JP2001523481A

JP2001523481A - 組換えｈｙｏ肺炎マイコプラズマワクチン

Info

Publication number: JP2001523481A
Application number: JP2000521865A
Authority: JP
Inventors: エフクリスミニオン; ツンダスー
Original assignee: アイオワステイトユニヴァーシティリサーチファウンデーションインコーポレイテッド
Priority date: 1997-11-26
Filing date: 1998-11-24
Publication date: 2001-11-27
Also published as: CN1301180A; ZA9810774B; ID26951A; EP1034004A1; CA2311759A1; PL341797A1; BR9815321A; KR20010032493A; HUP0100130A2; WO1999026664A1; US6162435A; AU1535299A

Abstract

(57)【要約】組み替えＤＮＡまたは合成手段によって得られたマイコプラズマｈｙｏ肺炎蛋白、前記蛋白をコーディングするＤＮＡシーケンス、前記ＤＮＡシーケンスを含む発現ベクターおよび前記変換ホスト、前記蛋白に基づくワクチン、前記ＤＮＡシーケンスに基づくワクチン、前記ワクチンを使い地方病性肺炎を防止するためにブタを処置する方法、ブタの群の中のＭｈｙｏ感染の存在を検出するための前記蛋白またはそれに対し生じる抗体に基づく診断テスト。

Description

【発明の詳細な説明】【０００１】本願は、米国仮特許出願第０６／０６６，５６５号（１９９７年１１月２６日
出願、参考のため本願に添付）による利益を請求する。【０００２】（技術分野）本発明は、hyo肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma hyopneumoniae（M.hyopneumo
niae またはＭhyo)に関し、より詳細には抗原性Mhyoタンパク質に関する。さらに詳細には、本発明は、地方病（流行性：enzootic）肺炎、特にブタの地方病性
肺炎に関する。【０００３】（背景技術）ブタの地方病性肺炎は、マイコプラズマ肺炎とも呼ばれ、Mhyoを原因とする。
この疾病は、慢性の非致死疾患であり、あらゆる年齢のブタを対象とする。感染
したブタには咳や発熱という軽い症状が見られるだけだが、飼料効率（feed eff
iciency）が下がって、体重増加が悪くなるため、重大な経済的衝撃が生じる。地方病性肺炎は、感染したブタの肺から排出された有機体が空気中を搬送されて
、鼻腔経路でブタからブタへと感染する。Mhyoによる一次感染が、他のマイクロ
プラズマ種（Mycoplasma hyorbinis及びMycoplasma flocculare）ならびに他の細菌病原体による二次感染を引き起こす可能性がある。【０００４】 Mhyoは、自由な生体生存が可能な小さな原核生物微生物であるが、外生ステリ
ン及び脂肪酸を絶対要件とするために、真核細胞に関連して発見されることが多
い。これらの要件により、一般的に、血清を含む媒体中での発育を必要とする。
Mhyoは、細胞壁を欠き、細胞膜により結合されている。Mhyoのゲノムは、長さが
約１，０００，０００の塩基対である。【０００５】宿主細胞（ホストセル）表面に対するマイコプラズマの物理的関係が、地方病
性肺炎の発生及び持続性の基礎的要因となる。Mhyoは、ブタの気道に感染し、気
管、気管支、及び細気管支に定着する。マイコプラズマは、気道に並ぶ（lining
)繊毛の運動（beating）を停止させる繊毛静止（ciliostatic）因子を生成する。この結果、繊毛が退化し（degenerate）、ブタは二次的病原体に感染しやすく
なる。感染した動物には、紫からグレーの硬化領域(areas of consolidation）という特徴的な病変が見られる。屠殺動物の調査により、ブタの３０％から８０
％に病変が見られた。１３州における３７群の調査結果により、群中の９９％の
ブタに地方病性肺炎に特徴的な肺炎の病変が観察された。したがって、有効な予
防及び治療手段に対する要望が高まっている。【０００６】チアムリン（tiamulin）、トリメトプリム、テトラサイクリン及びサイコマイ
シンなどの抗生物質もある程度の効果はあるが、これらは高価であるとともに、
長期間の使用が必要である。さらに、抗生物質によって、Mhyoの伝染または再感
染を効果的に排除できるという結果は得られていない。病原体不在の群を維持す
ることによる予防が可能な場合もあるが、Mhyoが再導入されることもしばしばあ
る。ブタの肺炎による経済的な影響が重大であるため、抗Mhyoワクチン、及び感
染の有無を示す診断テスト方法が求められている。血清を含む媒体中で発育した
マイコプラズマ有機体の製剤（プレパレーション：preparations）を含むワクチ
ンが市販されているが、このようなワクチンは高額であるとともに、免疫物質中
に存在する血清成分によって起こる副作用についての問題が提起されている。ワ
クチン提供の他の試みはいまだ成功せず、よってこの疾患は依然蔓延した状態で
ある。【０００７】したがって、ブタにおけるマイコプラズマ感染に抗するワクチン、及びこれを
コスト効率よく製造する方法が求められている。さらに、ブタの群中におけるブ
タのマイコプラズマ感染の有無を検出する診断テストが求められている。【０００８】（発明の開示）本発明は、組換えまたは合成手段により調製した、精製又は単離型hyo肺炎マイコプラズマタンパク質Ｐ１０２、及びＰ１０２の一部であり、ブタに投与され
ることにより、Mhyoに結合する抗体の生成を誘発するポリペプチド又はペプチド
を供給する。好ましいＰ１０２及びポリペプチドは、図１に示されるアミノ酸配
列（シーケンス）、又はかかる配列（シーケンス）の断片（フラグメント）を有
する。【０００９】さらに、本発明は、Ｐ１０２及び上記ポリペプチドの調製に有用な組換えＤＮ
Ａ分子を提供する。好ましい組換えＤＮＡ分子は、図２に示される配列から選択
されたＤＮＡ配列、図１及び図５に示されるアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ
配列、これらのＤＮＡ配列のいずれかに交雑（ハイブリダイズ）し、MhyoＰ１０
２の遺伝暗号（コード）を指定するＤＮＡ配列、上述のＤＮＡ配列のいずれかに
よりコード化されたMhyoの抗体の遺伝暗号（コード）を指定するＤＮＡ配列、及
び上記ＤＮＡ配列に対する遺伝暗号（ジェネティックコード：genetic code）の
結果として退化した、かつMhyoの抗体の暗号指定するＤＮＡ配列によって特徴づ
けられる。本発明によるタンパク質及びＤＮＡ配列を含む発現ベクタ及び宿主細
胞がさらに提供される。【００１０】さらに、本発明は、精製した後に単離された、本発明によるＤＮＡ配列を含む
Ｐ１０２、ポリペプチド又は発現ベクタを、抗体形成を誘発するのに十分な量、
（例えば注射により）ブタに投与することにより、Mhyo感染に対してブタを免疫
化するためのワクチンを含む。また、ブタの群のMhyo感染を検査するために、Ｐ
１０２、本発明のポリペプチド、又はこれらに抗して生じた抗体に基づく診断検
査が提供される。【００１１】本発明のさらなる効果及び特徴については、本発明の好ましい実施形態を例示
する下記の詳細な説明、図面及び実施例により明らかである。【００１２】（発明を実施するための最良の形態）現在好ましいとされる本発明の実施形態を詳細に説明し、図面及び以下の実施
例と共に本発明の原理を説明する。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施
できる程度に十分詳細に記載されている。なお、これ以外の実施形態を使用する
ことも可能であり、本発明の範囲を逸脱することなく、構造的及び化学的な変更
が可能である。【００１３】本願においては、以下の略語を使用する。ａａはアミノ酸、Ａｂは抗体、ｂｐ
は塩基対、ＣＨＥＦはクランプホモジナス（同質、同相）電界（clamped homoge
nous electric field）、Ｈ．はヘモフィルス（Haemophilus）、ｋｂはキロベー
ス、Ｋｎはカナマイシン、ＬＢはルリア−ベルトーニ媒体（Luria-Bertoni medi
a）、Ｍ．はマイコプラズマ、ｍＡｂは単クローンＡｂ、ＯＲＦは転写解読枠（オープン・リーディング・フレーム：open reading frame）、ＰＣＲはポリメラ
ーゼ連鎖反応、^Rは耐性の／耐性（resistant/resistance）、Ｔｎはトランスポゾン（transposon(s)）、：：は新規接合（novel junction）（溶融または挿入）である。アミノ酸の１文字及び３文字表記（designation）を以下の表１に示す。【００１４】【表１】【００１５】以下の記載で用いる「タンパク質」という用語は、予備（プレパラティブ：pr
eparative）クロマトグラフィ、免疫性分離、または金属キレートカラム（metal
chelete column）の通過などの従来の手段により、他のタンパク質、バクテリア全体、及び細胞物質から分離、単離又は精製された、微生物により発現したタ
ンパク質を意味する。また、以下の記載において用いられる「変異体（mutant）
」という用語は、少数の修正（モディフィケーション：modification）又は保守
的な変更（conservative variations）のために、その配列が、本来のMhyoＰ１０２と実質的に同等の機能を有するタンパク質となるようなアミノ酸またはＤＮ
Ａ配列を指す。【００１６】「保守的な変更（conservative variations）」とは、生物学的に類似する別の残基によるアミノ酸残基の置換、又は同じ結果を得るためのＤＮＡ配列中のヌ
クレオチドの置換を意味する。保守的変更の例として、イソロイシン、バリン、
ロイシン、またはメチオニンなどの１疎水性残基による別の残基の置換、または
アルギニンによるリシンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換また
はグルタミンによるアスパラギンの置換など、１極性残基（polar residue）による別の残基の置換などが含まれる。さらに、「保守的変更」には、置換された
ポリペプチドに対して生じた抗体が、置換されていないポリペプチドとも免疫反
応を起こすとして、置換されていない親アミノ酸の代用としての置換されたアミ
ノ酸の使用を含む。【００１７】本発明は、単離、精製、組換えの少なくともいずれかの形態におけるhyo肺炎マイコプラズマタンパク質Ｐ１０２、及びブタに用いるワクチン又は診断手段と
してのＰ１０２又はその断片の使用に関する。Ｐ１０２は、本願発明者により、
毒性の攻撃（virulent challenge）に抗して保護されたブタに免疫反応を引き起
こすことが示されたもので、本願の発明者により単離され、特徴づけられ、命名
された。さらに、本発明には、組換えＰ１０２に対応するＤＮＡ配列およびかか
る配列を含む発現ベクタ及び宿主が含まれる。単離、精製、組換えの少なくとも
いずれかによるＰ１０２を含むワクチン、Mhyo感染に抗してブタを免疫化するた
めの、Ｐ１０２をコード化するＤＮＡ配列、及びブタの群の感染の検査に役立つ
Ｐ１０２に基づく診断ツールがさらに提供される。【００１８】本発明によるＰ１０２を生成するためのスタート物質として、任意のMhyo細胞
株（strain）を使用できる。適当なMhyo細胞株は、アメリカンタイプカルチャー
コレクション（ＡＴＣＣ：ヴァージニア州マナッサス）及びＮＲＲＬカルチャー
コレクション（農業調査サービス、米国農務省、イリノイ州ピオリア）などの寄
託機関を含む種々の供給元から入手できる。ＡＴＣＣだけでも６つのMhyo株を販
売している。疾病の広範囲にわたる分布に鑑み、罹病動物の肺の分泌物及び組織
からMhyoを回収して適当な培養媒体に接種することにより、細胞株を入手しても
よい。【００１９】図１は、ＭｈｙｏＰ１２０のアミノ酸配列を示す。Ｐ１０２は、９０４アミノ酸を含む。この分布を表２に詳細に示す。【００２０】【表２】【００２１】Ｐ１０２はシステイン(cysteine)を含まず、９．２８の等電点(ｐＩ）を有する。この蛋白質が「Ｐ１０２」と指定されたのは、これが１０２．３キロダルト
ン重であるためである。Ｐ１０２は、膜スパニング蛋白質(membrane-spanning p
rotein)であると考えられる。これは、蛋白質（aa１０−３４）のＮターミナスに、推定２５アミノ酸膜スパニング領域(putative 25 amino acid membrane-spa
nning domain)が存在することによる。理論に縛られることは本意ではないが、現在、蛋白質配列の残り部分が１個以上のα螺旋（α-helices)を形成すると考えられている。これは、アミノ酸を形成するα螺旋が高い割合で（〜６４％）こ
の部分に存在するためである。【００２２】本発明に係わる蛋白質またはポリペプチドは、図１に示すアミノ酸配列または
、図１に示すアミノ酸配列のエピトープを認識する抗体または他の免疫反応を顕
在化できる配列のフラグメントまたは異性体を有する。アミノ酸またはエンコー
ディングＤＮＡ(encoding DNA)レベルに於ける突然変異は、蛋白質の産量(yield
)、その免疫原性または抗原性、または、多様な浄化スキーム、補助剤、投与モードとの適合性を改良するために有用であるかもしれない。このようなフラグメ
ントや突然変異、合成(synthetic)または組み替え(recombinant)は、生Ｍｈｙｏ
Ｐ１０２に一個以上の抗原性サイトがあることで特徴づけられられる。【００２３】本発明に係る蛋白質またはポリペプチドは、Ｍｈｙｏセルから抽出され、精製
または単離された蛋白質またはポリペプチドでも良いし、組み替え蛋白質または
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列によって形質転換されたホスト中で生成さ
れた組み替え蛋白質またはポリペプチドでも良い。もちろん、これらの蛋白質ま
たはポリペプチドは、Ｍｈｙｏに関係しない残留物を含むかもしれないことが分
かる。例えば、本発明に係る組み替え蛋白質またはポリペプチドは、形質発現ベ
クター(expression vector)または他のソースから誘導した蛋白質部分、およびＭｈｙｏから誘導した蛋白質部分を含む融合蛋白質であってもよい。これらの組
み替えポリペプチドおよび、これらの融合物(fusions)は、スターティングメチオニン(starting methionine)も含んでもよい。必要なことは、最終的なポリペプチドが生ＭｈｙｏＰ１０２の抗原性を示すことである。【００２４】図２は、本発明に係る、２７１２ベース対を有し、Ｐ１０２を符号化する組み
替えＤＮＡ配列を示す。この配列は非鋳型ストランド(non-template strand)であり、左に５’エンド、右に３’エンドを有する。その結果、補足鋳型ストラン
ドによって生成されたｍＲＡＭは、図２に示すものと同一の配列を有する。ただ
し、チミン（Ｔ）はウラシル（Ｕ）で代用されている。スタートコドン（ＡＴＧ
）とストップコドン（ＴＡＡ）に下線がひかれている。スタートコドンの推定シ
ャインダルガーノ(putative Shine Dalgarno)配列（ＧＧＡＧＧＴ）１０ベース対アップストリームを含む、スタートコドンの約２４個のベース対アップストリ
ームと、ストップコドンの２１ベース対ダウンストリームとを示す。Ｐ１０２配
列は、他のバクテリア付着遺伝子(bacterial adhesion genes)を含む任意の周知
配列との有意な一致は無い。【００２５】本発明は、フル以下のＤＮＡ配列(less than the full DNA sequence)およびその突然変異を含む、図１に示すアミノ酸配列のエピトープを認識する抗体また
は他の免疫反応（例えば、免疫システムのＴセル反応）を顕在化できる蛋白質を
コードする任意のＤＮＡ配列に関する。したがって、本発明のＤＮＡ配列によっ
て、蛋白質またはポリペプチドをコードする。この蛋白質またはポリペプチドは
、フル長抗原、抗原フラグメント、抗原派生物、または、かかる抗原、抗原フラ
グメント、または抗原派生物と、他の蛋白質との融合産物(fusion product)であ
ってもよい。【００２６】上記蛋白質およびポリペプチドの生成において有益な組み替えＤＮＡ分子も提
供する。好適な組み替えＤＮＡ分子は、図２に示す配列、上記のように本発明に
係る組み替え蛋白質またはポリペプチドをコードする配列を含むクローニングま
たは形質発現ベクター、これらＤＮＡ配列の任意のものに混成（ハイブリダイズ
）し、ＭｈｙｏＰ１０２をコードするＤＮＡ配列、前記ＤＮＡ配列の任意の物
によってコードされたＭｈｙｏの抗原をコードするＤＮＡ配列、および、前記Ｄ
ＮＡ配列への遺伝子コードの結果として変質(degenerate)し、Ｍｈｙｏの抗原を
コードするＤＮＡ配列、の中から選択されたＤＮＡ配列によって特徴づけられる
。【００２７】適切なＤＮＡ配列を、多様な手順によって、広範な形質発現ベクターの任意の
ベクターに挿入してもよい。これは、一般に、適切な制限エンドヌクレアーゼサ
イト(restriction endonuclease site)を用いて行う。適切なベクターは、例えば、ＳＶ４０の多様な周知派生物、周知バクテリアプラスミド等の、染色体、非
染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントからななるベクター（例えば、ｃｏｌ
Ｅｌ，ｐＣＲ１，ｐＢＲ３２２，ｐＭＢ９およびその派生物を含むＥ．ｃｏｌ
ｉをもとにしたプラスミド）、ワイダーホストレンジプラスミド（wider host r
ange plasmids)（例えば、ＲＰ４，ファージＤＮＡ、ファージλの多数の派生物
、ＮＭ９８９）、Ｍ１３やフィラメントスシングルスランディッドＤＮＡファー
ジ(filamentous single stranded DNA phages)等、他のＤＮＡファージ、２μプ
ラズミドまたはその派生物等の酵母プラズミド、バキュロウイルス(baculovirus
)、バチニア(vaccinia)、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、または仮狂犬病等のウイルスＤＮＡ、ファージＤＮＡまたは他の形質発現制御配列（expression con
trol sequences)を使用するように変形したプラスミド等のプラスミドとファージＤＮＡの化合物等、を含む。【００２８】各特定クローニングおよび形質発現ビークル内で、多様なサイトを選択して、
本発明のＤＮＡ配列を挿入してもよい。これらのサイトは通常、これら切断する
制限エンドヌクレアーゼ(restriction endonuclease)によって指定される。ＤＮ
Ａ配列をこれらのサイトに挿入して組み替えＤＮＡ分子を形成する多様な周知の
方法がある。例えば、ｄＧ−ｄＣまたはｄＡ−ｄＴテイリング(tailing)、ダイレクト連結反応(direct ligation)、合成リンカー(synthetic linkers)、連結反
応を伴うエキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ結合修復反応（exonuclease an
d polymerase-linked repair reactions followed by ligation)、またはＤＮＡ
ポリメラーゼを有するＤＮＡストランドの拡張(extension)、および連鎖反応を伴う適切なシングルストランド鋳型(single-stranded template)等を有する。も
ちろん、本発明において有益なクローニングまたは形質発現ビークルは、選択し
たＤＮＡフラグメントの挿入のための制限エンドヌクレアーゼサイトを有する必
要はなく、他の手段によってこの挿入を行っても良いことが分かる。【００２９】本発明のＤＮＡ配列の形質発現のために、これらのＤＮＡ配列を、形質発現ベ
クター内の一個以上の形質発現制限配列に機能的にリンクする。このような機能
的リンクは、選択したＤＮＡ配列をクローニングビークルに挿入する前後に実行
されるが、このリンクによって、形質発現制限配列は、挿入されたＤＮＡ配列の
形質発現の制御と促進を行うことができる。【００３０】ＤＮＡ配列と機能的にリンクされた時にその形質発現を制御する配列である、
広範囲の形質発現制御配列の内の任意の配列をこれらのベクター内に用いて、本
発明のＤＮＡ配列を形質発現する。このような有益な形質発現制御配列は、例え
ば、ＳＶ４０の初期および後期(early and late)プロモータ、ｔｈｅｌａｃ
ｏｒｔｒｐシステム、ＴＡＣまたはＴＲＣシステム、ファージλの主要オペレ
ータおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白質の制御領域、３ーホスホグリセリ
ン酸塩キナーゼ(3-phosphoglycerate kinase)またはその他の糖分解酵素(glycol
ytic enzymes)用プロモータ、酸ホスファターゼ(acid phosphatase)（例えばＰｈｏ５）のプロモータ、酵母αメイティングファクター(yeast α-mating facto
rs)のプロモータ、原核生物または真核性セルまたはそれらのウイルス中の遺伝子の形質発現を制御することが知られている、その他の配列、およびこれらの多
様な組み合わせ等である。形質発現ベクターは、翻訳開始(translation initiat
ion)の為のリボソームバインディングサイト用(ribosome binding site)非コーディング配列と、転写終了暗号とを更に有する。ベクターは、形質発現を増幅す
るための適切な配列を更に含む。ほ乳類のセルでは、その遺伝子を、デハイドロ
フォレート還元酵素(dehydrofolate reducrase)をコードする遺伝子にリンクし、ホストチャイニーズハムスター卵巣セル(host Chinese hamster ovary cells)
を選択することで、形質発現ユニットを増幅することが更に可能である。【００３１】ベクターまたは形質発現ビークルおよび、特に、選択されたＤＮＡフラグメン
トと、本発明で用いられる形質発現制御配列を挿入するために、これらのビーク
ル内で選択されたサイトは、多様な要因によって決定される。これらの要因とは
、特定の制限酵素、形質発現すべき蛋白質の大きさ、ベクター配列に対するスタ
ートコドンおよびエンドコドンの位置等の形質発現特徴、および当業者によって
認識される他の要因等である。ベクター、形質発現制御配列、挿入サイトの選択
は、これらの要因の均衡によって決定される。所定のケースに対して、全ての選
択が同様に効果的であるわけではない。【００３２】本発明の実施の形態では、図３〜５に示すクローンを含む多様なクローンを用
いてもよい。図３は、Ｐ９７オペロンの多様な重複クローン(overlapping clone
s)の制限酵素地図を示す。これは、Ｍｈｙｏ蛋白質Ｐ９７およびＰ１０２用の遺
伝子を含む。これらのクローンは、ｐＩＳＭ１１６１からクローン発生させたフ
ラグメントを用いたＤＮＡハイブリダイゼーション(DNA hybridization)によって求められた。Ｐ９７構造遺伝子の位置、変容の方向（矢印）、およびＤＮＡ配
列分析の領域（黒太線）を示す。サイトはキロベースで示す。制限酵素は以下の
略語で示す。Ａ，ＡｃｃＩ；Ｂ，ＢａｍＨＩ；Ｂｇ，ＢｇｌＩＩ；Ｃ
，ＣｌａＩ；Ｅ，ＥｃｏＲＩ；ＥＶ，ＥｃｏＲＶ；Ｈ，Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ；Ｈｎ，ＨｉｎｃＩＩ；Ｎ，ＮｃｉＩ；Ｓ，ＳａｌＩ．図４は、本発明のＰ１０２関連のクローンの制限酵素地図を示す。Ｐ９７およ
びＰ１０２遺伝子境界を有するＰ９７コンティグ(contig)の物理地図を参考とし
て示し、転写の方向は左から右とする。クローンｐＩＳＭ１２３２−３４および
ｐＩＳＭ２１６６のＤＮＡ配列と、Ｐ９７オペロン配列との間の相同関係は、斜
線を引いた領域で示す。薄いグレーは高い（＞９５％）Ｐ１０２相同、黒はＰ１
０２無し相同までの減少（＜７５％）、濃いグレーはＰ１０２無し相同を、それ
ぞれ示す。また斜線部分は、ＤＮＡ配列情報が無い領域を示す。ｐＩＳＭ１２３
２およびｐＩＳＭ１２３３に対するプラスミドｐＩＳＭ１１６５，ｐＩＳＭ１１
６８，ｐＩＳＭ１１６９，ｐＩＳＭ１１７０，ｐＩＳＭ１１７４の位置を示す。
各クローンまたはクローングループ毎に制限パターンを設け、サイズはキロベー
スで示す。【００３３】生Ｐ１０２を有する、Ｐ１０２クローンｐＩＳＭ２１６６，ｐＩＳＭ１２３２
，ｐＩＳＭ１２３３，ｐＩＳＭ１２３４の、遺伝情報を翻訳した(translated)ア
ミノ酸配列のアラインメントを図５に示す。Ｐ１０２アミノ酸配列のアラインメ
ントは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ^TMソフトウェア、バージョン６．０．１（Ｏｘｆｏ
ｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｒｏｕｐ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ）中のＣｌ
ｕｓｔａｌＷアラインメントを用いて行った。囲まれた領域は、その配列中
の同一性または類似性を示す。ｐＩＳＭ１２３２／３は、ｐＩＳＭ１２３２およ
びｐＩＳＭ１２３３双方用のアラインメントを示す。ｐＩＳＭ１２３２用の配列
はこのアラインメントの始めに、また、ｐＩＳＭ１２３３用の配列はこのアライ
ンメントの終わりに示す。【００３４】形質発現制御配列と機能的にリンクした所望の遺伝子を含む組み替えＤＮＡ分
子を用いて広範な適切なホストを変容して、これらのホスト（形質転換された物
質）が遺伝子またはそれらのフラグメントを形質発現し、ハイブリッドＤＮＡが
コードするポリペプチドまたはそれらの蛋白質を生成できるようにしてもよい。
組み替えＤＮＡ分子を用いてホストを変容させ、そのホストが複製によって、追
加的な組み替えＤＮＡ分子を、Ｍｈｙｏ遺伝子およびそのフラグメントのソース
として生成できるようにしてもよい。【００３５】本発明の抗原及びＤＮＡ配列を生成するためには数多くの宿主もまた有用であ
る。これらの宿主は例えば、E.Coliやバシラス、ストレプトミセス属の放線菌な
どのバクテリア、イーストなどの菌類、及び組織培養での動物又は植物細胞を含
む。これらの使用方法のいずれかのための適切な宿主の選択は、いくつかの要因
によって制御される。これらの要因は、例えば、選択されたベクタとの適合性、
副産物の毒性、所望ポリペプチドの回復の容易さ、発現特性、生物学的研究にお
ける安全性、及びコストを含む。特定の組み替えＤＮＡ分子又はポリペプチドの
ための宿主を、これらの要因の一つのみから絶対的に選択することはない。その
代わりに、これらの要因を、特定の組み替えＤＮＡ分子の発現のためには全ての
宿主の効率が同様でないという理解と共に、比較検討する必要がある。【００３６】クローン又は発現ビークル（ｖｅｈｉｃｌｅ）の選択された部位に挿入される
ＤＮＡ配列は、所望のポリペプチドの実際の遺伝子暗号の一部ではないヌクレオ
チドやそのタンパク質の遺伝子全体の一部のみを含んでいてもよい。どのＤＮＡ
配列が使われるにしても、形質転換した宿主が活性MhyoＰ１０２の抗原性を持つ
ポリペプチドを生成することのみが必要とされる。【００３７】例えば、本発明のＤＮＡ配列は、本発明の発現ベクタ内の同一の読みフレーム
（ｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ）内で、少なくとも一つの真核生物又は原核生物の担体タンパク質のＤＮＡ配列暗号又は少なくとも一つの真核生物又は原核生物
の信号配列のＤＮＡ配列暗号又はその組み合わせの一部と融合してもよい。この
ような構成は、所望のＤＮＡ配列の発現を助け、宿主細胞からの所望ポリペプチ
ドの精製を改善又は分泌及び好適には成熟を可能にする。ＤＮＡ配列はまた、Ａ
ＴＧ開始コドン（start codon）を単独で又は他のコドンと共に、所望のポリペプチドの最初のアミノ酸を暗号化する配列に直接融合して含んでいてもよい。こ
のような構成は、例えば、本発明の一部であるメチオニル又は他のペプチヂルポ
リペプチドの生成を可能にする。このＮ末端メチオニン又はペプチドは次に、数
々の既知の処理によって又は本発明の構成物及び方法においてメチオニン又は他
の融合物と共に使われるポリペプチドによって、細胞内又は細胞外で分割（clea
ve）できる。【００３８】宿主に導入された時にベクタに存在する適切なＤＮＡ配列は、一部又は暗号化
されたタンパク質の一部分のみを発現してもよい。この時、発現したタンパク質
が図１に示されるアミノ酸のエピトープを認識する抗原又は他の免疫応答を顕在
化できれば充分である。例えば、E.coliを宿主生物体として使った場合、ＵＧＡ
コドンが停止コドン（stop codon）であるため、発現したタンパク質は、ベクタ
に暗号化された抗原の断片でなくてはならない。このため一般的には、適切なＤ
ＮＡ配列内のＵＧＡコドンの全てを非停止コドン（non-stop codon）に変換する
ことが好適である。ＵＧＡを停止コドンとして認識する宿主の問題を避けるもう
一つの方法として、タンパク質暗号配列内のＵＧＡコドンを形質転換された生物
体内のトリプトファンとして翻訳するｔ−ＲＮＡを暗号化する追加のＤＮＡ配列
を含ませる方法もある。【００３９】ベクタによって形質転換された宿主によって発現したタンパク質は、当業者に
は明らかな方法によって収穫でき、ブタや畜牛などの人間以外の動物をMhyoによ
って引き起こされる地方性肺炎（enzootic pneumonia）から守るワクチンとして
使用できる。タンパク質は、Mhyoによって引き起こされる地方性肺炎からの保護
を提供するために効率的な量で使われ、下に詳述するように、生理学的に許容で
きる適切な担体と組合わせて使うことができる。【００４０】本発明の一つの好適な実施形態では、Ｐ１０２の遺伝子配列が、カリフォルニ
ア州カールスバド（Carlsbad, CA）のインヴィトロゲン社（Invitrogen Corp.) から入手可能な発現ベクタｐＴｒｃＨｉｓＸｐｒｅｓｓにクローンされた。E.c
oli宿主がこのベクタと共に形質転換され、Ｐ１０２タンパク質が高いレベルで生成された。ｐＴｒｃＨｉｓＸｐｒｅｓｓベクタは、短いリーダペプチドに融合されたＰ１０２を含む融合タンパク質を六つの連結したヒスチジン残留物と共
に生成した。次に細胞が溶解され、プロボンドカラム（ＰｒｏＢｏｎｄｃｏｌｕｍｎ）（カリフォルニア州カールスバド、インヴィトロゲン社（Invitrogen,
Carlsbad, CA））などの金属キレートカラムを通じて粗製細胞溶解物を流し、Ｐ
１０２が精製された。【００４１】本発明の組み換えタンパク質及びポリペプチドはまた、生物学的な試験サンプ
ルがMhyo抗原又はこれらの抗原の抗体を含むかどうかを決定する診断目的の抗原
として使うこともできる。このような動物でのMhyo感染のアッセイ（ａｓｓａｙ
）は通常、そのような状態にあると疑われている動物からの、抗原を含む生物学
的なサンプルを、本発明による検出可能に標識化された組み換えタンパク質が存
在する状態で培養するステップと、結合を検出するステップとを含む。【００４２】従って、本発明のこの態様によれば、組み換えタンパク質は、細胞、細胞粒子
又は溶性タンパク質を固定にできる固体相サポート、例えば、マイクロタイタプ
レート（microtiter plate)と関連することができる。このサポートが次に、適切な緩衝液で洗浄され、抗体を含むサンプルと処理されてもよい。次に、固体相
サポートに対して、二回目の緩衝液による洗浄が行われ、結合していない抗体を
除去してもよい。標識化された組み換えタンパク質が追加され、サポートに対し
ての三回目の洗浄が行われ、結合していない標識化抗原が除去される。次に、標
識の固体サポートへの結合量が従来の手段によって検出されることができる。【００４３】「固体相サポート」とは、抗原又は抗体を結合できるいずれかのサポートを意
味する。広く知られたサポート又は担体は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピ
レン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び修正され
たセルロース（特にニトロセルロース）、ポリアクリルアミド、アガロース、及
び磁鉄鉱を含む。担体の性質は、本発明の目的のためには、ある程度の溶性であ
ってもよいし溶性でなくてもよい。サポート物質は、対になった分子が抗原又は
固体に結合できるものであれば、実質的にどのような構造構成を持っていてもよ
い。従って、サポート構成は、ビーズのように球形であってもよく、試験管の内
部表面又は杖（rod）の外部表面のように円筒形であってもよい。その他の方法として、この表面は、シートやテストストリップ（test strip）などのように平
らであってもよい。好適なサポートは、ポリスチレンビーズを含む。【００４４】 Mhyoに特定の抗体を検出可能に標識化できる一つの方法に、酵素にMhyoに特定
の抗体をリンクし、酵素免疫学的検定（ＥＩＡ）又は酵素リンク免疫吸着剤アッ
セイ（ＥＬＩＳＡ）として使う方法がある。この酵素は後に、その基体に露出し
た時に、例えば、分光測光法、蛍光測定法、又は視覚的手段によって検出できる
化学的半体（chemical moiety）を生成するように基体と反応する。Mhyoに特定の抗体を検出可能に標識化するために使用できる酵素は、ここに挙げるものに制
限されないが、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、リンゴ酸塩デヒドロゲナーゼ
、ブドウ状球菌のヌクレアーゼ、デルターＶーステロイドイソメラーゼ、イース
トアルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロールー３−リン酸デヒドロゲナーゼ、
トリオースリン酸イソメラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ
、グルコースオキシダーゼ、βーガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレア
ーゼ、カタラーゼ、グルコースー６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコア／ニラ
ーゼ（glucoa/nylase）、及びアセチルコリンエステラーゼを含む。【００４５】検出は、様々な免疫学的検定のいずれかを用いて達成される。例えば、組み換
えタンパク質を放射性標識化することにより、放射免疫検定法（ＲＩＡ）を使い
抗体の結合を検出できる。放射性アイソトープは、γ線計数器又はシンチレーシ
ョン計数管を使い又はオートラジオグラフィなどの手段によって検出することが
できる。本発明の目的に特に有効なアイソトープは、³Ｈ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³⁵Ｓ、及び¹⁴Ｃであり、好適には、¹²⁵Ｉである。【００４６】また、組み換えタンパク質を蛍光性化合物によって標識化することもできる。
蛍光性に標識化されたタンパク質が適切な波長の光に露出された場合、そのタン
パク質の蛍光性によって、存在を検出することができる。蛍光性標識化化合物と
してもっとも広く使用されているものとしては、フルオレセインイソチオシアネ
ート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン（
allophycocyanin)、ｏーフタルデヒド（o-phthaldehyde）、及びフルオレサミン
が挙げられる。タンパク質はまた、¹⁵²Ｅｕ又はランタン系列の他の金属などの蛍光放射金属を使って検出可能に標識化することもできる。これらの金属は、ジ
エチレントリアミン五酢酸（diethylenetriaminepentaacetic acid）（ＤＴＰＡ
）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート化族を使ってタ
ンパク質に取り付けることができる。【００４７】タンパク質はまた、化学ルミネセンス又は生物発光化合物と連結することによ
り検出可能に標識化することもできる。化学ルミネセンスにより印付けられたタ
ンパク質の存在は、化学反応の際に起こる発光の存在を検出することにより決定
される。生物発光は、生物学的システムに見られる化学ルミネセンスの一種であ
り、触媒タンパク質が化学ルミネセンス反応の効率を増加させるものである。特
に有用な化学ルミネセンス標識化化合物の例としては、ルミノール、イソルミノ
ール（isoluminol）、テロマティックアクリジンエステル（theromatic acridin
ium ester）、イミダゾール、アクリジン塩、及び蓚酸塩エステルなどがあげられる。標識化の目的のために重要な生物発光化合物としては、ルシフェリン、ル
シフェラーゼ、及びエクオリンなどがあげられる。【００４８】標識は、例えば検出可能な標識が放射性γ線放射物の場合は、シンチレーショ
ン計数器によって、又は例えば標識が蛍光物質の場合は蛍光計によって検出でき
る。酵素標識の場合、その酵素のための基体を用いる測色的方法によって検出を
行うことができる。検出はまた、基体での酵素反応の程度を、同様に調製された
基準と視覚的に比較することにより行われてもよい。【００４９】検出可能に標識化された抗体の集まりの検出は、病気又は機能不全状態を示し
、サンプル内のMhyoを測定するために使うことができる。このような抗体又は他
の免疫応答の不在は、この動物が予防接種を受けたことも感染したことも無いこ
とを示す。本発明の目的のためには、このアッセイで検出されるバクテリアは、
生物学的サンプル内に存在してもよい。そのバクテリアを含むどのようなサンプ
ルを使ってもいいが、本発明の診断方法の利点の一つは、侵害的な組織除去（in
vasive tissue removal）を回避することである。したがって好適には、このサンプルは、鼻、のど、又は肺の流体などの生物学的な溶液であるが、本発明はこ
れらのサンプルを使ったアッセイに制限されるものではない。【００５０】動物から組織学的試験片を採取し、本発明の標識した抗体の組み合わせをその
試験片に供給することによって、インシトゥ検出が実施できる。抗体（またはフ
ラグメント）の供給は、その標識した抗体（またはフラグメント）を生物学的サ
ンプルに接触させるかその上に載置することによって実施することが好ましい。
このような手順の使用によって、検査する組織中のＭｈｙｏの有無のみならず、
その分布をも検出できる。本発明を用いればこのようなインシトゥ検出が、幅広
い種類の組織学的方法（たとえば染色）のいずれかを応用することで実施できる
ことを、当業者は認識するであろう。【００５１】代替案では、流体サンプルにおいて、ＭｈｙｏＰ１０２に関わる遺伝子の有無
を検査することができる。その検査は、図２に示す配列に含まれる組換えまたは
合成ＤＮＡ配列、またはそのＤＮＡ配列に相当するいずれかのＲＮＡ配列との反
応によって実施される。遺伝子の不在は、その動物が予防接種も受けていないし
、感染もしていないことを示す。この検査では、当業者に既知の核酸配列の合成
、増幅、またはハイブリッド形成方法が使用される。【００５２】本発明はさらに、ワクチンを含む。ワクチンは、本発明の組換え蛋白およびポ
リペプチド、またはそれらの蛋白およびポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を
含み、好ましくはブタであるヒト以外の動物を、Ｍｈｙｏの感染、特に地方病性
肺炎から保護する。「保護する」または「保護」という用語を本明細書で地方病
性肺炎のワクチンに関して使用する場合は、ワクチンがＭｈｙｏに起因する地方
病性肺炎を予防すること、および／またはその疾患の症状を緩和することを意味
する。【００５３】本発明のＤＮＡ配列に基づくワクチンは、ＵＧＡコドンを除去し、選択した配
列を適切なベクタに導入することによって作成できる。そしてそのワクチンを、
粒子衝撃（bombardment）、マイクロインジェクション、電気穿孔法、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームトランスフェクション、および、ウ
イルストランスフェクションなどの、適切な方法によって投与することができる
。ＤＮＡワクチンおよびその投与方法は当業界で既知であり、米国特許第５，８
３６，９０５号、５，７０３，０５５号、５，５８９，４６６号、および５，５
８０，８５９号に記載されている。これらの特許を本願に引用して援用する。【００５４】ワクチンは、キャリヤと共に用いる。そのキャリヤは、幅広い種類のキャリヤ
のいずれでもよい。代表的なキャリヤとしては、滅菌水、塩水、緩衝溶液、鉱油
、ミョウバン、合成ポリマなどが挙げられる。溶液中の懸濁および分散を向上さ
せるために追加の溶剤をを使用してもよい。適切なキャリヤの選択は、ワクチン
の投与方法に依存する。本ワクチンは通常、地方病性肺炎に罹患性を有するヒト
以外の動物、特にブタに使用される。【００５５】ワクチンは、筋内注射、皮下注射、腹腔内注射、または静脈注射などの、いず
れかの適切な方法によって投与できる。あるいは、活性成分を飼料または水に混
ぜたり、タブレットの形状にするなどして、ワクチンを鼻内または口内を通じて
投与してもよい。粒子衝撃、マイクロインジェクション、電気穿孔法、リン酸カ
ルシウムトランスフェクション、リポソームトランスフェクション、および、ウ
イルストランスフェクションなどの方法は、ＤＮＡ配列ワクチンの投与において
特に適切である。ワクチンの他の投与手段は、本明細書の記載から当業者にとっ
て明らかになる。したがって、本発明の範囲は特定の投与形態に限定されるもの
ではない。ワクチンはさらに、上述の抗原またはフラグメントに加えて、活性成
分またはアジュバント（たとえばフロイント不完全アジュバント）を含んでもよ
い。【００５６】アジュバントを用いて、抗原の免疫原性を促進させることができる。アジュバ
ントの作用メカニズムは、完全には解明されていない。いくつかのアジュバント
は、抗原をゆっくりと放出させることによって免疫性応答を促進すると考えられ
ており、また他のアジュバントは共同作用によって機能すると考えられている。
使用可能なアジュバントとしては、以下が挙げられる：油水乳剤、フロイント完
全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Corynebacterium parvum、ヘ
モフィルス、Mycobacterium butyricum、水酸化アルミニウム、デキストラン硫酸、酸化鉄、ナトリウムアルギン酸、バクト−アジュバント（Bacto-Adjuvant）
、ポリアミノ酸やアミノ酸のコポリマなどの特定の合成ポリマ、サポニン、イオ
ータカラゲナン（iota carrageenan）、リグレシン（Regressin；商標）、アヴリジン（Avridine；商標）、Mannite monooleate、パラフィン油、およびムラミ
ルジペプチド。【００５７】特定の問題または環境における本発明の教示内容の応用は、通常の技術を有す
る当業者であれば、本明細書に記載の教示内容を参照すれば実施可能な範囲であ
る。以下の実施例に、本発明の製品および工程の例を示す。【００５８】【実施例１】ライブラリ構築およびスクリーニングＭｈｙｏ染色体ＤＮＡゲノムライブラリを、ＥｃｏＲＩλＺＡＰＩＩ内にクロ
ーン化されたＴｓｐ５０９１消化の染色体ＤＮＡを用いて構築した。この方法は
、Minion,F.C.,VanDyk,C.and Smiley,B.K.,"Use of an Escherichia coli enhan
ced opal suppressor strain to screen a Mycoplasma hyopneumoniae library"
,131 FEMS Microbiol.Letters 81-85(1995)に以前に記載されており、この文献を本願に引用して援用する。そのライブラリを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＬＥ３９２上で
、Hanahan,D.,"Studies on transformation of Escherichia coli with plasmid
s",166 J.Mol.Biol.557-80(1983)に記載される手法を用いて培養した。そして、
Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.,Molecular cloning:A Laboratory M
anual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)の方法を用いたＤＮＡハイブリッド形成と、ブタ回復期抗血清とを用いて、そのライブ
ラリをMinion et al.に説明されるとおりにスクリーニングした。【００５９】図６に、Ｐ９７コンティグ（contig；連続）の転写解読枠（ＯＲＦ）と、ゲノ
ムライブラリのスクリーニングに使用したプローブとを示す。ボックスはＯＲＦ
を表し、下方にその名称を記す。色付きボックスは左から右への転写を表し、白
ボックスは右から左への転写を表す。ハイブリッド形成分析に使用したプローブ
１〜４、およびゲノムライブラリのスクリーニングに使用したプローブ５は、図
の下方に示す。ハイブリッド形成は、³²Ｐ放射標識したプローブを用いて６５℃
にて一晩かけて実施した。一つ目のプローブは、図３に示す上流配列に加えてＰ
９７のＮ末端を含むｐＩＳＭ１１６１からの３．３ｋｂクローン化フラグメント
であった。二つ目のプローブ（プローブ５）は、図６に示すような、Ｐ１０２構
造遺伝子内に位置するＤＮＡのクローン化された４００ｂｐフラグメントであっ
た。【００６０】ライブラリはさらに、Minion et al.で以前に説明されたとおりに、Ｍｈｙｏに感染したブタの回復期血清を用いてスクリーニングした。回復期血清は、以下
の工程によって得られた。Ｍｈｙｏに感染したブタの肺を動物から採取し、均質
化し、その部分片を凍結することにより、接種物を作成した。接種物の部分片を
、ステリルリン酸で緩衝した（steryl phosphate-buffered）塩水中で１：１０に希釈した。その１０ｍＬを、ブタ内に気管内を通じて（intertracheally）点滴注入した。２８日後または５６〜７３日後に、血液を採取して血清を得た。ク
ローン化Ｍｈｙｏ染色体ＤＮＡフラグメントを含むプラスミドを、対応の精製さ
れた組換えλＺＡＰＩＩファージから、エックスアシスト（ExAssist；商標）ヘ
ルパーファージ（Stratagene,La Jolla,CA）を用いてインビボで切り出した（ex
cised）。そのプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉＳＯＬＲ（商標）［el4-(mcrA) Δ
(mcrCB-hsdSMR-mrR^R)171 sbcC recB recJ uvrC umuC::Tn5(Kn^R) lac gyrA96 rel
A1 thi-l endA1 λ^R(F¹ proAB lacl⁴Z M15) Su^-］に、製造者（Stratagene,La
Jolla,CA）の指示に従って導入した。【００６１】【実施例２】ＤＮＡ配列決定および配列分析Ｔｎ１０００促進のＤＮＡ配列決定を、プラスミドｐＩＳＭ１２１０、ｐＩＳ
Ｍ１２１７、およびｐＩＳＭ２１６６に対して、Strathmann,M.,Hamilton,B.A.,
Mayeda,C.A.,Simon,M.I.,Meyerowitz,E.M.and Palazzolo,M.J.,"Transposon-fac
ilitated DNA sequencing",88 Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 1247-50(1991)に説明されるとおりに実施した。交配は、Strathmann et al.に記載されるようにＥ．ｃｏｌｉ株ＤＰＷＣ（Ｆ⁺）を用いて、さらにはＢＷ２６（Ｋｎ^R受容体）を用い
て実施した。挿入を、制限酵素ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＶ、およびＢａｍＨＩを用い
て制限消化物（restriction digests）によってマッピングした。一連のＴｎ１０００挿入を、反応の配列決定のための鋳型ＤＮＡとして選択した。その反応の
配列決定とは、Ｐ９７配列の上流および下流へＤＮＡ配列情報を追加する際の、
反応の位置および有用度に基づくものである。続いて、ＤＮＡ配列決定を実施し
た。その際、Strathmann et al.に説明されるとおり、Ｔ７およびＴ３ベクタ特異的プライマ部位、並びにＴｎ１０００末端特異的プライマ１８６（5'-ATATAAA
CAACGAATTATCTCC-3'）および１８８（5'-TAAGTTATACCATAAACG-3'）をサイクル配
列決定反応において使用した。自動化モデル３７３Ａ蛍光ＤＮＡシーケンサ（Pe
rkin-Elmer Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA）を用いることで、すべての配列が得られた。ＤＮＡ配列分析は、マックベクタ（商標）ソフトウェアバ
ージョン６．０．１（Oxford Molecular Group,Campbell,CA）を用いて実施した
。翻訳は、マイコプラズマ翻訳テーブルを使用して実施した。ＤＮＡおよび翻訳
された蛋白の配列相同サーチはそれぞれ、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ分析
によって達成された。【００６２】【実施例３】ハイブリッド形成分析ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ、およびＢｇｌＩＩ
によって消化されたＭｈｙｏ染色体ＤＮＡに対して、ハイブリッド形成分析を実
施した。消化されたＤＮＡを、０．７％のアガロースゲルに溶解し、ナイロン膜
上にブロットした。図３および図６に示す数個のＰ９７オペロン特異的プローブ
を、この分析に用いた。それらのプローブには、ｐＩＳＭ１２１３から得たＰ９
７の７５８ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（プローブ１）、主
要抗原性および繊毛結合性（cilium binding）エピトープを含むＰ９７のＲ１リ
ピート領域を含むＰＣＲ生成物（プローブ２）、並びに、ｐＩＳＭ２１３９から
のＨｉｎｃＩＩフラグメント（プローブ３）およびＨｉｎｃＩＩ−ＫｐｎＩ（プ
ローブ４）が含まれる。【００６３】プライマＴＨ１２０（5'-AAGGTAAAAGAGAAGAAGTAG）およびＴＨ１２１（5'TTGT
AAGTGAAAAGCCAGTAT）を、ＰＣＲ反応混合物に使用した。そのＰＣＲ反応混合物は、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、２５ｐｍｏｌの各プライマ、１〜５０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、および１．２５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを、５０μｌの１Ｘ製造者
の反応緩衝剤中に含むものであった。それを用いて、プローブ２を生成した。Ｐ
ＣＲ条件は以下のとおりであった。ＤＮＡを９４℃で５分間変性し、続いて３５
サイクル（９４℃での１分間の変性、５８℃での１．５分間のアニーリング、お
よび７２℃での１分間の伸張（extension））を実施し、最後に７２℃で５分間の伸張ステップを実施した。【００６４】図７は、ＭｈｙｏＤＮＡのハイブリッド形成を、図６のプローブを用いて分析
した結果を示す。各パネルは、パネルの上方に記す一つのプローブを用いたハイ
ブリッド形成を表す。プローブ１および２では、染色体ＤＮＡはＢｇｌＩＩによ
って消化された。プローブ３および４で染色体ＤＮＡを消化した制限酵素は、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ（レーン１）、ＨｉｎｃＩＩ（レーン２）、ＥｃｏＲＶ（レーン３
）、ＥｃｏＲＩ（レーン４）、およびＢｇｌＩＩ（レーン５）であった。レーン
６は、６ｎｇの対照プラスミドＤＮＡを含んだ。その対照プラスミドＤＮＡは、
プローブを単離する際に使用した酵素によって消化されたものであった。オート
ラジオグラフは、コフ社のモデル４９００高性能ＣＣＤカメラ（Cohu Inc.,San
Diego,CA）、および、サイオン社（Scion Corporation,Frederick,MD）のビデオ
ボードを搭載したマッキントッシュＩＩｃｉを用いてデジタル化した。各バンド
のサイズは、ゲルリーダーソフトウェア（NCSA,Urbana-Champaign,IL）を用いて
検出した。サイズは、キロベース単位で示した。ＴＩＦＦファイルを、アドービ
フォトショップでトリミングおよび編集し、アルダスフリーハンドでラベルを付
した（Adobe Systems Inc.,San Jose,CA）。【００６５】【実施例４】Ｐ１０２遺伝子コピーのクローン化および分析Ｍｈｙｏ染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩフラグメントであって、アガロースゲルで
精製した３．８ｋｂ、４．２ｋｂ、および４．８ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント
を、ＥｃｏＲＩに消化されたｐブルースクリプトＩＩｐＳＫ^-（Stratagene,La J
olla,CA）内にクローン化することによって、Ｐ１０２の追加クローンを得た。そしてプローブ３（図６に示す）を用い、Ｐ１０２特異的クローンに関して、コ
ロニーブロットによって組換えクローンをスクリーニングした。それによって得
られたプラスミドを制限マッピングし、クローン化フラグメントの末端を配列決
定した。配列プライマ（5'GCGGCTGCTAAACTAAGACTA）を用いて、Ｐ９７コンティグ配列に整列していたｐＩＳＭ１２３２およびｐＩＳＭ１２３４の３’末端の追
加配列情報を得た。ブタ回復期抗血清を用いてゲノムライブラリをスクリーニン
グすることで得られた追加クローンｐＩＳＭ２１６６は、完全に配列決定され、
Ｐ１０２に対して有意の相同性を含むことが観察された。【００６６】【実施例５】Ｐ１０２構造遺伝子の同定と特徴化Ｐ９７シーケンスを含むこれまでのすべての組み替えクローンは、ｍＡｂＦ
１Ｂ６を用いて同定された。これについてはHsu, T., Artiushin, S. and Minio
n, F.C., "Cloning and analysis of P97, a respiratory cilium adhesin gene
of Mycoplasma Hyopneumoniae", 179 J. Bacteriol. 1317-23(1997)に示されて
いる。Ｐ９７構造遺伝子およびその周辺のシーケンスを含む追加クローンを得る
ために、我々はゲノムのライブラリをｐ９７５’エンド（末端）およびトラン
スレーショナルスタートコドン（translational start codon）の上流のシーケンスを含むプローブを用いたハイブリダイゼーションによってスクリーンした。
Ｍｈｙｏ−インフェクテッド（感染）ブタからのブタコンバレセントアンチセラ
（ブタ回復期抗血清）によるライブラリのスクリーニングによって追加クローン
がＰ１０２シーケンスとともに同定された。結果物のクローンは、ＤＮＡシーケ
ンスおよびハイブリダイゼーション分析に供された。【００６７】図３に示されるように、ｐＩＳＭ１１６１からの３．３−ｋｂフラグメントに
よるゲノムライブラリのスクリーニングは、クローンｐＩＳＭ１２１０，ｐＩＳ
Ｍ１２１２−ｐＩＳＭ１２１４，ｐＩＳＭ１２１７の同定となった。２つの最も
大きなプラスミドであるｐＩＳＭ１２１０およびｐＩＳＭ１２１７によって代表
されるこれらのプラスミドは、Ｐ９７遺伝子の上流側および下流側にそれぞれ対
応する１６−ｋｂ領域（Ｐ９７コンティグで指定されている）にオーバーラップ
していた。クローンの中でプローブ５で同定されたものは、ｐＩＳＭ１１６５，
ｐＩＳＭ１１６８−ｐＩＳＭ１１７０、ｐＩＳＭ１１７４であった（図４）。【００６８】ＤＮＡシーケンスの９３７４ｂｐのトータルが得られた。Ｐ９７のシーケンス
も含まれている。図２は、Ｐ１０２遺伝子を含む２７５０ｂｐシーケンスの概略
を示している。Ｐ９７オペロンの完全なシーケンスは、すでに Hsu, T.and Min
ion, F.C., "Molecular analysis of the P97 cilium adhesin operon of Mycop
lasma Hyopneumoniae", 214 Gene 13-23(1998), および Hsu et. al. (Accesion
No. U50901)に書かれている。コンピュータ分析により、この９３７４−ｂｐシ
ーケンス（図６）の中の６つのＯＲＦの全部が同定された。Ｐ９７は、Ｐ９７オ
ペロンとして指定された２−遺伝子オペロンの最初の遺伝子と思われる。これら
は、図４および６に示されている。２つの遺伝子は、２０ｂｐによって分離され
ている。これは、第２ＯＲＦのＡＴＧスタートコドンの１０ｂｐ上流の推定シン
ダルガーノ（Shin Dalgarno）シーケンス（GGAGGT）を含んでいる。このＯＲＦは、１０２．３−ｋＤＡ蛋白のコーディングキャパシティを持つ長さ２７１２ｂ
ｐであった。この蛋白は、Ｐ１０２として指定（designated）されており、計算
された９．２８のｐＩを有しており、Ｃｙｓが欠けている（上記表２参照）。【００６９】この蛋白は、推定２５−ａａメンブランスパニングドメイン（membrane-spann
ing domain）とそのＮ−ターミナス（ａａ１０−３４）において、高親水性で
ある。Ｐ１０２の相同関係についてのデータベースのサーチによれば、他のバク
テリアアドへシン（adhesin）遺伝子を含む知られているシーケンスとよくマッチするものはない。Ｐ１０２についての蛋白構造予測は、ハイドロホビック（疎
水性の：hydorophobic）トランスメンブラン（経膜的な：transmenbrane）シーケンスをフォローする高度のαヘリシティー（ヘリシティー：らせん性：helici
ty）を示している（データは示していない）。【００７０】Ｐ１０２の追加のコピーがＭｈｙｏ染色体の中に存在する親水性の確認するた
め、Ｐ１０２特定プローブによって認識された追加のＥｃｏＲＩ染色体のフラグ
メントがクローン化され分析された。３．８−、４．８−ｋｂフラグメントをそ
れぞれ代表するｐＩＳＭ１２３２−ｐＩＳＭ１２３４プラスミドは、限定サイト
マップ化された。３．８および４．２ｋｂクローン化フラグメントの端部の部分
的シーケンシング（配列決定）から、２つのクローンは、オリジナルＰ１０２に
ついて異なる染色体領域からのものであると思われる。ｐ９７コンティグととも
にクローン化されたフラグメントの配列は図４に示されている。ｐＩＳＭ１２３
２の３’エンドおよびｐＩＳＭ１２３３の５’エンドは、Ｐ１０２シーケンス、
およびｐ９７およびＰ１０２の間の介在配列（インターヴィーニングシーケンス
）とよくアラインしていた。しかし、ｐ９７遺伝子シーケンスの３’エンドにお
いて、相同関係（ホモロジー）は、突然終わっていた（図４）。ｐＩＳＭ１２３
２の５’エンドは、ｐ９７遺伝子または他の知られたシーケンスとホモロジーを
示していない。ｐＩＳＭ１２３３の３’エンドは、蛋白レベルにおいて、Coryne
bacterium glutamicum heat-shock 蛋白ＣｌｐＢ（C.glutamincumシーケンスのａａ１５８および２５６の間の９８−ａａ領域において６２％同一、８４％近似
）とホモロジーを有していた。ｃｌｐＢシーケンスの上流に位置しているのは、
Ｍｈｙｏトリオセフォスフェイト（triosephosphate）イソメラーゼ遺伝子ｔｐｉ（Accession No.L33478）であった。ｐＩＳＭ１２３２およびｐＩＳＭ１２３３と近似した制限マップを有するオーバーラップしているクローン（ｐＩＳＭ１
１６５，ｐＩＳＭ１１６８−ｐＩＳＭ１１７０，およびｐＩＳＭ１１７４）のシ
リーズは、Ｐ１０２シーケンスから得られた４００−ｂｐプローブを用いてゲノ
ムライブラリから得られた。ｐＩＳＭ１２３２およびｐＩＳＭ１２３３に対する
これらのクローンの整列（alignment）が図４に示されている。これらのクローンからシーケンスに情報は得られなかった。しかし、これらの制限マップは、こ
れらがｐＩＳＭ１２３２および同一の染色体領域から得られたものであることを
示している。【００７１】４．８−ｋｂハイブリダイジングフラグメントを含むプラスミドｐＩＳＭ１２
３４から得られたＤＮＡシーケンス情報は、相同でない領域に散在するＰ１０２
と相同のＤＮＡのショートストレッチ（short stretches）を示している。１３０ｂｐ（Ｐ１０２と８２％相同（ホモロジー））および１７７ｂｐ（Ｐ１０２と
９５％ホモロジー）の２つのストレッチが図５に示すように同定された。これら
はＰ１０２特定プローブ３と弱い反応を有する。クローンｐＩＳＭ１２３２−ｐ
ＩＳＭ１２３４は、完全にはシーケンスしていない（連続していない）。Ｐ１０
２との他のホモロジーが、同定されていないクローン化されたフラグメントの中
に存在する可能性はある。【００７２】クローンｐＩＳＭ２１６６は、ほとんど完全にＰ１０２と相同のコピーを代表
している。１６２４−ｂｐシーケンスは、図４，５に示すように、１４４−３３
０ｂｐ（４８−１１０ａａ）領域にのみ分岐（divergence）を示す。Ｐ１０２の
限定パターンは、ＳａｌＩおよびＡｃｃＩサイトを除いて、ほぼ完全にｐ９７オ
ペロンシーケンスのそれと同一である（図４）。ＳａｌＩは、Ｍｈｙｏにおいて
レアーカッティング（rare cutting）酵素であり、Ｐ１０２のコピーにおけるこ
のサイトのロス（遺失：ｌｏｓｓ）は重大である。ｐＩＳＭ２１６６がＰ１０２
の第２のコピーであることが我々の結論である。プラスミドｐＩＳＭ１２３２お
よびｐＩＳＭ１２３３は、またＰ１０２とよい整列（alignment）示している。しかし、これらの限定パターンおよびｐＩＳＭ１２３２の上流シーケンスは、こ
れらのフラグメントが第３の染色体位置からきていることを示している。プラス
ミドｐＩＳＭ１２３２およびｐＩＳＭ１２３３は、たぶん同一の染色体位置から
きている。これは、クローンｐＩＳＭ１１６５、ｐＩＳＭ１１６８−ｐＩＳＭ１
１７０およびｐＩＳＭ１１７４が同一の制限パターンの領域をオーバーラップし
ているからである。プラスミドｐＩＳＭ１２３４は、我々の限定されたシーケン
ス分析によって認識されたＰ１０２と相同の２つのショートストレッチを有する
だけである。しかし、このフラグメントが他の染色体領域からきていることは明
らかである。【００７３】【実施例６】Ｐ１０２蛋白のブタのＭｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感
染の存在の検出への利用（予期的例）この発明のＭｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅをディスプレ
ーするポリペプチドは、ブタの群のＭｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ感染の存在の検出へのためにデザインされた方法およびキットに利用で
きる。このウイルスに感染している群の中のブタを認識し、感染に対応する群へ
の早期のワクチン投与することができる。例えば、この発明の組み替えＤＮＡ分
子によって形質変換された（transformed）ホストによって生成された抗原、またはそれらに対抗して生じた抗体は、この目的のＲＩＡまたはＥＬＩＳＡにおい
て使用することができる。放射性免疫検定（ラジオイムノアッセイ）の１つのタ
イプにおいて、例えばラビットのような実験動物において生じたこの発明の１以
上の抗原に対抗する抗体は、例えば試験管の内部のような固相にアタッチされる
。抗原は管に加えられ、抗体をバインドする。【００７４】群の中の１０〜２０頭に１頭の選ばれたブタの血清のサンプルを予め知られた
量の放射性同位元素でラベルされた抗原抗体と一緒に、抗原−抗体混合物でコー
トされた管に加えられる。ブタ血清中のどの抗体（Ｍｙｈｏ感染のためのマーカ
ー）抗原も、抗原−抗体混合物情の自由結合サイトをラベルされた抗体と競争す
る。一旦血清がインタラクト（相互作用）できた場合、他の液体は、除去され、
試験管は洗浄され、放射能の量が検出される。放射能カウントの低いことによっ
て、陽性の結果、すなわちブタの血清がＭｈｙｏ抗体を含んでいることが示され
る。【００７５】ＥＬＩＳＡテストの１つのタイプにおいて、マイクロ滴定プレートは、本発明
の１以上の抗原によってコートされる。そして、これにブタの血清のサンプルが
加えられる。これは、群の１０〜２０に１頭のものである。血清に存在する抗体
と抗原のインタラクションを許す培養期間（潜伏期間）の後、プレートは洗浄さ
れ、実験動物に発生し酵素ラベルとリンクされた抗原抗体のプレパレーションが
加えられる。そして、反応が生起されるよう置かれ、プレートはもう一度洗浄さ
れる。この後、酵素基質は、マイクロ滴定プレートに加えられ酵素が基質に作用
する期間だけおく。そして、最後のプレパレーションの吸収度が計測される。吸
収度の大きな変化は、陽性の結果、すなわちテストされたブタ血清はＭｈｙｏの
抗体を有しいることを示し、そのバクテリアに感染していることを示す。【００７６】【実施例７】この発明の抗原およびシーケンスのＭｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ感染に対するワクチンにおける使用（予測的例）ブタへの適用のための本発明のワクチンの調整において、当業者に知られてい
るスタンダードな方法が利用できる。例えば、選択のポリペプチドは、無菌塩溶
液に溶解される。長期間の貯蔵のために、ポリペプチドは、凍結乾燥され、適用
の前に無菌塩溶液によって再現される。凍結乾燥に先立ち、保存剤や他の一般的
な添加物であってバルク（ｂｕｌｋ）を提供するグリシンや、塩化ナトリウム等
が添加される。他の適用可能な助剤ワクチンと一緒に適用可能である。【００７７】本発明のワクチンは、またラビットのような実験動物において本発明のポリペ
プチドに対して生じる抗体を使用して調整することもできる。この「受動的」ワ
クチンは、Ｍｈｙｏ感染からブタを保護するために適用することができる。Ｐ１
０２ＤＮＡシーケンスのホストセルへの直接のインコーポレーション（結合：in
corporation）は、生体内の抗原のエクスプレッション（発現：expression）のための動物細胞の中へのシーケンスを導入を可能とする。【００７８】上記、記述図面、実施例は、単に目的、特徴、効果を得るための好適な実施形
態を示したものである。本発明は、これら実施形態に限定されない。本発明の変
形および特許請求の範囲は、本発明の範囲である。【００７９】新規のものとして請求し、米国の特許として保護を求める。【図面の簡単な説明】【図１】Ｐ１０２のアミノ酸配列を示す図である。【図２】 MhyoＰ１０２をコード化するＤＮＡ配列を示す図である。【図３】Ｐ９７オペロンのクローンの制限酵素地図を示す図である。【図４】Ｐ１０２クローンの制限酵素地図である。【図５】複数のクローンに対するＰ１０２の翻訳されたアミノ酸配列の配
置を示す図である【図６】Ｐ９７コンティグの転写解読枠（open reading frames）及びゲノミックライブラリの調査（screen）に用いるプローブを示す図である。【図７】図６のプローブによる、MhyoＤＮＡのハイブリダイゼーション分
析の結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｈ０４５Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者スーツンダアメリカ合衆国ニューヨーク州ブロンクスイーストチェスターロード 2100 アパートメント３シーＦターム(参考） 4B024 AA10 AA13 BA31 CA04 DA06 EA04 GA11 HA12 HA15 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ43 QR08 QR33 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4B065 AA26X AA37Y AB01 BA02 CA24 CA45 CA46 4C084 AA13 NA14 ZB351 ZB352 4C085 AA03 BA09 CC04 CC13 DD22 FF02 FF03 GG02 GG04 GG06 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA11 DA86 EA31 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】【請求項１】図１に示すＰ１０２のアミノ酸シーケンスの少なくとも一部
を含み、ネイティブＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＰ１０２の抗原を有する蛋
白。【請求項２】請求項１に記載の蛋白であって、前記蛋白は、図１に示すＰ
１０２のアミノ酸シーケンスの全体を含む蛋白。【請求項３】請求項１に記載の蛋白をエンコードするＤＮＡであって、こ
のＤＮＡは、組み替えまたは合成ＤＮＡであるＤＮＡ。【請求項４】請求項３に記載のＤＮＡであって、前記ＤＮＡは、適切なバ
クテリアホストセルとコンパチブルなコントロールシーケンスの少なくとも１つ
と実施可能にリンクするものであるＤＮＡ。【請求項５】バクテリアホストセルとコンパチブルなコントロールシーケ
ンスの少なくとも１つと実施可能にリンクする請求項３のＤＮＡで変換されたバ
クテリアホストセルであって、前記バクテリアホストセルは、前記ＤＮＡによっ
てエンコードされた蛋白を発現することが検出可能な量で可能であるバクテリア
ホストセル。【請求項６】Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされる地
方病性肺炎に対し感応性の高い動物を保護するワクチンであって、免疫原性の蛋
白であって、ネイティブＰ１０２の抗原と、前記免疫原性の蛋白の適切なキャリ
アーを含むワクチン。【請求項７】請求項６に記載のワクチンであって、前記免疫原性の蛋白は
、図１に示すアミノ酸シーケンスを有するワクチン。【請求項８】請求項６に記載のワクチンであって、前記免疫原性の蛋白は
、図２に示すＤＮＡシーケンスによってエンコードされているワクチン。【請求項９】請求項６に記載のワクチンであって、前記免疫原性の蛋白は
、図１に示すアミノ酸シーケンスの少なくとも一部を含むアミノ酸シーケンスを
有するワクチン。【請求項１０】請求項６に記載のワクチンであって、前記免疫原性の蛋白
は、図２に示すＤＮＡシーケンスの少なくとも一部を含むシーケンスを有するＤ
ＮＡによってエンコードされているワクチン。【請求項１１】請求項６に記載のワクチンであって、前記動物はブタであ
るワクチン。【請求項１２】自然発生のＰ１０２の抗原を有するポリペプチド生成物の
原核または真核ホストセルにおける発現のためのＤＮＡ。【瀬急行１３】請求項１２に記載のＤＮＡであって、前記ＤＮＡは、図２のＤＮＡ、図３のＤＮＡ、図２のＤＮＡに相補的なストラ
ンド（分子の連鎖）、および図３のＤＮＡに相補的なストランドからなるグルー
プから選ばれたものであるＤＮＡ。【請求項１４】請求項１２に記載のＤＮＡであって、前記ＤＮＡは、図２のＤＮＡ、図３のＤＮＡ、図２のＤＮＡに相補的なストラ
ンド（分子の連鎖）、および図３のＤＮＡに相補的なストランドからなるグルー
プから選ばれたものとハイブリダイズするＤＮＡ。【請求項１５】Ｍ．ｈｙｏｎｅｕｍｏｎｉａｅによる地方病性肺炎から動
物を保護する方法であって、Ｍ．ｈｙｏｎｅｕｍｏｎｉａｅＰ１０２抗原を認識する抗体を導出する蛋白お
よびＭ．ｈｙｏｎｅｕｍｏｎｉａｅＰ１０２抗原を認識する抗体を導出するポリ
ペプチドをエンコードするＤＮＡからなるグループから選ばれた活性な成分を含
むワクチンを動物に施し、かつ前記ワクチンは、前記活性な成分をＭ．ｈｙｏｎｅｕｍｏｎｉａｅによる地方
病性肺炎に対する保護に有効な量を含む方法。【請求項１６】請求項１５に記載の方法であって、前記蛋白は、Ｍ．ｈｙｏｎｅｕｍｏｎｉａｅＰ１０２である方法。【請求項１７】請求項１６に記載の方法であって、前記Ｍ．ｈｙｏｎｅｕｍｏｎｉａｅＰ１０２は、組み替えによるものである方法。【請求項１８】請求項１６に記載の方法において、前記Ｍ．ｈｙｏｎｅｕｍｏｎｉａｅＰ１０２は、図２のＤＮＡシーケンスによ
ってエンコードされている方法。【請求項１９】請求項１６に記載の方法において、前記Ｍ．ｈｙｏｎｅｕｍｏｎｉａｅＰ１０２は、図１のアミノ酸シーケンスを
有する蛋白の少なくとも一部をエンコードするＤＮＡシーケンスによってエンコ
ードされる方法。【請求項２０】請求項１５に記載の方法において、前記ＤＮＡは、図２のＤＮＡシーケンスの少なくとも一部を有する方法。【請求項２１】テストサンプル中のＰ１０２抗体の存在を検出する方法で
あって、Ｐ１０２抗体を含むと疑われるテストサンプルを用意し、Ｐ１０２またはその抗原性のフラグメントをテストサンプル中のＰ１０２抗体
によって酵素滴活性の検出可能なレベルを作るのに十分な量をテストサンプルに
添加し、テストサンプル中のＰ１０２抗体の存在を検出する蛋白検査を行う方法。【請求項２２】テストサンプル中のＰ１０２抗体の存在を検出するための
診断キットであって、レベルされたＰ１０２抗体を含む少なくとも１つのコンテナを有するキャリア
手段を含む診断キット。