KR100425009B1 - 스트렙토코쿠스 뮤탄스 균주에 의한 충치 예방용 항원 및항체의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스트렙토코쿠스 뮤탄스 균주의 핌브리아 부양 표면 항원 소편의 분리 방법 및 상기 항원을 이용한 충치 예방용 항체의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 스트렙토코쿠스 뮤탄스 균주의 핌브리아 부양 표면 항원 소편을 순수 분리하여, 이를 복강 또는 코 점막을 통해 포유 동물에 능동 면역시킴으로써, 포유 동물의 타액 내에 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 핌브리아 부양 표면 항원 소편 특이 IgA 항체 생성을 유도한다. 이와 같은 방법을 통해 소량의 백신 투여로 최대한의 항체 생성을 유도할 수 있으며, 안전성 및 용이성이 뛰어난 충치예방 효과를 나타낼 수 있다.

Description

스트렙토코쿠스 뮤탄스 균주에 의한 충치 예방용 항원 및 항체의 제조 방법{Method of producing an antibody and an antigen for dental caries prevention from Streptococcus mutans}

본 발명은 본 발명자들이 발명 제조한 충치 원인균인 스트렙토코쿠스 뮤탄스로부터 핌브리아 부양 표면 항원 소편을 분리하는 방법 및 분리한 상기 항원을 이용하여 균주가 치아에 유착하는 것을 억제하는 항체를 제조하는 방법 및 그 이용에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 충치 원인균인 스트렙토코쿠스 뮤탄스 균주로부터 치아 유착에 관여하는 핌브리아 부양 표면 항원 소편을 분리하여, 분리된 단백질 소편을 코 점막(nasal mucosal)을 통하여 면역시킴으로써 타액 내에 항원 특이 IgA 항체의 생성을 유도하는 방법에 관한 것이다.

충치(dental caries)는 치아 에나멜(tooth enamel)의 국소적인 탈광질화 (demineralization)로 말미암은 치아 부식을 일컬으며, 이러한 탈광질화는 주로 구강내의 세균인 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 의해 기인한 것으로 알려져 있다(Loesche, 1986).

스트렙토코쿠스 뮤탄스에 의한 충치 유발의 중요한 기작은 일반적인 염증반응보다는 균이 치아에 유착하여 군락을 형성 (colonization)하게 되고, 이 균이 치아에 부착된 당분이나 전분 등의 탄수화물을 대사과정을 통하여 분해 시켜 각종 유기산을 생성시키고, 이러한 산의 증가에 의해 치아의 무기질 성분이 탈광질화 되기 때문인 것으로 알려져 있다.

충치를 예방하고 치료하기 위하여 불소화합물, 아미노카프론산, 클로로헥사딘, 덱스트라아제 등이 현재 이용되고 있으며, 식물분리물이나 한방성분을 이용한 제품들이 연구되고 있다. 그러나 충치균의 항원성, 치아 및 구강 내에서의 충치균의 군락형성과 충치균에 대한 인체의 면역반응 등에 대해서는 아직 알려져 있는 것이 많지 않으며, 최근에 타액 내 s-IgA항체가 충치억제기능을 하고 있는 것으로 추정되어 지고 있다.

스트렙토코쿠스 뮤탄스의 치아 유착과 플라그 형성 및 치아 우식을 막기 위해서는 점막의 s-IgA 항체의 생성이 필수적이며, 특히 s-IgA항체의 생성을 유도하는 것과 함께 치아가 자라기 시작하는 시점에서는 치주 근처의 치근의 항체도 중요한 역할을 하게 되는데, 이는 주로 혈액 내에서 국소적으로 공급되는 전신형 IgG 항체이다.

충치가 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 의하여 발생한다는 임상적인 첫 보고가 1986년에 있은 이래로 충치 예방을 위한 예방접종의 가능성이 대두되었으며, 최근에 타액의 secretory IgA항체(s-IgA)가 충치 예방 면역의 주된 역할을 한다고 결론지어지고 있다. 최근의 충치균에 대한 능동면역의 연구는 고식적이며 안전하고, 효과적인 방법을 통한 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대한 s-IgA항체의 생성을 유도하고자 하는데 초점이 맞춰지고 있다.

한편, 특허등록 제89-4123호에는 스트렙토코쿠스 뮤탄스 균주의 세포표면상의 선모로부터 단리한 항원으로 포유동물을 면역시키고, 이로부터 얻어진 항체를 회수하는 것을 특징으로 하는 충치 억제용 항체의 제조 방법이 개시되어 있다. 하지만, 상기 발명은 본 발명과 같이 코 점막을 통해 항원을 직접 투여하는 방법이 아닌 항원 희석액을 피하 주사를 통해 투여하는 방법으로 항체를 제조하여, 상기 제조된 항체를 포함하는 치마제, 음료, 정제 등의 수동 면역용 충치 예방 조성물을 제공하고 있다.

원인병원균에 대한 항원특이 면역방법은 면역 반응을 유발시키는 방법에 따라 능동면역과 수동면역으로 구별된다. 수동면역은 사람이나 동물 등의 다른 개체가 만든 항체를 사람에게 투여하는 방법으로 특정 균에 대한 면역을 빨리 얻을 수는 있으나 오래 지속되지는 못한다. 능동면역은 항원을 사람에게 직접 투여하여 항체의 생산을 유도하는 면역방법으로, 유도된 면역은 오랫동안 지속되는 장점이 있다. 따라서 충치예방 목적을 위해서는 항체를 치약이나 구강세정제 등의 조성물에 포함시켜 도포 하는 수동면역과 충치를 유발시키는 주요 원인 균을 면역시켜 인체내에 항체의 생산을 직접 유도시키는 능동면역방법 모두를 사용할 수 있다.

본 개발에서는 충치예방을 위해서 충치 원인균인 스트렙토코쿠스 뮤탄스균으로부터 치아 유착에 관여하는 핌브리아 부양표면항원을 피하주사나 근육주사용 백신에 비하여 매우 안전한 면역 경로인 코점막 내로 면역시켜 구강 내에 항원 특이 s-IgA항체의 생산을 유도시키는 능동면역방법을 이용하였다.

본 발명의 목적은 충치 원인균인 스트렙토코쿠스 뮤탄스 균주로부터 치아 유착에 관여하는 핌브리아 부양 표면 항원 소편을 순수하게 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 분리된 스트렙토코쿠스 뮤탄스 균주로부터 치아 유착에 관여하는 핌브리아 부양 표면 항원 소편을 항원으로 하여, 이를 코 점막을 통하여 능동 면역시킴으로써 타액내에서 충치 예방용 항체 s-IgA의 생성을 유도하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 항체를 제공함으로써, 충치 원인균인 스트렙토코쿠스 뮤탄스가 치아에 유착하는 것을 억제하고, 이에 따라 효과적으로 충치를 예방할 수 있도록 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 주사제가 아닌 코 점막 투여 경로를 이용한 능동 면역기술을 통해 안전성 및 용이성이 우수하고, 상업적으로도 다양하게 이용될 수 있는 유용한 충치 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

그 밖의 발명의 다른 목적들은 후술하는 실시예를 통해서 알 수 있을 것이다.

도 1은 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 핌브리아 부양 표면 항원 소편으로 면역시킨 생쥐의 타액 내에 생성된 항원특이 IgA 항체에 대한 그래프이다.

이러한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스트렙토코쿠스 뮤탄스 균주를 배양한 후 원심분리시켜 세포를 분리하는 단계; 상기 분리된 세포를 완충용액으로 세척하고 냉동 보관하였다가 서서히 냉각시킨 다음 희석시켜 분쇄시키는 단계; 상기 분쇄된 부유액을 원심분리시켜 세포와 세포파편을 제거하고 상층액을 농축하는 단계; 상기 농축된 상층액으로부터 단백질을 용출시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 핌브리아 부양 표면 항원 소편(52-80KD)의 분리 방법 및 상기 방법으로 분리된 스트렙토코쿠스 뮤탄스 균주의 핌브리아 부양 표면 항원 소편(52-80KD)을 제공한다.

상기 사용된 스트렙토코쿠스 균주로는 스트렙토코쿠스 뮤탄스 10449 균주(KCTC 3065, serotype c)인 것이 바람직하다.

또한 상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스 균주의 핌브리아 부양 표면 항원 소편(52-80KD)을 이용하여 충치 예방용 항체를 제조하는 방법은 구체적으로 스트렙토코쿠스 뮤탄스 균주의 핌브리아 부양 표면 항원 소편(52-80KD)을 항원으로 사용하여 포유 동물을 능동면역시키는 단계; 상기 능동면역을 통해 포유동물의 타액 중에서 상기 항원에 상응하는 항체를 생성시키는 단계; 상기 생성된 포유 동물의 타액으로부터 항체를 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명 충치 예방용 항체의 제조 방법에 사용되는 동물은 마우스인 것이 바람직하며, 복강 및 코 점막을 통한 능동면역인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 핌브리아 부양 표면 항원을 포함하는 충치 예방을 위한 능동면역 조성물을 제공한다.

상기 항원의 소편은 균주의 치아 유착에 관여하는 핌브리아 항원(fimbrial antigen)이 다량 함유된 특정 부분 표면 항원 분리물(fimbrial antigen enriched special extract of surface proteins from cultured Streptococcus mutans; 이하, 핌브리아 부양 표면 항원 소편이라 칭함)을 말한다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 단, 본 실시예는 단지 예시적인 목적으로 기술된 것으로서 본 발명의 범위가 하기 실시예에 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1 : 스트렙토코쿠스 뮤탄스균으로부터 유착 단백질의 분리

본 발명에서 사용한 스트렙토코쿠스 뮤탄스 10449 균주(KCTC 3065, serotype c )는 생명공학연구소 유전자원센터 유전자은행(305-600, 대전시 유성우체국 사서함 115호)에서 구입하였다.

스트렙토코쿠스 뮤탄스 10449 균주를 1리터 플라스크에 850ml Todd-Hewitt broth 배지(Todd-Hewitt broth 25.5g, glucose 5.5g, 증류수 850ml)를 이용하여 37℃ 혐기성 배양기에서 24시간 이상 정치 배양하였다. 배양액은 4℃에서 16,000xg로 원심 분리하여 세포를 분리한 다음, 완충용액(20mM Tris, 1mM MgCl2, 0.02% NaN3, pH 6.8 ; 이하, 용액 A 라 칭함)으로 1회 세척하고 침전물을 -70℃에서 12시간동안 냉동 보관하였다. 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 세포막을 깨기 위해서 냉동된 세포를 서서히 녹인 다음 용액 A로 희석하고, 이것을 초음파분쇄기(Sonicator)로 30초씩 4회 분쇄하였다. 이 부유액을 4℃에서 16,000xg으로 10분 동안 원심 분리하여 세포와 세포파편을 제거하고 상층액을 10배 농축하였다. 단백질의 분석은 BCA 용액을 이용하여 정량한 다음 10% SDS-PAGE로 세포로부터 얻은 전체 단백질을 확인하였다. 우리가 얻고자 하는 52-80KD의 핌브리아 부양 표면 항원만을 얻기 위하여 농축된 단백질을 5x 샘플 완충액(sample buffer)와 섞은 후 100℃에서 10분 동안 끓인 다음 10% SDS-PAGE를 수행하였다. 젤은 고정시키지 않고, 0.3M 염화 구리(Cupric chloride) 용액으로 네가티브(negative) 염색을 수행한 다음 지표단백질을 이용하여 단백질소편을 만들었다. 젤로부터 단백질을 용출하기 위하여 투석막에 단백질 소편를 넣고, PBS로 채운 다음, SDS 러닝 완충액(running buffer)에서 110V를 유지하면서 2시간동안 수행한다. 용출된 단백질용액은 PBS로 18시간동안 투석하여 염화 구리 용액을 제거하였고 투석으로 인해 희석된 단백질은 농축시켜서 10% SDS-PAGE로 정확한 크기를 분석하였다.

실시예 2 : 충치균에 대한 항체의 생성

분리된 핌브리아 부양 표면 항원 소편은 타액내에서 충치균에 대한 항체 생성을 유도하기 위한 항원으로 사용하였다. 항체 생성을 유도하기 위한 동물로는 생후 8주된 Balb/c 마우스를 이용하였다. 상기 마우스를 1군당 3 마리씩 3군으로 구분한 다음 이들을 다시 스트렙토코쿠스 뮤탄스 감염군과 음성 대조군으로 나누어 실험하였다.

마우스에 면역을 수행하기 전에 마취제(케타민(Ketamin)과 자일라진 (xylizine) 혼합액)를 4㎍/g mouse로 복강 주사한 후 마취가 되면 하기 표1과 같은 방법으로 면역하였다. 표 1에는 주사제의 조성과 투여 경로가 나타나있다.

	투여경로	항 원
1 군	복 강	40㎍단백질/200㎕PBS 1㎎알룸하이드록시드
2 군	코 점막	40㎍단백질/20㎕PBS+5㎍콜레라톡신B
3 군	복 강	1mg 알룸하이드록사이드(sham immunization)

2차, 3차 면역은 각각 1주일 후에 1차 면역 때와 동일한 조건으로 수행하였다. 3차 면역한 후 일주일째 되는 날 마취제를 복강에 주사한 후 마취가 되면, 5㎍의 카바콜(Cabamyl chloride)을 복강으로 주사하여 타액 생성을 유도한 후에 타액을 채취하여 55℃에서 30분동안 끊인 후, 1,000xg, 4℃에서 30분동안 원심분리하였다. 타액내에 생성된 IgA는 효소면역측정법(Enzyme Linked ImmunoSorbant Assay; ELISA)을 이용하여 관찰하였다. 상기에서 면역에 사용했던 핌브리아 부양 표면 항원 소편을 0.01M 카보네이트 바이카보네이트 완충액(carbonate-bicarbonate pH9.6)에 2㎍/ml로 희석하여 웰마다 100㎕씩 넣고 4℃에서 하룻밤동안 코팅(coating)하였다. 그 다음에 PBST(phosphate buffer saline, 0.15% Tween 20)로 3회 세척하고, 1% 겸양혈청으로 실온에서 2시간동안 반응시켰다. 1차 항체가 들어 있는 타액은 1% BSA-PBST로 2배 희석하여 well마다 100㎕씩 넣고 4시간동안 37℃에서 반응시킨 후에 PBST로 3회 세척하였다. 바이오틴이 붙어있는 2차 항체인 항 마우스 IgA 항체(Biotin conjugated anti-IgA antibody)를 1㎍/ml이 되도록 1% BSA-PBST로 희석한 후에 웰마다 100㎕씩 넣고 1시간동안 37℃에서 반응시켰다. 다시 PBST로 3회 세척한 후에 스트렙트아비딘-퍼록시다아제(Streptavidin-Horseradish Peroxidase)를 1% BSA-PBST로 1000배 희석하여 웰마다 100㎕씩 넣고 30분동안 37℃에서 반응시킨 후에 다시 PBST로 4회 세척하였다. 효소반응을 위한 기질로는 티엠비(Tetra-Methylbenzidine : TMB)용액을 웰마다 100㎕씩 넣고 실온에서 반응시킨 후에 2N-황산으로 반응을 정지시키고 450nm 파장에서 ELISA 판독기로 흡광도를 측정하였다. 효소 면역 측정법을 수행한 후에 음성대조군와 양성군사이 그리고 면역경로에 따른 항체 생성 정도를 비교 분석하였다.

도 1은 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 핌브리아 부양 표면 항원 소편으로 면역시킨 생쥐의 타액 내에 생성된 항원특이 IgA 항체에 대한 그래프이다. 제 1 군과 제 2 군은 양성군이고 제 3 군은 음성대조군이다. 제 1 군은 스트렙토코쿠스 뮤탄스균으로부터 분리된 핌브리아 부양 표면항원을 복강내로 면역시킨것이고 제 2 군은 코점막내로 면역시킨 것으로, 코점막내로 면역시켰을 때 음성대조군과 복강내로 면역시켰을 때보다 타액내 항체생성이 크게 증가했고, 또한 복강으로 면역시켰을 때의타액내 항체 생산은 정상범위(<mean+2SD)에 포함되는 반면 코점막으로 면역시켰을 때는 핌브리아 부양 표면항원에 대한 s-IgA의 생산이 크게 증가하였음을 알 수 있다.

본 발명은 충치예방을 위해 충치 원인균인 스트렙토코쿠스 뮤탄스로부터 치아 유착에 관여하는 것으로 추정되어 지고 있는 핌브리아 부양 표면 항원 소편(52-80KD)을 순수 분리하는 방법과 이것을 코 점막으로 능동 면역 시킴으로써 타액 내에 이 단백질에 대한 IgA항체의 생성을 유도하는 방법에 관한 것으로써, 특히 순수 분리된 항원 단백질을 코 점막으로 투여하면, 일반 주사제를 이용할 때보다 훨씬 적은 양을 투여하여 최대한의 항체생성을 유도할 수 있으며, 안전성 및 용이성이 뛰어나 충치예방에 큰 효과가 있다.

충치는 전국민에게서 가장 빈번히 발생하는 질병 중에 하나이며, 우리나라에서는 그 심각성이 해마다 증가하고 있는 추세이다. 그럼에도 불구하고 현재로서는 충치의 예방이 거의 불가능한 상태이고, 이미 충치가 발생한 후에는 치료가 고통스럽고 비용이 비싸며 퇴치가 어려워서 치아를 영원히 잃게 되는 빈도가 높은 실정이다. 이에 본 발명은 충치 원인균인 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 핌브리아 부양 표면 항원 소편을 성공적으로 분리 제조하였고 이를 이용하여 항원 특이 항체를 생성시키는데 성공함으로써, 추후 충치 예방 수동 면역제(치아 도포용 치약 등) 및 능동 면역제 등의 안전성과 용이성이 뛰어난 다양한 상품의 개발에 이용될 수 있다.

Claims (10)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 핌브리아 부양 표면 항원 소편(52-80KD)을 포함하는 충치 예방용 능동면역 조성물.
5. 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 핌브리아 부양 표면 항원 소편(52-80KD)을 항원으로 사용하여 인간을 제외한 포유동물을, 코 점막을 통해 능동면역시키는 단계;

   상기 능동면역을 통해 상기 포유동물의 타액중에서 상기 항원에 상응하는 항체를 생성시키는 단계

   를 포함하는 것을 특징으로 하는 스트렙토코쿠스 뮤탄스 핌브리아 부양 표면 항원 소편 특이 IgA 항체의 제조 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 포유 동물이 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 생성된 항체를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.