DE2128626A1 - Typhus-Vakzine und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Description

PftMrtanw&lfe Ir.JlUllrfdi-Dr.T.UIlifdi

69 Hslde'bsrg

itldt»IJS* 2128626

SCHWEIZERISCHES SERUM- UND IMPFINSTITUT UND INSTITUT ZUR ERFORSCHUNG DER INFEKTIONSKRANKHEITEN, Bern (Schweiz)

Typhus-Vakzine und Verfahren zu deren Herstellung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vakzine aus lebenden Kei· men zur Vorbeugung gegen Typhus-Xnfektionen, welche zur oralen Applikation geeignet ist. Die Erfindung betrifft ausserdem das Verfahren zur Herstellung dieses Impfstoffes.

Eine übers tandene Typhus «-Infekt lon hinterlasst eine hochgradige Immunität. Reinfektionen sind selten. Trotzdem sind die heute bestehenden Irapfmöglichkeiten, im besonderen die orale Impfung, hinsichtlich ihrer Wirksamkeit noch unbefriedigend. Die parenteral Schutzimpfung mit abgetöteten Keimen verursacht zudem allgemeine und lokale Reaktionen.

Bereits 1896 hat A.E. Wright die ersten Versuche mit abgetöteten Salmonella-Keimen durchgeführt [Lancet II. S« 807-809 (1896)].

Durch Vakzination mit abgetöteten Keimen kann zwar die Konzentration der sogenannten 0-, H- und Vi-Antikörper stark gesteigert werden, es besteht jedoch offenbar kein direkter Zusammenhang zwischen diesen Antikörpern und der Resistenz gegen Infektion und Rückfall. [R.B. Horaick et al, New English Journal of Medlzine 285. 739-746(197O)]

106/INT .*/..

209845/1160

Kürzlich durchgeführte Feldversuche und klinische Versuche an Freiwilligen ergaben ernsthafte Zweifel an der Wirksamkeit einer oralen, inaktiven Typhus-Vakzine· R.B. Hornick et el, loc. zit.

Es gibt demnach bis heute keinen oralen Typhus-Impfstoff auf Basis abgetöteter Keime, der eine befriedigende Schutzwirkung zu erzeugen vermag. .

Zahlreiche Modellversuche mit Salronella typhirauriura oder Salmonella enteritidis an Mäusen lassen vermuten, dass mit einer Lebend-Vakzine bessere Resultate erzielt werden könnten. Diese Annahme wurde durch Versuche an Schimpansen [B. Cvjetanovic, D.M. MeI und 0„ Felsenfeld, Bulletin World Health Organisation 4£, 499-507 (197O)] und an Freiwilligen (Homick, loc. zit.) bestätigt. Die genannten Forscher benutzten für ihre Versuche eine streptomycln-abhänglge Mutante von Salmonella typhi [M. Reitman, Journal of Infection Diseases 117, 101-107 (1967)]. Der Nachteil dieses Stansäe8 liegt darin, dass Virulenz und Irnmunogenität durch tägliche Streptomycingaben geregelt werden muss. Auch ist die ReversloESG?rate sum virulenten, streptomycln-unabhängigen Ausgangsstaosn mit 3 · 10~ viel zu hoch als dass er jemals als Vakzine-Stamm Verwendung finden konnte.

Zweck und Aufgabe der Erfindung wer, für eine orale Lebend-Vakzine «inen stabilen Salmonella typhi Stamm zu finden, der völlig avirulenC und dennoch inxounogen 1st. Dieses Vorhaben etöasfc auf einige Schwierigkeiten;, weil sowohl Xnraunogenit&t als auch Virulenz stark an die aus sere Zellwandstruktur des Ba&terlums gebunden sind.

Eine weitere Schwierigkeit für dits experimentelle Bearbeitung besteht darin, dass Salmonella tjr>hi, der Erreger das mensch!!-

106/CH ._e/..

20984S/116C

chen Typhus, aussei- bei Schimpsinsen, In keinem der üblichen Versuchstieren eine echte Infektion bewirkt. Die ersten Entwicklungsarbeiten mussten caher iroinächst an einem Modell durchgeführt werden. Als Modell wurde der durch Salmonella enteritidis und Salmonella typhimurium hervorgerufene \' iuse-Typhuß gewählt. Die Ergebnisse dieser Mause-Versuche iiess^n sich glücklicherweise gut auf die manschenpathogenen Salmonella f.:yphi übertragen, was keineswegs vorauszusehen war.

Bsi der Prüfung verschiedenster Sai.raonella-Mutenten wurde gefunden, dass unter allen geprüften Mutanten nur solche, die durch einen Block im Ensym Uriaindiphosphat-Galöctoee-^-Epimerase gekennzeichnet sind, einen Infektioiaschutz hervorrufen, wie ihn eine überetandene Infektion hinterlasst. Solche epirnerase-negative Mutanten - sogenannte "epimera.seliciss^Mutanten - können wegen ihres Defektes im Enzym Urid:tncIipli>sphat~(UD?)-Galacto8e-4-Eplmerase auf dem normalen Weg kaine UDP-OaIsetose bilden. Da nun UDP-Galactose als Vorstufe für den Einbau von Galactose in die Zellwand-Lipopolysaceharide ditsnt, werden nur unvollständige Zeilwände synthetisiert. Solche Bakterien erwiesen sich als weitgehend avirulent. Es wurde weiter gefunden, d&3S die ausserge~ wohnlich gute IisnainislerungsfShigkeit dieser Mutanten darauf bel-uht, dass in Anwesenheit von Galactose, wie dies in vivo der Fall ist, die Lipopolysaccharide wisder teilweise aufgebaut werden können. Ein zu starker Anstieg der Virulenz durch diese phänotypicche Reversion -^ird dadurch verhindert, dass bei zu hohem Galactoseangebci die aufgenorane:ce Galactose in Form von Galactose:-1-Fhosphat und UDP-Gelee :ose angereichert wird, was zu einer starken Bactoriolyss führt. Die Stabilität dieser Mutanten wird dadurch erreicht, Jäse na:: fc.t; tarnten rait einer Deletion im Epi-taeraoc-Gsri verwandet v&vasn. EäiS-3 Mutanten zeigen weder

1OS/CH -../..

209845/1160

®AD ORIGINAL .

spontan noch nach Beliandlung mit rautagenen Agentien die geringste Reversion. Ferner werden unter diesen Mutanten nur solche ausgewählt, deren Deletion im Epimerase-Gen einen schwachen polaren Effekt auf die distal gelegenen Uridy!»Transferase- und Galactokinase-Gene ausüben. Auch dieser polare Effekt übt einen stabilisierenden Einfluss auf die Mutante aus. (Schutz gegen Mutation zu starker Galactosereslstenz).

Die erfindungsgetnäßse Vakzine zur Vorbe !igung gegen Typhus-Infektionen, die zur oralen Applikation geeignet ist, ist demnach dadurch gekennzeichnet, dass sie lebende, stabile epimeraee-negative Mutanten (« "epimeraseless" Mutanten) von virulenten Salmonella typhi Stämmen enthält. Im besonderen ist sie dadurch gekennzeichnet, dass sie epimerase-negative Deletions-Mutanten von Salmonella typhl mit abgeschwächter GaTactokinase und Galacto-1-Phosphat-Uridyl-Transferase enthalt.

Das Verfahren zur Herstellung der neuen Typhus-Vakzine 1st dadurch gekennzeichnetj dass man spontan auftretende oder durch mutagene Agentien Induzierte stabile Mutanten von virulenten Salmonella typhi Stämmen,' die sich durch einen Defekt im Enzym fe Urldindipho8phat-Galactose~4-Epunerase auszeichnen, selektioniert, Isoliert, kultiviert und anschliessend zum Lebend-Impfstoff verarbeitet.

Im besonderen werden dabei die eplmerase-negatlven Deletlons-Mutanten, welche zudem eine abgeschwächte G&lactokinase und Galacto-l-Phosphat-üridyl-Transferaee-Aktivität aufweisen, und welche sich durch eine absolute Stabilität auszeichnen, isoliert und kultiviert.

106/ΟΪ ../,

20984S/116Q.

Die Selektion der gewünschten epimerase-negativen Mutanten wird dadurch erleichtert, dass roan die Kultur von Salmonella typhi .vorzugsweise nach rautagener Behandlung mit smooth-spezifischen Phagen infiziert. Für diese Phagen weisen die epimerase-negativen Mutanten von Salmonella typhi mit ihrer rough Struktur keine Rezeptoren auf» sind diesen gegenüber also resistent, während die normalen, vlrulenteri smooth Bakterien von diesen Phagen lysisrt werden. Man erzielt damit eine Vorselektion der epimerasenegativen rough Mutanten, was deren Isolierung wesentlich erleichtert. Als sniooth-spezif Ische Phagen werden vorzugsweise solche vom Typ FO-I verwendet.

Die Produktion der Vakzine selbst erfolgt durch Kultivierung der selektlonierten Bakterien und deren Verarbeitung zum Impfstoff, die gewöhnlich in der Abtrennung der Bakterien vom Nährmedium und der Lyophilisation der Bakterieneuepension In einem Schutzmedium besteht.

Eine maximale Stabilität muss von einem Lebend-Impfstoff unbedingt gefordert werden. Es muss auegeschlossen werden können, dasβ sich die Virulenz zurückbildet und die Impfung zu echtem Typhus Anlass geben kann. Dies erreicht man auf folgende Weise: Durch die Benutzung von Deletions-Mutanten kann eine Reversion In die ursprüngliche Wildform definitiv verhindert werden. Ein weiteres kritisches Moment besteht aber darin, dass durch eine Sekundärmutation galactose-resIstente Mutanten zur Sekundärmutante erzeugt werden, welche den Slcherheitnpcniunieffius einer Galactose-Lyse nicht mehr besitzen, um die Gefahr der Sekundärmutation rum vollständig galactose-resistenten Stamm zu vermindern, verwendet man gemäss vorliegender Erfindung solche Mutanten, die zusätzlich teilweise galactose-resistent sind, bei denen also'

106/CH ../..

208845/118$

2128628

die Galactokinase und die Galacto·· i-Phosphat-Uridyl-Transferase· Aktivität von 100% auf bloss ca 107. reduziert ist.

Der neue orale Typhus-Impfstoff aus lebenden Bakterien veist die erhoffte hohe immunisierende Aktivität und die notwendige geringe Virulenz.und eine sichere StabilitSt gegenüber Revers ionen in die Wildform auf.

Prüfung des Impfstoffea

Prinzips

Da Salmonella typhl ausser in Schimpansen in keinem der üblichen Versuchstiere eine echte Infektion hervorruft, ist es umständlich, einen Typhus-Impfstoff zu prüfen. Wird Salmonella typhi Mäusen intraperitoneal Injiziert, vermehren sich diese Keime .zvar nur schwach, werden aber äueserst langsam eliminiert. Da die Fähigkeit, Salotonelien mehr oder weniger rasch inaktivieren su können, der wichtigste Faktor tjx der Immunität gegen Typhus darstellt, wurde die Eliminationsgeschwlndigkciit als Mass für die erreichte Immunität bei den Mäusen verwendet.

Ausführung:

Mäusen wurden subcutan je 10 labende Keime des neuen erfindunge™ gemäsa erhaltenen Vaksine Stammes, der die Bezeichnung Ty S3 trägt, verabreicht. Zu Vergleichszwecken erhielten andere Mause 10 lebende Keime des virulenten Stassnes Ty 2, respektive 10 durch letündigea Erhitzen auf 58° C inaktivierte Keime des gleichen Stammes mit eiy>.er gleichen Dosis 10 Tage- später, als Booster. Keimzahlbestimmungen in Leb-sx* und l'ilz dieser Tiere zeigten, dass

106/CH „./..

209845/1 160 BAD ORIGINAL

die attenulerten Keime des Iiapfstanxaes bereite nach 20 Tagen voll· ständig eliminiert waren, während die Keime dee virulenten Stammes trotz schwächerer Dosierung noch nach 4 Wochen in Konzentrat

2 3
tionen von 10 - 10 in den Mäusen nachweisbar waren.

6 Wochen nach der Impfung wurden die Mäuse lntraperitoneäl mit 10 lebenden Keimen des virulenten Stacsnes Ty 2 belastet. In. diesem Zeitpunkt waren alle Tiere frei von Impfbakterien. Durch KeituzahlbeetInnungen in Leber und Milz der Mäuse wurde das Schicksal dex* Challenge-Bakterien verfolgt. (Tab* 1)

TgbelleJ.

	-	Anzahl Challenge-Bakterien / Leber und Milz	Mäuse mit 106 lebenden Ty 2 Keimen ge impft	Mäuee mit 107 hitzeinakti vierten Ty 2 Keimen ge impft	Unbehan- delte Kontroll- mause
Anzahl Tag· nach Challenge	Mäuse mit 107 Keimen des neuen Vak- zinestamme* Ty SB geimpft	1 ' ΙΟ3 1 · 103	6,5 ■* 1O3 3 ' 104	8 * 103 5 * 104
3 4	4 " 102 1 " 102 .	110	2,5 ' 104	1,5 ' 105
5	60	HO	6 ' 103	1,5 ' 105
6	40	HO	5 ' 103	5 * 104
7	20	<10	3 ' 1O3	4 ' 103
8	30	<xo	1 ' 102	4 * 103
10	UO	<io	1,5 * ΙΟ2	9 · XO3
11	<10	<10	5 * ΙΟ2	1 "' iO4
12	<1O	Schutzwirkung	Kein wirksa mer Schutz
Schutzwirkung

209945/1

Die Konzentration der virulenten Challenge-Bakterien steigt in Leber und Milz unbehandelter Tiere während den ersten 6 Tagen nach dem Challenge leicht bis auf ca 10 Keime an. Nach 12 Tagen sind immer noch 10 Bakterien/Maus nachweisbar.

In den mit dem erfindungsgeraass erhaltenen neuen Impfstoff Ty SB immunisierten Tieren wurden die Challenge-Bakterien ähnlich rasch eliminiert wie in Tieren, die mit dem für Menschen pathogenen virulenten Stamm Ty 2 vorbehandelt - und damit immunisiert -waren.

Dagegen verhalten sich Mäuse, die mit inaktivierten Bakterien des virulenten smooth Stasmes Ty 2, wie sie in heute üblichen Impfstoffen enthalten s£nd, geimpft wurden, nicht wesentlich anders ale die Kontrolltiere. .

Der grosse Fortschritt des neuen erfindungsgemSse erhaltenen Impfstoffes Ty SB gegenüber den herkömmlichen inaktivierten Impfstoffen ist offensichtlich.

Lebende virulente Salmonella typhi Stämme, wie etwa Ty 2, sind als Impfstoffe für den Menschen natürlich unzulässig, da sie, im Gegensatz zu der neuen, völlig gefahrlosen, epiraerase-negatlven stabilen Mutant« Ty SB, beim Menschen echten Typhus aus.Iosen würden. <

Die Schutzwirkung das neuen Impfstoffes Tv SB ist Streng spezifisch: Sie 1st weder wirksam gegen virulente Bakterien anderer Salctonella Spezies noch kann sie durch epimerase-negatlve Mutanten anderer Salmonella Spezies erreicht werden. (Tab. 2 a) und 2 b)).

106/CH ../..

-•9 -

Tabelle 2

a) Belastung mit Salmonella (S.) typhl Ty 2 (pathogen für den Menschen)

	Anzahl Challenge-BaktfTlen / Leber und Mils	Mäuse mit 5 · 105 le benden Keimen der S. typhimurium-epi- meraselese Mutante G 30 geimpft	Kontroll- mäuee
Anzahl Tage nach Challenge	Mäuse mit 2 · 10& le benden Keimen des neuen Vakzinestammee Ty SB geimpft	9 * 104 • 5 * 103 2 # 103 8 · 102 7 * 102	3 * ΙΟ5 7 · 104 5 ·. 103 6 * 102 1 · 103
3 6 9 13 17	ΙΟ3 40 10 10 10	Kein Schutz
	Schutzwirkung

b) Belastung ait Salmonella (S,) typhimurium LT2 (pathogen für Mause)

	Anzahl Challenge-Bakterien / Leber und Milz	Mause mit 5 · 105 lei benden Keimen der S. typhüaurium?epi~ meraseless Mutant!} G 30 geimpft	Kontroll- mfiuee
Anzahl Tage nach Challenge	Mäuse mit 2 · 106 le benden Keimen des netten Vakzinestammes Ty SB geimpft	ΙΟ3 2 ' 103 2 · 102 50 50	4 · 108 2 v ΙΟ9
3 6 9 13 17	2 ' ' 108 1,5 · 109 * *	Schutzwirkung
	Kein Schutz

* Keine überlebende Mäuse

106/CH 2088*5/* 160

Mäuse, die mit: dem neuen Salmonella typhi Impfstoff Ty SB geimpft wurden, find nicht gegen eine Infektion mit dem für Mäuse virulenten Salmonella typhimuriiaa Stann geschützt (2 b). Ebenso verhalten sich Mause, die mit einer "epiraeraeeless" Mutante von Salmonella typhimurlum geimpft wurden, gegen eine Infektion mit Salmonella typhi Ty 2 nicht anders als die KontrollmSuse (2 a).

Die Vorteile einer Lebend-Vakzine aus epimeraee-negativen Mutanten von Salmonella typhi bestehen darin, dass durch eine einzige orale fc Gabe eine sichere, hochgradige, spezifische Immunität gegen die manschenpathogenen Salmonella typhi erzielt werden kann.

Beispiel?

a) Gewinnung des Xapfstanmes.

Der virulent· Salnomlla typhi Stoat» Ty 2 wird in 30 ml Brain Heart Infusion (DIfco) in 100 ml Schtittelkolben bei 37° C angesuchte»t« Nach 4 Stuadtn werden die Bakterlenzallen abzentrlfuglert und in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, so dass dl« Suspension 10⁸ Organismo/al enthält. Diese Suspension wird so lange mit UV-Licht bestrahlt, bis eine SOXlga Abteuung der Bakterien erreicht 1st. Die Bakterienzellen werden daran auf frische Brain Heart Infusion (DIfco) Übertopft u&d bei 37° C auf einer Schüttelaaschiua Inkublert^ Nach 2 Stunden wird die Kultur mit βαοοUh-spezifischen Bacteriophagen des Typs FO-I infiziert (1 Bacterlophag/10 Bakte'rlenzellen) und weitere 3 Stunden inkubiart. !durch diese Behandlung worden alle smooth Bakterien lyalert, und es bleiben nur rough Bakterien zurück.. Diese werden ß\fx Sutrient-Agar auegeplattet und bei 37° C während 14 Stunden inkubiert, öle gebildeten Kolo»d*c

106/CH ../..

werden nun auf Endo-Agar, der an Stelle der Lactose 0,2% Galactose enthält» repliziert. Auf diesem Nährboden sind epimerase-negative Mutanten aufgrund der Kolonien-Wuchs form leicht zu erkennen: Epimerase-negative Mutanten vergären, im Gegensatz zum Wild-Typ, die Galactose nicht, und sie wachsen in typischen farblosen, flachen Kolonien mit schmalem auseerem Wall und konkavem Zentrum, das zum gröesten Teil aus lyslerten Zellen besteht. 30 solcher Kolonien werden isoliert und von diesen diejenigen Deletion»-Mutanten isoliert, die auch nach tautagener Behandlung mit N-Methyl-N*-nitro-N-nitroso-guanidin (NG) keine Reverslon zeigen. Zu diesem Zwecke werden die isolierten Mutanten auf Brain Heart Infusion angezüchtet und nach 6 Stunden mit NG behandelt, um eine 99%ige AbtCtung zu erhalten. [E.A. Adelberg et al, Biochexq.» Biophy. Res. Com. £8, 788 (1965)3. Die überlebenden Zellen Werden nach 2-maligem Abzentrlfugieren und Waschen in Brain Heart Infusion suspendiert, auf einer Schüttelmaschine beil 37° C inkubiert und nach 2 Stunden in frische Brain Heart Infusion,

der 0,1% Galactose zugegeben wurde, überimpft. Wegejn des Defektes la Enzym UDP-Galactose-4-Epimeraae sind epinierase-negative Mutanten nicht in der Lage, di· aufgenommene Galactose zu metabolisieren. Ea kommt zu einer Anreicherung vton Galacto* ee-1-Phosphat und von UDP-Galactose, was innert 3 - jfr Stunden eine vollständige Lyse der epiraerase-negativen Bakterien zur Folge hat. Die Kultur wird dann noch für weitere 3 Stunden inkubiert. Dadurch wird das Aufkommen auch seltener. Revertonten stark gefördert. Die Überlebendan Bakterien werden dann auf galactosehftltige Eudo-Agar ausgeplattet· und 14 Stunden bei 37° C bebrütet« Eventuelle Revertanten sind auf diesem Nährboden leicht als.gaiactose-verglrende dunkelrote Kolonien sjrkenner«. Sämtliche Mutanten, die bei diesem Jhssserst sen-

tlblen Test auch nur die geringste Reversion zeigen, werden verworfen. Für die folgenden Enzymteets werden nur diejenigen Mutanten selektioniert, die keine Reversion gezeigt haben.

Ale letzter Test wird von diesen voreelektlonierten Mutanten die Aktivität der Enzyme des Leloir-Galactosestoffwechsels bestlnat [H. Nikaldo: Blochim, Biophys. Acta 48, 460-469 (1961)] und nur Mutanten eelektloniert, die keine Aktivität der UDP-öalactose-4-EplineraBe mehr aufweisen und deren Galactokinase und Galactose-1-Phosphat-Urldyl-Transferase Akt!· vltfit noch ca 10% der Aktivitäten dee Wildstammes besitzt. (Tab. 3)

Tabelle 3

	Aktivitäten der Lelolr-Enzyme in paol/ag Protein/Std.	Galactokinase	Galactose-1- Phoephat-üridyl- Transferase
Salmonella typhi Stnsuffi	Epimerase	3,4 0,4	18 2,5
Wildstes» Ty 2 Selektlonierter Impfstdoni	24 0

Die Reduktion der Aktivität der Klnase und Transferase tritt bei Deletlonen la Eplnerase-Getä häufig als polarer Effekt auf die distal gelegenen Klnaee- xmd Transferase-Gene auf. Die Reduktion der Aktivität dieser zwei Enzyme übt ebenfalls einen stabilisierenden Einfluss auf die Mutante aus, indem sie das Aufkommen zu stairk galactoeereslste.iter Sekundänsutanten heomt. (H. Nlkaido: loc. zit.)

106/CH

209845/1160

/IS -

Die auf diese Weise definitiv selektionlerte Mutante wird in Brain Heart Infusion auf einer Schüttelmaschine bei 37° C angezüchtet. Nach 6 Stunden werden die Bakterien in einer Kühlzentrifuge bei 6*000 g.ahzentrifugiert, ohne waschen in einen Schutzmedium - volunenmässig entsprechend dem abgegossenen Ueberstand - bestehend aus 8% Saccharose, I₉5% Gelatine und 5% Magermilchpulver, Suspendiert in je 1 ml dieser Bakteriensuspension in 5 ml Ampullen lyophilislert.

b) Herstellung des Impfstoffes

Eine Lyoampulle des nach a) erhaltenen neuen Impfstammes wird geöffnet und der Stemm auf Nutrlent-Schr&gagar bei 37° C angezüchtet. Die Bakterien werden von der Oberflache der Schrägagarkultur gewonnen und in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Mit dieser Zellsuspension wird der Inhalt eines 1 Liter Erlenmeyerkolbene beimpft. Dieser enthält 600 ml Nährlösung, hergestellt durch Auflösen von 28 g Casein-Hydrolysac, 10 g Hefeextrakt und 2 g Glucose in 1 Liter destilliertem Wasser und Einstellen des pH mit 1 η N&OH-Lösung auf 7,2. Der Erlenaeyerkolben wird 6 Stunden bei 37° C geschüttelt. Die erhaltene Bakterienkultur wird auf 25 Liter, wie oben hergestellte Nährlösung, überimpft. Die Kultur wird unter Belüftung (5 Liter Luft/Min,) bei 37° C wihrend 12 Stunden bebrütet. Das Wachstum der Vor- und der Hauptkultur wird nephelometrlsch verfolgt. Durch periodische Kulturproben wird die Reinheit geprüft. Am Ende der Kulturperlod« werden dl« Bakterienzellen in einer Kühlzentrifuge bei 6*000 g absentrlfugiert, ohne ache» in /v/ 600 ml des unter a) beschriebenen Schutzmediums ßUBpandlert und in 1 ml Portionen in 5 ml Ampullen oder Stechflaschen lyopnlliaiert.

106/ΓΗ ../.,

c) Anwendung des Impfstoffes

Die Ampullen oder Stechflaschen werdan geöffnet, der Inhalt wird In 3 -5 ml kaltem oder lauwarmem Wasser oder Milch suspendiert und oral verabreicht.

106/CH · ../..

Claims (11)

PATENTANSPRÜCHE;

1. Vakzine zur Vorbeugung gegen "yphusInfektionen, geeignet zur oralen Applikation, dadurch gekennzeichnet, dass sie lebende, stabile, epitnerase-negative Mutanten von virulenten Salmonella typhi Stanraen enthält»

2. Typhue-Vakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie epimerase-negative Deletione-Mutanten von Salmonella typhi enthält,

" t

ι ·

3. Typhus-Vakzine nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie epiraerase-negative Deletions-Mutanten von Salmonell.i typhi mit abgeschwächter Galactoklnase und Galacto-1-Phospha :- Uridyl-Transferase enthält.

4. Verfahren zur Herstellung einer Typhue-Vakzine geeignet zur oralen Applikation, dadurch gekennzeichnet, dass man sponten auftretende oder durch autagene Agentien induzierte stabile Mutanten von virulenten Salmonella typhi StSnmen, die sich durch einen Defekt im Enzym UridindiphosphAt-Galactose-4-Epinierace auszeichnen, selektioniert, isoliert, kultiviert und anschliessend zum Lebend-Impfstoff verarbeitet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man von den selektionierten eplmerase-negativen Hbitenten ausschliaselich die Deletions-Mutenten isoliert.

6. Verfahren nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dees men von den Deletions-epimeraselesa-Mutenten nur solche

106/CH .o/.o

21286|6

für die Kultivierung verwendet, welche eine abgeschwächte Galactokinase und Galacto-l-Phosphat-Uridyl-Transferase-Aktivität aufweisen und sich durch eine maximale Stabilität auszeichnen«

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kultur von Salmonella typhi vorzugsweise nach mutagener Behandlung mit smooth»spezifischen Phagen infiziert, dadurch

. eine Vorselektion der epimerase-negativen rough Mutanten erzielt und deren Isolierung erleichtert.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man dazu Phagen vom Typ FO-I verwendet.

9. Verfahren zur Produktion einer oralen Typhus-Vakzine, dadurch gekennzeichnet, dass men stabile epimerase-negative Mutanten von virulenten Salmonella typhi Stämmen kultiviert und zum Lebend-Impfstoff verarbeitet.

10« Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man dazu ©pimerase-negativ® Delstlons-Mutanten verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man dazu epimerase-negative Deletions"Mutanten mit abgeschwächter Galactokinase und Galacto-1-Phosphat-Uridyl-Transferase verwendet.

SCHWEIZERISCHES SERUM- UND IMPFINSTITUT UND INSTITUT ZUR ERFORSCHUNG DER INFEKTIONSKRANKHEITEN

203845/1160