HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Bereich der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft Bordetella-Pertussis-
Abarten, die ein nicht-toxisches, jedoch immunisierendes
mutiertes Pertussis-Toxinprotein erzeugen, welches für die
Herstellung eines neuen Pertussis-Impfstoffs verwendet
wird.
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Im einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung eine
Bordetella-Pertussis-Abart der Phase I, welche nicht die
toxische Wirksamkeit des Pertussis-Toxins aufweist, jedoch
ein Partialantigen-Protein erzeugt, welches die Bildung
eines Antikörpers zur Neutralisierung der biologischen
Wirksamkeit von Pertussis-Toxin induziert.
2. Beschreibung des verwandten Fachgebiets
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Das Pertussis-Toxin hat ein Molekulargewicht von ungefähr
107 KDa und besteht aus zwei funktionell verschiedenen
Teilen (A und B) als dem bakteriellen Toxin, wie
beispielsweise Diphterie-Toxin und Cholera-Toxin. Man nimmt
an, daß der Teil A (Untereinheit I, S1) bei der
NAD-abhängigen ADP-Ribosyltransferase-Aktivität eine Rolle spielt,
und daß Teil B (Untereinheit 2, 3, 4(2), 5, S2, S3, S4,
S5) bei der Anbindung an Targetzellen beteiligt ist. Eine
Anzahl seiner im folgenden genannten physiologischen
Aktivitäten sind bekannt, nämlich eine
Leukozytose-begünstigende Wirksamkeit, eine Aktivität zur Sensibilisierung
gegen
Histamin, eine die Langerhans'schen Inseln anregende
Aktivität, eine Adjuvans-Aktivität, eine
Mitogen-Aktivität, eine die Freisetzung von Glycerin bewirkende
Aktivität, eine die Gefäß-Permeabilität anregende Aktivität und
eine CHO-Zellen-Anhäufungs-Aktivität. Aufgrund dieser
physiologischen Aktivitäten betrachtet man das
Pertussis-Toxin als einen wichtigen krankheitsauslösenden Faktor beim
Auftreten von Keuchhusten, wobei eine Infektion bei
Kleinkindern gefährliche Auswirkungen hat. Dementsprechend wird
das Pertussis-Toxin als ein für die Herstellung eines
entsprechenden Pertussis-Impfstoffs wichtiges Schutz-Antigen
betrachtet.
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Generell ist die Eliminierung seiner toxischen Aktivität
und die Beibehaltung seiner Antigenität zur Gewährleistung
der Sicherheit bei der Herstellung eines
Pertussis-Impfstoffs wichtig, welcher aus einem solchen toxischen
Protein besteht, und dementsprechend wird das Toxin mittels
Agenzien wie beispielsweise Formal in oder Glutaraldehyd,
welche den Lysinrest modifizieren, entgiftet, (d. h.
Toxoid-Bildung). Ein kürzlich erschienener Bericht über das
Klonen des Gens für Pertussis-Toxin hat jedoch gezeigt,
daß an der aktiven Stelle (d. h. NAD-abhängige
ADP-Ribosyltransferase) aufgrund der ursprünglichen toxischen
Aktivität kein Lysinrest enthalten ist, und dies bedeutet, daß
durch die bisher verwandte Methode zur Toxoid-Bildung das
Pertussis-Toxin nicht ausreichend inaktiviert wird. Unklar
ist, ob die verbleibende toxische Aktivität auf den
menschlichen Körper Auswirkungen hat oder nicht. Zur
Vermeidung der oben genannten Probleme ist daher die
Entwicklung eines Pertussis-Toxoids erforderlich, welches keine
biologischen Aktivitäten aufweist, aber einen Antikörper
zur Neutralisierung der biologischen Aktivitäten von
Pertussis-Toxin induziert.
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In jüngster Zeit sind Verfahren aus der Biotechnologie,
insbesondere Verfahren der genetischen Manipulation, für
die effiziente Massenherstellung von nützlichen,
physiologisch aktiven Proteinen verwendet worden. Wie im
vorangegangenen bereits gesagt, wird das Gen für das Pertussis-
Toxin ebenfalls geklont, und manche Expressionen werden
unter Verwendung von E. coli durchgeführt.
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Nichtsdestotrotz besteht gegenwärtig dieses
Pertussis-Toxin aus fünf Untereinheiten und die Herstellung des neu
kombinierten Pertussis-Toxins durch E. coli erfolgt
innerhalb der Zellen. Daher bleiben viele Probleme der
industriellen Herstellung ungelöst.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Zur Lösung der oben genannten Probleme verwendeten die
betreffenden Erfinder Mutagene, um Abarten zu erhalten,
welche ein toxisches Pertussis-Toxin erzeugen, und unter
vielen Abarten wählten sie diejenigen Bordetella-Pertussis-
Abarten aus, welche ein mutiertes Pertussis-Toxinprotein
mit teilweise fehlenden Untereinheiten erzeugen, und ihre
im folgenden aufgeführten Erkenntnisse führten zu der
vorliegenden Erfindung: Das von der Abart erzeugte mutierte
Pertussis-Toxinprotein besaß die Fähigkeit, einen die
biologische Aktivität von Pertussis-Toxin neutralisierenden
Antikörper zu induzieren, und bei
Infektionsmodellversuchen unter Verwendung von Mäusen in-vivo zeigte dieser
Antikörper dieselbe Schutzwirkung wie der durch Pertussis-
Toxoid induzierte Antikörper.
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Die vorliegende Erfindung schafft eine
Bordetella-Pertussis-Abart, welche ein mutiertes Pertussis-Toxinprotein mit
teilweise fehlenden Untereinheiten erzeugt, wobei
insbesondere mindestens die Untereinheit S1 fehlt. Eine der
Abarten der vorliegenden Erfindung ist im Fermentation
Research Institute, Agency of Industrial Science and
Technology (1-3, Higashi I-chome, Tsukuba-shi,
Ibarakiken, Japan) als Bikoken Kinki Nr. 9428 (FERM P-9428) am
23. Juni 1987 hinterlegt und am 2. Juni 1988 in eine
internationale Hinterlegung unter der Nummer FERM BP-1902
umgewandelt worden.
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Beim Züchten der erfindungsgemäßen Abarten kann ein
mutiertes Pertussis-Toxinprotein mit teilweise fehlenden
Untereinheiten, insbesondere mindestens ohne Untereinheit
51, von der Kultur geerntet werden. Während des
Kultivierens der Abart wird vorzugsweise Cyclodextrin oder ein
Derivat hiervon dem Medium zugegeben. Das solchermaßen
erhaltene mutierte Pertussis-Toxinprotein mit teilweise
fehlenden Untereinheiten wird bei der Herstellung von
Pertussis-Impfstoff verwendet, wobei herkömmliche Verfahren
verwendet werden.
KURZE ERLÄUTERUNG DER ZEICHNUNGEN
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Fig. 1 zeigt die nach Ablauf einer Zeitspanne bei (a) dem
Wachstum jeder erfindungsgemäßen Abart in dem flüssigen
Nährmedium, (b) den in den Überständen der Kulturen
beobachteten Aktivitäten der CHO-Zell-Anhäufungen, bzw. (c)
den mit Anti-PT-Antikörper reagierenden Substanzen jeweils
aufgetretenen Veränderungen;
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Fig. 2 zeigt die SDS-PAGE von Proteinen, welche von der
erfindungsgemäßen Abart erzeugt wurden; und
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Fig. 3 zeigt die Ergebnisse einer Immunoblot-Analyse von
erfindungsgemäßen Proteinen.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
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Die Verfahren zur Auswahl der Abarten, die
charakteristischen Merkmale der Abarten und die Eigenschaften der gemäß
der vorliegenden Erfindung erzeugten Proteine werden im
folgenden ausführlich unter Bezugnahme auf Beispiele
beschrieben.
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Vor der Beschreibung der Beispiele sollen jedoch die
verwendeten Materialien und angewandten Verfahren beschrieben
werden.
(1) Verfahren für die Kultivierung von Bordetella
Pertussis
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(i) Kultur im flüssigen Nährmedium
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Bordetella Pertussis der Phase I vom Stamm Tohama wurde
unter Schütteln in einem flüssigen
Stainer-Schalte-Nährmedium, welchem Dimethyl-β-Cyclodextrin (CLM) zugegeben
worden war, bei 35ºC 36 Stunden lang kultiviert.
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(ii) Kultur auf dem festen Nährmedium
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Ein Medium, bei welchem eine 1,5%ige Agarlösung dem oben
genannten CLM zugegeben worden war, wurde als das feste
Nährmedium verwendet und der Tohama-Stamm bei 35ºC 5 bis 7
Tage lang kultiviert. Nachdem das Obengenannte gesiebt
worden war, wurde flüssiges Nährmedium gleichmäßig in eine
jede Vertiefung einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen
verteilt und dann unter Schütteln bei 35ºC 36 Stunden lang
kultiviert.
(2) Bestimmung der CHO-Zellen-Anhäufungsaktivität
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Da schon eine extrem geringe Menge von Pertussis-Toxin
(30 pg/ml) die Anhäufung von CHO-Zellen bewirkt, wird die
Anwesenheit von toxischer Aktivität durch dieses Verfahren
überprüft. CHO-Kl-Zellen, welche in einer Menge von
5·10³/200 ul/Vertiefung gleichmäßig in jede Vertiefung
einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen verteilt worden
waren und wozu 10 ul des Überstands des Kulturmediums der
Abart (oder des Standard-Pertussis-Toxins) zugegeben
worden waren, wurden in 5%igem C=&sub2; bei 37ºC über Nacht
kultiviert. Dann wurde das Ausmaß der Anhäufung (mit 3, 2, 1, 0
bewertet), beobachtet und die jeweilige Aktivität im
Vergleich zu dem Test-Toxin bestimmt.
(3) Bestimmung der die Leukozytose-begünstigende
Aktivität, der die Langerhans'schen Inseln anregenden
Aktivität und der Aktivität zur Sensibilisierung gegen
Histamin:
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Einer vier Wochen alten ddy-Maus (SPF) wurden 0,2 ml der
Probe intravenös injiziert und für die Bestimmung der
Leukozytose-begünstigenden Aktivität wurden nach drei Tagen
die peripheren Leukozyten von der Maus gesammelt und
gezählt. Was die Aktivität zur Anregung der Langerhans'schen
Inseln betrifft, wurde das Insulin in dem von einer Maus,
die über Nacht hungern gelassen und welcher nach der
Messung der Leukozytose-begünstigenden Aktivität 0,5 ml einer
30%igen Glukoselösung in den Bauchraum verabreicht wurde,
entnommenem Blut mittels RI oder ELISA gemessen. Die
Messung der Aktivität zur Sensibilisierung gegen Histamin
wurde durch Messen der Rektaltemperatur nach 30 Minuten
oder durch Feststellen, ob die Maus, welcher 0,5 ml
Histamin (4 mg/ml) in den Bauchraum injiziert worden war, nach
2 Stunden lebte oder tot war, durchgeführt, gefolgt von
der Messung der Leukozytose-begünstigenden Aktivität. Bei
der Messung der neutralisierenden Wirksamkeiten des
Antikörpers für diese drei Aktivitäten wurden gleiche Mengen
von 1 ug/ml Pertussis-Toxin und den Antikörpern vermischt,
um bei Raumtemperatur 30 Minuten oder länger zu reagieren,
0,2 ml jeder Mischung wurden Mäusen (4 Wochen alt)
intravenös injiziert, und die jeweilige neutralisierende
Wirksamkeit wurde von der Aktivität berechnet, welche durch
Messen der Wirkung auf jede Maus erhalten wurde.
(4) Bestimmung von Pertussis-Toxin und mutiertem
Pertussis-Toxinprotein:
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Für die Bestimmung wurde das ELISA-Verfahren verwendet und
die Messung von Pertussis-Toxin und mutiertem Pertussis-
Toxinprotein wurde durch ein herkömmliches Verfahren unter
Verwendung einer Mikroplatte, welche mit poly- oder
monoklonalen Antikörpern gegen Pertussis-Toxin überzogen war,
ausgeführt.
(5) SDS-PAGE und Immunoblot:
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Pertussis-Toxin oder Proben, welche mit 0,1%igem SDS ohne
Reduziermittel behandelt wurden, wurden auf 5% Haftgel und
15% Trenn-Gel getrennt, dann auf eine
Nitrozellulosemembran aufgetragen, um mit polyklonalen Antikörpern zu
reagieren, und wurden dann mit HRPO-Anti-Maus-IgG umgesetzt
und die Substrate eingefärbt.
Beispiel 1
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Der Tohama-Stamm von Bordetella Pertussis der Phase I
wurde durch ein herkömmliches Verfahren kultiviert und durch
Zentrifugieren gesammelt. Die Bakterien wurden sodann in
einer Tris-Malat-Pufferlösung suspendiert, bis sie eine
Zellkonzentration von 10¹&sup0; Zellen/ml erreichten, dieser
Suspension wurde sodann Nitrosoguanidin als Mutagen in
einer Gesamtkonzentration von 25 bis 50 ug/ml zugegeben und
das Ganze 60 Minuten lang geschüttelt. Diese Behandlung
verringerte die Anzahl von lebenden Bakterien auf ungefähr
1/10000. Nach dem Sammeln in dem flüssigen Nährmedium
mittels Zentrifugieren und angemessener Verdünnung mit dem
Medium gemäß der Anzahl der lebenden Bakterien wurden die
Bakterien auf Platten auf dem festen Nährmedium 5 bis 7
Tage lang kultiviert. Die Kolonien auf den Platten wurden
aufgesammelt, in das flüssige Nährmedium eingesät und
unter Schütteln 48 Stunden lang kultiviert. Unter Verwendung
des Überstands der Kultur wurde die Produktivität anhand
der CHO-Zell-Anhäufungsaktivität geschätzt und die
Erzeugung des mit dem Antikörper reagierenden Proteins wurde
anhand von ELISA unter Verwendung eines Anti-Pertussis-
Toxin-Antikörpers (aPT) festgestellt.
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Ungefähr 12000 Abarten der Kolonien wurden überprüft und
in die folgenden drei Gruppen unterteilt:
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(1) CHO-Zell-Anhäufungsaktivität negativ und
aPT-Aktivität, festgestellt durch ELISA, negativ;
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(2) CHO-Zell-Anhäufungsaktivität negativ und
aPT-Aktivität, festgestellt durch ELISA, positiv;
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(3) CHO-Zell-Anhäufungsaktivität positiv und
aPT-Aktivität, festgestellt durch ELISA, positiv.
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Fig. 1 zeigt die im Lauf der Zeit jeweils aufgetretenen
Veränderungen beim Wachstum jeder repräsentativen Abart in
dem flüssigen Nährmedium, bei den in den Überständen der
Kulturen beobachteten CHO-Zell-Anhäufungsaktivitäten, und
bei den mit dem PT-Antikörper reagierenden Substanzen.
Dabei wurde festgestellt, daß die Abart 79G keine CHO-Zell-
Anhäufungsaktivität, welche eine der Wirksamkeiten von
Pertussis-Toxin darstellt, aufweist, doch daß sie mit dem
polyklonalen Antikörper gegen Pertussis-Toxin reagiert,
wie in Fig. 1 gezeigt.
Beispiel 2
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Bordetella Pertussis wird durch das Phänomen der
Phasenvariation gekennzeichnet, wobei der Wildtyp (d. h. die
krankheitserregenden Bakterien) als Bakterien der Phase I
bezeichnet wird und wobei der nicht-toxische Typ als
Bakterien der Phase III oder Phase IV bekannt ist; diese
Einteilung erfolgt aufgrund des Serotyps. Dann wurden zur
Erforschung der bakteriologischen Merkmale jeder Abart die
Toxizität bei Mäusen durch Einimpfen dieser Abarten in
deren Gehirn (ic-Toxizität), die Produktion von
nicht-hitzebeständigem (Hautnekrose verursachendem) Toxin (DNT) und
die Serotypen von Agglutinin untersucht. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 1 gezeigt. Diese Daten zeigen, daß die
erwünschte Abart 79G eine Abart von Bakterien der Phase I
und die Abarten 19C und 102B Abarten von Bakterien der
Phase 111 sind. Außerdem weist die Abart 79G bei Mäusen
eine beträchtlich abgeschwächte ic-Toxizität von 2,5·10&sup7;
oder mehr auf.
Tabelle 1: ic-Toxizität, DNT-Produktivität und Serotypen
der Abarten (lebend)
Stamm Virulenz (ic) Serotyp Tohama
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Anmerkung: Die Letaldosis LD&sub5;&sub0; wurde aus der
Sterblichkeitsziffer von 6 Wochen alten ddy-Mäusen berechnet, zwei
Wochen nach einer Impfung mit 0,005 ml des seriell
verdünnten Mediums, in welchem die Abarten 20 Stunden lang
kultiviert worden waren.
Beispiel 3
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Hierbei wurde festgestellt, ob jede Abart die biologischen
Wirksamkeiten aufweist, welche vom Pertussis-Toxin
herrühren, d. h. die Leukozytose-begünstigende Aktivität (LP),
die Aktivität zur Anregung der Langerhans'schen Inseln
(IA) und die CHO-Zellen-Anhäufungsaktivität, in dem
kultivierten Überstand; dabei wurden gemäß der herkömmlichen
Verfahren zur Bestimmung der Aktivitäten von jeder Probe
die Abarten in CLM-Nährmedium 2 Tage lang unter Schütteln
kultiviert, wobei die zentrifugierten Überstände mit 2/3-
gesättigtem Ammoniumsulfat konzentriert wurden. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Dabei wurde festgestellt,
daß die Abart 79G keine Leukozytose-begünstigende
Aktivität und Aktivität zur Anregung der Langerhans'schen Inseln
als Indikatoren der biologischen Wirksamkeit des
Pertussis-Toxins aufwies, jedoch eine Reaktion der polyklonalen
Antikörper gegen Pertussis-Toxin verursachte.
Beispiel 4
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Die folgenden Versuche wurden durchgeführt, um die
Eigenschaften des von der Abart 79G erzeugten Abart-Proteins
aufzuzeigen. Der von dem unter Schütteln kultivierten
Nährmedium der Abart 79G erhaltene Überstand wurde mit
2/3-gesättigtem Ammoniumsulfat konzentriert, und dann
wurde der konzentrierte Kultur-Überstand gegen
PBS-Pufferlösung, welcher 1M NaCl zugefügt worden war, dialysiert, der
Extrakt dem mit Sepharose 4B verknüpften
Anti-PT-Antikörper ausgesetzt und das mit dem Anti-PT-Antikörper
umgesetzte Protein unter Verwendung von 3M KSCN eluiert,
wodurch ein teilweise gereinigtes Abart-Protein (PTMP)
erhalten wurde. Fig. 2 stellt das SDS-PAGE-Muster von PTMP
dar: Dabei werden die Kontrollsubstanz und das Pertussis-
Toxin (PT) links gezeigt und das PTMP auf der rechten
Seite dargestellt. Diese Daten zeigen, daß der
erfindungsgemäßen Abart die der Untereinheit S1 entsprechende Protein-
Bande fehlt. Fig. 3, welche die Muster der jeweiligen
Reaktionsfähigkeit zwischen dem Protein und dem polyklonalen
Anti-PT-Antikörper darstellt, zeigt deutlich das Fehlen
des der Untereinheit S1 entsprechenden Proteins.
Tabelle 2: Biologische Wirksamkeiten der Überstände von
mit den Abarten kultivierten Nährmedien
Stamm PT-Aktivität (%) aPT-ELISA Tohama (wild)
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Anmerkung: 1) CHO-Zell-Anhäufungsaktivität, 2)
Leukozytose-begünstigende Aktivität, 3) Aktivität zur Anregung
der Langerhans'schen Inseln
Beispiel 5
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Hierbei wurde festgestellt, ob der Antikörper gegen das
Abart-Protein in der Lage war, die Bildung des
neutralisierenden Antikörpers gegen das natürlich vorkommende
Pertussis-Toxin
zu induzieren; dabei wurden nach der
Behandlung mit Alaun-Adjuvans die Mäuse mit dem teilweise
gereinigten Abart-Protein immunisiert, und das
Anti-PTMP-Antiserum von den Mäusen erhalten. Danach wurde festgestellt,
ob das Serum die biologischen Wirksamkeiten, insbesondere
die LP-, HS-, IA-, CHO-Zell-Anhäufungsaktivität usw.
neutralisieren konnte. Im Einklang mit dem im voranstehenden
erwähnten Verfahren wurden das Serum (Anti-79G-PTMP) und
das in angemessenem Ausmaß verdünnte Test-PT als eine
Kontrollsubstanz für den Antikörper gegen das natürlich
vorkommende PT bei einem Verhältnis von 1 : 1 vermischt, bei
Raumtemperatur 30 Minuten oder länger zur Reaktion
gebracht und dann den Mäusen (10/Gruppe) verabreicht, um die
jeweilige neutralisierende Wirkung zu ermitteln. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3: Fähigkeit des Anti-79G-PTMP-Antikörpers zur
Neutralisierung der PT-Aktivität in Mäusen
Serum Verdünnung Anti-79G-PTMP Test-Toxin Anti-PT Test-Toxin Test-Toxin PBS
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Der Anti-79G-PTMP-Antikörper wies dieselbe
neutralisierende Wirkung gegen die LP-, HS-, IA- und die
CHO-Zell-Anhäufungsaktivität auf wie der Anti-PT-Antikörper gegen
natürlich vorkommendes PT, und der Grad der jeweiligen
Neutralisation erreichte fast dasselbe Ausmaß. Dies bedeutet,
daß der Anti-79G-PTMP-Antikörper ohne den
Anti-S1-Antikörper in der Lage ist, diese biologischen Aktivitäten
genauso zu neutralisieren wie der Antikörper gegen natürlich
vorkommendes PT mit dem Anti-S1-Antikörper.
Beispiel 6
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Danach wurde die Wirkung des 79G-PTMP-Impfstoffs mittels
herkömmlichem Einimpfen in das Gehirn von Mäusen
festgestellt (ic-Challenge), wobei natürlich vorkommendes PT als
Kontrollsubstanz verwendet wurde. Beide Antikörper wurden
mit Alaun-Adjuvans behandelt, und der ic-Challenge bzw.
Infektionsbelastungsversuch wurde mit einem virulenten
Pertussis-Stamm (18-323) mit 4 Wochen alten Mäusen (10
Mäuse pro Gruppe) 3 Wochen nach der Immunisierung der
Mäuse durchgeführt. Der Prozentsatz der Überlebenden nach dem
Challenge-Versuch ist in Tabelle 4 gezeigt. Durch das
Verfahren, Mäuse einem Infektionsbelastungsversuch
auszusetzen, wurde gezeigt, daß das Antigen 79G-PTMP den Mäusen
ausreichenden Schutz gewährte.
Tabelle 4: Prüfung der Impfschutzwirkung von 79G-PTMP in
Mäusen mittels ic-Challenge
Antigen Immun. Dosis Überlebende ug/Maus
Beispiel 7
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Um die Wirksamkeit des 79G-PTMP-Impfstoffs zu prüfen,
wurde der passive Impfschutz an neugeborenen Mäusen nach 3
Tagen unter Verwendung des Anti-79G-PT-Antikörpers durch
Challenge mit einer tödlichen Dosis Aerosol getestet. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Der Aerosol-
Challenge bei Mäusen zeigte, daß Anti-79G-PTMP eine
ähnliche Schutzwirkung hat wie diejenige von Anti-PT.
Tabelle 5: Prüfung des passiven Impfschutzes des Anti-79G-
PT-Antikörpers gegen Challenge mit tödlichem
Aerosol
Antikörper Dosis pro Maus¹ Prozentsatz der Überlebenden
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Anmerkung: 1) Die jeweilige Dosis ist in
PT-ELISA-Einheiten angegeben.
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2) Anzahl der überlebenden Mäuse/Gesamtzahl
der Mäuse 21 Tage nach dem Aerosol-Challenge.
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3) Die jeweilige 50%ige Impfschutzdosis
(PD&sub5;&sub0;) ist in PT-ELISA-Einheiten angegeben. Der jeweilige
Vertrauensbereich von 95% ist in Klammern angegeben.