KR101503907B1 - 흉막폐렴균과 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 감염 질환 예방을 위한 재조합 단백질 백신 - Google Patents

Abstract

흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질의 N 말단 영역과 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97의 C 말단 영역을 포함하는 융합 단백질, 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 조성물, 및 상기 조성물을 이용하여 흉막폐렴균, 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 중 어느 하나 이상의 감염증을 예방 또는 치료하는 방법이 제공된다.

Description

흉막폐렴균과 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 감염 질환 예방을 위한 재조합 단백질 백신 {Recombinant protein vaccine for preventing Actinobacillus pleuropneumoniae and Mycoplasma hyopneumoniae infection diseases}

흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 단백질, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 P97 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 단백질, 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 영역과 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 P97 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 영역을 포함하는 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 단백질 또는 융합 단백질을 포함하는 조성물, 상기 단백질을 포함하는 키트, 및 상기 융합 단백질을 포함하는 조성물을 이용하여 흉막폐렴균, 및 M. 하이오뉴모니아 중 어느 하나 이상의 감염증을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

흉막폐렴균 (Actinobacillus pleuropneumoniae)은 돼지의 전염성 및 잠재적으로 치명적인 호흡기 질환인 돼지 플루로뉴모니아에 대한 원인균이다. 흉막폐렴균의 독성은 흉막폐렴균 독소 (Apx), 리포폴리사카리드, 외막 단백질, 및 흡착 인자를 포함한, 여러 인자와 연관되어 있다. 이들 중 Apx가 흉막폐렴균의 독성의 일차적 결정기이다. Apx 단백질에는 ApxI, ApxII, ApxIII, 및 ApxIX가 알려져 있다. ApxIII 단백질은 ApxIIIA, ApxIIIB, 및 ApxIIID가 포함될 수 있다.

마이코플라즈마 하이오뉴모니아 (Mycoplasma hyopneumoniae)는 모든 연령의 돼지에 감염되는 돼지 풍토 폐렴 (porcine enzootic pneumonia: PEP), 만성 비치명적 질환에 대한 원인균이다. 일차 미코플라즈마 감염된 돼지는 PRRS 바이러스, 파스튜렐라 물토시다, 및 흉막폐렴균에 의한 잠재적으로 치명적인 2차 감염이 되는 경향이 있다.

P97 흡착 단백질은 M. 하이오뉴모니아의 다른 스트레인 중 고도로 보존되어 있다. P97은 M. 하이오뉴모니아가 섬모가 있는 호흡기 내피 세포에 흡착하는데 필수적이고, 기능적 P97이 없는 경우, 이 병원체의 일부 스트레인에서 비독성화와 연관된다. P97의 C-말단은 R1과 R2로 명명된 두 반복 영역을 포함하는데, 흡착에 중요한 역할을 한다.

이러한 선행 기술에도 불구하고, 흉막폐렴균 및 M. 하이오뉴모니아를 하나이상의 감염을 예방 또는 치료하는데 효과적인 물질 및/또는 방법이 요구되고 있다.

일 양상은 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 영역과 M. 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편을 포함하는 영역을 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 융합 단백질을 유효 성분으로서 포함하는, 포유동물의 흉막폐렴균, 및 M. 하이오뉴모니아 중 어느 하나 이상의 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 조성물을 이용하여 포유동물의 흉막폐렴균, 및 M. 하이오뉴모니아 중 어느 하나 이상의 감염증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

다른 양상은 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 단백질을 제공하는 것이다.

다른 양상은 M. 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편을 포함하는 단백질을 제공하는 것이다.

다른 양상은 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 단백질 및 M. 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편을 포함하는 단백질을 포함하는, 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질의 N 말단 영역을 포함하는 단백질, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97의 C 말단 영역을 포함하는 단백질, 또는 이들의 융합 단백질을 검출하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 단백질 및 M. 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편을 포함하는 단백질을 포함하는, 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질의 N 말단 영역을 포함하는 단백질, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97의 C 말단 영역을 포함하는 단백질, 또는 이들의 융합 단백질을 검출하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

일 양상은 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 영역과 M. 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편을 포함하는 영역을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

상기 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질의 단편은 N 말단 영역일 수 있다. 상기 M. 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97의 단편은 C 말단 영역일 수 있다.

상기 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 N 말단 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열의 21번 내지 131번 아미노산 잔기 (서열번호 2의 아미노산 서열)를 포함하는 것일 수 있다. 상기 N 말단 영역은 서열번호 2의 아미노산 서열일 수 있다. 상기 융합 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열의 21번 내지 131번의 아미노산 서열을 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질의 N 말단 영역을 포함하는 서열로서 포함할 수 있다. 상기 N 말단 영역은 예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열의 21번 내지 131번의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 선택된 연속 아미노산 서열일 수 있다. 상기 N 말단 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열의 21번 내지 131번의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 선택된 연속 아미노산 서열이고 길이가 111 내지 1049 아미노산, 예를 들면, 111 내지 1000 아미노산, 111 내지 800 아미노산, 111 내지 600 아미노산, 111 내지 400 아미노산, 111 내지 300 아미노산, 111 내지 200 아미노산, 또는 111 내지 150 아미노산인 것일 수 있다.

상기 M. 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 M. 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97의 C 말단 영역은 R1 반복 서열 (서열번호 3의 아미노산 서열의 814번 내지 888번 아미노산 잔기: 서열번호 4) 및 R2 반복 서열 (서열번호 3의 아미노산 서열의 981번 내지 1020번 아미노산 잔기: 서열번호 5)을 포함하는 것일 수 있다. 상기 C 말단 영역은 서열번호 3의 아미노산 서열의 768번 내지 1085번 아미노산 잔기 (서열번호 6의 아미노산 서열) 또는 768번 내지 1108번 아미노산 잔기를 갖는 것일 수 있다. 상기 M. 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97의 C 말단 영역은 서열번호 3의 814번 내지 1020 아미노산 잔기를 포함하고, 서열번호 3의 아미노산 서열로부터 선택된 연속 아미노산 서열일 수 있다. 상기 C 말단 영역은 서열번호 3의 아미노산 서열의 814번 내지 1020번의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 3의 아미노산 서열로부터 선택된 연속 아미노산 서열이고 길이가 207 내지 1108 아미노산, 예를 들면, 207 내지 1100 아미노산, 207 내지 1000 아미노산, 207 내지 800 아미노산, 207 내지 600 아미노산, 207 내지 400 아미노산, 207 내지 300 아미노산, 또는 207 내지 250 아미노산인 것일 수 있다.

상기 융합 단백질은 M. 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편, 예를 들면 그의 C 말단 영역의 N 말단 측에 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편, 예를 들면 그의 N 말단 영역이 연결되거나, M. 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편, 예를 들면 그의 C 말단 영역의 C 말단 측에 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편, 예를 들면 그의 N 말단 영역이 연결된 것일 수 있다.

상기 융합 단백질은, 상기 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편, 예를 들면 그의 N 말단 영역과 M. 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편, 예를 들면 그의 C 말단 영역 사이에 링커에 의하여 연결된 것일 수 있다. 상기 링커는 펩티드 링커일 수 있다. 용어 "펩티드 링커"란 아미노산이 펩티드 결합에 연결되어 있는 것을 포함한다. 상기 펩티드 링커는 총 아미노산 중 글리신이 50% 이상인 펩티드 링커인 것일 수 있다. 상기 링커는 GS, GSSG(서열번호 7), (GGGGS)₂ (서열번호 8), 또는 이들의 조합의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편, 예를 들면 그의 N 말단 영역과 P97또는 그의 단편, 예를 들면 그의 C 말단 영역은 선택적으로 링커를 매개하여, 한 융합 파트너의 C 말단에 다른 파트너의 N 말단이 연결되거나, 그 반대의 방식으로 연결될 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 융합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 ApxIIIA 단백질의 N 말단 영역의 C 말단에 상기 링커가 연결되고 여기에 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 P97의 C 말단 영역이 연결된 형태일 수 있다. 상기 융합 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 9에서, 1-21 아미노산 잔기는 pET-28a(+) 벡터 유래 서열로서 폴리히스티딘 영역을 포함하는 것으로 정제를 위하여 포함된 것이다. 22-132 아미노산 잔기는 ApxIIIA의 N 말단 영역의 서열이고, 133-134 아미노산 잔기는 링커 서열이며, 135-452 아미노산 잔기는 P97의 C-말단 영역의 서열이다. 상기 융합 단백질은 또한, 서열번호 9의 22-452 아미노산 잔기의 서열일 수 있다.

따라서, 상기 융합 단백질은, 그의 N 말단, C 말단, 또는 양 말단에 단백질 분리에 필요한 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 융합 단백질은 N 말단, C 말단, 또는 양 말단에 폴리히스티딘 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리히스티딘 서열은 6x His인 것일 수 있다. 상기 단백질 분리에 필요한 서열은 폴리히스티딘 서열과 같이 분리에 직접적으로 관여하는 것뿐만 아니라, 분리에 직접적으로 관여하는 서열이 외부로 노출되도록 도와주는 서열과 같이 간접적으로 분리에 관여하는 서열도 포함한다.

다른 양상은 상기 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 융합 단백질에 대하여는 상기한 바와 같다.

상기 폴리뉴클레오티드는 하나이상의 코돈 서열이 숙주세포의 발현에 적합한 코돈으로 변형된 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 대장균, 효모 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9 또는 서열번호 9의 22-452 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포의 발현에 적합한 조절 서열과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 조절 서열은 프로모터, 오퍼레이터, 폴리아데닐레이트, 리보좀 결합 서열 또는 이들의 조합일 수 있다.

다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 숙주세포에서 복제될 수 있도록 하는 복제 원점을 포함할 수 있다. 상기 벡터는 플라스미드성 벡터, 바이러스성 벡터 또는 이들의 조합일 수 있다.

다른 양상은 상기한 융합 단백질을 유효 성분으로서 포함하는, 포유동물의 흉막폐렴균, 및 M. 하이오뉴모니아 중 어느 하나 이상의 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 아주반트를 더 포함할 수 있다. "유효 성분"이란 치료 또는 예방하고자 하는 증상을 완화 또는 제거하는데 필요한 성분 및 그 요구되는 양을 의미하며, 당업자라면 적절하게 선택할 수 있다.

상기 담체는 희석제, 완충제, 보존제 등을 포함하는 의미로서 사용된다. 상기 담체에는 당업계에 알려진 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 성분이 포함될 수 있다. 또한, 상기 어주반트는 항원의 면역원성을 증진시키기 위하여 사용되는 물질로서, 예를 들면, 프로인트 완전 또는 불완전 어주반트 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 당업계에 알려진 임의의 형태 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 액제 또는 주사에의 경우, 필요시 10∼40%의 프로필렌 글리콜, 및 용혈현상을 방지하는데 충분한 양 (예: 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다. 상기 액제 또는 주사제에는 당업계에 알려진 임의의 희석제 또는 완충제가 포함될 수 있다.

상기 포유동물에는 인간, 소, 돼지, 염소 및 양으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 포유동물은 돼지이다.

다른 양상은 상기한 조성물을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물의 흉막폐렴균, 및 M. 하이오뉴모니아 중 어느 하나 이상의 감염증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 포유 동물은 소, 돼지, 개, 염소 및 양으로부터 선택되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 포유 동물은 돼지이다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 감염증은 흉막폐렴균, 및 M. 하이오뉴모니아 중 어느 하나 이상의 감염에 의하여 야기되는 임의의 증상일 수 있으며, 예를 들면, 흉막 폐렴 및 M. 하이오뉴모니아 폐렴이 포함된다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 투여는 당업계에 알려져 있는 임의의 투여 수단에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 로 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여되는 것일 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 본 발명의 조성물은 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양으로 투여되는 것일 수 있다. 상기 "치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양"은 당업자라면, 증상의 경중, 개체의 성별, 나이 및 체중 등을 고려하여 적절하게 선택할 수 있다. 상기 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양은, 예를 들면 투여되는 개체 1kg 당 1pg 내지 1g의 상기 융합 단백질일 수 있다.

다른 양상은 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편, 예를 들면 그의 N 말단 영역을 포함하는 단백질을 제공한다. 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 단백질에 대하여는 상기한 바와 같다.

다른 양상은 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편, 예를 들면 그의 C 말단 영역을 포함하는 단백질을 제공한다. 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편을 포함하는 단백질에 대하여는 상기한 바와 같다.

다른 양상은 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 단백질 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편을 포함하는 단백질을 포함하는, 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질의 N 말단 영역을 포함하는 단백질, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97의 C 말단 영역을 포함하는 단백질, 또는 이들 단백질의 융합 단백질에 결합하는 항체를 검출하기 위한 조성물을 제공한다.

다른 양상은 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 단백질 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편을 포함하는 단백질을 포함하는, 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질의 N 말단 영역을 포함하는 단백질, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97의 C 말단 영역을 포함하는 단백질, 또는 이들 단백질의 융합 단백질에 결합하는 항체를 검출하기 위한 키트를 제공한다.

흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편, 예를 들면 그의 N 말단 영역을 포함하는 단백질, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편, 예를 들면 그의 C 말단 영역을 포함하는 단백질 및 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편, 예를 들면 그의 N 말단 영역과 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편, 예를 들면 그의 C 말단 영역을 포함하는 융합 단백질에 대하여는 상기한 바와 같다.

상기 검출은 ELISA에 의한 검출일 수 있다. 상기 검출은 예를 들면, ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편, 예를 들면 그의 N 말단 영역을 포함하는 단백질 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편, 예를 들면 그의 C 말단 영역을 포함하는 단백질을 각각 고체 기판에 코팅하고, 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편, 예를 들면 그의 N 말단 영역을 포함하는 단백질, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편, 예를 들면 그의 C 말단 영역을 포함하는 단백질, 또는 이들 단백질의 융합 단백질에 결합하는 항체를 포함하는 시료를 상기 고체 기판에 첨가하여 각각 상기 단백질과 결합시키고, 결합된 복합체를 표지된 항체 특이적 물질 (예, HRP-접합된 제2 항체)과 반응시킨 후, 그 결과를 확인함으로써 이루어질 수 있다.

일 양상에 따른 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질의 N 말단 영역과 M. 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97의 C 말단 영역을 포함하는 융합 단백질에 의하면, ApxIIIA와 P97 단백질의 면역원성을 모두 가지고 있다.

다른 양상에 따른 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의하면, 상기 융합 단백질을 코딩할 수 있다.

다른 양상에 따른 상기 융합 단백질을 유효 성분으로서 포함하는 조성물에 의하면, 포유동물의 흉막폐렴균, 및 M. 하이오뉴모니아 중 어느 하나 이상의 감염을 효율적으로 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.

다른 양상에 따른 포유동물의 흉막폐렴균, 및 M. 하이오뉴모니아 중 어느 하나 이상의 감염증을 예방 또는 치료하는 방법에 의하면, 포유동물의 흉막폐렴균, 및 M. 하이오뉴모니아 중 어느 하나 이상의 감염을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

다른 양상에 따른 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질의 N 말단 영역을 포함하는 단백질, 또는 M. 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97의 C 말단 영역을 포함하는 단백질에 의하면, 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질의 N 말단 영역을 포함하는 단백질, M. 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97의 C 말단 영역을 포함하는 단백질, 또는 이들의 융합 단백질에 결합하는 항체를 효율적으로 검출하는데 사용될 수 있다.

다른 양상에 따른 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질의 N 말단 영역을 포함하는 단백질 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97의 C 말단 영역을 포함하는 단백질을 포함하는, 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질의 N 말단 영역을 포함하는 단백질, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97의 C 말단 영역을 포함하는 단백질, 또는 이들의 융합 단백질에 결합하는 항체를 검출하기 위한 조성물 또는 키트에 의하면, 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질의 N 말단 영역을 포함하는 단백질, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97의 C 말단 영역을 포함하는 단백질, 또는 이들의 융합 단백질에 결합하는 항체를 효율적으로 검출할 수 있다.

도 1은 ApxN, P97C와 Ap97 재조합 단백질의 발현과 정제를 나타낸 도면이다.
도 2는 ApxN, P97C와 Ap97 백신으로 면역접종된 마우스에서 ApxN 및 P97C에 대한 총 IgG, IgG1,및 IgG2a 이소타입 항체의 혈청 역가를 나타낸다.
도 3은 면역접종된 마우스로부터 얻은 비장세포의 시토킨 프로파일을 나타낸다.
도 4는 Ap97 또는 ApxN 재조합 단백질로 면역접종된 마우스로부터 얻은 항혈청에 의한 흉막폐렴균 ApxIII의 인식을 나타낸다.
도 5는 Ap97 또는 P97C 재조합 단백질로 면역접종된 마우스로부터 얻은 항혈청에 의한 M. 하이오뉴모니아 P97의 인식을 나타낸다.
도 6은 Ap97 백신에 의하여 면역접종된 돼지로부터 분리된 혈청에 의한 M. 하이오뉴모니아 P97과 흉막폐렴균 ApxIII의 인식을 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

달리 언급이 없으면, 이하의 실시예는 다음의 재료 및 방법을 사용하였다.

(1) 시약

별도로 서술한 경우를 제외하고 하기 실시예에서 사용된 시약은 모두 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, 미국)에서 판매하는 고순도의 제품을 사용하였다.

(2) 균주 배양

흉막폐렴균 균주 1536 (혈청형 2)과 M. 하이오뉴모니아 균주 J는 미국 타입 배양물 보관소 (American Type Culture Collection: ATCC)(Manassas, VA)에서 구입하였다. 미코플라즈마 효모뉴모니애 야생형 균주는 돼지 풍토 폐렴 (enzootic pneumonia)을 앓고 있는 돼지의 페 조직으로부터 분리하였다.

상기 흉막폐렴균 균주는 니코틴아미드 디뉴클레오티드 (NAD) 10μg/ml, L-시스테인 히드로클로리드 260μg/ml, L-글루타민 0.6mM, 덱스트로스 1mg/ml, L-시스테인 디히드로클로리드 10μg/ml 및 Tween 80 0.1 %(v/v))가 보충된 플루로뉴모니아-유사 개체 (pleuropneumonia-like organism: PPLO) 배지 (BD Bioscience, Sparks, MD) 중에 37℃에서 연속 교반하면서 배양하였다. 전세포 파쇄물을 얻기 위하여, 흉막폐렴균을 중간-로그 단계까지 배양하고, 3,000xg에서 10 분 동안 원심분리에 의하여 수확하였다. 상기 세포 펠렛을 인산 완충 염수 (PBS, pH 7.4)로 세척하고, 파쇄 버퍼 (20mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.15M NaCl, 0.1M EDTA, 1% SDS)로 파쇄하고, 사용시까지 -70℃에서 저장하였다.

상기 배양 배지에서 흉막폐렴균에 의하여 분비된 단백질은 상기 상등액에 0.02%(v/v) 데옥시콜산 및 15%(v/v) 트리클로로아세트산의 첨가에 의하여 침전시켰다. 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 상기 침전을 원심분리에 의하여 수집하고, 얻어진 펠렛을 찬 에탄올로 세척하고 원심분리하였다. 상등액을 흡입하여 제거한 후, 상기 펠렛은 건조시키고 PBS 중에 용해시켰다.

마이코플라즈마 하이오뉴모니아 균주는 ATCC 배지 1699 중에 37℃에서 연속 교반하면서 중간-로그 단계까지 배양하였다 (배지 pH 범위, 6.8-7.2). 세포 막을 삼투 파쇄 (osmotic lysis) 및 초음파 조파 (soniation)에 의하여 분리하였다. 간단하게 설명하면, 세포 펠렛을 PBS로 세척하고, 탈이온수 중에 재현탁하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 상기 현탁물은 초음파 (각 버스트 (burst) 사이에 2-s 냉각기와 함께 200-300 W에서 30 2-s 버스트)에 의하여 파괴한 다음, 37℃에서 10,000xg로 20분 동안 원심분리하였다. 상등액은 4℃에서 100,000xg로 1시간 동안 원심분리하여 세포 막을 회수하였다. 상기 세포 막 펠렛은 재현탁 버퍼 (10mM 포타슘 포스페이트, 50mM NaCl, 20% 글리세롤(v/v)) 중에 용해시키고, 사용시까지 -70℃에서 저장하였다. 상기 ATCC 배지 1699는 다음과 같이 제조하였다. 심장 침출 브로쓰 (heart infusion broth(BD238400) 7.5g, 증류수 660ml을 혼합하고 pH 7.4로 조정한 후 121℃에서 면균하였다. 다음의 필터-면균된 성분들을 무균적으로 첨가하였다. NaHCO3 또는 페놀 레드가 없는 10x HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)(CaCl2 1.4g, KCl 4.0g, KH2PO4 0.6g, MgCl2x6H2O 1.0g, MgSO4x7H2O 1.0g, NaCl 80.0g, Na2 PO4x7H2O 0.9g, 포도당 10.0g, 나머지 증류수를 1000.0ml가 되게 하는 양) 40.0ml, 0.25% 페놀 레드 10.0ml, 돼지 혈청 (열-불황성화) 200.0ml, 1xDulbecco's PBS (GIBCO 14040) 5% 락트알부민 가수분해물, TC (BD259962) 100.0ml 및 효모추출용액 (GIBCO 18180) 20.0ml.

대장균 DH5α 및 BL21(DE3) 균주 (Stratagene, La Jolla, CA)는 각각, 플라스미드 DNA 증폭, 및 재조합 단백질의 생산을 위하여 사용되었고, 연속 교반하면서 37℃에서 루리아-베르타니(Luria-Bertani: LB) 배지 중에서 성장시켰다.

(3) 단백질 발현 벡터 제작

pET-ApxN 플라스미드 벡터를 제조하기 위하여, apxIIIA 유전자의 단편을 흉막폐렴균의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 10의 ApxN-F와 서열번호 11의 ApxN-R을 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하여, ApxIIIA 유전자 (GenBank Accession No. L12145)의 N-말단 부위에 위치한 염기서열을 증폭하였다. 표 1은 증폭에 사용된 프라이머를 나타낸다. 얻어진 PCR 산물 (서열번호 17)은 pGEM-T Easy 벡터 (Promega, Madison, WI) 내로 클로닝하였다. 다음으로, 이 TA-클로닝된 벡터를 BamHI 및 XhoI로 절단하고, 삽입체 (insert)를, N-말단 히스티딘 태그를 갖는 선형화된 pET28a(+) (Novagen, Cambridge, UK)에 연결하여 pET-ApxN 플라스미드 벡터를 제조하였다. 여기서, ApxN은 서열번호 16의 ApxIII의 N-말단 영역을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 나타낸다. 서열번호 16에서, 1-21 아미노산 잔기는 pET28a(+) 벡터 유래의 폴리히스티딘 함유 서열이며, 22-139 아미노산 잔기는 ApxIIIA의 N-말단 서열이다. ApxN 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

프라이머	서열번호	표적 서열 accession 번호	표적 유전자	증폭산물 길이(bp)	비고
ApxN-F	10	L12145	apxIIIA	315	BamHI 부위 포함
ApxN-R	11	L12145	apxIIIA	315	XhoI 부위 포함
P97C-F	12	U50901	P97	954	BamHI 부위 포함
P97C-R	13	U50901	P97	954	XhoI 부위 포함
Ap97-F	14	L12145	apxIIIA	333	NdeI 부위 포함
Ap97-R	15	L12145	apxIIIA	333	BamHI 부위 포함

pET-P97C 벡터는 P97 (GenBank Accession No. U50901)의 C-말단 부분의 영역을 발현시키기 위하여 제작되었다. 먼저, 아미노산 서열을 변화시키지 않고 대장균에 의하여 선호된 코돈을 생성하도록 P97의 뉴클레오티드 서열이 변형되고, 5'-TGA-3' 코돈이 5'-TGG-3'으로 치환된 DNA 단편이 합성되었다. 5'-TGA-3'는 미코플라즈마에서 트립토판으로 읽히지만, 대장균과 같은 다른 유박테리아 (eubacteria)에서 번역의 조기 종결을 야기시킨다. 이 단편을 주형으로 하고 서열번호 12의 P97C-F와 서열번호 13의 P97C-R을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 P97의 R1 및 R2 영역을 포함하는 954bp 길이의 산물을 증폭시켰다. 얻어진 PCR 산물 (서열번호 19)은 pGEM-T Easy 벡터 (Promega, Madison, WI) 내로 클로닝하였다. 다음으로, 이 TA-클로닝된 벡터를 BamHI 및 XhoI로 절단하고, 삽입체 (insert)를, N-말단 히스티딘 태그를 갖는 선형화된 pET28a(+) (Novagen, Cambridge, UK)에 연결하여 pET-P97C 플라스미드 벡터를 제조하였다. 여기서, P97C는 서열번호 18의 P97의 C-말단 영역을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 나타낸다. 서열번호 18에서, 1-21 아미노산 잔기는 pET28a(+) 벡터 유래의 폴리히스티딘 함유 서열이며, 22-339 아미노산 잔기는 P97의 C-말단 서열이다. 상기 C-말단 서열은 R1 영역과 R2 영역을 포함한다. P97C 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열은 대장균 내에서 P97C를 발현시키기 위하여 사용되었다. 서열번호 19에서, 192-366 잔기는 R1 영역을 코딩하는 것이며, 703-822 잔기는 R2 영역을 코딩한다. 924 잔기의 구아닌 뉴클레오티드는 번역의 조기 종결을 방지하기 위하여, 아데닌 뉴클레오티드를 치환한 것이다.

pET-Ap97 벡터는 각각 N-말단과 C-말단에 ApxN 및 P97C를 포함하는, 키메라 단백질 Ap97을 발현하기 위하여 사용되었다. 흉막폐렴균 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 14의 Ap97-F와 서열번호 15의 Ap97-R을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 ApxIIIA 유전자 (GenBank Accession No. L12145)의 N-말단 부위에 위치한 염기서열을 증폭하였다. 얻어진 PCR 산물은 pGEM-T Easy 벡터 (Promega, Madison, WI) 내로 클로닝하였다. 상기 키메라 단백질 내의 Gly-Ser 펩티드 링커는 Ap97-R 프라이머 내의 5'-GGATCC-3'에 의하여 코딩된다. 다음으로, 이 TA-클로닝된 벡터를 NdeI 및 BamHI로 절단하고, 삽입체 (insert)를, 선형화된 pET-P97C에 연결하여 pET-Ap97 플라스미드 벡터를 제조하였다. Ap97-F와 Ap97-R 프라이머에서 루신 잔기에 대한 5'-TAG-3 뉴클레오티드 서열은 5'-CAG-3'으로 치환되었다.

상기 융합 단백질 Ap97은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는다. 서열번호 9에서, 1-21 아미노산 잔기는 pET-28a(+) 벡터 유래 서열로서 폴리히스티딘 영역을 포함하는 것으로 정제를 위하여 포함된 것이다. 22-132 아미노산 잔기는 ApxIIIA의 N 말단 영역의 서열이고, 133-134 아미노산 잔기는 링커 서열이며, 135-454 아미노산 잔기는 R1 영역과 R2 영역을 포함한 P97의 C-말단 영역의 서열이다. 상기 융합 단백질 Ap97를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

(4) 단백질 발현 및 정제

ApxN, P97C와 Ap97을 발현하도록 제작된 각 pET-ApxN, pET-P97C, 및 pET-Ap97 벡터로 열 충격 프로토콜을 사용하여 대장균 BL21(DE3)을 형질전환시켰다. 선택된 콜로니를 100μg/ml 카나마이신으로 보충된 LB 배지 중에서 37℃에서 교반하면서 배양하였다.

밤샘 배양물 (1:100으로 희석됨)은 0.5 내지 0.7의 A600에 의하여 나타내어지는 중간-로그 단계까지 37℃에서 교반하면서 배양시킨 후, 최종 1 mM 농도의 이소프로필-β-티오갈락토피라노시드(isopropyl-β-thiogalactopyranoside: IPTG)를 첨가한 후, 37℃에서 4시간 동안 배양하여 단백질 발현을 유도하였다.

P97C 및 Ap97 단백질 모두 대장균 봉입체 (inclusion body)로부터 정제되었다. 세포를 얼음으로 차게 된 PBS (pH 7.4)로 2번 세척한 다음, 버퍼 A (100mM 소듐 포스페이트, 10mM Tris-HCl, 100μg/ml 리소자임 및 5mM 페닐메탄술포닐플루오리드 (PMSF); pH 8.0) 중에 30분 동안 파쇄시켰다. 파쇄물(lysate)을 10,000xg 속도로 20분간 원심분리하고, 얻어진 펠렛은 버퍼 B (8M 우레아, 10mM Tris-HCl, 100mM 소듐 포스페이트 및 5mM PMSF; pH 8.0) 중에 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하여 재현탁시켰다. 다음으로, 상기 가용화된 추출물을 Ni-니트릴로트리아세트산 (NTA) 칼럼 (Qiagen, Chatsworth, CA)에 로딩하였다. 상기 칼럼을 버퍼 C (8M 우레아, 10mM Tris-HCl, 100mM 소듐 포스페이트 및 5mM PMSF; pH 6.3)로 세척하고, 제조자의 프로토콜에 따라 각각 버퍼 D (8M 우레아, 10mM Tris-HCl, 100mM 소듐 포스페이트 및 5mM PMSF; pH 5.9) 및 버퍼 E (8M 우레아, 10mM Tris-HCl, 100mM 소듐 포스페이트 및 5mM PMSF; pH 4.5)로 용출시켰다. 각각의 단백질은 폴리히스티딘을 N-말단에 포함하고 있으므로 이를 이용하여 정제하였다.

ApxN를 정제하기 위하여, 얼음으로 차게 된 PBS로 세척하고, 30 분 동안 얼음 상에서 버퍼 F (50mM 소듐 포스페이트, 300 mM 소듐 클로리드, 10 mM 이미다졸, 1mg/ml 리소자임 및 5mM PMSF; pH 8.0) 중에 파쇄하고, 버스트 (burst) 사이에 10-s 냉각기를 갖는 200-300 W에서 6 10-s 버스트를 사용하여 얼음 상에서 초음파를 조사하였다. 세포 파편 (debris)을 10,000xg에서 20 분 동안 원심분리에 의하여 펠렛화하고, 그 결과 얻어진 상등액을 Ni-NTA 칼럼에 적용하였다. 상기 칼럼을 버퍼 G (50mM 소듐 포스페이트, 300mM 소듐 클로리드, 20mM 이미다졸 및 5mM PMSF; pH 8.0)로 2회 세척하였다. Ni-NTA 칼럼에 결합된 단백질을 제조자의 프로토콜에 따라 버퍼 H (50mM 소듐 포스페이트, 300 mM 소듐 클로리드, 250 mM 이미다졸, 및 5mM PMSF; pH 8.0)로 용출시켰다.

정제된 단백질을 150mM 소듐 클로리드와 5% 글리세롤을 포함한 인산-완충 염수 (phosphate-buffered saline: PBS)로 연속적으로 (serially) 희석된 우레아 또는 이미다졸로 36 시간 동안 4℃에서 투석하였다. 단백질 농도는 BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL)를 이용하여 결정하였다.

(5) 마우스 면역 실험

본 실시예에 사용된 마우스를 취급하기 위한 모든 과정은 서울대학교의 실험 동물자원연구소에 의하여 리뷰되고 승인되었고 수의학적 감독하에 윤리적이고 인간적인 방식으로 수행되었다.

6 내지 8 주령 암컷 Balb/C 마우스 (SLC Japan, Shizuoka, 일본)는 서울대학교의 수의 약품과의 실험 동물 시설 (laboratory animal facilities) 중에서 사육되었다. 마우스는 제1차 면역접종 전까지 2주 동안 자유로 물과 먹이에 접근할 수 있도록 된 케이지에 유지하였다. 마우스를 졸레틸 (Virbac, Carros, France)-롬푼 (Bayer, Seoul, Korea) 혼합물로 마취시킨 다음, 0일, 14일, 28일, 및 42일에 25μg 면역원 (Ap97, ApxN, 또는 P97C)를 피하 투여하여 면역접종하였다. PBS-면역접종된 생쥐를 음성 대조군으로 포함시켰다. 면역원 또는 PBS는 0일에 완전 프로인트 아주반트 중에 및 14일, 28일 및 42일에는 불완전 프로인트 아주반트 중에 투여되었다.

혈청 시료는 0일, 14일, 28일 및 42일에 면역접종 전 마취하에서 안와 채혈 (retro-orbital bleeding)에 의하여 얻었다. 마우스를 최초 면역접종 3주 후 (63일) 심장천자 (cardiac puncture)에 의하여 희생시키고, 비장절제술 (splenectomy)를 수행하여 비장세포 (splenocyte)의 초대 배양 (primary culture)이 가능하도록 하였다.

(6) 비장세포 및 시토킨 분석

Ap97, ApxN, 및 P97C 백신으로 인 비보 프라이밍된 비장세포를 가습된 분위기의 5% CO₂ 하에서 37℃에서 10% FBS, 1mM 소듐 피루베이트, 2mM L-글루타민, 100U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토미신 및 50 μM 2-메르캅토에탄올로 보충된 RPMI 1640 배지 중에 배양하였다. 시토킨 생산 분석을 위하여, 비장세포 (4x10⁶ cells/ml)를 PBS 중에 용해된 1.25μg/ml의 Ap97, ApxN, 및 P97C로 72 시간 동안 재자극시켰다. 재자극 끝에, 세포 배양 상등액을 수확하고, 제조자의 프로토콜에 따라, bead-based multiplex assay kit (Procarta cytokine assay, Panomics, Fremont, CA)를 사용하여 IFN-γ및 IL-4에 대하여 분석하였다.

(7) 효소-연결 면역흡착 분석 ( ELISA )

ApxN 및 P97C에 대한 마우스 혈청 시료의 면역-반응성은 간접 ELISA를 사용하여 측정하였다. 간단하게 설명하면, 96-웰 플레이트의 웰을 50μl 카르보네이트 버퍼 (pH 9.6) 중 0.5μg ApxN 또는 P97C로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 상기 웰을 0.05% Tween 20을 포함한 PBS (PBS-T)로 세 번 세척하고, 5%의 탈지유를 포함한 PBS-T로 37℃에서 2시간 동안 차단한 후, 연속 (serially) 희석된 혈청 시료와 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 웰을 세척하고 호스래디쉬 더옥시다제 (horseradish peroxidase: HRP)-접합된 항-생쥐 IgG, IgG1, 또는 IgG2a (PBS-T 중 1:1,000으로 희석됨)와 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세척한 후, O-페닐렌디아민 (Amresco, Solon, OH)을 각 웰에 첨가하여, 37℃에서 30분간 반응시킨 후 3M HCl로 반응을 정지시켰다. 각 웰에 대하여 micro-plate spectrophotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 450nm에서의 흡광도 (absorbance)를 측정하였다. 분석에 대한 컷-오프 값은 1:100 희석에서 분석된 면역접종되지 않은 마우스 (0일)의 혈청 시료를 사용하여 평균 특이 광밀도 (OD) 더하기 3 표준편차 (SD)로 계산하였다. 역가 (titer)는 상기 컷-오프 보다 더 높은 OD를 발생시키는 가장 마지막 혈청 희석의 역수로서 확립하였다.

(8) 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅 분석

단백질 시료는 minigel apparatus (Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 SDS-PAGE 전기영동 (8-10% 아크릴아미드)에 의하여 분리하고 쿠마시 블루로 염색하였다. 웨스턴 블롯팅 분석을 위하여, SDS-PAGE 겔 중의 상기 단백질을 블롯팅 장치 (Bio-Rad) 중의 Protran nitrocellulose membrane (Whatman, Dassel, Germany)으로 전이시켰다. 상기 막을 5% 탈지유 함유 TBS-T와 1시간 동안 인큐베이션시켜 차단시킨 후, 마우스 또는 돼지로부터 얻고 1:500으로 희석된 항혈청과 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 세척과정을 거친 후, HRP-접합된 항-생쥐 IgG 또는 항-돼지 IgG (Biomedicals, Solon, OH) 2차 항체 (1:5,000으로 희석됨)와 1시간 동안 인큐베이션시키고, 화학발광 시약 (chemiluminescence reagent)으로 발색시켰다.

(9) 돼지 면역 실험

본 실시예에 사용된 돼지를 취급하기 위한 모든 과정은 서울대학교의 실험 동물자원연구소에 의하여 리뷰되고 승인되었고 수의학적 감독하에 윤리적이고 인간적인 방식으로 수행되었다.

12 마리의 4-6 kg의 3 주령 수컷 돼지를 무균 농장으로부터 얻었다. 돼지를 4개 그룹으로 무작위로 나누고, 분리된 방의 틈 바닥 (slatted floor)과 고무 매트를 가진 우리 중에 사육하고 물과 먹이를 자유롭게 접근가능하도록 제공하였다. 일주일의 적응 사육 후, 각 돼지 그룹을 알루미늄 히드록시드에 흡착된 700μg Ap97 또는 음성 대조군으로서 알루미늄 히드록시드를 포함한 PBS 2ml를 근육으로 면역접종하였다 (0일). 비슷한 방식으로 14일에 부스터 접종하였다. 면역-혈청학적 분석을 위한 혈액 시료는 제1 면역접종 후 24일에 vena cava cranialis의 천자에 의하여 채취하였고, 혈청은 1,500xg로 15 분 동안 원심분리에 의하여 얻었다. 혈액 채취 후 수행된 공격 처리 (challenge treatments)에서, 돼지는 흉막폐렴균 (혈청형 2)의 2x10⁸ 콜로니-형성 단위 (colony-forming unis)와 M. 하이오뉴모니아의 1.5x10⁸ 콜로니-형성 단위를 각각 비강내 또는 기관내 (intratracheal) 투여에 의하여 접종되었다.

공격 접종 후 2주 후 (38일) 직장 온도, 기침, dyspenia, tachypnea, depression, and nasal discharge와 같은 임상 증상을 모니터링하고 기록하였다. 공격 접종 3주 후 (45일) 돼지를 전류를 사용하여 안락사시키고 완전한 부검을 수행하였다. 거시적 폐 손상 점수 (macroscopic lung lesion score)를 이전에 기술된 바에 따라 결정하였다 (Halbur PG et al. (1995) Vet. Pathol. 32: 648-660).

(10) 통계

항체 역가, 시토킨 생산, 및 거시적 페 손상에 대한 값은 평균±SD로 표현하였다. 페어드(paired) 또는 언페어드(unpaired) t-테스트가 SPSS 15.0 (SPSS, Chiago, IL)를 사용하여 수행되어 선택된 그룹의 쌍을 비교하였다.

실시예 1

(1) 재조합 단백질의 생산

pET-ApxN, pET-P97C, 및 pET-Ap97 벡터로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)을 배양하여 단백질을 발현시키 후 정제된 단백질을 SDS-PAGE 분석한 결과, 각각 약 15 kDa, 45 kDa, 및 60 kDa의 밴드가 확인되었다 (도 1A). 이들 값은 ApxN, P97C와 Ap97 (ApxN 및 P97C을 포함한 키메라 단백질)의 예상된 분자량에 대응되었다. 이들 발견은 재조합 단백질이 예상대로 발현되었다는 것을 나타낸다. 도 1은 ApxN, P97C와 Ap97 재조합 단백질의 발현과 정제를 나타낸 도면이다. 도 1A는 His-태그 친화성 크로마토그래피를 사용하여 대장균 BL21 (DE3)로부터 정제된 ApxN, P97C와 Ap97를 나타내는 쿠마시 블루-염색된 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. 도 1A에서, 레인 1, 2, 및 3은 pET-ApxN, pET-P97C, 및 pET-Ap97 벡터로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)로부터 정제된 단백질 즉, ApxN, P97C와 Ap97을 각각 나타낸다. 도 1B, 1C, 및 1D는 각각 Ap97(B), ApxN(C) 및 P97C(D) 백신으로 면역접종된 마우스로부터 얻은 항혈청을 사용하여 ApxN, P97C와 Ap97를 웨스턴 블롯팅 분석한 결과를 나타낸다. 마우스 항혈청은 최종 면역접종 후 3주(63일)에 채취하였다. 도 1B, 1C, 및 1D에서, 레인 1, 2, 및 3은 ApxN, P97C와 Ap97을 각각 나타낸다.

(2) 마우스에서 재조합 단백질의 면역원성

Ap97 백신으로 면역접종된 마우스에서 생성된 항혈청을, Ap97이 전체 Ap97에 대하여 뿐만 아니라, 그의 성분 서브유닛, ApxN 및 P97C의 각각에 특이적인 항체의 생산을 유도할 수 있는 능력을 시험하기 위하여 사용하였다. Ap97 백신에 대한 항혈청은 ApxN, P97C와 Ap97과 반응하였으며, 이는 Ap97의 면역접종은 3 재조합 단백질 모두에 결합하는 항체의 생산을 유도한다는 것을 나타낸다 (도 1B 참조). 따라서, Ap97은 두 개별 성분의 항원성 특성을 보유하였다. ApxN 및 P97C 백신으로 면역접종된 항혈청은 Ap97 및 ApxN; 및 P97C 및 ApxN;와 각각 반응하였다. 그러나, ApxN으로 면역접종된 마우스로부터 얻은 항혈청은 P97C와 교차반응하지 않았으며, 그 역도 동일하였다 (도 1C 및 1D 참조).

Ap97 및 ApxN 백신의 면역접종은 마우스에서 ApxN에 대한 강렬한 IgG 반응을 유도하였다. IgG 로그 역가는 Ap97 및 ApxN 백신의 제1차 면역접종 후 14일에 각각 3.22 및 3.22, 최종 면역접종 후 3주일에 각각 5.87 및 5.82에 도달하였다 (도 2A; P < 0.01).

Ap97 및 P97C 백신의 면역접종은 또한 마우스에서 항-P97C IgG 항체의 수준을 증가시켰다. IgG 로그 역가는 Ap97 및 P97C 백신의 최종 면역접종 후 3주일(63일)에 각각 5.55 및 5.23에 도달하였다. 이 값들은 PBS가 주어진 마우스로부터 얻은 항혈청에 대한 값들보다 또한 더 높았다 (도 2B; P < 0.01).

ApxN 및 P97C에 대한 IgG1 및 IgG2a 이소타입의 수준은 최종 면역접종 후 3주일(63일)에 수집된 혈청에서 측정하였다 (도 2C 및 도 2D 참조). ApxN 및 P97C에 대한 IgG1 및 IgG2a 이소타입의 수준은 대응되는 PBS-처리된 대조군에서의 수준보다 더 높았으며 (P<0.01 또는 P<0.05), 이는 혼합된 Th1-Th2 반응을 나타낸다. 그러나, ApxN에 대한 IgG2a/IgG1의 평균 비율은 Ap97 및 ApxN 백신이 주어진 마우스로부터 얻은 항혈청에서 각각, 7.12 및 9.53이었으며, 이는 IgG1에 비해 IgG2a 생산의 우세, 즉 ApxN에 대한 Th1-치우친 반응을 나타낸다. 대조적으로, P97C에 대한 IgG2a/IgG1의 평균 비율은 Ap97 및 P97C 백신이 주어진 마우스로부터 얻은 항혈청에서 각각, 0.78 및 1.68이었다. 이는 Ap97 및 P97C가 P97C에 대하여 상대적으로 균형잡힌 IgG2a 및 IgG1 반응을 유도한다는 것을 나타낸다. Ap97의 두 성분에 대하여 생성된 IgG 이소타입의 비율의 이 차이는 흥미로운 것이지만, 그 기작은 명확하지 않다.

도 2는 ApxN, P97C와 Ap97 백신으로 면역접종된 마우스에서 ApxN 및 P97C에 대한 총 IgG, IgG1,및 IgG2a 이소타입 항체의 혈청 역가를 나타낸다. 혈액 시료는 제1차 면역접종 0, 14, 28, 42, 및 63일에 얻었다. 도 2A는 ApxN에 대한 총 IgG 역가를 나타내고, 도 2B는 P97C에 대한 총 IgG 역가를 나타내고, 도 2C는 ApxN에 대한 IgG 이소타입 역가를 나타내고, 도 2D는 P97C에 대한 IgG 이소타입 역가를 나타낸다. IgG1 및 IgG2a 역가는 최종 면역접종 후 3주일 (63일)에 수집된 혈청에서 측정하였다. 칼럼 위의 숫자는 평균 IgG2a/IgG1 비율 (C 및 D)를 나타낸다. 데이터는 평균±SD (n=5)로 나타낸다. * P < 0.05 및 ** P< 0.01, 대응되는 항-PBS 혈청 대조군으로부터 유의하게 다르다는 것을 나타낸다 (언어페어드 t-테스트).

(3) 재조합 단백질에 의하여 유도된 시토킨 분비

Ap97, ApxN, 및 P97C 백신으로 면역접종된 마우스로부터 얻은 재자극된 비장 단핵세포 (비장세포)를 IFN-γ 및 IL-4의 생산에 대하여 분석하였다 (도 3). Ap97, ApxN, 및 P97C로 인 비트로 재자극된 비장세포의 배양 배지 중의 IFN-γ, Th1 시토킨의 농도는 각각, 123.02±8.23 pg/ml, 42.89±15.81 pg/ml, 및 61.51±25.36 pg/ml이었다. 이들 수준은 PBS (대조군)으로 재자극된 것보다 각각, 80.9, 29.4, 및 50.8 배 더 높았다 (도 3A; P<0.01 또는 P<0.05).

Ap97, ApxN, 및 P97C로 인 비트로 재자극된 비장세포에 의하여 생산된 IL-4, Th2 시토킨의 농도는 각각, 18.21±5.08 pg/ml, 5.36±2.83 pg/ml, 및 9.77±2.04 pg/ml이었다. 이들 수준은 PBS (대조군)으로 재자극된 것보다 각각, 43.4, 7.66, 및 16.3 배 더 높았다 (도 3B; P<0.01 또는 P<0.05).

콘카나발린 A, 강력한 T 세포 자극자에 의한 자극은 또한 (대조군을 포함한) 비장세포가 이들 두 시토킨을 생산하도록 유도하였다 (데이터는 보이지 않음). 이들 발견은 세 재조합 단백질 모두 비장세포에 의한 IFN-γ 및 IL-4의 생산을 유도하였다는 것을 나타내고, 이는 혼합된 Th1-Th2 면역 반응의 유도를 암시한다.

도 3은 면역접종된 마우스로부터 얻은 비장세포의 시토킨 프로파일을 나타낸다. 마우스는 Ap97, ApxN, 또는 P97C 백신으로 프라이밍되었다. 비장세포는 각 마우스로부터 분리된 후 PBS 중에 용해된 Ap97, ApxN, 또는 P97C에 의하여 재자극되었다. 데이터는 평균±SD(n=4)를 나타낸다. * P< 0.05 및 ** P < 0.01은 대응되는 PBS-처리된 대조군과 유의하게 다르다는 것을 나타낸다 (페어드 t-테스트).

(4) ApxIII 와 P97 의 상기 재조합 단백질에 대한 마우스 항혈청과의 반응

웨스턴 블롯팅을 수행하여 천연 ApxIII과 Ap97 및 ApxN 백신에 대하여 생성된 마우스 항혈청과의 반응을 조사하였다 (도 4). 흉막폐렴균의 배양 배지로부터 침전된 단백질 시료를 분석에 대하여 사용하였다 ("재료 및 방법" 참조).

Ap97 및 ApxN 백신이 면역접종된 마우스에서 생성된 항혈청은, ApxIII의 분자량에 해당하는 크기 약 120kDa인 침전된 단백질과 반응한 반면, 대조군 배지에서는 단백질 신호가 검출되지 않았다. 이는 Ap97 및 ApxN 백신의 면역접종에 대한 반응으로 생성된 항체는 흉막폐렴균에 의하여 분비된 ApxIII에 쉽게 결합한다는 것을 나타낸다. 이들 데이터는 ApxN 뿐만 아니라, Ap97이 마우스 면역체계에 의하여 인식되는, ApxIII의 항원성 특성을 가지고 있다는 것을 나타낸다.

Ap97 및 P97C 백신이 면역접종된 마우스에서 얻은 항혈청은, 또한 M. 하이오뉴모니아의 막 분획에서 발견된, P97과의 반응에 대하여 분석되었다 (도 5). 상기 항혈청은 P97의 예측된 크기인 약 97kDa의 밴드를 검출하였다. 이들 데이터는 Ap97 및 P97 모두 천연 P97의 항원성 특성을 보유한다는 것을 나타낸다. 더욱이, M. 하이오뉴모니아로 인공적으로 감염된 돼지로부터 얻은 혈청은 상기 97kDa 단백질과 반응하였다. 세 항혈청 모두 또한 두 다른 단백질 (30 및 60kDa)과 반응하였고, 상기 돼지 항혈청은 70kDa의 추가적 밴드를 검출하였다. P97의 다른 크기의 절단 산물을 확인한 이전의 연구에 근거하여, 상기 비-97kDa 단백질은 P97의 절단 산물을 나타낼 수 있다. P97를 포함한, 이들 단백질 밴드는 대조군 혈청에 의하여는 인식되지 않았다.

도 4는 Ap97 또는 ApxN 재조합 단백질로 면역접종된 마우스로부터 얻은 항혈청에 의한 흉막폐렴균 ApxIII의 인식을 나타낸다. 웨스턴 블롯팅 분석이 흉막폐렴균 1536 배양 배지 (레인 1)와 대조군 배지로부터 침전된 단백질에 대하여 ApxN-백신접종된 (A) 및 Ap97-백신접종된 (B) 마우스 혈청을 가지고 수행되었다. 화살표는 표적 밴드 크기를 나타낸다.

도 5는 Ap97 또는 P97C 재조합 단백질로 면역접종된 마우스로부터 얻은 항혈청에 의한 M. 하이오뉴모니아 P97의 인식을 나타낸다. M. 하이오뉴모니아로부터 얻은 세포 막 분획을 Ap97-백신접종된 마우스 혈청 (레인 1), P97C-백신접종된 마우스 혈청 (레인 2), M. 하이오뉴모니아에 의해 실험적으로 감염된 돼지의 혈청 (레인 3), 및 PBS-백신접종된 대조군 마우스 혈청 (레인 4)를 가지고 웨스턴 블롯팅 분석하였다. 화살표는 표적 밴드 크기를 나타낸다.

(5) 돼지에서 Ap97 의 면역원성

본 발명자들은 또한 천연 P97과 ApxIII에 대한 Ap97 백신-처리된 돼지 혈청의 반응성을 조사하였다 (도 6). Ap97 백신에 대한 항혈청은 예상된 분자량의 단백질 밴드를 인식하였다; M. 하이오뉴모니아의 세포막 분획 중의 97kDa 및 흉막폐렴균의 배양 배지 및 세포 파쇄물 중의 120kDa. 더욱이, PBS로 처리된 돼지로부터 얻은 혈청은 P97 또는 ApxIII과 반응하지 않았다. 이들 데이터는 Ap97이 면역접종된 돼지에서 유도된 항체는 P97 및 ApxIII과 효율적으로 반응하고, Ap97 단백질의 두 도메인이 돼지에서 면역원성이라는 것은 나타낸다.

도 6은 Ap97 백신에 의하여 면역접종된 돼지로부터 분리된 혈청에 의한 M. 하이오뉴모니아 P97과 흉막폐렴균 ApxIII의 인식을 나타낸다. A는 M. 하이오뉴모니아의 세포 막 분획 (레인 1), 흉막폐렴균의 배양 배지 (레인 2) 및 흉막폐렴균의 세포 파쇄물 (레인 3)로부터 TCA-침전된 단백질에 대하여, Ap97-백신접종된 돼지 혈청을 가지고 웨스턴 블롯팅 분석을 수행한 결과이다. B는 패널 A에 기술된 단백질 시료를 PBS-백신접종된 돼지 혈청을 가지고 웨스턴 블롯팅 분석을 수행한 결과이다. 화살표는 표적 밴드 크기를 나타낸다.

(6) 돼지에서 Ap97 의 보호 효능

Ap97로 면역접종된 돼지는 P97 및 ApxIII에 대한 항체를 생산하였기 때문에 (도 6), 상기 돼지를 M. 하이오뉴모니아 및 흉막폐렴균로 직접적으로 공격접종시켰다 (표 2).

면역원	공격접종	체온a	임상증상을 가진 돼지 수/공격접종된 돼지수				폐 손상 점수b (평균±SD)
			기침	호흡장애 (빈호흡)	우울	비루
Ap97	흉막폐렴균	-	1/3	0/3	0/3	0/3	4.33±2.08*
PBS	흉막폐렴균	++	3/3	3/3	3/3	3/3	67.83±1.89
Ap97	M. 하이오뉴모니아	-	1/3	0/3	0/3	0/3	8.67±6.43*
PBS	M. 하이오뉴모니아	+	2/3	2/3	2/3	2/3	73.83±9.28

표 2에서, 흉막폐렴균와 M. 하이오뉴모니아 감염에 대한 돼지의 Ap97 백신에 의한 보호를 나타낸다. a는 최대 측정된 직장 온도이며, -는 ≤40℃, +는 40 내지 42℃미만, ++는 ≥42℃을 나타낸다. b는 폐렴 감염의 임의의 타입에 의하여 영향받은 폐의 총 면적 (0-100%). * P<0.01, 대응되는 PBS-처리된 그룹 (언페어드 t-테스트)과 유의하게 다르다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 흉막폐렴균의 비강내 투여에 의하여 공격접종된 세 PBS 백신-처리된 대조군 돼지 모두는 증가된 체온 (42℃ 보다 높음)을 보였고, 기침, 호흡곤란, 우울 및 비루를 포함한, 임상적 증상이 발생하였다. 사후 부검에 의하면, 세 PBS-면역접종된 돼지는 모두 돼지 플루로뉴모니아의 전형적인 폐 손상을 가졌다. 이들 돼지의 폐 손상 점수는 Ap97-백신접종된 돼지의 점수보다 유의하게 높았다. 대조적으로, Ap97-백신접종된 돼지는, 가벼운 기침을 앓은 한 마리 돼지를 제외하고, 감염의 임상적 증상이 없었다.

M. 하이오뉴모니아의 기관내 투여에 의하여 공격접종된 세 PBS-백신접종된 돼지 중 두 마리는 또한 임상적 증상 (기침, 호흡곤란, 우울, 및 비루)를 발생시켰고, 세 돼지 모두 40-42℃의 증가된 체온을 보였다. 또한, M. 하이오뉴모니아와 연관된 많은 중요한 병리적 변화가 PBS-백신접종된 돼지에서 관찰되었으나, Ap97-백신접종된 돼지 그룹 (한 마리 돼지에서 가벼운 기침을 갖는 것을 제외하고)에서는 현저한 임상적 증상 또는 폐 손상은 관찰되지 않았다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Recombinant protein vaccine for preventing Actinobacillus pleuropneumoniae and Mycoplasma hyopneumoniae infection diseases <130> PN099639 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1049 <212> PRT <213> Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 2 <400> 1 Met Ser Thr Trp Ser Ser Met Leu Ala Asp Leu Lys Lys Arg Ala Glu 1 5 10 15 Glu Ala Lys Arg Gln Val Lys Lys Gly Tyr Asp Val Thr Lys Asn Gly 20 25 30 Leu Gln Tyr Gly Val Ser Gln Ala Lys Leu Gln Ala Leu Ala Ala Gly 35 40 45 Lys Ala Val Gln Lys Tyr Gly Asn Lys Leu Val Leu Val Ile Pro Lys 50 55 60 Glu Tyr Asp Gly Ser Val Gly Asn Gly Phe Phe Asp Leu Val Lys Ala 65 70 75 80 Ala Glu Glu Leu Gly Ile Gln Val Lys Tyr Val Asn Arg Asn Glu Leu 85 90 95 Glu Val Ala His Lys Ser Leu Gly Thr Ala Asp Gln Phe Leu Gly Leu 100 105 110 Thr Glu Arg Gly Leu Thr Leu Phe Ala Pro Gln Leu Asp Gln Phe Leu 115 120 125 Gln Lys His Ser Lys Ile Ser Asn Val Val Gly Ser Ser Thr Gly Asp 130 135 140 Ala Val Ser Lys Leu Ala Lys Ser Gln Thr Ile Ile Ser Gly Ile Gln 145 150 155 160 Ser Val Leu Gly Thr Val Leu Ala Gly Ile Asn Leu Asn Glu Ala Ile 165 170 175 Ile Ser Gly Gly Ser Glu Leu Glu Leu Ala Glu Ala Gly Val Ser Leu 180 185 190 Ala Ser Glu Leu Val Ser Asn Ile Ala Lys Gly Thr Thr Thr Ile Asp 195 200 205 Ala Phe Thr Thr Gln Ile Gln Asn Phe Gly Lys Leu Ala Glu Asn Ala 210 215 220 Lys Gly Leu Gly Gly Val Gly Arg Gln Leu Gln Asn Ile Ser Gly Ser 225 230 235 240 Ala Leu Ser Lys Thr Gly Leu Gly Leu Asp Ile Ile Ser Ser Leu Leu 245 250 255 Ser Gly Val Thr Arg Ser Phe Ala Leu Arg Asn Lys Asn Ala Ser Thr 260 265 270 Ser Thr Lys Val Ala Ala Gly Phe Glu Leu Ser Asn Gln Val Ile Gly 275 280 285 Gly Ile Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr Ile Leu Ala Gln Arg Leu Arg 290 295 300 Ala Gly Leu Ser Thr Thr Gly Pro Ala Ala Ala Leu Ile Ala Ser Ser 305 310 315 320 Ile Ser Leu Ala Ile Ser Pro Leu Ala Phe Leu Arg Val Ala Asp Asn 325 330 335 Phe Asn Arg Ser Lys Glu Ile Gly Glu Phe Ala Glu Arg Phe Lys Lys 340 345 350 Leu Gly Tyr Asp Gly Asp Lys Leu Leu Ser Glu Phe Tyr His Glu Ala 355 360 365 Gly Thr Ile Asp Ala Ser Ile Thr Thr Ile Ser Thr Ala Leu Ser Ala 370 375 380 Ile Ala Ala Gly Thr Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Leu Val Gly Ala 385 390 395 400 Pro Ile Thr Leu Leu Val Thr Gly Ile Thr Gly Leu Ile Ser Gly Ile 405 410 415 Leu Glu Phe Ser Lys Gln Pro Met Leu Asp His Val Ala Ser Lys Ile 420 425 430 Gly Asn Lys Ile Asp Glu Trp Glu Lys Lys Tyr Gly Lys Asn Tyr Phe 435 440 445 Glu Asn Gly Tyr Asp Ala Arg His Lys Ala Phe Leu Glu Asp Ser Phe 450 455 460 Ser Leu Leu Ser Ser Phe Asn Lys Gln Tyr Glu Thr Glu Arg Ala Val 465 470 475 480 Leu Ile Thr Gln Gln Arg Trp Asp Glu Tyr Ile Gly Glu Leu Ala Gly 485 490 495 Ile Thr Gly Lys Gly Asp Lys Leu Ser Ser Gly Lys Ala Tyr Val Asp 500 505 510 Tyr Phe Gln Glu Gly Lys Leu Leu Glu Lys Lys Pro Asp Asp Phe Ser 515 520 525 Lys Val Val Phe Asp Pro Thr Lys Gly Glu Ile Asp Ile Ser Asn Ser 530 535 540 Gln Thr Ser Thr Leu Leu Lys Phe Val Thr Pro Leu Leu Thr Pro Gly 545 550 555 560 Thr Glu Ser Arg Glu Arg Thr Gln Thr Gly Lys 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Asp Asn Gly Asn 770 775 780 Asp Gln Leu Tyr Gly Gly Glu Gly Asp Asp Lys Leu Leu Gly Gly Asn 785 790 795 800 Gly Asn Asn Tyr Leu Ser Gly Gly Asp Gly Asn Asp Glu Leu Gln Val 805 810 815 Leu Gly Asn Gly Phe Asn Val Leu Arg Gly Gly Lys Gly Asp Asp Lys 820 825 830 Leu Tyr Gly Ser Ser Gly Ser Asp Leu Leu Asp Gly Gly Glu Gly Asn 835 840 845 Asp Tyr Leu Glu Gly Gly Asp Gly Ser Asp Phe Tyr Val Tyr Arg Ser 850 855 860 Thr Ser Gly Asn His Thr Ile Tyr Asp Gln Gly Lys Ala Ser Asp Ser 865 870 875 880 Asp Lys Leu Tyr Leu Ser Asp Leu Ser Phe Asp Asn Ile Leu Val Lys 885 890 895 Arg Val Asn Asp Asn Leu Glu Phe Arg Ser Asn Asn Asn Ser Asn Ser 900 905 910 Gly Val Leu Thr Ile Lys Asp Trp Phe Lys Gly Gly Asn Ser Tyr Asn 915 920 925 His Lys Ile Glu Gln Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg Lys Leu Thr Ala 930 935 940 Gly Asn Leu Gly Asn Asn Phe His Asp Thr Gln Gln Ala Ser Ser Leu 945 950 955 960 Leu Lys Asn Val Thr Gln Glu Gln Asn Glu Ser Asn Leu Ser Ser Leu 965 970 975 Lys Thr Glu Leu Gly Lys Ile Ile Thr Asn Ala Gly 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Ser Lys Lys Ser Lys Thr Phe Lys Ile Gly Leu Thr Ala Gly Ile 1 5 10 15 Val Gly Leu Gly Val Phe Gly Leu Thr Val Gly Leu Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Lys Tyr Arg Ser Glu Ser Pro Arg Lys Ile Ala Asn Asp Phe Ala Ala 35 40 45 Lys Val Ser Thr Leu Ala Phe Ser Pro Tyr Ala Phe Glu Thr Asp Ser 50 55 60 Asp Tyr Lys Ile Val Lys Arg Trp Leu Val Asp Ser Asn Asn Asn Ile 65 70 75 80 Arg Asn Lys Glu Lys Val Ile Asp Ser Phe Ser Phe Phe Thr Lys Asn 85 90 95 Gly Asp Gln Leu Glu Lys Ile Asn Phe Gln Asp Pro Glu Tyr Thr Lys 100 105 110 Ala Lys Ile Thr Phe Glu Ile Leu Glu Ile Ile Pro Asp Asp Val Asn 115 120 125 Gln Asn Phe Lys Val Lys Phe Gln Ala Leu Gln Lys Leu His Asn Gly 130 135 140 Asp Ile Ala Lys Ser Asp Ile Tyr Glu Gln Thr Val Ala Phe Ala Lys 145 150 155 160 Gln Ser Asn Leu Leu Val Ala Glu Phe Asn Phe Ser Leu Lys Lys Ile 165 170 175 Thr Glu Lys Leu Asn Gln Gln Ile Glu Asn Leu Ser Thr Lys Ile Thr 180 185 190 Asn Phe Ala Asp Glu Lys Thr Ser Ser Gln Lys Asp Pro Ser Thr Leu 195 200 205 Arg Ala Ile Asp Phe Gln 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Val Leu Ile Pro Tyr Arg Leu Glu Ile Lys 420 425 430 Asp Lys Phe Phe Ala Asp Asp Leu Tyr Pro Asp Thr Lys Asp Asn Ile 435 440 445 Leu Val Lys Glu Gly Ile Leu Lys Leu Thr Gly Phe Lys Lys Gly Ser 450 455 460 Lys Ile Asp Leu Pro Asn Ile Asn Gln Gln Ile Phe Lys Thr Glu Tyr 465 470 475 480 Leu Pro Phe Phe Glu Lys Gly Lys Glu Glu Gln Ala Lys Leu Asp Tyr 485 490 495 Gly Asn Ile Leu Asn Pro Tyr Asn Thr Gln Leu Ala Lys Val Glu Val 500 505 510 Glu Ala Leu Phe Lys Gly Asn Lys Asn Gln Glu Ile Tyr Gln Ala Leu 515 520 525 Asp Gly Asn Tyr Ala Tyr Glu Phe Gly Ala Phe Lys Ser Val Leu Asn 530 535 540 Ser Trp Thr Gly Lys Ile Gln His Pro Glu Lys Ala Asp Ile Gln Arg 545 550 555 560 Phe Thr Arg His Leu Glu Gln Val Lys Ile Gly Ser Asn Ser Val Leu 565 570 575 Asn Gln Pro Gln Thr Thr Lys Glu Gln Val Ile Ser Ser Leu Lys Ser 580 585 590 Asn Asn Phe Phe Lys Asn Gly His Gln Val Ala Ser Tyr Phe Gln Asp 595 600 605 Leu Leu Thr Lys Asp Lys Leu Thr Ile Leu Glu Thr Leu Tyr Asp Leu 610 615 620 Ala Lys Lys Trp Gly Leu Glu Thr Asn Arg Ala Gln Phe Pro Lys Gly 625 630 635 640 Val Phe Gln Tyr Thr Lys Asp Ile Phe Ala Glu Ala Asp Lys Leu Lys 645 650 655 Phe Leu Glu Leu Lys Lys Lys Asp Pro Tyr Asn Gln Ile Lys Glu Ile 660 665 670 His Gln Leu Ser Phe Asn Ile Leu Ala Arg Asn Asp Val Ile Lys Ser 675 680 685 Asp Gly Phe Tyr Gly Val Leu Leu Leu Pro Gln Ser Val Lys Thr Glu 690 695 700 Leu Glu Gly Lys Asn Glu Ala Gln Ile Phe Glu Ala Leu Lys Lys Tyr 705 710 715 720 Ser Leu Ile Glu Asn Ser Ala Phe Lys Thr Thr Ile Leu Asp Lys Asn 725 730 735 Leu Leu Glu Gly Thr Asp Phe Lys Thr Phe Gly Asp Phe Leu Lys Ala 740 745 750 Phe Phe Leu Lys Ala Ala Gln Phe Asn Asn Phe Ala Pro Trp Ala Lys 755 760 765 Leu Asp Asp Asn Leu Gln Tyr Ser Phe Glu Ala Ile Lys Lys Gly Glu 770 775 780 Thr Thr Lys Glu Gly Lys Arg Glu Glu Val Asp Lys Lys Val Lys Glu 785 790 795 800 Leu Asp Asn Lys Ile Lys Gly Ile Leu Pro Gln Pro Pro Ala Ala Lys 805 810 815 Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Thr Thr Lys Pro 820 825 830 Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val 835 840 845 Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala 850 855 860 Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala 865 870 875 880 Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Thr Asn Thr Gly Phe Ser Leu 885 890 895 Thr Asn Lys Pro Lys Glu Asp Tyr Phe Pro Met Ala Phe Ser Tyr Lys 900 905 910 Leu Glu Tyr Thr Asp Glu Asn Lys Leu Ser Leu Lys Thr Pro Glu Ile 915 920 925 Asn Val Phe Leu Glu Leu Val His Gln Ser Glu Tyr Glu Glu Gln Glu 930 935 940 Ile Ile Lys Glu Leu Asp Lys Thr Val Leu Asn Leu Gln Tyr Gln Phe 945 950 955 960 Gln Glu Val Lys Val Thr Ser Asp Gln Tyr Gln Lys Leu Ser His Pro 965 970 975 Met Met Thr Glu Gly Ser Ser Asn Gln Gly Lys Lys Ser Glu Gly Thr 980 985 990 Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala Pro Asn Gln Gly Lys Lys 995 1000 1005 Ala Glu Gly Thr Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala Pro Ser 1010 1015 1020 Gln Gln Ser Pro Thr Thr Glu Leu Thr Asn Tyr Leu Pro Asp Leu Gly 1025 1030 1035 1040 Lys Lys Ile Asp Glu Ile Ile Lys Lys Gln Gly Lys Asn Trp Lys Thr 1045 1050 1055 Glu Val Glu Leu Ile Glu Asp Asn Ile Ala Gly Asp Ala Lys Leu Leu 1060 1065 1070 Tyr Phe Ile Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ser Gly Asp Pro Lys Lys Ser 1075 1080 1085 Ser Leu Lys Val Lys Ile Thr Val Lys Gln Ser Asn Asn Asn Gln Glu 1090 1095 1100 Pro Glu Ser Lys 1105 <210> 4 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R1 region of P97 <400> 4 Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Thr 1 5 10 15 Thr Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala 20 25 30 Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys 35 40 45 Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro 50 55 60 Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val 65 70 75 <210> 5 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R2 region of P97 <400> 5 Gly Ser Ser Asn Gln Gly Lys Lys Ser Glu Gly Thr Pro Asn Gln Gly 1 5 10 15 Lys Lys Ala Glu Gly Ala Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Thr 20 25 30 Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu 35 40 <210> 6 <211> 318 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal region of P97 <400> 6 Lys Leu Asp Asp Asn Leu Gln Tyr Ser Phe Glu Ala Ile Lys Lys Gly 1 5 10 15 Glu Thr Thr Lys Glu Gly Lys Arg Glu Glu Val Asp Lys Lys Val Lys 20 25 30 Glu Leu Asp Asn Lys Ile Lys Gly Ile Leu Pro Gln Pro Pro Ala Ala 35 40 45 Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Thr Thr Lys 50 55 60 Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro 65 70 75 80 Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu 85 90 95 Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala 100 105 110 Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Thr Asn Thr Gly Phe Ser 115 120 125 Leu Thr Asn Lys Pro Lys Glu Asp Tyr Phe Pro Met Ala Phe Ser Tyr 130 135 140 Lys Leu Glu Tyr Thr Asp Glu Asn Lys Leu Ser Leu Lys Thr Pro Glu 145 150 155 160 Ile Asn Val Phe Leu Glu Leu Val His Gln Ser Glu Tyr Glu Glu Gln 165 170 175 Glu Ile Ile Lys Glu Leu Asp Lys Thr Val Leu Asn Leu Gln Tyr Gln 180 185 190 Phe Gln Glu Val Lys Val Thr Ser Asp Gln Tyr Gln Lys Leu Ser His 195 200 205 Pro Met Met Thr Glu Gly Ser Ser Asn Gln Gly Lys Lys Ser Glu Gly 210 215 220 Thr Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala Pro Asn Gln Gly Lys 225 230 235 240 Lys Ala Glu Gly Thr Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala Pro 245 250 255 Ser Gln Gln Ser Pro Thr Thr Glu Leu Thr Asn Tyr Leu Pro Asp Leu 260 265 270 Gly Lys Lys Ile Asp Glu Ile Ile Lys Lys Gln Gly Lys Asn Trp Lys 275 280 285 Thr Glu Val Glu Leu Ile Glu Asp Asn Ile Ala Gly Asp Ala Lys Leu 290 295 300 Leu Tyr Phe Ile Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ser Gly Asp Pro 305 310 315 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker peptide <400> 7 Gly Ser Ser Gly 1 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker peptide <400> 8 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A fusion protein of N-terminal region of ApxIIIA and C-terminal of P97 <400> 9 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Gln Val Lys Lys Gly Tyr Asp Val Thr Lys Asn 20 25 30 Gly Leu Gln Tyr Gly Val Ser Gln Ala Lys Leu Gln Ala Leu Ala Ala 35 40 45 Gly Lys Ala Val Gln Lys Tyr Gly Asn Lys Leu Val Leu Val Ile Pro 50 55 60 Lys Glu Tyr Asp Gly Ser Val Gly Asn Gly Phe Phe Asp Leu Val Lys 65 70 75 80 Ala Ala Glu Glu Leu Gly Ile Gln Val Lys Tyr Val Asn Arg Asn Glu 85 90 95 Leu Glu Val Ala His Lys Ser Leu Gly Thr Ala Asp Gln Phe Leu Gly 100 105 110 Leu Thr Glu Arg Gly Leu Thr Leu Phe Ala Pro Gln Leu Asp Gln Phe 115 120 125 Leu Gln Lys His Gly Ser Lys Leu Asp Asp Asn Leu Gln Tyr Ser Phe 130 135 140 Glu Ala Ile Lys Lys Gly Glu Thr Thr Lys Glu Gly Lys Arg Glu Glu 145 150 155 160 Val Asp Lys Lys Val Lys Glu Leu Asp Asn Lys Ile Lys Gly Ile Leu 165 170 175 Pro Gln Pro Pro Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala 180 185 190 Lys Pro Glu Thr Thr Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys 195 200 205 Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro 210 215 220 Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu 225 230 235 240 Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala 245 250 255 Thr Asn Thr Gly Phe Ser Leu Thr Asn Lys Pro Lys Glu Asp Tyr Phe 260 265 270 Pro Met Ala Phe Ser Tyr Lys Leu Glu Tyr Thr Asp Glu Asn Lys Leu 275 280 285 Ser Leu Lys Thr Pro Glu Ile Asn Val Phe Leu Glu Leu Val His Gln 290 295 300 Ser Glu Tyr Glu Glu Gln Glu Ile Ile Lys Glu Leu Asp Lys Thr Val 305 310 315 320 Leu Asn Leu Gln Tyr Gln Phe Gln Glu Val Lys Val Thr Ser Asp Gln 325 330 335 Tyr Gln Lys Leu Ser His Pro Met Met Thr Glu Gly Ser Ser Asn Gln 340 345 350 Gly Lys Lys Ser Glu Gly Thr Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly 355 360 365 Ala Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Thr Pro Asn Gln Gly Lys 370 375 380 Lys Ala Glu Gly Ala Pro Ser Gln Gln Ser Pro Thr Thr Glu Leu Thr 385 390 395 400 Asn Tyr Leu Pro Asp Leu Gly Lys Lys Ile Asp Glu Ile Ile Lys Lys 405 410 415 Gln Gly Lys Asn Trp Lys Thr Glu Val Glu Leu Ile Glu Asp Asn Ile 420 425 430 Ala Gly Asp Ala Lys Leu Leu Tyr Phe Ile Leu Arg Asp Asp Ser Lys 435 440 445 Ser Gly Asp Pro 450 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApxN-F primer <400> 10 ggggatccgg ctacgatgta actaaaaatg gt 32 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApxN-R primer <400> 11 ggctcgagtt attgtaagaa ctgatccagt tgcgg 35 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P97C-F primer <400> 12 cgggatccaa actggatgac aacctccaa 29 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P97C-R primer <400> 13 ggctcgagtt aaggatctcc ggatttgctg tcgtc 35 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ap97-F primer <400> 14 ggccatatgc aagttaaaaa aggctacgat gtaac 35 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ap97-R primer <400> 15 ggcggatcca tgtttttgtt agaactgatc cagttg 36 <210> 16 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ApxN protein <400> 16 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg 20 25 30 Gly Ser Gly Tyr Asp Val Thr Lys Asn Gly Leu Gln Tyr Gly Val Ser 35 40 45 Gln Ala Lys Leu Gln Ala Leu Ala Ala Gly Lys Ala Val Gln Lys Tyr 50 55 60 Gly Asn Lys Leu Val Leu Val Ile Pro Lys Glu Tyr Asp Gly Ser Val 65 70 75 80 Gly Asn Gly Phe Phe Asp Leu Val Lys Ala Ala Glu Glu Leu Gly Ile 85 90 95 Gln Val Lys Tyr Val Asn Arg Asn Glu Leu Glu Val Ala His Lys Ser 100 105 110 Leu Gly Thr Ala Asp Gln Phe Leu Gly Leu Thr Glu Arg Gly Leu Thr 115 120 125 Leu Phe Ala Pro Gln Leu Asp Gln Phe Leu Gln 130 135 <210> 17 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding ApxN protein <400> 17 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccggctacga tgtaactaaa 120 aatggtttgc aatatggggt gagtcaagca aaattacaag cattagcagc tggtaaagcc 180 gttcaaaagt acggtaataa attagtttta gttattccaa aagagtatga cggaagtgtt 240 ggtaacggtt tctttgattt agtaaaagca gctgaggaat taggcattca agttaaatat 300 gttaaccgta atgaattgga agttgcccat aaaagtttag gtaccgcaga ccaattcttg 360 ggtttaacag aacgtggact tactttattt gcaccgcaac tggatcagtt cttacaataa 420 420 <210> 18 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P97C protein <400> 18 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Lys Leu Asp Asp Asn Leu Gln Tyr Ser Phe Glu 20 25 30 Ala Ile Lys Lys Gly Glu Thr Thr Lys Glu Gly Lys Arg Glu Glu Val 35 40 45 Asp Lys Lys Val Lys Glu Leu Asp Asn Lys Ile Lys Gly Ile Leu Pro 50 55 60 Gln Pro Pro Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys 65 70 75 80 Pro Glu Thr Thr Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro 85 90 95 Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val 100 105 110 Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala 115 120 125 Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Thr 130 135 140 Asn Thr Gly Phe Ser Leu Thr Asn Lys Pro Lys Glu Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Met Ala Phe Ser Tyr Lys Leu Glu Tyr Thr Asp Glu Asn Lys Leu Ser 165 170 175 Leu Lys Thr Pro Glu Ile Asn Val Phe Leu Glu Leu Val His Gln Ser 180 185 190 Glu Tyr Glu Glu Gln Glu Ile Ile Lys Glu Leu Asp Lys Thr Val Leu 195 200 205 Asn Leu Gln Tyr Gln Phe Gln Glu Val Lys Val Thr Ser Asp Gln Tyr 210 215 220 Gln Lys Leu Ser His Pro Met Met Thr Glu Gly Ser Ser Asn Gln Gly 225 230 235 240 Lys Lys Ser Glu Gly Thr Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala 245 250 255 Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Thr Pro Asn Gln Gly Lys Lys 260 265 270 Ala Glu Gly Ala Pro Ser Gln Gln Ser Pro Thr Thr Glu Leu Thr Asn 275 280 285 Tyr Leu Pro Asp Leu Gly Lys Lys Ile Asp Glu Ile Ile Lys Lys Gln 290 295 300 Gly Lys Asn Trp Lys Thr Glu Val Glu Leu Ile Glu Asp Asn Ile Ala 305 310 315 320 Gly Asp Ala Lys Leu Leu Tyr Phe Ile Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ser 325 330 335 Gly Asp Pro <210> 19 <211> 1017 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding P97C protein <400> 19 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 atgaaactgg atgacaacct ccaatactcc ttcgaagcga tcaaaaaagg cgaaaccact 120 aaagagggca aacgcgagga ggtggacaag aaggtgaaag agctcgacaa caaaatcaaa 180 ggtatccttc cgcaaccgcc ggcggcgaaa cctgaggcgg caaagccggt cgccgccaaa 240 ccagaaacta ccaaaccagt cgcagccaag ccggaagcag cgaaaccaga ggccgcgaaa 300 cccgtcgccg caaagccgga agcagccaaa ccggtggcag ccaaacccga agcggcaaaa 360 cctgtagcag caaaaccaga agcggcaaaa cctgtggccg ccaagccaga agcagccaaa 420 cccgtagcga ccaatacagg cttctcattg accaacaaac caaaagaaga ctactttccg 480 atggctttta gctataaatt agaatacaca gacgagaata aactgtccct gaaaacccct 540 gaaattaatg tctttctcga actggtacat caaagtgaat atgaagaaca agaaatcatt 600 aaagaattag acaaaaccgt attaaacttg cagtatcagt ttcaagaagt aaaagtgacg 660 agcgatcaat accagaaact gtcccaccct atgatgacag aaggcagctc aaaccaaggc 720 aaaaaaagcg aaggcacacc gaaccaaggc aaaaaagctg agggagcccc caaccaaggt 780 aagaaggccg aaggcacccc gaatcaaggt aaaaaagcag aaggtgcacc cagccagcag 840 agcccaacaa ccgagctgac aaactattta ccggacctgg gtaaaaaaat tgacgaaatt 900 atcaaaaaac agggcaaaaa ctggaaaacc gaagttgaac tcatcgaaga caacattgcg 960 ggtgatgcta aattattgta tttcattctg cgcgacgaca gcaaatccgg agatcct 1017 <210> 20 <211> 3 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding a fusion proteion of N-terminal region of ApxIIIA and C-terminal region of P97 <400> 20 atg 3

Claims (27)

1. 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 영역과 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편을 포함하는 영역을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열의 21번 내지 131번의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 선택된 연속 아미노산 서열이고 길이가 111 내지 1049 아미노산인 것이고, 상기 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편을 포함하는 영역은 서열번호 3의 아미노산 서열의 814번 내지 1020번의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호 3의 아미노산 서열로부터 선택된 연속 아미노산 서열이고 길이가 207 내지 1108 아미노산인 것인 융합 단백질.
2. 삭제
3. 청구항 1에 있어서, 상기 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 영역은 서열번호 2의 아미노산 서열인 것인 융합 단백질.
4. 삭제
5. 청구항 1에 있어서, 상기 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편을 포함하는 영역은 서열번호 6의 아미노산 서열인 것인 융합 단백질.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 흉막폐렴균 ApxIIIA 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 영역과 상기 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 섬모흡착 단백질 P97 또는 그의 단편을 포함하는 영역 사이에 링커에 의하여 연결된 것인 융합 단백질로서, 상기 링커는 GS, GSSG, (GGGGS)₂, 또는 이들의 조합인 것인 융합 단백질.
7. 삭제
8. 청구항 1에 있어서, 상기 융합 단백질의 N 말단, 상기 융합 단백질의 C 말단, 또는 상기 융합 단백질의 양 말단에 폴리히스티딘 서열을 더 포함하는 것인 융합 단백질.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 폴리히스티딘 서열은 6x His인 것인 융합 단백질.
10. 청구항 1에 있어서, 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질.
11. 삭제
12. 청구항 1,3,5,6, 및 8 내지 10 중 어느 하나의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
13. 삭제
14. 청구항 12에 있어서, 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 폴리뉴클레오티드.
15. 청구항 1,3,5,6, 및 8 내지 10 중 어느 하나의 융합 단백질을 유효 성분으로서 포함하는, 포유동물의 흉막폐렴균, 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 중 어느 하나 이상의 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
16. 청구항 15에 있어서, 상기 포유동물은 돼지인 것인 조성물.
17. 청구항 15에 따른 조성물을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물의 흉막폐렴균, 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 중 어느 하나 이상의 감염증을 예방 또는 치료하는 방법.
18. 청구항 17에 있어서, 상기 포유 동물은 돼지이고, 상기 감염증은 폐렴을 포함한 호흡기 질환인 것인 방법.
    
    
    
    
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
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