ES2581981T3 - Polipéptidos de Streptococcus suis y polinucleótidos codificantes de los mismos y su utilización en aplicaciones vacunales y diagnósticas - Google Patents

Abstract

Polipéptido SP1 aislado que puede provocar una respuesta inmunitaria específica a Streptococcus suis que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de por lo menos 95% respecto a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID nº 4 o 17.

Description

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inmunogénicos por sí mismos y se cree que actúan sinérgicamente. Entre los adyuvantes conocidos se incluyen, aunque sin limitación, emulsiones de aceite y agua (por ejemplo, adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund), Corynebacterium parvum, Quil A, citocinas tales como IL12, Emulsigen-Plus®, Bacillus Calmette Guerin, hidróxido de aluminio, glucano, dextran sulfato, óxido de hierro, alginato sódico, adyuvante Bacto,

5 determinados polímeros sintéticos, tales como poli-aminoácidos y copolímeros de aminoácidos, saponina, aceite de parafina y dipéptido muramilo. Los adyuvantes comprenden además adyuvantes genéticos, tales como moléculas inmunomoduladoras codificadas en un ADN coinoculado o como oligonucleótidos de CpG. El ADN coinoculado puede encontrarse en el mismo constructo plásmido que el inmunógeno plásmido o en un vector de ADN separado.

10 La presente invención se refiere además a:

-un procedimiento para preparar una composición tal como se ha definido anteriormente para prevenir enfermedades asociadas a Streptococcus suis o una infección causada por S. suis, que comprende la etapa de mezclar por lo menos un anticuerpo tal como se ha definido anteriormente con por lo menos un vehículo

15 aceptable, en el que el anticuerpo o anticuerpos resultan de una vacunación con un adyuvante que dirige a Th1.

-Un procedimiento para preparar una composición para la utilización en la prevención de una enfermedad o infección asociada a Streptococcus suis en un animal, comprendiendo el procedimiento la etapa de mezclar 20 por lo menos uno de entre:

-un polipéptido tal como se ha definido anteriormente,

-un polinucleótido tal como se ha definido anteriormente,

25 -un vector tal como se ha definido anteriormente,

con por lo menos un vehículo aceptable y un adyuvante que dirige a Th1.

30 -Un polipéptido tal como se ha definido anteriormente y un adyuvante que dirige a Th1, un polinucleótido tal como se ha definido anteriormente y un adyuvante que dirige a Th1; un vector de expresión tal como se ha definido anteriormente y un adyuvante que dirige a Th1, o una composición tal como se ha definido anteriormente y un adyuvante que dirige a Th1, para la utilización como medicamento o como vacuna.

35 -Un polinucleótido tal como se ha definido anteriormente y un adyuvante que dirige a Th1, un polinucleótido tal como se ha definido anteriormente y un adyuvante que dirige a Th1, un vector de expresión tal como se ha definido anteriormente y un adyuvante que dirige a Th1, o una composición tal como se ha definido anteriormente y un adyuvante que dirige a Th1, para la utilización en la prevención de una enfermedad o infección asociada a Streptococcus suis en un animal.

40 -Un anticuerpo tal como se ha definido anteriormente o una composición tal como se ha definido anteriormente para la utilización como medicamento, en el que el anticuerpo o anticuerpos resultan de una vacunación con un adyuvante que dirige a Th1.

45 -Un anticuerpo tal como se ha definido anteriormente o una composición tal como se ha definido anteriormente para la utilización en la prevención de una enfermedad o infección asociada a Streptococcus suis en un medicamento animal en el que por lo menos un anticuerpo resulta de una vacunación con un adyuvante que dirige a Th1.

50 Sin embargo, una forma de realización adicional de la presente invención es proporcionar la utilización de la invención, comprendiendo la etapa de administrar en el animal una composición según la invención.

Pueden añadirse agentes adicionales a la composición de la invención. Por ejemplo, la composición de la invención puede comprender además agentes tales como fármacos, inmunoestimuladores (tales como interferón-α, interferón

55 β, interferón-ν, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (FEC-GM), factor estimulante de colonias de macrófagos (FEC-M) e interleuquina-2 (IL2)), antioxidantes, surfactantes, agentes saborizantes, aceites volátiles, agentes tamponadores, dispersantes, propelentes y conservantes. Para la preparación de dichas composiciones, pueden utilizarse procedimientos bien conocidos de la técnica.

60 La cantidad de los componentes o los elementos de la composición de la invención preferentemente es una cantidad terapéuticamente eficaz. Una cantidad terapéuticamente eficaz del componente contemplado es la cantidad necesaria para permitir que el mismo realice su función inmunitaria sin provocar excesivos efectos negativos en el huésped en el que se administra la composición. La cantidad exacta de los componentes que deben utilizarse y de la composición que debe administrarse variará según factores tales como el tipo de afección bajo tratamiento, el tipo

65 y edad del animal bajo tratamiento, el modo de administración, así como los demás ingredientes en la composición.

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Los cebadores directo e inverso utilizados para la distribución de SP2 en diferentes serotipos fueron, respectivamente:

(5'-TTTAAAAGAACGGTTGAAGGC-3', SEC ID nº 15, y 5'-GCATAAGCTGCCACTTGATCT-3', SEC ID nº 16).

Se amplificó el gen SP2 de 31 de las 33 cepas de referencia de serotipo con algunas variaciones de tamaño (fig. 14). El análisis de secuencias de los fragmentos de las variantes seleccionadas sugiere que el número de repeticiones en el gen SP2 es responsable de las variaciones de tamaño.

Producción y purificación de SP2 recombinante

El gen codificante de la SP2 madura se generó mediante PCR a partir del cromosoma de S. suis S735 y se subclonó en un vector pET32+ (New England BioLabs). Se utilizó el constructo para transformar E. coli cepa DE3 mediante electroporación con el aparato Genepulse II (Bio-Rad) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Para la sobreexpresión, el cultivo se inoculó a partir de un cultivo de durante la noche con la DO600 inicial del mismo ajustada a 0,1. El cultivo se incubó bajo agitación hasta una DO600 de aproximadamente 0,8 y después se añadió IPTG (0,5 mM) con el fin de inducir la producción de la proteína de fusión Trx-His-SP2. Transcurridas 2 horas desde la inducción, se preparó el citoplasma bacteriano y se utilizó para la purificación de la proteína SP2.

Se purificó la proteína de fusión Trx-His-SP2 a partir del citoplasma mediante cromatografía de afinidad utilizando una columna de Ni+ (Amersham Pharmacia Biotech, Baie d'Urfee, Canadá). El citoplasma se filtró a través de una membrana de 0,45 µm y se sometió a la columna. La proteína de fusión se eluyó con imidazol 500 mM en tampón de unión y se determinaron las fracciones que contenían proteína mediante SDS-PAGE. La proteína de fusión purificada se cortó con 0,001% (p/p) de enteroquinasa (New England BioLabs), rindiendo una SP2 de 58 kDa aparentes y la etiqueta esperada Trx-His de 20 kDa (fig. 15) y después se aplicó a una columna mono-Q (Amersham Pharmacia Biotech, Baie d'Urfee, Canadá). La SP2 recombinante sin etiqueta Trx-His se obtuvo mediante elución de la columna utilizando un gradiente lineal de NaCl, con una pureza estimada superior a 95% según visualización mediante SDS-PAGE (fig. 15). Se determinó la concentración de las proteínas mediante el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se confirmó la identidad de la SP2 purificada mediante secuenciación de proteínas N-terminal.

SP2 es una proteína inmunogénica de S. suis y muestra actividad de unión a IgG

Se generó un anticuerpo específico de SP2 mediante inmunización por vía intramuscular de los conejos New Zealand White con 100 µg de proteína SP2 recombinante emulsionada con 0,5 ml de adyuvante incompleto de Freund. Los conejos recibieron dos inyecciones de refuerzo con la misma dosis de la SP2 a intervalos de 2 semanas, seguido de la extracción de muestras de sangre 10 días después de la última inmunización de refuerzo. A la inversa, el anticuerpo específico de SP2 reconoció SP2 en la preparación de células S. suis en una transferencia western (fig. 16a). Además, la SP2 recombinante reaccionó con suero de cerdos convalecientes (fig. 16b), demostrando que el anticuerpo anti-SP2 existe en el suero de los cerdos clínicamente infectados por S. suis.

Las actividades de unión de la SP2 recombinante a IgG humana y de cerdo se muestran en las figuras 16c y 16d.

La SP2 recombinante protege parcialmente a los ratones frente a la provocación de infección por S. suis

Se asignaron aleatoriamente los ratones (CD1) a dos grupos de once (grupo de vacunación) y diez (de control) y se inmunizaron por vía subcutánea dos veces a intervalos de 2 semanas con 50 µg de SP2 purificada y mezclada con 20 µg de Quil A como adyuvante que dirige a Th1 o 20 µg de Quil A únicamente como control. Diez días después de la segunda vacunación, los ratones se retaron por vía i.p. con 1x108 UFC de una cepa virulenta de S. suis (31533). Se realizó un seguimiento de los ratones dos veces al día para signos clínicos y mortalidad hasta el día 14 después de la infección. Se recogieron muestras de sangre antes de cada vacunación y se retaron para determinar las respuestas de anticuerpos.

La vacunación con SP2 indujo respuestas humorales de IgG significativas en los ratones. En contraste, la IgG específica de SP2 en los sueros del grupo de control se encontraba a un nivel no detectable (fig. 17). Ambos grupos mostraron signos clínicos de septicemia y meningitis. Sin embargo, las puntuaciones clínicas en el grupo de vacunación con SP2 eran menores que en el grupo de control (fig. 18). De los 11 ratones en el grupo de vacunación con SP2, 4 murieron o debieron ser eutanizados debido a la gravedad de la afección (tasa de supervivencia=64%). En contraste, 8 de 10 ratones en el grupo de control murieron (tasa de supervivencia=20%) (fig. 19). Estos resultados demuestran que SP2 protege a los ratones frente a la provocación de infección por S. suis.

Conclusión

SP2 es una proteína inmunogénica de S. suis nuevamente descrita que comparte poca identidad con otras secuencias conocidas. Los sueros de cerdos convalecientes presentaban anticuerpos contra dicha proteína,

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