KR102530966B1 - 치주염 백신 및 관련 조성물 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

면역원성 조성물, 상기 면역원성 조성물을 함유하는 치주 백신 제형, 및 치주 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 면역학적 유효량의 조성물 또는 백신 제형을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 면역학적 조성물은 포르피로모나스(Porphyromonas) 박테리아의 Mfa1 핌브릴린(fimbrilin) 단백질 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 Mfa1 서열; 및 HA1 항원 서열, HA2 항원 서열, 또는 HA1 항원 서열 및 HA2 항원 서열 둘 다를 포함하되, HA1 항원 서열은 포르피로모나스 박테리아의 RgpA 진지파인 단백질 내에 함유된 RgpA 진지파인 헤마토글루티닌 도메인 1 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성이고, HA2 항원 서열은 포르피로모나스 박테리아의 RgpA 진지파인 단백질 내에 함유된 RgpA 진지파인 헤마토글루티닌 도메인 2 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인, 적어도 하나의 폴리펩타이드를 함유한다.

Description

치주염 백신 및 관련 조성물 및 사용 방법

본 발명은 일반적으로 치주염의 예방 및 치료에 관한 것이고, 보다 구체적으로 치주 백신 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

"치주염"으로 통칭되는 치주 질환은 흔히 발생하지만, 치아를 지지하는 연조직과 경조직을 파괴하는 복잡한 만성 구강 염증 질환이다. 치료하지 않은 상태로 두면, 치아 주위의 치조골이 손실되어, 치아가 흔들리고, 이어서 치아 손실이 일어날 수 있다. 치주 질환은 박테리아 기원의 가장 흔한 인간 질환 중 하나이며, 최근 연구는 미국에서 40세 초과의 개인 중 대략 60%가 중등증 또는 중증의 치주염이 있으며, 측정가능한 구강 뼈 손실이 있는 것을 나타내었다. 치주염의 유병률은 나이가 들면서 증가한다(문헌[Eke et al. (2012) J. Dent. Res.91(10): 914-920] 참조). 중증의 전신화된 치주 질환이 전세계적으로 약 5 내지 20%의 개인에서 발생하여(Burt et al. (2005) J. Periodontol . 76(8): 1406-19), 종종 중년까지 다수의 치아 손실이 일어나며, 이 질환의 경제적 부담이 상당한데, 2010년 데이터는 US에서만 540억 달러의 경제적 영향을 추정한다(Listl et al. (2015) J. Dent. Res. 94(10): 1355-61).

치주염은 알려진 7가지의 주요 카테고리가 있는 분류 시스템으로 중등도 및 원인에 따라 특성화된다: (1) 잇몸의 염증을 수반하는, 치은 질환, 또는 "치은염"; (2) 국소화 또는 전신화될 수 있는 천천히 진행하는 질환인, 만성 치주염; (3) 조기 발병, 또는 "공격적인" 치주염; (4) 전신 질환, 예컨대, 당뇨병, AIDS, 및 백혈병과 연관된 치주염; (5) 괴사성 치주 질환; (6) 치주 농양; 및 (7) 근관(endodontic) 병변과 연관된 치주염. 후자의 6가지 카테고리는, 야기되는 손상이 되돌릴 수 없는 것이므로, "파괴적인" 치주 질환으로 지정된다. 문헌[Armitage (1999) Ann. Periodontol . 4(1): 1-6]을 참조한다. 치주염의 증상은 염증이 있거나, 출혈이 있는 잇몸, 잇몸 퇴축, 치아와 잇몸 사이의 치주포켓, 및 중증 치주염의 경우 치아의 흔들림 또는 손상을 포함한다. 치료는 질환의 정도 및 원인에 따라 다를 것이며, 스케일링, 치근활택술, 항생제 요법, 및 수술을 포함한다. 스케일링 및 치근활택술은 종종 다수 회 수행되어야 하며, 항생제 요법은 유익한 구강 미생물이 병원성 박테리아와 함께 사멸될 수 있는 한 문제가 될 수 있으며, 구강 수술은 일반적으로 바람직하지 않은 최후 수단의 해결책이다.

치주염은 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)와 같은 핵심 박테리아의 존재에 의해 개시된다. 포르피로모나스 유기체는, 세포 및 다른 공동체 미생물에 대한 박테리아의 부착, 염증 진행, 및 치주 질환과 연관된 미생물 군집붕괴(dysbiosis)를 포함한 질환 발병의 다양한 양태에 영향을 미치는 핌브리아(fimbriae) 및 진지파인(gingipain)(시스테인 프로테아제의 그룹)을 포함하여, 전반적인 병독성에 기여하는 분자 배열을 보유한다(예를 들어, 문헌[Lamont et al. (1998) Microbiol . Mol . Biol . Rev. 62(4): 1244-63], 및 [Bostanci et al. (2012) FEMS Microbiol . Lett . 333(1): 1-9]. 이들 박테리아 병독성 인자 중 몇몇은 백신 개발을 위한 잠재적인 표적으로서 탐구되었다. 예를 들어, 문헌[Lamont et al., supra]; [Arjunan et al. (2016) Mol . Oral Microbiol . 31(1): 78093]; [Takahashi et al. (2006) Cell Microbiol . 8(5):738-57]; [Malek et al. (1994) J. Bacteriol . 176(4): 1-52-9]; [Gibson et al. (2001) Infect. Immun .69(12): 7959-63]; 및 [Evans et al. (1992) Infect. Immun. 60(7): 2926-35]을 참조한다.

치주염을 치료하는 (그리고 또한 치주염을 예방할 수 있는) 백신은 반복적인 임상 개입 및/또는 구강 수술의 필요성을 제거할 것이다. 치주 질환이 성인 집단의 상당 부분에서 발생하기 때문에 치주 질환에 대한 효과적인 치료 및/또는 예방 백신의 개발은 특히 유용할 것이다. 그러나, 치주염은 치태의 박테리아 조성, 숙주 유전자 구성, 및 치주 질환 발병과 표적으로 하는 백신 개발에 대한 잠재력의 기본적인 이해에 대한 고유의 장벽을 제공하는 환경적 인자를 포함한 인자를 갖는 다인성 질환이다.

이상적인 치주염 백신은 치주염이 있는 대상체에서 치료 효능을 달성하고 또한 예방적인 맥락에서도 효과적일 것이다. 공격적인 임상 개입에 대한 필요성이 제거될 것이고, 치주 질환을 앓는 개인의 수가 실질적으로 감소할 것이다. 추가적으로, 이상적인 백신은 대규모 생산이 가능한 비용 효율적인 공정을 사용하여 제조하기에 간단할 것이다.

본 발명은 당업계에서의 상기 언급된 필요성에 대해 다루며, 면역원성 조성물, 상기 조성물을 포함하는 백신 제형, 치주 질환을 치료 및 예방하는 방법을 제공한다.

제1 실시형태에서, (a) 포르피로모나스(Porphyromonas) 박테리아의 Mfa1 핌브릴린(fimbrilin) 단백질 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 Mfa1 항원 서열; 및 (b) HA1 항원 서열, HA2 항원 서열, 또는 HA1 항원 서열 및 HA2 항원 서열 둘 다를 포함하되, (i) HA1 항원 서열은 포르피로모나스 박테리아의 RgpA 진지파인 단백질 내에 함유된 RgpA 진지파인 헤마토글루티닌 도메인 1(본 명세서에서 "진지파인 HA1" 또는 "HA1"로도 지칭됨) 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성이고, (ii) HA2 항원 서열은 포르피로모나스 박테리아의 RgpA 진지파인 단백질 내에 함유된 RgpA 진지파인 헤마토글루티닌 도메인 2(본 명세서에서 "진지파인 HA1" 또는 "HA1"로도 지칭됨) 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인, 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.

이러한 실시형태의 일 양태에서, 적어도 하나의 폴리펩타이드는 (a) Mfa1 항원 서열 및 HA1 항원 서열; (b) Mfa1 항원 서열 및 HA2 항원 서열; 또는 (c) Mfa1 항원 서열, HA1 항원 서열, 및 HA2 항원 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서, 제1 폴리펩타이드는 Mfa1 항원 서열뿐만 아니라, HA1 항원 서열 및/또는 HA2 항원 서열을 포함하는 융합 단백질일 수 있음이 이해될 것이다. 관련 양태에서, 적어도 하나의 폴리펩타이드는 (a) Mfa1 항원 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및 (b) HA1 항원 서열, HA2 항원 서열, 또는 HA1 항원 서열 및 HA2 항원 서열 둘 다를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서, 이러한 양태에서, Mfa1 항원 서열은 하나의 폴리펩타이드 내에 존재하고, HA1 및 HA2 항원 서열은 제2 폴리펩타이드 내에 존재하며, 둘 다 존재하는 경우 제2 폴리펩타이드는 융합 단백질이다.

이러한 실시형태의 또 다른 양태에서, 면역원성 조성물의 적어도 하나의 폴리펩타이드는 Mfa1 항원 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드, HA1 항원 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드, 및 HA2 항원 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서, 이러한 양태에서, 각각 Mfa 1, HA1 및 HA2 항원 서열 중 하나를 함유하는 3개의 별개의 폴리펩타이드가 존재한다.

관련 양태에서, Mfa1 항원 서열, HA1 항원 서열, 및 HA2 항원 서열은 각각 피. 진지발리스(P. gingivalis), 피. 굴래(P. gulae), 피. 칸진지발리스(P. cangingivalis), 피. 진지비카니스(P. gingivicanis), 피. 카노리스(P. canoris), 피. 살리보사(P. salivosa) 및 피. 서쿰덴타리아(P. circumdentaria)로부터 선택되는 포르피로모나스 종의 Mfa1 핌브릴린 폴리펩타이드, 진지파인 HA1, 및 진지파인 HA2의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성이다.

이러한 실시형태의 또 다른 양태에서, Mfa1 항원 서열, HA1 항원 서열, 및 HA2 항원 서열은 각각 피. 진지발리스의 Mfa1 핌브릴린 폴리펩타이드, 진지파인 HA1, 및 진지파인 HA2의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성이다.

이러한 실시형태의 또 다른 양태에서, Mfa1 항원 서열, HA1 항원 서열, 및 HA2 항원 서열은 각각 피. 굴래의 Mfa1 핌브릴린 폴리펩타이드, 진지파인 HA1, 및 진지파인 HA2의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성이다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, 상기 기재된 바와 같은 면역원성 조성물 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 치주염 백신 제형이 제공된다. 통상적인 경우에, 제형은 적어도 1종의 부형제를 함유하며, 여기서 적어도 1종의 부형제는 비히클, 가용화제, 유화제, 안정화제, 보존제, 등장화제, 완충 시스템, 분산제, 희석제, 점도 조절제, 및 흡수 강화제로부터 선택된다. 백신은 추가적으로 또는 대안적으로, 적어도 하나의 보조제를 포함할 수 있다.

이러한 실시형태의 일 양태에서, 백신 제형은 멸균 주사용 용액으로 제형화된다. 이러한 실시형태의 관련 양태에서, 백신 제형은 사용 전에 재수화되는 동결건조된 조성물로 제형화된다.

또 다른 실시형태에서, 면역학적 유효량의 본 발명의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여함으로써 치주 질환에 대하여 대상체를 면역화시키는 방법이 제공된다. 이러한 실시형태의 일 양태에서, 방법은 치주염의 증상을 나타내는 대상체에서 치주염을 치료하는 것을 포함한다. 이러한 실시형태의 또 다른 양태에서, 방법은 중등증 내지 중증의 치주염을 포함하여 치주염이 발생할 소인을 가질 수 있는 대상체에서 치주염 발생 위험을 감소시키는 것을 포함하며, 여기서 소인은 위험 인자, 예컨대, 연령, 유전적 소인, 면역력 약화 상태, 치주염 발생 위험을 증가시키는 전신 질환, 근관 병변 또는 농양의 존재, 또는 다른 위험 인자와 연관된다. 중등증 내지 중증의 치주염 발생 위험을 증가시키는 전신 질환의 예는 당뇨병, AIDS, 백혈병, 및 다운 증후군을 포함한다.

도 1은 무세포 단백질 합성에 의해 생성된 정제된 폴리펩타이드 Mfa1, HA1, 및 HA2의 SDS-PAGE 분석결과.
도 2는 피. 진지발리스 Mfa1, HA1, 및 HA2에 대한 혈청 IgG EC₅₀ 값. 동물 G1 내지 G6의 그룹은 대조군 또는 실험군으로 작용하였고, 경구 시험투여(challenge) 직전(백신접종 후; 속이 빈 막대) 또는 희생 시(채워진 막대) 동물로부터 혈청 샘플을 수집하였으며, 피. 진지발리스 (A) Mfa1, (B) HA1, 및 (C) HA2에 대한 ELISA 데이터로부터 분자-특이적 IgG EC₅₀ 값을 계산하였다.
도 3은 생체 내에서 구강 뼈 손실에 대한 치주염 백신 제형의 효과를 평가하는 실험의 결과.

1. 용어 및 정의:

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 업계의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본 발명의 설명에 특히 중요한 구체적인 용어는 하기와 같이 정의된다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "폴리펩타이드"는 단일 폴리펩타이드뿐만 아니라, 조합될 수 있거나 조합되지 않을 수 있는 2종 이상의 상이한 폴리펩타이드의 조합을 말하고, "보조제"는 단일 보조제뿐만 아니라, 단일 조성물에서 별개일 수 있거나 조합될 수 있는 2종 이상의 보조제를 말하는 식이다.

본 명세서에서 "생물학적 분자"로도 지칭되는 "생체분자"는 자연 발생, 재조합으로 생산, 전체 또는 부분적으로 화학적으로 합성, 또는 화학적 또는 생물학적으로 변형되는지 여부, 즉 살아있는 유기체의 일부였거나 일부일 수 있는지 여부에 관계없이, 임의의 유기 분자이다. 이 용어는, 예를 들어 폴리펩타이드, 펩타이드 단편, 아미노산, 다당류, 지질 등을 포함한다.

용어 "폴리펩타이드"는 하나 이상의 아미노산으로 구성된 임의의 구조를 포함하는 것으로 의도되며, 따라서 다이펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 단편 및 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 형성하는 아미노산은 20가지의 통상적인 자연 발생 아미노산, 즉 알라닌(A), 시스테인(C), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 글리신(G), 히스티딘(H), 이소류신(I), 리신(K), 류신(L), 메티오닌(M), 아스파라긴(N), 프롤린(P), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 세린(S), 트레오닌(T), 발린(V), 트립토판(W), 및 타이로신(Y)뿐만 아니라, 비통상적인 아미노산, 예컨대, 통상적인 아미노산의 이성질체 및 변형물, 예를 들어 D-아미노산, 비단백질 아미노산, 번역후 개질된 아미노산, 효소로 개질된 아미노산, β-아미노산, 아미노산을 모방하도록 설계된 작제물 또는 구조물(예를 들어, α,α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, β-알라닌, 나프틸알라닌, 3-피리딜알라닌, 4-하이드록시프롤린, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-폼일메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, 및 노르-류신), 및 예를 들어 미국 특허 5,679,782(Rosenberg et al.)에 기재된 바와 같은 다른 비통상적인 아미노산 중 임의의 것일 수 있다. 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드는 2차 항원, 예를 들어 다당류와 컨쥬게이션을 가능하게 하는 작용기를 보유하는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 (a) 자연 발생, (b) 화학적 합성에 의해 생성, (c) 재조합 DNA 기술에 의해 생성, (d) 보다 큰 분자의 생화학적 또는 효소적 단편화에 의해 생성, (e) 상기 열거한 (a) 내지 (d)의 방법의 조합에 의한 방법에 의해 생성, 또는 (f) 펩타이드를 생성하는 임의의 다른 수단, 예컨대, 하기 기재된 무세포 단백질 합성에 의해 생성될 수 있다.

중합체 생체분자 서열, 예를 들어 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 용어 "서열 동일성", "서열 상동성 백분율", 및 "서열 상동성"은, 서열 비교 알고리즘, 예를 들어 BLASTP 또는 스미스-워터맨 상동성 검색 알고리즘(Smith-Waterman homology search algorithm)을 사용하여 측정될 때, 주어진 길이(비교 윈도우)에 걸쳐 최대 관련성에 대해 비교되고 정렬될 경우, 동일하거나 동일한 아미노산 잔기(또는 뉴클레오타이드, 또는 중합체 생체분자를 구성하는 단량체 단위의 다른 유형)의 명시된 백분율을 갖는 2종 이상의 서열을 지칭한다. 본 맥락에서, 서열 동일성 백분율은 생체분자의 전체 길이 또는 단지 일부에 걸쳐 결정될 수 있다. 서열 동일성 백분율을 계산하는 하나의 방법은 단어길이(W) 3, 기대치(E) l0, 블로썸62(BLOSUM62) 스코어링 매트릭스에서 설정된 디폴트 값을 갖는 BLASTP 프로그램이다(예를 들어, 문헌[Henikoff et al. (1989) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10915] 참조). 서열 정렬 및 % 서열 동일성의 예시적인 결정은 제공된 디폴트 파라미터를 사용하여, GCG 위스콘신 소프트웨어 패키지(GCG Wisconsin Software package; 엑설리스(Accelrys; 미국 위스콘신주 매디슨 소재))의 BESTFIT 또는 GAP 프로그램을 이용한다. 서열 동일성을 계산하는 이러한 바람직한 방법이 상이한 양을 제공한다면, 더 높은 서열 동일성을 제공하는 방법이 우선한다.

용어 "실질적으로 상동성"은 주어진 길이(예를 들어, 폴리펩타이드의 "x" 아미노산)에 걸친 서열 상동성 백분율이 적어도 약 50%, 따라서 예를 들어 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 99%, 및 100%인 것을 지칭한다.

"재조합" 폴리펩타이드는 재조합 DNA 기법에 의해 생성된, 즉 원하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 외인성 DNA 작제물에 의해 형질전환된 세포로부터 생성된 폴리펩타이드를 지칭한다. "합성" 폴리펩타이드는 화학적 합성에 의해 제조된 것이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역원성"은 면역 반응, 즉 체액 면역 반응 또는 세포 면역 반응, 및 바람직하게는 둘 다를 유발하는 항원(예를 들어, 폴리펩타이드)의 능력을 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 대상체는 본 명세서의 "유효량" 또는 "면역학적 유효량"의 면역원성 조성물의 투여에 대한 치료적 또는 보호성 면역학적 반응을 나타내어, 새로운 감염에 대한 저항성이 향상될 것이고/거나 치주 질환의 임상적 중증도는 감소될 것이다. 면역학적 반응은 보통 감염과 연관된 적어도 하나의 증상의 완화 또는 제거에 의해 입증될 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "정제된"이 분자와 관련하여 사용될 경우, 이는 정제된 분자의 농도가 자연 환경에서의 분자의 농도에 비해 증가되었음을 의미한다. 상기 용어는 또한 분자가 반응 생성물로서 생성된 반응 혼합부로부터 화학적으로 합성된 분자의 정제를 말할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"이 분자와 관련하여 사용될 경우, 상기 용어는 분자가 원래 환경으로부터 제거되었음을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 유기체에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 "단리된" 것이 아니지만, 자연 상태에서 공존 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 "단리된" 것이다. 자연 환경 또는 비자연 환경(예를 들어, 재조합 발현, 무세포 발현, 화학적 합성 등)으로부터 분리되었는지 여부에 상관없이 단리된 모이어티는 바람직하게는 적어도 약 1% 순도, 5% 순도, 10% 순도, 20% 순도, 30% 순도, 40% 순도, 50% 순도, 60% 순도, 70% 순도, 80% 순도, 90% 순도, 95% 순도, 또는 99% 순도이거나, 100% 순도일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "% 순도"는 관심의 분자로 구성된 조성물의 중량을 기준으로 한 백분율을 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 폴리펩타이드 또는 다른 생체분자의 "분자량"은 다각도 레이저 광 산란(MALS)과 조합된 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 계산된 분자량을 지칭한다.

용어 "치료하는"은 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신 제형의 투여에 의한 치료적 처치를 말하며, 여기서 목적은 감염을 감소시키거나 제거하는 것이다. 예를 들어, "치료하는"은 감염에 직접적으로 영향을 미치는 것, 감염의 억제, 저해, 및 제거뿐만 아니라, 감염과 연관된 증상의 중증도의 감소, 상기 증상의 개시의 지연, 및/또는 상기 증상의 감소를 포함할 수 있다. 달리 문맥상 명시적으로 나타내거나 암시되지 않는 한, 용어 "치료하는"은 "예방하는"(또는 예방 또는 예방적 처치)을 포함하며, 여기서 "예방하는"은 대상체에서 감염이 발생할 위험을 감소시키거나, 증상의 개시를 지연시키거나, 감염의 재발을 예방하거나, 감염의 발생을 예방하는 것을 말할 수 있다.

2. 면역원성 조성물 및 백신 제형:

본 발명의 제1 실시형태에서, (a) 포르피로모나스 박테리아의 Mfa1 핌브릴린 단백질 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 Mfa1 항원 서열; 및 (b) HA1 항원 서열 및/또는 HA2 항원 서열을 포함하되, HA1 항원 서열은 포르피로모나스 진지파인 HA1 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성이고, HA2 항원 서열은 포르피로모나스 진지파인 HA2 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인, 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 적어도 하나의 폴리펩타이드는 Mfa1 항원 서열, HA1 항원 서열, 및 HA2 항원 서열을 함유하는 융합 단백질일 수 있다. 적어도 하나의 폴리펩타이드는 또한 Mfa1 항원 서열 및 HA1 항원 서열을 함유하는 융합 단백질, 또는 Mfa1 항원 서열 및 HA2 항원 서열을 함유하는 융합 단백질일 수 있다. 이와 같은 실시형태의 변형에서, 적어도 하나의 폴리펩타이드는 Mfa1 항원 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 HA1 항원 서열 및 HA2 항원 서열 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.

그러나, 바람직한 실시형태에서, 면역원성 조성물 중 적어도 하나의 폴리펩타이드는 2개의 별개의 폴리펩타이드, 즉 Mfa1 항원 서열을 함유하는 제1 폴리펩타이드 및 HA1 항원 서열 또는 HA2 항원 서열을 함유하는 제2 폴리펩타이드를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 면역원성 조성물 중 적어도 하나의 폴리펩타이드는 3개의 별개의 폴리펩타이드, 즉 Mfa1 항원 서열을 함유하는 제1 폴리펩타이드, HA1 항원 서열을 함유하는 제2 폴리펩타이드, 및 HA2 항원 서열을 함유하는 제3 폴리펩타이드를 포함한다.

상기 논의된 바와 같이, Mfa1 항원 서열은 포르피로모나스 박테리아의 Mfa1 핌브릴린 단백질 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성이고, HA1 항원 서열은 포르피로모나스 진지파인 HA1 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성이며, HA2 항원 서열은 포르피로모나스 진지파인 HA2 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성이다. 이들 3가지 항원 내의 면역원성 서열은 집합적으로 또는 개별적으로 전장 단백질 또는 도메인(즉, Mfa 1 단백질, RgpA 진지파인 헤마토글루티닌 도메인 1, 및/또는 RgpA 진지파인 헤마토글루티닌 도메인 2), 또는 선택된 일부분이 포르피로모나스 박테리아 감염에 대하여 치료적 또는 예방적 면역원성 반응을 생성하는 능력을 갖는 조성물을 생성하는 한, 이와 같은 단백질 또는 도메인의 일부분(또는 단편)일 수 있다. 보통 전장 단백질 또는 도메인의 이러한 면역원성 일부분 또는 단편은 길이가 적어도 20개 아미노산 잔기이다. 원하는 면역원성 특성이 유지되는 경우, 항원 서열이 기반으로 하는 단백질 또는 도메인 서열의 길이는 설계 선택의 문제이며, 최대 및 전장 단백질 또는 도메인을 포함하여, 적어도 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 아미노산 잔기일 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드 내에 포함된 항원 서열은 천연 단백질 또는 도메인 서열(즉, Mfa1 핌브릴린 단백질, RgpA 진지파인 헤마토글루티닌 도메인 1, 및/또는 RgpA 진지파인 헤마토글루티닌 도메인 2)의 전장 또는 일부분 유래의 이러한 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성이다. 전형적으로, 보통 폴리펩타이드 생산의 방법론 또는 효율과 관련된 이유로, 본 발명의 폴리펩타이드 내에 포함된 항원 서열은 이들 서열이 상응하는 천연 면역원성 서열의 정확한 복제물이 아니다. 예를 들어, 최대 백분율 동일성 또는 상동성을 계산하기 위해 항원 서열 외부로서 처리될 수 있는 N-말단의 메티오닐은, 종종 시작 코돈의 첨가로 인해 존재한다. 유용한 면역원성 특성이 여전히 폴리펩타이드에 존재하는 경우, 첨가, 결실 및 치환(종종 보존적 치환)이 또한 발생할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상응하는 단백질 또는 도메인 내에서 발견되는 면역원성 아미노산 잔기 서열에 실질적으로 상동성인 항원 서열(즉, Mfa1 항원 서열, HA1 항원 서열, 또는 HA2 항원 서열)을 나타내는 아미노산 잔기 서열을 (내부에 또는 전체로) 포함하는 폴리펩타이드로 수행될 수 있으며, 여기서 면역원성 아미노산 잔기 서열은 전장 단백질 또는 도메인, 또는 이의 일부분 또는 단편임이 이해될 수 있다. 항원 서열의 실질적 상동성이 측정되는 이들 면역원성 아미노산 잔기 서열은 개별적으로, 길이가 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 또는 100개의 아미노산 잔기인 전장 단백질 또는 도메인, 또는 이의 일부분이다. 전형적으로, 이러한 항원 서열은 항원 서열의 실질적 상동성이 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100%의 수준에서 측정된 면역원성 아미노산 잔기 서열에 상동성이다. 동물 또는 인간에서 일상적인 시험은 전장 박테리아 단백질 또는 도메인의 일부분에 기초한 본 발명의 조성물이 당해 박테리아에 의한 감염에 대한 치료적 또는 예방적 면역원성 반응을 생성하는지 여부를 용이하게 입증할 수 있다.

Mfa1 핌브릴린 단백질은 포르피로모나스 박테리아에서 유래한 것이고, RgpA 진지파인 헤마토글루티닌 도메인 1 및 2는 또한 포르피로모나스 박테리아 유래인 RgpA 진지파인 단백질 내에 함유되어 있으며, 여기서 포르피로모나스 박테리아는 피. 진지발리스, 피. 굴래, 피. 칸진지발리스, 피. 진지비카니스, 피. 카노리스, 피. 살리보사 및 피. 서쿰덴타리아를 포함한 다양한 포르피로모나스 종의 임의의 것일 수 있다.

다양한 실시형태에서, Mfa1 핌브릴린 단백질은 피. 진지발리스로부터 유래된 것이다. 이러한 맥락에서 면역학적 유효량의, Mfa1 항원 서열과 함께 적어도 하나의 폴리펩타이드를 함유하는 조성물의 투여는, 항-Mfa1 항체가 생성되는 면역 반응을 유도하여, 피. 진지발리스 감염이 진행되는 병원성 경로 중 하나 이상을 방해할 것이다. 이러한 실시형태에서, Mfa1 항원 서열은 피. 진지발리스 박테리아의 Mfa1 핌브릴린 단백질 유래, 예컨대, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 피. 진지발리스 Mfa1 핌브릴린 단백질 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성이다.

하기 실험 섹션에 기재된 바와 같이 제조된 피. 진지발리스 Mfa1 핌브릴린 폴리펩타이드는 552개의 아미노산(이것 및 이후의 서열번호는 하기 기재된 무세포 합성에서 사용되는 시작 코돈으로부터 N-말단 메티오닐의 첨가를 포함함)을 함유하고 60,018의 분자량을 가지며, 이 때 아미노산 서열은 편의를 위해 하기에 복제한 서열번호 1이다:

이러한 실시형태에서, Mfa1 항원 서열이 피. 진지발리스로부터의 Mfa1 핌브릴린 단백질 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 것이 바람직하지만, 필수적이지는 않고, HA1 항원 서열이 피. 진지발리스 RgpA 진지파인 단백질 내에 함유된 RgpA 진지파인 헤마토글루티닌 도메인 1(HA1) 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실적으로 상동성일 것이며, 여기서, 예를 들어 면역원성 아미노산 서열은 서열번호 2를 갖는 HA1로부터 유래된 것일 수 있다. 유사하게, 이러한 실시형태에서, HA2 항원 서열이 피. 진지발리스 RgpA 진지파인 단백질 내에 함유된 RgpA 진지파인 헤마토글루티닌 도메인 2(HA2) 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 것이 바람직하며, 여기서 면역원성 아미노산 서열은 서열번호 3을 갖는 HA2로부터 유래된 것일 수 있다.

하기 기재된 바와 같이 제조된 피. 진지발리스 진지파인 HA1은 176개의 아미노산을 함유하고 19,059의 분자량을 가지며, 이 때 아미노산 서열은 편의를 위해 하기에 복제한 서열번호 2이다:

또한 하기 기재된 바와 같이 제조된 피. 진지발리스 진지파인 HA2는 442개의 아미노산을 함유하고 48,299의 분자량을 가지며, 이 때 아미노산 서열은 하기에 복제한 서열번호 3이다:

단일 면역원성 조성물 중 하나 이상의 폴리펩타이드에서 HA1 항원 서열 및 HA2 항원 서열 중 하나 또는 둘 다와 Mfa1 항원 서열을 조합하는 것은 포르피로모나스 감염과 연관된 치주 질환의 병원성 진행에 관여하는 다중 메커니즘, 즉 Mfa1 핌브릴린 단백질뿐만 아니라 RgpA 진지파인 단백질에 연관된 메커니즘을 표적으로 하는 것으로 여겨진다.

또 다른 실시형태에서, Mfa1 핌브릴린 단백질은 피. 굴래로부터 유래된 것이다. 이 경우에, Mfa1 항원 서열은 피. 굴래 박테리아의 Mfa1 핌브릴린 단백질 유래, 예컨대, 서열번호 4의 아미노산을 갖는 피. 굴래 Mfa1 핌브릴린 단백질 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성이다. 피. 진지발리스와 관련하여 설명한 바와 같이, HA1 항원 서열 및 HA2 항원 서열은 각각 피. 굴래 유기체의 RgpA 진지파인 단백질 내에 함유된 RgpA 헤마토글루티닌 도메인 1 및 RgpA 헤마토글루티닌 도메인 2 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성이어야 한다. 피. 굴래 HA1 유래의 면역원성 아미노산 서열은 서열번호 5로부터 유래될 수 있고, 피. 굴래 HA2 유래의 면역원성 아미노산 서열은 서열번호 6으로부터 유래될 수 있다.

피. 굴래 Mfa1 핌브릴린 폴리펩타이드(서열번호 4):

피. 굴래 진지파인 HA1(서열번호 5):

피. 굴래 진지파인 HA2(서열번호 6):

따라서 본 면역원성 조성물은 하기를 포함한다:

(1) (a) 서열번호 1을 갖는 피. 진지발리스 Mfa1 핌브릴린 단백질 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 피. 진지발리스 Mfa1 항원 서열, 및 (b) 서열번호 2의 피. 진지발리스 진지파인 HA1 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 피. 진지발리스 HA1 항원 서열을 포함하는 면역원성 조성물;

(2) (a) 서열번호 1을 갖는 피. 진지발리스 Mfa1 핌브릴린 단백질 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 피. 진지발리스 Mfa1 항원 서열, 및 (b) 서열번호 3의 피. 진지발리스 진지파인 HA2 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 피. 진지발리스 HA2 항원 서열을 포함하는 면역원성 조성물;

(3) (a) 서열번호 1을 갖는 피. 진지발리스 Mfa1 핌브릴린 단백질 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 피. 진지발리스 Mfa1 항원 서열, (b) 서열번호 2의 피. 진지발리스 진지파인 HA1 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 피. 진지발리스 HA1 항원 서열, 및 (c) 서열번호 3의 피. 진지발리스 진지파인 HA2 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 피. 진지발리스 HA2 항원 서열을 포함하는 면역원성 조성물;

(4) (a) 서열번호 4를 갖는 피. 굴래 Mfa1 핌브릴린 단백질 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 피. 굴래 Mfa1 항원 서열, 및 (b) 서열번호 5의 피. 굴래 진지파인 HA1 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 피. 굴래 HA1 항원 서열을 포함하는 면역원성 조성물;

(5) (a) 서열번호 4를 갖는 피. 굴래 Mfa1 핌브릴린 단백질 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 피. 굴래 Mfa1 항원 서열, 및 (b) 서열번호 6의 피. 굴래 진지파인 HA1 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 피. 굴래 HA2 항원 서열을 포함하는 면역원성 조성물; 및

(6) (a) 서열번호 4를 갖는 피. 굴래 Mfa1 핌브릴린 단백질 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 피. 굴래 Mfa1 항원 서열, (b) 서열번호 5의 피. 굴래 진지파인 HA1 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 피. 굴래 HA1 항원 서열, 및 (c) 서열번호 6의 피. 굴래 진지파인 HA1 유래의 면역원성 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 피. 굴래 HA2 항원 서열을 포함하는 면역원성 조성물.

바람직한 실시형태에서, 조성물은 백신 제형에 혼입하기에 적합한 면역원성 조성물을 포함한다. 상기 기재된 바와 같은 선택된 항원 서열을 함유하는 적어도 하나의 폴리펩타이드는 바람직하게는 단리 또는 정제된 형태로 조성물에 혼입되며, 여기서 용어 "단리된" 및 "정제된"은 본 명세서에서 앞서 정의되어 있다. 면역원성 조성물 중 적어도 하나의 폴리펩타이드의 양은 대상체에서 치료적 또는 예방적 면역 반응을 생성하기에 충분하고 효과적인 양, 즉 조성물을 전체 면역원성으로 만드는 양이다. 따라서, 백신 제형으로 면역학적 유효량의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하면, 본 섹션의 파트 (I)에서 설명된 바와 같은 면역 반응, 바람직하게는 포르피로모나스 감염과 연관된 치주 질환의 진행을 억제, 또는 상기 치주 질환의 개시를 예방하는 역할을 하는 반응을 유발할 것이다. 조성물 중 각각의 폴리펩타이드의 상대적인 양은 상당히 다양할 수 있다. 그러나, 조성물은 일반적으로 선택된 폴리펩타이드(예를 들어, (a) Mfa1 항원 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 HA1 항원 서열, HA2 항원 서열, 또는 둘 다를 포함하는 제2 폴리펩타이드; 또는 (b) Mfa1 항원 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드, HA1 항원 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드, 및 HA2 항원 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드)와 함께 제형화되며, 상기 폴리펩타이드는 조성물 중 각각의 폴리펩타이드 대 조성물 중 각각의 다른 폴리펩타이드의 중량비가 약 1:5 내지 약 5:1의 범위, 전형적으로 약 1:3 내지 약 3:1의 범위, 예를 들어 약 1:1.5 내지 약 1.5:1의 범위, 예를 들어 약 1:1에 상응하는 양으로 조합된다. 바람직한 실시형태에서, 조성물 중 각각의 폴리펩타이드 대 조성물 중 각각의 다른 폴리펩타이드의 중량비는 1:5 내지 5:1, 전형적으로 1:3 내지 약 3:1, 예를 들어 1:1.5 내지 1.5:1의 범위, 예를 들어 1:1이다. 따라서, 면역원성 조성물은 하기 중 하나일 수 있다:

(1) Mfa1 항원 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 HA1 항원 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 1:5 내지 5:1의 중량비로 조합함으로써 제형화된 조성물;

(2) Mfa1 항원 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 HA1 항원 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 1:3 내지 3:1의 중량비로 조합함으로써 제형화된 조성물;

(3) Mfa1 항원 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 HA1 항원 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 1:1.5 내지 1.5:1의 중량비로 조합함으로써 제형화된 조성물;

(4) Mfa1 항원 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 HA1 항원 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 약 1:1의 중량비로 조합함으로써 제형화된 조성물;

(5) Mfa1 항원 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 HA2 항원 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 1:5 내지 5:1의 중량비로 조합함으로써 제형화된 조성물;

(6) Mfa1 항원 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 HA2 항원 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 1:3 내지 3:1의 중량비로 조합함으로써 제형화된 조성물;

(7) Mfa1 항원 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 HA2 항원 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 1:1.5 내지 1.5:1의 중량비로 조합함으로써 제형화된 조성물;

(8) Mfa1 항원 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 HA2 항원 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 약 1:1의 중량비로 조합함으로써 제형화된 조성물;

(9) Mfa1 항원 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드, HA1 항원 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드, 및 HA2 항원 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드를 조합함으로써 제형화되는 조성물이되, 조성물 중 각각의 폴리펩타이드 대 조성물 중 각각의 다른 폴리펩타이드의 중량비가 1:5 내지 5:1의 범위인, 조성물;

(10) Mfa1 항원 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드, HA1 항원 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드, 및 HA2 항원 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드를 조합함으로써 제형화되는 조성물이되, 조성물 중 각각의 폴리펩타이드 대 조성물 중 각각의 다른 폴리펩타이드의 중량비가 1:3 내지 3:1의 범위인, 조성물;

(11) Mfa1 항원 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드, HA1 항원 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드, 및 HA2 항원 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드를 조합함으로써 제형화되는 조성물이되, 조성물 중 각각의 폴리펩타이드 대 조성물 중 각각의 다른 폴리펩타이드의 중량비가 1:1.5 내지 1.5:1의 범위인, 조성물; 및

(12) Mfa1 항원 서열을 포함하는 제1 폴리펩타이드, HA1 항원 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드, 및 HA2 항원 서열을 포함하는 제3 폴리펩타이드를 조합함으로써 제형화되는 조성물이되, 조성물 중 각각의 폴리펩타이드 대 조성물 중 각각의 다른 폴리펩타이드의 중량비가 약 1:1이어서, 3종 폴리펩타이드의 중량비가 약 1:1:1인, 조성물.

추가적인 항원: Mfa1 항원 서열 및 HA1 항원 서열 및/또는 HA2 항원 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩타이드에 추가적으로, 면역원성 조성물은 하나 이상의 추가적인 항원을 함유할 수 있다. 추가적인 항원은 포리피로모나스 발병 메커니즘 및/또는 독성 인자, 예를 들어 박테리아 타이로신 키나제 Ptk1(문헌[Bainbridge (2010) Infect. Immun . 78(11): 4560-69] 참조) 또는 포스포세린 포스파타제 효소 SerB(문헌[Wright et al. (2014) MicrobiologyOpen 3(3): 383-94] 참조)를 표적으로 하는 항체 반응을 유도하는 것일 수 있다. 포르피로모나스 유기체 이외의 병원체, 예컨대, 치주 질환의 진행과 연관된 복합미생물 바이오필름에 존재하는 경향이 있는 유기체에 관한 항원이 또한 조성물에 포함될 수 있다.

면역원성 조성물의 적어도 하나의 폴리펩타이드는 다양한 방법으로, 예를 들어 고상 또는 액상 화학 합성(전체 또는 부분적으로)에 의해, 프로테아제를 사용한 보다 긴 폴리펩타이드의 분해에 의해, 세포-기반 재조합 단백질 발현에 의해, 세포 배양물(예를 들어, 재조합 발현물)로부터의 정제 등에 의해 제조될 수 있다. 그러나, 폴리펩타이드를 제조하는 바람직한 방법은 미국 특허 9,040,253(Roy et al.), 미국 특허 9,650,621(Thanos et al.), 및 문헌[Murray et al. (2013) Current Opin. Chem . Biol . 17(3): 420-26]에 기재된, 확장가능한 무세포 단백질 합성("CFPS") 시스템이다. Mfa1, HA1, 및 HA2 폴리펩타이드 항원의 무세포 합성은 하기 실시예에 상세히 기재되어 있다.

본 발명은 또한, 예를 들어 현탁액, 용액으로, 또는 사용 전에 재수화되는 동결건조된 형태로, 대상체에게 투여하기 위한 멸균 제형으로 면역원성 조성물을 포함하는 백신 제형을 제공한다. 백신 제형은 Mfa1 항원 서열 및 HA1 항원 서열 및/또는 HA2 항원 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩타이드; 상기 설명한 바와 같은 선택적인 추가적 항원; 및 다음과 같은 보조제 및 부형제로부터 선택되는 적어도 하나의 추가적인 성분을 포함한다:

보조제: 백신 제형은 면역원성 조성물 중 하나 이상의 항원에 대한 면역 반응을 강화시키기 위해 하나 이상의 보조제를 함유할 수 있다. 본 제형에 혼입시키기에 적합한 백신 보조제는 관련 교재 및 문헌에 기재되어 있으며, 당업자에게 명백할 것이다. 주요 보조제 그룹은 다음과 같다:

알럼(alum)계 보조제, 예컨대, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 및 황산알루미늄을 포함한 미네랄 염 보조제뿐만 아니라, 다른 미네랄 염 보조제, 예컨대, 칼슘, 철, 및 지르코늄의 인산염, 수산화물, 및 황산염의 염;

퀼라야 사포닌 킬(Quillaia saponin Quil) A 및 킬 A-유래 사포닌 QS-21을 포함한 사포닌 제형뿐만 아니라, 콜레스테롤, 인지질, 및 사포닌의 혼합시 형성된 면역 자극 복합체(ISCOM);

그람음성 박테리아, 예컨대, 마이코박테리움(Mycobacterium) 종, 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum), 씨. 그라눌로섬(C. granulosum), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 및 나이세리아 메닌지티스(Neisseria meningitis) 유래의 세포벽 펩티도글리칸 및 지질다당류, 예컨대, 지질 A, 모노포스포릴 지질 A(MPLA), 다른 지질 A 유도체 및 모방체(예를 들어, RC529), 장내세균 지질다당류("LPS"), TLR4 리간드, 및 트레할로스 디마이콜레이트(trehalose dimycolate)("TDM")를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 박테리아-유래 및 박테리아-관련 보조제;

뮤라밀 펩타이드, 예컨대, N-아세틸 뮤라밀-L-알라닐-D-아이소글루타민("MDP") 및 MDP 유사체 및 유도체, 예를 들어 트레오닐-MDP 및 노르-MDP;

수중유(O/W) 및 유중수(W/O) 에멀션을 포함한 오일-기반 보조제, 예컨대, 스쿠알렌-물 에멀션(예를 들어, MF59, AS03, AF03), 완전 프로인트 보조제("CFA") 및 불완전 프로인트 보조제("IFA");

리포좀 보조제;

생분해성 및 비독성 중합체로 형성된 미소구체 보조제, 예컨대, 폴리(α-하이드록시산), 폴리(하이드록시 뷰티릭) 산, 폴리오쏘에스터, 폴라안하이드라이드, 폴리카프로락톤 등;

사이토카인을 포함한 인간 면역조절제, 예컨대, 인터류킨(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12), 인터페론(예를 들어, 인터페론-γ), 대식세포 집락 자극 인자, 및 종양 괴사 인자;

생체접착제 및 점막접착제, 예컨대, 키토산 및 이의 유도체 및 에스터화 히알루론산 및 미소구체 또는 점막접착제, 예컨대, 폴리(아크릴산), 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 다당류 및 카복시메틸셀룰로스의 가교된 유도체;

이미쿠아모드 및 이의 동족체, 예를 들어 레시퀴모드를 포함하는, 이미다조퀴놀론 화합물;

TLR-9 효현제, 예컨대, Hsp90 및 메틸되되지 않은 CpG 모티프를 함유하는 올리고데옥시뉴클레오타이드(예를 들어, 문헌[Bode et al. (2011) Expert Rev. Vaccines 10(4): 499-511] 참조); 및

이눌린-유래 보조제 감마 이눌린 및 알감물린을 포함하는 탄수화물 보조제, 및 다른 탄수화물 보조제, 예컨대, 글루칸, 덱스트란, 렌티난, 글루코만난, 갈락토만난, 레반, 및 자일란을 포함하는, 글루코스 및 만노스 기반의 다당류.

본 명세서의 예시적인 보조제는 알럼계 염, 예컨대, 인산알루미늄 및 수산화알루미늄을 포함한다.

백신 제형은 또한 다수의 기능 중 임의의 기능을 수행하기 위한 적어도 1종의 부형제, 보통 둘 이상의 부형제를 포함하며, 여기서 부형제는 "약학적으로 허용가능한" 면역학적 및 약리학적 비활성 성분이다. 본 명세서의 "약학적으로 허용가능한" 성분은 (1) 심각한 원치않는 생물학적 효과를 야기하거나 제형의 다른 임의의 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않고 대상체에게 투여되는 백신 제형에 포함될 수 있는 것; 및 (2) 미국 식품의약국이 작성한 비활성 성분(Inactive Ingredient)에 제시된 기준을 충족하며, 바람직하게는 또한 "일반적으로 안전하다고 볼 수 있는 물질(Generally Regarded as Safe)"("GRAS")로 지정된 것이다. 본 명세서에서 백신 제형에 혼입되는 부형제 또는 부형제들의 유형은 선택된 투여 방식 및 특정 제형 유형 또는 투약 형태, 예를 들어 주사용 액체 제형, 비강내 스프레이 제형 등에 부분적으로 의존할 것이며; 투여 방식 및 상응하는 제형은 하기에서 논의된다. 그러나 일반적으로, 본 발명의 백신 제형에 유리하게 혼입될 수 있는 비활성 성분은 비히클, 가용화제, 유화제, 안정화제, 보존제, 등장화제, 완충 시스템, 분산제, 희석제, 점도 조절제, 흡수 강화제, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 약학적으로 허용가능한 비활성 첨가제의 세부적인 논의는 문헌[Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th ed., ISBN: 0683306472]에서 입수 가능하다.

3. 투여 및 사용:

본 발명의 면역원성 조성물은 치주 질환에 대하여 대상체를 면역화시키는 방법에 유용하며, 여기서 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역원성 조성물을 포함하는 면역학적 유효량의 치주 백신 제형을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

대상체는 인간 또는 비인간 포유동물일 수 있고, 표적 박테리아(항원 서열이 상응하는 면역원성 아미노산 서열의 공급원일 것임)의 선택은 대상체의 유형에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 인간 대상체에서 치주염을 치료 또는 예방하는 데 사용되는 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 전형적으로 피. 진지발리스를 표적으로 할 것이다. 또 다른 예에서, 비인간 포유동물(이와 같은 대상체는 개, 말, 젖소, 고양이, 또는 다른 포유동물일 수 있음)에서 치주염을 치료 또는 예방하는 데 사용되는 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 일반적으로 피. 굴래를 표적으로 할 것이다.

본 방법은 치료 백신으로서, 즉, 치주염을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위해, 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 방법은 또한 예방 백신으로서 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 이는, 예를 들어 본 방법은 대상체에서 치주염(중등증 내지 중증 치주염을 포함함) 발생 위험을 감소시키고, 따라서 치주염의 발생을 연기하거나 제거할 수 있음을 의미한다. 백신이 예방적으로 사용될 경우, 대상체는, 연령; 유전적 소인; 면역력 약화 상태; 중등증 내지 증증의 치주염 발생 위험을 증가시키는 질환, 예컨대, 당뇨병, AIDS, 백혈병, 다운 증후군; 또는 근관 병변 또는 농양의 존재를 포함한, 임의의 다수의 위험 인자의 결과로서 치주염이 발생할 소인을 가질 수 있다. 예로서, 예컨대, 류마티스 관절염 또는 건선의 치료에서, 항-TNF 요법을 받는(즉, TNF 억제제, 예컨대, 에타너셉트(etanercept) 또는 아달리무맙(adalimumab)을 복용하는) 환자는 종종 치은 염증을 나타내며, 치주염이 발생할 위험이 높다.

백신 제형의 "면역학적 유효랑"은 단일 용량으로서 또는 일련의 2회 이상 용량의 일부로서 치주 질환을 치료 또는 예방하는 데 효과적인 양이며, 여기서 "치료하는" 및 "예방하는"은 본 섹션의 파트 (1)에 정의되어 있다. 투여되는 양은, 대상체의 전반적인 건강 및 신체 상태, 대상체의 연령, 관련 항체를 합성하는 대상체 면역계의 능력, 조성물의 형태(예를 들어, 주사용 액체, 비강 스프레이 등), 대상체의 생물분류학상 그룹(예를 들어, 인간, 비인간 영장류, 비영장류 등), 및 투여를 감독하는 의사에게 알려진 다른 인자를 포함한, 여러 인자에 따라서 달라질 것이다.

백신 제형으로서 면역원성 조성물의 투여는 임의의 효과적인 전신 전달 방식을 사용하여 수행될 수 있다. 조성물은 보통 비경구로, 예컨대, 정맥내, 근육내, 복강내, 세포간질내, 또는 피하 주사를 포함한 주사에 의해 투여되며; 주사는 또한 치은 주사일 수 있으며, 이 경우 백신 제형은 잇몸에 직접 주사된다. 추가적으로, 조성물은 경점막으로, 예컨대, 비강내, 설하, 볼(transbuccal), 질내, 또는 직장내 경로를 통하여 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여 방식도 또한 구상되며, 본 발명은 이와 관련하여 제한되지 않는다. 예로서, 다른 투여 방식은 경구 및 경피 전달뿐만 아니라, 흡입을 통하거나 피하 임플란트를 사용하는 투여를 포함한다.

투여 방식은 면역원성 조성물을 포함하는 제형 또는 투약 형태의 유형에 크게 영향을 미친다. 비경구 투여를 위해 제형화된 조성물은 멸균 수성 및 비수성 용액, 현탁액, 및 에멀션을 포함한다. 주사용 수용액은 수용성 형태로 활성 성분을 함유한다. 비수성 용매 또는 비히클의 예는 지방 오일, 예컨대, 올리브유 및 옥수수유, 합성 지방산 에스터, 예컨대, 에틸 올레에이트 또는 트라이글리세라이드, 저분자량 알코올, 예컨대, 프로필렌 글라이콜, 합성 친수성 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글라이콜, 리포좀 등을 포함한다. 비경구 제형은 또한 부형제, 예컨대, 가용화제, 유화제, 안정화제, 보존제, 등장화제, 완충 시스템, 분산제, 희석제, 점도 조절제, 흡수 강화제, 및 이들의 조합을 함유할 수 있다. 주사용 제형은 멸균제의 혼입, 박테리아-유지(bacteria-retaining) 필터를 통한 여과, 조사, 또는 열에 의해 멸균 상태가 된다. 이들은 또한 멸균 주사용 배지를 사용하여 제조될 수 있다. 면역원성 조성물 또는 이의 개별 성분은 또한 주사를 통한 투여 직전에 적합한 비히클을 이용하여 재수화될 수 있는 건조된 형태, 예를 들어 동결건조된 형태일 수 있다.

경점막 경로 중에서, 비강내 투여는 반드시 그런 것은 아니지만 일반적으로 바람직하다. 비강으로 투여된 백신 제형을 포함한, 비강내 제형은 당업계에 알려져 있으며, FDA의 [Guidance for Industry: Nasal Spray and Inhalation Solution, Suspension, and Spray Drug Products]를 참조하여 제형화되어야 한다. 비강내 제형은 스프레이, 비강내 주사, 또는 점적제로서 투여하기 위한 액체, 즉 용액, 에멀션, 현탁액 등이며, 상기한 바와 같은 보조제 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유할 수 있다. 제형 중 항원의 비교적 큰 크기 때문에, 비강내 경로를 통한 전신 전달은 면역원성 조성물 중 경점막 흡수 강화제의 혼입을 필요로 한다. 적합한 경점막 흡수 강화제의 예는, 알킬사카라이드, 사이클로덱스트린, 및 키토산을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니며; 문헌[Maggio (2014) J. Excip . Food Chem . 5(2): 100-12]; 및 [Merkus et al. (1999) Adv . Drug Deliv . Rev. 36: 41-57]을 참조한다. 강화제의 농도는 면역학적 유효량의 제형이 비강막을 통과하고 효율적인 수송 속도로 전신 순환계로 전달되는 것을 보장하도록 선택된다. 비강내 백신 제형의 조성 및 성질을 나타내는 다양한 해부학적 및 생리학적 고려사항은, 예를 들어 문헌[Aurora (October 2002) Drug Development & Delivery 2(7)]에 의해 논의된다.

다른 투여 방식 및 상응하는 제형은, 빠르게 용해되는 투약 형태, 예컨대, 빠르게 용해되는 정제를 이용한 설하 투여; 협측 패치 또는 다른 협측 전달 시스템을 사용하는 볼을 통한 투여; 페서리, 연고, 또는 크림을 사용하는 질내 투여; 직장 좌제, 연고, 또는 크림을 사용하는 직장내 전달; 경피 패치 또는 제형을 사용하는 경피 투여; 주사된 임플란트 또는 펠릿을 이용하는 피하 투여; 건조 분말 폐 제형을 사용하는 흡입; 및 경구 투약 형태, 예컨대, 정제, 캡슐 등을 사용하는 구강 투여를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 앞서 시사한 바와 같이, 백신 제형은 적절한 투약 요법의 맥락 내에서 대상체에게 투여된다. 조성물은 연장된 기간에 걸쳐 1회, 또는 2회 이상 간격을 두고 투여될 수 있다. 예를 들어, 초기 "프라임(prime)" 용량 다음에 적어도 하나의 "부스트(boost)" 용량이 투여될 수 있다. 프라임 용량 및 이후 부스트 용량 사이, 및 부스트 용량들 사이의 시간 간격은 보통 약 2 내지 약 24주의 범위, 보다 전형적으로는 약 2 내지 12주, 예컨대, 2 내지 8주, 3 내지 6주의 범위 등이다. 투여 방식, 예를 들어 근육내 주사, 치은 주사, 비강내 투여 등에 관계 없이, 백신의 단일 용량의 부피는 일반적으로 약 1㎕ 내지 약 500㎕의 범위, 전형적으로 약 1㎕ 내지 약 250㎕의 범위, 보다 전형적으로 약 2.5㎕ 내지 약 200㎕의 범위, 바람직하게는 약 5㎕ 내지 약 150μ㎕의 범위일 것이다. 면역원성 조성물 중 총 항원의 농도는, 상기 언급한 용량 부피 가이드라인으로부터 작업하여, 단위 부피당 조성물의 면역학적 유효량에 상응하는 것으로 이해될 것이다.

사용의 용이성을 위해, 본 발명의 면역원성 조성물은 자가 투여 또는 의사에 의한 투여를 위한 설명서를 포함한 포장된 제품, 또는 "키트"에 포함될 수 있다. 키트는 백신 제형의 일정 용량, 전형적으로는 면역학적으로 유효한 단일 투약 사건에 적절한 "단위 용량"의 백신 제형을 수용하는 밀봉된 용기를 포함한다. 백신은 액체 형태이어서, 주사 등으로서 투여할 준비가 되어 있을 수 있거나, 투여 전에 준비 공정, 예를 들어 동결건조된 제형의 수화, 비활성 성분의 활성화 등을 사용자가 수행할 필요가 있는 또 다른 형태일 수 있다. 키트는 또한 제1 용기에 프라임 용량이 있고 하나 이상의 추가적인 용기에 부스트 용량이 있거나, 제1 용기에 치주염 백신 제형이 있고 또 다른 용기에 포르피로모나스 감염과 관련이 있을 수 있거나 관련이 있지 않을 수 있는 또 다른 감염에 대한 백신이 있는 둘 이상의 밀봉된 용기를 포함할 수 있다.

실험

무세포 추출물의 생성:

문헌[Groff et al. (2014) Mabs 7(1):231-242]에 앞서 기재된 바와 같이 추가적인 DsbC 샤페론을 함유하는 무세포 추출물을 제조하였다. 간략하게, dsbC 유전자의 일렬 복제물을 보유하는 pACYC 플라스미드로 이. 콜라이(E. coli) 균주 SBJY001(문헌[Yin et al. (2012) Mabs 6(3):671-678] 참조)을 형질전환시켰다. 문헌[Zawada et al. (2011) Biotechnol . Bioeng . 108(7):1570-1578]에 기재된 바에 따라 세포를 성장시키고, 수확한 다음 균질화하였다. 원심분리를 통한 후속 정화로 후속 무세포 발현 반응에 사용된 추출물을 산출하였다.

재조합 피. 진지발리스 Mfa1 , HA1, HA2의 생성, 및 정제:

피. 진지발리스와 연관된 HA1, HA2 및 Mfa1 핌브릴린 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 코돈 최적화하고, 합성한 다음(DNA 2.0; 미국 캘리포니아주 멘로파크 소재) 앞서 기재한 pYD317 벡터로 클로닝하였다[30]. 본질적으로 앞서 기재된 바와 같이(Yin et al., supra; Zimmerman et al. (2014) Bioconjug. Chem. 25(2):351-361) 엑스프레스(Xpress) CFTM CFPS 시스템을 이용하여 무세포 반응을 수행하였다. HA1, HA2, 및 Mfa1 핌브릴린의 발현을 위해, 산화 글루타티온(2mM)을 첨가하여 25℃에서 IAM 전처리로 반응을 수행하여 이황화 결합을 위한 산화 환경을 생성하였다. 세포 추출물의 IAM 처리 없이 HA1 및 HA2의 발현을 수행하였고; 환원된 글루타티온(8mM)의 첨가로 환원 발현 환경을 유지시켰다. 16시간의 반응 시간 후, 제조자 권장 사항에 따라서 Ni 세파로스 수지(GE 라이프사이언시스(GE Lifesciences), 미국 펜실베이니아주 피츠버그 소재) 상에서 his-태그 친화성 정제를 사용하여 무세포 반응 혼합물로부터 발현된 단백질을 단리시켰다. SP 임프레스(ImpRes) 수지(GE 라이프사이언시스) 상에서 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 HA1, HA2뿐만 아니라, Mfa1 핌브릴린 단백질의 추가 정제를 달성하였다. 간략하게, Ni 세파로스 용리 풀(pool)을 시트르산나트륨(50mM), NaCl(50mM)(pH 4.5)로 교환하고, 동일 완충액에서 평형화된 컬럼에 적용하였다. 이어서, 구배 용리를 통해 트리스(Tris)(50mM), NaCl(1 M)(pH 7.5)로 연마된 단백질을 용리시켰다. 유사하게, Q 임프레스(GE 라이프사이언시스) 상에서 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 HA2를 추가로 정제시켰다. 트리스(50mM), NaCl(50mM)(pH 7.5)에서 컬럼 평형화 및 로딩을 수행하고, 이어서 트리스(50mM), NaCl(1 M)(pH 7.5)로 구배 용리하였다.

크로마토그래피를 연마한 후, 모든 단백질을 둘베코(Dulbecco's) PBS로 투석하고 SDS-PAGE를 통해 분석하고, Q-TOF(애질런트(Agilent), 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)를 통해 온전한 질량 분석을 하였다. HA1의 경우에, 결정적으로 온전한 질량 분석은 시스테인이 산화되어 예상된 이황화 결합을 형성하였음을 나타내었다.

피. 진지발리스의 배양 및 박테리아 순도 평가:

앞서 기재된 바와 같이(Huang et al. (2015) Mol . Oral. Microbiol . 30(6):438-450) 포리피로모나스 진지발리스 균주 A7436을 취급하였다. 간략하게, 혐기성 혈액 한천 플레이트 상에 냉동고 스톡을 도말하고, 37℃에서 3일 동안 혐기성 성장을 시킨 후 피. 진지발리스를 수집하고, 수확된 유기체를 L-시스테인(0.75 g/ℓ), 헤민(5 ㎎/ℓ), 및 메나디온(1 ㎎/ℓ)으로 보충된 멸균 뇌-심장 주입 브로스에 넣었다. 24시간 후, 원심분리에 의해 로그기(log-phase) 성장의 박테리아를 수확하고, 경구 시험투여(100㎕/시험투여)를 위한 무발열원 식염수 중 2% 카복시메틸셀룰로스 중 1×10¹⁰ CFU/㎖로 현탁시켰다. 면역화를 위해, 브로스에서 성장한 피. 진지발리스를 주사 등급 식염수 중 1×10⁹ CFU/㎖로 조정하고, 주사 전에 (60℃에서 30분 동안) 가열 사멸시켰으며, 박테리아 사멸은 도말로 확인하였다. 모든 피. 진지발리스 브로스 배양물에 대하여 그람-염색을 수행하여 순도를 보장하였다.

마우스, 면역화, 및 경구 시험투여:

6주령의 암컷 BALB/c 마우스(찰스 리버 라보라토리즈(Charles River Laboratories), 미국 메사추세츠주 윌밍턴 소재)를 6개의 그룹(n=8/그룹)으로 무작위로 분리하고, 병원체가 없는 특정 시설에 수용한 다음, 임의로 물과 음식을 주었다. IACUC 승인에 따라 모든 살아있는 동물 사용을 수행하였다. 그룹은 G1) 비면역화/경구 시험투여가 없는 대조군, G2) 비면역화/피. 진지발리스 경구 시험투여, G3) 가열 사멸한 피. 진지발리스 면역화/피. 진지발리스 경구 시험투여, G4) 알럼 중 Mfa1+HA1+HA2 조합 면역화/피. 진지발리스 경구 시험투여, G5) MPL 중 Mfa1+HA1+HA2 조합 면역화/피. 진지발리스 경구 시험투여, 및 G6) 주사 등급 식염수 중 Mfa1+HA1+HA2 조합 면역화/피. 진지발리스 경구 시험투여를 포함하였다. 면역화의 개시 전에, 각각의 동물로부터 기준 혈청 샘플을 수득한 다음, 알럼(임젝트(Imject), 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Sci), 미국 일리로이주 록퍼드 소재), 모노포스포릴 지질 A(MPL; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미시건주 세인트루이스 소재), 또는 주사 등급 식염수 중에 현탁된 사멸된 피. 진지발리스, 또는 Mfa1+HA1+HA2(각각의 단백질 5 ㎍/주사)의 근육내 주사에 의해 각각의 마우스 그룹을 면역화시켰다. 초기 면역화 후 2주, 및 4주째에 후속 근육내 부스터 면역화를 수행하였다. 면역화 완료 후 2주째에 피. 진지발리스를 경구 시험투여하기 직전에 동물로부터 혈청 샘플을 수득하였다. 앞서 보고된 바와 같이(Gonzalez et al. (2003) Infect. Immun. 71(4):2283-2287) 마우스의 경구 시험투여를 달성하였다. 간략하게, 동물은 10일 동안 식수 중 경구 설파메톡사졸/트라이메소프림(하이-테크 파미컬(Hi-Tech Pharmical), 미국 뉴욕주 아미티빌 소재)을 받은 다음, 항생제를 제거하고 3일 휴식을 취했다. 1주일 기간에 걸쳐 3회 피딩 니들(feeding needle)이 장착된 시린지를 사용하여 시험투여한 마우스의 잇몸에 피. 진지발리스 슬러리(주사 등급 식염수 중 1×10¹⁰ CFU/㎖ + 2% 카복시메틸셀룰로스)를 부드럽게 적용하였다. 대조군 동물은 2% 카복시메틸셀룰로스 단독으로 모의 시험투여한 동물을 포함하였다. 경구 시험투여을 완료한 다음 42일 휴식 후, 동물을 희생시키고, 말단에서 채혈하였으며, 각각의 마우스의 머리를 구강 뼈 손실 측정을 위해 처리하였다. 희생 시 각각의 동물로부터 최종 혈청 샘플을 수집하였고, -80℃에서 수집한 모든 혈청 샘플을 보관하였다.

마우스 혈청 중 Mfa1 -, HA1-, 및 HA2-특이적 IgG의 검출:

맥시소프(Maxisorp) 플레이트(NUNC, 미국 뉴욕주 로체스터 소재) 상에 4℃에서 밤새 항원(0.5 ㎍/㎖)을 도말하고, 트윈-20(Tween-20)(0.05%)을 함유하는 PBS로 3회 세척한 다음, 1% BSA가 포함된 PBS로 최소 1시간 동안 차단시켰다. 백신을 맞은 마우스 유래의 2배로 연속 희석된 혈청 샘플을 개별 웰에 첨가하고(100㎕/웰) 2시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고, 호스래디쉬 퍼옥시다제와 접합된 적절한 아이소타입 특이적 항체(1:6000 희석물; 서던 바이오테크(Southern Biotech), 미국 앨라배마주 버밍햄 소재)와 함께 인큐베이션시킨 다음, 100㎕의 TMB 기질(피어스(Pierce), 미국 일리노이주 록퍼드 소재)을 첨가하여 20 내지 30분 동안 시각화하였으며, 50㎕의 H2SO4(1.0 M)를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트 이상에 대한 교정을 위하여 450 ㎚에서의 흡광도에서 570 ㎚에서의 흡광도를 차감하여 각각의 웰에서의 흡광도를 측정하였다. 각각의 샘플에 대한 결과 데이터를 플롯팅하여 희석값의 역수 대 A450-A570 측정값의 곡선을 수득하였다. 프리즘(Prism) 통계 분석 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software), 미국 캘리포니아주 라호야 소재)를 사용하여 EC50 계산에 의해 정의된 바와 같은 희석 곡선의 중간점으로 항체 역가를 결정하였다. 각각의 코호트에 대한 EC50의 평균을 최종 항체 역가인 것으로 결정하였다.

구강 뼈 손실의 측정:

앞서 수행된 바와 같이(Gibson et al. (2001) Infect. Immun . 69(12): 7959-7963), 형태 분석에 의해 구강 뼈 수준을 결정하였다. 희생 후, 악골 구치 주위에서 연조직을 제거한 다음, 광범위하게 세정하고, 두개골을 메틸렌 블루로 염색하였다. 뼈 측정을 개시하기 전에, 그룹화를 인식하지 못하는 연구원이 샘플을 맹검하였다. 14개의 랜드마크 부위에서 치조골 돌출부(ABC)로부터 백악질 법랑질 접합부(CEJ)까지 입체현미경에 부착된 디지털 카메라를 사용하여 악골 구치에서 구강 뼈 측정 결과를 수득하였다(Baker et al. (1994) Arch. Oral Biol . 39(12): 1035-1040). 이미지J(ImageJ)를 사용하여 이미지 분석을 수행하고(Schneider et al. (2012) Nat. Methods 9(7): 671-675), 화면상의 픽셀 길이를 밀리미터로 변환한 다음, 그룹의 각각의 동물로부터 수득한 데이터를 합하여 그룹 수준 평균 길이 ± SEM을 얻었다.

통계 분석:

프리즘 통계 분석 소프트웨어(그래프패드)를 이용하여 데이터를 분석하였다. 쌍을 이루지 않은 스튜던트 T 시험(unpaired Student T test), 또는 사후 분석(post-test analysis)과 함께 ANOVA를 사용하여 그룹 간의 비교를 수행하였으며, P < 0.05를 유의한 것으로 간주하였다.

결과:

SDS-PAGE: CFPS에 의해 생성된 정제된 단백질을 변성시키고 웰에 첨가한 다음(3 ㎍/웰), 4 내지 12% 비스-트리스 구배 겔 상에서 분리하고, 쿠마씨 블루로 염색하였다. 환원 조건 하에서 생성된 단백질의 분석 결과는 도 1에 나타내었다. 레인 1: 분자 질량 마커. 레인 2: Mfa1. 레인 3: HA1. 레인 4: HA2.

근육내 주사에 의해 전달된 단백질이 단백질-특이적 IgG 항체 반응을 유발하는지 여부를 결정하고, 상이한 보조제(알럼 대 MPL)가 유발된 IgG 반응에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해, 면역화 기간의 완료 시 마우스 그룹으로부터 혈청을 수집하였으며, 희생 시 Mfa1-, HA1- 및 HA2-특이적 IgG의 수준에 대해 ELISA로 시험하였다. 각각의 혈청 샘플에 대한 적정 곡선을 EC₅₀ 값으로 전환시켰다. 예상한 바와 같이, 경구 시험투여 전에 비면역화 마우스 그룹으로부터 수집한 혈청은 Mfa1, HA1, 및 HA2에 대한 낮은 수준의 IgG를 가졌다. 사멸된 피. 진지발리스 A7436으로 면역화시킨 마우스로부터 수집한 혈청은 정제된 Mfa1, 및 HA2에 특이적인 IgG에서 명목상 증가를 유발하였으며, 이 때 HA2 > Mfa1이었다. 면역화된 마우스의 그룹에 있어서, 알럼, MPL, 또는 주사 등급 식염수 중에 현탁된 조합된 단백질을 이용한 IM은 백신 조합을 받은 모든 마우스가 항원-특이적 IgG 반응으로 반응하였음이 밝혀졌다. Mfa1에 대한 IgG의 면역 후 수준은 MPL 보조제에서 가장 강력했으며, MPL > 알럼 또는 식염수였다. HA1에 있어서, 알럼 > MPL > 식염수의 순으로 분자-특이적 IgG를 알럼이 가장 잘 촉진시킨 반면, HA2에 있어서는 알럼과 MPL이 유사한 수준으로 항원-특이적 IgG 반응성을 촉진시켰고 둘 다 식염수에서 관찰된 것보다 더 컸다.

희생 시 IgG 수준의 비교는, 피. 진지발리스 A7436으로 경구 시험투여한 비면역화 마우스 그룹이 Mfa1 및 HA2에 대해 특이적인 IgG에서 약간의 상승을 발생시켰지만, HA1에 대해서는 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다. 가열 사멸한 피. 진지발리스 A7436을 이용한 면역화는, 식염수 중 단백질 조합으로 면역화한 마우스 유래의 HA1에 대하여 측정된 IgG를 제외하고, 보조제 또는 식염수와 무관하게 경구 시험투여 직전에 측정한 IgG의 수준과 비교하여 유사한 저수준의 증가를 나타냈다.

도 2는 피. 진지발리스 Mfa1, HA1, 및 HA2에 대한 혈청 IgG EC₅₀ 값을 제공한다. 동물 G1 내지 G6의 그룹은 대조군 또는 실험군으로 작용하였고, 경구 시험투여 직전(백신접종 후; 속이 빈 막대) 또는 희생 시(채워진 막대) 동물로부터 혈청 샘플을 수집하였으며, 피. 진지발리스 (A) Mfa1, (B) HA1, 및 (C) HA2에 대한 ELISA 데이터로부터 분자-특이적 IgG EC₅₀ 값을 계산하였다.

단백질 조합이 피. 진지발리스로 유발된 경구 뼈 손실의 정도를 효과적으로 제한할 수 있는지 여부를 이해하기 위해, 면역화한 동물에 피. 진지발리스 경구 시험투여를 하였다. 면역화하지 않은, 또는 사멸된 피. 진지발리스로 면역화한 마우스의 그룹을 대조군으로 사용하였다. 모의 시험투여한 마우스(G1)와 비교하여, 피. 진지발리스 A7436으로 경구 시험투여한 동물(G2)는 ABC로부터 CEJ까지의 평균 거리의 증가로 입증된 바와 같이, 경구 뼈 손실을 발생시켰다(p<0.001). 예상한 바와 같이, 피. 진지발리스 A7436의 사멸된 제제(G3)를 이용한 면역화는 동종 유기체로 유발된 구강 뼈 손실로부터의 측정가능한 보호를 제공하였다(p<0.01). 알럼(G4) 또는 MPL(G5) 중에 현탁된 피. 진지발리스의 이종 균주로부터 생성된 조합 단백질 백신을 받은 마우스 그룹은 피. 진지발리스로 유발된 경구 뼈 손실로부터 보호되었다(피. 진지발리스 경구 시험투여 단독에 대하여 각각에 있어서 p<0.01). 보조제 간에는 보호 수준(ABC에서 CEJ 측정)의 어떠한 차이도 관찰되지 않았는데, 이는 백신 후보물의 근육내 전달이 유사한 보호 반응을 제공함을 나타낸다(p>0.05). 또한 식염수 용액 중에 현탁된 조합 단백질 백신으로 면역화된 동물 그룹(G6)은 또한, 단백질이 보조제와 함께 근육내로 전달될 경우 관찰된 것과 유사하게 피. 진지발리스 경구 시험투여에 대하여 보호되었으며(알럼 또는 MPL 보조제에 대해 p>0.05), 보호 수준은 이용된 보조제에 관계없이, 가열 사멸된 전체 유기체 백신 그룹에 의해 제공된 것과 유사하였음(전부에 대하여 p>0.05)을 관찰하였다.

도 3은 생체 내에서 구강 뼈 손실을 평가하는 실험의 결과를 나타낸다. (A) BALB/c 마우스를 그룹(G1 내지 G6)으로 무작위화하고, 면역화된 동물은 각각의 보조제, 또는 주사 등급 식염수 중의 조합 단백질 칵테일을 2주 간격으로 3회 근육내 주사를 받았다(최초 및 2회 부스트; 적색 화살표). 면역화 대조군(G3)은 가열 사멸된 피. 진지발리스를 받았다(1×10⁷ CFU/주사에 동등). 모든 동물에게 10일 동안 식수 중 설파메톡사졸/트라이메소프림(항생제)을 준 다음, 모의 경구 시험투여(G1), 또는 피. 진지발리스 경구 시험투여(1주 기간에 걸쳐 3회; G2 내지 G6) 3일 전에 항생제를 제거하였다. 경구 시험투여 완료 후(0주째), 6주 동안 동물을 휴식시킨 후, 희생시켰다. 도 3은 백악질 법랑질 접합부(CEJ)와 치조골 돌출부(ABC)사이의 평균 거리를 ㎜ ± SEM로 나타낸 결과를 제공하며, # = G1(시험투여 없음)에 대하여 p<0.001, *** = G2(피. 진지발리스 경구 시험투여 단독)에 대하여 p<0.01이다(던 다중 비교(Dunns multiple comparisons)와 함께 ANOVA를 사용함).

SEQUENCE LISTING <110> SUTROVAX, INC. <120> PERIODONTITIS VACCINE AND RELATED COMPOSITIONS AND METHOD OF USE <130> WO2019/075260 <140> PCT/US2018/055496 <141> 2018-10-11 <150> US 62/571,582 <151> 2017-10-12 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 543 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <223> Mfa1 fimbrilin <400> 1 Met Gly Asn Gly Pro Asp Pro Asp Asn Ala Ala Lys Ser Tyr Met Ser 1 5 10 15 Met Thr Leu Ser Met Pro Met Gly Ser Ala Arg Asp Gly Gln Asn Gln 20 25 30 Asp Asn Pro Gln Tyr Asn Phe Val Gly Glu Trp Ala Gly Lys Asp Lys 35 40 45 Ile Glu Lys Val Ser Ile Tyr Met Val Pro Gln Gly Gly Pro Gly Leu 50 55 60 Val Glu Ser Ala Glu Asp Leu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Asp Ala Pro 65 70 75 80 Thr Gln Glu Ala Gly Ser Asn Asn Val Ile Leu Lys Pro Lys Lys Gly 85 90 95 Ile Lys Val Asn Ser Ala Val Gly Lys Thr Val Lys Val Tyr Val Val 100 105 110 Leu Asn Asp Ile Ala Gly Lys Ala Lys Ala Leu Leu Ala Asn Val Asn 115 120 125 Ala Val Asp Phe Glu Ala Lys Phe Lys Glu Val Ile Glu Leu Ser Thr 130 135 140 Gln 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Thr Ser His Tyr Lys Arg Gly Asn Thr Ala Tyr Val Leu Val Arg 355 360 365 Ala Lys Phe Thr Pro Lys Lys Glu Ala Phe Ile Asp Lys Gly Lys Asp 370 375 380 Tyr Thr Asp Gly Thr Pro Val Pro Glu Tyr Thr Asp Gly Asp Asp Phe 385 390 395 400 Phe Val Gly Glu Asn Gly Gln Phe Tyr Val Ser Met Lys Ser Val Thr 405 410 415 Asp Pro Lys Val Gly Gly Val Ala Gly Met Lys Ala His Lys Tyr Val 420 425 430 Lys Gly Lys Val Leu Tyr Tyr Ala Trp Leu Asn Pro Ser Thr Thr Ser 435 440 445 Pro Asp Ser Trp Trp Asn Ser Pro Val Val Arg Asn Asn Ile Tyr His 450 455 460 Ile His Ile Lys Ser Ile Lys Lys Leu Gly Phe Asn Trp Asn Pro Leu 465 470 475 480 Val Pro Asn Pro Gln Asn Pro Asn Asp Pro Asn Gly Pro Ile Asn Pro 485 490 495 Asn Asn Pro Asp Pro Asn Pro Asp Glu Pro Gly Thr Pro Ile Pro Thr 500 505 510 Asp Pro Glu Gln Pro Leu Pro Asp Gln Asp Thr Phe Met Ser Val Glu 515 520 525 Val Thr Val Leu Pro Trp Lys Val His Ser Tyr Glu Val Asp Leu 530 535 540 <210> 2 <211> 167 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <223> Gingipain HA1 <400> 2 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Leu Cys 20 25 30 Leu Ser Ser Gly Gln Leu Asp Trp Leu Thr Ala His Gly Gly Thr Asn 35 40 45 Val Val Ala Ser Phe Ser Trp Asn Gly Met Ala Leu Asn Pro Asp Asn 50 55 60 Tyr Leu Ile Ser Lys Asp Val Thr Gly Ala Thr Lys Val Lys Tyr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Val Asn Asp Gly Phe Pro Gly Asp His Tyr Ala Val Met Ile 85 90 95 Ser Lys Thr Gly Thr Asn Ala Gly Asp Phe Thr Val Val Phe Glu Glu 100 105 110 Thr Pro Asn Gly Ile Asn Lys Gly Gly Ala Arg Phe Gly Leu Ser Thr 115 120 125 Glu Ala Asn Gly Ala Lys Pro Gln Ser Val Trp Ile Glu Arg Thr Val 130 135 140 Asp Leu Pro Ala Gly Thr Lys Tyr Val Ala Phe Arg His Tyr Asn Cys 145 150 155 160 Ser Asp Leu Asn Tyr Ile Leu Leu Asp Asp Ile Gln Phe Thr Met Gly 165 170 175 Gly Ser Pro Thr Pro Thr Asp Tyr Thr Tyr Thr Val Tyr Arg Asp Gly 180 185 190 Thr Lys Ile Lys Glu Gly Leu Thr Glu Thr Thr Phe Glu Glu Asp Gly 195 200 205 Val Ala Thr Gly Asn His Glu Tyr Cys Val Glu Val Lys Tyr Thr Ala 210 215 220 Gly Val Ser Pro Lys Val Cys Val Asn Val Thr Ile Asn Pro Thr Gln 225 230 235 240 Phe Asn Pro Val Lys Asn Leu Lys Ala Gln Pro Asp Gly Gly Asp Val 245 250 255 Val Leu Lys Trp Glu Ala Pro Ser Gly Lys Arg Gly Glu Leu Leu Asn 260 265 270 Glu Asp Phe Glu Gly Asp Ala Ile Pro Thr Gly Trp Thr Ala Leu Asp 275 280 285 Ala Asp Gly Asp Gly Asn Asn Trp Asp Ile Thr Leu Asn Glu Phe Thr 290 295 300 Arg Gly Glu Arg His Val Leu Ser Pro Leu Arg Ala Ser Asn Val Ala 305 310 315 320 Ile Ser Tyr Ser Ser Leu Leu Gln Gly Gln Glu Tyr Leu Pro Leu Thr 325 330 335 Pro Asn Asn Phe Leu Ile Thr Pro Lys Val Glu Gly Ala Lys Lys Ile 340 345 350 Thr Tyr Lys Val Gly Ser Pro Gly Leu Pro Gln Trp Ser His Asp His 355 360 365 Tyr Ala Leu Cys Ile Ser Lys Ser Gly Thr Ala Ala Ala Asp Phe Glu 370 375 380 Val Ile Phe Glu Glu Thr Met Thr Tyr Thr Gln Gly Gly Ala Asn Leu 385 390 395 400 Thr Arg Glu Lys Asp Leu Pro Ala Gly Thr Lys Tyr Val Ala Phe Arg 405 410 415 His Tyr Asn Cys Thr Asp Val Leu Gly Ile Met Ile Asp Asp Val Val 420 425 430 Ile <210> 4 <211> 539 <212> PRT <213> Porphyromonas gulae <223> Mfa 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Val Glu Arg Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Ser Thr Lys Ala Asp 210 215 220 Thr Phe Glu Ile Leu Ala Ala Asn Gln Ile Gly Glu Ile Ala Ala Gly 225 230 235 240 Ser Val Leu Ala Thr Ile Thr Asp Ile Arg Trp Val Val Ala Gln Gly 245 250 255 Glu Arg Arg Gln Tyr Leu Ser Lys Lys Arg Gly Thr Ile Gln Glu Asn 260 265 270 Thr Trp Val Thr Pro Gly Ser Asp Phe Val Pro Thr Ser Ser Thr Phe 275 280 285 His Thr Asn Ala Thr Glu Tyr Tyr Asp Tyr Ala Gly Trp Glu Asp His 290 295 300 Asn Thr Asp Pro Thr Val Ile Ser Gly Thr Gln Val Pro Thr Leu Ala 305 310 315 320 Asp Tyr Gln Leu Gln Asn Val Thr Asp Glu Leu Ala Gln Ser Leu Ser 325 330 335 Gly Lys Phe Leu Leu Pro Asn Thr His Lys Ser Gly Thr Asp Ala Ala 340 345 350 Thr Ser His Tyr Lys Arg Gly Asn Thr Ala Tyr Val Leu Ile Arg Ala 355 360 365 Lys Phe Thr Pro Lys Lys Glu Ala Phe Ile Asp Lys Gly Lys Thr Tyr 370 375 380 Thr Asp Gly Thr Gln Val Pro Glu Tyr Glu Ala Asp Gln Asp Phe Phe 385 390 395 400 Val Gly Glu Asn Gly Gln Phe Tyr Val Ser Met Lys Ser Val Thr Asp 405 410 415 Pro Lys Val Gly Gly Val Thr Gly Met Lys Ala His Lys Tyr Val Lys 420 425 430 Gly Lys Val Leu Tyr Tyr Ala Trp Leu Asn Pro Ser Thr Thr Ser Pro 435 440 445 Asp Thr Trp Trp Asn Ser Pro Val Val Arg Asn Asn Ile Tyr His Ile 450 455 460 His Ile Lys Ser Ile Lys Lys Leu Gly Phe Asn Trp Asn Pro Leu Val 465 470 475 480 Pro Asp Pro Asn Pro Asn Asp Pro Val Asn Pro Asn Asn Pro Asp Pro 485 490 495 Asn Pro Asp Glu Pro Gly Thr Pro Val Pro Thr Asp Asp Pro Glu Gln 500 505 510 Pro Leu Pro Asp Gln Asp Thr Phe Met Ser Val Glu Val Thr Val Leu 515 520 525 Pro Trp Lys Val His Ser Tyr Glu Val Asp Leu 530 535 <210> 5 <211> 166 <212> PRT <213> Porphyromonas gulae <223> Gingipain HA1 <400> 5 Met Thr Glu Ser Phe Asp Gly Gly Ile Pro Ala Thr Trp Thr Leu Ile 1 5 10 15 Asp Ala Asp Gly Asp Gly His Gly Trp Lys His Gly Lys Ala Pro Gly 20 25 30 Val Ala Gly Tyr Asn Ser Asn Gly Cys Val Tyr Ser Glu Ser Phe Gly 35 40 45 Leu Gly Gly Ile Gly Val Leu Thr Pro Asp Asn Tyr Leu Ile Thr Pro 50 55 60 Ala Leu Asn Leu Pro Asn Gly Gly Lys Leu Thr Phe Trp Val Cys Ala 65 70 75 80 Gln Asp Ala Ala Tyr Ala Ser Glu His Tyr Ala Val Tyr Ala Ser Ser 85 90 95 Thr Gly Asn Ala Ala Ser Asn Phe Thr Asn Ala Leu Leu Glu Glu Thr 100 105 110 Leu Thr Ala Lys Gly Val Arg Ser Pro Glu Ala Ile Arg Gly Arg Val 115 120 125 Gln Gly Thr Trp Tyr Gln Lys Thr Val Asp Leu Pro Ala Gly Thr Lys 130 135 140 Tyr Val Ala Phe Arg His Phe Gln Ser Thr Asp Met Phe Tyr Ile Asp 145 150 155 160 Ile Asp Glu Val Glu Ile 165 <210> 6 <211> 173 <212> PRT <213> Porphyromonas gulae <223> Gingipain HA2 <400> 6 Met Asn Ala Lys Arg Ser Glu Leu Leu Asn Glu Asn Phe Glu Gly Asp 1 5 10 15 Asp Ile Pro Ala Gly Trp Thr Ala Leu Asp Ala Asp Gly Asp Gly Asn 20 25 30 Asn Trp Gly Val Gln Leu Asn Gln Phe Thr Arg Gly Glu Arg Glu Ala 35 40 45 Leu Ala Pro Leu Arg Ala Ser Asn Val Ala Ile Ser Tyr Ser Ser Leu 50 55 60 Asn Gln Gly Gly Gly Tyr Leu Pro Leu Thr Pro Asn Asn Phe Leu Ile 65 70 75 80 Thr Pro Lys Val Glu Gly Ala Lys Lys Ile Ser Tyr Lys Val Gly Ser 85 90 95 Pro Gly Asn Gln Ser Trp Ser His Asp His Tyr Ala Leu Cys Ile Ser 100 105 110 Lys Thr Gly Thr Ala Ala Ser Asp Phe Glu Ile Ile Phe Glu Glu Thr 115 120 125 Met Val Tyr Ser Gln Gly Gly Ala Asn Phe Thr Arg Glu Lys Asp Leu 130 135 140 Pro Asp Gly Thr Lys Tyr Val Ala Phe Arg His Tyr Asn Cys Thr Asp 145 150 155 160 Val Leu Ala Ile Val Ile Asp Asp Val Val Ile Thr Gly 165 170

Claims (50)

1. 치주 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 적어도 하나의 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물로서,
   상기 적어도 하나의 재조합 폴리펩타이드는,
   (a) 서열번호 1의 서열을 포함하는 Mfa1 항원 서열; 및
   (b) HA1 항원 서열 및 HA2 항원 서열을 포함하되,
   (i) 상기 HA1 항원 서열은 서열번호 2의 서열을 포함하고,
   (ii) 상기 HA2 항원 서열은 서열번호 3의 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 재조합 폴리펩타이드는, 상기 Mfa1 항원 서열과 HA1 항원 서열과 HA2 항원 서열을 포함하는 제1 재조합 폴리펩타이드를 포함하는, 면역원성 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 재조합 폴리펩타이드는,
   (a) 상기 Mfa1 항원 서열을 포함하는 제1 재조합 폴리펩타이드; 및
   (b) 상기 HA1 항원 서열과 상기 HA2 항원 서열을 포함하는 제2 재조합 폴리펩타이드
   를 포함하는, 면역원성 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 재조합 폴리펩타이드는,
   (a) 상기 Mfa1 항원 서열을 포함하는 제1 재조합 폴리펩타이드;
   (b) 상기 HA1 항원 서열을 포함하는 제2 재조합 폴리펩타이드; 및
   (c) 상기 HA2 항원 서열을 포함하는 제3 재조합 폴리펩타이드
   를 포함하는, 면역원성 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 대상체의 치주 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제1항의 면역원성 조성물 및 적어도 1종의 부형제를 포함하는, 백신 제형.
10. 삭제
11. 삭제
12. 제9항에 있어서, 상기 적어도 1종의 부형제는 비히클, 가용화제, 유화제, 안정화제, 보존제, 등장화제, 완충 시스템, 분산제, 희석제, 점도 조절제 및 흡수 강화제로부터 선택되는 것인, 백신 제형.
13. 제12항에 있어서, 보조제를 더 포함하는, 백신 제형.
14. 제9항에 있어서, 멸균 주사용 용액으로 제형화되는, 백신 제형.
15. 제9항에 있어서, 동결건조된 형태인, 백신 제형.
16. 제9항에 있어서, 상기 치주 질환은 피. 진지발리스(P. gingivalis)에 의해 야기되는, 백신 제형.
17. 삭제
18. 제16항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 백신 제형.
19. 삭제
20. 제16항에 있어서, 상기 대상체는 비인간 포유동물인, 백신 제형.
21. 제9항에 있어서, 상기 백신 제형은 멸균 주사용 용액을 포함하고, 주사에 의해 상기 대상체에게 투여되는, 백신 제형.
22. 제21항에 있어서, 상기 백신 제형은 근육내 주사로 투여되는, 백신 제형.
23. 제21항에 있어서, 상기 백신 제형은 치은 주사로 투여되는, 백신 제형.
24. 제9항에 있어서, 상기 백신 제형은 경점막으로 투여되는, 백신 제형.
25. 제24항에 있어서, 상기 백신 제형은 비강내로 투여되는, 백신 제형.
26. 제9항에 있어서, 상기 백신 제형은 1회 투여되는, 백신 제형.
27. 제9항에 있어서, 상기 백신 제형은 2회 이상 투여되는, 백신 제형.
28. 제9항에 있어서, 상기 대상체는 치주염의 증상을 나타내고, 상기 백신 제형은 치료 백신으로서 투여되는, 백신 제형.
29. 제9항에 있어서, 상기 대상체는 치주염을 발생시키는 적어도 하나의 위험 인자를 갖는, 백신 제형.
30. 제29항에 있어서, 상기 적어도 하나의 위험 인자는 연령, 유전적 소인, 전신 질환, 근관 병변 또는 농양의 존재, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 백신 제형.
31. 제1항에 있어서, 치주 질환에 의해 야기된 뼈 손실이 감소되는, 면역원성 조성물.
32. 제9항에 있어서, 치주 질환에 의해 야기된 뼈 손실이 예방되는, 백신 제형.
33. 제1항에 있어서, 치주 질환에 의해 야기된 염증이 감소되는, 면역원성 조성물.
34. 제9항에 있어서, 치주 질환에 의해 야기된 염증이 감소되는, 백신 제형.
35. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 재조합 폴리펩타이드가 무세포 단백질 합성에 의해 생성되는, 면역원성 조성물.
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