CN111225684A - 牙周炎疫苗和相关组合物及使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了一种免疫原性组合物、一种含有所述免疫原性组合物的牙周疫苗调配物以及用于治疗或预防牙周疾病的方法，其中所述方法涉及向受试者施用免疫有效量的所述组合物或疫苗调配物。所述免疫原性组合物含有至少一种多肽，所述多肽包括：Mfa1抗原序列，其与来自卟啉单胞菌的Mfa1纤毛素蛋白的免疫原性氨基酸序列基本上同源；和HA1抗原序列、HA2抗原序列或HA1抗原序列和HA2抗原序列两者，其中所述HA1抗原序列与来自卟啉单胞菌的RgpA牙龈蛋白酶蛋白中含有的RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域1的免疫原性氨基酸序列基本上同源，并且所述HA2抗原序列与来自卟啉单胞菌的RgpA牙龈蛋白酶蛋白中含有的RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域2的免疫原性氨基酸序列基本上同源。

Description

牙周炎疫苗和相关组合物及使用方法

技术领域

本发明总体上涉及牙周炎的预防和治疗，并且更特别地涉及牙周疫苗组合物及其使用方法。

背景技术

牙周疾病被统称为“牙周炎”，是常见但复杂的慢性口腔炎性疾病，其会破坏支撑牙齿的软组织和硬组织。如果不治疗，牙齿周围的牙槽骨的流失会导致牙齿松动并随后缺失。牙周疾病是人类最常见的细菌性疾病之一，最近的研究表明，在美国40岁以上的人群中，大约60％患有中度或重度牙周炎，并且其口腔骨质流失可测量。牙周炎的患病率随年龄增长而增加；参见Eke等人(2012)，《牙科研究杂志(J.Dent.Res.)》，91(10):914-920。全球估计有5-20％的人患有严重的普遍性牙周疾病(Burt等人(2005)，《牙周病学杂志(J.Periodontol.)》，76(8):1406-19)，通常会导致中年人的多发性牙齿缺失，并且这种疾病的经济负担非常高，其中2010年的数据估计仅在美国就造成了540亿美元的经济影响(Listl等人(2015)，《牙科研究杂志(J.Dent.Res.)》，94(10):1355-61。

牙周炎根据严重程度和分类体系中的病因进行表征，具有七个公认的主要类别：(1)涉及牙龈炎症的牙龈疾病或“牙龈炎”；(2)慢性牙周炎，一种缓慢进展的疾病，可能是局部性的也可能是普遍性的；(3)早发性或“侵袭性”牙周炎；(4)与全身性疾病(例如，糖尿病、AIDS和白血病)相关的牙周炎；(5)坏死性牙周疾病；(6)牙周脓肿；和(7)与牙髓病变相关的牙周炎。后六类被称为“破坏性”牙周疾病，因为所造成的损害是不可逆的。参见Armitage(1999)，《牙周病学年鉴(Ann.Periodontol.)》，4(1):1-6。牙周炎的症状包含牙龈发炎或出血、牙龈萎缩、牙齿和牙龈之间的牙周袋以及在重度牙周炎的情况下的牙齿松动或缺失。治疗将取决于疾病的程度和病因，包含刮治、根面平整、抗生素治疗和手术。刮治和根面平整通常必须进行多次，抗生素治疗可能会存在问题，因为有益的口腔微生物会与病原菌一起被杀死，并且口腔手术通常是不希望的最后解决方案。

牙周炎是由存在关键性细菌(例如，牙龈卟啉单胞菌)引起的。卟啉单胞菌生物体具有一系列影响其整体毒力的分子，包含菌毛和牙龈蛋白酶(一组半胱氨酸蛋白酶)，其会影响疾病发病机理的各个方面，包含细菌与细胞和其它群落微生物的附着、炎症的发展以及与牙周疾病相关的微生物失调；参见Lamont等人(1998)，《微生物学与分子生物学综述(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)》，62(4):1244-63，和Bostanci等人(2012)，《FEMS微生物学快报(FEMS Microbiol.Lett.)》，333(1):1-9。已经研究了其中几种细菌毒力因子作为疫苗开发的潜在靶标。参见例如Lamont等人，同上；Arjunan等人(2016)，《分子口腔微生物学(Mol.Oral Microbiol.)》，31(1):78093；Takahashi等人(2006)，《细胞微生物学(CellMicrobiol.)》，8(5):738-57；Malek等人(1994)，《细菌学杂志(J.Bacteriol.)》176(4):1-52-9)；Gibson等人(2001)，《感染与免疫(Infect.Immun.)》，69(12):7959-63；和Evans等人(1992)，《感染与免疫(Infect.Immun.)》，60(7):2926-35。

一种用于治疗牙周炎(并可能还预防牙周炎)的疫苗将消除对重复临床干预和/或口腔手术的需求。对于牙周疾病的有效治疗和/或预防性疫苗的开发将尤其有用，因为所述疾病发生在很大一部分成年人口中。然而，牙周炎是一种多因素疾病，这些因素包含牙菌斑的细菌组成、宿主基因组成以及对牙周疾病发病机理的基本理解和靶向疫苗开发的潜力造成独特障碍的环境因素。

理想的牙周炎疫苗将在患有牙周炎的受试者中达到治疗效果，并且在预防方面也有效。消除了对积极临床干预的需要，并且患有牙周疾病的个体数量将大大地减少。另外，理想的疫苗将使用适合大规模生产的具有成本效益的工艺来直接制造。

发明内容

本发明针对本领域中的前述需求，并且提供了一种免疫原性组合物、一种包括所述组合物的疫苗调配物以及用于治疗和预防牙周疾病的方法。

在第一实施例中，提供了一种包括至少一种多肽的免疫原性组合物，所述至少一种多肽包括：(a)Mfa1抗原序列，其与来自卟啉单胞菌的Mfa1纤毛素(fimbrilin)蛋白的免疫原性氨基酸序列基本上同源；和(b)HA1抗原序列、HA2抗原序列或HA1抗原序列和HA2抗原序列两者，其中(i)HA1抗原序列与来自卟啉单胞菌的RgpA牙龈蛋白酶蛋白中含有的RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域1(在本文中还被称为“牙龈蛋白酶HA1”或“HA1”)的免疫原性氨基酸序列基本上同源，并且(ii)HA2抗原序列与来自卟啉单胞菌的RgpA牙龈蛋白酶蛋白中含有的RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域2(在本文中还被称为“牙龈蛋白酶HA1”或“HA1”)的免疫原性氨基酸序列基本上同源。

在本实施例的一个方面，所述至少一种多肽包括第一多肽，所述第一多肽包括：(a)Mfa1抗原序列和HA1抗原序列；(b)Mfa1抗原序列和HA2抗原序列；或(c)Mfa1抗原序列、HA1抗原序列和HA2抗原序列。因此，应当理解，第一多肽可以是融合蛋白，其包含Mfa1抗原序列以及HA1抗原序列和/或HA2抗原序列。在一个相关方面，所述至少一种多肽包括(a)第一多肽，所述第一多肽包括Mfa1抗原序列；和(b)第二多肽，所述第二多肽包括HA1抗原序列、HA2抗原序列或HA1抗原序列和HA2抗原序列两者。因此，在本方面，Mfa1抗原序列在一种多肽内，并且HA1和HA2抗原序列在第二多肽内，如果两者都存在，则所述第二多肽是融合多肽。

在本实施例的另一方面，免疫原性组合物的所述至少一种多肽包括包括Mfa1抗原序列的第一多肽、包括HA1抗原序列的第二多肽和包括HA2抗原序列的第三多肽。因此，在本方面，存在三种不同的多肽，每种多肽含有Mfa 1、HA1和HA2抗原序列中的一个。

在一个相关方面，Mfa1抗原序列、HA1抗原序列和HA2抗原序列分别与卟啉单胞菌种的Mfa1纤毛素多肽、牙龈蛋白酶HA1和牙龈蛋白酶HA2的免疫原性氨基酸序列基本上同源，所述卟啉单胞菌种选自牙龈卟啉单胞菌、动物嘴卟啉单胞菌(P.gulae)、犬牙龈卟啉单胞菌、犬齿龈卟啉单胞菌、犬嘴卟啉单胞菌、唾液卟啉单胞菌和牙周卟啉单胞菌。

在本实施例的另一方面，Mfa1抗原序列、HA1抗原序列和HA2抗原序列分别与牙龈卟啉单胞菌的Mfa1纤毛素多肽、牙龈蛋白酶HA1和牙龈蛋白酶HA2的免疫原性氨基酸序列基本上同源。

在本实施例的另一方面，Mfa1抗原序列、HA1抗原序列和HA2抗原序列分别与动物嘴卟啉单胞菌的Mfa1纤毛素多肽、牙龈蛋白酶HA1和牙龈蛋白酶HA2的免疫原性氨基酸序列基本上同源。

在本发明的另一实施例中，提供了一种牙周炎疫苗调配物，其包括如上所述的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂。在通常的情况下，调配物含有至少一种赋形剂，其中所述至少一种赋形剂选自媒剂、增溶剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、缓冲体系、分散剂、稀释剂、粘度调节剂和吸收促进剂。疫苗可以另外地或可替代地包含至少一种佐剂。

在本实施例的一个方面，疫苗调配物被调配成无菌注射溶液。在本实施例的一个相关方面，疫苗调配物被调配成冻干组合物，其应在使用前重新水化。

在另一实施例中，提供了一种通过向受试者施用免疫学有效量的本发明的免疫原性组合物来使受试者免疫牙周疾病的方法。在本实施例的一个方面，所述方法涉及治疗表现出牙周炎症状的受试者中的牙周炎。在本实施例的另一方面，所述方法涉及降低受试者中牙周炎发展风险，所述受试者可能具有发展牙周炎的易感性，包含中度至重度牙周炎，其中所述易感性与风险因素(例如，年龄、遗传易感性、免疫低下状态、增加牙周炎发展风险的全身性疾病、牙髓病变或脓肿的存在或其它风险因素)相关。增加中度至重度牙周炎发展风险的全身性疾病的实例包含糖尿病、AIDS、白血病和唐氏综合征。

附图说明

图1提供了通过无细胞蛋白质合成生成的纯化多肽Mfa1、HA1和HA2的SDS-PAGE分析。

图2提供了针对牙龈卟啉单胞菌Mfa1、HA1和HA2的血清IgG EC₅₀值。动物组G1-G6用作对照或实验组，并且在口腔激发之前(接种疫苗后；空心柱)或处死时(实心柱)从动物收集血清样品，并从针对牙龈卟啉单胞菌(A)Mfa1、(B)HA1和(C)HA2的ELISA数据计算分子特异性IgG EC₅₀值。

图3示出了评价牙周炎疫苗调配物对体内口腔骨质流失的作用的实验结果。

具体实施方式

1.术语和定义：

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。以下定义了对本发明的描述特别重要的具体术语。

除非上下文另外明确指出，否则在本说明书和所附权利要求书中，单数形式的“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指示物。因此，例如，“一种多肽”不仅是指单种多肽，而且是指可以组合或不组合的两种或两种以上不同多肽的组合，“佐剂”是指单种佐剂以及可以分开或组合成单一组合物的两种或两种以上佐剂，等等。

“生物分子(biomolecule)”在本文中也被称为“生物分子(biologicalmolecule)”，是任何有机分子，无论是全部或部分天然存在的、重组产生的、化学合成的、还是化学或生物修饰的，即其曾经是或可能是活生物体的一部分。所述术语涵盖例如多肽、肽片段、氨基酸、多糖、脂质等。

术语“多肽”旨在包含包含一个或多个氨基酸的任何结构，因此包含二肽、寡肽、多肽、多肽片段和蛋白质。形成多肽的全部或一部分的氨基酸可以是二十种常规的天然存在的氨基酸中的任何一种，即丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)，以及非常规的氨基酸，例如常规氨基酸的异构体和修饰，例如D-氨基酸、非蛋白质氨基酸、翻译后修饰的氨基酸、酶修饰的氨基酸、β-氨基酸、被设计成模拟氨基酸的构建体或结构(例如，α,β-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、β-丙氨酸、萘基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-羟基脯氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸和正亮氨酸)，以及其它非常规的氨基酸(例如，在授予Rosenberg等人的美国专利第5,679,782中所述)。本文所述的多肽可以包含带有能够与第二抗原(例如，多糖)缀合的官能团的一个或多个非天然氨基酸。多肽可以是(a)天然存在的，(b)通过化学合成产生的，(c)通过重组DNA技术产生的，(d)通过较大分子的生物化学或酶促裂解产生的，(e)通过由上文列出的方法(a)至(d)的组合形成的方法产生的，或(f)通过下文所述的用于产生肽的任何其它方式(例如，无细胞蛋白质合成)产生的。

在聚合生物分子序列(例如，多肽序列)的上下文中，术语“序列同一性”、“序列同源性百分比”和“序列同源性”是指当比较和比对以在给定的长度(比较窗口)上获得最大对应关系(如使用序列比较算法(例如，BLASTP或Smith-Waterman同源性搜索算法)测量)时相同或具有相同的氨基酸残基(或核苷酸、或构成聚合生物分子的其它类型的单体单元)的指定百分比的两个或两个以上序列。在本上下文中，可以在生物分子的全长或仅一部分上确定序列同源性百分比。一种用于计算序列同源性百分比的方法是BLASTP程序(其默认值设置为字长(W)为3，期望值(E)为10)和BLOSUM62评分矩阵；参见例如Henikoff等人(1989)，《美国科学学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，89:10915。使用提供的默认参数，采用GCG Wisconsin软件包(Accelrys，Madison Wis)中的BESTFIT或GAP程序进行序列比对和序列同一性％的示例性确定。如果这些优选的计算序列同一性的方法给出不同量，则以给出较高序列同一性的方法为准。

术语“基本上同源”是指在给定长度(例如，多肽的“x”个氨基酸)上至少约50％(因此包含例如至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约99％和100％)的序列同源性百分比。

“重组”多肽是指通过重组DNA技术产生的多肽，即从由编码所需多肽的外源DNA构建体转化的细胞产生的多肽。“合成”多肽是通过化学合成制备的那些。

如本文使用，术语“免疫原性”是指抗原(例如，多肽)引发免疫应答的能力，所述免疫应答是体液免疫应答或细胞免疫应答，并且优选地包括两者。在一个优选实施例中，受试者将表现出对“有效量”或“免疫有效量”的本文中的免疫原性组合物的施用的治疗性或保护性免疫应答，使得将增强对新感染的抗性和/或将降低牙周疾病的临床严重程度。免疫应答通常将通过减轻或消除与感染相关的至少一种症状来证明。

如本文使用，当术语“纯化的”用于指分子时，是指所纯化的分子的浓度相对于分子在其天然环境中的浓度有所增加。所述术语还可以是指从反应混合物中纯化化学合成分子，其中所述分子已经作为反应产物生成。如本文使用，当术语“分离的”用于指分子时，所述术语是指所述分子已经从其天然环境中去除。例如，天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但从其天然状态下的共存材料分离的相同多核苷酸或多肽是“分离的”。分离的部分，无论是从天然环境分离还是从非天然环境分离(例如，重组表达、无细胞表达、化学合成等)，优选为至少1％纯、5％纯、10％纯、20％纯、30％纯、40％纯、50％纯、60％纯、70％纯、80％纯、90％纯、95％纯或99％纯，或者它们可以是100％纯。如本文使用，术语“％纯”表示按重量计由目标分子组成的组合物的百分比。

如本文使用，术语多肽或其它生物分子的“分子量”是指通过尺寸排阻色谱法(SEC)结合多角度激光散射(MALS)计算的分子量。

术语“治疗”是指通过施用本发明的免疫原性组合物或疫苗调配物进行治疗，其中目的是减轻或消除感染。例如，“治疗”可以包含直接影响、阻遏、抑制和消除感染，以及降低其严重程度，延迟其发作和/或减轻与感染相关的症状。除非上下文另有明确指示或暗示，否则术语“治疗”涵盖“预防(preventing)”(或预防(prophylaxis)或预防性治疗)，其中“预防”可以是指降低受试者发生感染的风险，延迟症状发作，预防感染复发或防止感染发展。

2.免疫原性组合物和疫苗调配物：

在本发明的第一实施例中，提供了一种免疫原性组合物，其包含至少一种多肽，所述至少一种多肽包括：(a)Mfa1抗原序列，其与来自卟啉单胞菌的Mfa1纤毛素蛋白的免疫原性氨基酸序列基本上同源；和(b)HA1抗原序列和/或HA2抗原序列，其中HA1抗原序列与来自卟啉单胞菌牙龈蛋白酶HA1的免疫原性氨基酸序列基本上同源，并且HA2抗原序列与来自卟啉单胞菌牙龈蛋白酶HA2的免疫原性氨基酸序列基本上同源。所述至少一种多肽可以是含有Mfa1抗原序列、HA1抗原序列和HA2抗原序列的融合蛋白。所述至少一种多肽也可以是含有Mfa1抗原序列和HA1抗原序列的融合蛋白，或者是含有Mfa1抗原序列和HA2抗原序列的融合蛋白。在此实施例的一个变体中，所述至少一种多肽可以包括包含Mfa1抗原序列的第一多肽和包含HA1抗原序列和HA2抗原序列中的任一者或二者的第二多肽。

然而，在一个优选实施例中，免疫原性组合物中的所述至少一种多肽包括两种不同的多肽：含有Mfa1抗原序列的第一多肽和含有HA1抗原序列或HA2抗原序列的第二多肽。在另一优选实施例中，免疫原性组合物中的所述至少一种多肽包括三种不同的多肽：含有Mfa1抗原序列的第一多肽、含有HA1抗原序列的第二多肽和含有HA2抗原序列的第三多肽。

如上所讨论，Mfa1抗原序列与来自卟啉单胞菌的Mfa1纤毛素蛋白的免疫原性氨基酸序列基本上同源，HA1抗原序列与来自卟啉单胞菌牙龈蛋白酶HA1的免疫原性氨基酸序列基本上同源，并且HA2抗原序列与来自卟啉单胞菌牙龈蛋白酶HA2的免疫原性氨基酸序列基本上同源。这三种抗原中的免疫原性序列可以共同或分别为全长蛋白质或结构域(即Mfa 1蛋白、RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域1和/或RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域2)或此蛋白质或结构域的部分(或片段)，只要所选择的部分产生的组合物具有对卟啉单胞菌感染生成治疗性或预防性免疫原性应答的能力。通常，完整蛋白质或结构域的这些免疫原性部分或片段的长度为至少20个氨基酸残基。只要保持所需的免疫原性性质，抗原序列所基于的蛋白质或结构域序列的长度就是设计选择的问题，并且可以为至少20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基，直至并包含全长蛋白质或结构域。因此，本发明的多肽内包括的抗原性序列与来自天然蛋白质或结构域序列的全长或部分的这些免疫原性氨基酸序列基本上同源(即Mfa1纤毛素蛋白、RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域1和/或RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域2)。通常，一般出于与多肽生产的方法或效率有关的原因，本发明的多肽内包括的抗原性序列不是它们所对应的天然免疫原性序列的精确拷贝。例如，由于加入了起始密码子，经常存在N末端甲硫氨酰基，其可以被视为在抗原性序列之外以计算最大同一性或同源性百分比。只要多肽中仍然存在有用的免疫原性性质，还可以发生加入、缺失和取代(通常是保守取代)。因此，可以理解，本发明可以用包括(内含包括或整体包括)表示抗原性序列(即Mfa1抗原序列、HA1抗原序列或HA2抗原序列)的氨基酸残基序列的多肽来进行，所述抗原性序列与在相对应的蛋白质或结构域内发现的免疫原性氨基酸残基序列基本上同源，其中免疫原性氨基酸残基序列是全长蛋白质或结构域或其部分或片段。针对其测量抗原性序列的基本同源性的这些免疫原性氨基酸残基序列分别是全长蛋白质或结构域或其部分(其长度为至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或100个氨基酸残基)。通常，这些抗原性序列与针对其测量抗原性序列的基本同源性的免疫原性氨基酸残基序列至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同源。在动物或人类中的常规检测可以容易地证明基于全长细菌蛋白质或结构域的一部分的本发明的组合物是否对所述细菌的感染生成治疗性或预防性免疫原性应答。

Mfa1纤毛素蛋白来自卟啉单胞菌，并且RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域1和2含在RgpA牙龈蛋白酶蛋白中，所述RgpA牙龈蛋白酶蛋白也来自卟啉单胞菌，其中卟啉单胞菌可以是各种卟啉单胞菌种中任何一种，包含牙龈卟啉单胞菌、动物嘴卟啉单胞菌、犬牙龈卟啉单胞菌、犬齿龈卟啉单胞菌、犬嘴卟啉单胞菌、唾液卟啉单胞菌和牙周卟啉单胞菌。

在一个优选实施例中，Mfa1纤毛素蛋白来自牙龈卟啉单胞菌。本上下文中的含有具有Mfa1抗原序列的至少一种多肽的免疫学有效量的组合物的施用将诱导生成抗Mfa1抗体的免疫应答，从而破坏牙龈卟啉单胞菌感染进行的一种或多种致病途径。在本实施例中，Mfa1抗原序列与来自牙龈卟啉单胞菌的Mfa1纤毛素蛋白(例如，来自具有SEQ ID NO:1的氨基酸的牙龈卟啉单胞菌Mfa1纤毛素蛋白)的免疫原性氨基酸序列基本上同源。

如下文实验部分中所述制备的牙龈卟啉单胞菌Mfa1纤毛素多肽含有552个氨基酸(本SEQ ID和以下SEQ ID包含从下述用于无细胞合成的起始密码子加入N末端甲硫氨酰基)，其分子量为60,018，其中为方便起见，以下再现了SEQ ID NO:1的氨基酸序列：

MGNGPDPDNAAKSYMSMTLSMPMGSARDGQNQDNPQYNFVGEWAGKDKIEKVSIYMVPQGGPGLVESAEDLDFGTYYDAPTQEAGSNNVILKPKKGIKVNSAVGKTVKVYVVLNDIAGKAKALLANVNAVDFEAKFKEVIELSTQAQALGTVADGPNPATAAGKIAKKNGVDNETIMMTCFEPSAPLTIEAAVSEANAIAGVKNQAKVTVERSVARAMVSTKAESYEIKATTQIGSIAAGDVLATVSDIRWVVAQGERKQYLSKKRGTVPENTWVTPGSDYISTNANFHAQATMYYDYTGLWDDHNADPTMVSGTKVPTLANYQLQDVTDELAQRLSGKFLLPNTHKSGIDAATSHYKRGNTAYVLVRAKFTPKKEAFIDKGKDYTDGTPVPEYTDGDDFFVGENGQFYVSMKSVTDPKVGGVAGMKAHKYVKGKVLYYAWLNPSTTSPDSWWNSPVVRNNIYHIHIKSIKKLGFNWNPLVPNPQNPNDPNGPINPNNPDPNPDEPGTPIPTDPEQPLPDQDTFMSVEVTVLPWKVHSYEVDL

在本实施例中，Mfa1抗原序列与来自牙龈卟啉单胞菌的Mfa1纤毛素蛋白的免疫原性氨基酸序列基本上同源，优选但非必要的是，HA1抗原序列可以与来自牙龈卟啉单胞菌RgpA牙龈蛋白酶蛋白中含有的RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域1(HA1)的免疫原性氨基酸序列基本上同源，其中例如免疫原性氨基酸序列可以来自具有SEQ ID NO:2的HA1。类似地，在本实施例中，优选的是，HA2抗原序列可以与来自牙龈卟啉单胞菌RgpA牙龈蛋白酶蛋白中含有的RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域2(HA2)的免疫原性氨基酸序列基本上同源，其中免疫原性氨基酸序列可以来自具有SEQ ID NO:3的HA2。

如下文所述制备的牙龈卟啉单胞牙龈蛋白酶HA1含有176个氨基酸，其分子量为19,059，其中为方便起见，以下再现了SEQ ID NO:2的氨基酸序列：

MLSESFENGIPASWKTIDADGDGHGWKPGNAPGIAGYNSNGCVYSESFGLGGIGVLTPDNYLITPALDLPNGGKLTFWVCAQDANYASEHYAVYASSTGNDASNFTNALLEETITAKGVRSPEAIRGRIQGTWRQKTVDLPAGTKYVAFRHFQSTDMFYIDLDEVEI

同样如下文所述制备的牙龈卟啉单胞牙龈蛋白酶HA2含有442个氨基酸，其分子量为48,299，其中以下再现了SEQ ID NO:3的氨基酸序列：

MFTETFESSTHGEAPAEWTTIDADGDGQDWLCLSSGQLDWLTAHGGTNVVASFSWNGMALNPDNYLISKDVTGATKVKYYYAVNDGFPGDHYAVMISKTGTNAGDFTVVFEETPNGINKGGARFGLSTEANGAKPQSVWIERTVDLPAGTKYVAFRHYNCSDLNYILLDDIQFTMGGSPTPTDYTYTVYRDGTKIKEGLTETTFEEDGVATGNHEYCVEVKYTAGVSPKVCVNVTINPTQFNPVKNLKAQPDGGDVVLKWEAPSGKRGELLNEDFEGDAIPTGWTALDADGDGNNWDITLNEFTRGERHVLSPLRASNVAISYSSLLQGQEYLPLTPNNFLITPKVEGAKKITYKVGSPGLPQWSHDHYALCISKSGTAAADFEVIFEETMTYTQGGANLTREKDLPAGTKYVAFRHYNCTDVLGIMIDDVVI

据信，在单个免疫原性组合物中的一种或多种多肽中将Mfa1抗原序列与HA1抗原序列和HA2抗原序列中的任一者或二者组合，靶向了与卟啉单胞菌感染相关的牙周疾病的致病性进展中涉及的多种机制，即与Mfa1纤毛素蛋白以及RgpA牙龈蛋白酶蛋白相关的机制。

在另一实施例中，Mfa1纤毛素蛋白来自动物嘴卟啉单胞菌。在此情况下，Mfa1抗原序列与来自动物嘴卟啉单胞菌的Mfa1纤毛素蛋白(例如，来自具有SEQ ID NO:4的氨基酸的动物嘴卟啉单胞菌Mfa1纤毛素蛋白)的免疫原性氨基酸序列基本上同源。如关于牙龈卟啉单胞菌解释，HA1抗原序列和HA2抗原序列应分别与来自动物嘴卟啉单胞菌生物体的RgpA牙龈蛋白酶蛋白中含有的RgpA血凝素结构域1和RgpA血凝素结构域2的免疫原性氨基酸序列同源。来自动物嘴卟啉单胞菌HA1的免疫原性氨基酸序列可以来自SEQ ID NO:5，并且来自动物嘴卟啉单胞菌HA2的免疫原性氨基酸序列可以来自SEQ ID NO:6。

动物嘴卟啉单胞菌Mfa1纤毛素多肽(SEQ ID NO:4)：

MGNGPDPDNAAKSYMSMTLSMPLGSARAGDGQDQPNPDYNYVGEWAGKDKIEKVSIYMVPQGGPGLVESAEDLDFSTYYDAPTQDPGSNNVILKPKKGIK

VNSAVGKTVKVYVVLNDIAGKAKALLANVNAADFDAKFKEVIELSTQAEAVSQANAFNGTAAGKIAKKNGATDETIMMTCLQPSDALTIEAAVSEANAIAGVKNQAKVTVERSVARAMLSTKADTFEILAANQIGEIAAGSVLATITDIRWVVAQGERRQYLSKKRGTIQENTWVTPGSDFVPTSSTFHTNATEYYDYAGWEDHNTDPTVISGTQVPTLADYQLQNVTDELAQSLSGKFLLPNTHKSGTDAATSHYKRGNTAYVLIRAKFTPKKEAFIDKGKTYTDGTQVPEYEADQDFFVGENGQFYVSMKSVTDPKVGGVTGMKAHKYVKGKVLYYAWLNPSTTSPDTWWNSPVVRNNIYHIHIKSIKKLGFNWNPLVPDPNPNDPVNPNNPDPNPDEPGTPVPTD DPEQPLPDQDTFMSVEVTVLPWKVHSYEVDL

动物嘴卟啉单胞菌牙龈蛋白酶HA1(SEQ ID NO:5)：

MTESFDGGIPATWTLIDADGDGHGWKHGKAPGVAGYNSNGCVYSESFGLGGIGVLTPDNYLITPALNLPNGGKLTFWVCAQDAAYASEHYAVYASSTGNAASNFTNALLEETLTAKGVRSPEAIRGRVQGTWYQKTVDLPAGTKYVAFRHFQSTDMFYIDIDEVEI

动物嘴卟啉单胞菌牙龈蛋白酶HA2(SEQ ID NO:6)：

MNAKRSELLNENFEGDDIPAGWTALDADGDGNNWGVQLNQFTRGEREALAPLRASNVAISYSSLNQGGGYLPLTPNNFLITPKVEGAKKISYKVGSPGNQSWSHDHYALCISKTGTAASDFEIIFEETMVYSQGGANFTREKDLPDGTKYVAFRHYNCTDVLAIVIDDVVITG

因此，本免疫原性组合物包含：

(1)免疫原性组合物，其包括(a)牙龈卟啉单胞菌Mfa1抗原序列，其与来自具有SEQID NO:1的牙龈卟啉单胞菌Mfa1纤毛素蛋白的免疫原性氨基酸序列基本上同源，和(b)牙龈卟啉单胞菌HA1抗原序列，其与来自牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶HA1(SEQ ID NO:2)的免疫原性氨基酸序列基本上同源；

(2)免疫原性组合物，其包括(a)牙龈卟啉单胞菌Mfa1抗原序列，其与来自具有SEQID NO:1的牙龈卟啉单胞菌Mfa1纤毛素蛋白的免疫原性氨基酸序列基本上同源，和(b)牙龈卟啉单胞菌HA2抗原序列，其与来自牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶HA2(SEQ ID NO:3)的免疫原性氨基酸序列基本上同源；

(3)免疫原性组合物，其包括(a)牙龈卟啉单胞菌Mfa1抗原序列，其与来自具有SEQID NO:1的牙龈卟啉单胞菌Mfa1纤毛素蛋白的免疫原性氨基酸序列基本上同源，(b)牙龈卟啉单胞菌HA1抗原序列，其与来自牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶HA1(SEQ ID NO:2)的免疫原性氨基酸序列基本上同源，和(c)牙龈卟啉单胞菌HA2抗原序列，其与来自牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶HA2(SEQ ID NO:3)的免疫原性氨基酸序列基本上同源；

(4)免疫原性组合物，其包括(a)动物嘴卟啉单胞菌Mfa1抗原序列，其与来自具有SEQ ID NO:4的动物嘴卟啉单胞菌Mfa1纤毛素蛋白的免疫原性氨基酸序列基本上同源，和(b)动物嘴卟啉单胞菌HA1抗原序列，其与来自动物嘴卟啉单胞菌牙龈蛋白酶HA1(SEQ IDNO:5)的免疫原性氨基酸序列基本上同源；

(5)免疫原性组合物，其包括(a)动物嘴卟啉单胞菌Mfa1抗原序列，其与来自具有SEQ ID NO:4的动物嘴卟啉单胞菌Mfa1纤毛素蛋白的免疫原性氨基酸序列基本上同源，和(b)动物嘴卟啉单胞菌HA2抗原序列，其与来自动物嘴卟啉单胞菌牙龈蛋白酶HA1(SEQ IDNO:6)的免疫原性氨基酸序列基本上同源；和

(6)免疫原性组合物，其包括(a)动物嘴卟啉单胞菌Mfa1抗原序列，其与来自具有SEQ ID NO:4的动物嘴卟啉单胞菌Mfa1纤毛素蛋白的免疫原性氨基酸序列基本上同源，(b)动物嘴卟啉单胞菌HA1抗原序列，其与来自动物嘴卟啉单胞菌牙龈蛋白酶HA1(SEQ ID NO:5)的免疫原性氨基酸序列基本上同源，和(c)动物嘴卟啉单胞菌HA2抗原序列，其与来自动物嘴卟啉单胞菌牙龈蛋白酶HA1(SEQ ID NO:6)的免疫原性氨基酸序列基本上同源。

在一个优选实施例中，所述组合物包括适于掺入疫苗调配物的免疫原性组合物。如上所述，含有所选择的抗原序列的至少一种多肽优选以分离或纯化形式掺入组合物中，其中术语“分离的”和“纯化的”在本文前面定义。免疫原性组合物中的所述至少一种多肽的量是足以在受试者中生成治疗性或预防性免疫应答的量，即使组合物整体具有免疫原性的量。因此，在疫苗调配物中向受试者施用免疫学有效剂量的免疫原性组合物将引发本节第(I)部分所解释的免疫应答，优选可以用于抑制与卟啉单胞菌感染相关的牙周疾病的进展或预防其发作的应答。组合物中每种多肽的相对量可以变化很大。然而，所述组合物通常用所选择的多肽调配——例如(a)包括Mfa1抗原序列的第一多肽和包括HA1抗原序列、HA2抗原序列或两者的第二多肽；或(b)包括Mfa1抗原序列的第一多肽、包括HA1抗原序列的第二多肽和包括HA2抗原序列的第三多肽——以与组合物中的每种多肽与组合物中的每种其它多肽的重量比相对应的量组合，其在约1:5到约5:1的范围内，通常在约1:3到约3:1的范围内，例如在约1:1.5到约1.5:1的范围内，包含约1:1。在一个优选实施例中，组合物中的每种多肽与组合物中的每种其它多肽的重量比在1:5到5:1的范围内，通常为1:3到3:1，例如1:1.5到1.5:1，包含1:1。因此，免疫原性组合物可以是以下中的一个：

(1)通过将包括Mfa1抗原序列的第一多肽和包括HA1抗原序列的第二多肽以1:5到5:1的重量比组合而调配的组合物；

(2)通过将包括Mfa1抗原序列的第一多肽和包括HA1抗原序列的第二多肽以1:3到3:1的重量比组合而调配的组合物；

(3)通过将包括Mfa1抗原序列的第一多肽和包括HA1抗原序列的第二多肽以1:1.5到1.5:1的重量比组合而调配的组合物；

(4)通过将包括Mfa1抗原序列的第一多肽和包括HA1抗原序列的第二多肽以约1:1的重量比组合而调配的组合物；

(5)通过将包括Mfa1抗原序列的第一多肽和包括HA2抗原序列的第二多肽以1:5到5:1的重量比组合而调配的组合物；

(6)通过将包括Mfa1抗原序列的第一多肽和包括HA2抗原序列的第二多肽以1:3到3:1的重量比组合而调配的组合物；

(7)通过将包括Mfa1抗原序列的第一多肽和包括HA2抗原序列的第二多肽以1:1.5到1.5:1的重量比组合而调配的组合物；

(8)通过将包括Mfa1抗原序列的第一多肽和包括HA2抗原序列的第二多肽以约1:1的重量比组合而调配的组合物；

(9)通过将包括Mfa1抗原序列的第一多肽、包括HA1抗原序列的第二多肽和包括HA2抗原序列的第三多肽组合而调配的组合物，其中组合物中的每种多肽与组合物中的每种其它多肽的重量比在1:5到5:1的范围内；

(10)通过将包括Mfa1抗原序列的第一多肽、包括HA1抗原序列的第二多肽和包括HA2抗原序列的第三多肽组合而调配的组合物，其中组合物中的每种多肽与组合物中的每种其它多肽的重量比在1:3到3:1的范围内；

(11)通过将包括Mfa1抗原序列的第一多肽、包括HA1抗原序列的第二多肽和包括HA2抗原序列的第三多肽组合而调配的组合物，其中组合物中的每种多肽与组合物中的每种其它多肽的重量比在1:1.5到1.5:1的范围内；和

(12)通过将包括Mfa1抗原序列的第一多肽、包括HA1抗原序列的第二多肽和包括HA2抗原序列的第三多肽组合而调配的组合物，其中组合物中的每种多肽与组合物中的每种其它多肽的重量比为约1:1，使得三种多肽的重量比约为1:1:1。

另外的抗原：除了包括Mfa1抗原序列和HA1抗原序列和/或HA2抗原序列的至少一种多肽之外，免疫原性组合物还可以含有一种或多种另外的抗原。另外的抗原可以是诱导靶向卟啉单胞菌致病机制和/或毒力因子的抗体应答的抗原，例如细菌酪氨酸激酶Ptk1(参见Bainbridge(2010)，《感染与免疫(Infect.Immun.)》，78(11):4560-69)或磷酸丝氨酸磷酸酶SerB(参见Wright等人(2014)(《开放式微生物学(MicrobiologyOpen)》，3(3):383-94。抗原也可能包含在针对除卟啉单胞菌生物体以外的病原体(例如，倾向于存在于与牙周疾病进展相关的复合微生物生物膜中)的组合物中。

免疫原性组合物中的所述至少一种多肽可以多种方式制备，例如通过固相或液相化学合成(全部或部分)，通过使用蛋白酶消化较长的多肽，通过基于细胞的重组蛋白表达，通过从细胞培养(例如，从重组表达)纯化等。然而，一种用于制备多肽的优选方法是授予Roy等人的美国专利第9,040,253号，授予Thanos等人的美国专利第9,650,621号和Murray等人(2013)，《化学生物学现状(Current Opin.Chem.Biol.)》，17(3):420-26中描述的可扩展无细胞蛋白质合成(“CFPS”)系统。Mfa1、HA1和HA2多肽抗原的无细胞合成在以下实例中详细描述。

本发明还提供了一种疫苗调配物，其包括用于向受试者施用的无菌调配物中的免疫原性组合物(例如，混悬液、溶液或在使用前需重新水化的冻干形式)。疫苗调配物包含至少一种多肽，所述多肽包括Mfa1抗原序列和HA1抗原序列和/或HA2抗原序列；如上所解释的任选的另外的抗原；和选自佐剂和赋形剂的至少一种另外的组分，如下所示：

佐剂：疫苗调配物可以含有一种或多种佐剂，以增强对免疫原性组合物中的一种或多种抗原的免疫应答。用于掺入本调配物的合适的疫苗佐剂在相关的文本和文献中有所描述，并且对本领域普通技术人员而言将是显而易见的。主要的佐剂组如下：

矿物盐佐剂，包含明矾基佐剂，例如磷酸铝、氢氧化铝和硫酸铝，以及其它矿物盐佐剂，例如钙、铁和锆的磷酸盐、氢氧化物和硫酸盐；

皂素调配物，包含Quillaia皂素QuilA和Quil A衍生皂素QS-21，以及在胆固醇、磷脂和皂素混合后形成的免疫刺激复合物(ISCOM)；

细菌衍生和细菌相关的佐剂，包含但不限于衍生自革兰氏阴性细菌(例如，分枝杆菌、短小棒状杆菌、颗粒棒状杆菌、百日咳博德特氏菌和脑膜炎奈瑟菌)的细胞壁肽聚糖和脂多糖，例如脂质A、单磷酰基脂质A(MPLA)、其它脂质A衍生物和模拟物(例如，RC529)、肠细菌脂多糖(“LPS”)、TLR4配体和海藻糖二霉菌酸酯(“TDM”)；

胞壁酰基肽，例如N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(“MDP”)和MDP类似物和衍生物，例如苏氨酰基-MDP和正MDP；

油基佐剂，包含水包油(O/W)和油包水(W/O)乳剂，例如角鲨烯-水乳剂(例如，MF59、AS03、AF03)、完全弗氏佐剂(“CFA”)和不完全弗氏佐剂(“IFA”)；

脂质体佐剂；

由可生物降解且无毒聚合物(例如，聚(α-羟基酸)、聚(羟基丁)酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己内酯等)形成的微球佐剂；

人免疫调节剂，包含细胞因子，例如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12)、干扰素(例如，干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子；

生物粘合剂和粘膜粘合剂，例如壳聚糖及其衍生物，以及酯化的透明质酸和微球或粘膜粘合剂，例如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物；

咪唑并喹诺酮化合物，包含咪喹莫特及其同源物，例如雷西喹莫特；

TLR-9激动剂，例如Hsp90和含有未甲基化的CpG基序的寡脱氧核苷酸(参见例如Bode等人(2011)，《疫苗专家审评(Expert Rev.Vaccines)》，10(4):499-511)；和

碳水化合物佐剂，包含菊粉衍生佐剂γ菊粉和藻类菊粉，以及其它碳水化合物佐剂，例如基于葡萄糖和甘露糖的多糖，包含葡聚糖、右旋糖酐、香菇多糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、左聚糖和木聚糖。

本文的示例性佐剂包含明矾基盐，例如磷酸铝和氢氧化铝。

疫苗调配物还包含至少一种赋形剂，通常是两种或两种以上赋形剂，以发挥多种功能中的任何一种，其中赋形剂是“药学上可接受的”免疫学和药理学惰性组分。本文的“药学上可接受的”组分是指(1)可以包含在被施用于受试者的疫苗调配物中而不会引起明显的有害生物学作用或以有害的方式与调配物的任何其它组分相互作用的组分；(2)符合美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)制定的非活性成分中规定的标准，并且最好还被指定为“公认安全的”(“GRAS”)。掺入本文的疫苗调配物中的一种或多种赋形剂的类型将部分取决于所选择的施用方式和特定的调配物类型或剂型，例如可注射液体调配物、鼻内喷雾调配物等；下文讨论了施用方式和相对应的调配物。然而，一般而言，可以有利地掺入本发明的疫苗调配物中的惰性组分包含但不限于媒剂、增溶剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、缓冲体系、分散剂、稀释剂、粘度调节剂和吸收促进剂及其组合。药学上可接受的惰性添加剂的详尽讨论可在Gennaro(2000)，《雷明顿：药学的科学与实践(Remington:The Science and Practice ofPharmacy)》第20版，ISBN:0683306472中找到。

3.施用和使用：

本发明的免疫原性组合物可用于使受试者免疫牙周疾病的方法，其中所述方法涉及向受试者施用免疫学有效量的如本文所述的包括免疫原性组合物的牙周疫苗调配物。

受试者可以是人类或非人类哺乳动物，并且靶细菌的选择(其将是抗原序列所对应的免疫原性氨基酸序列的来源)可以取决于受试者的类型。例如，用于治疗或预防人类受试者中的牙周炎的根据本发明的免疫原性组合物通常将靶向牙龈卟啉单胞菌。作为另一实例，用于治疗或预防非人类哺乳动物中的牙周炎的本发明的免疫原性组合物通常将靶向于动物嘴卟啉单胞菌，其中所述受试者可以是狗、马、奶牛、猫或其它哺乳动物。

所述方法可以涉及施用免疫原性组合物作为治疗性疫苗，即治疗患有牙周炎的受试者。所述方法还可以涉及施用免疫原性组合物作为预防性疫苗，这意味着，例如，所述方法降低了受试者中牙周炎(包含中度至重度牙周炎)发展的风险并且因此可以推迟或消除牙周炎的发展。当预防性地使用疫苗时，由于多种风险因素(包含年龄；遗传易感性；免疫低下状态；增加中度至重度牙周炎发展风险的疾病(例如，糖尿病、AIDS、白血病和唐氏综合征)；牙髓病变或脓肿的存在)，受试者可能会患上牙周炎。作为一个实例，例如在类风湿性关节炎或牛皮癣的治疗中，接受抗TNF疗法(即服用TNF抑制剂，例如依那西普或阿达木单抗)的患者通常表现出牙龈炎症并且患牙周炎的风险增加。

疫苗调配物的“免疫有效量”是有效治疗或预防牙周疾病的单剂量或一系列两个或两个以上剂量的一部分的量，其中“治疗”和“预防”在本节的第(1)部分中定义。施用的量将根据几个因素而有所不同，包含受试者的整体健康和身体状况、受试者的年龄、受试者的免疫系统合成相关抗体的能力、组合物的形式(例如，注射液、鼻喷雾剂等)、受试者的分类群(例如，人类、非人灵长类、非灵长类等)以及监督施用的医师已知的其它因素。

免疫原性组合物作为疫苗调配物的施用可以使用任何有效的全身递送方式进行。所述组合物通常肠胃外施用，例如通过注射，包含静脉内、肌内、腹膜内、间质内或皮下注射；注射也可以是牙龈注射，在这种情况下，疫苗调配物直接注射到牙龈中。另外，所述组合物可以经粘膜施用，例如经由鼻内、舌下、经颊、阴道内或直肠内途径。也可以设想其它施用方式，但是本发明不限于此。作为实例，其它施用方式包含口服和透皮递送以及经由吸入或使用皮下植入物施用。

施用方式在很大程度上决定了包括免疫原性组合物的调配物或剂型的类型。被调配用于肠胃外施用的组合物包含无菌水溶液和非水溶液、混悬液和乳剂。可注射水溶液含有水溶性形式的活性剂。非水溶剂或媒剂的实例包含脂肪油，例如橄榄油和玉米油；合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯；低分子量醇，例如丙二醇；合成亲水性聚合物，例如聚乙二醇、脂质体等。肠胃外调配物还可以含有赋形剂，例如增溶剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、缓冲体系、分散剂、稀释剂、粘度调节剂、吸收促进剂及其组合。通过掺入灭菌剂、通过除菌过滤器过滤、辐照或加热来使可注射调配物变得无菌。它们也可以使用无菌注射介质来制造。免疫原性组合物或其单个组分也可以是干燥的(例如，冻干形式)，其可以在经由注射施用之前用合适的媒剂重新水化。

在经粘膜途径中，通常是鼻内施用，但其不一定是优选的。鼻内调配物，包含鼻内施用的疫苗调配物，在本领域中是已知的，并且应参考FDA的《工业指南：鼻喷雾剂和吸入溶液、混悬液和喷雾药物产品(Guidance for Industry:Nasal Spray and InhalationSolution,Suspension,and Spray Drug Products)》进行调配。鼻内调配物是液体，即溶液、乳剂、混悬液等，以作为喷雾剂、鼻内注射剂或滴剂施用，并且可以含有如上所述的佐剂和药学上可接受的赋形剂。由于调配物中抗原的相对较大尺寸，经由鼻内途径的全身递送需要在免疫原性组合物中掺入透粘膜吸收促进剂。合适的透粘膜吸收促进剂的实例包含但不限于烷基糖、环糊精和壳聚糖；参见Maggio(2014)，《赋形剂与食品化学杂志(J.Excip.Food Chem.)》，5(2):100-12；和Merkus等人(1999)，《高级药物递送审评(Adv.Drug Deliv.Rev.)》，36:41-57。选择促进剂的浓度以确保免疫有效量的调配物以有效的转运速率通过鼻膜并进入体循环。决定了鼻内疫苗调配物的组成和性质的各种解剖学和生理学方面的考虑例如由Aurora(2002年10月)《药物开发与递送(Drug Development&Delivery)》2(7)讨论。

其它施用方式和相对应的调配物包含但不限于：速溶剂型(例如，速溶片剂)的舌下施用；使用颊贴剂或其它颊递送系统的经颊施用；使用阴道栓剂、药膏或乳膏的阴道内施用；使用直肠栓剂、药膏或乳膏的直肠内递送；使用透皮贴剂或调配物的透皮施用；注射植入物或小丸的皮下施用；使用干粉肺调配物的吸入；使用口服剂型(例如，片剂、胶囊等)的口服施用。

如本文前面所提及，疫苗调配物在适当的剂量方案的情况下施用于受试者。所述组合物可以在延长的时间内一次或两次或两次以上(间隔)施用。例如，可以在初始的“原始”剂量之后加上至少一个“增强”剂量。原始和后续增强剂量之间以及增强剂量之间的时间间隔通常在约2到约24周的范围内，更通常在约2到12周的范围内，例如2到8周，3-6周等。无论施用方式如何(例如，肌内注射、牙龈注射、鼻内施用等)，单剂量疫苗的体积通常在约1μL到约500μL的范围内，通常在约1μL到约250μL的范围内，更通常在约2.5μL到约200μL的范围内，并且优选在约5μL到约150μL的范围内。应当理解，免疫原性组合物中的总抗原的浓度对应于每单位体积的组合物的免疫学有效剂量，从而根据上述剂量体积准则起作用。

为了易于使用，可以将本发明的免疫原性组合物掺入包装产品或“试剂盒”(其包含自我施用或医师施用的说明书)中。所述试剂盒包含密封容器，所述容器容纳一定剂量的疫苗调配物，通常是具有免疫学有效性的适合于单剂量事件的“单位剂量”。疫苗可以是液体形式，并且因此易于以注射剂等形式施用，其也可以是另一形式，需要用户在施用前进行制备过程，例如冻干调配物的水化、惰性组分的活化等。所述试剂盒还可以包含两个或两个以上密封容器，其中第一容器中含有原始剂量，而一个或多个另外的容器中含有增强剂量，或这第一容器中含有牙周炎疫苗调配物，而另一容器中含有针对另一感染(可能与或不与卟啉单胞菌感染有关)的疫苗。

实验

无细胞提取物的生成：

如先前由Groff等人(2014)，《单克隆抗体(Mabs)》，7(1):231-242所述制备含有另外的DsbC分子伴侣的无细胞提取物。简而言之，用携带dsbC基因的串联拷贝的pACYC质粒转化大肠杆菌菌株SBJY001(参见Yin等人(2012)，《单克隆抗体(Mabs)》，6(3):671-678)。如Zawada等人(2011)，《生物技术及生物工程(Biotechnol.Bioeng.)》，108(7):1570-1578所述生长、收获并均质化细胞。随后的经由离心的澄清产生了用于随后的无细胞表达反应的提取物。

重组牙龈卟啉单胞菌Mfa1、HA1、HA2的生成和纯化：

编码与牙龈卟啉单胞菌相关的HA1、HA2和Mfa1纤毛素蛋白的DNA序列经过密码子优化，合成(DNA 2.0；门洛帕克，加利福尼亚州)并克隆到先前描述的pYD317载体中[30]。基本上如先前所述，使用Xpress CFTM CFPS系统进行无细胞反应(Yin等人，同上；Zimmerman等人(2014)，《生物结合化学(Bioconjug.Chem.)》，25(2):351-361)。为了表达HA1、HA2和Mfa1纤毛素，在25℃下利用IAM预处理进行反应，其中加入氧化型谷胱甘肽(2mM)以创建二硫键的氧化环境。HA1和HA2的表达无需细胞提取物的IAM处理即可进行；还原型谷胱甘肽(8mM)的加入可以维持还原表达环境。反应16小时后，按照制造商的建议，在Ni琼脂糖树脂(GE Lifesciences，匹兹堡，宾夕法尼亚州)上使用his标签亲和纯化，从无细胞反应混合物中分离所表达的蛋白质。经由SP ImpRes树脂(GE Lifesciences)上的阳离子交换色谱，实现了HA1、HA2和Mfa1纤毛素蛋白的进一步纯化。简而言之，Ni琼脂糖洗脱液被交换成柠檬酸钠(50mM)，NaCl(50mM)，pH 4.5，并且加到在相同缓冲液中平衡的柱上。随后经由梯度洗脱将所精制的蛋白质洗脱到Tris(50mM)，NaCl(1M)，pH 7.5。类似地，经由Q ImpRes(GELifesciences)上的阴离子交换色谱法进一步纯化HA2。在Tris(50mM)，NaCl(50mM)，pH 7.5中进行柱平衡和加样，随后梯度洗脱到Tris(50mM)，NaCl(1M)，pH 7.5。

精制色谱后，将所有蛋白质透析到杜氏PBS中，并且经由SDS-PAGE进行分析，并经由Q-TOF(Agilent，圣克拉拉，加利福尼亚州)进行完整的质量分析。对于HA1，完整的质量分析最终表明半胱氨酸被氧化并形成了预期的二硫键。

牙龈卟啉单胞菌的培养和细菌纯度评估：

如先前所述(Huang等人(2015)，《分子口腔微生物学(Mol.Oral.Microbiol.)》，30(6):438-450)处理牙龈卟啉单胞菌菌株A7436。简而言之，冷冻原料接种在厌氧血琼脂平板上，在37℃下厌氧生长三天后收集牙龈卟啉单胞菌，将所收获的生物体放入无菌的脑心浸液肉汤(补充有L-半胱氨酸(0.75g/L)、血红素(5mg/L)和甲萘醌(1mg/L))中。24小时后，通过离心收集对数生长期的细菌，并将其在2％羧甲基纤维素的无热原盐水溶液中混悬为1x1010 CFU/mL，以进行口腔激发(100μL/激发)。对于免疫，将肉汤中生长的牙龈卟啉单胞菌在注射级盐水中调整为1x109 CFU/mL，并在注射前进行热灭活(60℃下持续30分钟)，并通过平板接种确认细菌灭活。对所有牙龈卟啉单胞菌肉汤培养物进行革兰氏染色以确保纯度。

小鼠、免疫和口腔激发：

将六周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River实验室，威尔明顿，马萨诸塞州)随机分为六组(n＝8/组)，圈养在无特定病原体的设施中，并随意饲喂水和食物。所有活动物的使用均按照IACUC批准进行。各组包含G1)未免疫/无口腔激发对照，G2)未免疫/牙龈卟啉单胞菌口腔激发，G3)热灭活的牙龈卟啉单胞菌免疫/牙龈卟啉单胞菌口腔激发，G4)Mfa1+HA1+HA2联合免疫的明矾溶液/牙龈卟啉单胞菌口腔激发，G5)Mfa1+HA1+HA2联合免疫的MPL溶液/牙龈卟啉单胞菌口腔激发，和G6)Mfa1+HA1+HA2联合免疫的注射级盐水/牙龈卟啉单胞菌口腔激发。在开始免疫之前，从每个动物中获取基线血清样品，然后通过肌内注射灭活的牙龈卟啉单胞菌或混悬Mfa1+HA1+HA2(每种蛋白质5μg/注射液)明矾(Imject，ThermoFisher Sci，罗克福德，伊利诺伊州)溶液、单磷酰脂质A(MPL；Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州)溶液或注射级盐水溶液来免疫相应组的小鼠。初次免疫后2周和4周递送随后的肌内增强免疫。免疫完成两周后，在用牙龈卟啉单胞菌口腔激发之前从动物获得血清样品。如先前所报道完成小鼠的口腔激发(Gonzalez等人(2003)，《感染与免疫(Infect.Immun.)》，71(4):2283-2287)。简而言之，动物被以饮用水饲喂10天的口服磺胺甲恶唑/甲氧苄啶(Hi-Tech Pharmical，阿米提维尔，纽约州)，然后去除抗生素并休息三天。使用装有饲喂针头的注射器，将牙龈卟啉单胞菌浆液(1x1010 CFU/ml+2％羧甲基纤维素的注射级盐水溶液)轻轻涂在所激发的小鼠的牙龈上，在1周的时间内进行3次。对照动物包含仅用2％羧甲基纤维素空白对照激发的动物。口腔激发完成后休息42天后，处死动物，获得末梢出血，并对每个小鼠的头部进行处理，以进行口腔骨质流失测量。在处死时从每个动物收集最终血清样品，并将所有收集的血清样品在-80℃下储存。

小鼠血清中Mfa1、HA1和HA2特异性IgG的检测：

将抗原(0.5μg/mL)在4℃下在Maxisorp平板(NUNC，罗契斯特，纽约州)上接种过夜，用含吐温-20(0.05％)的PBS洗涤三次，并用含1％BSA的PBS封闭最少1小时。将来自接种小鼠的连续2倍稀释血清样品(100μL/孔)加入到各个孔中，并在室温下温育2小时。洗涤平板，与缀合到辣根过氧化物酶的适当同种型特异性抗体(1:6000稀释；Southern Biotech，伯明翰，阿拉巴马州)一起温育，加入100μL TMB底物(Pierce，罗克福德，伊利诺伊州)观察20-30分钟，并通过加入50μL H2SO4(1.0M)终止反应。测量每个孔在450nm处的吸光度减去570nm处的吸光度，以校正平板异常。绘制每个样品的所得数据，以得出相互稀释度相对于A450-A570测量的曲线。使用Prism统计分析软件(GraphPad Software，拉荷亚，加利福尼亚州)，将抗体滴度确定为稀释曲线的中点，如EC50计算所定义。将每组的EC50平均值确定为最终抗体滴度。

口腔骨质流失的测量：

如先前所进行，通过形态分析来确定口腔骨质水平(Gibson等人(2001)，《感染与免疫(Infect.Immun.)》，69(12):7959-7963)。处死后，除去上颌磨牙周围的软组织，并在彻底清洁后，将头骨用亚甲蓝染色。在开始进行骨质测量之前，样品盲于不知道分组的研究人员。使用附于立体显微镜上的数码相机从牙槽骨顶(ABC)到釉牙骨质界(CEJ)的14个标志性部位获得上颌磨牙处的口腔骨质测量(Baker等人(1994)，《口腔生物学档案(Arch.OralBiol.)》，39(12):1035-1040)。使用ImageJ(Schneider等人(2012)，《自然方法(Nat.Methods)》，9(7):671-675)进行图像分析，并将屏幕上的像素长度转换为毫米，并且将从一组中每个动物获得的数据合并以取得组水平平均长度±SEM。

统计分析：

用Prism统计分析软件(GraphPad)分析数据。如使用未配对的学生T检验或ANOVA及检验后分析所指示进行组间比较，并且P<0.05被认为是显著的。

结果：

SDS-PAGE：使通过CFPS生成的纯化蛋白变性并将其加入到孔中(3μg/孔)，在4-12％Bis-Tris梯度凝胶上分离，并用考马斯兰染色。在还原条件下生成的蛋白质的分析结果如图1中所示。泳道1：分子量标志物。泳道2：Mfa1。泳道3：HA1。泳道4：HA2。

为了确定肌内注射递送的蛋白是否引起蛋白特异性IgG抗体应答，并且确定不同的佐剂(明矾相对于MPL)是否影响所引起的IgG应答，在免疫期结束时从各组小鼠收集血清，并且在处死时通过ELISA检验Mfa1、HA1和HA2特异性IgG的水平。将每个血清样品的滴定曲线转换为EC₅₀值。如所预期，在口腔激发前从未免疫组的小鼠收集的血清具有较低的Mfa1、HA1和HA2的IgG水平。从用灭活的牙龈卟啉单胞菌A7436免疫的小鼠收集的血清引起对纯化的Mfa1和HA2具有特异性的IgG的名义增加，且HA2>Mfa1。对于用混悬的组合蛋白的明矾、MPL或注射级盐水溶液IM免疫的各组小鼠，所有接受疫苗组合的小鼠均以抗原特异性IgG应答做出应答。Mfa1的IgG的免疫后水平在MPL佐剂中是最强的；MPL>明矾或盐水。对于HA1，明矾最好地促进了分子特异性IgG，且明矾>MPL>盐水；而对于HA2，明矾和MPL促进了抗原特异性IgG的响应度达到相似的水平，并且都比用盐水观察到的要大。

处死时IgG水平的比较表明，用牙龈卟啉单胞菌A7436口腔激发的未免疫小鼠组的Mfa1和HA2的特异性IgG的生成量略有升高，但针对HA1却没有。与在口腔激发前测量的IgG水平相比，用热灭活的牙龈卟啉单胞菌A7436进行的免疫表现出相似的低水平增加，这独立于佐剂或盐水，从用蛋白组合的盐水溶液免疫的小鼠测量的针对HA1的IgG除外。

图2提供了针对牙龈卟啉单胞菌Mfa1、HA1和HA2的血清IgG EC₅₀值。动物组G1-G6用作对照或实验组，并且在口腔激发之前(接种疫苗后；空心柱)或处死时(实心柱)从动物收集血清样品，并从针对牙龈卟啉单胞菌(A)Mfa1、(B)HA1和(C)HA2的ELISA数据计算分子特异性IgG EC₅₀值。

为了了解蛋白质组合是否可以有效限制牙龈卟啉单胞菌引起的口腔骨质流失的程度，对免疫的动物进行牙龈卟啉单胞菌口腔激发。未免疫或用灭活的牙龈卟啉单胞菌免疫的小鼠组作为对照。与空白对照激发的小鼠(G1)相比，用牙龈卟啉单胞菌A7436(G2)口腔激发的动物出现口腔骨质流失，如由ABC到CEJ的平均距离增加所证实(p<0.001)。如所预期，用灭活的牙龈卟啉单胞菌A7436(G3)的制剂进行的免疫提供了可测量的对同源生物体引起的口腔骨质流失的保护(p<0.01)。现对于仅牙龈卟啉单胞菌口腔激发，接受由混悬的异源牙龈卟啉单胞菌菌株的明矾(G4)或MPL(G5)溶液生成的组合蛋白疫苗的小鼠组被保护免于牙龈卟啉单胞菌引起的口腔骨质流失(每一种p<0.01)。佐剂之间未观察到保护水平的差异(ABC到CEJ的测量)，表明疫苗候选的肌内递送提供了相似的保护性应答(p>0.05)。还观察到，用混悬的组合蛋白疫苗的盐水溶液(G6)免疫的动物组被保护免于牙龈卟啉单胞菌口腔激发，类似于用佐剂肌内递送蛋白质时观察到的情况(与明矾或MPL佐剂相比，p>0.05)，并且无论采用何种佐剂，其保护水平与热灭活的全生物体疫苗组所提供的保护水平相似(所有p>0.05)。

图3示出了评价体内口腔骨质流失的实验结果。(A)将BALB/c小鼠随机分为多组(G1-6)，并以2周的间隔对免疫动物进行3次组合蛋白混合物(分别为佐剂或注射剂盐水溶液)的肌内注射(初始和2次增强；红色箭头)。免疫对照组(G3)接受热灭活的牙龈卟啉单胞菌(相当于1x10⁷ CFU/注射)。所有动物以饮用水饲喂10天的磺胺甲恶唑/甲氧苄啶(抗生素)，然后在空白对照口腔激发(G1)或牙龈卟啉单胞菌口腔激发(1周内进行3次；G2-6)之前三天去除抗生素。口腔激发完成后(0周)，让动物休息六周，然后处死。图3提供了结果，其示出了釉牙骨质界(CEJ)和牙槽骨顶(ABC)之间的平均距离，单位为mm±SEM；#＝p<0.001，相对于G1(未激发)；***＝p<0.01，相对于G2(仅牙龈卟啉单胞菌口腔激发)(使用ANOVA及Dunns多重比较)。

Claims (50)

1.一种包括至少一种多肽的免疫原性组合物，其中所述至少一种多肽包括：

(a)Mfa1抗原序列，其中所述Mfa1抗原序列与来自卟啉单胞菌的Mfa1纤毛素(fimbrilin)蛋白的免疫原性氨基酸序列基本上同源；和

(b)HA1抗原序列、HA2抗原序列或HA1抗原序列和HA2抗原序列两者，其中

(i)所述HA1抗原序列与来自卟啉单胞菌的RgpA牙龈蛋白酶蛋白中含有的RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域1的免疫原性氨基酸序列基本上同源，并且

(ii)所述HA2抗原序列与来自卟啉单胞菌的RgpA牙龈蛋白酶蛋白中含有的RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域2的免疫原性氨基酸序列基本上同源。

2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述至少一种多肽包括第一多肽，所述第一多肽包括：

(a)所述Mfa1抗原序列和所述HA1抗原序列；

(b)所述Mfa1抗原序列和所述HA2抗原序列；或

(c)所述Mfa1抗原序列、所述HA1抗原序列和所述HA2抗原序列。

3.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述至少一种多肽包括：

(a)第一多肽，所述第一多肽包括所述Mfa1抗原序列；和

(b)第二多肽，所述第二多肽包括所述HA1抗原序列、所述HA2抗原序列或所述HA1抗原序列和所述HA2抗原序列两者。

4.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述至少一种多肽包括：

(a)第一多肽，所述第一多肽包括所述Mfa1抗原序列；

(b)第二多肽，所述第二多肽包括所述HA1抗原序列；和

(c)第三多肽，所述第三多肽包括所述HA2抗原序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述卟啉单胞菌包括选自牙龈卟啉单胞菌、动物嘴卟啉单胞菌(P.gulae)、犬牙龈卟啉单胞菌、犬齿龈卟啉单胞菌、犬嘴卟啉单胞菌、唾液卟啉单胞菌和牙周卟啉单胞菌的卟啉单胞菌种。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述卟啉单胞菌种是牙龈卟啉单胞菌。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述来自卟啉单胞菌的Mfa1纤毛素蛋白的免疫原性氨基酸序列来自SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述来自RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域1的免疫原性氨基酸序列来自SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且所述来自RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域2的免疫原性氨基酸序列来自SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述Mfa1抗原序列相对于来自SEQ ID NO:1的免疫原性氨基酸序列具有至少80％的序列同源性，所述HA1抗原序列相对于来自SEQ ID NO:2的免疫原性氨基酸序列具有至少80％的序列同源性，并且所述HA2抗原序列相对于来自SEQID NO:3的免疫原性氨基酸序列具有至少80％的序列同源性。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述Mfa1抗原序列相对于来自SEQ ID NO:1的免疫原性氨基酸序列具有至少90％的序列同源性，所述HA1抗原序列相对于来自SEQ ID NO:2的免疫原性氨基酸序列具有至少90％的序列同源性，并且所述HA2抗原序列相对于来自SEQID NO:3的免疫原性氨基酸序列具有至少90％的序列同源性。

10.根据权利要求5所述的组合物，其中所述卟啉单胞菌种是动物嘴卟啉单胞菌。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述来自卟啉单胞菌的Mfa1纤毛素蛋白的免疫原性氨基酸序列来自SEQ ID NO:4的氨基酸序列，所述来自RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域1的免疫原性氨基酸序列来自SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且所述来自RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域2的免疫原性氨基酸序列来自SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述Mfa1抗原序列相对于来自SEQ ID NO:4的免疫原性氨基酸序列具有至少80％的序列同源性，所述HA1抗原序列相对于来自SEQ IDNO:5的免疫原性氨基酸序列具有至少80％的序列同源性，并且所述HA2抗原序列相对于来自SEQ ID NO:6的免疫原性氨基酸序列具有至少80％的序列同源性。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述Mfa1抗原序列相对于来自SEQ ID NO:4的免疫原性氨基酸序列具有至少90％的序列同源性，所述HA1抗原序列相对于来自SEQ IDNO:5的免疫原性氨基酸序列具有至少90％的序列同源性，并且所述HA2抗原序列相对于来自SEQ ID NO:6的免疫原性氨基酸序列具有至少90％的序列同源性。

14.一种牙周炎疫苗调配物，其包括根据权利要求1所述的免疫原性组合物和至少一种赋形剂。

15.根据权利要求14所述的疫苗调配物，其中所述卟啉单胞菌包括选自牙龈卟啉单胞菌、动物嘴卟啉单胞菌、犬牙龈卟啉单胞菌、犬齿龈卟啉单胞菌、犬嘴卟啉单胞菌、唾液卟啉单胞菌和牙周卟啉单胞菌的卟啉单胞菌种。

16.根据权利要求15所述的疫苗调配物，其中所述卟啉单胞菌种是牙龈卟啉单胞菌。

17.根据权利要求16所述的疫苗调配物，其中所述来自卟啉单胞菌的Mfa1纤毛素蛋白的免疫原性氨基酸序列来自SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述来自RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域1的免疫原性氨基酸序列来自SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且所述来自RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域2的免疫原性氨基酸序列来自SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

18.根据权利要求17所述的疫苗调配物，其中所述Mfa1抗原序列相对于来自SEQ IDNO:1的免疫原性氨基酸序列具有至少80％的序列同源性，所述HA1抗原序列相对于来自SEQID NO:2的免疫原性氨基酸序列具有至少80％的序列同源性，并且所述HA2抗原序列相对于来自SEQ ID NO:3的免疫原性氨基酸序列具有至少80％的序列同源性。

19.根据权利要求18所述的疫苗调配物，其中所述Mfa1抗原序列相对于来自SEQ IDNO:1的免疫原性氨基酸序列具有至少90％的序列同源性，所述HA1抗原序列相对于来自SEQID NO:2的免疫原性氨基酸序列具有至少90％的序列同源性，并且所述HA2抗原序列相对于来自SEQ ID NO:3的免疫原性氨基酸序列具有至少90％的序列同源性。

20.根据权利要求15所述的疫苗调配物，其中所述卟啉单胞菌种是动物嘴卟啉单胞菌。

21.根据权利要求20所述的疫苗调配物，其中所述来自卟啉单胞菌的Mfa1纤毛素蛋白的免疫原性氨基酸序列来自SEQ ID NO:4的氨基酸序列，所述来自RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域1的免疫原性氨基酸序列来自SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且所述来自RgpA牙龈蛋白酶血凝素结构域2的免疫原性氨基酸序列来自SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

22.根据权利要求21所述的疫苗调配物，其中所述Mfa1抗原序列相对于来自SEQ IDNO:4的免疫原性氨基酸序列具有至少80％的序列同源性，所述HA1抗原序列相对于来自SEQID NO:5的免疫原性氨基酸序列具有至少80％的序列同源性，并且所述HA2抗原序列相对于来自SEQ ID NO:6的免疫原性氨基酸序列具有至少80％的序列同源性。

23.根据权利要求22所述的疫苗调配物，其中所述Mfa1抗原序列相对于来自SEQ IDNO:4的免疫原性氨基酸序列具有至少90％的序列同源性，所述HA1抗原序列相对于来自SEQID NO:5的免疫原性氨基酸序列具有至少90％的序列同源性，并且所述HA2抗原序列相对于来自SEQ ID NO:6的免疫原性氨基酸序列具有至少90％的序列同源性。

24.根据权利要求14所述的疫苗调配物，其中所述至少一种赋形剂选自媒剂、增溶剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、缓冲体系、分散剂、稀释剂、粘度调节剂和吸收促进剂。

25.根据权利要求24所述的疫苗调配物，其进一步包含佐剂。

26.根据权利要求14所述的疫苗调配物，其被调配成无菌注射溶液。

27.根据权利要求14所述的疫苗调配物，其为冻干形式。

28.一种用于使受试者免疫牙周疾病的方法，其包括向所述受试者施用免疫有效量的根据权利要求1所述的组合物。

29.一种用于使受试者免疫牙周疾病的方法，其包括向所述受试者施用免疫有效量的根据权利要求14所述的牙周炎疫苗调配物。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述牙周疾病与选自牙龈卟啉单胞菌、动物嘴卟啉单胞菌、犬牙龈卟啉单胞菌、犬齿龈卟啉单胞菌、犬嘴卟啉单胞菌、唾液卟啉单胞菌和牙周卟啉单胞菌的卟啉单胞菌相关。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述卟啉单胞菌是牙龈卟啉单胞菌。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述受试者是人类。

33.根据权利要求30所述的方法，其中所述卟啉单胞菌是动物嘴卟啉单胞菌。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述受试者是非人类哺乳动物。

35.根据权利要求29所述的方法，其中所述疫苗调配物包括无菌注射溶液，并且通过注射施用于所述受试者。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述疫苗调配物以肌内注射的形式施用。

37.根据权利要求35所述的方法，其中所述疫苗调配物以牙龈注射的形式施用。

38.根据权利要求29所述的方法，其中所述疫苗调配物经粘膜施用。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述疫苗调配物鼻内施用。

40.根据权利要求29所述的方法，其中所述疫苗调配物施用一次。

41.根据权利要求29所述的方法，其中所述疫苗调配物施用两次或更多次。

42.根据权利要求29所述的方法，其中所述受试者表现出牙周炎的症状，并且所述疫苗调配物以治疗性疫苗的形式施用。

43.一种用于降低受试者中牙周炎发展风险的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫有效量的根据权利要求1所述的组合物。

44.一种用于降低受试者中牙周炎发展风险的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫有效量的根据权利要求14所述的牙周炎疫苗调配物。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述受试者具有至少一种牙周炎发展风险因素。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述至少一种风险因素选自年龄、遗传易感性、全身性疾病、牙髓病变或脓肿的存在或其组合。

47.一种用于减少由牙周疾病引起的骨质流失的方法，其包括向需要此治疗的受试者施用免疫有效量的根据权利要求1所述的组合物。

48.一种用于预防由牙周疾病引起的骨质流失的方法，其包括向需要此治疗的受试者施用免疫有效量的根据权利要求18所述的牙周炎调配物。

49.一种用于减轻由牙周疾病引起的炎症的方法，其包括向需要此治疗的受试者施用有效量的根据权利要求1所述的组合物。

50.一种用于减轻由牙周疾病引起的炎症的方法，其包括向需要此治疗的受试者施用有效量的根据权利要求18所述的牙周炎疫苗调配物。

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