JPH0313205B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は歯科用ワクチンとくに歯周炎予防用ま
たは抑制用ワクチン及びその製法に関する。この
明細書において歯周炎というのは、歯周組織すな
わち歯肉、歯根膜、セメント質、歯槽骨に及ぶ広
範囲の炎症のことで、一般に辺縁性歯周炎と根尖
性歯周炎に大別され、前者の代表的なものは歯槽
膿漏である。歯周炎には各種の病型があるが、そ
の原因の一つは、アクチノミセス属、バクテロイ
デス属またはアクチノバチルス属に属する細菌の
増殖による歯牙面への歯后付着、歯周ポケツトの
形成などによる歯周の破壊があげられている。例
えば、アクチノミセス・ビスコージスが庶糖を分
解して強粘着性のレバン多糖体やヘテロ多糖体を
産出し、これらが歯牙面に集塊となつて付着する
と歯周炎の原因となること、及びアクチノミセ
ス・ビスコージス、アクチノミセス・ナイセリン
デイ及びアクチノバチルス・アクチノミセテム・
コミタンスが歯牙面に付着して歯周炎を誘発する
ことが知られている。そしてアクチノミセス・ビ
スコージスやバクテロイデス・ジンジバリスなど
の細菌が歯周炎病集内の細菌の大部分を占めるこ
とも実際にしばしば観察されている。これらの細
菌は菌体表面に線毛を有し、これによつて歯周組
織によく付着することが認められる。 本発明は、歯周炎誘発能を有するアクチノミセ
ス属、バクテロイデス属及びアクチノバチルス属
に属する細菌の菌体表面の線毛成分から単離した
抗原が歯周炎を予防または抑制する作用をもつ抗
原として有用であるとの知見に基いている。歯周
炎の予防法は知られていない。また歯周炎の治療
法として外科的治療法が行なわれている。しかし
歯周炎の予防、抑制、治療にワクチンを用いるこ
とは知られていない。 本発明の目的は、口腔内の細菌によつて誘発ま
たは悪化される歯周炎を予防または抑制するため
の歯科用ワクチンを提供することにある。 本発明によつて提供される歯科用ワクチンは、
歯周炎誘発能または悪化能を有しかつ菌体表層に
線毛を有する口腔内細菌の線毛から単離された抗
原を有効成分とすることを特徴としている。 本発明の目的に利用し得る細菌は、歯周炎誘発
能または悪化能を有しかつ菌体表層に線毛を有
し、これによつて歯牙面または歯周組織に付着し
得るものであれば何でもよいが、これらの細菌の
例は、アクチノミセス・ビスコージス、アクチノ
ミセス・ナイセリンデイ、バクテロイデス・ジン
ジバリス及びアクチノバチルス・アクチノミセテ
ム・コミタンスである。歯周炎誘発能または悪化
能を有しかつ菌体表層の線毛を有し、これによつ
て歯牙面または歯周組織に付着する能力を有する
かぎり、これらの変異株を用いることもできる。 下記の実施例及び試験例において用いられた菌
株のうち、アクチノミセス・ビスコージス変異株
Ｋ−TL＋株（微工研条寄第411号）は、本発明者
が、ヒトの歯周炎病巣から分離した同種の野生株
を公知の変異誘導法で処理して作出した突然変異
株であつて、これをTYC培地やTYC寒天平板培
地で培養すると、培地中の蔗糖を分解して、親株
や公知の他の同種の菌株よりもさらに粘着性の強
い多量のレバン多糖体を生産し、たとえば試験管
内の液体培養では管壁に多くの菌塊が付着する。
継代培養をくり返しても、または公知の変異誘導
処理（ニトロソグアニジンや紫外線照射など）を
行なつても、この菌株の性状は安定で、逆変異や
他の変異株の出現は認められない。ゴールデンハ
ムスターへの経口投与では、この菌株は歯によく
定着し、う蝕誘発飼料でハムスターを飼育する
と、強い歯周炎誘発能の存在が歯槽骨吸収の測定
から認められる。次に実施例および試験例に記載
されたバクテロイデス・ジンジバリス株Ｋ−Bg
−ml株（微工研条寄第410号）は、本発明者がヒ
トの歯周炎病巣から分離した同種の多数の野生株
から、赤血球凝集反応および細胞付着能の強さの
観点から選んだものであつて、他の同種の菌株と
比較すると、口腔粘膜上皮細胞などへの付着能と
赤血球凝集能とが極めて強い菌株である。ゴール
デンハムスターへの経口投与では、この菌株の定
着性は必ずしも良好ではないが、上述のアクチノ
ミセス・ビスコージス変異株Ｋ−TL＋株の感染
定着後、歯周炎発症開始期の前後に経口感染を行
なうと、よく定着する。このような混合感染を行
なうと、上記変異株Ｋ−TL＋株単独感染時より
も、さらに強い歯周炎の出現することが、歯槽骨
吸収測定から認められる。 両菌株の菌学的性状は次の通りである。 (A) アクチノミセス・ビスコージス変異株Ｋ−
TL＋株（微工研条寄第411号） 形 態 (1) 菌型および大きさ 桿菌、1μ×３−4μ、グラム陽性。 発育条件 嫌気性（微好気性） 各種培地における生育状態 (1) TYO寒天平板培地〔PH乱7.2；
Stoppelaar et al、Arch.Oral Biol、12、
1199−1201（1967）〕 辺縁不規則の塊状に隆起した、粗大顆粒
状の多量のレバン多糖体で覆われた、固着
性の白色不透明の硬い集落をつくる。 (2) ブレーンハート・インフエージヨン寒天
平板培地（PH約7.4；米国BBL社製；９cm
シヤーレ） 正円形の大きな隆起の厚い均質の表面と
平滑な辺縁とを有する、無色半透明の集落
をつくる。 (3) トリプトケース・イソプロス（PH7.8；
米国BBL社製） 培地の深部より増殖する。 (4) ドツトヒユーイツトプロス（PH約7.8；
米国BBL社製） 培地の下層部より増殖する。 生理学的性状 (1) レバン多糖体産生 (2) 付着能（試験管壁） (3) 色素の生成 − (4) 生育の範囲 PH ６−8.5 温度 22−39℃ (5) 糖分解 アドニツト − アラビノース − デキストリン − フルクトース ＋ ガラクトース ＋ グルコース − イヌリン − ラクトース − マルトース ＋ マンノース ＋ メリビオース ＋ ラフイノース ＋ シユークロース ＋ キシロース − 諸性状 カタラーゼ ＋ インドール − 硝酸塩還元性 ＋ 硫化水素産生 ＋ ゲラチン水解性 − エスクリン加水分解 ＋ 口腔粘膜上皮細胞付着性 動物に対する感染性 歯周炎発症性（ゴールデンハムスターに対
する歯槽骨吸収により測定） (B) バクテロイデス・ジンジバリス株Ｋ−Bg−
ml株（微工研条寄第410号） 形 態 (1) 菌型および大きさ 桿菌、0.5μ×0.8μ、グラム陰性。 発育条件 偏性嫌気性 各培地における生育状態 (1) 10％血液寒天平板培地（PH約7.3） 正円形、大きな平面扁平、表面および辺
縁平滑なやや光沢のある黒色の集落をつく
り、溶血性は示さない。 (2) バクテロイデス寒天平板培地（PH約
7.2；日水製薬製；９cmシヤーレ） 正円形、やや小さな扁平均質の表面およ
び辺縁平滑な、光沢のある透明な集落をつ
くる。 (3) トリプトケース・イソプロス 培地の下層部より増殖する。 生理学的性状 (1) 色素の形成 − (2) 生育の範囲 PH 5.0−8.5 温 度 22−39℃ (3) 糖分解 アドニトール − アラビノース − デキストリン − フルクトース − ガラクトース − グルコース − イヌリン − ラクトース − マルトース − マンノース − メリビオース − ラフイノース − シユークロース − 諸性状 運動性 − インドール産生 ＋ 硝酸塩還元性 − 硫化水素産性 ＋ ゲラチン水解性 ＋ エスクリン加水分解 − 口腔粘膜上皮細胞付着性 赤血球凝集性 動物に対する感染性 歯周炎発症性（ゴールデンハムスターに対
する歯槽骨吸収により測定） ± 本発明に用いられるアクチノミセス・ナイセリ
ンデイは、米国、アメリカン・タイプ・カルチヤ
ー・コレクシヨン・カタログ、第14版、27頁、
（1980年）に記載されている公知菌である。 本発明に用いる菌株の培養は同種の公知菌株に
常用される培養法で行なうことができる。すなわ
ち培地は天然培地でも合成培地でもよいが、大量
の培養には液体培地での嫌気的培養が適してい
る。培地のPHは5.0−8.0たとえば約7.4で、温度は
22−39℃たとえば37℃が適している。一般に培養
は48−72時間で完了する。実施例および試験例に
おいて用いた培地の組成は下記に通りである。 培地Ａ（PH7.4±） トリプトケースペプトン（米国BBL社製）1.7
％、フアイトンペプトン（同上）0.3％、イース
トエキス（米国デイフコ社製）0.5％、リン酸二
カリウム0.25％、塩化ナトリウム0.5％、ブドー
糖0.25％。 培地Ｂ（PH7.8） 培地Ａにヘミン0.007％を加える。 アクチノミセス・ビスコージスの培養には培地
Ａを、バクテロイデス・ジンジバリスの培養には
培地Ｂを用い、生育菌数約１億／mlを培養完了の
基準とした。 本発明により、歯周炎誘発または悪化能を有し
かつ菌体表層に線毛を有する口腔内細菌またはこ
れらの細菌の歯周炎誘発または悪化能を有する突
然変異株の線毛から、所望の抗原の変性を防ぐに
十分な低温度において所望の抗原を単離すること
を特徴とする、ワクチンの製法が提供される。下
記に実用的な製造法を例示する。 (A) アクチノミセス・ビスコージスの使用例。 培地Ａを用い、温度35−37℃、PH6.5−8.0例
えば約7.5で24時間培養して得た種培養液を同
じ組成の本培地に接種して培養する。本培養の
条件によつて異なるが、通常72時間培養する
と、培地中の生菌数が最高（約１億／ml）とな
る。培養液から例えば遠心処理（8000r.p.m.／
20分間）で菌体を分離する。線毛成分を回収す
るために、菌体を0.5−1M酢酸／酢酸ナトリウ
ム緩衝液（PH6.5）または1M塩化ナトリウム加
0.75Mリン酸塩緩衝液（PH7.0）で処理する。
遠心処理によつて得た上清中に含有される線毛
成分を回収するために、固形硫酸アンモニウム
を直接に上清に加え、撹拌溶解し、４℃で24−
48時間以上静置して線毛成分を沈殿させる。上
清を除去した後、遠心処理（8000r.p.m.／20分
間）により沈殿を回収する。あるいは固形硫酸
アンモニウムを30−70％（例えば33％）飽和に
なるように培養液を加え、溶解後、低温（例え
ば４℃）に24時間以上静置して菌体等を沈殿さ
せ、上清を除き、沈殿部を遠心処理（例、
8000r.p.m.／20分間）して所望の抗原を回収す
る。 上清及び菌体から回収された線毛成分を混合
し、常法、例えば等電点法、エタノールその他
の溶媒分画沈殿法、膜濃縮法、カラム分画法、
硫酸アンモニウムによる塩析法または庶糖密度
勾配遠心法などの単独または組合わせによつ
て、線毛成分を単離精製することができる。 (B) バクテロイデス・ジンジバリス使用例。 培地Ｂを用いて35−37℃でPH6.5−8.0例えば
約7.5で24時間培養して得た種培養液を同じ組
成の培地で本培養する。培養時間は条件により
異なるが、通常72時間で培養が完了する。この
時の培養液の生菌数は約１億／mlである。線毛
成分を培養液及び菌体から回収し分離する方法
は上記Ａの方法に準じることができる。 次に、こうして得られた線毛分分画を0.75M
リン酸塩緩衝食塩水（PH6.2）で、線毛成分分
画の成分がタンパクN0.05mg／ml以上になるよ
うに希釈し、アジユバントとして水酸化アルミ
ニウムゲルをアルミニウムの最終濃度が0.05−
0.2mg／mlとなるように加え、PH6.2に補正し、
防腐剤としてメチロサール0.01％（ｗ／ｖ）を
加える。上記両菌株以外の菌株を用いる場合
も、上記方法に準じて所望の歯科用ワクチンを
製造することができる。抗原を所望により不活
化することも公知である。 本発明によるワクチンを使用する際の投与量
は、歯周炎の病壁、病状等各種の条件によつて
異なるが、通常は、例えばヒトに対して１回
0.2−2.0mlを皮下または筋肉内、とくに口腔粘
膜内に注射する。本ワクチンを投与すると、ヒ
トまたは動物の体内とくに唾液中に免疫抗体の
生成することが認められる。この抗体（主とし
てIg Ａ）は、対応する歯周炎誘発能を有する
同属の野生株の歯周組織への付着や定着を阻止
する作用を有するが、対応する同種野生株の増
殖自体やレバン多糖体の産生能を阻止しない。
しかし、これらの野生株が口腔内で増殖して
も、歯牙面や歯周組織における歯垢形成能が抑
制されることが認められる。例えば２−５週間
おきに２−５回投与または３−12日間連続投与
すると、本発明によるワクチンにより歯周炎の
予防及び抑制を効果的に行ない得ることがわか
つた。 本発明によるワクチンの投与により、対応す
る属の野生株が歯の表面や粘膜に付着するのを
予防し、または歯周炎の悪化を防ぐことができ
る。抑制された野生株は凝集するので、例えば
歯磨剤やウガイ剤の使用により容易に除去する
ことができる。 本発明によるワクチンを公知方法により哺乳
動物に投与することによつて、免疫抗体を動物
の体内に産生し、これを回収することもでき
る。 下記の実施例および試験例における培養は、窒
素ガス（90％）、炭酸ガス（５％）および水素ガ
ス（５％）の混合ガスふんい気下で嫌気的に行な
つた。試験動物はゴールデンハムスターで、動物
数は特記しない限り１群10匹とした。ワクチンと
して、実施例３の方法で得たものを用いた。 実施例 １ アクチノミセス・ビスコージス変異株Ｋ−TL
＋株（微工研条寄第411号）の作出。 ヒトの歯槽膿漏病巣から採取し、菌学的および
血清学的性状からアクチノミセス・ビスコージス
の野外株であることを同定した菌株を、トリプト
ケース・ソイプロス培地（PH7.3；40ml；米国
BBL社製）で37℃、24時間培養した。培溶液を
遠心処理（8000r.p.m.；20分間）して菌体を分離
した。菌体を0.75Mリン酸塩緩衝食塩水（PH
7.0；各200ml）で３回遠心処理（各8000r.p.m.；
20分間）で洗浄後、0.2％ナイトロジエンマスタ
ードを含む0.75Mリン酸塩緩衝食塩水（PH7.0；
10ml）に浮遊し、37℃で菌体数の90％以上が死滅
するまで常温中に保持した（約60−90分間）。こ
の菌体浮遊液を上記方法に準じて、0.75Mリン酸
塩緩衝食塩水（PH7.0；各200ml）で３回遠心処理
して洗浄した。残りの菌体をTYC寒天平板培地
（PH7.4；９cmのシヤーレ；５ml）上に塗り、37
℃、48時間培養後、室温に24時間静置し、できた
集落を観察し、質的に硬い、辺縁不規則な、塊状
の多量のレバン多糖体を形成する集落を選んだ。
所望により、前記と同様の変異誘導、洗浄、選別
をくり返して、レバン多糖体産生能の高い菌株を
分離して純粋培養して、所望の変異株を作出し
た。 実施例 ２ バクテロイデス・ジンジバリス株Ｋ−Bg−ml
株（微工研条寄第410号）の作出。 ヒトの出血性歯周炎の病巣から分離し、菌学的
および血清学的性状からバクテロイデス・ジンジ
バリス野外株と同定した多数の菌株を次の方法で
処理して、赤血球凝集能および細胞付着能が著し
く強い菌株を選んだ。 分離菌株を10％血液寒天平板培地〔血液寒天基
礎培地（米国BBL社製）；PH約7.3；９cmシヤー
レ；18ml〕上で37℃、72時間培養をくり返し、集
落を選別し、それぞれトリプトケース・ソイプロ
ス（前記）20mlに37℃、72−96時間培養した。各
培養液をマイクロタイタープレート法により生理
食塩水（PH7.0）で倍数希釈し、各希釈液（0.025
ml）に0.5％緬羊赤血球浮遊液（0.025ml）を加え
て充分混和して室温に60−120分間静置した。ホ
ール底に赤血球が一面にひろがつているものを凝
集陽性とし、最高希釈倍数の凝集力価を示す菌株
を選んで純化した。所望により、この処理をくり
返した。継代培養をくり返し、また公知の変異誘
導処理を行なつて、性状の安定な菌株であること
を確認し、純粋培養して、本菌株を作出した。 実施例 ３ ワクチンの製造（） アクチノミセス・ビスコージス変異株Ｋ−TL
＋株（微工研条寄第411号）を培地(A)100mlで37
℃、24時間培養した種培養を同じ組成の培地(A)
15000mlに接種し、37℃、48時間培養した。培養
液に固形硫酸アンモニウムを33％飽和になるよう
に加え、溶解後、静置した後、遠心処理（8000r.
p.m.；20分間）して菌体を分離し、1M塩化ナト
リウム加0.75Mリン酸塩緩衝液（PH7.0）150mlに
浮遊し、氷冷下に20KHz、10分間超音波処理し
た。その後、遠心処理（8000r.p.m.；20分間）に
よつて菌体その他の不溶物を除去した。遠心上清
に飽和硫酸アンモニウム溶液を60％飽和になるよ
うに加え、撹拌して40℃、24時間以上静置する。
上清をサイフオンで除去し、沈降部分を遠心処理
（5000r.p.m.；20分間）によつて分離した。この
沈殿を50mlの1M塩化ナトリウム加0.75Mリン酸
塩緩衝液（PH7.0に溶解し、これをセロフアン透
析チユーブに入れ、1M塩化ナトリウム加0.75M
リン酸塩緩衝液（PH7.0）2000ml中で４℃、24時
間以上透析した。 透析内液は遠心処理（10000r.p.m.；30分間）
によつて不純物を除去した。遠心上清は約60ml得
られ、タンパクＮ量は約４−６mg／mlであつた。
これをセロフアン透析チユーブに移し、フエコー
ル400（スエーデン国、フアルマシア・フアイン・
ケミカル社製）で１／10量になるまで濃縮する。
この濃縮液１mlずつを、10−30％の蔗糖密度勾配
液30ml、３本のセルローズチユーブ上にのせ、４
℃で超遠心処理（米国、ベツクマン社、SW
＃25.1ローター；35000r.p.m.；４時間）して分離
する。次にデンシテイグレーデントフラクシヨネ
ーター（米国、イスコ社製、1200型）で１mlずつ
分画を採取した。比重1.38−1.42、蔗糖濃度14−
18％分画で綿毛分画が回収される。この分画のタ
ンパクＮ量は約７−12mg／mlであつた。 実施例 ４ ワクチン製造（） バクテロイデス・ジンジバリス株Ｋ−Bg−ml
株（微工研条寄第410号）を培地(B)100mlで37℃、
48時間培養した種培養を同じ組成の培地(B)15000
mlに接種し、37℃、72時間培養した。培養液を遠
心処理（8000r.p.m.；20分間）して分離した菌体
を1M塩化ナトリウム加0.75Mリン酸塩緩衝液
（PH7.0）200mlに浮遊し、４℃で温和に撹拌しな
がら抽出を行なう。これを遠心処理（10000r.p.
m.；50分間）して菌体と他の不純物を除去する
と、抽出液約200mlが得られた。 培養液遠心上清に10％塩化亜鉛溶液を撹拌しな
がら小量ずつ添加し、最終濃度１％になるように
した。これを10％炭酸ナトリウム溶液でPH6.0に
補正し、４℃で24時間静置して沈降させた。上清
をサイフオンで除去し、沈降部分を遠心分理
（5000r.p.m.；５分間）して集めた。この沈殿に
結晶リン酸二ナトリウム・十二水塩150ｇを加え
てよく練りまぜた。これをガラスフイルターで吸
引過し、さらに10％リン酸二ナトリウム溶液約
30mlを流して洗浄吸引して生成したリン酸亜鉛を
除去すると約90mlの抽出液が得られた。 両抽出液約300mlを混合し、飽和硫酸アンモニ
ウム溶液を60％飽和になるように加え、４℃で48
時間静置して沈降させた。上清を除去し、沈降部
分を遠心処理（5000r.p.m.；５分間）によつて分
離した。この沈殿を10mlの1M塩化ナトリウム加
0.75Mリン酸塩緩衝液（PH7.0）に溶解し、2000
mlの同処方緩衝液中でセロフアン膜透析チユーブ
によつて、４℃で24時間以上透析した。 透析内液を遠心処理（10000r.p.m.；30分間）
して不溶物を除去すると、約30mlの上清が得られ
た。この溶液のタンパルＮ量は約16mg／mlであつ
た。 精製濃縮は実施例３の方法に準じて行なつた。
蔗糖密度勾配超遠心法で比重1.36−1.41、蔗糖濃
度12−16％分画に線毛成分分画が回収された。こ
の分画の混合液の赤血球凝集能は１：25600倍以
上であつた。 実施例 ５ ワクチン製造（） 実施例３および実施例４記載の方法によつてア
クチノミセス・ビスコージスおよびバクテロイデ
ス・ジンジバリスから別々に抽出精製した綿毛成
分分画を、それぞれタンパクＮ量0.5mg／mlずつ
含有するように0.75Mリン酸塩緩衝食塩水（PH
6.2）で希釈し、混合し、アジユバントとして水
酸化アルミニウムゲルをアルミニウム量最終濃度
0.2mg／mlになるように加えて吸着させ、PH6.2に
補正し、これに防腐剤としてチメロサール0.01％
（ｗ／ｖ）を加えた。 試験例 １ 歯周炎予防ワクチンの安全性 実施例３、４及び５により得られたワクチンを
用いて、厚生省告示生物学的製剤基準、Ａ試験法
に準じて、染色試験、無菌試験および急性異常毒
性試験（マウスおよびモルモツト）を行なつた
が、特記すべき異常は認められなかつた。 試験例 ２ 細胞付着性試験 菌株の細胞付着性はGibbons and van Houte
（Infection and Immunity、Apr.1971、P567−
573）の方法に準じてセメントスパチユラで集め
たヒトの口腔粘膜上皮細胞をアール液（PH7.4）
でよく洗浄し、細胞数10⁵／mlになるように同じ
液に浮遊させ、これに菌体10⁶／mlを加え、37℃、
30分間ロツカープレート上でゆつくり振とう（毎
分１回ぐらい）した。この細胞浮遊液を15μmの
メンブランフイルター（米国、ミリポアー社製）
上でアール液を流しながら吸引して洗浄し、付着
した菌数を顕微鏡で調べた。 試験例 ３ (1) 生後21日のゴールデンハムスターを用いて、
本発明によるワクチンの免疫効果を次の方法で
調べた。歯周疾患発症誘発能を有するアクチノ
ミセス・ビスコージス変異株Ｈ−TL＋株（微
工研条寄第411号）を37℃、24時間培地(A)で培
養した培養液と、バクテロイデス・ジンジバリ
ス株Ｋ−Bg−ml株（微工研条寄第410号）を
37℃、24時間培地(B)で培養した培養液とをそれ
ぞれ遠心処理（8000r.p.m.；20分間）し、生理
食塩水（PH7.0）にそれぞれ両菌体を約10億
個／ml含んだ混合浮遊液をつくり、これを試験
動物の頬嚢内に各0.2ml／日、生後45日から７
日間連続投与し、それ以後は各0.2ml週一度の
投与を続けた。投与開始と同時にう蝕誘発飼料
としてダイエツト2000（船橋農場製；日量10−
20ｇ）と脱イオン水とを与えて飼育した。。 本発明ワクチンを生後21、28日令にそれぞれ
0.2ml、35日令に0.4mlずつ頬嚢部皮下に注射し
た。試験動物を80日間飼育したのち、ベントバ
ルビタールで麻酔させ、0.75％塩酸ピロカルピ
ン溶液を体重100ｇ当り0.1ml腹腔内に注射し、
唾液を採取した。その後、全採血して殺し、顎
を剔出し、オートクレーブで121℃、１−２分
間処理した。軟組織を除去し、残部を充分に水
で洗浄したのち乾燥して骨標本とした。 対照両群は試験群と同様に処理されたが、本
発明によるワクチンを投与しなかつた。 投与菌株の口腔内定着の検索は、試験期間中
に適宜滅菌小綿棒で各個体別に上下顎臼歯の頬
側面を強く擦過し採取した被検材料を、ただち
に10％血液寒天平板培地（前記）、バクテロイ
デス寒天平板培地（前記）およびTYC寒天培
地（前記）に37℃、72時間培養し、室温で24時
間静置したのち、各寒天平板培地上に発育した
集落性状と血清学的性状によつて確認した。 (2) 試験群と対照両群との歯槽骨吸収の差を比較
するために、各群の試験動物の全臼歯に発生し
た歯槽骨吸収を築山ら（口腔衛生会誌、第28巻
第３号149頁、1978年）の方法に従つて評価し
た。 試験群および対照両群の各個別に骨標本を20
％硝酸銀溶液で５分間染色し、よく水洗し乾燥
して骨標本とした。 骨標本を顕微鏡で20倍（５×４）弱拡大下で
接限マイクロメーターによつてエナメル−セメ
ントジヤンクシヨンより歯槽骨縁までの距離を
計測して判定した。 (3) 試験群と対照両群との保有抗体の関係を調べ
るために、採取した血清および唾液中の抗体
を、マイクロタイタープレート法による定量凝
集反応、付着抑制試験およびゲル内沈降反応に
よつて比較評価した。 凝集反応の抗原は、本発明によるアクチノミ
セス・ビスコージス変異株Ｋ−TL＋株とバク
テロイデス・ジンジバリス株Ｋ−Bg−ml株を
トツドヒユーイツトプロス〔（米国、BBL社
製）；PH約7.8〕200mlで37℃、24時間培養し、
それぞれの培養液を遠心処理（8000r.p.m.；20
分間）して得られた菌体を、0.2mMグルター
ルアルデヒド加生理食塩水（PH7.0）100mlに浮
遊して37℃で12時間処理した後、遠心処理
（8000r.p.m.；20分間）により菌体を回収し、
それぞれの菌体を生理食塩水（PH7.0）cm²
OD550nm0.50になるように浮遊して両抗原と
した。被検材料の唾液および血清の各希釈
0.025mlにそれぞれの抗原0.025mlを加え、37℃
で４時間反応させた後、５℃で一夜静置して肉
限で判定した。 付着抑制試験は被検材料の唾液または血清を
TYC培地（PH7.2）で10倍希釈したのち、メン
プランフイルター0.45μ（米国、ミリポアー社
製）で無菌過し、これを同培地で２倍希釈
し、各倍希釈液（５ml）にアクチノミセス・ビ
スコージス変異株Ｋ−TL＋株（微工研条寄第
411号）のトツドヒユーイツトブロス培養液
（PH約7.8；10ml；37℃；24時間）0.01mlずつを
接種し、37℃で24時間培養して、各試験管壁へ
の菌塊の付着様態を判定した。 ゲル内沈降反応は、被検材料の唾液液および
血清を、実施例３および実施例４の方法によつて
得られる線毛成分分画をそれぞれ用いて、
Goldman（Goldman J.C.et al.J.Cell.Biology
vol 78、426−440、1980）の方法に準じて0.05M
トリス−塩酸緩衝液（PH7.5）、0.15M塩化ナトリ
ウム、0.5％トリトン−X100（米国、ローム・ア
ンド・ハース社製）0.1％ラウリル硫酸ナトリウ
ムおよび１％アガロース（米国、シグマ社製）に
よつてゲルを調製し、平板内二重拡散法によつて
行なつた。 感染防御試験の成績は第１表に示したように、
対照誘発群で強い歯槽骨吸収がみられるが、免疫
群では抑制され、対照群とほぼ同程度で、明らか
に有意の差を示した。 試験群各被検材料中の抗体は、凝集素は両菌株
に対して一部個体の血清中に低い値がみられたも
のもあつたが、唾液中ではさらに低い値であつ
た。 アクチノミセス・ビスコージスに対する付着抑
制効果（対付着素）はやはり免疫群に認められ、
これは血清中よりも唾液中に強い活性のあること
が認められた。この抑制効果は対照誘発群の一部
にも認められたものでもあつたが、免疫群に比べ
て低い値であつた。 両菌株線毛抽出分画に対するゲル内沈降反応も
免疫群では血清および唾液中に認められたが、他
の試験群では確認できなかつた。 試験期間中の免疫群および対照誘発群の両投与
菌株の定着様態に関しては、アクチノミセス・ビ
スコウジスは全期間を通じて検出されたが免疫群
では菌数が極めて少ないか、あるいは全く検出さ
れなかつた。 バクテロイデス・ジンジバリスは各培養ごとに
検出されたが全く認められない場合も多かつた。
その定着は必ずしも良くなかつた。対照誘発群の
試験後期に、一部の個体から比較的多くの菌が検
出された。

【表】 ＊：アクチノミセス〓ピスコージスに対して。
＊＊：バクテロイデス・ジンジバリスに対して。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 歯周炎誘発能または悪化能を有しかつ菌体表
   層に線毛を有する口腔内細菌の線毛から単離され
   た抗原を有効成分とすることを特徴とする、前記
   細菌の作用によつて誘発または悪化された歯周炎
   を予防または抑制するためのワクチン。 ２ 細菌がアクチノミセス属、バクテロイデス属
   及びアクチノバチルス属に属する細菌である特許
   請求の範囲第１項記載のワクチン。 ３ 細菌がアクチノミセス・ビスコージスまたは
   その突然変異株である特許請求の範囲第２項記載
   のワクチン。 ４ 細菌がアクチノミセス・ビスコージス変異株
   Ｋ−TL＋株（微工研条寄第411号）である特許請
   求の範囲第３項記載のワクチン。 ５ 細菌がアクチノミセス・ナイセルンデイであ
   る特許請求の範囲第３項記載のワクチン。 ６ 細菌がバクテロイデス属に属する細菌である
   特許請求の範囲第１項記載のワクチン。 ７ 細菌がバクテロイデス・ジンジバリスである
   特許請求の範囲第６項記載のワクチン。 ８ 細菌がバクテロイデス・ジンジバリス株Ｋ−
   Bg−ml株（微工研条寄第410号）である特許請
   求の範囲第７項記載のワクチン。 ９ 細菌がアクチノバチルス属に属する細菌であ
   る特許請求の範囲第１項記載のワクチン。 １０ 細菌がアクチノバチルス・アクチノミセテ
   ム・コミタンスである特許請求の範囲第９項記載
   のワクチン。 １１ 歯周炎誘発または悪化能を有しかつ菌体表
   層に線毛を有する口腔内細菌またはこれらの細菌
   の歯周炎誘発または悪化能を有する突然変異株の
   線毛から、所望の抗原の変性を防ぐに十分な低温
   度において所望の抗原を単離することを特徴とす
   る、前記細菌の作用によつて誘発または悪化され
   た歯周炎を予防または抑制するためのワクチンの
   製法。 １２ 単離が10℃以下の温度において行なわれる
   特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １３ 単離工程が、塩化ナトリウムを含む高張緩
   衝液に前記細胞を分散させ、分散液から所望の抗
   原を抽出する工程を含む特許請求の範囲第１１項
   記載の方法。