결합 이후에 적어도 30%, 바람직하게 50%, 더욱 바람직하게 80%의 내재화를 유도할 수 있다.
복합체 IGF-1R/항체는 상기 IGF-1R의 ECD에 대한 항체의 결합 이후에 내재화되고, 세포 표면에서 IGF-1R의 정량을 감소시킨다. 이러한 감소는, 비-제한적인 예로서 웨스턴-블럿, FACS, 면역형광법 등과 같은 당업자에게 숙지되어 있는 임의의 방법에 의해 정량화될 수 있다.
일 구현예에서, 이러한 내재화를 반영하는 감소는 바람직하게 FACS에 의해 측정되고, 항체와 함께 4시간 배양 이후에 4℃에서 측정된 평균 형광 강도 (MFI) 및 37℃에서 측정된 MFI 사이의 차이 또는 델타값으로서 표현될 수 있다.
비-제한적인 예로서, 이러한 델타값은 미처리된 세포 및 항체로 처리된 세포을 사용하여 획득된 MFI를 기초로 하여, i) 본원에 설명된 항체와 함께 4시간 배양 기간 이후에 유방암 세포 MCF17, 및 ii) 알렉사 488로 표지된 이차 항체를 사용하여 결정된다. 이 매개변수는 하기 공식으로 계산된 바와 같이 정의된다:
Figure pct00069
MFI 간의 이러한 차이는 MFI가 세포-표면 상에서 발현된 IGF-1R과 비례하기 때문에 IGF-1R 하향조절을 반영한다.
유리한 양태에서, 항체는 MCF-7에서 적어도 280, 바람직하게는 적어도 400의
Figure pct00070
를 촉발하는 항체로 구성된다.
보다 자세하게, 상기 언급된 델타값은 하기의 공정에 따라 측정될 수 있고, 이는 예시적이고, 비-제한적인 예로서 고려되어야 한다:
a) 관심있는 종양 세포를 본 발명의 항체로 차가운 (4℃) 또는 따뜻한 (37℃) 둘 중 하나의 완전 배양 배지에서 처리하여 배양하는 단계;
b) 단계 a)의 처리된 세포 및 미처리된 세포를 동시에 이차 항체로 처리하는 단계;
c) 처리된 및 미처리된 세포에 대한 MFI (표면에 존재하는 IGF-1R의 정량을 예시함)를 본 발명의 항체에 결합할 수 있는 이차 표지된 항체로 측정하는 단계; 및
d) 미처리된 세포로 획득된 MFI로부터 처리된 세포들로 획득된 MFI을 차감하여 델타값을 계산하는 단계.
이러한 델타값 MFI로부터, 내재화 백분율이 다음과 같이 결정될 수 있다:
Figure pct00071
.
본 발명에 따른 ADC의 항체는 바람직하게 MCF7 상에서 50% 내지 99%, 70% 내지 90%, 바람직하게는 75% 내지 87% 범위에 포함되는 내재화 백분율을 제시한다.
본원에 기술된 항체의 구체적인 장점은 이들의 내재화 속도에 의존한다.
일반적으로 ADC의 경우, 사용된 항체가 바람직하게 항체의 투여로부터 24시간 이내, 더욱 바람직하게는 12시간 이내, 훨씬 더 바람직하게는 6시간 이내의 신속한 내재화 속도를 나타내는 것이 바람직함이 알려져 있다.
본 발명에서, 내재화 속도는 세포 표면 결합 항체 감소 또는 세포 표면 항체 붕괴로도 역시 지칭되며, t1/2 (반감기)로서 표현되고, △MFI의 50% 감소를 획득하는데 필요한 시간에 해당한다 (이러한 양태는 하기 실시예를 고려하여 명백하게 이해될 것임).
구체적인 장점은 본 발명의 ADC의 항체가 5분 내지 25분, 바람직하게는 10분 내지 20분에 포함되는 t1/2를 갖는 것이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 항체는 서열번호 1, 2 및 3의 서열, 또는 서열번호 1, 2 또는 3과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 나타내는 임의의 서열을 포함하거나, 이로 구성되는 3개의 중쇄 CDR, 및 서열번호 4, 5 및 6의 서열, 또는 서열번호 4, 5 또는 6과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 나타내는 임의의 서열을 포함하거나, 이로 구성되는 3개의 경쇄 CDR을 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 결합 단위는 인간 IGF-1R에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
(i) 서열번호 2의 서열의 CDR-H2 및 서열번호 3의 서열의 CDR-H3를 갖는 3개의 중쇄 CDR 및 서열번호 5의 서열의 CDR-L2를 갖는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 항체;
(ii) (i)의 항체와 IGF-1R에 대한 결합을 경쟁하는 항체; 및
(iii) (i)의 항체와 IGF-1R의 동일한 에피토프에 결합하는 항체:
로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 결합 단위는 인간 IGF-1R에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
(i) 서열번호 1, 2 및 3의 서열의 3개의 중쇄 CDR 및 서열번호 4, 5 및 6의 서열의 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 항체;
(ii) (i)의 항체와 IGF-1R에 대한 결합을 경쟁하는 항체; 및
(iii) (i)의 항체와 IGF-1R의 동일한 에피토프에 결합하는 항체:
로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1, 2 및 3의 서열을 포함하는 3개의 중쇄 CDR 및 서열번호 4, 5 및 6의 서열을 포함하는 3개의 경쇄 CDR을 포함한다.
독특한 IMGT 번호매김은 어떤 항원 수용체, 사슬 유형 또는 종이라도 가변 도메인을 비교하도록 정의되어 왔다 [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M. P., Pommie C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. 독특한 IMGT 번호매김에서, 보존되는 아미노산은 항상 동일한 위치, 예를 들면 23번 시스테인 (1번째-CYS), 41번 트립토판 (보존된-TRP), 89번 소수성 아미노산, 104번 시스테인 (2번째-CYS), 118번 페닐알라닌 또는 트립토판 (J-PHE 또는 J-TRP)을 보유한다. 독특한 IMGT 번호매김은 구조틀 영역 (FR1-IMGT: 1 내지 26번 위치, FR2-IMGT: 39 내지 55번 위치, FR3-IMGT: 66 내지 104번 위치 및 FR4-IMGT: 118 내지 128번 위치) 및 상보성 결정 영역 (CDR1-IMGT: 27 내지 38번 위치, CDR2-IMGT: 56 내지 65번 위치 및 CDR3-IMGT: 105 내지 117번 위치)의 표준화된 구획을 제공한다. "갭"은 채워지지 않은 위치를 나타내기 때문에, CDR-IMGT 길이 (괄호 사이에 나타나고 점으로 분리됨, 예로 [8.8.13])는 결정적인 정보가 된다. 독특한 IMGT 번호매김은 IMGT 진주목걸이라고 명명되는 [Ruiz, M. and Lefranc, M. P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. and Lefranc, M. P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)] 2차원 그래픽 예시 및 IMGT/3D 구조-DB의 3차원 구조 [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M. P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]에 사용된다.
기준 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 동일성을 갖는 아미노산 서열의 경우, 바람직한 예는 기준 서열, 소정의 변형, 명확하게는 적어도 하나의 아미노산의 결실, 첨가 또는 치환, 절단 또는 연장을 포함한다. 하나 이상의 연속적 또는 비-연속적 아미노산(들)의 치환의 경우에, 치환된 아미노산은 "동등한" 아미노산에 의해 교체되는 치환이 바람직하다. 본원에서 용어 표현 "동등한 아미노산"은 상응하는 항체의 생물학적 활성을 변형시키지 않고도 구조적 아미노산 및 하기 정의된 특정한 예의 하나로 치환될 수 있는 임의의 아미노산을 가리키도록 의미한다.
동등한 아미노산은 치환된 아미노산과의 이들의 구조적 상동성을 기초로 하거나 생성될 수 있는 다양한 항체 간의 생물학적 활성의 비교 테스트들의 결과를 기초로 하여 결정될 수 있다.
비-제한적인 예로서, 하기 표 1은 상응하는 변형된 항체의 생물학적 활성의 유의한 변형을 유발하지 않고도 수행될 수 있는 가능한 치환들을 요약하고 있고; 역 치환들도 동일한 조건 하에서 자연적으로 가능하다.
Figure pct00072
본 발명의 구체적인 양태는 항체가 인슐린 수용체 (IR)에 결합하지 않는 것이다. 이러한 양태는 본원에 기술된 항체가 인슐린 대사를 의미하는 IR에 미치는 임의의 부정적 영향을 갖지 않을 것이기 때문에 흥미롭다.
또 다른 구현예에서, 항체의 또 다른 유리한 양태는 인간 IGF-1R, 뿐만 아니라 원숭이 IGF-1R, 보다 구체적으로 시노몰거스 IGF-1R에도 결합할 수 있는 것이다. 이러한 양태는 또한 임상시험에 요구되는 독성 평가를 용이하게 할 것이기 때문에 흥미롭다.
보다 또 다른 구현예에서, 항체는 단일클론 항체로 구성된다. 본원에서 단일클론 항체는 하기에 기술된 바와 같은 마우스, 키메라 및 인간화 항체를 포함한다.
항체는 바람직하게 프랑스 미생물 배양물 기탁기관 (프랑스 파리, 시덱스 15, 75724, 닥터 루 거리 25, 파스퇴르 연구소, CNCM)에 제출된 마우스 기원의 하이브리도마로부터 유래하고, 상기 하이브리도마가 Balb/C 면역화된 마우스 비장세포/림프세포 및 골수종 Sp 2/O-Ag 14 세포주의 융합에 의해 획득된다.
일 구현예에서, IGF-1R 항체는 마우스 항체로 구성되며, 다음으로 m[항체의 명칭]으로 언급된다.
일 구현예에서, IGF-1R 항체는 키메라 항체로 구성되며, 다음으로 c[항체의 명칭]으로 언급된다.
일 구현예에서, IGF-1R 항체는 인간화 항체로 구성되며, 다음으로 hz[항체의 명칭]으로 언급된다.
명확하게, 하기 설명에서 용어 표현 "IGF-1R 항체" 및 "[항체의 명칭]"은 유사하고, (반대의 특정이 없는 경우라면) 상기 IGF-1R 항체 및 상기 "[항체의 명칭]"의 마우스, 키메라 및 인간화 버전들을 포함한다. 필요한 때, 접두어 m- (마우스), c- (키메라) 또는 hz- (인간화)가 사용된다.
보다 명확하게, 하기 표 2는 바람직한 항체에 대한 IMGT에 따라 정의된 CDR 서열을 예시한다.
Figure pct00073
상기에 기술된 바와 같은 6개 CDR의 임의의 조합이 본 발명의 일부로서 고려되어야 하는 점은 당업자에게 자명할 것이다.
이러한 표 2로부터 관찰될 수 있는 바와 같이, 본원에 기술된 모든 항체는 CDR-H2, CDR-H3 및 CDR-L2에 대한 동일한 서열을 갖고, 이러한 특성이 상기에 기술된 바와 같이 특히 흥미롭다.
특정한 양태에 따르면, 항체는 마우스와 이종유래의 종, 명백하게 인간의 항체로부터 유래한 경쇄 및 중쇄 불변 영역도 역시 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스 항체이다.
또 다른 특정한 양태에 따르면, 항체는 마우스와 이종유래의 종, 명백하게 인간의 항체로부터 유래한 경쇄 및 중쇄 불변 영역도 역시 포함하는 것을 특징으로 하는 키메라 (c) 항체이다.
키메라 항체는 주어진 종의 항체로부터 유래한 자연적 가변 영역 (경쇄 및 중쇄)을 상기 주어진 종과 이종유래 종의 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 영역과 조합하여 포함하는 것이다.
키메라 항체는 재조합 유전학의 기법들을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 키메라 항체는 프로모터 그리고 본 발명의 비-인간, 명확하게 마우스 단일클론 항체의 가변 영역을 코딩하는 서열 및 이종유래 종, 바람직하게 인간의 항체 불변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 DNA를 클로닝함으로써 생산될 수 있다. 이러한 재조합 유전자에 의해 코딩되는 본 발명에 따른 ADC의 키메라 항체는 예를 들면, 이러한 항체의 특이도가 마우스 DNA로부터 유래한 가변 영역에 의해 결정되고 이의 이소형이 인간 DNA로부터 유래한 불변 영역에 의해 결정되는, 마우스-인간 키메라일 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 항체는
(a) 서열번호 7, 2 및 3의 서열의 3개 중쇄 CDR 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 항체;
(b) 서열번호 7, 2 및 3의 서열의 3개 중쇄 CDR 및 서열번호 10, 5 및 11의 서열의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 항체;
(c) 서열번호 7, 2 및 3의 서열의 3개 중쇄 CDR 및 서열번호 9, 5 및 12의 서열의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 항체; 및
(d) 서열번호 8, 2 및 3의 서열의 3개 중쇄 CDR 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 항체:
로부터 선택된다.
바람직하지만 이에 제한되지는 않는 구현예에서, 항체는
(a) 서열번호 13의 서열 또는 서열번호 13과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 항체;
(b) 서열번호 14의 서열 또는 서열번호 14와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 10, 5 및 11의 서열의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 항체;
(c) 서열번호 15의 서열 또는 서열번호 15와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 9, 5 및 12의 서열의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 항체;
(d) 서열번호 16의 서열 또는 서열번호 16과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 항체; 및
(e) 서열번호 17의 서열 또는 서열번호 17과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 9, 5 및 12의 서열의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 항체:
로부터 선택된다.
"서열번호 13 내지 17과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 나타내는 임의의 서열"은 서열번호 1, 2 및 3 서열의 3개 중쇄 CDR을 나타내고, 추가하여 CDR에 상응하는 서열 (예로, 서열번호 1, 2 및 3) 외부에서 서열번호 13 내지 17의 전장 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 나타내는 서열을 지정하도록 의도된다.
본 발명의 구현예에 따르면, 항체는
(a) 서열번호 13의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 항체;
(b) 서열번호 14의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 10, 5 및 11의 서열의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 항체;
(c) 서열번호 15의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 9, 5 및 12의 서열의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 항체;
(d) 서열번호 16의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 항체; 및
(e) 서열번호 17의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 9, 5 및 12의 서열의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 항체:
로부터 선택된다.
바람직하지만 이에 제한되지는 않는 또 다른 구현예에서, 항체는
(a) 서열번호 18의 서열 또는 서열번호 18과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 항체;
(b) 서열번호 19의 서열 또는 서열번호 19와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 항체;
(c) 서열번호 20의 서열 또는 서열번호 20과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 항체;
(d) 서열번호 21의 서열 또는 서열번호 21과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 8, 2 및 3의 서열의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 항체; 및
(f) 서열번호 22의 서열 또는 서열번호 22와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 항체;
"서열번호 18 내지 22와 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 나타내는 임의의 서열"은 서열번호 4, 5 및 6 서열의 3개 경쇄 CDR을 나타내고, 추가하여 CDR에 상응하는 서열 (예로, 서열번호 4, 5 및 6) 외부에서 서열번호 18 내지 22의 전장 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 나타내는 서열을 각각 지정하도록 의도된다.
본 발명의 구현예에 따르면, 항체는
(a) 서열번호 18의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 항체;
(b) 서열번호 18의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 항체;
(c) 서열번호 20의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 항체;
(d) 서열번호 21의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 8, 2 및 3의 서열의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 항체; 및
(e) 서열번호 22의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 항체:
로부터 선택된다.
본 발명의 구현예에 따르면, 항체는
(a) 서열번호 13의 서열 또는 서열번호 13과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 18의 서열 또는 서열번호 18과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체;
(b) 서열번호 14의 서열 또는 서열번호 14와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 19의 서열 또는 서열번호 19와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체;
(c) 서열번호 15의 서열 또는 서열번호 15와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 20의 서열 또는 서열번호 20과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체;
(d) 서열번호 16의 서열 또는 서열번호 16과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 21의 서열 또는 서열번호 21과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체; 및
(e) 서열번호 17의 서열 또는 서열번호 17과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 22의 서열 또는 서열번호 22와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체:
로부터 선택되는 항체이다.
본원에 기술된 키메라 항체는 불변 영역을 또한 특징으로 할 수 있고, 보다 구체적으로 상기 키메라 항체는 이에 한정되지 않지만 IgG1, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgD 또는 IgE와 같이 선별되거나 지정될 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 맥락에서 상기 키메라 항체는 IgG1 또는 IgG4이다.
본 발명의 구현예에 따르면 항체는 IgG1 형식으로 상기 기술된 바와 같은 가변 도메인 VH 및 VL을 포함하는 키메라 항체이다. 더욱 바람직하게, 상기 키메라 항체는 서열번호 43 서열의 VH에 대한 불변 도메인 및 서열번호 45 서열의 VL에 대한 카파 도메인을 포함한다.
본 발명의 구현예에 따르면 항체는 IgG4 형식으로 상기 기술된 바와 같은 가변 도메인 VH 및 VL을 포함하는 키메라 항체이다. 더욱 바람직하게, 상기 키메라 항체는 서열번호 44 서열의 VH에 대한 불변 도메인 및 서열번호 45 서열의 VL에 대한 카파 도메인을 포함한다.
바람직하지만 이에 제한되지는 않는 또 다른 구현예에서, 항체는
(a) 서열번호 23의 서열 또는 서열번호 23과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 28의 서열 또는 서열번호 28과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
(b) 서열번호 24의 서열 또는 서열번호 24와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 29의 서열 또는 서열번호 29와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
(c) 서열번호 25의 서열 또는 서열번호 25와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 30의 서열 또는 서열번호 30과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
(d) 서열번호 26의 서열 또는 서열번호 26과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 31의 서열 또는 서열번호 31과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체; 및
(e) 서열번호 27의 서열 또는 서열번호 27과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 32의 서열 또는 서열번호 32와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체:
로부터 선택된다.
보다 명확하게, 하기 표 3은 바람직한 키메라 항체에 대한 VH 및 VL의 서열을 각각 예시한다.
Figure pct00074
본 발명의 또 다른 특정한 양태에 따르면, 항체는 인간 항체로부터 유래한 경쇄 및 중쇄의 불변 영역이 각각 람다 또는 카파 영역 및 감마-1, 감마-2 또는 감마-4 영역인 것을 특징으로 하는 인간화 항체이다.
인간화 항체 또는 이들의 단편은 당업자에게 알려진 기법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 인간화 항체는 시험관내 진단 또는 생체내 예방적 및/또는 치료제 치료가 관여하는 방법에서 사용하는데 바람직하다. 또한, 다른 인간화 기법도, 예를 들면 유럽 특허 EP 0　451 261, EP 0　682 040, EP 0　939 127, EP 0　566 647 또는 미국 특허 US 5,530,101, US 6,180,370, US 5,585,089 및 US 5,693,761에서 PDL에 의해 기술된 "CDR 접합"과 같은 기술분야의 당업자에게 숙지되어 있다. 미국 특허US 5,639,641 또는 US 6,054,297, US 5,886,152 및 US 5,877,293도 역시 인용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 항체는 중쇄 가변 도메인 (VH)으로서,
(i) 각각 서열번호 7, 2 및 3의 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3,
(ii) 인간 생식계열 IGHV1-46*01 (서열번호 46)로부터 유래한 FR1, FR2 및 FR3, 및
(iii) 인간 생식계열 IGHJ4*01 (서열번호 48)로부터 유래한 FR4:
를 갖는, 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 항체는 경쇄 가변 도메인 (VL)으로서,
(i) 각각 서열번호 9, 5 및 11의 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3,
(ii) 인간 생식계열 IGKV1-39*01 (서열번호 47)로부터 유래한 FR1, FR2 및 FR3, 및
(iii) 인간 생식계열 IGKJ4*01 (서열번호 49)로부터 유래한 FR4:
를 갖는, 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
바람직하지만 이에 제한되지는 않는 본 발명의 구현예에서, 항체는
a) 각각 서열번호 7, 2 및 3의 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3, 인간 생식계열 IGHV1-46*01 (서열번호 46)로부터 유래한 FR1, FR2 및 FR3, 및 인간 생식계열 IGHJ4*01 (서열번호 48)로부터 유래한 FR4를 갖는 중쇄; 및
b) 각각 서열번호 9, 5 및 11의 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3, 인간 생식계열 IGKV1-39*01 (서열번호 47)로부터 유래한 FR1, FR2 및 FR3, 및 인간 생식계열 IGKJ4*01 (서열번호 49)로부터 유래한 FR4를 갖는 경쇄:
를 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열번호 33 서열의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열번호 35 서열의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 상기 인간화 항체는 이하 본 명세서에서 hz208F2 ("변이체 1" 또는 "Var. 1")으로 불릴 것이다.
또 다른 구현예에서, 항체는 서열번호 33 서열의 중쇄 가변 도메인 (VH)으로서, 상기 서열번호 33의 서열은 잔기 20번, 34번, 35번, 38번, 48번, 50번, 59번, 61번, 62번, 70번, 72번, 74번, 76번, 77번, 79번, 82번 및 95번으로부터 선택된 적어도 1개의 역-돌연변이를 포함하는, 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항체는 서열번호 33 서열의 중쇄 가변 도메인 (VH)으로서, 상기 서열번호 33의 서열은 잔기 20번, 34번, 35번, 38번, 48번, 50번, 59번, 61번, 62번, 70번, 72번, 74번, 76번, 77번, 79번, 82번 및 95번으로부터 선택되는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개 또는 17개의 역-돌연변이를 포함하는, 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
보다 명확하게, 하기 표 4는 바람직한 역-돌연변이를 예시한다.
Figure pct00075
일 구현예에서, 항체는 서열번호 35 서열의 경쇄 가변 도메인 (VL)으로서, 상기 서열번호 35의 서열은 잔기 22번, 53번, 55번, 65번, 71번, 72번, 77번 및 87번으로부터 선택되는 적어도 1개의 역-돌연변이를 포함하는, 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열번호 35 서열의 경쇄 가변 도메인 (VL)으로서, 상기 서열번호 35의 서열은 잔기 22번, 53번, 55번, 65번, 71번, 72번, 77번 및 87번으로부터 선택되는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 역-돌연변이를 포함하는, 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 항체는
a) 서열번호 33의 서열의 중쇄 가변 도메인 (VH)으로서, 상기 서열번호 33의 서열은 잔기 20번, 34번, 35번, 38번, 48번, 50번, 59번, 61번, 62번, 70번, 72번, 74번, 76번, 77번, 79번, 82번 및 95번으로부터 선택된 적어도 1개의 역-돌연변이를 포함하는, 중쇄 가변 도메인; 및
b) 서열번호 35의 서열의 경쇄 가변 도메인 (VL)으로서, 상기 서열번호 35의 서열은 잔기 22번, 53번, 55번, 65번, 71번, 72번, 77번 및 87번으로부터 선택된 적어도 1개의 역-돌연변이를 포함하는, 경쇄 가변 도메인:
을 포함한다.
보다 명확하게, 하기 표 5는 바람직한 역-돌연변이들을 예시한다.
Figure pct00076
이러한 구현예에서, 항체는 상기에 언급된 모든 역-돌연변이를 포함하고, 서열번호 34 서열의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열번호 36 서열의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체에 해당한다. 상기 인간화 항체는 이하 본 명세서에서 hz208F2 ("변이체 3" 또는 "Var. 3")으로 불릴 것이다.
또 다른 구현예에서, 변이체 1 및 변이체 3 사이에 포함되는 모든 인간화 형태도 역시 본 발명에 의해 포괄된다. 다른 말로 하면, 항체는 서열번호 41의 "공통" 서열의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열번호 42의 "공통" 서열의 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체에 해당한다. 상기 인간화 항체는 전체적으로, 이하 본 명세서에서 hz208F2 ("변이체 2" 또는 "Var. 2")으로 불릴 것이다.
바람직하지만 이에 제한되지는 않는 구현예에서, 항체는
(a) 서열번호 33의 서열 또는 서열번호 33과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 항체; 및
(b) 서열번호 34의 서열 또는 서열번호 34와 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 항체:
로부터 선택된다.
"서열번호 33 또는 34와 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 나타내는 임의의 서열"은 서열번호 1, 2 및 3의 3개 중쇄 CDR을 나타내고, 추가하여 CDR에 상응하는 서열 (예로, 서열번호 1, 2 및 3) 외부에서 서열번호 33 또는 34의 전장 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 나타내는 서열을 각각 지정하도록 의도된다.
본 발명의 구현예에서, 항체는
(a) 서열번호 33의 서열 또는 서열번호 33과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 항체; 및
(b) 서열번호 34의 서열 또는 서열번호 34와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 9, 5 및 11의 서열의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 항체:
로부터 선택된다.
관련된 단락에서 표시되지 않은 경우라면, 본 상세한 설명에서 임의의 서열에 의하여 또는 특정한 서열과 적어도 80% 동일성을 나타내는 서열에 의하여, 상기 서열은 기준 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 이들 서열이 CDR 서열을 포함하는지 여부와 상관없이, 서열이 기준 서열 CDR과 최소로 일치하는 이들 CDR, 이들 CDR에 상응하는 서열 외부에 위치하는 잔여 서열에 대해 계산되어야 하는 전장의 서열과 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 나타내는 점을 지정하도록 의도된다.
바람직하지만 이에 제한되지는 않는 구현예에서, 항체는
(a) 서열번호 35의 서열 또는 서열번호 35와 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 항체; 및
(b) 서열번호 36의 서열 또는 서열번호 36과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 항체:
로부터 선택된다.
"서열번호 35 또는 36과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 나타내는 임의의 서열"은 서열번호 4, 5 및 6의 3개 경쇄 CDR을 나타내고, 추가하여 CDR에 상응하는 서열 (예로, 서열번호 4, 5 및 6) 외부에서 서열번호 35 또는 36의 전장 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 나타내는 서열을 지정하도록 의도된다.
본 발명의 구현예에서, 항체는
(a) 서열번호 35의 서열 또는 서열번호 35와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 항체; 및
(b) 서열번호 36의 서열 또는 서열번호 36과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인, 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 항체:
로부터 선택된다.
본원에 기술된 인간화 항체는 불변 영역도 역시 불변 영역을 특징으로 할 수 있고, 보다 구체적으로 상기 인간화 항체는 이에 제한되지 않지만 IgG1, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgD 또는 IgE와 같이 선별되거나 지정될 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 맥락에서 상기 인간화 항체는 IgG1 또는 IgG4이다.
본 발명의 구현예에 따르면, 항체는 IgG1 형식으로 상기 기술된 바와 같은 가변 도메인 VH 및 VL을 포함하는 인간화 항체이다. 더욱 바람직하게, 상기 인간화 항체는 서열번호 43 서열의 VH에 대한 불변 도메인 및 서열번호 45 서열의 VL에 대한 카파 도메인을 포함한다.
본 발명의 구현예에 따르면, 항체는 IgG4 형식으로 상기 기술된 바와 같은 가변 도메인 VH 및 VL을 포함하는 인간화 항체이다. 더욱 바람직하게, 상기 인간화 항체는 서열번호 44 서열의 VH에 대한 불변 도메인 및 서열번호 45 서열의 VL에 대한 카파 도메인을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 항체는
(a) 서열번호 37의 서열 또는 서열번호 37과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 39의 서열 또는 서열번호 39와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체; 및
(b) 서열번호 38의 서열 또는 서열번호 38과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 40의 서열 또는 서열번호 40과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체:
로부터 선택된다.
보다 명확하게, 하기 표 6a는 인간화 항체 hz208F2의 변이체 1 (Var. 1) 및 변이체 3 (Var. 3)에 대한 VH 및 VL 서열의 비-제한적인 예를 예시한다. 또한, 이것은 변이체 2 (Var. 2)의 공통 서열을 포함한다.
Figure pct00077
바람직하지만 이에 제한되지는 않는 또 다른 구현예에서, 항체는
a) 서열번호 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 80 또는 서열번호들 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 80과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 갖는 임의의 서열로부터 선택된 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호들 9, 5 및 11 서열의 3개 경쇄 CDR을 포함하는 항체;
b) 서열번호 57 또는 60 또는 서열번호 57 또는 60과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 갖는 임의의 서열로부터 선택된 서열의 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 7, 2 및 3의 서열의 3개 중쇄 CDR을 포함하는 항체; 및
c) 서열번호 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 80 또는 서열번호들 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 80과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 갖는 임의의 서열로부터 선택된 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 57 또는 60 또는 서열번호 57 또는 60과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 또는 98% 동일성을 갖는 임의의 서열로부터 선택된 서열의 경쇄 가변 도메인:
으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 항체는
a) 서열번호 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 80의 서열 또는 서열번호 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 및 80과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 57의 서열 또는 서열번호 57과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는 항체; 및
b) 서열번호 56, 64, 68 및 78의 서열 또는 서열번호 56, 64, 68 및 78과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄 및 서열번호 60의 서열 또는 서열번호 60과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하는 항체:
로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 항체는
(a) 서열번호 58의 서열 또는 서열번호 58과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄, 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
(b) 서열번호 58의 서열 또는 서열번호 58과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄, 및 서열번호 61의 서열 또는 서열번호 61과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
(c) 서열번호 63의 서열 또는 서열번호 63과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄, 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
(d) 서열번호 65의 서열 또는 서열번호 65와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄, 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
(e) 서열번호 65의 서열 또는 서열번호 65와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄, 및 서열번호 61의 서열 또는 서열번호 61과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
(f) 서열번호 67의 서열 또는 서열번호 67과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄, 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
(g) 서열번호 69의 서열 또는 서열번호 69와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄, 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
(h) 서열번호 69의 서열 또는 서열번호 69와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄, 및 서열번호 61의 서열 또는 서열번호 61과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
(i) 서열번호 71의 서열 또는 서열번호 71과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄, 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
(j) 서열번호 73의 서열 또는 서열번호 73과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄, 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
(k) 서열번호 75의 서열 또는 서열번호 75와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄, 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
(l) 서열번호 77의 서열 또는 서열번호 77과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄, 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
(m) 서열번호 79의 서열 또는 서열번호 79와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄, 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체;
(n) 서열번호 79의 서열 또는 서열번호 79와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄, 및 서열번호 61의 서열 또는 서열번호 61과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체; 및
(o) 서열번호 81의 서열 또는 서열번호 81과 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 중쇄, 및 서열번호 59의 서열 또는 서열번호 59와 적어도 80% 동일성을 나타내는 임의의 서열의 경쇄를 포함하거나 이들로 구성되는 항체:
로부터 선택된다.
다른 말로 하면, 항체는
(a) 서열번호 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 및 81 또는 서열번호 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 및 81과 적어도 80% 동일성을 갖는 임의의 서열로부터 선택된 서열의 중쇄; 및
(b) 서열번호들 59 및 61 또는 서열번호들 59 및 61과 적어도 80% 동일성을 갖는 임의의 서열로부터 선택된 서열의 경쇄:
을 포함하는 항체일 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 항체는
(a) 서열번호 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 및 81 또는 서열번호 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 및 81과 적어도 80% 동일성을 갖는 임의의 서열로부터 선택된 서열의 중쇄; 및
(b) 서열번호들 59 및 61 또는 서열번호들 59 및 61과 적어도 80% 동일성을 갖는 임의의 서열로부터 선택된 서열의 경쇄:
을 포함하는 항체로부터 선택된다.
보다 명확하게, 하기 표 6b는 인간화 항체 hz208F2의 상이한 변이체에 대한 VH 및 VL의 서열 (가변 도메인 및 전장)의 비-제한적인 예를 예시한다.
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 항체는 (i) 프랑스 파스퇴르 연구소, CNCM에 각각 2013년 5월 30일, 2013년 6월 26일, 2013년 6월 26일, 2013년 4월 24일 및 2013년 6월 26일자로 기탁된 하이브리도마 I-4757, I-4773, I-4775, I-4736 또는 I-4774에 의해 생산된 항체; (ii) (i)의 항체와 IGF-1R에 대한 결합을 경쟁하는 항체; 또는 (iii) (i)의 항체가 결합하는 곳과 동일한 IGF-1R의 에피토프에 결합하는 항체로부터 선택된 항체이다.
본 발명의 구체적인 양태에 따르면, 결합 단위는 숙주 표적 부위에 세포독 제제를 전달하는 어드레싱 운반체로서 사용되는, 상기에 기술된 바와 같은 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이고, 상기 숙주 표적 부위가 IGF-1R, 바람직하게 IGF-1R 세포외 도메인, 더욱 바람직하게 인간 IGF-1R (서열번호 50), 훨씬 더 바람직하게는 인간 IGF-1R 세포외 도메인 (서열번호 51), 훨씬 더 바람직하게는 인간 IGF-1R 세포외 도메인의 N 말단 (서열번호 52), 또는 이들의 임의의 자연적 변이체 서열 내에 국소화된 에피토프로 구성된다.
바람직한 구현예에서, 상기 숙주 표적 부위는 포유동물 세포, 더욱 바람직하게 인간 세포, 더욱 바람직하게 자연적으로 또는 유전적 재조합에 의해 IGF-1R을 발현하는 세포의 표적 부위이다.
추가적인 바람직한 구현예에서, 상기 표적 부위는 암, 바람직하게 IGF-1R을 발현하는 암 또는 IGF-1R 관련 암에 걸린 환자, 바람직하게 인간의 세포의 표적 부위이다.
IGF-1R을 발현하는 암 또는 IGF-1R 관련 암은 구체적으로 종양성 세포가 이들의 표면에 IGF-1R의 전부 또는 일부를 발현하거나 과다-발현하는 암을 포함한다.
본 발명에서 결합 단위로서 사용될 수 있는 IGF-1R 항체는 구체적으로 국제특허출원 WO 2015/162291, WO 2015/162292 또는 WO 2015/162293에 기술되어 있다.
링커 분자
본 발명에 따른 화학식 (I), 바람직하게 q = 2인 링커는 항체 (예로, 단일클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 결합 단위에 약물을 공유 결합시키는데 유용하다.
이 경우, 링커의 설포말레이미드 모이어티는 결합 단위 상에 존재하는 티올 모이어티와 반응할 수 있는 반면, 링커의 X3 말단은 약물 (QH 또는 Q-OH) 상에 존재하는 작용기와 반응할 수 있다.
링커 분자는 실험 부분에서 예시화된 다양한 합성 방법에 따라 제조될 수 있다.
X1 및 X2가 독립적으로 H 및 Cl 중에서 선택되고, 적어도 하나가 Cl일 때, 본 발명에 따른 링커는 L이 L1-(CO)c-(W)w-(Y)y-X3를 나타내는 화학식 L-NHCO-CH2CH2-S-S-CH2CH2-CONH-L의 디설파이드 화합물로부터 SO2Cl2와 같은 염소화제와의 반응에 의해 선택적으로 보호된 형태로 제조될 수 있다.
X1 및 X2가 독립적으로 H 및 Br 중에서 선택되고, 적어도 하나가 Br일 때, 본 발명에 따른 링커는 L이 L1-(CO)c-(W)w-(Y)y-X3를 나타내는 화학식
Figure pct00081
의 화합물로부터 Br2와 같은 브롬화제와의 반응에 의해 선택적으로 보호된 형태로 제조될 수 있다.
X1 및 X2 중 적어도 하나가 독립적으로 (C1-C6)알콕시, 선택적으로 치환된 아릴옥시 또는 -O-(CH2CH2O)rH일 때, 본 발명에 따른 링커는 X1 및 X2 중 적어도 하나가 Cl 또는 Br인 화학식 (1)의 상응하는 링커로부터 화학식 Ra-OH의 알코올과의 친핵성 치환 반응에 의해 선택적으로 보호된 형태로 제조될 수 있고, Ra가 (C1-C6)알킬, 선택적으로 치환된 아릴 또는 -(CH2CH2O)rH를 나타낸다.
또한, 약물-링커 컨쥬게이트의 합성의 경우 하기에 명확하게 도시된 바와 같이, 이에 접합된 절단된 링커 모이어티로 설포말레이미드 모이어티를 형성하고 (예로, L = L1-(CO)c-X6이고, X6가 NH2, OH 또는 이탈기와 같은 작용기, 선택적으로 보호된 형태임), 설포말레이미드 모이어티의 형성 이후에 링커 합성을 완성하는 것으로 고려될 수 있다.
더우기, 산화 단계를 수행하여 필요한 산화 상태로 S(O)q 기를 전환할 수 있다 (즉, 바람직하게 q = 2). 이러한 산화 단계는 당업자에게 잘 알려져 있다. 사용된 산화제는 예를 들면 mCPBA, RuO4 또는 RuCl3/NaIO4일 수 있다.
추가의 보호/탈보호 단계가 상기 기술된 공정에서 수행될 수 있으며, 이러한 단계 및 이들의 반응 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다.
획득된 링커는 당업자에게 잘 알려져 있는 방법, 예컨대 추출, 용매의 증발에 의해 또는 침전 또는 결정화에 의해 (이어지는 여과에 의해) 반응 배지로부터 분리될 수 있다.
또한, 링커는 필요한 경우 당업자에게 잘 알려져 있는 방법, 예컨대 재결정화에 의해, 증류에 의해, 실리카겔 컬럼 상의 크로마토그래피에 의해 또는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 정제될 수 있다.
약물-링커 컨쥬게이트
본 발명에 따른 화학식 (Ⅱ), 바람직하게 q = 2인 약물-링커 컨쥬게이트는 항체 (예로, 단일클론 항체) 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 결합 단위에 약물을 공유 결합시키는데 유용하다.
이 경우, 약물-링커 컨쥬게이트의 설포말레이미드 모이어티는 결합 단위 상에 존재하는 티올 모이어티와 반응할 수 있다.
약물-링커 컨쥬게이트는 다양한 합성 방법에 따라 제조될 수 있다. 따라서, 화학식 (I)의 링커는 컨쥬게이트를 형성하기 위하여 약물 (QH 또는 Q-OH)와 반응할 수 있다. 그러나, 링커가 약물 분자 상에서 진행성으로 형성되고, 즉 링커의 제 1 부분이 먼저 약물 상에 접합되고, 생성된 화합물이 절단된 링커와 반응하여 약물-링커 컨쥬게이트를 형성할 다른 가능성이 고려될 수 있다.
따라서, 다른 합성 경로가 고려될 수 있지만, 다음의 비-제한적인 합성 경로가 본 발명에 따른 화학식 (Ⅱ)의 약물-링커 컨쥬게이트의 제조에 사용될 수 있다.
이들 합성 경로 모두에서, 추가의 보호/탈보호/치환 단계가 수행될 수 있으며, 이러한 단계 및 이들의 반응 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다.
획득된 추가의 보호/탈보호 단계가 상기 기술된 공정에서 수행될 수 있으며, 이러한 단계 및 이들의 반응 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다.
획득된 약물-링커 컨쥬게이트는 당업자에게 잘 알려져 있는 방법, 예컨대 추출, 용매의 증발에 의해 또는 침전 또는 결정화에 의해 (이어지는 여과에 의해) 반응 배지로부터 분리될 수 있다.
또한, 약물-링커 컨쥬게이트는 필요한 경우 당업자에게 잘 알려져 있는 방법, 예컨대 재결정화에 의해, 증류에 의해, 실리카겔 컬럼 상의 크로마토그래피에 의해 또는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 정제될 수 있다.
반응식 I으로 나타낸 합성 경로 I:
Figure pct00082
말단 설포말레이미드 모이어티는 하기에 상술된 바와 같이 접합된 약물 상에 이미 존재하는 기로부터 형성될 수 있다.
단계 1: 3-(2-클로로카보닐-에틸디설파닐)-프로피오닐 염화물을 화학식 H2N-L1-(CO)c-(W)w-(Y)y-Q의 분자 (즉, 링커의 부분이 이미 접합되었던 약물 분자)와 반응시킨다. 이러한 반응을 트리메틸아민와 같은 염기의 존재 시 수행할 수 있다. 반응은 DCM과 같은 용매에서, 특히 실온 내지 0℃ 및 실온에서 수행할 수 있다.
3-(2-클로로카보닐-에틸디설파닐)-프로피오닐염화물을 3,3'-디티오디프로피온산으로부터 잘 알려진 방법에 의해 제조하여 아실 염화물을 예컨대 (COCl)2로의 반응에 의해 형성할 수 있다. 반응을 DCM과 같은 용매에서, 특히 실온에서 수행할 수 있다. 촉매적 양의 DMF를 첨가할 수 있다.
또한, 3-(2-클로로카보닐-에틸디설파닐)-프로피오닐 염화물을 예를 들면 선택적으로 보호된 형태로 화학식 H2N-L1-(CO)c-X3와 반응시키고, 후속 단계에서 Q와 접합된 링커 모이어티의 합성을 완성하는 것이 고려될 수 있다.
단계 2: 단계 1에서 획득된 분자를 고리화하고, 특히 매우 과량 (예를 들면, 약 9 당량과 같은 5 내지 10 당량)으로 존재하는 SO2Cl2,의 존재 시 염소화할 수 있다. 반응을 DCM과 같은 용매에서, 특히 실온에서 수행할 수 있다. 염소 원자를 잘 알려진 방법에 의해, 예컨대 친핵성 치환에 의해 또 다른 X1 또는 X2 기 (H가 아님)로 전환할 수 있다.
단계 3: 필요한 경우, 단계 2에서 획득된 분자를 산화하여 화학식 (Ⅱa)의 약물-링커를 획득할 것이다. 이러한 산화 단계는 당업자에게 잘 알려진 조건에서, 특히 mCPBA (예를 들면, 10 당량)의 존재 시 수행할 수 있다. 반응을 DCM과 같은 용매에서, 특히 실온에서 수행할 수 있다.
반응식 Ⅱ로 나타낸 합성 경로 Ⅱ:
Figure pct00083
약물 (QH 또는 Q-OH) 및 화학식 (I)의 링커 사이에 직접적 커플링을 수행할 수 있고, 이 조건은 X3 및 약물 상에 존재하는 작용기의 성질에 의존한다.
이 커플링은 친핵성 치환 또는 미쓰노부 반응과 같은 치환일 수 있고, 이러한 화학 반응의 반응 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다.
X3 = OH 및 적어도 y = 1, w ≠0 또는 c = 1 (즉, 화학식 (I)의 링커의 말단 작용기가 COOH임)이고, QH가 NH 기능을 포함할 때, 화학식 (I)의 링커 및 약물 (QH) 사이의 커플링은 당업자에게 잘 알려진 펩티드 커플링일 수 있다. 또한, 말단 COOH 기능은 아실 염화물 COCl로 전환될 수 있고, 다음으로 이는 약물 (QH) (예로, NH 또는 OH) 상에 존재하는 친핵성 기능과 반응할 수 있다.
X3 = NH2; X3 = H, y = z = 1 및 Z = -NR4-(CH2)u-NR5-; 또는 X3 = H, c = w = y = 0, z'　= 1 및 Z' = -NR4-(CH2)u-NR5- (즉, 화학식 (I)의 링커의 말단 작용기가 NH임)이고, Q-OH가 COOH 기능을 포함할 때, 화학식 (I)의 링커 및 약물 (Q-OH) 사이의 커플링은 당업자에게 잘 알려진 펩티드 커플링일 수 있다. 또한, 약물의 말단 COOH 기능은 아실 염화물 COCl로 전환될 수 있고, 다음으로 이는 NH 기능과 반응할 수 있다.
필요한 경우, 추가적인 산화 단계를 수행하여 필요한 산화 상태로 S(O)q 기를 전환할 수 있다 (즉, 바람직하게 q = 2). 이러한 산화 단계는 당업자에게 잘 알려져 있다. 사용된 산화는 예를 들면 mCPBA, RuO4 또는 RuCl3/NaIO4일 수 있다.
반응식 Ⅲa 및 Ⅲb로 나타낸 합성 경로 Ⅲ:
Figure pct00084
반응식 Ⅲa 및 Ⅲb로 도시된 바와 같이, 펩티드 커플링을 또한 COOH 기능을 보유하는 절단된 링커 및 링커의 나머지 부분에 접합된 약물 모이어티 사이에 수행할 수 있다. 절단된 링커의 말단 COOH 기능을 또한 아실 염화물 COCl로 전환할 수 있고, 다음으로 이는 다른 반응물의 NH 기능과 반응할 수 있다. 이러한 반응의 반응 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다.
필요한 경우, 추가적인 산화 단계를 수행하여 예를 들면 mCPBA, RuO4 또는 RuCl3/NaIO4의 존재 시 필요한 산화 상태로 S(O)q 기를 전환할 수 있다 (즉, 바람직하게 q = 2).
반응식 Ⅳ으로 나타낸 합성 경로 Ⅳ:
Figure pct00085
반응식 Ⅳ으로 예시된 바와 같이, 설포말레이미드 모이어티 및 링커의 잔여부가 이미 접합되었던 약물 사이의 커플링을 수행할 수 있고, 여기서 X5는 이전에 정의된 바와 같이 OH 또는 이탈기를 나타낸다.
커플링은 친핵성 치환과 같은 치환일 수 있다.
필요한 경우, 추가적인 산화 단계를 수행하여 예를 들면 mCPBA, RuO4 또는 RuCl3/NaIO4의 존재 시, 필요한 산화 상태로 S(O)q 기를 전환할 수 있다 (즉, 바람직하게 q = 2).
반응식 Va 및 Vb로 나타낸 합성 경로 V:
Figure pct00086
상기 반응식 Va 및 Vb로 도시된 바와 같이, 링커가 2가의 1H-1,2,3-트리아졸인 헤테로아릴렌 모이어티를 포함할 때, 이 헤테로아릴렌 기를 당업자에게 잘 알려진 조건에서 아자이드 및 알킨 사이의 클릭 화학에 의해 형성할 수 있고, 여기서 L2는 -(CH2)n- 또는 -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-를 나타내고, L3는 -(CH2)p- 또는 -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-를 나타내고, L2 및 L3가 동시에 -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-기는 아니다.
필요한 경우, 추가적인 산화 단계를 수행하여 예를 들면 mCPBA, RuO4 또는 RuCl3/NaIO4의 존재 시, 필요한 산화 상태로 S(O)q 기를 전환할 수 있다 (즉, 바람직하게 q = 2).
결합 단위-약물 컨쥬게이트
항체-약물 컨쥬게이트와 같은 결합 단위-약물 컨쥬게이트는
(1) 결합 단위 상에 명확하게 디설파이드 결합(들)에 의해 티올 기능을 형성하고;
2) 티올 기능을 보유하는 상기 결합 단위를 약물-링커 컨쥬게이트(들)과 반응시키고, 결합 단위에 약물 모이어티/모이어티들을 설포말레이미드 기능을 티올 기능과 반응시킴으로써 공유 결합시키는 단계에 의해 제조될 수 있다.
이러한 방법은 하기 반응식 Ⅵ으로 도시된다.
Figure pct00087
약제학적 조성물
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 화학식 (Ⅲ) 또는 (Ⅳ)의 결합 단위-약물 컨쥬게이트 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 장내 (예로, 경구) 또는 비경구 (예로, 정맥내) 투여, 바람직하게 경구 또는 정맥내 투여를 의도할 수 있다. 활성 성분은 통상적인 약제학적 부형제와 혼합된 단위 투여 형태로 동물, 바람직하게 인간을 포함한 포유동물에게 투여될 수 있다.
경구 투여의 경우, 약제학적 조성물은 고체 또는 액체 (용액 또는 현탁액) 형태일 수 있다.
고체 조성물은 정제, 젤라틴 캡슐, 분말, 과립 등의 형태일 수 있다. 정제에서, 활성 성분은 압축되기 이전에 젤라틴, 전분, 락토스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 아라비아검 등과 같은 약제학적 비히클(들)과 혼합될 수 있다. 정제는 특히 슈크로스 또는 기타 적합한 물질로 추가로 코팅될 수 있거나, 이들이 연장되거나 지연된 활성을 갖는 방식으로 처리될 수 있다. 분말 또는 과립에서, 활성 성분은 분산제, 습윤제 또는 현탁제 및 향미 교정제 또는 감미제와 함께 혼합되거나 과립화될 수 있다. 젤라틴 캡슐에서, 활성 성분은 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐 내에 이전에 언급된 것과 같은 분말 또는 과립의 형태로 또는 하기에 언급된 것과 같은 액체 조성물의 형태로 도입될 수 있다.
액체 조성물은 활성 성분을 감미제, 미각 증진제 또는 적합한 채색제와 함께 물과 같은 용매에 포함할 수 있다. 또한, 액체 조성물은 상기 언급된 바와 같이 분말 또는 과립을 물, 쥬스 등과 같은 액체에 현탁하거나 용해함으로써 획득될 수 있다. 이것은 예를 들면 시럽 또는 엘리시르일 수 있다.
비경구 투여의 경우, 조성물은 현탁제 및/또는 습윤제를 포함할 수 있는 수용성 현탁액 또는 용액의 형태일 수 있다. 유리하게, 조성물은 멸균성이다. 이것은 (특히 혈액과 비교하여) 등장성 용액의 형태일 수 있다.
이러한 비경구 조성물은 유리하게 일반적으로 등장성 식염수 용액, 즉 0.9% NaCl 수용성 용액 (정상 식염수)을 기초로 하여 생리학적으로 허용가능한 매질을 포함할 것이다. 또한, 비-수용성 물 혼화가능한 보조-용매, 예컨대 에탄올, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 n-락타미드도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 비경구 조성물은 하나 이상의 첨가제, 예컨대 현탁제, 습윤제, 보존제, 항산화제, 킬레이팅제, 완충제, 장력 조절제 등을 포함할 수 있다. 이러한 첨가제는 당업자에게 통상적인 것이다.
현탁제는 알기네이트, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 히드록실 메틸 셀룰로스, 히드록시 에틸 셀룰로스, 히트록시프로필 메틸 셀룰로스, 미세결정성 셀룰로스, 아카시아, 트라칸스 또는 잔탄 검과 같은 검, 젤라틴, 카라기난, 폴리비닐 피롤리돈 등일 수 있다.
습윤제는 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 레시틴이거나, 폴리솔베이트 또는 폴록사머와 같은 비이온성 계면활성제도 역시 일 수 있다.
보존제는 벤질 알코올, 페놀, 크레졸, 클로로부탄올, 메틸파라벤, 프로필파라벤 또는 프로필파라벤과 같은 파라벤, 벤즈알코늄 염화물, 벤즈토늄 염화물 등일 수 있다.
항산화제는 아스코브산, 시트르산, 아세틸시스테인, 아황산염 (바이설파이트, 메타설파이트), 모노티오글리세롤, 소듐 포름알데히드 설포옥실레이트, 티오우레아, 토코페롤 등일 수 있다.
킬레이팅제는 에틸렌 디아민 테트라아세트산 (EDTA) 염일 수 있다.
완충제는 아세테이트, 시트레이트, 타르트레이트, 포스페이트, 트리에탄올아민 (TRIS) 등일 수 있다.
장력 조절제는 덱스트로스, 글리세롤, 염화나트륨, 글리세린, 만니톨 등일 수 있다.
본 발명의 결합 단위-약물 컨쥬게이트는 하루 0.01 mg 내지 1000 mg 범위의 용량으로 약제학적 조성물에 사용되고, 하루 한 번 단 1회 용량 또는 하루에 다회 용량, 예를 들면 매일 2회의 동등한 용량으로 투여된다. 매일 투여된 용량은 유리하게 5 mg 내지 500 mg, 더욱 유리하게 10 mg 내지 200 mg 범위에 포함된다. 그러나, 이들 범위를 벗어난 용량을 사용하는 것이 필요할 수 있고, 이는 당업자에게 인지되어 있다.
암 치료
화학식 (Ⅲ) 또는 (Ⅳ)의 결합 단위-약물 컨쥬게이트 또는 화학식 (Ⅲ) 또는 (Ⅳ)의 결합 단위를 포함하는 약제학적 조성물은, 구체적으로 세포독 제제와 같은 암의 치료에 유용한 약물 (QH)의 잔기인 약물 모이어티 (Q)를 포함할 때 암의 치료에 사용될 수 있다.
항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)와 같은 결합 단위-약물 컨쥬게이트는 항체와 같은 결합 단위의 결합 특이성을 예를 들면 세포독 제제와 같은 약물의 효능과 조합한다.
ADC와 같은 결합 단위-약물 컨쥬게이트의 사용은 컨쥬게이션되지 않은 약물로서 투여되는 경우 정상 세포에 대해 허용 불가능한 수준의 독성을 생성할 수 있는 약물의 국소적 전달을 허용한다. 다른 말로 하면, 최소의 독성으로 최대의 효능이 이로써 달성된다.
암은 이에 한정되지 않지만 전립샘암, 골육종, 폐암, 유방암, 자궁내막암, 교모세포종, 결장암, 위암, 신장암, 췌장암, 두경부암 또는 종양 세포 상에 항체에 의해 표적화된 항원의 발현과 관련된 임의의 기타 암으로 예시화될 수 있다.
본 발명은 하기의 비-제한적인 실시예 및 도면에 의해 설명된다.
도 1a, 도 2, 도 3a, 도 4a, 도 5a, 도 6a, 도 7a, 도 21 및 도 22a는 본 발명에 따른 약물-링커 컨쥬게이트의 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 1b, 도 3b, 도 4b, 도 5b, 도 6b, 도 7b, 도 8 및 도 9는 본 발명에 따른 약물-링커 컨쥬게이트의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 10 및 도 11은 본 발명에 따른 약물-소마토스타틴 컨쥬게이트의 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 12는 환원 및 비-환원 조건 하에 Ab1 항체 (1) 및 본 발명에 따른 정제된 ADC (ADC1-A (2), ADC1-B (3), ADC1-C (4), ADC1-D (5), ADC1-E (6), ADC1-F (7) 및 ADC1-G (8))의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 젤 상에서 관찰된 밴드는 완전하게 가교된 항체 (즉, LHHL); 부분적으로 가교된 항체 (즉, HHL, HH, HL) 및 가교가 없는 항체 (즉, H 및 L)에 해당한다.
도 13은 Ab1 항체 및 본 발명에 따른 ADC (ADC1-A, ADC1-B, ADC1-C, ADC1-D, ADC1-E, ADC1-F 및 ADC1-G)의 SEC 분석을 나타낸다.
도 14a, 도 14b, 도 14c 및 도 14d는 본 발명에 따른 ADC (A)의 컨볼루션 제거 이전에 ADC m/z 스펙트럼을 각각 나타낸다: (A) ADC1-A, (B) ADC1-B, (C) ADC1-C 및 (D) ADC-1D
도 15a, 도 15b 및 도 15c는 (A) ADC1-A, (B) ADC1-B 및 (C) ADC1-D에 대한 맥센트 컨볼루션 제거 이후 DAR 분포를 각각 나타낸다.
도 16a 및 도 16b는 ADC의 고유의 질량 분광광도법에 의한 분석을 나타낸다: (A) 기준 ADC Ref-A 및 (B) 본 발명에 따른 ADC1-C.
도 17a, 도 17b 및 도 17c는 시험관내 안정성 연구의 결과를 전체 항체 (100%) 및 ADC의 백분율을 (1) 인간, (2) 시노몰거스, (3) 마우스 및 (4) 래트 혈청에서 (A) 기준 ADC Ref-B, (B) ADC1-C 및 (C) ADC1-E에 대하여 각 시점 (D0, D3, D7 및 D14)에서 각각 제시함으로써 나타낸다.
도 18a 및 도 18b는 NCI-H2122 (A) 및 MCF-7 (B) 세포에서 상이한 ADC의 시험관내 세포독성 평가를 각각 나타낸다.
도 19 및 도 20은 난소암 모델에서 ADC1-C 및 기준 ADC Ref-A의 생체내 활성을 나타낸다.
도 22b는 본 발명에 따른 약물-링커 컨쥬게이트의 TOF-MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 23a는 Ab1 항체 및 PNU-159682 유도체로 합성된 본 발명에 따른 ADC의 SEC 분석을 나타낸다.
도 23b는 Ab2 항체 및 PNU-159682 유도체로 합성된 본 발명에 따른 ADC의 SEC 분석을 나타낸다.
도 24a, 도 24b, 도 24c 및 도 24d는 본 발명에 따른 ADC (A)의 컨볼루션 제거 이전에 ADC m/z 스펙트럼을 각각 나타낸다: (A) hz208F2-F562524, (B)c9G4-F562524, (C) hz208F2-F562616 및 (D) c9G4-F562646.
도 25a, 도 25b, 도 25c 및 도 25d는 본 발명에 따른 ADC에 대한 맥센트 컨볼루션 제거 이후 DAR 분포를 각각 나타낸다: (A) hz208F2-F562524, (B)c9G4-F562524, (C) hz208F2-F562616 및 (D) c9G4-F562646.
도 26a 및 도 26b는 NCI-H2122 (A) 및 MCF-7 (B) 세포에서 ADC hz208F2-F562524 및 상응하는 대조군 ADC c9G4-F562524의 시험관내 세포독성 평가를 각각 나타낸다.
도 27a 및 도 27b는 NCI-H2122 (A) 및 MCF-7 (B) 세포에서 ADC hz208F2-F562524 및 상응하는 대조군 ADC c9G4-F562524의 시험관내 세포독성 평가를 각각 나타낸다.
도 28은 난소암 모델에서 ADC hz208F2-F562524 및 상응하는 대조군 ADC c9G4-F562524의 생체내 활성을 나타낸다.
실시예
Figure pct00088
Figure pct00089
실험 절차
무수 조건을 요구하는 모든 반응을 질소 대기 하에 오븐 건조된 장치에서 시행하였다. 무수 용매를 불활성 대기 하에 밀봉된 병에 받았다. 모든 시약을 받으면서 사용하였다. 컬럼 크로마토그래피를 인터침사 puriFlash® 430 및 Grace Reveleris® X2 상에서 실리카겔 (50 μm)을 갖는 puriFlash® 컬럼으로 수행하였다. TLC를 실리카 (머크사 실리카겔 60 F254)로 미리 코팅된 알루미늄 시트 상에서 수행하였고, 이는 UV 램프 254 nm로 영상화되었다. 양성자 (1H) 및 탄소 (13C) NMR 스펙트럼을 CDCl3 및 DMSO에서 BBO 프로디지 프로브 (5　mm)가 장착된 브루커 500 MHz 어센드TM로 실온에서 기록하였다. 스펙트럼을 탑스핀TM 3.2 소프트웨어를 사용하여 해석하였다. 화학적 변위 (δH and δC)를 백만 당 부분 (ppm)으로 보고하고, CDCl3 (1H　NMR 7.26, 13C NMR 77.0, 삼중자의 중앙 신호) 또는 DMSO (1H NMR 2.50, 13C　NMR 37.9, 칠중자의 중앙 신호) 둘 중 하나와 비교하여 기준화하였다. 할당은COSY 및 HSQC 실험에 의해 도움을 받았다. 커플링 상수 (J: 인접한 양성자, Jcis: 시스 위치의 인접한 양성자, Jo: 오르토 위치의 양성자, Jm: 메타 위치의 양성자)를 최근접 ±0.1 Hz에 대한 헤르츠로 제공하였다. 배수가 적용가능한 곳에서 단일자 (s), 이중자 (d), 삼중자 (t), 사중자 (q), 삼중자의 삼중자 (t. 중 t.), 복수자 (m) 및 광범위 (b)로서 주어진다. 질량 스펙트럼 (m/z)을 워터스® ZQ 질량 검출기 분광측정기 상에서 전기스프레이 이온화 (ES+), 출처 온도: 120°C, 용해 제거 온도: 350℃, 캐필러리 전압: 3.20 kV, 콘 전압: 25 V, 추출기 전압: 5 V, Rf 렌즈 전압: 0.5 V, MS 스캔 범위: 100 내지 2000의 기법을 사용하여 기록하였다. HPLC 분석을 워터스® X-브리지 쉴드 RP18 3.5 μm (3.0 mm × 30 mm) 컬럼 및 워터스® X-브리지 쉴드 RP18 3.5 μm (3.0 mm × 20 mm) 프리컬럼을 사용하여 MassLynx 4.1 소프트웨어 및 워터스 2996 PDA 검출기 UV/가시광선 프리컬럼을 갖는 HPLC 워터스® 얼라이언스 2695 상에서 분석 중 시료에 적절한 파장에서 수행하였다. 체류 시간 (R t )을 최근접 0.01분에 대한 분으로 제공한다. 2가지 용리 방법을 사용하였다.
Figure pct00090
방법 1에 의해 주어진 체류 시간은 Rt,1로 표시되고, 방법 2에 의한 체류 시간은 Rt,2로 표시된다.
1. 링커의 합성
옥소이소티아졸론의 합성 경로의 예:
Figure pct00091
I.1. 3,3'-디설판디일디프로판오일 염화물
Figure pct00092
I.2. 3,3'-디설판디일디프로피온산 (4 g, 0.019 mol, 1 당량)을 무수 DCM (100 mL)에 현탁하고, 무수 DMF (300 μL)에 이어서 옥살릴 염화물 (7.24 g, 0.057 mol, 3 당량)를 불활성 대기 하에 0℃에서 첨가하였다. 용액을 정화하였다. 혼합물을 정화될 때까지 실온에서 3시간 동안 방치하였고, 가스 형성은 더 이상 관찰되지 않았다. 조 산물을 증발시키고, 감압 하에 추가 30분 동안 유지하여 옥살릴 염화물의 잔류물을 제거하였다. 노란색 오일 (4.70 g, 100%)을 획득하였다. 조 산물을 추가 정제 없이 사용하였다. Rt,1 (MeOH 중): 2.13; MS ES+ m/z: 206.86.
I.3. 디벤질 6,6'-((3,3'-디설판디일비스(프로판오일))비스(아잔디일))디헥사노에이트
Figure pct00093
6-(벤질옥시)-6-옥소헥산-1-아미늄 4-메틸벤젠설포네이트 (12.20 g, 0.031 mol, 2.2 당량)을 0℃의 얼음 수조에서 불활성 대기 하에 격렬히 교반하면서 무수 DCM (75 mL) 중에 현탁하였다. TEA (15.72 mL, 0.113, 8 당량)를 용액에 첨가하였다. DCM (25 mL) 중에 신선하게 준비된 3,3'-디설판디일디프로판오일 염화물 (3.88 g, 0.014 mol, 1 당량) 용액을 0℃에서 유지되는 용액에 천천히 적가하였다. 교반을 24시간 동안 계속하면서 용액이 실온이 되도록 나두었다. 물을 첨가하고 (50 mL), 혼합물을 분리용 펀넬로 이동시켰다. 유기층을 분리하고, 염수로 세척한 다음 (1 × 100 mL) 1 M HCl (1 × 100 mL), NaHCO3 염의 포화 용액 (2 × 100 mL) 및 다시 염수 (1 × 100 mL)로 세척하였다. 조합된 수용성 층을 DCM (2 × 100 mL)으로 추출하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켜 MeOH에서 분쇄된 노란색 고체를 얻고, 디벤질 6,6'-((3,3'-디설판디일비스(프로판오일)) 비스(아잔디일))디헥사노에이트를 연한 노란색 분말 (6.0 g, 66%)로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3), δ 7.35 (m, 10H), 6.0 (s, 2H), 5.11 (s, 4H), 3.25 (q, J=5.9 Hz, 4H), 3.00 (t, J=7.0 Hz, 4H), 2,55 (t, J=7.10 Hz, 4H), 2,.36 (t, J=7.30 Hz, 4H), 1.66 (t of t., J=8.10 Hz, 4H), 1.52 (t 중 t, J=8.10 Hz, 4H), 1.35 (t 중 t, J=8.52 Hz, 4H); 13C NMR (500 MHz, CDCl3), δ 173.5 (2 -NH-C=O), 170.9 (-O-C=O), 136.0 (방향족 고리로부터의 2 Cquat), 128.6 (2 H-C방향족), 128.3 (H-C방향족), 128.2 (2 H-C방향족), 66.2 (2 -CH2-O-), 39.4 (2 -CH2-N), 35.8 (2 -CH2-COO-), 34.3 (2 -CH2-S-), 34.1 (2 -CH2-CNO-), 29.1 (2 C), 26,3 (2 C), 24,4 (2 C); Rt,1 (MeOH 중): 2.50; MS ES+ M/Z: 617.00.
I.4. 벤질 6-(5-클로로-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트
Figure pct00094
디벤질 6,6'-((3,3'-디설판디일비스(프로판오일))비스(아잔디일))디헥사노에이트 (2.50 g, 4.05 mmol, 1 당량)를 무수 DCM (20.3 mL)에 용해하였다. SO2Cl2 (순도 97%, 2.96 mL, 0.036 mol, 9 당량)을 용액에 적가하고, 혼합물을 불활성 대기 하에 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 용액을 정화하여 흐린 노란색이 되었다. 후속으로 용액을 물 (2 × 100 mL) 및 염수 (1 × 100 mL)로 세척하였다. 조합된 수용성 층을 DCM (2 × 100 mL)로 추출하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과한 다음 감압 하에 농축하고, 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 정제하였다. 벤질 6-(5-클로로-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트 (0.824 g, 29.9%)를 옅은 노란색 오일로서 벤질 6-(3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트와 함께 획득하였다. 1H NMR (CDCl3), δ 7.35 (m, 5H), 6.25 (s, 1H), 5.11 (s, 2H), 3.72 (t, J=7.34 Hz, 2H), 2.37 (t, J=7.39 Hz, 2H), 1.69 (m, 4H), 1.38 (m, 2H); 13C NMR (500 MHz, CDCl3), δ 173.2 (-O-C=O), 166.9 (-N-C=O), 145.6 (Cl-HC=CH-), 136.0 (방향족 고리로부터의 Cquat.), 128.6-128.3 (5 H-C방향족), 114.8 (Cl-HC=CH-), 66.2 (-CH2-O-), 43.5 (-CH2-N-), 34.0 (-CH2-C=O), 29.4, 25.9, 24.4; Rt,1 (ACN 중): 2.35; MS ES+ m/z: 339.84.
I.5. 벤질 6-(5-클로로-1-옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트
Figure pct00095
벤질 6-(5-클로로-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트 (802 g, 3.58 mmol)을 무수 DCM (25 mL)에 희석하였다. 3-클로로벤조퍼옥소산 (1.2 당량)을 첨가하였다. 용액을 불활성 대기 하에 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 다음으로 용액을 DCM으로 희석하고, 10% 수용성 Na2S2O3로 처리하였다. 다음으로 유기층을 NaHCO3 염의 포화 용액 (2 × 100 mL), 이어진 염수 (1 × 100 mL)로 연속하여 추출하였다. 조합된 수용성 층을 DCM (2 × 100 mL)로 추출하였다. 유기층을 MgSO4 위에서 건조시키고, 여과한 다음 감압 하에 농축하고, 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 정제하였다. 다음으로 벤질 6-(5-클로로-1-옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트 (753 mg)를 무색의 오일로서 획득하였다.
I.6. 벤질 6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트
Figure pct00096
단일 염화물 화합물의 산화를 위한 표준 절차
벤질 6-(5-클로로-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트 (1.11 g, 0.0036 mol, 1 당량)를 무수 DCM (7 mL)에 희석하였다. 3-클로로벤조퍼옥소산 (2.69 g, 0.0109 mol, 3 당량)을 첨가하였다. 용액을 불활성 대기 하에 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 다음으로 용액을 DCM으로 희석하고, 10% 수용성 Na2S2O3로 처리하였다. 다음으로 유기층을 NaHCO3 염의 포화 용액 (2 × 100 mL), 이어지는 염수 (1 × 100 mL)로 추출하였다. 조합된 수용성 층을 DCM (2 × 100 mL)로 추출하였다. 유기층을 MgSO4 위에서 건조시키고, 여과한 다음 감압 하에 농축하고, 크로마토그래피 컬럼를 사용하여 정제하였다. 벤질 6-(5-클로로-1,1-di옥시드o-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트를 옅은 노란색 오일 (0.760 g, 64.3%)로서 획득하였다. 1H NMR (CDCl3), δ 7.36 (m, 5H), 6.68 (s, 1H), 5.11 (s, 2H), 3.67 (t, J=7.68 Hz, 2H), 2.37 (t, J=7.27 Hz, 2H), 1.78 (t 중 t, J=7.73 Hz, 2H), 1.70 (t 중 t, J=7.38 Hz, 2H), 1.40 (m, 2H); 13C NMR (500 MHz, CDCl3), δ 173.2 (-O-C=O), 157.0 (-N-C=O), 144.6 (Cl-HC=CH-), 136.0 (방향족 고리로부터의 Cquat.), 128.6-128.2 (H-C방향족), 123.6 (Cl-HC=CH-), 66.2 (-CH2-O), 40.3 (-CH2-N-), 34.0 (-CH2-C=O), 27.9, 26.0, 24.2; Rt,1 (ACN 중): 2.49; MS ES+ M/Z: 371.83.
실시예 1. 6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산산
Figure pct00097
6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산산을 벤질 6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트 (0.445 g, 77%)로부터 출발하여 벤질 에스테르의 탈보호의 표준 절차 이후에 옅은 흰색 분말로서 획득하였다. 1H NMR (CDCl3), δ 10.89 (br. s, 1H), 6.70 (s, 1H), 3.70 (t, J=7.43 Hz, 2H), 2.38 (t, J=7.38 Hz, 2H), 1.81 (t 중 t, J=7.60 Hz, 2H), 1.69 (t 중 t, J=7.71 Hz, 2H), 1.43 (분열된 t 중 t, J=7.75 Hz, J=3.31 Hz, 2H); 13C NMR (500 MHz, CDCl3), δ 178.7 (O=C-OH), 157.1 (-N-C=O), 144.7 (Cl-HC=CH-), 123.6 (Cl-HC=CH-), 40.2 (-CH2-N), 33.5 (-CH2-C=O), 27.9, 25.9, 23.9; Rt,1 (ACN 중): 1.98; MS ES+ m/z: 349.89.
I.7. 벤질 6-(4,5-디클로로-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트
Figure pct00098
디벤질 6,6'-((3,3'-디설판디일비스(프로판오일))비스(아잔디일))디헥사노에이트 (3.21 g, 0.0052 mol, 1 당량)을 무수 DCM (26 mL)에 용해하였다. SO2Cl2 (순도 97%, 3.80 mL, 0.047 mol, 9 당량)를 용액에 적가하고, 혼합물을 불활성 대기 하에 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 용액을 정화하여 흐린 노란색이 되었다. 후속으로 혼합물을 물 (2 × 100 mL) 및 염수 (1 × 100 mL)로 세척하였다. 조합된 수용성 층을 DCM (2 × 100 mL)로 추출하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과한 다음 감압 하에 농축하고, 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 정제하였다. 벤질 6-(4,5-디클로로-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트를 옅은 노란색 오일 (1.391 g, 35.7%)로서 획득하였다. 1H NMR (CDCl3), δ 7.35 (m, 5H), 5.11 (s, 2H), 3.79 (t, J=7.18 Hz, 2H), 2.37 (t, J=7.33 Hz, 2H), 1.70 (m, 4H), 1.38 (m, 2H); 13C NMR (500 MHz, CDCl3), δ 173.2 (-O-C=O), 161.9 (-N-C=O), 138(-CH2-O-), 3 (Cl-C-S-), 135.6 (방향족 고리로부터의 Cquat.), 128.6-128.3 (5 H-C방향족), 115.1 (Cl-C-C=O), 66.2, 44.9 (-CH2-N-), 33.9 (-CH2-C=O), 29.1, 25.9, 24.3; Rt,1 (ACN 중): 2.50; MS ES+ m/z: 373.75.
I.8. 벤질 6-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트
Figure pct00099
이염화물 화합물의 산화를 위한 표준 절차:
단일수화된 루테늄 삼염화물 (16 mg, 0.07 mmol, 0.013 당량)을 물 : DCM : ACN (2 : 1 : 1, 1 mL) 중 벤질 6-(4,5-디클로로-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트 (1.94 g, 0.0052 mol, 1 당량)의 교반된 용액에 일정량 첨가하였다. 다음으로 소듐 페리오데이트 (3.33 g, 0.0156 mol, 3 당량)를 5분에 걸쳐 첨가하고, 생성된 혼합물을 불활성 대기 하에 실온에서 90분 동안 교반하였다. 고체를 여과하고, 여과물을 물 (50 mL)로 희석하고, EtOAc (2 × 100 mL)로 추출하여 MgSO4로 건조시키고, 감압 하에 농축하였다. 다음으로 획득된 회색 고체를 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 정제하고, 벤질 6-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트를 흐린 노란색 오일 (0.930 g, 44.2%)로서 획득하였다. 1H NMR (CDCl3), δ 7.36 (m,5H), 5.12 (s, 2H), 3.72 (t, J=7.53 Hz, 2H), 2.73 (t, J=7.50 Hz, 2H), 1.80 (t 중 t, J=7,53 Hz, 2H), 1.70 (t 중 t, J=7.70 Hz), 1.41 (m, 2H); 13C NMR (500 MHz, CDCl3), δ 173.1 (-O-C=O-), 154.1 (N-C=O), 138.0 (Cl-C-SO2-), 136.0 (방향족 고리로부터의 Cquat.), 130.7 1 (Cl-C-C=O), 128.6-128.3 (5 H-C방향족), 66.2 (-CH2-O-), 41.1 (-CH2-N-), 33.9 (-CH2-C=O), 27.9, 26.0, 24.2; Rt,1 (ACN 중): 2.59; MS ES+ m/z: 405.76.
실시예 2. 6-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산산
Figure pct00100
벤질 에스테르의 탈보호의 표준 절차:
벤질 6-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트 (0.930 g, 2.23 mmol, 1 당량)를 무수 DCM (11.5 mL)에 희석하였다. 메탄설폰산 (1.5 mL, 0.023 mol, 10 당량)을 첨가하였다. 용액을 불활성 대기 하에 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 다음으로 용액을 DCM로 희석하고, 물 (50 mL)로 처리하였다. 유기층을 물 (2 × 100 mL), 다음으로 (1 × 100 mL)로 추출하였다. 조합된 수용성 층을 DCM (2 × 100 mL)로 추출하였다. 유기층을 MgSO4 위에서 건조시키고, 감압 하에 농축한 다음 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 정제하였다. 6-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산산을 옅은 흰색 분말 (0.563 g, 78%)로 획득하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3), δ=3.76 (t, J=7.34 Hz, 2H), 2.38 (t, J=7.32 Hz, 2H), 1.83 (t 중 t, J=7.65 Hz, 2H), 1.70 (t 중 t, J=7.77 Hz, 2H), 1.45 (t 중 t, J=7.54 Hz, J=3.31 Hz, 2H); 13C NMR (500 MHz, CDCl3), δ 178.2 (O=C-OH), 154.2 (N-C=O), 138.1 (Cl-C-SO2-), 130.9 (Cl-C-C=O), 41.1 (-CH2-N-), 33.4 (-CH2-C=O), 27.9, 25.9, 23.9; Rt,1 (ACN 중): 2.09; MS ES+ m/z: 315.76.
I.9. 벤질 6-(4-브로모-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트
Figure pct00101
CCl4 (40 mL) 중 벤질 6-(1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트 (벤질 6-(3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트로부터 출발하여 단일-염화물 화합물의 산화를 위한 표준 절차에 이어서 획득됨)(3　g, 8.89 mmol, 1.00 당량) 용액에 Br2 (1.2 mL, 19.58 mmol, 2.2 당량)를 상온에서 30분에 걸쳐 교반하면서 적가하였고, 75℃에서 밤샘 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축하고, CHCl3 (40 mL)로 희석하였고, 이어서 피리딘 (0.9 g)을 첨가하였다. 생성된 용액을 상온에서 30분 동안 교반한 다음 50 ml 포화 NaHCO3 용액을 첨가하여 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 포화 소듐 카보네이트 (2 × 50 mL) 및 50 mL 염수로 세척하였다. 생성된 혼합물을 감압 하에 농축하였으며, 잔류물을 에틸 아세테이트/석유 에테르 (1:5)를 사용한 실리카겔 컬럼에 의해 정제하여 0.4 g (10.8%)의 벤질 6-(4-브로모-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트를 옅은 노란색 오일로서 제공하였다. LC-MS (ES, m/z): 416 [M+H]+, 433[M+NH4] +; 1H-NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.42 - 7.28 (m, 2H), 5.12 (s, 1H), 3.69 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 2.38 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 1.86 - 1.64 (m, 2H), 1.47 - 1.34 (m, 1H).
실시예 3. 6-(4-브로모-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산산
Figure pct00102
디옥산 (10 mL) 중 벤질 6-(4-브로모-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트 (1 g, 2.40 mmol, 1.00 당량) 용액에 4 N HCl (10 mL)을 0℃에서 교반하면서 적가하였다. 생성된 용액을 실온에서 2일 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 감압 하에 농축하고, 디클로로메탄 (3 × 50 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기층을 염수 (2 × 100 mL)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트 위에서 건조시켜 진공 하에 농축하였다. 잔류물을 DCM/MeOH (10:1)을 사용한 실리카겔 컬럼에 의해 정제하여 100 mg (13%)의 6-(4-브로모-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산산을 흰색 고체로서 제공하였다. LC-MS (ES, m/z): 308[M+NH4] +, 326/328[M+H]+; 1H-NMR (300 MHz, 클로로포름-d) δ 7.58 (s, 1H), 3.75 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.78 (dq, J = 34.6, 7.4 Hz, 4H), 1.47 (t, J = 7.7 Hz, 2H).
X 1 = OR인 링커의 합성을 위한 합성 경로의 예
Figure pct00103
I.10. 벤질 6-(5-(4-시아노펜옥시)-1-옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트
Figure pct00104
THF (2 mL) 중 4-히드록시벤젠카보니트릴 (76 mg, 0639 mmol) 용액을 0℃에서 THF (2 mL) 중 NaH (0.639 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 교반하면서 30분 후에, THF (2 mL) 중 벤질 6-(5-클로로-1-옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트 (250 mg, 0,703 mmol)를 첨가하였다. 다음으로 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 AcOEt로 희석하고, NH4Cl (10% 수용성)을 첨가하였다. 다음으로 유기상을 염수로 세척하고, MgSO4 위에서 건조시키고, 여과하여 농축하였다. 조 산물을 DCM/MeOH 혼합물 (80/20)을 사용한 실리카겔 컬럼 상에서 정제하여 벤질 6-(5-(4-시아노펜옥시)-1-옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트 (210 mg, 75% 수율)을 무색 오일로서 제공하였다. LC-MS (ES, m/z): 439.0 [M+H]+; 1H-NMR (300 MHz, 클로로포름-d) δ 7.79 (m, 2H), 7.35 (m, 7H), 5.59 (s, 1H), 5.12 (s, 2H), 3.69 (m, 2H), 2.37 (m, 2H), 1.71 (m, 4H), 1.39 (m, 2H).
I.11. 벤질 6-(5-(4-시아노펜옥시)-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트
Figure pct00105
벤질 6-(5-(4-시아노펜옥시)-1-옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트로부터 출발하여 단일-염화물 화합물의 산화를 위한 표준 절차 이후에 무색 오일로서 획득되었다 (136 mg, 48% 수율). LC-MS (ES, m/z): 455.0 [M+H]+; 1H-NMR (300 MHz, 클로로포름-d) δ 7.82 (m, 2H), 7.40 (m, 2H), 7.35 (m, 5H), 5.63 (s, 1H), 5.12 (s, 2H), 3.65 (m, 2H), 2.38 (m, 2H), 1.79 (m, 2H), 1.70 (m, 2H), 1.41 (m, 2H).
실시예 4. 6-(5-(4-시아노펜옥시)-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산산
Figure pct00106
벤질 6-(5-(4-시아노펜옥시)-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트로부터 출발하여 벤질 에스테르의 탈보호를 위한 표준 절차 이후에 흰색 고체로서 획득되었다 (38 mg, 35% 수율). LC-MS (ES, m/z): 365.0 [M+H]+; 1H-MR (300 MHz, 클로로포름-d) 7.82 (m, 2H), 7.41 (m, 2H), 5.65 (s, 1H), 3.67 (m, 2H), 2.38 (m, 2H), 1.80 (m, 2H), 1.69 (m, 2H), 1.44 (m, 2H).
I.12. 벤질 6-(5-메톡시-1-옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트
Figure pct00107
메탄올 (5 mL) 중 벤질 6-(5-클로로-1-옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트 (270 mg, 0,759 mmol) 밑 트리에틸아민 (113 μL, 0,835 mmol)의 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 다음으로 휘발물을 진공 하에 제거하고, 잔류물을 실리카 컬럼 시클로헥산/AcOEt (1/1) 상에서 정제하여 벤질 6-(5-메톡시-1-옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트 (107 mg, 40%)를 노란색 오일로서 제공하였다. LC-MS (ES, m/z): 352.0 [M+H]+; 1H-NMR (300 MHz, 클로로포름-d) δ 7.36 (m, 5H), 5.57 (s, 1H), 5.11 (s, 2H), 4.04 (s, 3H), 3.60 (m, 2H), 2.37 (m, 2H), 1.75 (m, 2H), 1.69 (m, 2H), 1.39 (m, 2H).
I.13. 벤질 6-(5-메톡시-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트
Figure pct00108
벤질 6-(5-메톡시-1-옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트로부터 출발하여 단일염화물 화합물의 산화를 위한 표준 절차 이후에 흰색 고체로서 획득하였다 (62 mg, 36% 수율). LC-MS (ES, m/z): 368.0 [M+H]+; 1H-NMR (300 MHz, 클로로포름-d) δ 7.36 (m, 5H), 5.57 (s, 1H), 5.11 (s, 2H), 4.04 (s, 3H), 3.60 (m, 2H), 2.37 (m, 2H), 1.75 (m, 2H), 1.69 (m, 2H), 1.39 (m, 2H).
실시예 5. 6-(5-메톡시-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산산
Figure pct00109
벤질 6-(5-메톡시-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트로부터 출발하여 벤질 에스테르의 탈보호를 위한 표준 절차 이후에 흰색 고체로서 획득하였다 (37 mg, 67% 수율). HRMS (ES, m/z): [M+H] 관찰값 278.0691, 계산값 278.0698; 1H-NMR (300 MHz, 클로로포름-d) δ 5.60 (s, 1H), 4.05 (s, 3H), 3.62 (m, 2H), 2.36 (m, 2H), 1.77 (m, 2H), 1.68 (m, 2H), 1.42 (m, 2H).
I.14. 벤질 4-(아미노메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 4-메틸벤젠설포네이트
Figure pct00110
톨루엔 (50 mL) 중 4-(아미노메틸)시클로헥산카르복실산 (10 g, 63.61 mmol, 1 당량), 페닐메탄올 (55.03 g, 508.87 mmol, 52.91 mL, 8 당량) 및 TsOH.H2O (12.70 g, 66.79 mmol, 1.05 당량)의 혼합물을 140℃에서 16시간 동안 딘 앤 스타크 장치를 사용하여 교반하여 압축의 물을 톨루엔 설폰산 모노하이드레이트로부터 수집하였다. 반응은 수시간 동안 환류한 이후에 맑게 변하였다. 맑은 반응 혼합물을 TBME (500 mL)에 넣고, 생성된 흰색 고체를 여과하고, TBME (200 mL)로 세척하여 진공에서 건조시켰다. 벤질 4-(아미노메틸)시클로헥산카르복실레이트;4-메틸벤젠설폰산 (26.6 g, 63.40 mmol, 99.68% 수율)을 흰색 고체로서 획득하였다. 1H NMR (400 MHz, METHANOL-d4) δ ppm 7.71 (d, J=8.16 Hz, 2 H) 7.28 - 7.40 (m, 5 H) 7.23 (d, J=7.94 Hz, 2 H) 5.11 (s, 2 H) 2.77 (d, J=7.06 Hz, 2 H) 2.29 - 2.39 (m, 4 H) 1.99 - 2.08 (m, 2 H) 1.85 (br d, J=11.25 Hz, 2 H) 1.53 - 1.65 (m, 1 H) 1.43 (qd, J=12.97, 3.20 Hz, 2 H) 1.06 (qd, J=12.75, 3.20 Hz, 2 H).
I.15. 디벤질 4,4'-(((3,3'-디설판디일비스(프로판오일))비스(아잔디일))비스(메틸렌))비스 (시클로헥산-1-카르복실레이트)
Figure pct00111
DCM (300 mL) 중 3-(2-카르복시에틸디설파닐)프로판산(6.64 g, 31.58 mmol, 1 당량), HOBt (9.39 g, 69.48 mmol, 2.2 당량) 및 TEA (12.78 g, 126.33 mmol, 17.58 mL, 4 당량)의 용액에 0℃에서 EDCI (13.32 g, 69.48 mmol, 2.2 당량)를 첨가하였다. 다음으로 벤질 4-(아미노메틸)시클로헥산카르복실레이트; 4-메틸벤젠설폰산 (26.5 g, 63.17 mmol, 2 당량)을 이 온도에서 첨가하였다. 혼합물을 0 내지 20℃에서 4시간 동안 교반하였다. TLC (석유 에테르:에틸 아세테이트 = 2:1, Rf = 0.5)가 반응이 완료된 것을 나타내었다. 혼합물을 포화 NaHCO3 (100 mL) 및 H2O (100 mL)에 넣고, 유기층을 분리하였다. 수용성 층을 DCM (200 mL)로 추출하였다. 조합된 유기층을 H2O (100 mL), 염수 (100 mL)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축하였다. 잔류물을 DCM (50 mL)에 용해시키고, 석유 에테르를 흰색 침전물이 형성될 때까지 매우 천천히 첨가하였으며, 여과하고 석유 에테르로 세척하여 진공 위에서 건조하였다. 벤질 4-[[3-[[3-[(4-벤질옥시카보닐시클로헥실)메틸아미노]-3-옥소-프로필]디설파닐]프로판오일아미노]메틸]시클로헥산카르복실레이트 (19 g, 28.40 mmol, 89.94% 수율)를 흰색 고체로서 획득하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 7.27 - 7.41 (m, 10 H) 6.05 (br s, 2 H) 5.11 (d, J=1.54 Hz, 4 H) 3.10 - 3.17 (m, 4 H) 2.96 - 3.02 (m, 4 H) 2.54 - 2.63 (m, 4 H) 2.30 (td, J=12.24, 1.76 Hz, 2 H) 2.04 (br d, J=12.57 Hz, 4 H) 1.85 (br d, J=12.79 Hz, 4 H) 1.38 - 1.54 (m, 6 H) 0.99 (q, J=12.72 Hz, 4 H).
I.16. 벤질 4-((5-클로로-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트
Figure pct00112
I.17. 벤질 4-((4,5-디클로로-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트
Figure pct00113
DCM (100 mL) 중 벤질 4-[[3-[[3-[(4-벤질옥시카보닐시클로헥실)메틸아미노]-3-옥소-프로필] 디설파닐]프로판오일아미노]메틸]시클로헥산카르복실레이트 (10 g, 14.95 mmol, 1 당량) 용액에 설퓨릴 염화물 (10.09 g, 74.75 mmol, 7.47 mL, 5 당량)을 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 0 내지 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 맑은 용액을 설퓨릴 염화물을 첨가한 이후에 획득하였다. TLC (석유 에테르:에틸 아세테이트 = 2:1, Rf. (주요) = 0.5)는 반응이 완료된 것을 나타내었다. 혼합물을 H2O (30 mL)에 넣고, DCM (50 mL × 2)으로 추출하였다. 조합된 유기층을 H2O (50 mL), 염수 (50 mL)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축하였다. 실리카겔 컬럼 상의 정제로 갈색 고체로서 획득된 벤질 4-[(3-옥소이소티아졸-2-일)메틸]시클로헥산카르복실레이트 (2.1 g, 3.42 mmol, 11.44% 수율, 54% 순도), 미색 고체로서 획득돤 벤질 4-[(5-클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)메틸]시클로헥산카르복실레이트 (7.1 g, 18.82 mmol, 62.96% 수율, 97% 순도) 및 갈색 오일로서 획득된 벤질 4-[(4,5-디클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)메틸]시클로헥산카르복실레이트 (0.4 g, 869.31 μmol, 2.91% 수율, 87% 순도)를 제공하였다.
I.18. 벤질 4-((5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트
Figure pct00114
H2O (20 mL), ACN (10 mL) 및 DCM (10 mL) 중 벤질 4-[(5-클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)메틸]시클로헥산카르복실레이트 (2 g, 5.01 mmol, 1 당량)의 혼합물에 RuCl3.H2O (22.58 mg, 100.14 μmol, 0.02 당량) 및 NaIO4 (6.43 g, 30.04 mmol, 1.66 mL, 6 당량)을 0℃에서 N2 하에 일정량 첨가하였다. 다음으로 혼합물을 20℃로 가온하여 16시간 동안 교반하였다. TLC가 반응이 완료된 것을 나타내었다 (석유 에테르:에틸 아세테이트=2:1, Rf-p1=0.6). 혼합물을 여과하고, 여과물을 질소 주입에 의해 농축하고, 다시 나온 고체를 여과하고, 여과물을 질소로 농축하였다. 잔류물을 제조용 TLC (컬럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카겔, 석유 에테르:에틸 아세테이트=2:1)에 의해 정제하여 벤질 4-[(5-클로로-1,1,3-트리소-이소티아졸-2-일)메틸]시클로헥산카르복실레이트 (1.4 g, 3.17 mmol, 63.25% 수율, 90% 순도)를 흰색 고체로서 제공하였다.
실시예 6. 4-((5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)메틸)시클로헥산-1-카르복실산
Figure pct00115
DCM (5 mL) 중 벤질 4-[(5-클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)메틸]시클로헥산카르복실레이트 (0.1 g, 226.20 μmol, 1 당량) 혼합물에 MsOH (217.39 mg, 2.26 mmol, 161.03 uL, 10 당량)를 30℃에서 N2 하에 일정량을 첨가하였다. 혼합물을 30℃에서 16시간 동안 교반하였다. TLC가 반응이 완료된 것을 나타내었다. LCMS (ET17992-54-P1A)가 검출된 원하는 MS를 보여주었다. 혼합물울 얼음물 (5 mL)에 넣고, 5분 동안 교반하였다. 수용성 상을 DCM (3 mL × 2)로 추출하였다. 조합된 유기상을 염수 (3 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시켰으며, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 제조용 TLC (컬럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬실리카겔, 석유 에테르:/에틸 아세테이트=2:1)에 의해 정제하여 4-[(5-클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)메틸]시클로헥산카르복실산 (0.02 g, 64.99 umol, 28.73% 수율)를 무색 오일로서 제공하였다. LC-MS (ES, m/z): 306.0 [M-H]-; 1H-NMR (300 MHz, DMSO-D6) δ 12.01 (bs, 1H), 7.62 (s, 1H), 3.45 (m, 2H), 2.11 (m, 1H), 1.90 (m, 2H), 1.76 (m, 2H), 1.73 (m, 1H), 1.23 (m, 2H), 0.96 (m, 2H).
I.19 벤질 4-((4,5-di클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트
Figure pct00116
H2O (20 mL), DCM (10 mL) 및 ACN (10 mL) 중 벤질 4-[(4,5-디클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)메틸] 시클로헥산카르복실레이트 (1.2 g, 2.70 mmol, 1 당량)의 혼합물에 RuCl3.H2O (12.16 mg, 53.96 μmol, 0.02 당량) 및 NaIO4 (3.46 g, 16.19 mmol, 896.96 μL, 6 당량)을 0℃에서 N2 하에 일정량 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC가 반응이 완료된 것을 보여주었다 (석유 에테르:에틸 아세테이트=2:1, Rf-p1=0.7). 혼합물을 얼음물 (30 mL)에 넣고, 5분 동안 교반하였다. 수용성 상을 에틸 아세테이트 (20 mL × 2)로 추출하였다. 조합된 유기상을 염수 (20 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4, 위에서 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (컬럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카겔, 석유 에테르:에틸 아세테이트=5:1 내지 3:1)에 의해 정제하여 벤질 4-[(4,5-디클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)메틸]시클로헥산카르복실레이트 (0.8 g, 1.67 mmol, 61.73% 수율, 90% 순도)를 흰색 고체로서 제공하였다.
실시예 7. 4-((4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)메틸)시클로헥산-1-카르복실산
Figure pct00117
DCM (20 mL) 중 벤질 4-[(4,5-디클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)메틸] 시클로헥산카르복실레이트 (0.8 g, 1.67 mmol, 1 당량) 혼합물에 MsOH (1.60 g, 16.65 mmol, 1.19 mL, 10 당량)를 30℃에서 N2 하에 일정량 첨가하였다. 혼합물을 30℃에서 16시간 동안 교반하였다. LCMS가 반응이 완료된 것을 보여주었다. 혼합물을 얼음물 (5 mL)에 넣고, 감압 하에 농축한 다음 고체가 나왔다. 용액을 여과하고, EtOAc (2 mL × 3)에 의해 분쇄하였으며, 필터 케이크를 진공에서 건조하여 4-[(4,5-디클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)메틸]시클로헥산카르복실산 (0.170 g, 486.86 μmol, 29.23% 수율, 98% 순도)를 흰색 고체로서 제공하였다. LC-MS (ES, m/z): 364.0 [M+Na]+ ; 1H-NMR (300 MHz, DMSO-D6) δ 11.99 (bs, 1H), 3.49 (m, 2H), 2.11 (m, 1H), 1.88 (m, 2H), 1.79 (m, 2H), 1.66 (m, 1H), 1.23 (m, 2H), 0.96 (m, 2H).
I.20 디벤질 3,3'-(((3,3'-디설판디일비스(프로판오일))비스(아잔디일))비스(4,1-페닐렌)) 디프로피오네이트
Figure pct00118
DCM (50 mL) 중 3-(2-카르복시에틸디설파닐)프로판산 (651.56 mg, 3.10 mmol, 1 당량), HOBt (921.15 mg, 6.82 mmol, 2.2 당량) 및 TEA (1.25 g, 12.39 mmol, 1.73 mL, 4 당량)의 용액에 EDCI (1.31 g, 6.82 mmol, 2.2 당량)을 0℃에서 첨가하였다. 다음으로 벤질 4-(아미노메틸)시클로헥산카르복실레이트;4-메틸벤젠설폰산 (2.6 g, 6.20 mmol, 2 당량)을 이 온도에서 첨가하였다. 혼합물을 0 내지 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC (석유 에테르:에틸 아세테이트 = 2:1, Rf = 0.5)가 반응이 완료된 것을 나타내었다. 혼합물을 포화 NaHCO3 (20 mL) 및 H2O (20 mL)에 넣고, 유기층을 분리하였다. 수용성 층을 DCM (50 mL)로 추출하였다. 조합된 유기층을 H2O (50 mL), 염수 (50 mL)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축하였다. 벤질 4-[[3-[[3-[(4-벤질옥시카보닐시클로헥실)메틸아미노]-3-옥소-프로필]디설파닐]프로판오일 아미노]메틸]시클로헥산카르복실레이트 (1.1 g, 1.64 mmol, 53.07% 수율)을 흰색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 7.28 - 7.41 (m,　10 H) 5.96 (br s, 2 H) 5.10 (s, 4 H) 3.13 (t, J=6.39 Hz, 4 H) 2.98 (t, J=6.84 Hz, 4 H) 2.57 (t, J=6.95 Hz, 4 H) 2.23 - 2.34 (m, 2 H) 2.03 (br d, J=12.79 Hz, 4 H) 1.84 (br d, J=12.13 Hz, 4 H) 1.37 - 1.63 (m,　6 H) 0.91 - 1.05 (m, 4 H).
I.21. 벤질 3-(4-(5-클로로-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)페닐)프로파노에이트
Figure pct00119
DCM (200 mL) 중 벤질 3-[4-[3-[[3-[4-(3-벤질oxy-3-옥소-프로필)anilino]-3-옥소-프로필]디설파닐]프로판오일아미노]페닐]프로파노에이트 (10 g, 14.60 mmol, 1 당량) 용액에 설퓨릴 염화물 (5.91 g, 43.80 mmol, 4.38 mL, 3 당량)을 25℃에서 N2 하에 적가하였다. 용액을 25℃에서 8시간 동안 교반하였다. 설퓨릴 염화물을 첨가할 때 용액의 색상이 무색에서 검정색으로, 1시간 후에 노란색으로 다시 변하였다. TLC (석유 에테르:에틸 아세테이트 = 2:1, Rf = 0.60)가 출발 물질이 소모된 다음 2개의 새로운 주요 스폿이 생성된 것을 보여주었다. 잔류물을 얼음물 (200 mL)에 넣은 다음 진공에서 농축하여 DCM을 제거하였다. 농축 이후에, 수용성 상을 에틸 아세테이트 (200 mL × 3)로 추출한 다음 조합된 유기상을 물 (200 mL × 1)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 석유 에테르:에틸 아세테이트 = 5:1 내지 1:1)에 의해 정제하여 벤질 3-[4-(3-옥소이소티아졸-2-일)페닐]프로파노에이트 (2.5 g, 7.37 mmol, 50.47% 수율) 1H NMR (400 MHz, METHANOL-d4) δ = 8.56 (d, J=6.2 Hz, 1H), 7.44 - 7.39 (m, 2H), 7.37 - 7.26 (m, 7H), 6.30 (d, J=6.4 Hz, 1H), 5.09 (s, 2H), 2.98 (t, J=7.4 Hz, 2H), 2.78 - 2.66 (m, 2H); 및 벤질 3-[4-(5-클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)페닐]프로파노에이트 (5 g, 13.37 mmol, 91.60% 수율) 1H NMR (ET17992-22-P2A) 검증된 ET17992-22-P2. 1H NMR (400MHz, 메탄올-d4) δ = 7.42 - 7.36 (m, 2H), 7.35 - 7.25 (m, 7H), 6.49 - 6.45 (m, 1H), 5.08 (s, 2H), 2.99 - 2.91 (m, 2H), 2.69 (t, J=7.5 Hz, 2H)을 노란색 고체로서 수득하였다.
I.22. 벤질 3-(4-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)페닐)프로파노에이트
Figure pct00120
H2O (12 mL), DCM (6 mL) 및 ACN (6 mL) 중 벤질 3-[4-(5-클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)페닐]프로파노에이트 (1.4 g, 3.74 mmol, 1 당량)의 혼합물에 NaIO4 (4.81 g, 22.47 mmol, 1.25 mL, 6 당량)을 25℃에서 일정량 첨가한 다음 혼합물을 N2 로 3회 세척하였다. 다음으로 RuCl3.H2O (42.21 mg, 187.24 umol, 0.05 당량)을 N2 하에 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 혼합물이 혼탁하게 변하고, 색상은 회색이 되었다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (100 mL)에 넣은 다음 여과하였다. 여과물을 진공에서 농축하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 석유 에테르:에틸 아세테이트 = 10:1 내지 4:1)에 의해 정제하여 벤질 3-[4-(5-클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)페닐]프로파노에이트 (460 mg, 1.08 mmol, 28.75% 수율, 95% 순도)를 노란색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (ET17992-63-P1A) 검증된 ET17992-63-P1. 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 7.41 - 7.30 (m, 7H), 6.84 (s, 1H), 5.13 (s, 2H), 3.04 (t, J=7.6 Hz, 2H), 2.72 (t, J=7.7 Hz, 2H).
실시예 8. 3-(4-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)페닐)프로판산
Figure pct00121
DCM (15 mL) 중 벤질 3-[4-(5-클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)페닐]프로파노에이트 (460 mg, 1.13 mmol, 1 당량) 용액에 메탄설폰산 (1.09 g, 11.33 mmol, 806.87 μL, 10 당량)을 10℃에서 적가하였다. 다음으로 용액을 35℃로 가온하여 12시간 동안 교반하였다. 잔류물을 물 (15 mL × 3)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축하였다. 잔류물을 물 (20 mL)에 넣은 다음 여과하였다. 필터 케이크를 DCM (5 mL)에 용해시킨 다음 석유 에테르 (30 mL)를 잔류물에 넣어 용액을 10℃에서 2시간 동안 교반한 다음 여과하였으며, 필터 케이트를 진공에서 건조하여 3-[4-(5-클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)페닐]프로판산 (162 mg, 501.81 umol, 44.27% 수율, 97.8% 순도)를 흰색 고체로서 제공하였다. LC-MS (ES, m/z): 313.9 [M-H]-; 1H-NMR (300 MHz, DMSO-D6) δ 12.18 (bs, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.45 (m, 2H), 7.37 (m, 2H), 2.89 (m, 2H), 2.58 (m, 2H).
I.23. 벤질 3-(4-(4,5-디클로로-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)페닐)프로파노에이트
Figure pct00122
H2O (20 mL), ACN (10 mL) 및 DCM (10 mL) 중 벤질 4-[(3-옥소이소티아졸-2-일)메틸]시클로헥산카르복실레이트 (1.2 g, 3.32 mmol, 1 당량)의 용액에 RuCl3.H2O (14.95 mg, 66.33 μmol, 0.02 당량) 및 NaIO4 (4.26 g, 19.90 mmol, 1.10 mL, 6 당량)을 0℃에서 N2 하에 일정량 첨가하였다. 다음으로 혼합물을 20℃로 가온하여 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 여과물을 질소 주입에 의해 농축하고, 고체가 나오면 다시 여과하였으며, 여과물을 질소에 의해 농축하였다. 잔류물을 제조용 TLC (컬럼 높이: 250 mm, 직경: 100 mm, 100-200 메쉬 실리카겔, 석유 에테르:에틸 아세테이트 = 2:1)에 의해 정제하여 벤질 4-[(1,1,3-트리옥소이소티아졸-2-일)메틸]시클로헥산카르복실레이트 (0.45 g, 1.11 mmol, 33.60% 수율, 90% 순도)을 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 7.53 (dd, J=3.2, 8.7 Hz, 2H), 7.17 (ddd, J=3.2, 7.6, 9.0 Hz, 2H), 6.97 - 6.89 (m, 2H), 5.56 (br s, 1H), 4.12 - 4.06 (m, 4H), 3.92 (s, 5H), 3.55 (q, J=5.1 Hz, 5H).
I.24. 벤질 3-(4-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)페닐)프로파노에이트
Figure pct00123
H2O (10 mL), DCM (5 mL) 및 ACN (5 mL) 중 벤질 3-[4-(4,5-디클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)페닐]프로파노에이트 (650 mg, 1.59 mmol, 1 당량) 및 NaIO4 (1.36 g, 6.37 mmol, 352.86 μL, 4 당량)의 혼합물에 RuCl3.H2O (7.18 mg, 31.84 μmol, 0.02 당량)를 0에서 N2 하에 일정량 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (30 mL × 2)로 추출하였다. 조합된 유기상을 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 석유 에테르:에틸 아세테이트 = 30:1 내지 5:1)에 의해 정제하여 벤질 3-[4-(4,5-디클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)페닐]프로파노에이트 (180 mg, 25.68% 수율)를 노란색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 7.43 - 7.29 (m, 9H), 5.13 (s, 2H), 3.05 (t, J=7.6 Hz, 2H), 2.73 (t, J=7.6 Hz, 2H).
실시예 9. 3-(4-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)페닐)프로판산
Figure pct00124
DCM (5 mL) 중 벤질 3-[4-(4,5-디클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)페닐]프로파노에이트 (180 mg, 408.81 μmol, 1 당량) 용액에 메탄설폰산 (392.89 mg, 4.09 mmol, 291.03 μL, 10 당량)을 10℃에서 적가하였다. 용액을 55℃에서 12시간 동안 교반하였다. 잔류물을 물 (5 mL)에 넣은 다음 여과하였다. 필터 케이크를 물 (10 mL × 3)로 세척한 다음 진공에서 건조하였다. 잔류물을 디클로로메탄:메탄올 (5.5 mL, v/v = 10:1)에 용해시킨 다음 제조용 TLC (에틸 아세테이트, Rf = 0.26)에 의해 정제하여 3-[4-(4,5-디클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)페닐]프로판산 (57.64 mg, 156.83 umol, 38.36% 수율, 95.278% 순도)를 흰색 고체로서 제공하였다. LC-MS (ES, m/z): 347.9 [M-H]-; 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 12.22 (br s, 1H), 7.51 - 7.40 (m, 4H), 2.90 (br t, J=7.6 Hz, 2H), 2.60 (br t, J=7.6 Hz, 2H).
I.25. 디벤질 4,4'-((3,3'-디설판디일비스(프로판오일))비스(아잔디일))디벤조에이트
Figure pct00125
DMF (120 mL) 중 3-(2-카르복시에틸디설파닐)프로판산 (6.01 g, 28.60 mmol, 1 당량) 및 피리딘 (14.93 g, 188.77 mmol, 15.24 mL, 6.6 당량)의 용액에 EDCI (12.06 g, 62.92 mmol, 2.2 당량) 및 벤질 4-아미노벤조에이트 (13 g, 57.20 mmol, 2 당량)를 10℃에서 첨가하였다. 다음으로 혼합물을 50℃에서 12시간 동안 교반하였다. 잔류물을 얼음물 (200 mL)에 넣고, 20분 동안 교반하였다. 수용성 상을 에틸 아세테이트 (200 mL × 3)로 추출하였다. 조합된 유기상을 포화 NaCl (200 mL × 3)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축하였다. 다음으로 잔류물을 석유 에테르:DCM = 50:1로부터 재결정화하여 고체를 수득하였다. 고체를 석유 (150 mL × 3)로 3회 세척한 다음 진공에서 건조하 여 벤질 4-[3-[[3-(4-벤질옥시카보닐아닐리노)-3-옥소-프로필]디설파닐] 프로판오일아미노]벤조에이트 (14 g, 미정제)를 흰색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 10.37 (s, 2H), 8.02 - 7.83 (m, 4H), 7.72 (d, J=8.8 Hz, 4H), 7.48 - 7.32 (m, 10H), 5.31 (s, 4H), 3.05 - 2.98 (m, 4H), 2.81 - 2.75 (m, 4H).
I.26. 벤질 4-(5-클로로-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)벤조에이트
Figure pct00126
I.27. 벤질 4-(4,5-디클로로-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)벤조에이트
Figure pct00127
DCM (120 mL) 중 벤질 4-[3-[[3-(4-벤질옥시카보닐아닐리노)-3-옥소-프로필] 디설파닐]프로판오일아미노]벤조에이트 (9.4 g, 14.95 mmol, 1 당량) 용액에 설퓨릴 염화물 (10.09 g, 74.75 mmol, 7.47 mL, 5 당량)을 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 0 내지 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 혼합물이 수분 동안 교반한 이후에 맑게 변하였다. TLC (석유 에테르:에틸 아세테이트 = 2:1)가 반응이 완료된 것을 나타내었다. 혼합물을 H2O (200 mL)에 넣고, DCM (200 mL × 2)로 추출하였다. 조합된 유기층을 H2O (200 mL × 2)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시켰으며, 여과하여 진공에서 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 (석유 에테르:에틸 아세테이트 = 5:1 내지 1:1) 상의 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였으며, 미색 고체로서 획득된 벤질 4-(3-옥소이소티아졸-2-일)벤조에이트 (1.2 g, 3.43 mmol, 11.47% 수율, 89% 순도) 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 8.09 - 8.27 (m, 3 H) 7.63 - 7.82 (m, 2 H) 7.32 - 7.52 (m, 5 H) 6.34 (br d, J=6.36 Hz, 1 H) 5.39 (s, 2 H); 미색 고체로서 획득된 벤질 4-(5-클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)벤조에이트 (3.5 g, 10.01 mmol, 33.49% 수율, 98.92% 순도) 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 8.15 (d, J=8.60 Hz, 2 H) 7.69 (d, J=8.82 Hz, 2 H) 7.33 - 7.49 (m, 4 H) 6.38 (s, 1 H) 5.38 (s, 2 H); 및 미색 고체로서 획득된 벤질 4-(4,5-디클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)벤조에이트 (2.8 g, 7.19 mmol, 24.06% 수율, 97.68% 순도) 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 8.18 (d, J=8.60 Hz, 2 H) 7.71 (d, J=8.60 Hz, 2 H) 7.33 - 7.50 (m, 4 H) 5.39 (s, 2 H)를 제공하였다.
I.28. 벤질 4-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)벤조에이트
Figure pct00128
H2O (10 mL), ACN (5 mL) 및 DCM (5 mL) 중 벤질 4-(5-클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)벤조에이트 (1 g, 2.89 mmol, 1 당량)의 혼합물에 RuCl3.H2O (13.04 mg, 57.84 μmol, 0.02 당량) 및 NaIO4 (2.47 g, 11.57 mmol, 640.97 μL, 4 당량)를 0℃에서 N2 하에 일정량 첨가하였다. 다음으로 혼합물을 20℃로 가온하여 2시간 동안 교반하였다. 잔류물을 여과하고, 여과물을 물 (40 mL)에 넣었다. 수용성 상을 에틸 아세테이트 (50 mL × 1)로 추출하였다. 유기상을 포화 NaCl (30 mL × 3)로 추출하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 석유 에테르:에틸 아세테이트 = 15:1 내지 5:1)에 의해 정제하여 벤질 4-(5-클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)벤조에이트 (500 mg, 1.32 mmol, 45.77% 수율)을 노란색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 8.27 - 8.21 (m, 2H), 7.61 - 7.55 (m, 2H), 7.49 - 7.34 (m, 5H), 6.87 (s, 1H), 5.40 (s, 2H).
실시예 10. 4-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)벤조산
Figure pct00129
DCM (20 mL) 중 벤질 4-(5-클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)벤조에이트 (450 mg, 1.19 mmol, 1 당량) 용액에 메탄설폰산 (1.14 g, 11.91 mmol, 847.94 μL, 10 당량)을 10℃에서 적가하였다. 용액을 35℃에서 10시간 동안 교반하였다. 잔류물 진공에서 농축하여 DCM를 제거하였다. 다음으로, 잔류물을 에틸 아세테이트 (10 mL)에 용해시킨 다음 유기상을 물 (20 mL × 5)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축하였다. 잔류물을 메탄올 (3 mL)에 용해시킨 다음 석유 에테르 (30 mL)를 잔류물에 넣고, 용액을 10℃에서 2분 동안 교반한 다음 여과하고, 필터 케이크를 진공에서 건조하여 4-(5-클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)벤조산 (112.56 mg, 379.48 μmol, 31.86% 수율, 96.986% 순도)를 흰색 고체로서 제공하였다. LC-MS (ES, m/z): 285.9 [M-H]-; 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 13.33 (br s, 1H), 8.17 - 8.11 (m, 2H), 7.87 (d, J=1.5 Hz, 1H), 7.67 - 7.61 (m, 2H).
I.29. 벤질 4-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)벤조에이트
Figure pct00130
H2O (10 mL), ACN (5 mL) 및 DCM (5 mL) 중 벤질 4-(4,5-디클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)벤조에이트 (1 g, 2.63 mmol, 1 당량)의 용액에 RuCl3.H2O (11.86 mg, 52.60 μmol, 0.02 당량) 및 NaIO4 (2.25 g, 10.52 mmol, 582.91 μL, 4 당량)을 0℃에서 N2 하에 일정량 첨가하였다. 다음으로 혼합물을 20℃로 가온하여 2시간 동안 교반하였다. 잔류물을 여과하고, 여과물을 진공에서 농축하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 석유 에테르:에틸 아세테이트 = 20:1 내지 5:1)에 의해 정제하여 벤질 4-(4,5-디클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)벤조에이트 (130 mg, 315.35 μmol, 11.99% 수율)를 흰색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 8.25 (d, J=8.6 Hz, 2H), 7.58 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.49 - 7.34 (m, 5H), 5.41 (s, 2H).
실시예 11. 4-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)벤조산
Figure pct00131
DCM (5 mL) 중 벤질 4-(4,5-디클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)벤조에이트 (130 mg, 315.35 μmol, 1 당량) 용액에 메탄설폰산 (303.07 mg, 3.15 mmol, 224.49 μL, 10 당량)을 10℃에서 적가하였다. 용액을 10℃에서 5분 동안 교반한 다음 용액을 35℃로 가온하여 10시간 동안 교반하였다. 용액의 색상이 무색에서 노란색으로 변하였다. 반응 용액을 물 (20 ml)에 넣은 다음 여과하였다. 필터 케이크를 물 (10 mL × 3) 및 DCM (10 mL × 3)로 각각 3회 세척하였다. 다음으로 필터 케이크를 진공에서 건조하였다. 잔류물을 DCM (10 mL)로 분산시킨 다음 석유 에테르 (30 mL)를 잔류물에 넣었으며, 혼합물을 10℃에서 2분 동안 교반한 다음, 여과하고, 필터 케이크를 진공에서 건조시켜서 4-(4,5-디클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)벤조산 (93.4 mg, 282.97 μmol, 89.73% 수율, 97.590% 순도)를 흰색 고체로서 제공하였다. LC-MS (ES, m/z): 319.9 [M-H]-; 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 8.16 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.68 (d, J=8.4 Hz, 2H).
I.30. 벤질 3-(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에톡시)프로파노에이트 4-메틸벤젠설포네이트
Figure pct00132
톨루엔 (30 mL) 중 3-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]프로판산 (4 g, 18.08 mmol, 1 당량), 페닐메탄올 (15.64 g, 144.63 mmol, 15.04 mL, 8 당량) 및 TsOH.H2O (3.61 g, 18.98 mmol, 1.05 당량)의 혼합물에 딘 앤 스타크 장치를 사용하여 140℃에서 8시간 동안 교반하여 압축의 물을 수집하였다. 반응은 수시간의 환류 이후에 맑게 변하였다. TLC (디클로로메탄:메탄올 = 10:1, Rf = 0.3)이 반응이 완료된 것을 나타내었다. 맑은 반응 혼합물을 TBME:석유 에테르 (1:1, 50 mL)에 넣어 맑은 용액을 제거하였다. 잔류물을 TBME:석유 에테르 (1:1, 50 mL)로 2회 세척하고, 진공에서 건조시켰다. 조 산물 벤질 3-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]프로파노에이트;4-메틸벤젠설폰산 (8.9 g, 미정제)을 노란색 오일로서 획득하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 7.76 (br d, J=8.07 Hz, 2 H) 7.33 - 7.38 (m, 5 H) 7.15 (d, J=7.95 Hz, 2 H) 5.11 (s, 2 H) 3.72 (q, J=6.11 Hz, 4 H) 3.53 - 3.64 (m, 8 H) 3.11 - 3.24 (m, 2 H) 2.53 - 2.69 (m, 2 H) 2.30 - 2.41 (m, 1 H) 2.34 (s, 3 H).
I.31. 벤질 3-[2-[2-[2-[3-[[3-[2-[2-[2-(3-벤질옥시-3-옥소-프로폭시)에톡시]에톡시]에틸 아미노]-3-옥소프로필]디설파닐]프로판오일아미노]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트
Figure pct00133
DCM (100 mL) 중 3-(2-카르복시에틸디설파닐)프로판산 (1.90 g, 9.04 mmol, 1 당량), HOBt (2.69 g, 19.88 mmol, 2.2 당량) 및 TEA (4.57 g, 45.18 mmol, 6.29 mL, 5 당량)의 혼합물에 EDCI (3.81 g, 19.88 mmol, 2.2 당량)를 20℃에서 첨가하였다. 다음으로 벤질 3-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]프로파노에이트;4-메틸벤젠설폰산 (8.74 g, 18.07 mmol, 2 당량)을 상기 용액에 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC (석유 에테르:에틸 아세테이트 = 2:1, Rf = 0.25)가 반응이 완료된 것을 나타내었다. MeOH을 첨가하고, 용액을 감압 하에 농축하고, 진공에서 건조시켰다. 잔류물을 H2O (20 mL)에 넣고, EtOAc (50 mL)로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축하였다. 조 산물을 제조용 TLC (석유 에테르:에틸 아세테이트 = 1:1, Rf = 0.5)에 의해 정제하여 벤질 3-[2-[2-[2-[3-[[3-[2-[2-[2-(3-벤질옥시-3-옥소-프로폭시)에톡시]에톡시]에틸아미노]-3-옥소-프로필]디설파닐]프로판오일 아미노]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트 (6.52 g, 7.94 mmol, 87.81% 수율, 97% 순도)을 노란색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 7.29 - 7.42 (m, 10 H) 6.42 (br s, 2 H) 5.15 (s, 4 H) 3.79 (t, J=6.42 Hz, 4 H) 3.53 - 3.69 (m, 18 H) 2.92 - 3.00 (m, 4 H) 2.62 - 2.71 (m, 4 H) 2.53 - 2.62 (m, 4 H).
I.32. 벤질 3-(2-(2-(2-(5-클로로-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)에톡시)에톡시)에톡시)프로파노에이트
Figure pct00134
DCM (50 mL) 중 벤질 3-[2-[2-[2-[3-[[3-[2-[2-[2-(3-벤질옥시-3-옥소-프로폭시)에톡시]에톡시]에틸아미노]-3-옥소프로필]디설파닐]프로판오일아미노]에톡시] 에톡시]에톡시]프로파노에이트 (6.4 g, 8.03 mmol, 1 당량) 용액에 DCM (10 mL) 중 설퓨릴 염화물 (4.34 g, 32.12 mmol, 3.21 mL, 4 당량)을 10℃에서 적가하였다. 혼합물을 0 내지 10℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC (석유 에테르:에틸 아세테이트 = 0:1, Rf = 0.15, 0.35)가 반응이 완료된 것을 나타내었다. 혼합물을 얼음/물 (100 mL)에 넣고, DCM (200 mL × 2)로 추출하였다. 조합된 유기층을 H2O (100 mL × 2), 염수 (100 mL)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시켰다. 여과물을 진공에서 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 (석유 에테르:에틸 아세테이트 = 1:1 내지 0:1) 상의 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 갈색 오일로서 벤질 3-[2-[2-[2-(3-옥소이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트 (820 mg, 1.66 mmol, 10.33% 수율, 80% 순도) 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 8.06 (d, J=6.17 Hz, 1 H) 7.30 - 7.41 (m, 5 H) 6.24 (d, J=6.39 Hz, 1 H) 5.15 (s, 2 H) 3.95 - 4.03 (m, 2 H) 3.79 (t, J=6.39 Hz, 2 H) 3.68 - 3.75 (m, 2 H) 3.59 - 3.68 (m, 8 H) 2.63 - 2.70 (m, 2 H); 및 무색 오일로서 벤질 3-[2-[2-[2-(5-클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트 (2.5 g, 4.30 mmol, 26.79% 수율, 74% 순도) 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 7.28 - 7.43 (m, 5 H) 6.25 (s, 1 H) 5.15 (s, 2 H) 3.92 - 3.98 (m, 2 H) 3.77 - 3.81 (m, 2 H) 3.59 - 3.71 (m, 10 H) 2.66 (t, J=6.39 Hz, 2 H)를 제공하였다.
I.33. 벤질 3-(2-(2-(2-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)에톡시)에톡시) 에톡시)프로파노에이트
Figure pct00135
H2O (20 mL), DCM (10 mL), ACN (10 mL) 중 벤질 3-[2-[2-[2-(5-클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시] 에톡시]프로파노에이트 (1 g, 2.33 mmol, 1 당량) 및 NaIO4 (1.99 g, 9.30 mmol, 515.57 μL, 4 당량)의 혼합물에 RuCl3.H2O (26.22 mg, 116.30 μmol, 0.05 당량)를 20℃에서 N2 하에 일정량 첨가하였다. 다음으로 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (20 mL × 2)로 추출하였다. 조합된 유기상을 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 석유 에테르:에틸 아세테이트 = 5:1 내지 1:1)에 의해 정제하여 벤질 3-[2-[2-[2-(5-클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트 (560 mg, 1.21 mmol, 52.12% 수율, 100% 순도)를 보라색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 7.42 - 7.29 (m, 5H), 6.70 (s, 1H), 5.15 (s, 2H), 3.92 - 3.86 (m, 2H), 3.77 (td, J=6.0, 11.9 Hz, 4H), 3.68 - 3.58 (m, 8H), 2.67 (t, J=6.5 Hz, 2H).
실시예 12. 3-(2-(2-(2-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)에톡시)에톡시)에톡시) 프로판산
Figure pct00136
DCM (30 mL) 중 벤질 3-[2-[2-[2-(5-클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)에톡시] 에톡시]에톡시]프로파노에이트 (560 mg, 1.21 mmol, 1 당량) 용액에 메탄설폰산 (1.17 g, 12.12 mmol, 863.06 μL, 10 당량)을 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 35℃로 가온하고, 10시간 동안 교반하였다. 용액의 색상이 노란색으로 변하였다. 잔류물을 물 (30 mL × 3)로 세척한 다음 유기상을 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축하였다. 잔류물을 제조용 TLC (에틸 아세테이트:에틸 아세테이트:메탄올: 아세트산 = 40:8:1, Rf = 0.77)에 의해 정제하여 3-[2-[2-[2-(5-클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시] 프로판산 (95.61 mg, 240.16 μmol, 19.81% 수율, 93.389% 순도)를 무색 오일로서 제공하였다. LC-MS (ES, m/z): 372.1 [M+H]+ ; 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 12.13 (br s, 1H), 7.64 (s, 1H), 3.86 - 3.74 (m, 2H), 3.61 (td, J=6.0, 16.9 Hz, 4H), 3.54 - 3.46 (m, 8H), 2.43 (t, J=6.4 Hz, 2H).
I.34. 벤질 3-(2-(2-(2-(4,5-디클로로-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)에톡시)에톡시)에톡시) 프로파노에이트
Figure pct00137
DCM (30 mL) 중 벤질 3-[2-[2-[2-(5-클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시] 프로파노에이트 (1.6 g, 3.72 mmol, 1 당량) 용액에 설퓨릴 염화물 (1.00 g, 7.44 mmol, 744.17 μL, 2 당량)을 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 0 내지 10℃에서 12시간 동안 교반하였다. 맑은 흐린 노란색 용액을 설퓨릴 염화물을 첨가한 이후 획득하였다. TLC (에틸 아세테이트:석유 에테르 = 2:1, Rf = 0.5)가 반응이 완료된 것을 나타내었다. 혼합물을 진공에서 농축하여 조 산물을제공하였다. 잔류물을 H2O (50 mL)에 넣고, DCM (50 mL × 2)로 추출하였다. 조합된 유기층을 H2O (50 mL)로 세척하고, Na2SO4, 위에서 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 (에틸 아세테이트:석유 에테르 = 1:2 내지 2:1) 상의 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 벤질 3-[2-[2-[2-(4,5-디클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시] 프로파노에이트 (1.06 g, 1.76 mmol, 47.17% 수율, 76.9% 순도)를 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 7.28 - 7.40 (m, 4 H) 5.13 (s, 2 H) 3.98 - 4.04 (m, 2 H) 3.77 (t, J=6.39 Hz, 2 H) 3.67 - 3.72 (m, 2 H) 3.57 - 3.67 (m, 8 H) 2.65 (t, J=6.39 Hz, 2 H).
I.35. 벤질 3-(2-(2-(2-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)에톡시)에톡시) 에톡시)프로파노에이트
Figure pct00138
H2O (20 mL), CH3CN (10 mL) 및 DCM (10 mL) 중 벤질 3-[2-[2-[2-(4,5-디클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)에톡시] 에톡시]에톡시] 프로파노에이트 (1 g, 2.15 mmol, 1 당량) 및 NaIO4 (1.84 g, 8.61 mmol, 477.32 μL, 4 당량)의 혼합물에 RuCl3.H2O (7.28 mg, 32.30 μmol, 0.015 당량)을 N2 하에 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0 내지 10℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC가 반응이 완료된 것을 나타내었다. 혼합물을 EtOAc (50 mL)로 희석하고, 여과하여 불용성 고체를 제거하였다. 유기층을 분리하고 진공에서 농축하였다. 잔류물을 제조용 TLC (석유 에테르:에틸 아세테이트 = 1:1, Rf = 0.6)에 의해 정제하여 벤질 3-[2-[2-[2-(4,5-디클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트 (830 mg, 1.61 mmol, 74.96% 수율, 96.533% 순도)를 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 7.28 - 7.41 (m, 5 H) 5.15 (s, 2 H) 3.91 - 3.97 (m, 2 H) 3.75 - 3.83 (m, 4 H) 3.59 - 3.68 (m, 8 H) 2.66 (t, J=6.50 Hz, 2 H).
실시예 13. 3-(2-(2-(2-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)에톡시)에톡시)에톡시) 프로판산
Figure pct00139
DCM (10 mL) 중 벤질 3-[2-[2-[2-(4,5-디클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)에톡시] 에톡시]에톡시]프로파노에이트 (820.00 mg, 1.65 mmol, 1 당량) 용액에 메탄설폰산 (1.59 g, 16.52 mmol, 1.18 mL, 10 당량)을 10℃에서 적가하였다. 다음으로 용액을 35℃로 가온하여 10시간 동안 교반하였다. 잔류물을 DCM (20 mL)에 의해 희석한 다음 용액을 물 (15 mL × 3)로 세척하고, 유기상을 무수 Na2SO4 위에서 건조시켰으며, 여과하여 진공에서 농축하였다. 잔류물을 제조용 TLC (에틸 아세테이트:아세트산 = 250:1, Rf = 0.55)에 의해 정제하여 3-[2-[2-[2-(4,5-디클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (249.4 mg, 602.76 umol, 36.49% 수율, 98.180% 순도)을 노란색 오일로서 제공하였다. LC-MS (ES, m/z): 406.0 [M+H]+; 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 12.16 (br s, 1H), 3.85 (t, J=5.5 Hz, 2H), 3.65 (br t, J=5.4 Hz, 2H), 3.61 - 3.45 (m, 10H), 2.43 (t, J=6.3 Hz, 2H).
I.36. 벤질 1-아미노-3,6,9,12,15,18-헥사옥사헤니코산-21-오에이트 4-메틸벤젠설포네이트
Figure pct00140
톨루엔 (30 mL) 중 페닐메탄올 (2.45 g, 22.64 mmol, 2.35 mL, 8 당량), 3-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (1 g, 2.83 mmol, 1 당량) 및 TsOH.H2O (565.16 mg, 2.97 mmol, 1.05 당량)의 혼합물을 딘-스타크 트랩으로 140℃에서 14시간 동안 교반하였다. 혼합물은 혼탁하다가 수시간 후에 맑게 변하였다. 잔류물을 진공에서 농축하여 톨루엔을 제거한 다음 TBME (50 mL)를 잔류물에 넣어 1분 동안 교반하였다. 다음으로 상청액을 제거하고, 건조시켜서 벤질 3-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트;4-메틸벤젠 설폰산 (1.45 g, 미정제)을 노란색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 7.80 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.67 - 7.46 (m, 2H), 7.39 - 7.31 (m, 5H), 7.15 (d, J=7.8 Hz, 2H), 5.13 (s, 2H), 3.96 - 3.83 (m, 2H), 3.75 - 3.50 (m, 22H), 3.24 - 3.14 (m, 2H), 2.63 (t, J=6.2 Hz, 2H), 2.34 (s, 3H).
I.37. 디벤질 23,30-디옥소-4,7,10,13,16,19,34,37,40,43,46,49-도데카옥사-26,27-디티아-22,31-디아자도펜타콘탄디오네이트
Figure pct00141
DCM (5 mL) 중 3-(2-카르복시에틸디설파닐)프로판산 (47.41 mg, 225.47 μmol, 1 당량), TEA (91.26 mg, 901.86 umol, 125.53 μL, 4 당량), HOBt (91.40 mg, 676.40 μmol, 3 당량) 및 EDCI (129.67 mg, 676.40 μmol, 3 당량)의 혼합물에 벤질 3-[2-[2-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트; 4-메틸 벤젠설폰산 (277.65 mg, 450.93 μmol, 2 당량)을 25℃에서 적가하였다. 첨가 이후, 혼합물을 25℃에서 8시간 동안 교반하였다. TLC (에틸 아세테이트:메탄올 = 3:1, Rf = 0.33)가 출발 물질이 소모되어 새로운 주요 스폿이 생성된 것을 보여주었다. 잔류물을 포화 NaCl (10 mL)에 넣어 2분 동안 교반하였다. 다음으로 수용성 상을 DCM (5 mL × 3)로 추출하였다. 조합된 유기상을 포화 NaCl (10 mL × 2)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과하여 진공에서 농축하였다. 잔류물을 제조용 HPLC (컬럼: 워터스 X브리지 150*25 5μ); 이동상: [물(10 mM NH4HCO3)-ACN]; B%: 32%-62%, 12분)에 의해 정제하여 벤질 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(3-벤질옥시-3-옥소-프로폭시)에톡시]에톡시] 에톡시]에톡시]에톡시]에틸아미노]-3-옥소-프로필]디설파닐]프로판오일아미노] 에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시] 프로파노에이트 (70 mg, 65.96 μmol, 29.25% 수율)를 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 7.41 - 7.29 (m, 10H), 6.50 (br s, 2H), 5.14 (s, 4H), 3.78 (t, J=6.5 Hz, 4H), 3.67 - 3.61 (m, 40H), 3.59 - 3.55 (m, 4H), 3.45 (q, J=5.1 Hz, 4H), 2.97 (t, J=7.2 Hz, 4H), 2.66 (t, J=6.5 Hz, 4H), 2.60 (t, J=7.1 Hz, 4H).
I.38. 벤질 1-(5-클로로-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)-3,6,9,12,15,18-헥사옥사헤니코산-21-오에이트
Figure pct00142
DCM (60 mL) 중 벤질 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(3-벤질옥시-3-옥소-프로폭시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에틸아미노]-3-옥소-프로필] 디설파닐]프로판오일아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]-프로파노에이트 (5.5 g, 5.18 mmol, 1 당량) 용액에 설퓨릴 염화물 (3.50 g, 25.91 mmol, 2.59 mL, 5 당량)을 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 0 내지 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. TLC (에틸 아세테이트:메탄올 = 10:1, Rf = 0.3, 0.5)가 반응이 완료된 것을 나타내었다. 혼합물을 얼음/물 (10 mL)에 넣고, DCM (20 mL × 2)로 추출하였다. 조합된 유기층을 H2O (20 mL × 2), 염수 (20 mL)로 세척하고, Na2SO4 위에서 건조시켰다. 여과물을 진공에서 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 (석유 에테르:에틸 아세테이트 = 1:1 내지 0:1) 상의 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하고, 갈색 오일로서 벤질 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(3-옥소이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트 (1.4 g, 2.29 mmol, 22.05% 수율, 86.148% 순도) 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 8.02 (d, J=6.17 Hz, 1 H) 7.22 - 7.32 (m, 5 H) 6.17 (br d, J=6.17 Hz, 1 H) 5.07 (s, 2 H) 3.92 (br t, J=4.30 Hz, 2 H) 3.51 - 3.73 (m, 24 H) 2.58 (t, J=6.39 Hz, 2 H); 및 무색 오일로서 벤질 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(5-클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시] 에톡시]에톡시]프로파노에이트 (3.1 g, 4.44 mmol, 42.85% 수율, 80.532% 순도) 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 7.30 - 7.40 (m, 5 H) 6.26 (s, 1 H) 5.15 (s, 2 H) 3.93 - 3.99 (m, 2 H) 3.78 (t, J=6.50 Hz, 2 H) 3.60 - 3.72 (m, 23 H) 2.66 (t, J=6.50 Hz, 2 H)를 제공하였다.
I.39 벤질 1-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)-3,6,9,12,15,18-헥사옥사헤니코산-21-오에이트
Figure pct00143
H2O (20 mL), DCM (10 mL) 및 ACN (10 mL) 중 벤질 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(5-클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트 (1 g, 1.78 mmol, 1 당량) 및 NaIO4 (1.52 g, 7.12 mmol, 394.34 μL, 4 당량)의 혼합물에 RuCl3.H2O (20.05 mg, 88.96 μmol, 0.05 당량)을 20℃에서 N2 하에 일정량 첨가하였다. 다음으로 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (20 mL × 2)로 추출하였다. 조합된 유기상을 무수 Na2SO4 위에서 건조시켰으며, 여과하여 진공에서 농축하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 석유 에테르:에틸 아세테이트 = 1:1 내지 에틸 아세테이트:메탄올 = 10:1)에 의해 정제하여 벤질 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(5-클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시] 에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트 (520 mg, 849.06 μmol, 47.72% 수율, 97% 순도)을 노란색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ = 7.44 - 7.29 (m, 5H), 6.72 (s, 1H), 5.14 (s, 2H), 3.92 - 3.86 (m, 2H), 3.80 - 3.73 (m, 4H), 3.69 - 3.59 (m, 20H), 2.66 (t, J=6.4 Hz, 2H).
실시예 14. 1-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)-3,6,9,12,15,18-헥사옥사헤니코산-21-산
Figure pct00144
DCM (30 mL) 중 벤질 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(5-클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트 (520 mg, 875.32 μmol, 1 당량) 용액에 메탄설폰산 (841.23 mg, 8.75 mmol, 623.13 μL, 10 당량)을 10℃에서 적가하였다. 용액을 35℃로 가온하여 10시간 동안 교반하였다. 잔류물을 물 (30 mL × 3)로 세척한 다음 유기상을 무수 Na2SO4 위에서 건조시켰으며, 여과하여 진공에서 농축하였다. 잔류물을 제조용 TLC (에틸 아세테이트:메탄올:아세트산 = 40:8:1, Rf = 0.58)에 의해 정제하였다. 잔류물을 다시 제조용 HPLC (컬럼: 나노-마이크로 크로마실 C18 100*30 mm 5 μm; 이동상: [물(0.05% HCl)-ACN]; B%: 1%-30%, 10분)에 의해 정제하여 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(5-클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (55.93 mg, 106.24 μmol, 12.14% 수율, 95.726% 순도)를 무색 오일로서 획득하였다. LC-MS (ES, m/z): 504.2 [M+H]+; 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 12.30 - 11.96 (m, 1H), 7.64 (s, 1H), 3.83 - 3.76 (m, 2H), 3.65 - 3.58 (m, 4H), 3.54 - 3.52 (m, 2H), 3.52 - 3.48 (m, 18H), 2.44 - 2.42 (m, 2H).
I.40 벤질 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4,5-디클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시] 에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트
Figure pct00145
DCM (30 mL) 중 벤질 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(5-클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트 (1.3 g, 2.31 mmol, 1 당량) 용액에 설퓨릴 염화물 (624.34 mg, 4.63 mmol, 462.47 μL, 2 당량)을 20℃에서 적가하였다. 용액을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 용액이 노란색으로 변하였다. 잔류물을 얼음물 (30 mL)에 넣고, 30분 동안 교반하였다. DCM 상을 물 (50 mL × 6)로 세척하고, 무수 Na2SO4 위에서 건조시켰으며, 여과하여 진공에서 농축하였다. 잔류물을 제조용 TLC (에틸 아세테이트:메탄올 = 10:1, Rf = 0.50)에 의해 정제하여 벤질 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4,5-디클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트 (800 mg, 1.21 mmol, 52.19% 수율, 90% 순도)을 노란색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ = 7.40 - 7.29 (m, 5H), 5.15 (s, 2H), 4.04 (t, J=4.7 Hz, 2H), 3.78 (t, J=6.4 Hz, 2H), 3.72 (t, J=4.7 Hz, 2H), 3.69 - 3.63 (m, 16H), 3.62 (s, 4H), 2.66 (t, J=6.5 Hz, 2H).
I.41 벤질 1-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)-3,6,9,12,15,18-헥사옥사헤니코산-21-오에이트
Figure pct00146
H2O (20 mL), DCM (10 mL), ACN (10 mL) 중 벤질 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4,5-디클로로-3-옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트 (600 mg, 1.01 mmol, 1 당량) 및 NaIO4 (860.56 mg, 4.02 mmol, 222.94 μL, 4 당량)의 혼합물에 RuCl3.H2O (11.34 mg, 50.29 μmol, 0.05 당량)을 0℃에서 N2 하에 일정량 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 2분 동안 교반한 다음, 25℃로 가온하여 1시간 동안 교반하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (30 mL)로 추출한 다음 여과하였다. 여과물을 에틸 아세테이트 (30 mL × 3)로 추출하였다. 조합된 유기상을 진공에서 농축하였다. 잔류물을 제조용 TLC (에틸 아세테이트, Rf = 0.50)에 의해 정제하여 벤질 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4,5-디클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트 (220 mg, 350.03 μmol, 34.80% 수율, 100% 순도)을 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ = 7.40 - 7.27 (m, 4H), 5.15 (s, 2H), 3.99 - 3.90 (m, 2H), 3.78 (t, J=6.2 Hz, 4H), 3.70 - 3.58 (m, 20H), 2.66 (t, J=6.4 Hz, 2H).
실시예 15. 1-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)-3,6,9,12,15,18-헥사옥사헤니코산-21-산
Figure pct00147
DCM (5 mL) 중 벤질 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4,5-디클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로파노에이트 (220 mg, 350.03 μmol, 1 당량) 용액에 메탄설폰산 (504.60 mg, 5.25 mmol, 373.78 μL, 15 당량)을 10℃에서 적가하였다. 다음으로 용액을 40℃로 가온하여 20시간 동안 교반하였다. 잔류물을 DCM (20 mL)로 희석한 다음 용액을 물 (15 mL × 3)로 세척하고, 유기상을 무수 Na2SO4 위에서 건조시켰으며, 여과하여 진공에서 농축하였다. 잔류물을 제조용 HPLC (컬럼: 나노-마이크로 크로마실 C18 100*30 mm 5 μm; 이동상: [물(0.05% HCl)-ACN]; B%: 25%-55%, 10분)에 의해 정제하여 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(4,5-디클로로-1,1,3-트리옥소-이소티아졸-2-일)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (53.79 mg, 98.63 μmol, 28.18% 수율, 98.724% 순도)을 노란색 오일로서 제공하였다. LC-MS (ES, m/z): 538.2 [M+H]+ ; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 12.13 (br s, 1H), 3.89 - 3.81 (m, 2H), 3.65 (t, J=5.5 Hz, 2H), 3.59 (t, J=6.4 Hz, 2H), 3.56 - 3.48 (m, 20H), 2.43 (t, J=6.4 Hz, 2H).
실시예 16.
Figure pct00148
아르곤 하에 플라스크에 산물 6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일) 헥산산 (12.58 mg, 0.045 mmol), DCM (2 mL) 및 DMF (10 μL)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시킨 다음 옥살릴 이염화물 (11.65 μL, 0.136 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고, 완벽한 전환이 LCMS에 의해 관찰될 때까지 (분취량의 건조 MeOH을 첨가하여 메틸 에스테르를 형성함으로써 LCMS에 의한 추적) 교반하였다. 조 산물을 진공 하에 증발시켰다. 잔류물을 DCM에 수집하고, 진공 하에 다시 건조시켜서 노란색 고체를 제공하였다. 미정제 물질을 후속 단계를 위해 추가 정제 없이 사용하였다.
2. 약물-링커 컨쥬게이트의 합성
실시예 A. ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)-N-메틸헥산아미도)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판오일)-L-페닐알라닌
Figure pct00149
약물 링커의 합성을 위한 표준 절차:
질소 하에 플라스크에 실온에서 6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산산 (205 mg, 0,73 mmol) (실시예 1), 디클로로메탄 (10 mL) 및 DMF (100 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 얼음 수조를 이용하여 0℃로 냉각시킨 다음 옥살릴 염화물을 첨가하였다 (190,4 μL, 2,18 mmol). 혼합물을 실온으로 가온하여 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 CH2Cl2에 수집하고, 다시 진공 하에 건조시켜서 6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산오일 염화물을 노란색 고체로서 제공하였다. 바이알에 질소 하에 실온에서 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸(4-(메틸아미노)펜에틸)아미노)부탄아미도)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산, (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸(4-(메틸아미노)펜에틸)아미노)부탄아미도)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산 화합물을 2,2,2-트리플루오로아세트산 (1:1) (111 mg, 0,102 mmol) 및 디클로로메탄 (3,7 mL)과 함께 도입하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, DIPEA (70,9 μL, 0,406 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반한 다음 6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산오일 염화물 (36,6 mg, 0,122 mmol)을 DCM 중 용액으로서 적가하였다 (2 mL DCM 중 248 mg 산 염화물). 혼합물을 0℃에서 1시간 15분 동안 교반하였다. 반응을 0℃에서 트리플루오로아세트산 (32,9 μL, 0,426 mmol), 아세토니트릴 (2,1 mL) 및 물 (0,3 mL)을 혼합물에 첨가함으로써 정지시켰다. 미정제 물질을 진공에서 농축하고, 잔류물을 제조용 HPLC (컬럼 X-브리지 C18 (100*30) 0.1% TFA와 함께 ACN 및 물의 구배를 이동상으로서 사용함)에 의해 정제하여 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)-N-메틸헥산아미도)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판오일)-L-페닐알라닌를 제공하였다. 이러한 약물-링커 컨쥬게이트의 질량 스펙트럼 및 1H-NMR 스펙트럼을 도 1a 및 도 1b에 각각 나타낸다.
실시예 B. ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)-N-메틸헥산아미도)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판오일)-L-페닐알라닌.
Figure pct00150
이것을 약물 링커의 합성을 위한 표준 절차 이후에 6-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산산 (실시예 2) 및 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸(4-(메틸아미노)펜에틸)아미노)부탄아미도)부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판오일)-L-페닐알라닌 화합물을 2,2,2-트리플루오로아세트산 (1:1)과 함께 출발 물질로 사용하여 합성하였다. 이러한 약물-링커 컨쥬게이트의 질량 스펙트럼을 도 2에 나타낸다.
실시예 C. ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질)옥시)카보닐)(메틸)아미노)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판오일)-L-페닐알라닌
Figure pct00151
이것을 약물-링커의 합성을 위한 표준 절차 이후에 6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산산 (실시예 1) 및 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질)옥시)카보닐) (메틸)아미노)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판오일)-L-페닐알라닌을 출발 물질로서 사용하여 합성하였다. 이러한 약물-링커 컨쥬게이트의 질량 스펙트럼 및 1H-NMR 스펙트럼을 도 3a 및 도 3b에 각각 나타낸다.
실시예 D. ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질)옥시)카보닐)(메틸)아미노)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판오일)-L-페닐알라닌
Figure pct00152
이것을 약물 링커의 합성을 위한 표준 절차 이후에 6-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산산 (실시예 2) 및 ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질)옥시)카보닐)(메틸)아미노)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판오일)-L-페닐알라닌을 출발 물질로서 사용하여 획득하였다.
약물-링커 컨쥬게이트의 질량 스펙트럼 및 1H-NMR 스펙트럼을 도 4a 및 도 4b에 각각 나타낸다.
실시예 E. ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2-(2-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)에톡시)에톡시)에톡시)프로판아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질)옥시)카보닐)(메틸)아미노)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판오일)-L-페닐알라닌 2,2,2-트리플루오로아세트산 염
Figure pct00153
약물 링커의 합성을 위한 표준 절차 이후에 3-(2-(2-(2-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)에톡시)에톡시)에톡시) 프로판산 (실시예 12) 및 (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-5 우레이도펜탄아미도)벤질)옥시)카보닐)(메틸)아미노)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판아미도)-3-페닐프로판산을 출발 물질로서 사용하여 합성하였다.
이러한 약물-링커 컨쥬게이트의 질량 스펙트럼 및 1H-NMR 스펙트럼을 도 5a 및 도 5b에 각각 나타낸다.
실시예 F. ((2R,3R)-3-(1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2-(2-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)에톡시)에톡시)에톡시)프로판아미도)-3-메틸부탄아미도)-N-메틸프로판아미도)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판오일)-D-페닐알라닌
Figure pct00154
약물 링커의 합성을 위한 표준 절차 이후에 3-(2-(2-(2-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)에톡시)에톡시)에톡시) 프로판산 (실시예 12) 및 ((2R,3R)-3-(1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-N-메틸프로판아미도)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판오일)-D-페닐알라닌을 출발 물질로서 사용하여 합성하였다.
약물-링커 컨쥬게이트의 질량 스펙트럼 및 1H-NMR 스펙트럼을 도 6a 및 도 6b에 각각 나타낸다.
실시예 G. ((2R,3R)-3-(1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-N-메틸프로판아미도)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판오일)-D-페닐알라닌
Figure pct00155
약물 링커의 합성을 위한 표준 절차 이후에 6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산산 (실시예 1) 및 ((2R,3R)-3-(1-((3R,4R,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-N-메틸프로판아미도)펜에틸)(메틸)아미노)-3-메틸부탄아미도)-N,3-디메틸부탄아미도)-3-메톡시-5-메틸헵탄오일)피롤리딘-2-일)-3-메톡시-2-메틸프로판오일)-D-페닐알라닌을 출발 물질로서 사용하여 합성하였다.
약물-링커 컨쥬게이트의 질량 스펙트럼 및 1H-NMR 스펙트럼을 도 7a 및 도 7b에 각각 나타낸다.
실시예 H. 4-((S)-2-((S)-2-(6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 (2-((2S,4S)-2,5,12-트리히드록시-7-메톡시-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-메톡시-1-메틸옥타히드로-1H-피라노[4',3':4,5]옥사졸로[2,3-c][1,4]옥사진-3-일)옥시)-6,11-디옥소-1,2,3,4,6,11-헥사히드로테트라센-2-카르복사미도)에틸)카바메이트
Figure pct00156
실시예 H를 하기 합성 경로에 따라 합성하였다.
Figure pct00157
I.42. (2S,4S)-2,5,12-트리히드록시-7-메톡시-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-메톡시-1-메틸옥타히드로-1H-피라노[4',3':4,5]옥사졸로[2,3-c][1,4]옥사진-3-일)옥시)-6,11-디옥소-1,2,3,4,6, 11-헥사히드로테트라센-2-카르복실산
플라스크에 메탄올 (15 mL) 및 물 (10 mL)의 혼합물 중 PNU-159682 (52 mg, 0.081 mmol)를 첨가하였다. 물 (5 mL) 중 NaI04 (34.7 mg, 0.162 mmol) 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 완벽한 전환이 LCMS에 의해 관찰될 때까지 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하여 I.42를 적색 고체로서 제공하였고, 이는 후속 단계에 직접 사용되었다.
I.43 (9H-플루오렌-9-일)메틸 ((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-아미노에틸)카바모일)옥시) 메틸)페닐) 아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트
하르곤 하에 플라스크에 DMF (0.443 mol/L) 중 (9H-플루오렌-9-일)메틸 ((S)-1-(((S)-1-((4-(히드록시메틸)페닐)아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트 (1 g, 1.662 mmol) 및 비스(4-니트로페닐) 카보네이트 (1.011 g, 3.32 mmol)를 첨가하였다. 다음으로, 혼합물을 0℃로 냉각시키고, DIPEA (639 μL, 3.66 mmol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하여 18시간 동안 교반하였다. 미정제 혼합물을 진공 하에 농축하였다. 조 산물을 Et2O/EtOAc의 1:1 혼합물에 수집하여 여과하였다. 침전물을 Et2O, 시트르산 5%, H2O, 다음으로 Et2O에 다시 세척하여 노란색 고체를 획득하였다. 이 고체를 자동 컬럼 크로마토그래피 실리카겔 (100 DCM:0 MeOH 내지 80 DCM:20 MeOH)에 의해 정제하여 345 mg (9H-플루오렌-9-일)메틸 ((S)-3-메틸-1-(((S)-1-((4-((((4-니트로펜옥시)카보닐)옥시)메틸)페닐)아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일)아미노)-1-옥소부탄-2-일)카바메이트 (흰색 고체, 27.1% 수율)을 제공하였다.
DMF (6 mL) 중 이전 산물 (150 mg, 0.196 mmol) 용액에 HOBt (34.4 mg, 0.254 mmol) 및 피리딘 (63.3 μL, 0.782 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 5분 후에, 혼합물에 DMF (1.5 mL) 중 터르-부틸 (2-아미노에틸)카바메이트 1-2 (40.7 mg, 0.254 mmol), 이어서 DIPEA (102 μL, 0.587 mmol)를 첨가하였다. 혼합물 실온으로 가온하여 2시간 동안 교반하였다. 조 산물을 진공 하에 농축하여 흰색 고체를 획득하고, 이는 자동 컬럼 크로마토그래피 실리카겔 (100 DCM:0 MeOH 내지 80 DCM:20 MeOH)에 의해 정제되어 129 mg 4-((S)-2-((S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 터르-부틸 에탄-1,2-디일디카바메이트 (흰색 고체, 84% 수율)를 제공하였다.
플라스크에 DCM (6 mL) 중 이전 산물 (154 mg, 0.195 mmol)을 넣어 혼합물을 0℃로 냉각시키고, TFA (753 μL, 9.77 mmol)을 첨가하여 혼합물을 완벽한 전환이 LCMS에 의해 관찰될 때까지 0℃에서 교반하였다. 미정제 혼합물을 진공에서 농축하여 I.43을 흰색 고체 (정량적 수율)로서 제공하였다.
I.44 4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 (2-((2S,4S)-2,5,12-트리히드록시-7-메톡시-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-메톡시-1-메틸옥타히드로-1H-피라노[4',3':4,5]옥사졸로[2,3-c][1,4]옥사진-3-일)옥시)-6,11-디옥소-1,2,3,4,6,11-헥사히드로테트라센-2-카르복사미도)에틸)카바메이트
플라스크에 I.42 (50.9 mg, 0.081 mmol), I.43 (78.0 mg, 0.097 mmol) 및 DMF (8 mL), 이어서 HATU (30.8 mg, 0.081 mmol) 및 DIPEA (56.7 μL, 0.324 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 다음으로 이 혼합물에 피페리딘 (80 μL, 0.811 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 (완벽한 전환이 LCMS에 의해 관찰될 때까지) 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 하에 농축하였다. 획득된 조 산물을 바로 자동 컬럼 크로마토그래피 실리카겔 (100 DCM:0 수용성 MeOH/NH3 내지 85 DCM:25 수용성 MeOH/NH3)에 의해 정제하여 20 mg I.44 (적색 오일, 23% 수율)을 제공하였다.
실시예 H.
질소 하에 플라스크에 DCM (1 mL) 및 DMF (10 μL) 중 6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산산 (실시예 1) (7.86 mg, 0.028 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시킨 다음 옥살릴 염화물 (7.28 μL, 0.085 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고, 완벽한 전환이 LCMS에 의해 관찰될 때까지 (분취량의 건조 MeOH을 첨가하여 메틸 에스테르를 형성함으로써 LCMS에 의한 추적) 교반하였다. 미정제 혼합물을 진공 하에 증발시켰다. 잔류물을 DCM에 수집하고, 다시 진공 하에 건조시켜서 6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산오일 염화물를 노란색 고체 (수율 정량적)로서 제공하였다. 미정제 물질을 후속 단계를 위한 추가 정제 없이 사용하였다.
질소 하에 플라스크에 실온에서 DCM (2 mL) 중 I.44 (20 mg, 0.019 mmol)를 도입하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, DIPEA (12.96 μL, 0.074 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반한 다음 DCM (1 mL)에 희석된 이전 단계의 산물 (8.40 mg, 0.028 mmol)을 첨가하였다. 다음으로 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 (완벽한 전환이 LCMS에 의해 관찰될 때까지) 교반하였다. 미정제 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 자동 컬럼 크로마토그래피, 실리카겔 (100 DCM:0 MeOH 내지 85 DCM:15 MeOH)에 의해 정제하여 6.85 mg의 실시예 H (화합물 F562524으로도 명명됨)(고체, 27% 수율)를 제공하였다.
이러한 약물-링커 컨쥬게이트의 1H-NMR 스펙트럼은 도 8에 나타낸다.
실시예 I. 4-((S)-2-((S)-2-(6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 (2-옥소-2-((2S,4S)-2,5,12-트리히드록시-7-메톡시-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-메톡시-1-메틸옥타히드로-1H-피라노[4',3':4,5]옥사졸로[2,3-c][1,4]옥사진-3-일)옥시)-6,11-디옥소-1,2,3,4,6,11-헥사히드로테트라센-2-일)에틸) 에탄-1,2-디일비스(메틸카바메이트)
Figure pct00158
실시예 I를 하기 합성 경로에 따라 합성하였다.
Figure pct00159
I.45 2-옥소-2-((2S,4S)-2,5,12-트리히드록시-7-메톡시-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-메톡시-1-메틸옥타히드로-1H-피라노[4',3':4,5]옥사졸로[2,3-c][1,4]옥사진-3-일)옥시)-6,11-디옥소-1,2,3,4,6,11-헥사히드로테트라센-2-일)에틸 (퍼플루오로페닐) 카보네이트
아르곤 하에 플라스크에 PNU-159682 (12 mg, 0.0180 mmol) 및 DMF (1.5 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 비스(퍼플루오로페닐) 카보네이트 (36.9 mg, 0.094 mmol)를 첨가하였다. 다음으로 DMF (0.5 mL) 중 DIPEA (9.80 μL, 0.056 mmol)을 용액을 5분의 기간 동안 천천히 첨가하였다. 마지막으로 혼합물을 0℃에서 3시간 동안 교반하였다 (LCMS에 의해 전환이 전찰됨). 미정제 혼합물을 진공에서 농축하여 자동 컬럼 크로마토그래피, 실리카겔 (100 DCM:0 [80 DCM:20 MeOH] 내지 50 DCM:50 [80 DCM:20 MeOH])에 의해 정제하여 5.52 mg I.45을 적색 오일로서 (36% 수율) 제공하였다.
I.46 (9H-플루오렌-9-일)메틸 ((S)-3-메틸-1-(((S)-1-((4-((((4-니트로펜옥시)카보닐) 옥시)메틸)페닐)아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일)아미노)-1-옥소부탄-2-일)카바메이트 2,2,2-트리플루오로아세테이트
아르곤 하에 플라스크에 DMF (0.443 mol/L) 중 (9H-플루오렌-9-일)메틸 ((S)-1-(((S)-1-((4-(히드록시메틸)페닐)아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트 (1 g, 1.662 mmol) 및 비스(4-니트로페닐) 카보네이트 (1.011 g, 3.32 mmol)을 첨가하였다. 다음으로 혼합물을 0℃로 냉각시키고, DIPEA (639 μL, 3.66 mmol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하여 18시간 동안 교반하였다. 미정제 혼합물을 진공 하에 농축시키고, Et2O/EtOAc (1/1)에 수집하여 여과하였다. 침전물을 Et2O, 시트르산, 5%, H2O, 다음으로 Et2O로 다시 세척하여 노란색 고체를 획득하였다. 이 고체를 자동 컬럼 크로마토그래피, 실리카겔 (100 DCM:0 MeOH 내지 80 DCM:20 MeOH)에 의해 정제하여 345 mg 흰색 고체 (27.1% 수율)을 제공하였다. DMF (6 mL) 중 이 화합물 (118 mg, 0,154 mmol) 용액에 HOBt (27.0 mg, 0.200 mmol) 및 피리딘 (49.8 μL, 0.616 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 5분 후에, DMF (1.5mL) 중 터르-부틸 메틸(2-(메틸아미노)에틸)카바메이트 (37.7 mg, 0.200 mmol), 이어서 DIPEA (81.0 μL, 0.462 mmol)를 혼합물에 첨가하였다. 다음으로 혼합물을 실온으로 가온하여 2시간 동안 (완벽한 전환이 LCMS에 의해 관찰될 때까지) 교반하였다. 미정제 혼합물을 진공 하에 농축하여 노란색 오일을 수득하였고, 이는 자동 컬럼 크로마토그래피, 실리카겔 (100 DCM:0 MeOH 내지 80 DCM:20 MeOH)에 의해 정제되어 103 mg 흰색 고체 (82% 수율)를 제공하였다. 플라스크에 DCM (12 mL) 중 이 산물 (198 mg, 0.243mmol)을 배치하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, TFA (935 μL, 12.13 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 4시간 동안 (완벽한 전환이 LCMS에 의해 관찰될 때까지) 교반하였다. 미정제 혼합물을 진공 하에 농축하여 220 mg I.46을 맑은 노란색 고체 (정량적 수율)로서 제공하였다.
I.47 4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-5-우레이도펜탄아미도)벤질 (2-옥소-2-((2S,4S)-2,5,12-트리히드록시-7-메톡시-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-메톡시-1-메틸옥타히드로-1H-피라노[4',3':4,5]옥사졸로[2,3-c][1,4]옥사진-3-일)옥시)-6,11-디옥소-1,2,3,4,6,11-헥사히드로테트라센-2-일)에틸) 에탄-1,2-디일비스(메틸카바메이트)
DMF (1 mL) 중 I.45 (19 mg, 0.022 mmol) 용액에 DMF (1 mL) 중 산물 I.46 (22.2 mg, 0.027 mmol) 및 DIPEA (15.59 μL, 0.089 mmol)의 용액을 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 (완벽한 전환이 LCMS에 의해 관찰될 때까지) 교반하였다. 다음으로 혼합물에 피페리딘 (22.09 μL, 0.223 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 (완벽한 전환이 LCMS에 의해 관찰됨) 교반하였다. 미정제 혼합물을 진공 하에 농축하고, 자동 컬럼 크로마토그래피, 실리카겔 (100 DCM:0 MeOH/NH3 (9/1) 내지 75 DCM:25 MeOH/NH3 (9/1))에 의해 정제하여 10 mg I.47을 적색 오일 (39% 수율)로서 제공하였다.
실시예 I.
질소 하에 플라스크에 DCM (1 mL) 및 DMF (10 μL) 중 6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산산 (실시예 1) (7.86 mg, 0.028 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시킨 다음 옥살릴 염화물 (7.28 μL, 0.085 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고, 완벽한 전환이 LCMS에 의해 관찰될 때까지 (분취량의 건조 MeOH을 첨가하여 메틸 에스테르를 형성함으로써 LCMS에 의한 추적) 교반하였다. 미정제 혼합물을 진공 하에 증발시켰다. 잔류물을 DCM에 수집하고, 다시 진공 하에 건조시켜서 6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥산오일 염화물을 노란색 고체 (수율 정량적)로서 제공하였다. 미정제 물질은 후속 단계를 위한 추가 정제 없이 사용되었다.
질소 하에 실온에서 플라스크에 DCM (2 mL) 중 산물 I.47 (10 mg, 0.0086 mmol)을 도입하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, DIPEA (6.0 μL, 0.034 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반한 다음, DCM (1 mL)에 희석된 이전 산물 (3.90 mg, 0.013 mmol)을 첨가하였다. 다음으로 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 (완벽한 전환이 LCMS에 의해 관찰될 때까지) 교반하였다. 조 산물을 진공에서 농축하고, 자동 컬럼 크로마토그래피, 실리카겔 (100 DCM:0 MeOH 내지 85 DCM:15 MeOH)에 의해 정제하여 2.45 mg 실시예 I을 적색 고체 (19% 수율0로서 제공하였다.
이러한 약물-링커 컨쥬게이트의 1H-NMR 스펙트럼은 도 9에 나타낸다.
실시예 J.
Figure pct00160
실시예 J를 하기 합성 경로에 따라 합성하였다.
Figure pct00161
화합물 I.50을 하기 합성 경로에 따라 제조하였다.
Figure pct00162
화합물 I.48:
아르곤 하에 플라스크에 DCM (5 mL) 중 2-([1,1'-바이페닐]-4-일) 프로판-2-올 (1 g, 4.71 mmol) 및 피리딘 (0.465 mL, 5.75 mmol)을 첨가하였다. 다음으로 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 건조 DCM (2.4 mL) 중 페닐 클로로포르메이트 (0.662 mL, 5.28 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하여 18시간 동안 (LCMS로 중간 확인함) 교반하였다. 조 산물을 진공에서 농축하였다. 고체 혼합물을 DCM에 용해시키고, 염수로 3회 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과하였으며, 진공에서 농축하여 원하는 화합물 I.48 (수율 880 mg, 56%)을 흰색 고체로서 제공하였다. LCMS (ESI): 333.40 (MH+).
화합물 I.49:
N,N'-디메틸-1,2-에탄디아민 (2791 μL, 26.2 mmol), N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민 (305 μL, 1.748 mmol) 및 DMF (4 mL)을 포함하는 아르곤 하에 플라스크에 DMF (1.5mL) 중 2-([1,1'-바이페닐]-4-일)프로판-2-일 페닐 카보네이트 (581 mg, 1.748 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하여 24시간 동안 (LCMS로 중간 확인함) 교반하였다. 조 산물을 진공에서 농축하고, 잔류물을 자동 컬럼 크로마토그래피 (Interchim, 고체 침전물): DCM/MeOH: 9/1에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 진공에서 농축하여 원하는 화합물 I.49 (수율 433 mg, 76%)을 노란색 오일로서 제공하였다. LCMS (ESI): 327.43 (MH+).
화합물 I.50:
비스(트리클로로메틸)카보네이트 (157 mg, 0.531 mmol) 및 톨루엔 (4.3 mL)을 포함하는 아르곤 하에 플라스크에, 톨루엔 (2.9 mL) 중 2-([1,1'-바이페닐]-4-일)프로판-2-일 메틸(2-(메틸아미노)에틸)카바메이트 (433 mg, 1,326 mmol) 및 트리에틸아민 (368 μL, 2.65 mmol)의 용액을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하여 1시간 동안 (LCMS로 중간 확인함) 교반하였다. 용액을 여과하고, 용매를 진공에서 농축하였으며, 잔류물을 자동 컬럼 크로마토그래피 (Interchim, 고체 침전물): 시클로헥산/에틸 아세테이트: 7/3에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 진공에서 농축하여 원하는 화합물 I.50 (수율 166 mg, 33%)을 흰색 고체로서 제공하였다. LCMS (ESI): 405.60 (MH+).
화합물 I.52를 하기 합성 경로에 따라 제조하였다.
Figure pct00163
화합물 I.51:
(8S,10S)-6,8,11-트리히드록시-8-(2-히드록시아세틸)-1-메톡시-10-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-메톡시-1-메틸옥타히드로-1H-피라노[4',3':4,5]옥사졸로[2,3-c][1,4]옥사진-3-일)옥시)-7,8,9,10-테트라히드로테트라센-5,12-디온 (50 mg, 0.078 mmol), 4-디메틸아미노피리딘 (47,6 mg, 0,390 mmol), 분자체 0.4 nm (33 mg) 및 DCM (1 mL)을 포함하는 아르곤 하에 플라스크에 DCM (0.5 mL) 중 2-([1,1'-바이페닐]-4-일)프로판-2-일 (2-((클로로카보닐)(메틸)아미노)에틸)(메틸)카바메이트 (91 mg, 0.234 mmol) 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 암소에 25℃로 5일 동안 교반하였다. 용액을 여과하고, 용매를 진공에서 농축하였으며, 잔류물을 후속 단계에서 추가 정제 없이 사용하였다.
화합물 I.52:
얼음 수조에서 DCM (1 mL) 중 화합물 I.51 용액에 0.5 mL DCM 중 디클로로아세트산 (96 μL, 1.169 mmol) 용액을 첨가하였다. 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 진공에서 농축하고, 잔류물을 자동 컬럼 크로마토그래피 (Interchim, 고체 침전물): DCM/MeOH: 9/1에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 진공에서 농축하여 원하는 화합물 I.52 (수율 13 mg, 22%)을 적색 고체로서 제공하였다. LCMS (ESI): 756.76 (MH+).
화합물 I.53:
아르곤 하에 플라스크에 (9H-플루오렌-9-일)메틸 ((S)-1-(((S)-1-((4-(히드록시메틸)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트 (250 mg, 0.485 mmol), 비스(퍼플루오로페닐) 카보네이트 (382 mg, 0.970 mmol) 및 DMF (4 mL)을 첨가하였다. 다음으로 혼합물을 0℃로 냉각시키고, N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민 (127 μL, 0.727 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하여 2시간 동안 (LCMS로 중간 확인함) 교반하였다. 조 산물을 진공에서 농축하였다. 조 산물을 자동 컬럼 크로마토그래피 (Interchim, 고체 침전물): DCM/MeOH: 9/1에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 진공에서 농축하여 원하는 화합물 I.53 (수율 281 mg, 80%)을 노란색 오일로서 제공하였다. LCMS (ESI): 726.65 (MH+).
화합물 I.54:
아르곤 하에 플라스크에 2-옥소-2-((2S,4S)-2,5,12-트리히드록시-7-메톡시-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-메톡시-1-메틸옥타히드로-1H-피라노[4',3':4,5]옥사졸로[2,3-c][1,4]옥사진-3-일)옥시)-6,11-디옥소-1,2,3,4,6,11-헥사히드로테트라센-2-일)에틸 메틸(2-(메틸아미노)에틸)카바메이트 (78 mg, 0.103 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 (27.9 mg, 0.206 mmol), N,N'-디이소프로필에틸아민 (35.1 μL, 0.206 mmol) 및 DMF (2 mL)을 첨가하였다. 다음으로 혼합물을 0℃로 냉각시키고, (9H-플루오렌-9-일)메틸 ((S)-3-메틸-1-옥소-1-(((S)-1-옥소-1-((4-((((퍼플루오로펜옥시)카보닐)옥시)메틸)페닐)아미노)프로판-2-일)아미노)부탄-2-일)카바메이트 (112 mg, 0.155 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하여 2시간 동안 (LCMS로 중간 확인함) 교반하였다. 조 산물을 진공에서 농축하였다. 조 산물을 자동 컬럼 크로마토그래피 (Interchim, 고체 침전): DCM/MeOH: 9/1에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 진공에서 농축하여 원하는 화합물 I.54 (수율 77 mg, 58%)을 적색 오일로서 제공하였다. LCMS (ESI): 1298.0 (MH+).
화합물 I.55:
아르곤 하에 플라스크에 4-((S)-2-((S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카보닐)아미노)-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)벤질 (2-옥소-2-((2S,4S)-2,5,12-트리히드록시-7-메톡시-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-메톡시-1-메틸옥타히드로-1H-피라노[4',3':4,5]옥사졸로[2,3-c][1,4]옥사진-3-일)옥시)-6,11-디옥소-1,2,3,4,6,11-헥사히드로테트라센-2-일)에틸) 에탄-1,2-디일비스(메틸카바메이트) (77.7 mg, 0.060 mmol) 및 DMF (2 mL)를 첨가하였다. 다음으로 혼합물을 0℃로 냉각하고, 몰포린 (259 μL, 2.99 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하여 2시간 동안 (LCMS로 중간 확인함) 교반하였다. 조 산물을 진공에서 농축하였다. 조 산물을 자동 컬럼 크로마토그래피 (Interchim, 고체 침전): DCM/MeOH: 9/1에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 진공에서 농축하여 원하는 화합물 I.55 (수율 32 mg, 50%)을 적색 오일로서 제공하였다. LCMS (ESI): 1075.80 (MH+).
실시예 J:
아르곤 하에 플라스크에 25℃에서 디클로로메탄 (2 mL) 중 4-((S)-2-((S)-2-아미노-3-메틸부탄아미도)프로판아미도) 벤질(2-옥소-2-((2S,4S)-2,5,12-트리히드록시-7-메톡시-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-메톡시-1-메틸옥타히드로-1H-피라노[4',3':4,5]옥사졸로[2,3-c][1,4]옥사진-3-일)옥시)-6,11-디옥소-1,2,3,4,6,11-헥사히드로테트라센-2-일)에틸) 에탄-1,2-디일비스(메틸카바메이트) (32 mg, 0.030 mmol, 1 당량)을 도입하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민 (20.74 μL, 0.119 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반한 다음 디클로로메탄 (2 mL)에 희석된 실시예 16을 첨가하였다. 다음으로 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 (완벽한 전환이 LCMS에 의해 관찰될 때까지) 교반하였다. 조 산물을 진공에서 농축하고, 자동 컬럼 크로마토그래피 (Interchim, 12g, 고체 침전물): DCM/MeOH: 9/1에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 진공에서 농축하여 원하는 실시예 J (화합물 F562646로도 명명됨) (수율 17.4 mg, 40%)을 적색 오일로서 제공하였다. LCMS (ESI): 1338.41 (MH+).
이러한 약물-링커 컨쥬게이트의 질량 스펙트럼은 도 21에 나타낸다.
실시예 K.
Figure pct00164
실시예 K를 하기 합성 경로에 따라 합성하였다.
Figure pct00165
화합물 I.56:
아르곤 하에 플라스크에 출발 물질 SM1 (100 mg, 0.135 mmol) 및 DMF (1 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시킨 다음 DMF (0.5 mL) 중 3-브로모프로판산 (22.79 mg, 0.149 mmol) 및 2,3,4,6,7,8,9,10-옥타히드로피리미도[1,2-a]아제핀 (40.5 μL, 0.271 mmol)을 적가하였다. 다음으로 혼합물을 실온으로 가온하고, 완벽한 전환이 LCMS에 의해 관찰될 때까지 교반하였다. 조 산물을 진공에서 농축하고, 자동 컬럼 크로마토그래피 (Interchim, 12g, 고체 침전물): DCM/MeOH: 80/20에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 진공에서 농축하여 원하는 화합물 I.56 (수율 108 mg, 98%)을 흰색 고체로서 제공하였다. LCMS (ESI): 811.35 (MH+).
화합물 I.57:
아르곤 하에 플라스크에 화합물 I.56 (87.0 mg, 0.107 mmol) 및 DCM (2 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, N-히드록시숙신이미드 (13.59 mg, 0.118 mmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 염산화물 (30.9 mg, 0.161 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하여 2시간 동안 (LCMS로 중간 확인함) 교반하였다. 조 산물을 진공에서 농축하였다. 미정제 물질을 후속 단계를 위한 추가 정제 없이 사용하였다.
화합물 I.58:
아르곤 하에 플라스크에 화합물 I.57 (97 mg, 0.107 mmol) 및 DCM (1 mL)을 첨가한 다음 1 mL of DCM 중 화합물 I.49 및 N, N'-디이소프로필에틸아민 (37.3 μL, 0.214 mmol)의 용액을 적가하였다. 혼합물을 완벽한 전환이 LCMS에 의해 관찰될 때까지 교반하였다. 조 산물을 진공에서 농축하고, 후속 단계를 위한 추가 정제 없이 사용하였다.
화합물 I.59:
아르곤 하에 플라스크에 화합물 I.58 (58 mg, 0.052 mmol) 및 DCM (1 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시킨 다음 디클로로아세트산 (86 μL, 1.037 mmol)을 적가하였다. 다음으로 혼합물을 실온으로 가온하고, 완벽한 전환이 LCMS에 의해 관찰될 때까지 교반하였다. 조 산물을 진공에서 농축하고, 자동 컬럼 크로마토그래피 (Interchim, 12g, 고체 침전물): DCM/MeOH: 80/20에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 진공에서 농축하여 원하는 화합물 I.59 (수율 39 mg, 86%)을 흰색 고체로서 제공하였다. LCMS (ESI): 882.6 (MH+).
실시예 K:
아르곤 하에 플라스크에 25℃에서 디클로로메탄 (1 mL) 중 화합물 I.59를 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민 (15.83 μL, 0.091 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반한 다음 디클로로메탄 (2 mL)에 희석된 실시예 16을 첨가하였다. 다음으로 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 (완벽한 전환이 LCMS에 의해 관찰될 때까지) 교반하였다. 조 산물을 진공에서 농축하고, 제조용 HPLC (HCOOH 조건)에 의해 정제하여 원하는 실시예 K (수율 6 mg, 22%)를 흰색 고체로서 제공하였다. LCMS (ESI): 1165.37 (M+Na)+.
이러한 약물-링커 컨쥬게이트의 질량 스펙트럼 및 TOF-MS 스펙트럼을 도 22a 및 도 22b에 각각 나타낸다.
3. 소마토스타틴과의 컨쥬게이션
Ⅵ1. 벤질 6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트와 소마토스타틴의 반응
Figure pct00166
1 mg의 동결건조된 소마토스타틴 (mexact = 1636,72)을 4 mL 완충액 (57.5% NaH2PO4 20 mM, pH 6.5, 40% ACN, 2.5% DMF)에 가용화하여 153　μM (0.25 mg/mL)의 농도를 수득하였다. 33.5 mg TCEP을 4 mL 완충액 (57.5% NaH2PO4 20 mM, pH 6.5, 40% ACN, 2.5% DMF)에 용해시켰다. 300 μL 소마토스타틴 용액 (1 당량)에 3 μL TCEP 용액 (1.1 당량)을 첨가하였다. 용액을 37℃에서 1시간 동안 교반하였다. 시판 소마토스타틴: Rt,1 (ACN 중): 1.57; MS ES+: M+3/3=546.4, M+2/2=819.2. 환원된 디설파이드 결합 소마토스타틴: Rt,1 (ACN 중): 1.50; MS ES+ : M+3/3=547.2, M+2/2=820.3. 5 mg 벤질 6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트 (I.6)을 800 μL ACN에 가용화하였다. 용액 중 3 μL 벤질 6-(5-클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트 (1.1 당량)를 소마토스타틴 용액에 첨가하였다. 용액을 37℃에서 교반하였다. Rt,1 (ACN 중): 1.66; MS ES+: M+3/3=637.6, M+2/2=956.0.
동일한 반응을 완충액 pH 8 (57.5% NaH2PO4 20 mM, pH 8, 40% ACN, 2.5% DMF)에서 수행하였다
획득된 컨쥬게이트의 질량 스펙트럼은 도 10에 나타낸다.
Ⅵ2. 벤질6-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트와 소마토스타틴의 반응
Figure pct00167
1 mg의 동결건조된 소마토스타틴 (mexact = 1636,72)을 4 mL 완충액 (57.5% NaH2PO4 20 mM, pH 6.5, 40% ACN, 2.5% DMF)에 가용화하여 153　μM (0.25 mg/mL)의 농도를 수득하였다. 33.5 mg TCEP을 4 mL 완충액 (57.5% NaH2PO4 20 mM, pH 6.5, 40% ACN, 2.5% DMF)에 용해시켰다. 300 μL 소마토스타틴 용액 (1 당량)에 3 μL TCEP 용액 (1.1 당량)을 첨가하였다. 용액을 37℃에서 1시간 동안 교반하였다. 시판 소마토스타틴: Rt,1 (ACN 중): 1.57; MS ES+: M+3/3=546.4, M+2/2=819.2. 환원된 디설파이드 결합 소마토스타틴: Rt,1 (ACN 중): 1.50; MS ES+ : M+3/3=547.2, M+2/2=820.3. 5 mg 벤질 6-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트 (I.7)을 800 μL ACN에 가용화하였다. 용액 중 3 μL 벤질 6-(4,5-디클로로-1,1-디옥시도-3-옥소이소티아졸-2(3H)-일)헥사노에이트 (1.1 당량)를 소마토스타틴 용액에 첨가하였다. 용액을 37℃에서 교반하였다. Rt,1 (ACN 중): 1.65; MS ES+: M+3/3=673.3, M+2/2=955.5.
동일한 반응을 완충액 pH 8 (57.5% NaH2PO4 20 mM, pH 8, 40% ACN, 2.5% DMF)에서 수행하였다
획득된 컨쥬게이트의 질량 스펙트럼은 도 11에 나타낸다.
4. 단일클론 항체와의 컨쥬게이션
4.1. ADC 합성, 정제 및 특성화
하기에 기술된 절차는 키메라, 인간화 및 인간 IgGl 형태에 적용된다. IgG2, IgG4 등과 같은 임의의 다른 형태의 경우 당업자가 이 절차를 일반 지식을 사용하여 적응시킬 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
Ab1 항체는 항-IGF1R IgG1 단일클론 항체이다. 이러한 항체는 국제특허출원 WO 2015162291 (p36, 표 3 참조)의 항체 208F2에 상응하는데, 3개의 경쇄 CDR이 서열번호 9, 5 및 11을 갖고, 3개의 중쇄 CDR이 서열번호 7, 2 및 3을 갖으며, 경쇄 가변 도메인이 서열번호 18을 갖고, 중쇄 가변 도메인이 서열번호 13을 갖는다.
Ab2 항체는 세균 단백질에서 유래한 관련없는 키메라 (IgG1) 항체이고, 이세균 단백질은 대장균의 외부 막 단백질이고 c9G4로 불린다 (Haeuw J. F. and Beck A. Proteomics for development of immunotherapies, In Proteomics: Biomedical and Pharmaceutical Applications, Kluwer Academic Publishers, Ed. Hondermarck H., 2014, p243-278; 국제특허출원 WO2015162291).
항체 (1 내지 5 mg/mL)를 150 mM NaCl 및 2 mM EDTA를 포함하는 10 mM 보레이트 완충액 pH 8.4에서 TCEP 수염화물로 37℃에서 2 내지 4시간 동안 부분적으로 환원하였다. 전형적으로, TCEP의 6 내지 20 몰 당량을 약 4의 DAR을 목표로 하는데 사용하였다. 부분적 항체 환원을 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE 분석에 의해 검증하였다. 다음으로 항체 농도를 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 6% 슈크로스를 포함하는 10 mM 보레이트 완충액 pH 8.4으로 1 mg/mL로 조절하였고, 항체 대비 5 내지 20 몰 과량의 약물-링커 컨쥬게이트를 DMSO 중 10 mM 용액으로부터 첨가하였다.
본 발명에 따른 약물-링커 컨쥬게이트의 7가지 실시예를 Ab1에 커플링하였다.
- 각각 ADC1-A 및 ADC1-B (절단불가능한 링커)를 제공하는 실시예 A 및 실시예 B;
- 각각 ADC1-C, ADC1-D, ADC1-E, ADC1-F 및 ADC1-G (절단가능한 링커)를 제공하는 실시예 C, 실시예 D, 실시예 E, 실시예 F 및 실시예 G.
최종 DMSO 농도를 10%로 조절하여 커플링 동안 수용성 매질에서 약물의 용해도를 유지하였다. 반응을 실온 또는 37℃에서 1 내지 4시간 동안 수행하였다. 과량의 약물을 약물 몰 당 2.5 몰의 N-아세틸시스테인을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양함으로써 켄칭하였다.
150 mM NaCl 및 6% 슈크로스를 포함하는 25 mM His 완충액 pH 6.5에 대한 4℃에 밤샘 투석 이후에, 재가교된 항체-약물 컨쥬게이트를 시판되는 크로마토그래피 컬럼 및 한외여과 유닛으로 당업자에게 숙지된 방법을 사용하여 정제하였다. 정제된 ADC를 0.2 μm 필터 상의 멸균 여과 이후에 4℃에서 보관하였다.
이들을 환원 및 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 추가로 분석하여 약물 컨쥬게이션을 검증하였고, 분석용 TSK G3000 SWXL 컬럼 상의 SEC에 의해 단량체 및 응집된 형태의 함량을 결정하였다. SEC 크로마토그램으로부터 추론된 응집된 형태의 함량은 표 9에 나타낸 바와 같이 5% 미만이었다.
Figure pct00168
SDS-PAGE 분석은 완전하게 가교된 항체 H2L2의 형성을 검증하고 있다 (도 12). 그러나, 부분적으로 가교된 항체에 해당하는 다른 종 (H2L, H2 및 HL)도 검출하였다. 이들 종이 전개 이전에 환원 조건에서 열 처리될 때 가시적이고, 고유의 사슬간 가교에 의해 연결되지 않은 중쇄 및 경쇄 (H 및 L)의 완전한 해리를 입증함을 언급하는 것이 중요하다.
단백질 농도를 표준으로서 IgG로의 BCA 검정법을 사용하여 결정하였다. DAR을 정제된 ADC 각각에 대해 TSK-부틸-NPR 컬럼을 사용한 HIC에 의해 추정하였다. DAR이 3.5 내지 4.3 범위에 포함되었다 (표 10). HIC 프로파일은 DAR0 없음 및 DAR 4의 주요 피크가 합성된 대부분의 ADC에 대해 관찰됨을 보여주었다. 따라서, 단지 ADC1-C 및 ADC1-E만이 미량의 DAR0를 보여준다. 더우기, ADC1-A, B, C 및 G의 경우에 DAR3, DAR4 만 DAR5이 관찰되었다. ADC1-D를 제외하고, 주요 피크가 DAR4이다. 2세대 ADC와 비교하여, 이들 ADC가 표 10에 나타낸 바와 같이 더욱 균일하다.
Figure pct00169
아드세트리스® (브렌툭시맙, 베도틴)가 항체의 시스테인에 컨쥬게이션된 2세대 말레이미드 링커를 사용하기 때문에, 이를 기준으로서 사용하였다. 이것은 2세대 ADC의 최고의 대표적인 예이고, 이러한 필요에서 기술된 기술학은 3세대로서 고려될 수 있다.
4.2. 고유의 질량 분광분석법에 의한 ADC 분석
모든 화학물질은 시그마-알드리치사로부터 구입하였다: 암모늄 아세테이트 (A1542), 세슘 할로겐화물 (21004), 2-프로판올 (I9516). IgG 제로 (A0-IZ1-010) 효소를 제노비스사로부터 회득하였다. 수용성 용액을 울트라-퓨어 물 시스템 (독일, 괴팅겐, 사토리우스)을 사용하여 준비하였다.
ADC1-A 내지 ADC1-G를 고유의 MS 실험 이전에 탈글리코실화하였다. 이것을 ADC 마이크로그램 당 1 단위의 IgG 제로를 37℃에 30분 동안 배양함으로써 수행하였다. 다음으로, ADC를 마이크로원심분리기 (Vivaspin, 10-kD 컷오프, 독일, 괴팅겐, 사르토리우스)를 사용한 농축/희석의 6회 순환을 사용하여 50 mM 암모늄 아세테이트 용액 (pH 6.9)에 대응하여 완충액 교환하였다. 단백질 농도를 나노드롭 분광광도기 (Thermo Fisher Scientific, 프랑스)를 사용한 UV 흡광도에 의해 결정하였다. ADC의 비-변성화 (고유의) 질량 분광분석법을 자동화된 칩 기반의 나노전기스프레이 장치 (트리버사 나노메이트, 어드비온사, 미국 이타카)에 둘 다 연결된 양성 이온 방식으로 작동하는 Q-TOF (Synapt G2 HDMS, 워터스사, 영국 맨체스터) 질량 분광분석기 상에서 수행하였다. 분석을 m/z 1000 내지 10000 범위에서 수행하였다. 시료를 150 mM NH4OAc pH 6.9에 희석하고, 10 μM로 주입하였다.
외부 보정을 2-프로판올/물 (50/50 v/v) 중 세슘 요오드화물의 2 g/L 용액에 의해 생성된 단일 하전된 이온을 사용하여 수행하였다.
나노전기스프레이의 전압을 1.75 kV 및 질소 나노흐름을 0.75 psi에 설정하였다.
콘 전압을 180 볼트 및 후방 압력을 6 mbar에 설정하였다.
도 14는 탈컨볼루션되지 않은 MS 스펙트럼의 예를 제시한다.
DAR 분포를 질량 Lynx 4.1(워터스사, 영국 맨체스터)로부터의 MaxEntTM 알고리즘을 사용한 탈컨볼루션 이후에 결정하였다 (도 15). 소프트웨어의 매개변수를 각 스펙트럼에 대해 최적화하였다.
평균 DAR 값 (도 15)을 하기 공식 (여기서 j는 약물 로딩의 최대값임)을 사용하여 계산되었다.
Figure pct00170
결과는 미가공 스펙트럼에서 각 전하 상태의 상대 피크 강도로부터 유래하였고, 하기 표 11에 제시한다.
Figure pct00171
도 16은 하기 2개의 상이한 ADC의 경우에 질량 탈컨볼루션 이후 미가공 스펙트럼으로부터 결정된 DAR 분포를 비교하고 있고, 즉
- Ab1 항체 및 약물-링커 컨쥬게이트 C (도 16b)로부터 제조된 본 발명에 따른 ADC1-C 및
- 동일한 항체 (Ab1)로부터 및 약물-링커 컨쥬게이트 C에 상응하는 약물-링커 컨쥬게이트로부터 합성된 비교 ADC인 기준 ADC Ref-A, 여기서 설포말레이미드 모이어티 (
Figure pct00172
)가 말레이미드 모이어티 (
Figure pct00173
)로 대체된다 (도 16a).
DAR 0 내지 DAR 8의 불균일한 분포가 약물을 항체에 연결하는 고전적인 말레이미드 화학을 사용하여 합성된 ADC의 경우에 관찰하였던 반면 (도 16a), 본 발명에 따라 설포말레이미드 화학을 사용하여 생성된 ADC는 75% DAR 4 및 DAR 0/2 및 6/8 종 없음으로 매우 균일하다 (도 16b). 이들 결과는 하기 표 12에 나타낸다.
Figure pct00174
4.3. 리간드 결합 검정 방법을 사용한 4개의 포유동물 혈청에서 ADC의 시험관내 안정성 연구
안정성을 확립하기 위하여, 시험관내 안정성 연구를 시행하였다. 이것은 37℃에서 14일의 기간 동안 ADC의 배양으로 구성된다. 시료를 0일, 3일, 7일 및 14일째 수집하였다. 다음으로 다양한 시료 (D0, D3, D7 및 D14)를 LBA에 의해 분석하여 전체 항체의 농도 대 ADC 농도를 결정하였다. 실제적으로, 각 ADC의 용액을 4개의 혈청 (인간, 시노몰거스, 마우스 및 래트)에서 100 μg/mL로 준비하고, 37℃에서 최대 14일 동안 배양한다. 다음으로 분취량을 D0, D3, D7 및 D14에 수집하고, 투약까지 -80℃에서 보관하였다. 총 Ab 및 ADC 정량화를 위해, 플레이트를 실온에서 교반하면서 해동하고, LBA 검정법을 동시에 진행한다. 간략하게, 표준 마이크로타이터 플레이트 (MSD, 미국 게티스버그)를 PBS 1× 중 2 μg/mL로 준비된 50 μL의 항-His 항체 용액을 사용하여 코팅한다. 4℃에서 밤샘 배양 이후, 검정 플레이트를 차단 완충액 (3% MSD 블록커 A (MSD, 미국 게티스버그))으로 37℃에서 1시간 동안 처리한다. 다음으로 재조합 His-태그 항원을 검정 완충액 중 2,5 μg/mL의 농도로 37℃에서 1시간 동안 첨가한다. 세척 단계 이후에, 시료를 1/5000 희석에서 두 벌로 분석하고, 표준 ADC가 검정 플레이트 상에 두 벌이 로딩되는 동안 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 검출 단계를 총 Ab의 검출을 위한 1 μg/mL의 염소 항-인간 Ig 카파 설포-태그 용액 또는 ADC 검출을 위한 설포태그로 표지된 마우스 단일클론 항-약물 항체의 검출을 사용하여 시행한다. 37℃에서 1시간 배양 이후, MSD 섹터 영상화기를 사용한 판독 직전에 계면활성제 (MSD, alrnr 게티스버그)를 포함하는 2× MSD-판독 T 완충액 150 μL를 사용하여 검출을 실현시킨다.
전체 항체 및 ADC 농도를 각 시점에 결정하고, 각 시점에 총 ADC 또는 항체의 정량으로서 100%를 취하여 백분율로 변환한다.
데이타는 3개의 ADC에 대해 도 17a, 도 17b 및 도 17c에 도시한다: 고전적인 말레이미드 화학을 사용하여 약물이 항체와 연결된 기준 ADC Ref-B (도 17a)와 비교하여, 약물이 본 발명에 따른 설포말레이미드 화학을 사용하여 (각각 약물-링커 컨쥬게이트 C 또는 E에 의해) Ab1 항체에 연결된 ADC1-C (도 17b) 및 ADC1-E (도 17c).
Figure pct00175
기준 ADC Ref-B를 제조하는데 사용된 약물-링커
비교 대상으로서, 동일한 페이로드 및 절단 불가능한 링커를 사용하는 약물-링커가 선택되었다 (ADC Ref-B의 약물-링커). 이것을 말레이미드 화학을 사용하여 동일한 항체에 컨쥬게이션하였다. 이러한 비교 대상의 선택은 역-마이클 반응을 통한 항체로부터의 탈컨쥬게이션에 의해 혈청에서 기준 ADC의 "불안정성"을 제한한다. 절단가능한 링커를 기반으로 하는 본 발명자의 구조물과 비교하여, 이러한 비교대상은 본 발명자의 약물-링커의 안정성 개선을 더욱 더 대단하게 하여 바람직하다.
예상된 바와 같이, ADC 농도의 감소가 고전적인 말레이미드 화학을 사용하여 합성된 ADC (ADC Ref-B)에 대해 관찰된 반면, 본 발명에 따른 설포말레이미드 화학을 사용하여 생성된 ADC (ADC1-C 및 ADC1-E)은 놀랍게도 14일 기간에 걸쳐 더욱 더 안정하다.
4.4. ADC의 시험관내 세포독성
본 발명에 따른 ADC의 시험관내 세포독성을 평가하였다. 비-특이적인 세포독성을 평가하기 위하여, 화합물을 또한 c9G4로 불리는 관련없는 키메라 항체 (Ab2)에 동일한 DAR로 및 동일한 약물-링커 컨쥬게이트를 사용하여 커플링하여 실시예 C의 ADC2-C, 실시예 E의 ADC2-E 및 실시예 F의 ADC2-F를 제공하였다.
MCF-7 및 NCI-H2122 세포를 완전 성장 배지를 넣은 96 웰 플레이트 (웰 당 2500개 세포) 상에 도말하였다. 이후, 테스트된 ADC의 일련 희석물을 상응하는 웰에 첨가하고, 37℃에서 6일 동안 배양하였다. ADC의 첨가 후 6일째, 세포 역가 글로 검정법 (프로메가사)를 플레이트 상에서 수행하여 세포의 생존도를 검토하였다.
생존도의 백분율로 표현되는 획득된 결과는 도 18a 및 도 18b에 나타낸다. 예상된 바와 같이, 관련없는 항체로 합성된 ADC는 MCF-7 및 NCI-H2122 세포 둘 다 상에 세포독 활성이 없거나 미미하였다. 대조적으로, 본 발명의 ADC: ADC1-C, ADC1-E 및 ADC1-F는 세포 생존도를 극적으로 감소시켰다. NCI-H2122 상에서 ADC1-C, ADC1-E 및 ADC1-F에 대해 각각 7,61×10-11, 7,16×10-11 및 3,64×10-11 M의 EC50 값이 획득되었고, MCF7 상에서 ADC1-C, ADC1-E 및 ADC1-F에 대해 각각 1,04×10-11, 1,33×10-11 및 7,39×10-11 M의 EC50 값이 획득되었으며, 강력한 세포독 활성을 나타내었다.
4.5. 생체내
모든 실험 프로토콜을 피에르파브르 연구소 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다.
난소암 모델의 경우, 7주령 암컷 SCID 마우스 (챨스리버 연구실)에게 10×106개 CaoV3 세포를 피하로 이식하였다 (실험군 당 6마리 동물).
본 발명에 따른 ADC1-C, 기준 ADC Ref-A 또는 ADC 운반체의 정맥내 투여에 의한 치료는 종양이 대략 150 mm3에 도달할 때 개시되었다. 동물을 1회 주사 (Q1d1) 또는 3회 주사 (매주 1회) (Q7d3)로 처리하였다. 종양 부피 (길이×너비×높이×0.52)를 전자식 캘리퍼로 첫 주사 후 대략 25일 동안 적어도 매주 2회 측정하였다. 결과는 도 19 (Q1d1에 처리된 동물) 및 도 20 (Q7d3에 처리된 동물)에 제시되어 있다.
도 19 및 도 20에서 관찰된 바와 같이, 본 발명에 따른 ADC는 단일 주사 이후 완벽한 종양 퇴행과 함께 큰 효능을 갖는다.
5. 단일클론 항체에 대한 PNU-159682 유도체의 컨쥬게이션
5.1. ADC 합성, 정제 및 특성화
2개의 PNU-159682 유도체, 즉 F562524 (실시예 J) 및 F562646 (실시예 H)를 실시예 4에서 이전에 기술된 조건 하에 항체 208F2 (Ab1) 및 c9G4 (Ab2)에 커플링하였다. 208F2 (Ab1) 및 c9G4 (Ab2)는 실시예 4에 개시되어 있다. 간략하게, 항체 (1 내지 5 mg/mL)를 150 mM NaCl 및 2 mM EDTA를 포함하는 10 mM 보레이트 완충액 pH 8.4에서 TCEP 수염화물의 6 내지 20 당량으로 37℃에서 2 내지 4시간 동안 부분적으로 환원시켰다. 다음으로 항체 농도를 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 6% 슈크로스를 포함하는 10 mM 보레이트 완충액 pH 8.4으로 1 mg/mL로 조절하였고, 항체 대비 5 내지 20 몰 과량의 약물-링커 컨쥬게이트를 DMSO 중 10 mM 용액으로부터 첨가하였다. 반응을 실온 또는 37℃에서 10% DMSO의 존재 하에 1 내지 4시간 동안 수행하였다. 과량의 약물을 약물 몰 당 2.5 몰의 N-아세틸시스테인을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양함으로써 켄칭하였다. 150 mM NaCl 및 6% 슈크로스를 포함하는 25 mM His 완충액 pH 6.5에 대한 4℃에서 밤샘 투석 이후, ADC를 크로마토그래피 컬럼 및 한외여과에 의해 정제하였다. ADC 농도를 표준으로서 IgG로의 BCA 검정법을 사용하여 결정하였고, 정제된 ADC를 0.2 μm 필터 상의 멸균 여과 이후에 4℃에서 보관하였다.
ADC를 실시예 4에서 이전에 기술된 바와 같이 SDS-PAGE 및 SEC (TSK G3000 SWXL 컬럼)에 의해 추가로 분석하여 약물 컨쥬게이션 및 재가교화를 검증하였고, 단량체 및 응집체의 함량을 결정하였다. 단량체의 함량은 대략 95%이었다 (도 23 및 표 13).
Figure pct00176
5.2. 고유의 LC-MS에 의한 ADC 분석
ADC를 Synapt G2Si 질량 분광분석기 (워터스사)에 연결된 UPLC 액퀴티 H 클래스 바이오시스템 상에서 고유의 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법에 의해 분석하였다. LC 분리를 일련으로 연결된 2개의 폴리히드록시에틸 A 컬럼 (Poly-LC, 150 x 1 mm, 300 A, 5 μm) 상에서 수행하였다. 시료를 0.2 mg/mL로 용리 완충액 (150 mM 암모늄 아세테이트)를 사용하여 희석하였다. 시료 4 μg을 주입하고, 40 μL/분의 윳ㄱ으로 용리하였다. 질량 분광분석기를 2.9 kV의 캐필러리 전압을 갖는 양성 모드로 작동하였다. 시료 콘을 150 V에 설정하였다. 분석을 m/z 1000-8000 범위에서 1초의 스캔 시간으로 수행하였다. 도 24는 탈컨볼루션 이전의 m/z 스펙트럼을 나타낸다. DAR 분포를 질량 Lynx 소프트웨어 (워터스사)로부터의 MaxEntTM 알고리즘을 사용한 탈컨볼루션 이후에 결정하였다 (도 25). 평균 DAR 값을 하기 공식 (여기서 j는 약물 로딩의 최대값임)을 사용하여 계산하였다.
Figure pct00177
결과는 하기 표 14에 제시한다.
Figure pct00178
5.3. 시험관내 안정성
ADC hz208F2-F562524를 시노몰거스 혈청에서 200 μg/mL로 37℃에 14일 기간 동안 배양하였다. 시료를 0일, 3일, 7일 및 14일째 수집하고, LC-MS 분석까지 -80℃에 보관하여 평균 DAR을 결정하였다.
LC-MS 분석 이전에, 시료를 캡쳐 셀렉트 항-인간 IgG-바이오틴 컨쥬게이트 (Life Technologies, 8 μg 항체/200 μL 비드)로 코팅된 스트렙트아비딘 자성 비드 (M-280, 인비트로겐사)를 사용하여 면역침전하였다. 시료를 항-IgG-코팅된 ㅂ비드로 실온에서 2시간 동안 배양하고 (100 μL 시료/200 μL 비드), 후속으로 40 μL의 0.4% 트리플루오로아세트산으로 산성 용리를 하였다. pH는 4 μL의 3 M 트리스/HCl pH 8.8 용액을 첨가하여 증가시켰다. 면역침전된 시료를 상기에 기술된 바와 같은 고유의 조건에서 LC-MS 분석 이전에 2 μL의 IgG 제로와 함께 37℃에 30분 동안 배양하였다. DAR 분포를 질량 Lynx 소프트웨어 (워터스사)로부터의 MaxEntTM 알고리즘을 사용한 탈컨볼루션 이후에 결정하였고, 평균 DAR 값을 하기 공식 (여기서 j는 약물 로딩의 최대값임)을 사용하여 계산되었다.
Figure pct00179
결과를 하기 표 15에 제시한다. ADC hz208F2-F562524는 시노몰거스 혈청에서 시험관내 배양 이후 최대 14일 동안 매우 안정한 것을 나타내었다.
Figure pct00180
5.4. 시험관내 세포독성
ADC의 세포독성을 MCF-7 및 NCI-H2122 세포에서 평가하였다. 세포를 완전 성장 배지를 넣은 96 웰 플레이트 (웰 당 2500개 세포) 상에 도말하였다. 이후, 테스트된 ADC의 일련 희석물을 상응하는 웰에 첨가하고, 37℃에서 6일 동안 배양하였다. 세포 생존도를 세포포 역가 글로 검정법 (프로메가사)를 사용하여 ATP를 측정함으로서 결정하였다. 발광을 베르톨드사로부터의 미트라스 플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다. 생존도 백분율로 표현되는 획득된 결과는 도 26 및 도 27에 나타낸다. 처리되지 않은 웰에서 생존도를 100%로서 고려하였다.
예상된 바와 같이, ADC hz208F2-F562524 및 hz208F2-F562646는 세포 생존도를 극적으로 감소시켰다. NCI-H2122 세포 상에서 ADC hz208F2-F562524 및 hz208F2-F562646에 대해 각각 2.48×10-11 및 1.92×10-11 M의 EC50 값이 획득되었고, MCF7 세포 상에서 ADC hz208F2-F562524 및 hz208F2-F562646에 대해 각각 5.86×10-12 및 9.45×10-13 M의 EC50 값이 획득되었으며, 강력한 세포독 활성을 나타내었다. 대조적으로, 관련없는 항체로 합성된 상응하는 ADC는 MCF-7 및 NCI-H2122 세포 둘 다 상에서 미민한 세포독 활성을 나타내었다.
5.5. 생체내 항-종양 활성
7주령 암컷 SCID 마우스 (챨스리버 연구실)에게 10×106개 CaoV3 세포를 피하로 이식하였다 (실험군 당 6마리 동물). ADC hz208F2-F562524 (0.3 mg/kg), 상응하는 대조군 ADC c9G4-F562524 (0.3 mg/kg) 또는 운반체의 정맥내 투여 (Q7d2)에 의한 치료는 종양이 대략 150 mm3에 도달할 때 개시되었다. 종양 부피 (길이×너비×높이×0.52)를 전자식 캘리퍼로 첫 주사 후 대략 50일 동안 매주 2회 측정하였다. 결과는 도 28에 제시되어 있다. ADC hz208F2-F562524의 2회 주사 이후 완벽한 종양 퇴행이 관찰될 수 있는 반면, 항-종양 효과가 대조군 ADC 또는 운반체로는 관찰되지 않았다.
5.6. 결론
설포말레이미드-링커 기술학을 사용하여 PNU-159682 유도체로 합성된 ADC는 혈청에서 매우 균일하고, 안정하다. 이들의 효능은 서로 다른 시험관내 및 생체내 모델에서 입증되었다.
6. 전반적인 결론
전반적으로, 본 발명에 기술된 설포말레이미드계 링커 기술학은 아드세트리스와 같은 시판되는 화합물에 사용되는 보통의 말레이미드계 링커와 비교하여 상이한 종의 혈장에서 더 양호한 안정성 및 시험관내 모델에서 더 양호한 효능을 제공한다. 이들 성질은 상이한 세포주에서, 보다 명확하게 항원의 더 낮은 발현을 보이는 세포주 (CAOV3)에 대해 생체내 효능의 명백한 개선으로 변환되었다.
또한, 본 발명에 따른 ADC가 인간 치료에서 효능 개선 및 안전성 보장과 관련된 순환에서 더 안정하기 때문에 더 양호한 내성도가 기대된다.
SEQUENCE LISTING <110> PIERRE FABRE MEDICAMENT <120> SULFOMALEIMIDE-BASED LINKERS AND CORRESPONDING CONJUGATES <130> B376705PCTD37611 <150> B73896EPD37611 <151> 2018-09-27 <160> 81 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Consensus CDR -H1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Thr may be replaced by Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Tyr may be replaced by Phe <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Consensus CDR-H2 <400> 2 Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr 1 5 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Consensus CDR-H3 <400> 3 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Consensus CDR-L1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Ser may be replaced by Asn <400> 4 Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Consensus CDR-L2 <400> 5 Tyr Thr Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Consensus CDR-L3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Thr may be replaced by Ala <400> 6 Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR-H1 <400> 7 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR-H1 <400> 8 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Phe 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR-L1 <400> 9 Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR-L1 <400> 10 Gln Asp Ile Asn Lys Tyr 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR-L3 <400> 11 Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> CDR-L3 <400> 12 Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 13 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c208F2, heavy chain, VH <400> 13 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c212A11, heavy chain, VH <400> 14 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c214F8, heavy chain, VH <400> 15 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c219D6, heavy chain, VH <400> 16 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Phe Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c213B10, heavy chain, VH <400> 17 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c208F2, light chain, VL <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Val Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c212A11, light chain, VL <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c214F8, light chain, VL <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c219D6, light chain, VL <400> 21 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c213B10, light chain, VL <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 449 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c208F2, heavy chain, full length <400> 23 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 24 <211> 449 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c212A11, heavy chain, full length <400> 24 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 25 <211> 449 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c214F8, heavy chain, full length <400> 25 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 26 <211> 449 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c219D6, heavy chain, full length <400> 26 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Phe Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 27 <211> 449 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c213B10, heavy chain, full length <400> 27 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 28 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c208F2, light chain, full length <400> 28 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Val Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 29 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c212A11, light chain, full length <400> 29 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 30 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c214F8, light chain, full length <400> 30 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 31 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c219D6, light chain, full length <400> 31 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 32 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> c213B10, light chain, full length <400> 32 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 33 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 (var.1) heavy chain, VH <400> 33 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 34 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 (var. 3), VH <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Phe Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 35 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 (var. 1), VL <400> 35 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 36 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 (var.3), VL <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 37 <211> 449 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 (var. 1), heavy chain, full length <400> 37 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 38 <211> 449 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 (var.3), heavy chain full length <400> 38 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Phe Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 39 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 (var. 1), light chain, full length <400> 39 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 40 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 (var.3), light chain, full length <400> 40 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 41 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 (var.2) heavy chain, VH <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Met may be replaced by Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Ile may be replaced by Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Tyr may be replaced by His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Lys may be replaced by Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Leu may be replaced by Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Trp may be replaced by Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> Lys may be replaced by Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61) <223> Asn may be replaced by Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> Glu may be replaced by Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> Leu may be replaced by Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> Ala may be replaced by Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (74)..(74) <223> Lys may be replaced by Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> Ser may be replaced by Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> Asn may be replaced by Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(79) <223> Ala may be replaced by Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (82)..(82) <223> Phe may be replaced by Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (95)..(95) <223> Phe may be replaced by Tyr <400> 41 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Phe Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 (var. 2), light chain, VL <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Ser may be replaced by Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Arg may be replaced by Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> His may be replaced by Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (65)..(65) <223> Arg may be replaced by Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (71)..(71) <223> Tyr may be replaced by Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> Ser may be replaced by Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> Asn may be replaced by Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> Phe may be replaced by Tyr <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 43 <211> 329 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Constant domain (VH) IgG1 <400> 43 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 44 <211> 326 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Constant domain (VH) IgG4 (S228P) <400> 44 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly 325 <210> 45 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Domain kappa (VL) <400> 45 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 46 <211> 98 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Human germline IGHV1-46*01 <400> 46 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 47 <211> 95 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Human germline IGKV1-39*01 <400> 47 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro 85 90 95 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Human germline IGHJ4*01 <400> 48 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Human germline IGKJ4*01 <400> 49 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 50 <211> 1367 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IGF-1R (human) <400> 50 Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu 1 5 10 15 Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile 20 25 30 Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg 35 40 45 Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile 50 55 60 Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val 65 70 75 80 Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu 85 90 95 Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe 100 105 110 Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile 115 120 125 Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu 130 135 140 Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile 145 150 155 160 Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys 165 170 175 Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys 180 185 190 Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr 195 200 205 Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys 210 215 220 Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser 225 230 235 240 Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr 245 250 255 Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu 260 265 270 Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala 275 280 285 Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met 290 295 300 Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr 305 310 315 320 Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys 325 330 335 Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly 340 345 350 Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn 355 360 365 Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val 370 375 380 Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser 385 390 395 400 Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly 405 410 415 Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp 420 425 430 Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe 435 440 445 Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu 450 455 460 Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg 465 470 475 480 Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr 485 490 495 Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr 500 505 510 Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys 515 520 525 Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala Cys 530 535 540 Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys 545 550 555 560 Asp Val Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln 565 570 575 Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn Asp 580 585 590 His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn Ala 595 600 605 Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser 610 615 620 Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn 625 630 635 640 Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly Tyr 645 650 655 Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys 660 665 670 Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Ile Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro Lys 675 680 685 Thr Glu Val Cys Gly Gly Glu Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro Lys 690 695 700 Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys 705 710 715 720 Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro Glu 725 730 735 Arg Lys Arg Arg Asp Val Met Gln Val Ala Asn Thr Thr Met Ser Ser 740 745 750 Arg Ser Arg Asn Thr Thr Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Asp Pro 755 760 765 Glu Glu Leu Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp Asn 770 775 780 Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr Arg 785 790 795 800 Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys Ser 805 810 815 Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala Asp 820 825 830 Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Ser Ile 835 840 845 Phe Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu Met 850 855 860 Tyr Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Val Glu Asp Gln Arg Glu Cys Val 865 870 875 880 Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg Leu 885 890 895 Asn Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser Gly 900 905 910 Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Gln Ala Lys Thr 915 920 925 Gly Tyr Glu Asn Phe Ile His Leu Ile Ile Ala Leu Pro Val Ala Val 930 935 940 Leu Leu Ile Val Gly Gly Leu Val Ile Met Leu Tyr Val Phe His Arg 945 950 955 960 Lys Arg Asn Asn Ser Arg Leu Gly Asn Gly Val Leu Tyr Ala Ser Val 965 970 975 Asn Pro Glu Tyr Phe Ser Ala Ala Asp Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp 980 985 990 Glu Val Ala Arg Glu Lys Ile Thr Met Ser Arg Glu Leu Gly Gln Gly 995 1000 1005 Ser Phe Gly Met Val Tyr Glu Gly Val Ala Lys Gly Val Val Lys 1010 1015 1020 Asp Glu Pro Glu Thr Arg Val Ala Ile Lys Thr Val Asn Glu Ala 1025 1030 1035 Ala Ser Met Arg Glu Arg Ile Glu Phe Leu Asn Glu Ala Ser Val 1040 1045 1050 Met Lys Glu Phe Asn Cys His His Val Val Arg Leu Leu Gly Val 1055 1060 1065 Val Ser Gln Gly Gln Pro Thr Leu Val Ile Met Glu Leu Met Thr 1070 1075 1080 Arg Gly Asp Leu Lys Ser Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Pro Glu Met 1085 1090 1095 Glu Asn Asn Pro Val Leu Ala Pro Pro Ser Leu Ser Lys Met Ile 1100 1105 1110 Gln Met Ala Gly Glu Ile Ala Asp Gly Met Ala Tyr Leu Asn Ala 1115 1120 1125 Asn Lys Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Val 1130 1135 1140 Ala Glu Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Thr Arg 1145 1150 1155 Asp Ile Tyr Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Lys Gly Leu 1160 1165 1170 Leu Pro Val Arg Trp Met Ser Pro Glu Ser Leu Lys Asp Gly Val 1175 1180 1185 Phe Thr Thr Tyr Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp 1190 1195 1200 Glu Ile Ala Thr Leu Ala Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu Ser Asn 1205 1210 1215 Glu Gln Val Leu Arg Phe Val Met Glu Gly Gly Leu Leu Asp Lys 1220 1225 1230 Pro Asp Asn Cys Pro Asp Met Leu Phe Glu Leu Met Arg Met Cys 1235 1240 1245 Trp Gln Tyr Asn Pro Lys Met Arg Pro Ser Phe Leu Glu Ile Ile 1250 1255 1260 Ser Ser Ile Lys Glu Glu Met Glu Pro Gly Phe Arg Glu Val Ser 1265 1270 1275 Phe Tyr Tyr Ser Glu Glu Asn Lys Leu Pro Glu Pro Glu Glu Leu 1280 1285 1290 Asp Leu Glu Pro Glu Asn Met Glu Ser Val Pro Leu Asp Pro Ser 1295 1300 1305 Ala Ser Ser Ser Ser Leu Pro Leu Pro Asp Arg His Ser Gly His 1310 1315 1320 Lys Ala Glu Asn Gly Pro Gly Pro Gly Val Leu Val Leu Arg Ala 1325 1330 1335 Ser Phe Asp Glu Arg Gln Pro Tyr Ala His Met Asn Gly Gly Arg 1340 1345 1350 Lys Asn Glu Arg Ala Leu Pro Leu Pro Gln Ser Ser Thr Cys 1355 1360 1365 <210> 51 <211> 932 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IGF-1R ECD (human) <400> 51 Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu 1 5 10 15 Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile 20 25 30 Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg 35 40 45 Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile 50 55 60 Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val 65 70 75 80 Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu 85 90 95 Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe 100 105 110 Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile 115 120 125 Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu 130 135 140 Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile 145 150 155 160 Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys 165 170 175 Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys 180 185 190 Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr 195 200 205 Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys 210 215 220 Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser 225 230 235 240 Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr 245 250 255 Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu 260 265 270 Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala 275 280 285 Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met 290 295 300 Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr 305 310 315 320 Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys 325 330 335 Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly 340 345 350 Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn 355 360 365 Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val 370 375 380 Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser 385 390 395 400 Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly 405 410 415 Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp 420 425 430 Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe 435 440 445 Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu 450 455 460 Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg 465 470 475 480 Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr 485 490 495 Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr 500 505 510 Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys 515 520 525 Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala Cys 530 535 540 Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys 545 550 555 560 Asp Val Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln 565 570 575 Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn Asp 580 585 590 His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn Ala 595 600 605 Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser 610 615 620 Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn 625 630 635 640 Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly Tyr 645 650 655 Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys 660 665 670 Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Ile Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro Lys 675 680 685 Thr Glu Val Cys Gly Gly Glu Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro Lys 690 695 700 Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys 705 710 715 720 Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro Glu 725 730 735 Arg Lys Arg Arg Asp Val Met Gln Val Ala Asn Thr Thr Met Ser Ser 740 745 750 Arg Ser Arg Asn Thr Thr Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Asp Pro 755 760 765 Glu Glu Leu Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp Asn 770 775 780 Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr Arg 785 790 795 800 Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys Ser 805 810 815 Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala Asp 820 825 830 Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Ser Ile 835 840 845 Phe Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu Met 850 855 860 Tyr Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Val Glu Asp Gln Arg Glu Cys Val 865 870 875 880 Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg Leu 885 890 895 Asn Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser Gly 900 905 910 Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Gln Ala Lys Thr 915 920 925 Gly Tyr Glu Asn 930 <210> 52 <211> 512 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IGF-1R ECD Nterminal (human) <400> 52 Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu 1 5 10 15 Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile 20 25 30 Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg 35 40 45 Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile 50 55 60 Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val 65 70 75 80 Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu 85 90 95 Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe 100 105 110 Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile 115 120 125 Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu 130 135 140 Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile 145 150 155 160 Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys 165 170 175 Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys 180 185 190 Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr 195 200 205 Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys 210 215 220 Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser 225 230 235 240 Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr 245 250 255 Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu 260 265 270 Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala 275 280 285 Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met 290 295 300 Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr 305 310 315 320 Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys 325 330 335 Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly 340 345 350 Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn 355 360 365 Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val 370 375 380 Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser 385 390 395 400 Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly 405 410 415 Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp 420 425 430 Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe 435 440 445 Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu 450 455 460 Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg 465 470 475 480 Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr 485 490 495 Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr 500 505 510 <210> 53 <211> 4 <212> PRT <213> artificial <220> <223> tetrapeptide (linker) <400> 53 Gly Phe Leu Gly 1 <210> 54 <211> 4 <212> PRT <213> artificial <220> <223> tetrapeptide (linker) <400> 54 Ala Leu Ala Leu 1 <210> 55 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> tetrapeptide (linker) <400> 55 Pro Val Gly Val Val 1 5 <210> 56 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H037, VH <400> 56 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 57 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 light chain L018, VL <400> 57 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 58 <211> 449 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H037 full length <400> 58 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 59 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 light chain L018 full length <400> 59 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 60 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 light chain L021, VL <400> 60 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 61 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 light chain L021 full length <400> 61 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 62 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H047, VH <400> 62 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 63 <211> 449 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H047 full length <400> 63 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 64 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H049, VH <400> 64 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 65 <211> 449 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H049 full length <400> 65 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 66 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H051, VH <400> 66 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 67 <211> 449 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H051 full length <400> 67 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 68 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H052, VH <400> 68 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 69 <211> 449 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H052 full length <400> 69 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 70 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H057, VH <400> 70 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 71 <211> 449 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H057 full length <400> 71 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 72 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H068, VH <400> 72 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 73 <211> 449 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H068 full length <400> 73 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 74 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H070, VH <400> 74 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 75 <211> 449 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H070 full length <400> 75 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 76 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H071, VH <400> 76 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 77 <211> 449 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H071 full length <400> 77 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 78 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H076, VH <400> 78 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 79 <211> 449 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H076 full length <400> 79 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 80 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H077, VH <400> 80 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 81 <211> 449 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hz208F2 heavy chain H077 full length <400> 81 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly

Claims (25)

  1. 하기 화학식 (I) 또는 이의 염의 링커:
    Figure pct00181
    ,
    여기서 X1 및 X2는 서로 독립적으로 H, 할로겐 원자, (C1-C6)알콕시, 선택적으로 치환된 아릴옥시 또는 -O-(CH2CH2O)rH를 나타내고, 단 X1 및 X2가 동시에 H를 나타내지 않으며;
    L1은 화학식 L1'-(CO-Z')z'의 기를 나타내고, L1'이 -(CH2)n-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 시클로알칸디일, -(CH2)n-아릴렌-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-, -(CH2)n-시클로알칸디일-, -아릴렌-(CH2)p-, -헤테로아릴렌-(CH2)p-, -시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2)n-아릴렌-(CH2)p-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-(CH2)p-, -(CH2)n-시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-아릴렌-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-헤테로아릴렌-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2)n-아릴렌-CH2-CH2-(OCH2CH2)m-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-CH2-CH2-(OCH2CH2)m- 또는 -(CH2)n-시클로알칸디일-CH2-CH2-(OCH2CH2)m-이며;
    각각의 W는 독립적으로 아미노산 단위를 나타내고;
    Y는 PAB-CO-(Z)z-이고, PAB가
    Figure pct00182
    이고 (PAB 단위의 산소가 CO-(Z)z에 연결됨);
    Z는 -NR4-(CH2)u-NR5-, -NR4-(CH2)u-NR5-CO-, -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v- 또는 -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v-CO-이고, NR4 기가 PAB-CO의 CO 기에 연결되고;
    Z'는 -NR4-(CH2)u-NR5- 또는 -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v-이고, NR4 기가 CO-Z'의 CO 기에 연결되고;
    R4 및 R5는 독립적으로 H 또는 (C1-C6)알킬기이고;
    c는 0 또는 1, 바람직하게 1이고;
    m은 1 내지 15의 정수이고;
    n은 1 내지 6의 정수이고;
    p는 1 내지 6의 정수이고;
    q는 0, 1 또는 2, 바람직하게 2이고;
    r은 1 내지 24, 명확하게 1 내지 12의 정수이고;
    u는 1 내지 6의 정수이고;
    v는 1 내지 6의 정수이고;
    w는 0 또는 5의 정수, 바람직하게 0 또는 2이고;
    y는 0 또는 1이고;
    z는 0 또는 1이고;
    z'는 0 또는 1이고;
    X3은 y = z = 1, Z가 -NR4-(CH2)u-NR5-일 때 또는 c = w = y = 0, z'　= 1, Z'가 -NR4-(CH2)u-NR5-일 때 H를 나타내고, 나머지 경우에 X3는 OH, NH2 또는 이탈기를 나타내고, 여기서 이탈기는 할로겐 원자, 화학식 -OSO2-RLG의 설포네이트, N-숙신이미딜옥시, 4-니트로-페닐옥시, 펜타플루오로펜옥시 또는 N-벤조트리아졸옥시이고, RLG는 (C1-C6)알킬, 아릴, 아릴-(C1-C6)알킬 또는 (C1-C6)알킬-아릴기이고, 상기 기가 1개 또는 여러 개의 불소 원자와 같은 할로겐 원자로 선택적으로 치환되며;
    단 상기 링커가 화학식 (I)의 화합물로서,
    X1이 Cl이고, X2가 H이고, q가 0이고, L1이
    Figure pct00183
    이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
    X1이 Cl이고, X2가 Cl이고, q가 0이고, L1이
    Figure pct00184
    이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
    X1이 Cl이고, X2가 H이고, q가 0이고, L1이
    Figure pct00185
    이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
    X1이 Cl이고, X2가 H이고, q가 0이고, L1이
    Figure pct00186
    이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
    X1이 Cl이고, X2가 H이고, q가 0이고, L1이
    Figure pct00187
    이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
    X1이 Cl이고, X2가 H이고, q가 0이고, L1이
    Figure pct00188
    이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Br이거나;
    X1이 Cl이고, X2가 H이고, q가 0이고, L1이
    Figure pct00189
    이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 I이거나;
    X1이 H이고, X2가 Cl이고, q가 0이고, L1이
    Figure pct00190
    이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
    X1이 H이고, X2가 Br이고, q가 0이고, L1이
    Figure pct00191
    이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
    X1이 H이고, X2가 Br이고, q가 0이고, L1이
    Figure pct00192
    이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
    X1이 Cl이고, X2가 Cl이고, q가 0이고, L1이
    Figure pct00193
    이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
    X1이 Cl이고, X2가 Cl이고, q가 0이고, L1이
    Figure pct00194
    이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
    X1이 Cl이고, X2가 Cl이고, q가 0이고, L1이
    Figure pct00195
    이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
    X1이 Cl이고, X2가 Br이고, q가 0이고, L1이
    Figure pct00196
    이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
    X1이 Cl이고, X2가 Br이고, q가 0이고, L1이
    Figure pct00197
    이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이고;
    X1이 Cl이고, X2가 Br이고, q가 0이고, L1이
    Figure pct00198
    이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl이거나;
    X1이 Br이고, X2가 Br이고, q가 0이고, L1이
    Figure pct00199
    이고, c가 0이고, w가 0이고, y가 0이고, X3가 Cl인, 화합물이 아니고,
    여기서 점선은
    Figure pct00200
    의 질소 원자에 대한 L1의 부착점을 표시하고, 물결선은 X3에 대한 L1의 부착점을 표시한다.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 링커는 하기 화학식 (Ia) 또는 이의 염을 갖고,
    Figure pct00201

    여기서 X1, X2, X3, L1, W, Y, c 및 w는 제 1항에 정의된 바와 같고,
    y는 w가 0일 때 0이고, w가 1 내지 5의 정수일 때 y는 0 또는 1인, 링커.
  3. 제 2항에 있어서,
    적어도 X1 또는 X2는 할로겐 원자인, 링커.
  4. 제 3항에 있어서,
    적어도 X1 또는 X2는 Br 또는 Cl인, 링커.
  5. 제 4항에 있어서,
    X1 및 X2 중 하나는 Br 또는 Cl이고, 나머지 기는 H, Cl 또는 Br인, 링커.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    L1'은 -(CH2)n-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-, 아릴렌, -시클로알칸디일 -, -(CH2)n-아릴렌-, -아릴렌-(CH2)n-, -(CH2)n-시클로알칸디일-, -시클로알칸디일-(CH2)n-,
    Figure pct00202

    인, 링커.
  7. 제 6항에 있어서,
    L1'은 -(CH2)n- 또는 -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-, 명확하게 -(CH2)5-와 같은 -(CH2)n-인, 링커.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 W는 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 라이신, 아세틸 또는 포르밀로 보호된 라이신, 아르기닌, 토실 또는 니트로 기(들)로 보호된 아르기닌, 히스티딘, 오르니틴, 아세틸 또는 포르밀로 보호된 오르니틴 및 시트룰린으로부터 선택되는, 링커.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    w = 0이고, (W)w는 결합이거나,
    w = 2이고 (W)w는 Val-Cit 또는 Val-Ala, 바람직하게 Val-Cit인, 링커.
  10. 제 1항, 제 2항 및 제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    X1 및 X2는 동일하고, Cl, Br, (C1-C6)알콕시 및 할로겐, CN, NO2 및 1개 또는 여러 개의 불소 원자와 같은 할로겐 원자로 선택적으로 치환된 아릴옥시로부터 선택된 1개 또는 여러 개의 기로 선택적으로 치환된 아릴옥시로부터 선택되거나,
    X1 및 X2 중 하나는 H 이고, 나머지는 Cl, Br, (C1-C6)알콕시 그리고 할로겐, CN, NO2 및 1개 또는 여러 개의 불소 원자와 같은 할로겐 원자로 선택적으로 치환된 아릴옥시로부터 선택된 1개 또는 여러 개의 기로 선택적으로 치환된 아릴옥시로부터 선택되는, 링커.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
    X3는 y = z = 1이고, Z가 -NR4-(CH2)u-NR5-일 때 또는 c = w = y = 0이고, z'　= 1이고, Z'가 -NR4-(CH2)u-NR5-일 때 H이고, 나머지 경우에 X3는 OH, Cl 또는 N-숙신이미딜옥시인, 링커.
  12. 하기 화학식 (Ⅱ) 또는 이의 염의 링커-약물 컨쥬게이트:
    Figure pct00203
    ,
    여기서 X1 및 X2는 서로 독립적으로 H, 할로겐 원자, (C1-C6)알콕시, 선택적으로 치환된 아릴옥시 또는 -O-(CH2CH2O)rH를 나타내고, 단 X1 및 X2가 동시에 H를 나타내지 않으며;
    L1은 화학식 L1'-(CO-Z')z'의 기를 나타내고, L1'가 -(CH2)n-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 시클로알칸디일, -(CH2)n-아릴렌-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-, -(CH2)n-시클로알칸디일-, -아릴렌-(CH2)p-, -헤테로아릴렌-(CH2)p-, -시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2)n-아릴렌-(CH2)p-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-(CH2)p-, -(CH2)n-시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-아릴렌-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-헤테로아릴렌-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2)n-아릴렌-CH2-CH2-(OCH2CH2)m-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-CH2-CH2-(OCH2CH2)m- 또는 -(CH2)n-시클로알칸디일-CH2-CH2-(OCH2CH2)m-이며;
    각각의 W는 독립적으로 아미노산 단위를 나타내고;
    Y는 PAB-CO-(Z)z-이고, PAB가
    Figure pct00204
    이고 (PAB 단위의 산소가 CO-(Z)z에 연결됨);
    Z는 -NR4-(CH2)u-NR5-, -NR4-(CH2)u-NR5-CO-, -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v- 또는 -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v-CO-이고, NR4 기가 PAB-CO의 CO 기에 연결되고;
    Z'는 -NR4-(CH2)u-NR5- 또는 -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v-이고, NR4 기가 CO-Z'의 CO 기에 연결되고;
    R4 및 R5는 독립적으로 H 또는 (C1-C6)알킬기이고;
    Q는 약물 모이어티를 나타내고;
    c는 0 또는 1, 바람직하게 1이고;
    m은 1 내지 15의 정수이고;
    n은 1 내지 6의 정수이고;
    p는 1 내지 6의 정수이고;
    q는 0, 1 또는 2, 바람직하게 2이고;
    r은 1 내지 24, 명확하게 1 내지 12의 정수이고;
    u는 1 내지 6의 정수이고;
    v는 1 내지 6의 정수이고;
    w는 0 또는 5의 정수, 바람직하게 0 또는 2이고;
    y는 0 또는 1이고;
    z는 0 또는 1이고;
    z'는 0 또는 1이다.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 링커-약물 컨쥬게이트는 하기 화학식 (Ⅱa) 또는 이의 염을 갖고,
    Figure pct00205

    여기서 X1, X2, L1, W, Y, Q, c 및 w는 제 12항에 정의된 바와 같고,
    y는 w가 0일 때 0이고, w가 1 내지 5의 정수일 때 y는 0 또는 1인, 링커-약물 컨쥬게이트.
  14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서,
    L1', W, w, X1 및 X2는 제 3항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 링커-약물 컨쥬게이트.
  15. 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    Q는 아우리스타틴, 안트라사이클린, 캄프토테신, SN-38, 튜불린, 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 듀오카마이신, 아마니틴, 피롤로벤조디아제핀의 잔기, 또는 면역 체크포인트의 활성인자, 예컨대 인터페론 유전자 자극인자 (STING) 작동제의 잔기 또는 인돌아민 2,3-디옥시게나제 (IDO) 저해제의 잔기인, 링커-약물 컨쥬게이트.
  16. 제 12항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,
    Q는
    - 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF), 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 또는 모노메틸 돌라스타틴-10의 잔기 또는 하기 화학식 (C)을 갖는 이의 유도체의 잔기,
    Figure pct00206

    여기서 R1은 H 또는 OH이고,
    R2는 (C1-C6)알킬, COOH, COO-((C1-C6)알킬) 또는 티아졸릴이고,
    R3는 H 또는 (C1-C6)알킬, 구체적으로 (C1-C6)알킬이고,
    X4는 O 또는 NR9이고,
    R9는 H 또는 (C1-C6)알킬이고,
    t는 1 내지 8, 구체적으로 1 내지 6, 유리하게 1 내지 4의 정수, 바람직하게 1 또는 2이고;
    - 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 아다루비신, 2-피롤리노독소루비신, 프로-2-피롤리노독소루비신 또는 PNU-159682의 잔기, 또는 하기 화학식 (A) 또는 (B)의 잔기,
    Figure pct00207
    ;
    - 캄프토테신 또는 SN-38의 잔기;
    - 튜불린 A, 튜불린 B, 튜불린 C 또는 튜불린 D의 잔기;
    - 에스퍼라미신, 칼리케아미신 γ1 또는 N-아세틸 디메틸 히드라지드 칼리케아미신의 잔기;
    - 메이탄신, DM1 또는 DM4의 잔기;
    - 듀오카마이신 A, 듀오카마이신 B1, 듀오카마이신 B2, 듀오카마이신 C1, 듀오카마이신 C2, 듀오카마이신 D, 듀오카마이신 SA 또는 CC-1065의 잔기;
    - α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴 또는 ε-아마니틴의 잔기;
    - 안트라마이신 또는 SGD-1882의 잔기;
    - 하기 화학식 (D)의 잔기,
    Figure pct00208

    여기서 X11 및 X21은 독립적으로 O 또는 S, 바람직하게 O이고,
    X12 및 X22은 독립적으로 OH, SH, O 또는 S이고,
    A11 및 A21은 독립적으로 하기 화학식의 기이고,
    Figure pct00209
    ;
    여기서
    ● Z1은 OR11, NR11R12, O 또는 NR11이고, R11 및 R12가 독립적으로 H, R13 또는 COR13이고, R13이 (C1-C6)알킬, 아릴 또는 아릴(C1-C6)알킬이고,
    ● Z2은 H, NR21R22 또는 NR21이고, R21 및 R22가 독립적으로 H, R23 또는 COR23이고, R23이 (C1-C6)알킬, 아릴 또는 아릴(C1-C6)알킬이고,
    ● Z3은 N 또는 CR33이고, R33이 H 또는 할로겐 원자이고,
    ● Z4는 H 또는 (C1-C6)알킬이고,
    A12 및 A22는 독립적으로 H, OH 또는 F이고,
    A2는 H이거나, A2 및 A22는 다함께 연결되고, A2가 CH2이고, A22가 O이고,
    여기서
    ■ X12가 O 또는 S일 때, 다음으로 X22는 O이 아니고, S가 아니며, Z1은 O가 아니고, NR11이 아니며, Z2는 NR21이 아니고, STING 작동제의 잔기는 X12에 의해 분자의 잔여부에 연결되고;
    ■ X22가 O 또는 S일 때, 다음으로 X12는 O이 아니고, S가 아니며, Z1은 O가 아니고, NR11이 아니며, Z2는 NR21이 아니고, STING 작동제의 잔기는 X22에 의해 분자의 잔여부에 연결되고;
    ■ Z1이 O 또는 NR11일 때, 다음으로 X12는 O이 아니고, S가 아니며, X22는 O가 아니고, S가 아니며, Z2는 NR21이 아니고, STING 작동제의 잔기는 Z1에 의해 분자의 잔여부에 연결되고;
    ■ Z2가 NR21일 때, 다음으로 X12는 O이 아니고, S가 아니며, X22는 O가 아니고, S가 아니며, Z1은 O이 아니고, NR11이 아니며, STING 작동제의 잔기는 Z2에 의해 분자의 잔여부에 연결되는, 링커-약물 컨쥬게이트.
  17. 제 12항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서,
    Q는
    - 하기 화학식 (A)
    Figure pct00210
    ;
    - 하기 화학식 (B)
    Figure pct00211
    ;
    - 하기 화학식 (C)
    Figure pct00212
    ;
    여기서 R1은 H 또는 OH이고,
    R2는 (C1-C6)알킬, COOH, COO-((C1-C6)알킬) 또는 티아졸릴이고,
    R3는 H 또는 (C1-C6)알킬, 구체적으로 (C1-C6)알킬이고,
    X4는 O 또는 NR9이고,
    R9는 H 또는 (C1-C6)알킬이고,
    t는 1 내지 8, 구체적으로 1 내지 6, 유리하게 1 내지 4의 정수, 바람직하게 1 또는 2이고;
    - 하기 화학식 (D)의 잔기,
    Figure pct00213

    여기서 X11 및 X21은 독립적으로 O 또는 S, 바람직하게 O이고,
    X12 및 X22은 독립적으로 OH, SH, O 또는 S이고,
    A11 및 A21은 독립적으로 하기 화학식의 기이고,
    Figure pct00214
    ;
    여기서
    ● Z1은 OR11, NR11R12, O 또는 NR11이고, R11 및 R12가 독립적으로 H, R13 또는 COR13이고, R13이 (C1-C6)알킬, 아릴 또는 아릴(C1-C6)알킬이고,
    ● Z2은 H, NR21R22 또는 NR21이고, R21 및 R22가 독립적으로 H, R23 또는 COR23이고, R23이 (C1-C6)알킬, 아릴 또는 아릴(C1-C6)알킬이고,
    ● Z3은 N 또는 CR33이고, R33이 H 또는 할로겐 원자이고,
    ● Z4는 H 또는 (C1-C6)알킬이고,
    A12 및 A22는 독립적으로 H, OH 또는 F이고,
    A2는 H이거나, A2 및 A22는 다함께 연결되고, A2가 CH2이고, A22가 O이고,
    여기서
    ■ X12가 O 또는 S일 때, 다음으로 X22는 O이 아니고, S가 아니며, Z1은 O가 아니고, NR11이 아니며, Z2는 NR21이 아니고, STING 작동제의 잔기는 X12에 의해 분자의 잔여부에 연결되고;
    ■ X22가 O 또는 S일 때, 다음으로 X12는 O이 아니고, S가 아니며, Z1은 O가 아니고, NR11이 아니며, Z2는 NR21이 아니고, STING 작동제의 잔기는 X22에 의해 분자의 잔여부에 연결되고;
    ■ Z1이 O 또는 NR11일 때, 다음으로 X12는 O이 아니고, S가 아니며, X22는 O가 아니고, S가 아니며, Z2는 NR21이 아니고, STING 작동제의 잔기는 Z1에 의해 분자의 잔여부에 연결되고;
    ■ Z2가 NR21일 때, 다음으로 X12는 O이 아니고, S가 아니며, X22는 O가 아니고, S가 아니며, Z1은 O이 아니고, NR11이 아니며, STING 작동제의 잔기는 Z2에 의해 분자의 잔여부에 연결되는, 링커-약물 컨쥬게이트.
  18. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 링커 또는 제 12항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 약물-링커 컨쥬게이트로서, 펩티드, 단백질, 항체 및 이의 항원 결합 단편으로부터 선택되는, 구체적으로 항체 및 이의 항원 결합 단편으로부터 선택되는 결합 단위에 약물을 공유 결합하는데 사용되는, 링커 또는 약물-링커 컨쥬게이트.
  19. 제 18항에 있어서,
    q는 2인, 링커 또는 약물-링커 컨쥬게이트.
  20. 하기 화학식 (Ⅲ) 또는 (Ⅳ) 또는 이들의 염, 바람직하게 이들의 약제학적으로 허용가능한 염의 결합 단위-약물 컨쥬게이트:
    Figure pct00215
    ,
    Figure pct00216

    여기서 상기 결합 단위는 펩티드, 단백질, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    L1은 화학식 L1'-(CO-Z')z'의 기를 나타내고, L1'이 -(CH2)n-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 시클로알칸디일, -(CH2)n-아릴렌-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-, -(CH2)n-시클로알칸디일-, -아릴렌-(CH2)p-, -헤테로아릴렌-(CH2)p-, -시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2)n-아릴렌-(CH2)p-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-(CH2)p-, -(CH2)n-시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-아릴렌-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-헤테로아릴렌-(CH2)p-, -(CH2CH2O)m-CH2-CH2-시클로알칸디일-(CH2)p-, -(CH2)n-아릴렌-CH2-CH2-(OCH2CH2)m-, -(CH2)n-헤테로아릴렌-CH2-CH2-(OCH2CH2)m- 또는 -(CH2)n-시클로알칸디일-CH2-CH2-(OCH2CH2)m-이며;
    각각의 W는 독립적으로 아미노산 단위를 나타내고;
    Y는 PAB-CO-(Z)z-이고, PAB가
    Figure pct00217
    이고 (PAB 단위의 산소가 CO-(Z)z에 연결됨);
    Z는 -NR4-(CH2)u-NR5-, -NR4-(CH2)u-NR5-CO-, -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v- 또는 -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v-CO-이고, NR4 기가 PAB-CO의 CO 기에 연결되고;
    Z'는 -NR4-(CH2)u-NR5- 또는 -NR4-(CH2)u-NR5-CO-(CH2)v-이고, NR4 기가 CO-Z'의 CO 기에 연결되고;
    R4 및 R5는 독립적으로 H 또는 (C1-C6)알킬기이고;
    Q는 약물 모이어티를 나타내고;
    c는 0 또는 1, 바람직하게 1이고;
    m은 1 내지 15의 정수이고;
    n은 1 내지 6의 정수이고;
    p는 1 내지 6의 정수이고;
    s는 1 내지 8의 정수이고;
    u는 1 내지 6의 정수이고;
    v는 1 내지 6의 정수이고;
    w는 0 또는 5의 정수, 바람직하게 0 또는 2이고;
    y는 0 또는 1이고;
    z는 0 또는 1이고;
    z'는 0 또는 1이다.
  21. 제 20항에 있어서,
    L1', W 및 w는 제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같고/거나, Q는 제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 결합 단위-약물 컨쥬게이트.
  22. 제 20항 또는 제 21항에 있어서,
    상기 결합 단위는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 결합 단위-약물 컨쥬게이트.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 항체는 IGF-1R 항체 또는 HER2 항체인, 결합 단위-약물 컨쥬게이트.
  24. 제 20항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 따른 결합 단위-약물 컨쥬게이트 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  25. 제 20항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 따른 결합 단위-약물 컨쥬게이트 또는 제 24항에 따른 약제학적으로 조성물로서, 전립샘암, 골육종, 폐암, 유방암, 자궁내막암, 교모세포종, 결장암, 위암, 신장암, 췌장암 또는 두경부암과 같은 암의 치료에 사용되는, 결합 단위-약물 컨쥬게이트 또는 약제학적 조성물.
KR1020217012389A 2018-09-27 2019-09-27 설포말레이미드계 링커 및 상응하는 컨쥬게이트 KR20210065991A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18306270.2 2018-09-27
EP18306270 2018-09-27
PCT/IB2019/001114 WO2020065408A1 (en) 2018-09-27 2019-09-27 Sulfomaleimide-based linkers and corresponding conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210065991A true KR20210065991A (ko) 2021-06-04

Family

ID=63857832

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217012389A KR20210065991A (ko) 2018-09-27 2019-09-27 설포말레이미드계 링커 및 상응하는 컨쥬게이트

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20220023438A1 (ko)
EP (1) EP3856258A1 (ko)
JP (1) JP2022502431A (ko)
KR (1) KR20210065991A (ko)
CN (1) CN113453724A (ko)
AU (1) AU2019350536A1 (ko)
BR (1) BR112021005655A2 (ko)
CA (1) CA3113378C (ko)
MX (1) MX2021003295A (ko)
WO (1) WO2020065408A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201908886D0 (en) * 2019-06-20 2019-08-07 Almac Discovery Ltd Anthracycline derivatives

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4127687A (en) * 1976-07-19 1978-11-28 Rohm And Haas Company Prevention of fouling of marine structures such as boat hulls
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
TW258789B (ko) * 1992-09-28 1995-10-01 Rohm & Haas
KR20070110327A (ko) * 2005-03-08 2007-11-16 미쓰비시 가가꾸 가부시키가이샤 이방성 색소 필름용 조성물, 이방성 색소 필름 및 편광소자
JP2007025635A (ja) * 2005-06-17 2007-02-01 Fujitsu Hitachi Plasma Display Ltd プラズマディスプレイ装置及びその処理方法
US20060293374A1 (en) 2005-06-24 2006-12-28 Beers Scott A Substituted isothiazolones
FR3005051A1 (fr) 2013-04-25 2014-10-31 Pf Medicament Derives de la dolastatine 10 et d'auristatines
TN2015000457A1 (en) 2013-04-29 2017-04-06 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods for altering second messenger signaling
US10781259B2 (en) * 2013-06-06 2020-09-22 Magenta Therapeutics, Inc. Modified antibodies and related compounds, compositions, and methods of use
AU2015250759B2 (en) 2014-04-25 2017-11-30 Pierre Fabre Medicament IGF-1R antibody-drug-conjugate and its use for the treatment of cancer
EP3607996B1 (en) 2014-04-25 2023-01-04 Pierre Fabre Medicament Antibody-drug-conjugate and its use for the treatment of cancer
CN106459204B (zh) 2014-04-25 2021-02-02 皮埃尔法布雷医药公司 Igf-1r抗体及其作为定位载体用于治疗癌症的用途
CN104230916B (zh) * 2014-09-30 2020-04-28 上海化学试剂研究所有限公司 一种异噻唑啉酮类化合物及其制备方法和应用
EP3209334A2 (en) * 2014-10-20 2017-08-30 Igenica Biotherapeutics, Inc. Novel antibody-drug conjugates and related compounds, compositions, and methods of use
PL3233882T3 (pl) 2014-12-16 2020-04-30 Kayla Therapeutics Fluorowane cykliczne dinukleotydy do indukcji cytokin
US10449211B2 (en) 2015-03-10 2019-10-22 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for activating “stimulator of interferon gene”—dependent signalling
WO2015151078A2 (en) * 2015-06-15 2015-10-08 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd Hydrophilic linkers for conjugation
WO2017106740A1 (en) 2015-12-16 2017-06-22 Aduro Biotech, Inc. Methods for identifying inhibitors of "stimulator of interferon gene"-dependent interferon production
AU2016202632B2 (en) * 2016-02-04 2021-09-09 Hangzhou Dac Biotech Co, Ltd Specific conjugation linkers, specific immunoconjugates thereof, methods of making and uses such conjugates thereof
JOP20170192A1 (ar) 2016-12-01 2019-01-30 Takeda Pharmaceuticals Co داي نوكليوتيد حلقي

Also Published As

Publication number Publication date
CA3113378C (en) 2024-01-02
US20220023438A1 (en) 2022-01-27
CN113453724A (zh) 2021-09-28
AU2019350536A1 (en) 2021-05-06
EP3856258A1 (en) 2021-08-04
CA3113378A1 (en) 2020-04-02
JP2022502431A (ja) 2022-01-11
BR112021005655A2 (pt) 2021-06-29
MX2021003295A (es) 2021-07-16
WO2020065408A1 (en) 2020-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220105195A1 (en) Antibody-drug-conjugate and its use for the treatment of cancer
KR102215954B1 (ko) 튜부리신 화합물, 그의 제조 및 사용 방법
KR102051503B1 (ko) 항체 약물 접합체에 사용하기 위한 안정성-조정 링커
US20190209704A1 (en) Novel antibody-drug conjugates and related compounds, compositions and methods of use
TWI582112B (zh) 新穎結合劑－藥物接合物（ＡＤＣｓ）及其用途（二）
JP2018502131A (ja) ヘテロアリーレン架橋したベンゾジアゼピン二量体、そのコンジュゲート、ならびに製造および使用方法
CA2973354A1 (en) Benzodiazepine dimers, conjugates thereof, and methods of making and using
CA3082160A1 (en) Anti-mesothelin antibody and antibody drug conjugate thereof
KR101795984B1 (ko) Igf-1r 항체-약물-결합체 및 암의 치료를 위한 그의 용도
JP2018509908A (ja) Ｃｄ４８抗体及びその複合体
KR20170129828A (ko) Cti 약물작용발생단을 함유하는 이관능성 세포독성제
JP2022507781A (ja) Ｌｘｒアゴニストとしての使用のためのビス－オクタヒドロフェナントレンカルボキサミド誘導体及びそのタンパク質コンジュゲート
KR20190039570A (ko) 세코-시클로프로파피롤로인돌 화합물, 그의 항체-약물 접합체, 및 제조 및 사용 방법
TWI831797B (zh) 靶向adam9之免疫接合物及其使用方法
CA3113378C (en) Sulfomaleimide-based linkers and corresponding conjugates
RU2815199C2 (ru) Линкеры на основе сульфомалеимида и соответствующие конъюгаты
WO2024105206A1 (en) Antibody-drug-conjugates cleavable in a tumor microenvironment