DE2220053C3 - Mittel zur aktiven und passiven Immunisierung gegen die toxischen Effekte von Infektionen durch Elastase bildende Bakterien und Verfahren zur Herstellung derselben - Google Patents
Mittel zur aktiven und passiven Immunisierung gegen die toxischen Effekte von Infektionen durch Elastase bildende Bakterien und Verfahren zur Herstellung derselbenInfo
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Description
Gegenstand der Erfindung sind ein Mittel zur aktiven und passiven Immunisierung gegen die toxischen
Wirkungen von Infektionen durch Elastase bildende Bakterien und ein Verfahren zur Herstellung desselben.
Die Bedeutung von Elastase bildenden Bakterien als Pathogen bei einer Vielzahl von Infektionen ist im Laufe
der Jahre erheblich gestiegen. Besondere Bedeutung hat das zunehmende Auftreten von Pseudomonas-Infektion
bei Leukämie-Patienten oder im Anschluß an schwere Verletzungen oder Verbrennungen, wobei der natürliche
Schutzmechanismus gegen bakterielle Infektion gestört ist. Pseudomonas-Infektion ist in solchen Fällen
eine schwere Komplikation, da sie einen durch ihre Elastase induzierteii nekrotisierenden Effekt auf Gefäß-
und Bindegewebe hat.
Im Ganzen gesehen sind Antibiotika gegen manifeste Pseudomonas-Infektion unwirksam. Vaccine sind hergestellt
worden, jedoch infolge ihrer Ableitung von somatischen Antigenen von geringem Wert gegen
andere Stämme des gleichen Organismus. Außerdem enthalten solche Vaccine äußerliches Zellmaterial,
welches allergenische Reaktionen induzieren kann, und Proteasen vom Organismus können die Abwehrmechanismen
des Empfängers zerstören, falls sie nicht neutralisiert sind.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, verbesserte Antigene und Immunseren zur aktiven und passiven
Immunisierung gegen die toxischen Wirkungen einer Infekton durch elastasebildende Bakterien sowie
Verfahren zu deren Herstellung zu schaffen.
Es wurde gefunden, daß die toxischen Wirkungen einer Infektion durch elastasebildende Bakterien, wie
r> Pseudomonas, durch Immunisieren geeigneter Tiere
gegen bakterielle Elastase unter Verwendung von bakterieller Elastase als Antigen auf ein Mindestmaß
verringert werden können.
Die gestellte Aufgabe wird daher gelöst durch ein
ι» Mittel zur parenteralen aktiven oder passiven Immunisierung
gegen die toxischen Wirkungen einer Infektion durch elastasebildende Bakterien, das erfindun^sgemäß
dadurch gekennzeichnet ist, daß es gereinigte Bakterienelastase als Antigen in einem pharmazeutisch
ι r> geeigneten flüssigen Träger, gegebenenfalls mit einem
Adjuvans, enthält.
Ein Verfahren zur Herstellung desselben ergibt sich aus dem Unteranspruch.
Zur aktiven Immunisierung wird das erfindungsgemäße Mitte! zur Verringerung der toxischen Wirkungen
von Infektion durch elastasebildende Bakterien, eine gereinigte Bakterienelastase als Antigen, parenteral
einem geeigneten Tier in einer genügenden Menge verabreicht, um im Tier Antikörperbildung hervorzuru-
2) fen.
Die Erfindung wird erläutert durch die folgende Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen. Die
Beschreibung bezieht sich besonders auf Pseudomonas-Organismen, jedoch dienen die erfindungsgemäßen
ίο Mittel auch zur Immunisierung geeigneter Tiere gegen
die toxischen Wirkungen von Infektionen durch andere elastasebildende Organismen.
Die meisten, wenn nicht alle virulenten Stämme von Pseudomonas aeruginosa bilden eine Protease, die
elastolytische Aktivität zeigt. Das als Elastase bezeichnete Enzym ist spezifisch und von Stamm zu Stamm
sehr wenig verschieden. Zwar treten geringere Species-Unterschiede bei der Elastase auf, jedoch findet sich im
Genus Kreuz-Antigenität gemeinsames Band.
Die meisten Bakterienvaccine, einschließlich polyvalenter Vaccine, sind von somatischen Antigenen
abgeleitet und daher von geringem Wert gegen Stämme des Organismus, die nicht in die Vaccinherstellung
eingeschlossen wurden. Im Gegensatz zu den bisher üblichen Vaccinen ist das erfindungsgemäße Antigen
von stamm- und species-spezifischen somatischen Antigenen frei und unabhängig. Durch Anwendung der
erfindungsgemäßen Mittel können also darauf ansprechende Tiere nicht nur gegen bestimmte elastasebildende
Bakterien sondern gegen die toxischen Wirkungen der Elastase als solche immunisiert werden.
P. aeruginosa-Elastase kann nach der Methode von Morihara u. a., Journal of Biological Chemistry, Band
240, Seite 3295 (1965) hergestellt und gereinigt werden.
Wie von Johnson u.a. in Vanadian Journal of Microbiology, Band 13, Seite 711 (1967) berichtet,
werden bessere Ausbeuten an Elastase erhalten, wenn der Organismus auf einem Agarmedium kultiviert und
die Elastase aus dem Agar extrahiert wird. Es kann nicht stark genug betont werden, daß die erfindungsgemäß
hergestellte und benutzte Elastase sorgfältig gereinigt sein muß.
Nach Prüfung zahlreicher Abwandlungen ist die beste erfindungsgemäße Methode zur Isolation und Reinigung
von Elastase, die Folgende:
Impfkulturen von bekannten Elastase erzeugenden Stämmen von Pseudomonas aeruginosa werden 12
Stunden in Rinderbouillon oder einem anderen flüssigen
Nährmedium gezüchtet, und diese Kulturen werden zum Impfen von fester Tryptase (Trypticase) benutzt
Nach 18 bis 24 Stunden Brüten bei 300C werden die an der Oberfläche gewachsenen Zellen geerniet, in
0,15 M KCl suspendiert, mit Glasperlen geschüttelt, und
die Zellreste werden abzentrifugiert Die rohe Elastase wird durch Zugabe von vier Volumen kaltem Äthanol
gefällt. Nach 12 Stunden Aufbewahren unter Kühlung auf 5°C wird das gefällte Material durch Zentrifugieren
bei hoher Geschwindigkeit abgetrennt und in einem Volumen Wasser gleich einem Zehntel des ursprünglichen
Zellextraktvolumens gelöst. Das lösliche Material wird gegen 0,002 M Phosphatpuffer von pH 7,5
dialysiert und dann auf zuvor mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gesetzte Säulen von Diäthylaminoäthylcellulose
aufgebracht. Die Säulen werden bei 5° C mit linearen Selzgradienten entwickelt, die aus dem
obigen Gleichgewichtspuffer und einem gleichen Volumen von 0,03 M Phosphatpuffer ebenfalls von pH
7,5 hergestellt sind. Die unter Verwendung dieses Ionenaustausch-Chromatografieverfahrens erhaltene
Elastase erfüllt gewöhnlich die immunochemischen und physiochemischen Reinheitsbedingungen. Das Verfahren
kann wiederholt werden, falls erforderlich.
Die gereinigte Elastase wird in physiologischer oder geupfferter Salzlösung in einer Konzentration von etwa
1 mg Elastase pro ml Salzlösung suspendiert. Die Suspension hat eine spektrophotometrische optische
Dichte von 2,8 bei 420 rnu. Die Vorratslösung wird dann
in einer Verdünnungsreihe auf die gewünschten Testkonzentrationen verdünnt, um die Suspension des
erfindungsgemäßen Mittels (Antigens) zu erhalten.
Nachweis der Wirksamkeit des Mittels
Ein Milliliter der verdünnten Suspension des Mittels welche Freund's vollständiges Adjuvans enthält, wird
intraperitoneal in einer Dosis oder wiederholten Dosen
ίο Laboratoriumsmäusen, die etwa 13 bis 15 g wiegen,
verabreicht 11 oder 12 Tage später werden die dann etwa 22 bis 25 g wiegenden Mäuse durch intraperitoneale
Verabreichung einer einen virulenten Stamm von P. aeruginosa enthaltenden Suspension infiziert (challenged),
der durch Züchten des Organismus in einer Rinderbouillon-Nährlösung während etwa 4 bis 5
Stunden und Verdünnen in einer Verdünnungsreihe mit 4% Magenschleim (gastric mucin) hergestellt wurde.
Wenn der Tod eintritt, ist das gewöhnlich innerhalb 48 Stunden nach der Infektion der Fall, und es wird gezeigt,
daß er durch die Infektion mit dem infizierenden Organismus verursacht ist.
Wie zu erwarten wird die Immunität durch Verabreichung
wiederholter Dosen der Antigen enthaltenden Suspension erhöht. Die Ergebnisse, die bei Tests des
Schutzes von Mäusen durch aktive Immunisierung am 4. Tag nach der Infektion erhalten wurden, sind in der
folgenden Tabelle angegeben.
Tag der Im- T;ig der Verdünmunisierimg
Infektion nung des
Immunogens
Immunogens
Überlebensrale bei Injektion von Kuliurvcrdünnungcn
Überiebensralcn nicht immunisierter Knmrnll
tiere bei Injektion von KulturverilüniHmpen
tiere bei Injektion von KulturverilüniHmpen
10
10
10
10
H)
11
18
20
ΙΟ"2 | 6/10 | 8/10 | 7/10 |
ΙΟ"4 | 5/10 | 7/10 | 9/10 |
10 " | 6/10 | 7/10 | 10/10 |
10"8 | 9/10 | 10/10 | 10/10 |
10 2 | 10/10 | 10/10 | 10/10 |
ΙΟ'4 | 8/10 | 9/10 | 8/9 |
ICT6 | 7/10 | 10/10 | 9/10 |
10 s | 9/10 | 10/10 | 10/10 |
10 3 | 8/9 | 6/10 | 9/10 |
ΙΟ"" | 4/10 | 8/10 | 8/10 |
ΙΟ'9 | 7/10 | 6/10 | 7/10 |
10H2 | 2/10 | 6/10 | 6/10 |
0/10 5/10 3/10 7/10
1/10 3/10 3/10 1/10
0/10 0/10 0/10 0/10
Tag der Im- Tag der Verdünmunisicrung Infektion nung des
Immuiiogens
Immuiiogens
Überlebensrate bei Injektion von Kulturverdünnungen Überlebensraten nicht immunisierter Kuiitmlltiere
bei Injektion von Kullurverclünnungen
10"
10"
10" 10"
10"
10 "
11
12
10"'
10~3
KT5
10~3
KT5
ΙΟ"6
10"8
lo-io
lo-io
10"12
6/9
2/10
6/10
9/10
8/9
6/10
7/10
8/9
6/10
7/10
9/10 6/10 9/10
9/10
8/10
8/10
10/10
10/10
10/10
10/10 2/10
1/10
2/10
3/10
7/10
0/10
7/10
6/10
1-orb.cl/iiim
Tag der Immunisierung
Tag der
Infektion
Infektion
Verdünnung des
Immunogens
Immunogens
Überlebensrale bei Injektion von Kulturverdünnungen Überlebensraten nicht immunisierter Kunlrollliere
bei Injektion von Kulturverdünnungen
10
10
10
10
10
10
11
10 '
10 "
10 *
10 "
10 "
10 *
10 "
10 3
10 "
10 "*
10 l:
10 "
10 "*
10 l:
6/9
5/9
2/9
2/10
7/10
6/10
7/10
8/10
5/lü S/10 2/10 5/9
6/10 10/10 10/10
9/9
0/9
0/10
0/9
5/10
0/10
0/10
3/10
4/10
In allen Versuchsreihen, außer der zuletzt aufgeführten, war die Elastase erhalten vun P aeruginosa
Hab's-Typ 0 : G-Stamm 332—1369. in der letzten Reihe
war die Elastase erhalten von Hab's Typ 0 :10-Stamm B
319. Der Infektionsorganismus war in der ersten, zweiten, dritten und letzten Reihe der homologe Stamm
332, in der vierten und fünften Reihe war der Infektionsorganismus Hab's Typ 0:10-Stamm 319, in
der vorletzten Reihe war der Infektionsorganismus Hab's Typ 0 :2-Stamm 112. Die beiden letzten Stämme
sind besonders virulente Stämme, die kürzlich von schwerkranken Patienten isoliert wurden.
Immunserum wurde hergestellt, indem man Kaninchen intramuskulär 1 ml einer Adjuvans enthaltenden
1/1280 Verdünnung von Elastase von P. aeruginosa Hab's Typ 0 :6-Stamm 332—1369 injizierte. Diese Dosis
wurde 3 Wochen nach der ersten Impfung wiederholt, und Booster-Injektionen mit einer Verdünnung von
1/2560 wurden jede Woche danach gegeben. Es wurden Blutproben entnommen und Serum hergestellt und auf
seine Wirkung bei der passiven Immunisierung von Mäusen gegen Infektion geprüft, wie oben beschrieben.
Bei 18 Stunden Infektion mit dem homologen Stamm schützen 0,5 m! des Kan'mchenserums bei einer Verdünnung
von 1/320 die infizierten Mäuse gegen 100 χ Minimum-Lethaldosis.
Die gleiche Menge Serum mit einer Verdünnung von 1/80 schützte die infizierten Mäuse
gegen 1000 χ Minimum-Lethaldosis. Bei Infektion mit einem Stamm von heterologem Serumtyp, schützten
0,5 ml des Kaninchenserums bei einer Verdünnung von 1/20 die infizierten Mäuse gegen eine 100 χ Minimum
Lethaldosis. Die gleiche Menge von 1/40 verdünntem Serum bot Schutz gegen eine 10 χ Mindestlethaldosis
des infizierenden Organismus.
Die Immunogen enthaltende Suspension muß dem zu schützenden oder als Quelle für Immunserum eingesetzten
Tier parenteral verabreicht werden. Die Suspension enthält gewöhnlich ein übliches Adjuvans, wie Freund's
vollständiges Adjuvans, um die Antikörperbildung zu fördern. Die Anwendung in der Praxis würde wahrscheinlich
durch subkutane oder intramuskuläre Injektion erfolgen.
Claims (2)
1. Mittel zur parenteralen aktiven oder passiven Immunisierung gegen die toxischen Wirkungen
einer Infektion durch Elastase bildende Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß es gereinigte
Bakterienelastase als Antigen in einem pharmazeutisch geeigneten Träger, gegebenenfalls mit
einem Adjuvans, enthält.
2. Verfahren zur Herstellung des Mittels nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Impfkulturen
von Elastase erzeugenden Stämmen von Pseudomonas 12 Stunden in einem flüssigen Nährmedium gezüchtet werden und mit diesen
Kulturen feste Tryptase geimpft wird, nach 18 bis 24
Stunden Brüten bei 30°C die oberflächlich gewachsenen Zellen geerntet, in 0,15 M KCl suspendiert, mit
Glasperlen geschüttelt und die Zellreste abzenirifugiert
werden, rohe Elastase durch Zugabe des vierfachen Volumens von kaltem Ethanol ausgefällt
wird, nach 12 Stunden Aufbewahren unter Kühlung auf 5°C das gefällte Material durch Zentrifugieren
bei hoher Geschwindigkeit abgetrennt und in einem Volumen Wasser gleich einem Zehntel des ursprünglichen
Zellextraktvolumens gelöst und diese Lösung gegen 0,002 M Phosphatpuffer von pH 7,5
dialysiert und dann auf zuvor mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gesetzte Diäthylaminoethylcellulosesäulen
aufgebracht wird und die Säulen bei 5° C mit linearen Salzgradienten, die aus dem
erwähnten Gleichgewichtspuffer und einem gleichen Volumen von 0,03 M Phosphatpuffer von pH
7,5 hergestellt sind, entwickelt und die Elastase dadurch, gegebenenfalls nach Wiederholung des
Reinigungsverfahrens, rein gewonnen wird.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19722265620 DE2265620C2 (de) | 1972-04-24 | 1972-04-24 | Mittel zur passiven Immunisierung gegen die toxischen Effekte von Infektionen durch Elastase bildende Bakterien und Verfahren zur Herstellung desselben |
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Applications Claiming Priority (1)
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DE19722220053 DE2220053C3 (de) | 1972-04-24 | 1972-04-24 | Mittel zur aktiven und passiven Immunisierung gegen die toxischen Effekte von Infektionen durch Elastase bildende Bakterien und Verfahren zur Herstellung derselben |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2220053A1 DE2220053A1 (de) | 1973-11-08 |
DE2220053B2 DE2220053B2 (de) | 1981-02-26 |
DE2220053C3 true DE2220053C3 (de) | 1982-04-15 |
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ID=5843103
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DE19722220053 Expired DE2220053C3 (de) | 1972-04-24 | 1972-04-24 | Mittel zur aktiven und passiven Immunisierung gegen die toxischen Effekte von Infektionen durch Elastase bildende Bakterien und Verfahren zur Herstellung derselben |
Country Status (1)
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DE (1) | DE2220053C3 (de) |
-
1972
- 1972-04-24 DE DE19722220053 patent/DE2220053C3/de not_active Expired
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
NICHTS-ERMITTELT |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE2220053B2 (de) | 1981-02-26 |
DE2220053A1 (de) | 1973-11-08 |
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