CN103555673B - 体外筛选体内抗菌活性噬菌体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种体外筛选体内抗菌活性不受补体系统影响的噬菌体制剂的方法，通过测定噬菌体和细菌在有补体活性的血清中以及补体被灭活的血清中相互作用后存活下来的细菌数，并结合在不含噬菌体只含细菌的含有补体的血清中活菌数的变化结果，分析判断出该噬菌体的抗菌活性是否受血清补体的影响。本发明所建立的体外筛选方法，对从环境中新分离到的大量的噬菌体可进行初步淘汰，筛选出体内具有抗菌活性可能性大的噬菌体再进一步实施动物治疗的实验研究，缩短了研究周期，加快了实验进程，节省了研究经费，对新型噬菌体抗菌制剂的研发具有非常重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体而言，涉及一种体外筛选抗菌活性不受某生物体体内补体影响的噬菌体制剂的方法。
背景技术
人们对细菌感染性疾病的治疗常采用的方法是使用各种抗生素。但随着大量广谱抗菌药物的长期应用，尤其是滥用，细菌耐药问题逐年加剧，一系列耐药病原菌，如结核杆菌、金萄菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、肠球菌和铜绿假单胞菌等，引起公众的广泛关注。尤其是近10年来，肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌以及铜绿假单胞菌对所有常规使用的抗生素全耐药菌株(Pan-resistantstrains)的出现，让人们意识到：抗生素治疗革兰氏阴性菌感染的时代已接近终点。更为严峻地是，目前处于临床试验阶段的新抗菌药物不足30种，而其中大多数仍是对传统药物的结构修饰物。另外，对15个全球最大的跨国制药公司研发部门的调查表明：目前只有不到10种的抗生素制剂处于研发阶段，未来可用于临床的新抗生素的研发前景不容乐观。研发新型抗生素的速度是远远落后于细菌对抗生素产生抗性的速度，“后抗生素时代”即将来临，因此，寻找抗生素以外的新型抗菌制剂已势在必行。在这样的时代背景下，噬菌体治疗重新受到人们的关注，自2000年以来，国外已发表了多篇关于噬菌体治疗的综述，多株临床耐药菌的噬菌体相继被分离并得到深入研究。
噬菌体治疗(phagetherapy)就是运用噬菌体及其产物来预防和治疗各种细菌感染性疾病的方法。噬菌体(bacteriophage/phage)是能够感染细菌的病毒。据估计：在生态环境中，每48h就会有约一半数量的细菌要被噬菌体感染。噬菌体通过限制细菌的数量、种类、以及改变细菌的代谢能力和生活史等途径对微生物的生物化学循环以及进化起着重要影响。噬菌体最早是由Twort和HerelleD两人分别于1915年和1917年发现。当时，虽然对噬菌体生物学特性的认识还很浅，但就已经用它来治疗疾病了。首次噬菌体治疗的公开报道是在1921年，RichardB.和JosephM.用噬菌体治疗葡萄球菌引起的皮肤感染。在注射给药后的48小时之内，感染消退。H.W.Smith和M.B.Huggins用噬菌体制剂治疗小鼠的大肠杆菌全身感染，小鼠在接种106CFU/ml的病原菌后致死率为100％，但当提前接种大肠杆菌噬菌体104PFU/ml后，无一例发生死亡。这种噬菌体制剂的疗效比用四环素、链霉素、氯霉素、氨苄青霉素、三甲氧苄二氨嘧啶等抗生素的效果要好。这些满意的疗效激起了人们对噬菌体治疗研究的热情，自1917年到1956年期间共发表800余篇有关噬菌体治疗的报道，所治疗的疾病有痢疾、伤寒、副伤寒、霍乱、化脓及尿道感染等，给药方式分为皮内、皮下、静脉、腹膜内、肌肉注射等，还有直接用于肺、颈动脉及心包的。当时许多研究机构和生物公司也对噬菌体的临床应用产生了兴趣，开始将噬菌体用于临床治疗。虽然当时许多噬菌体治疗的尝试都是成功的，但绝大部分实验结果都刊登在乌克兰和乔治亚的期刊中，并没有传到西方，即使有一小部分传到西方科学界，也因实验设计不够周密、实验数据不够详细以及缺乏相应的对照实验而受到西方学者的摒弃。另外，从商业角度上说，对噬菌体治疗的知识产权很难划定，这些都是当时西方世界未对噬菌体治疗进行深入研究的原因，加上后来抗生素的成功推广，及其所表现出的快捷、高效、简便的优势，许多国家停止了对噬菌体治疗的科学研究。直到20世纪末，快速加剧的细菌耐药现象促使人们重新审视噬菌体作为抗菌制剂所具有的巨大潜力，越来越多的研究人员意识到利用噬菌体来预防和治疗细菌感染的可行性和广阔前景。
噬菌体制剂以其杀菌特异性强、自然资源丰富、易于工程改造等抗生素无法比拟的优点，必将成为未来治疗全耐药菌株(对所有常规使用的抗菌药物全耐药的细菌，即所谓的“超级细菌”)所造成感染的新型抗菌制剂。然而，噬菌体在防治疾病的过程中也存在很多需要克服的问题，此处不再详述，仅将本发明所涉及的一项要解决问题叙述如下：
噬菌体无论数量还是种类都是自然界最为丰富的物种之一，从环境中分离到可以杀灭各种多重耐药菌的噬菌体并非难事，但并不是所有新分离到的噬菌体在生物体内都能行驶其抗菌活性。因为生物体内存在很多可以影响噬菌体杀菌的因素，因此噬菌体抗菌活性在体内和体外会存在很大差异。传统的筛选体内具有抗菌活性噬菌体的方法主要是通过动物实验，对这些新分离到的噬菌体未经过一个初筛而直接进行动物实验，势必造成实验动物的浪费、研究成本的提高和研究周期的增长。
虽然体内影响噬菌体抗菌活性的因素至今未完全明确，但本发明所建立的方法，仅针对其中一种影响因素，即补体系统对噬菌体抗菌活性的影响，可快速淘汰抗菌活性受补体系统影响的噬菌体，快速筛选出抗菌活性不受某一生物体内补体系统影响的噬菌体。这种方法增强了噬菌体研究对象的针对性，避免了一些不必要的研究成本的浪费。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种体外筛选抗菌活性不受某一生物体体内补体系统影响的噬菌体制剂的方法。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：
本发明一方面涉及一种体外筛选体内抗菌活性噬菌体的方法，其特征在于包括如下步骤：
无菌采集实验动物的外周血，将血清分成三份A、B、C，其中一份血清A经52-60℃，20-40min的补体灭活处理；
于三份血清中加入噬菌体的宿主菌，37C放置4-6分钟，再分别于灭活血清A和未灭活血清B中加入待筛选的噬菌体，未灭活血清C中不加入任何噬菌体，三份血清于37℃反应0.5-1.5h；
计数测定三份血清中的宿主菌活菌数，如果A、B中宿主菌的生长速度一致，且生长速度小于宿主菌在C中的生长速度，则该待筛选的噬菌体可以作为动物实验的候选噬菌体，反之则淘汰该待筛选的噬菌体。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的细菌可以是从感染者痰液标本以外的临床微生物检验送检标本中(例如灌洗液、伤口、粪便、尿液等)分离得到的所有种类的细菌和与其相关的噬菌体。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述的灭活或未灭活血清中加入的的细菌可以是一种以上细菌的混合物，加入的噬菌体也可以是一种以上噬菌体的混合物。
本发明的原理如下：补体系统(complementsystem)是天然存在于人和脊椎动物正常新鲜血清中的一组非特异性球蛋白。在这些生物体内，补体的激活在特异性免疫和非特异性免疫过程中均起重要的作用。细菌和噬菌体进入机体内环境中均可遇到补体，其作用结果有三种情况：①补体激活后顺利发挥溶菌效应，将细菌杀灭，感染结束。此类细菌一般不会引起实验动物的败血症，因此无需实施噬菌体治疗败血症的动物实验研究。②某些细菌因对补体系统具有天然的抗性可在机体内环境中存活，此类细菌虽可通过一定的机制抵抗补体的溶解作用，但其与补体的作用是客观存在的。当补体作用后改变的位点不影响细菌表面噬菌体吸附的受体结构或噬菌体尾部参与吸附细菌的关键结构，噬菌体即可行驶其在血清中的抗菌活性，此类噬菌体可考虑后续进行噬菌体治疗的实验动物研究。③当补体作用后改变的位点恰好位于细菌表面噬菌体吸附的受体结构或噬菌体的尾部参与吸附细菌的关键结构，均会影响噬菌体对细菌的抗菌活性，甚至使噬菌体的抗菌活性完全丧失。这些噬菌体在内环境中充满补体的生物体内其抗菌活性也一定会受到影响，因此，后续进行的噬菌体治疗感染的实验动物研究中，此类噬菌体应考虑被淘汰。另外，补体的活性对热非常敏感，56℃，30min可完全灭活血清补体。因此，如果噬菌体在新鲜未灭活血清中无抗菌活性，而在灭活血清中有抗菌作用，便可证明此噬菌体抗菌活性的丧失与补体系统直接相关，否则为其他因素造成(如中和抗体等其他血清充分)。
本发明所建立的体外筛选方法，对从环境中新分离到的噬菌体可进行初步淘汰，从而选择出在某生物体体内具有抗菌活性可能性大的噬菌体再进一步实施动物治疗的实验研究，因此，本发明所涉及的方法可缩短研究周期，加快实验进程，节省研究经费。
附图说明
图1：噬菌体ZZ1和PF19分别对细菌AB09V和KP19的血清杀菌实验结果
具体实施方式
下面通过对两株新分离噬菌体(ZZ1和PF19)的筛选实例详细叙述本发明的技术内容：
1实验材料
1.1主要试剂
营养琼脂粉、营养肉汤粉、琼脂粉(购自杭州天和微生物试剂有限公司)，上层琼脂培养基(含0.7％琼脂，配制方法为营养肉汤22.0g、琼脂粉7.0g于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装，121℃高压灭菌15min，4℃保存备用)，下层琼脂培养基(含1.5％琼脂，配制方法为营养琼脂粉38.0g于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，倾倒分装于灭菌平皿内，4℃保存备用)，PEG-8000(购自北京泽平科技有限责任公司)，噬菌体保存液SM(Nacl5.8g、MgSO4·7H2O2g、1mol/LTtris·HCL50ml、2％明胶5ml，加超纯水至1000ml，分装，121℃高压灭菌20min，4℃保存)。
1.2菌株和噬菌体
本发明所用的两株细菌(鲍曼不动杆菌AB09V和肺炎克雷伯菌KP19)是从河南省人民医院微生物室住院病人痰液中分离到的致病菌，经法国生物梅里埃公司生产的细菌生化鉴定板条进行鉴定，用纸片法测定药物敏感性。将过夜培养菌液分装制成20％的甘油菌后置-70℃下长期保存。用接种环挑取-70℃冻存的菌种划线接种于营养琼脂平板表面，于37℃恒温培养箱中培养过夜。挑取单菌落接种于盛有营养肉汤的锥形瓶中，放于摇床中37℃、160r/min震荡培养过夜(约16h)。实验其取1ml菌液5000g离心1min，弃去上清，加入1ml生理盐水吹吸混匀制成菌悬液后备用。ZZ1、PF19分别是用AB09V和KP19为指示菌从污水中分离的两株噬菌体，参照传统的方法进行单斑纯化和平板裂解增殖后，得到浓度为1010PFU/ml噬菌体裂解液，经过0.2um滤孔的滤菌器进行过滤除菌后分装于EP管内置4℃保存备用。
1.3实验动物
SPF级BALB/c小鼠，6～8周龄，雌雄不限，体重(19±1)g，购于郑州大学实验动物研究中心。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。
2.实验方法
2.1灭活血清和未灭活血清的制备
1只小鼠内眦取血可获得新鲜血液约1ml。为保持原有血清补体的活性，要尽可能快的收获血清。将采集的鼠血于37℃放置30min，4℃再放置10min，5000g离心5min，收获血清。经过0.2um滤孔的滤菌器进行过滤除菌，取1/3的血清置于56℃的水浴灭活30min。
2.2血清中噬菌体的杀菌实验
取等体积的三份血清：两份未灭活血清和一份热灭活血清。于三份血清中先加入1/100血清体积的含有AB09V菌的生理盐水混悬液(终浓度均达107CFU/ml)。37℃放置5分钟，再分别于一份灭活血清和一份未灭活血清中加入1/100血清体积的噬菌体ZZ1(终浓度均达108PFU/ml)，另一份未灭活血清作为无噬菌体对照反应管。三份反应物置于37℃水浴反应1h后，同时进行5000g×5min的离心，弃去上清，加入等体积无菌生理盐水充分吹吸混匀后再次进行5000g×5min的离心，再弃去上清，如此反复5次以充分去除游离噬菌体。最后一次洗涤后加入等体积营养肉汤混匀后，在营养肉汤中进行适当稀释后通过平板倾注法计数活菌的菌落数。以相同的方法操作PF19在血清中对KP19菌的杀菌实验。
2.3F19对其宿主菌所致小鼠败血症动物模型的治疗实验
将培养过夜的KF19菌液(109CFU/ml)进行离心洗涤(3000g，5min)，弃去上清后加入等体积无菌生理盐水并吹吸混匀。40只小鼠均尾静脉注射100ul洗涤后的菌液(细菌总量为108CFU)。1h后将这些感染的小鼠随机分为4组，每组10只。第一组尾静脉注射100ul的F19噬菌体无菌滤液(1010PFU/ml)，第二组注射经90℃，10min热灭活的F19噬菌体无菌滤液(1010PFU/ml)，第三组注射100ul的无菌生理盐水，第四组为无治疗对照组。观察四组小鼠的生存情况。
3结果和讨论
噬菌体ZZ1和PF19分别对细菌AB09V和KP19的血清杀菌实验结果参见说明书附图1。
鲍曼不动杆菌AB09V和肺炎克雷伯菌KP19在新鲜未灭活血清中的活菌数未有下降，说明二者均可在具有补体活性的新鲜血清中存活而不被杀灭，因此二者均对鼠血清补体有着天然的抗性。
噬菌体ZZ1在新鲜未灭活血清中不能有效杀灭AB09V，1h后的活菌数与无噬菌体对照组的活菌数基本无差异，但在补体灭活血清中对AB09V却具明显杀灭作用，活菌数只有1.5±0.4×103CFU/ml，与初始活菌浓度(107CFU/ml)相比下降约4个数量级。此结果说明：血清补体几乎可使噬菌体ZZ1对AB09V的杀灭作用完全丧失，噬菌体ZZ1在小鼠体内对鲍曼不动杆菌AB09V不可能具有抗菌活性，因此，没有必要再进一步实施动物实验来观察治疗效果。
噬菌体PF19在新鲜未灭活血清中以及灭活血清中均能有效杀灭KP19，1h后的活菌数仅剩1.3±0.6×102CFU/ml，与初始活菌浓度(107CFU/ml)相比下降约5个数量级。此结果说明：血清补体对PF19杀灭肺炎克雷伯菌KP19几乎无影响，因此，我们对F19进一步实施了动物实验。将致死量的KF19(108CFU)注射入小鼠的尾静脉，24h后未经治疗的第四组小鼠、注射灭活F19的第二组小鼠以及仅注射无菌生理盐水的第三组小鼠均全部死亡，而尾静脉注射活性噬菌体F19的第一组小鼠除1只于注射细菌后的第三天死亡外，其余9只小鼠的存活期均超过30天(存活率达90％)。
体内存在很多可以影响噬菌体和细菌相互作用的因素，这些因素可使一些噬菌体在体内的抗菌活性减弱甚至完全丧失，而那些在体内具有抗菌活性的噬菌体必定不受这些因素的影响(如噬菌体F19)。但到目前为止，这些影响噬菌体抗菌活性的体内因素并未被明确。本发明所建立的方法，仅针对其中一种影响因素，即补体系统对噬菌体抗菌活性的影响，可快速淘汰抗菌活性受补体系统影响的噬菌体，快速筛选出抗菌活性不受某一生物体内补体系统影响的噬菌体。这种方法增强了噬菌体研究对象的针对性，避免了一些不必要的研究成本的浪费。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (3)
1.一种体外筛选体内抗菌活性噬菌体的方法，其特征在于包括如下步骤：
无菌采集实验动物的外周血，将血清分成三份A、B、C，其中一份血清A经52-60℃，20-40min的补体灭活处理；
于三份血清中加入噬菌体的宿主菌，37℃放置4-6分钟，再分别于灭活血清A和未灭活血清B中加入待筛选的噬菌体，未灭活血清C中不加入任何噬菌体，三份血清于37℃反应0.5-1.5h；
计数测定三份血清中的宿主菌活菌数，如果A、B中宿主菌的生长速度一致，且生长速度小于宿主菌在C中的生长速度，则该待筛选的噬菌体可以作为动物实验的候选噬菌体，反之则淘汰该待筛选的噬菌体。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的宿主菌可以是从感染者痰液标本以外的临床微生物检验送检标本中分离得到的所有种类的细菌。
3.根据权利要求1所述的方法，所述的灭活或未灭活血清中加入的宿主菌可以是一种以上细菌的混合物，加入的噬菌体也可以是一种以上噬菌体的混合物。
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