JPS59128338A - 歯周炎予防用ワクチン及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は歯科用ワクチンとくに歯周炎予防または抑制用
ワクチンに関する。この種のワクチンはまだ知られてい
ない。この明細誓において歯周炎というのは、歯周組織
すなわち歯肉、歯根膜、セメント質、歯槽骨に及ぶ広範
囲の炎症のことで、一般に辺緑性出周炎と根尖性歯周炎
に大別され、前者の代表的なものは歯槽膿漏である。歯
周炎には各種の病型があるが、その原因の一つとして、
アクチノミセス属やバクテロイデス属に属する細菌の増
殖による歯牙面への歯垢付着、歯周ポケットの形成など
による歯周組織の破壊があげられている。たとえば、ア
クチノミセス・ビスコラジスが蔗糖を分解して強粘着性
のレバン多糖体やヘテロ多糖体を産出し、これらが歯牙
面に集塊となって付着すると歯周炎の原因となること、
およびアクチノミセス・ビスコラジスやアクチノミセス
・ナイセリンディが歯牙面に付着して歯周炎を誘発する
ことが知られている。そしてアクテノミセス・ビスコウ
ジスやバクテロイデス・ジンジバリウスなどの細菌が歯
周炎病巣内の細菌の大部分を占めることも実際にしばし
ば観察されている。これらの細菌は菌体表面に線毛層を
有し、これによって歯周組織によく付着することができ
ることが認められる。１ 本発明は、歯周炎誘発能を有するアクナノミセス属また
はバクテロイデス属細菌の菌体表面の線毛層が歯周炎を
予防ま／こは抑制する作用ををもつ抗原として有用であ
るとの知見に基いている、。

促って本発明の目的は、とくにアクナノミセス属捷たは
バクテロイデス篇に属する口腔常在の細菌によって誘発
される歯周炎を予防１／ヒは抑制するブζめの歯科用ワ
クチンを提供することにある。本発明によって提供され
る歯科用ワクチンは、歯周炎誘発能を有しかつ菌体表面
しζ線毛ｋｊを有する細菌の線毛層を抗原とすることを
％徴としている・ 本発明の目的に利用し得る細菌は、歯周炎誘発能を有し
かつ菌体表面に線毛層を有し、これによって歯牙面また
は苗筒組織に付着し得るものであれば何でもよいが、上
述の理由から、アクナノミセス属またはバクテロイデス
属に属する細菌を用いることが実用的である。これらの
実用的細菌の例は、アクナノミセス・ビスコラジス、ア
クナノミセス・ナイセリンデイおよびバクテロイデス・
ジンジバリウスである。歯周炎誘発能を有しかつ菌体表
面の線毛層によって歯牙面または歯周組鎗に付着する能
力を有する限り、これらの変異株を用いることもできる
。

下記の実施例および試験例において用いられ／ζ菌株の
うち、アクナノミセス・ビスコラジス変異株に−ＴＬ子
株（微工研菌寄第６５１６号）は、本発明者が、ヒトの
歯周炎病巣から分離した同種の野外株を公知の変異訪導
法で処理して作出した突然変異株であって、これをＴＹ
Ｏ培地やＴＹＯ寒天平板培地で培養すると、培地中の蔗
糖を分解して、剥１株や公知の他の同極の菌株よりもさ
らに粘着性の強い多片のレバン多糖体を産生じ、たとえ
ば試馴管内の液体培養でば管壁に多くの菌株が付７ｈす
る。継代培養をくり返しても、ｉたは公知の変異１秀導
処理にトロソグア二二ジンや紫外線照射など）を行なっ
ても、この菌株の性状は安定で、逆変異や他の変異株の
出現はｂ３められない。ゴールデンハムスターへの経口
投与では、このｍ１株は歯によ〈定着し、う餘誘発飼料
でハムスターを飼肯すると、強い歯周炎誘発能の存在が
爾（Ｗ骨吸収の測定から認められる。次に実施例および
試ｈ！例に記載され株 たバクテロイデス・ジンジバリウスに−Ｂｇ−ｍｌ△ 株（微工研菌寄第６５１５号）は、本発明者がヒトの歯
周炎病巣から分離した同種の多数の野外株から、赤血球
凝集反Ｌ５．および細胞付着能の強さのり１点から選ん
だものであって、他の同種の菌株と比較すると、口腔粘
膜上皮細胞などへの伺２１“能と赤血球Ｇ〔集能とが極
めて強い菌株である。ゴールデンハムスターへの経口投
与では、この菌株の定着性は必ずしも良好ではないが、
上述のアクナノミセス・ビスコラジス変異株に−ＴＬ子
株の感染定着後、歯周炎発症開始期の前後に経口感染を
行なうと、よく定着する。このような混合感染を行なう
と、上記変異株に−ＴＬ子株単独感染時よりも、さらに
強い歯周炎の出現することが、歯槽骨吸収測定から認め
られる。

両菌株の蘭学的性状は次の通りである。

（Ａ）　　アクナノミセス・ビスコラジス変異株に−Ｔ
Ｌ子株（微工研薗寄第６５１６号） ■、形態 （１）菌型および大きさ 桿菌、１μ×３−４μ、ダラム陽性。

■１発育条件 嫌気性（微好気性） ■、各種培地における生育状態 （１）ＴＹＯ寒天平板培地〔ｐ）■約７．２；５ｔｏｐ
ｐｅｌａａｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ａｒｃｈ、　０ｒａｌＢ
ｉｏｌ、　１２．１１９９−１２０１　（１９６７））
辺縁不規則の塊状に隆起した、粗大顆 粒状の長門のレバン多糖体で覆わｆ′した、固着性の白
色不透明の硬い集落をつくる。

（２１フレーンハー１−・インフュージョン寒天平板培
地（ｐｌ−（約７．４；米国Ｂ　Ｂ　Ｌ社製；　９　ｃ
ｔｒｂシャーレ） 正円形の大きな隆起の厚い均質の底面 と平滑な辺縁とを有する、無色半透明の蛯畜をつくる。

（３）トリプトク′−ス・ソイプロス（ｐ）１７．８；
米国１３　Ｂ　Ｔ、社製） 培地の深部より増殖する。

（４）　　ドツトヒユーイツトプロス（ｐｎ約７゜８；
米国ＢＢＬ社製） 培地の下層部より増殖する。

■、生理学的性状 （１）　　レバン多拗体産生　　　　　　　＋ｊト（２
）伺着能（試験管壁） （３）色素の生成　　　　　　　　　　−（４）生育の
範囲 ｐＩ（６８，５ 温度　　　　　　　２２−３９８Ｃ （５）糖分解 アトニット　　　　　　　　　− アラビノース　　　　　　　− デキストリン　　　　　　　　− フルクトース　　　　　　　　＋ ガンクト−ス　　　　　　　＋ グルコース　　　　　　　　− イヌリン　　　　　　　　　− ラクトース　　　　　　　　　− ７／′トー８　　　　　　　　　　＋ マンノース　　　　　　　　士 メリビオース　　　　　　　＋ ラフィノース　　　　　　　＋ シュークロース　　　　　　＋ キシロース　　　　　　　　　− ■、諸性状 力３′ラーゼ　　　　　　　　　＋ インドール　　　　　　　　　− 硝酸塩還元性　　　　　　　　十 硫化水素産生　　　　　　　　十 ゲラチン氷解性　　　　　　　− エスクリン加水分解　　　　　十 口腔粘膜上皮細胞付着性　　　廿 ■、動物に対する感染性 歯周炎発症性（ゴールチンハムスターに対する歯槽骨吸
収により測定）　＠ （Ｂｌ　　バクテロイデス・ジンジバリウス株Ｋ　−Ｂ
　ｇ−ｍ１株（微工研菌寄第６５１５号） ■、形態 （１）菌型および大きさ オ♀菌、０．５μ×０．８ｆｔ、ダラム陰性。

■０発育条件 イＷｌｉ性嫌気性 ■。各種培地における生育状態 （リ　１０チ血′ｅ、寒天平板培地 正円形、大きな平面扁平、表面および 辺縁平滑な・やや光沢のある黒色の集落をつくり、溶血
性は示さない。

（２）バクテロイデス寒天平板培地（ｐｒＴ約７゜２；
日永製薬製；９Ｑ１７にシャーレ）正円形、やや小さな
扁平均質の表面お よび辺縁平滑な、光沢のある透明な集落をつくな。

（３）　　）リグトり一−−ス・ソイプロス培地の１層
部よシ増殖−する。

■、生理学的性状 （１）色素の形成　　　　　　　　− （２）　　生育の範囲 ｐ）−１５，０−８，５ 温鵬　　　　　　　　２２−３９°Ｃ （３）糖分解 アドニトール　　　　　　　− アラビノース　　　　　　　　− テキストリン　　　　　　　− フルクトース　　　　　　　　− ガラクト−ス　　　　　　　− ク゛ルコース　　　　　　　　　− イヌリン　　　　　　　　　− ラクトース　　　　　　　　　− マルトース　　　　　　　　　− マンノース　　　　　　　　　− メリヒオース　　　　　　　− ラフィノース　　　　　　　− シュークロース　　　　　　− Ｖ、　諸性状 連動性　　　　　　　　　　　− インドール産生　　　　　　　十 硝酸塩還元性　　　　　　　　− 石［Ｌ化水素産生　　　　　　　　十 ゲラチン氷解件　　　　　　　十 エスクリン加水分解　　　　　− 口腔粘膜上皮細胞＋Ｊ着件　　　＋−１１赤血球凝集性
　　　　　　　　ｍ ■、動物に対する感染性 歯周炎発に性（コールテンハムスターに対する歯他帽・
吸収により測定）　土 上記両菌株の私養は同槓の公知菌株の培養に常用される
培ｉ法で行なうことができる。すなわち、培地は天然培
地でも合成培地でもよいが、大量の培養には液体培地で
の嫌気的培養が適している。培地のｐ）Ｉは５．０−８
．０たとえば約７．４で、温度は２２−３９℃たとえば
３７℃が適している。一般に培養は４８〜７２時間で完
了する。実施例および試験例において用いた培地の組成
は下記の通りである。

培地Ａ　（ＰＨ７，４±） トリプトケースペプトン（米国ＢＢＬ社製）１．７％、
ファイトンペプトン（同上）０．３％、イーストエキス
（米国ディフコ社製）０．５％、リン酸二カリウム０．
２５　ｑ６、塩化ナトリウムｏ、５ｑ６、ブドー糖０．
２５％。

培地Ｂ　（ｐＨ７，８） 培地Ａにヘミン０．００７％を加える、アクテノミセス
・ビスコラジスの培養には培地人を。バクテロイデス・
ジンジバリウスの培養には培地Ｂを用い、生育菌数約１
億７−を培養完了の基進とした。

本発明によるワクチンを各種の公知方法によって製造す
ることができる。下記に実用的な製蹟法を例示する。

（Ａ）　　アクチノミセス・ビスコラジスの使用例。

培地Ａを用い、温度３５−３７℃、ｐＨ６，５−８，０
たとえば約７．５で２４時間培養して得た種培養液を同
じ組成の本培地に接種して培養する。本培３ｉ−の条件
によって異なるが、通常７２時間培養すると、培地中の
生菌数が最高（約１億７ｍ１）となる。培養液から遠心
処理（たとえば８０００　ｒ、ｐ、ｍ、　７２０分間）
で菌体を分離する。線毛層を回収するために、菌体を０
．５−ＩＲＪ酢醒酢酸酢酸　ＩＪウム緩衝液（ｐＨ６，
８）’ｆたけ１Ｍ塩化す）　ＩＪウム加１／７５　Ｍリ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）で処理する。遠心処理によ
って得た上溝中に含有される線毛を回収するために、固
形硫酸アンモニウム１２−．１５仰を面接に上溝に加え
・撹拌溶解し、４℃で２４−４８時間以上静置して線毛
を沈殿させる。上清を除去した後、遠心処理（８０００
ｒ、ｐ、ｍ。；２０分間）により、沈殿を回収する。上
むソおよび菌体から回収された線毛層成分を混合し、常
法、たとえ応 ば等常法、エタノールその他の溶媒分画沈殿△ 法、膜濃縮法、カラム分画法、硫酸アンモニウムによる
塩析法または蔗糖密度勾配遠心法などの単独−１：は組
合わせによって、線毛層を分離精製することができる。

（Ｂ）　　バクテロイデス・ジンジバリウ／使用例。

培地Ｂを用いて３５−３７°ＣでｐＨ６，５−８，０た
とえば約７．５で２４時間培養して得た種培養液を同じ
組成の培地で本培養する。培養時間は条件により異なる
が通常７２時間で培養が完了する。この時の培養液の生
菌数は約１億／　ｍｌである。線毛層を培養液セよび菌
体から回収し分離する方法は上記Ａの方法に準じること
ができる。

次に、こうして得られたアクチノミセス・ビスコラジス
またはバクテロイデス・ジンジバリウス属細菌の線毛層
分画を／７５Ｍリン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ６，２）で、
線毛層分画の成分がタンパクＮ　Ｏ，０５Ｔｎ９／ｍ１
以上になるように希釈し、アジュバントとして水酸化ア
ルミニウムゲルをアルばニウムの最Ｐ：濃度が０．０５
−０．２ｍ９る。上記両菌株以外の菌株を用いる場合も
、上記方法に慈じて歯周炎予防および抑制に有効な歯利
用ワクチンを製造することができる。

本発明によるワクチンを使用する際の投与量は、膚周炎
の病型、病状等各種の条件によって異なるが、通常は、
ヒトに対して１回０．２−１．０ｍｌを皮下または筋肉
内、とくに口腔粘膜内に注射する。本ワクチンを投与す
ると、ヒト甘たけ動物の体内とくに唾液中に免疫抗体の
生成することが認められる。この抗体（主としてＩｇ　
Ａ）は、対応する歯周炎誘発能を有する同属の野外株の
歯周組織および歯牙面への伺脇や定着を阻止する作用を
有しているが、凝集素は産生ぜず、また対応する同種の
野外株の増殖自体やレバン多糖体の産生能を阻止しない
。しかし、これらの野外株が口腔内で増殖しても、歯牙
面や歯周組織における歯垢形成能が抑制されることが認
められる。従って、本発明によるワクチンにより、歯周
炎の予防および抑制を効果的に行ない得ることがわかっ
た。

下記の実施例および試験例における培養は、窒素ガス（
９０％）、炭酸ガス（５係）および水素ガス（ｓｌの混
合ガスふんい気下で嫌気的に行なった。試験動物はゴー
ルデンハムスターで、動物数は特記しない限り１群１０
匹とした。ワクチンとして、実施例３の方法で得たもの
を用いた。

実施例１ アクチノミセス・ビスコラジス変異株に−ＴＬ子株（微
工研菌寄第６５１６号）の作出。

ヒトの歯槽膿漏病巣から採取し、菌学的お上Ｕ　Ｊｋ　
Ｗｔ　学的性状からアクチノミセス・ビスコラジスの野
外株であることを・同定した菌株を、トリプトケース・
ソイブロス培地（ｐＨ７，３；　４０―；米国ＢＢＬ社
製）で３７℃、２４時間培養した。培養液を遠心処理（
８’０００　ｒ、ｐ、ｍ、　；２０分間）して菌体を分
離した。菌体を／７５Ｍリン酸塩緩衝食塩水（ｐＩ（７
，０；各２００ＴｆＬＩりで３回遠心処理（各８００Ｏ
ｒ、ｐ、ｍ、；２０分間）で洗浄後、Ｏｏ２％ナイトロ
ジエンマスタードを含む１／７５Ｍリン酸塩緩衝食塩水
（ｐＨ７，ｏ、；１０ｍ１）Ｋ浮遊し、３７℃で菌体数
の９０％以常 上が死滅する才で憧温槽中に保持１７だ（約６０−９０
分間）。この菌体浮遊液を上記方法に準じて、１／７５
Ｍリン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ７，０；各２００ｍｇ）で
３回遠心処理して洗浄した。残りの菌体をＴＹＯ寒天乎
板培地（ｐｎ　７．４　；　９ＧＩＬシャーレ；５ｍＡ
’）上に塗り、３７°Ｃ１４８時間培養後、室温に２４
時間靜酩′シ１、できた県落を観察し７、（１的に硬い
、辺縁不規則な、塊状の多量のレバン多糖体を形成、す
る集落？：選んだ。

所望により、１）１１記と同様の変異訪導、洗浄、選別
をくり返して、Ｉ／パン多糖体産生能の高い菌株を分＃
ｉ＋ｌで純粋培養１〜で、所望の変異株を作出した。

実施例２ バクトロイデス・ジンジバリウス株に−Ｂｇ−ｍ１株（
微工研菌寄第６５１５＠）の作出・ヒトの出血性歯周炎
の棒巣から分離し、菌学的およびｎｕｆｒ’を学的性状
からバタトロイデス・ジンジバリウス野外株と同定した
多数の菌株を次の方法で処理して、赤血球凝集能および
細胞付着能が著しく強い菌株を選んだ。

分離菌株を１０％血液寒天平板培地〔血液寒天基礎培地
（米国１３　Ｂ　］’、社ルリ）＋ｐＨ約７．３；ｇ　
ｏｎｂ　シャーレ；１８ｍＡり上で３７°０１７２時間
培養ケくり返し、年落を選別し、それぞれトリプトケー
ス・ソイプｒｙ　ス（ｉｌ記）　２０　ｍｌＫ　３７℃
、７２−９６時間培養した。６培養液をマイクロタイタ
ープレート法により生理食塩水（ｐＨ７，０）で倍数希
釈し、各希釈液（０，０２５−）に０．５係緬羊赤血球
浮遊液（ｏ、ｏ２ｓｍｉを加えて充分混和して室温に６
０−１２０分間靜置１た。

ホール底に赤血球が一面にひろがっているものを凝集陽
性とし、最高希釈倍数の凝集力価を示すＰｈｉ株を選ん
で純化し／こ。所望により、この処理をくり返した。継
代培養をくり返し、また公知の変異誘導処理を行なって
、性状の安定な菌株であることを確認Ｌ、純粋培養して
、本菌株を作出した、。

実施例３ ワクチンの製造（Ｉ） アクテノミセス・ビスコラジスｇ異株Ｋ　−ＴＬ十子株
微工研菌寄第６５１６号）を培地（Ｎｌｏｏｍｅで３７
℃、２４時間培養した種培養を同じ組成の培１１（Ａ１
１　ｓ　Ｏ００ｒｎｌに接種し、３７℃、４８時間培」
ガした。培養液を遠心処理（８００Ｏｒ、ｌ）、ｍ、　
；　２０分間）して菌体を分離し、１Ｍ塩化ナトリウム
加１／７５λ４リン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）　１５０
ｎｌｌに浮遊し、水冷下に２０ＫＩｌｚ。

１０分間超音波処理した。その後、遠心処理（８０００
ｒ、ｐ、ｍ。；２０分間）によって菌体その他の不溶物
を除去した。遠心上溝に飽和価げアンモニウム溶液を６
０チ飽和になるように加え、攪拌して４０℃、２４時間
以上靜１する。

−上清をサイフオンで除去し、沈降部分を遠心処理（５
０００ｒ、ｐ、ｍ、；２０分間）によって分離した。こ
の沈殿を５０ｍ１の１Ｍ塩化す）　ＩＪウム加１／７５
Ｍリン酸塩綬衝液（ｐｎ　７．０　）に溶解し、これを
セロファン透析チューブに入れ、１Ｍ塩化ナトリウム加
１／７５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）２０００ｍＪ
中で４°０１２４時間以−辷透析した。

透析内液は遠心処理（１００００ｒ、ｐ、ｍ、；３０分
間）Ｋよって不純物を除去し、た。遠心上清は約６０ｍ
／得られ、タンパクＮ菫は約４−６ｍ９／ｍｌであった
１、これをセロファン透析チューブに移シ、フェニール
４００（スエーデン国、ファルマシア・ファイン・ケミ
カル社製）で１／１ｏ量になるまで濃縮する。この濃縮
液ｌ　ｒｔｔｌずつを、１０−３０％の蔗糖密度勾配液
３０ＴＩＬ／、３本のセルローズチューブ上にのせ、４
℃で超遠心処理（米国、ベックマン社、ＳＷす２５．１
０−ター；　３５０００　ｒ、ｐ、ｍ、　；　４時間）
シ、て分ＮＩＬする。次にデンシテイグレーデントフラ
クショ不一ター（米ＩＬイスコ１ｍ、１２０　ｏｑ）で
１．　ｍｌずつ分画を採取（〜／ζ３．比重１．３８−
１．４２．１ｒｉｉ糖１７糖度７鴎　４−１８φ分ｉ…
１で腺毛分画が回収される１、この分画のタンパクＮ景
は約７−１２ｍ９７　ｍｌであった。

実施例４ ワクチン製造（１■） バクテロイデス・ジンジバリウス株に−Ｂｇ−ｍ１株（
微工研菌寄第６５１５号）を培地（Ｂ）１００ｍで３７
°ｄ、４８時間培養した種培養を同じ組成の培地（Ｂ）
　］　５００’Ｏｍ１ＶＣ接柚し、３７℃、７２時間培
養した。培養液を遠心処理（ｓｏｏ。

ｒ、ｐ、叱；２ｏ分間）して分離し／ζ菌体をＩＭ塩化
ナトリウム加１／７５Ｍ’）ン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０
）　２００ｒａｌに浮遊し、４°Ｃで温和に攪拌しなが
ら抽出を行なう。これを遠心処理（１００００ｒ、ｐ、
ｍ。；５０分間）して菌体と他の不純物を除去すると、
抽出収約２００ＴＬｌが得られた。

培養液遠心上清に１０係塩化亜鉛溶液を攪拌しながら小
量ずつ添加し７、最終濃度１％になるようにした。これ
を１０％炭酸ナトリウム溶液でｐＨ６，０に補正し、４
℃で２４時間静置して沈降させ／ζ０上清をサイフオン
で除去し、沈降部分を遠心処理（５０００ｒ、ｐ、ｍ、
；５分間）し２て集めた。この沈、殴に結晶リイ酸二ナ
トリウム・−工水塩１５０ｇを加えてよく練りまぜた。

これをガラスフィルターで吸引濾過し、さらに１０優リ
ン酸二ナトリウム溶液約３０ｍ／を流して洗浄吸引して
生成したリン酸亜鉛を除去すると約９０ゴの抽出液が得
られた。

両抽出液約３００ｍ１を混合し、飽和硫酸アンモニウム
溶液を６０俤飽和になるように加え、４°Ｃで４８時間
・静置して沈降させた。上清を除去し、沈降部分を遠心
処理（５０００ｒ、ｐ、ｍ、　；５分間）によって分離
した。この沈殿を１０ｍ１のＩＭ塩化ナトリウム加１７
７５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、２ＱＯ
ＯｍＪの同処方緩衝液中でセロファン膜透析チューブに
よって、４℃で２４時間以上透析した。

透析内液を遠心処理（１００００ｒ、ｐ、ｍ、；３０分
間）（−で不溶物を除去すると、約３０ゴの上清が朴［
られ７’？：　Ｏこの溶液のタンパクＮ量は約］６即／
　ｍＡであった１、 ８１′＃製誤Ｉ宿は実施例３の方法にＷじて行なった。

蔗糖密度勾配超遠心法で比重１．３６−１．４１、蔗糖
ｄ度１２−１６俤分画に綜毛層分画が回収された。この
分画の混合液の赤血球凝集能は１：２５６００倍以上で
あった。

火施しｌ１５ ワクチン製造（Ｉｌｌ） 実施例３および実施例・１記ｆｌｉｌ！、の方法によっ
てアクチノミセス・ビスコラジスおよびノくクプロイデ
ス・ジンジバリウスから別々に抽出精製した純毛層分画
を、それぞれプロチンＮ量０　、５　Ｔｎ９１ｗｒｌず
つ含有するように１７７５ＭＩＪン酸塩緩衝食塩酸塩　
ｐＨ６，２）で希釈し、混合し、アジュバントとして水
酸化アルεニウムゲルをアルミニウム量最終湿度０．２
　ｍｙ　／　ｒｔｔｌになるように加えて吸着させ、ｐ
Ｈ６，２に補正し、これに防腐剤としてチメロサール０
．０１％（ｗ／　ｖ　）を加えた。

ｔ、（験例１ 歯周炎予防用ワクチンの安全件 実施例３および４によって得られたワクチンを用いて、
厚生省告示生物学的製剤基準、Ａ試験法に漁じて、染色
試験、無菌試験および急性異常毒性試験（マウスおよび
モルモット）ヲ行なったが、特記すべき異常は認められ
なかった。

試験例２ 細胞付着性試験 菌株の細胞付’Ａ”ｉ性は（３１ｂｂａｎｓ　ａｎｄ　
ｖａｎ　Ｈｏｕｔｓ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｎｎｄ　Ｉ
ｍｍｕｎｉｔｙ、　Ａｐｒ、　１９７１゜Ｐ５６７−５
７３）の方法に準じてセメントスパナニラで集めたヒト
の口腔粘膜上皮細胞をアール１１Ｍ　（ｐＨ７，４）で
よく洗浄し、細胞数１０５７ｍ１になるように同じ液に
浮遊させ、これに菌体１０６／ｍｌを加え、３７℃、３
０分間ロッカープレートーヒでゆっくり振とう（毎分１
回ぐらい）し／ζ。この細胞浮遊液を１５ノ１ｍのメン
ブランフィルタ−（米国、ミリボアー社製）上でアール
液を流しながら吸引して洗浄し、付着ｔまた菌数を顕微
鏡で調べた。

試験例３ （リ　生後２１日のゴールデンノ・ムスターヲ用いて、
本発明によるワクチンの免疫効果を次の方法で調べた。

歯周疾患発症誘発能を有するアクチノミセス・ビスコラ
ジス変Ｒ，株Ｋ　−ＴＬ十子株微工研菌寄第６５１６号
）を３７℃、２４時間培地（Ａ）で培養した培養液と、
バクテロイデス・ジンジバリウス株に−Ｂｇ−ｍ１株（
微工研菌寄第６５１５号）を３７℃、２４時間培地（Ｂ
）で培養した培養液をそれぞれ遠心処理（８０００ｒ、
ｐ、ｍ、；２０分間）し、生理食塩水（ｐＨ７，０）Ｋ
それぞれ両菌体を約１０億個／１１Ｌｌ含Ｘ７だ混合浮
遊液をつくり、これを試験動物の頬験内に各０　、２　
ｒｎｌ　７日、生後４５日から７日間連続投与し、それ
板抜は各０．２−週一度の投与を続けた。投与開始と同
時にう蝕誘発飼料としてダイエラ）２０００（船＠＠農
場製；日、ｈｔｌＯ〜２０＆）と脱イオン水とを与えて
飼育した。。

本発明ワクチンを生後２１．２８日令にそれぞれ０．２
Ｔｌｌ、　３５日令にｏ　、　４　ｍＪずつ頬嚢部皮下
に注射した。試験動物を８０日間飼育したのち、ベンド
パルビタールで麻酔させ、０．７５％塩酸ピロカルピン
溶液を体重１００ｙ当り０゜１ｍ／腹腔内に注射し、唾
液を採取した。その後、全採血［２て殺し、顎を副出し
、オートクレーブで１２１　℃、１−２分間処理した。

軟組織を除去し、残部を充分に水で洗浄したのち乾燥し
て骨標本とした。

両 対照群は試験群と同様に処理されたが、本△ 発明によるワクチンを投与しなかった。

投与菌株の口腔内定着の検索は、試験期間中に適宜滅菌
小綿棒で各個体別に上下顎臼歯の頬側面を強く擦過し、
採取した被検材料を、ただちに１０％血液寒天平板培地
（前記）、バクテロイデス寒天平板培地（前記）および
ＴＹＯ寒天培地（前記）に３７℃、７２時間培養し、室
温で２４時間靜１したのち、各寒天平板培地上に発育し
た集落性状と血清学的性状によって確認し／ζ０ （２）　　ｐ験群と対照両群との歯槽骨吸収の差を比２
８巻第３号１４９頁、１９７８年）の方法に従って評価
した。

試験群および対照両群の各個別に骨標本を２０係硝酸銀
溶液で５分間染色し、よく水洗し乾燥して骨標本とした
。

骨標本を顕微鏡で２０倍（５Ｘ４）弱拡犬イ 下で接眼マクロメーターによってエナメル−△ セメントジャンクションより歯槽骨＝−ｔでの距離を計
測して判定した。

（３）試験群と対照両群との保′、ｂ゛抗体の関係を調
べるために、採取した血清および唾液中の抗体−ｔマイ
クロタイ／ターグレート法による定菫凝集反応、付層抑
制試験νよびゲル内沈降反応によって比較評価した。

凝集反応の抗原は、本発明によるアクチノミセス・ビス
コラジス変異株に−ＴＬ子株とバクテロイデス・ジンジ
バリウス株Ｋ　−Ｂ　ｇ　−ｍ１株をトッドヒユーイツ
トブロス〔（米国、ＢＢＬ社製）；ｐ１１約７．ｇ：）
２００プで３７°Ｃ，２４時間培養し、それぞれの培養
液を遠心処理（８０ｔ）Ｏｒ、ｐ、ｍ、；　２０分間）
して得られた菌体を、０．２ｍＭゲルタールアルデヒド
加生理食塩水（ｐｒ−＋　７．０）　１００πｌｌに浮
遊して、３７°Ｃで１２時間処理した後、遠心処理（８
０００ｒ、ｐ、ｍ、；２０分間）により菌体を回収し、
それぞ名の菌体を生理食塩水（ｐＨ７，０）でＯＤ　５
５０　ｎｍ０．５０になるように浮遊して両抗原とした
。被検材料の唾液および血清の各希釈０，０２５ｍ１に
それぞれの抗原０　、”０２　ｓ　ｍ／！を加え、３７
℃で４時間反応させた後、５℃で一夜静置して肉眼で判
定した。

付着抑制状；と・ｉ秒ｊ被倹材イ・（の唾液または血清
を゛ｒｙＣ培地（ＰＩ（７，２）テｔ　ｏ倍希釈ｔ、た
のち、メンブランフィルタ−０，４５μ（米国、ミリボ
アー社製）で無菌１過し、これを同培地で２倍希釈し、
各倍希釈液（ｓｍＪ）にアクチノミセス・ビスコラジス
変異株に−ＴＬ＋株（微工研菌寄第６５１６号）のトッ
ドヒユーイツトブロス培誉ｉ？Ｈｐｎ約７．８　；　１
０＋ｎ／！；３７℃；２４時間）０．０１ｍ／ずつを接
種し、３７℃で２４時間私５して、各試験管壁への菌塊
の付着様態を判定した。

ゲル内沈降反応は、被検材料の唾液Ｐ液および血清を、
実施例３および実施例４の方法によって得られる線毛層
分画をそれぞれ用いて、（’）ｏｌｄｍａｎ　（Ｇｏｌ
ｄｍａｎ　Ｊ、　Ｏ’、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ。

０ｅ１１．、Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ　７８．４’２６
−４４０゜１９８０　）の方法に車じて０．０５　Ｍ　
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、０．１５Ｍ塩化ナ
トリウム、０．５係トリトン−Ｘ１００（米国、ローム
・アンド・ハース社製）０．１％ラウリル硫酸ナトリウ
ムおよび１％アガロース（米国、シグマ社製）によって
ゲルを調製し、平板内二重拡散法によって行なった。

感染防御試験の成績は第１表に示したよりに、対照誘発
群で強い歯槽骨吸収がみられるが、免疫群では抑制され
、対照群とほぼ同程度で、明らかに有意の差を示した。

試験群各被検材別中の抗体は、凝集素は両菌株に対して
一部個体の血清中に低い値がみられたものもあったが、
１垂液中ではさらに低い値であった。

アクチノミセス・ビスコラジスに対する付着抑制効果（
対付着素）は−やはり免疫群に認められ、これは血清中
よりも唾液中に強い活性のあることが認められた。この
抑制効果は対照誘発群の一部にも認められたものもあっ
たが、免疫群に比べて低い値であった。

両菌株綜毛抽出分画に対するり゛ル内沈降反応も免疫群
では血清および唾液中に認められたが、他の試験群では
確認できなかった。

試験期間中の免疫群および対照誘発群の両投与菌株の定
着様態に関しては、アクチノミセス・ビスコラジスは全
期間を通じて検出されたが免疫群では菌数が極めで少な
いか、あるいは全く検出されなかつ／１０ バクテロイデス・ジ／ジノ；リウスは各培養毎に検出さ
れたが全く認められない場合も多かった。その定着は必
ずしも良くなかった。

対照誘発群の試験後期に、一部の個体から比較的多くの
菌が検出された。

（自発的）手　続　補　正　書 ｌ召（：１１５９年２月１５日 特許庁長官　若杉和夫　殿 ＩＪＲＩの表示 昭和５７；１：　　特ｆＦ　　願第２１５１４６シじ２
発明の名称　　歯周炎予防用ワクチン３　補ＩＦをする
者 小作との関（系　特許出願人 （１所　　　来京都港区白金５丁目９番１号［；　　６
　（ＩＶＦ）北里研究所（社団法人）代表者　吉　岡　
勇　雄 ４、　代　　理　　人　　　電話　３５３−５５２１ｆ
ｌ−１！ｌｉ　　　　東京ｔ５新荷置イ「鐘打１１番地
５　補１ｒミ命令の日付 ６　浦正により増加する発明の数　　なし８　補止の内
＠−ｔ＋１．ｔ’−／−二−″・　。

（１）　　明細１の特許請求の範囲の記載を別紙の辿り
補正する。

（２）明細書第３頁９行、「線毛層」を［線毛成分から
単離した抗原］に補正する。

（３）　　同１８行、「線毛層」を「線毛成分」ＶＣ補
正する、 （４）同第５頁１２行、ｌ［ｉ官記６５１５号」を「条
寄第４１０号」に補正する。

（５）同第６負９行、「菌寄第６５１６号」を「条寄第
４１１号」に補正する。

（６）　　同第９頁１５行、「培地」の彼に「（ｐＨ約
７．３）Ｊを加入する。

（７）　　同第１１声１７行、「上記両菌株」を１本発
明に用いる菌株」に補正する。

（８）　　同第１３頁１０行、「線毛層−１を「線毛成
分」に補正する。

（９）同１５行および１８行、「線毛」の後に「成分」
を加入する。

（１０）同１６行、「１２〆１５チ」を削除する。

（１１）同２０行、「回収する。」の後に次の通り加入
する。

「あるいは固形硫酸アンモニウムを３０−７０　％（た
とえば３３φ）飽和すこなるよう＆ｃ培養液に加え、溶
解後但温（たとえば４６Ｃ）＆こ２４時間以上静置して
菌体晴を沈降させ、十清を除き、沈降Ｂｊｉを遠心処理
（例、８０００ｒ、ｐ、ｍ、　７２０分間）して所望の
抗原を回収する。」 （１２）同第１４頁１３、工８および１９行、「線毛層
」をｒ＆１毛成分成分・こ補正する。

（１３）同第１５頁７行、「できる。」の後に「抗原を
所望により不活化することも公知である。」を加入する
。

紫 （１４）同１７行、「凝集は産生ぜず」を「凝集素の産
△ 生は訂（められず」に補正する。

（１５）同等：ｌ８ａ３？’ｊ、「バクテロイデス」を
「バクテロイデス」に補正する。

（１６）同第１９頁９行、「＠寄第６５１６号」を「条
寄第４１１号」に補正する。

（１７）同１２行、１培養液を２１を「培養液に固形硫
酸アンモニウムを３３係飽和になるＪ：うに加え、溶解
後、静置した後、」に補正する。

（１８）同第２１頁９行、「菌寄第６５１５号」を１条
寄第４１０号」に補正する。

（１９）　　同第２３頁６および１４．１線毛層」を「
線毛成分」に補正する。

（２０）同第２４貞１０行、「０４ｂｂａｎｓ　Ｊを［
Ｇｉｂｂｏｎｓ　Ｊに補正する。

（２１）同第２５頁７行、「菌寄第６５１６号」を「条
寄第４１１号」に補正する。

（２２）同１０行、「菌寄第６５１５号」を「条寄第４
１０号」に補正する。

（２３）同第２９賀３行、「菌を第６５１６号」を［−
条寄第４１１号」に補正する。

（２４）　　同１０行、「線毛層」を「線毛成分」Ｕこ
補正する。

（２５）明細畜の次の個Ｑｉ　Ｑ＜ｌ記載さＪまた「／
７５λ工」を１−ｏ、７ｓへ（」に補正する。

第１４頁１８行、第１７貝１−２行、同５および９行、
第２０頁４行、紀２２貞１６で〕、第２１頁１４行、第
２３頁１５行。

（２６）凹か１１　ｊ１’　１６行、［歯槽骨吸収Ｑこ
より測定）±」゛のＶに次の通り加入する。

［本発明６ｃ用いらねるアクチノミセス・ナイセリンデ
イは、米国、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション・カタログ、記１４版、２７頁、（１９８０年）
に記載されている公知紹である。」 特許請求の範囲 （１）　　ｍ周炎誘発能を有しかつ菌体表面に線毛を有
する細菌の線毛計マたはその抽出物を抗原とする歯周炎
予防用ワクチン。

（２ 異株である特許請求の範囲給糸項記載のワクチン０ （４１細１ｉがアクチノミセス・ビスコラジス変異株に
−ＴＬ子株（微工研条寄第４１１号）である特許請求の
範囲第３項記載のワクチン。

＜η （支）細菌がノセクテロイデス・レンジ／ミリウスまた
はその変異株である特許請求の範囲第１項記載のワクチ
ン。

（７）　　細菌がバクテロイデス・ジン：）／ツリ９フ
許請求の範囲第見項記載のワクチン。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）歯周炎誘発能を有しかつ菌体表面に線毛を有する
   細菌の線毛層重たけその抽出物を抗原とする歯周炎予防
   用ワクチン。
2. （２）　　細［がアクチノミセス・ビスコラジスまたは
   その変異株である特許請求の範囲第１項によるワクチン
   。
3. （３）細菌がアクチノミセス・ビスコラジス変異株Ｋ　
   −Ｔ　Ｌ子株（微工研菌寄第６５１６号）である特許請
   求の範囲第２項によるワクチン。
4. （４）細菌がバクテロイデス・ジンジバリウスまたはそ
   の変異株である特許請求の範囲第１項゛によるワクチン
   。 株 （ｓ）　　Ｉａ菌がバクテロイデス・ジンジバリウスに
   ／＼ −Ｂｇ−ｍ１株（微工研菌寄第６５１５号）である特許
   請求の範囲第４項によるワクチン。