ES2283581T3 - Procedimientos de preparacion de bacteriofagos polivalentes para el tratamiento de infeccines bascterianas. - Google Patents
Procedimientos de preparacion de bacteriofagos polivalentes para el tratamiento de infeccines bascterianas. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para obtener una cepa de bacteriófago multivalente caracterizado porque: a) se acumula un número suficiente (n) de cepas bacterianas patógenas de una especie específica que aparece aleatoriamente en una región dada, con lo que las cepas bacterianas aisladas son posiblemente cepas resistentes a fármacos; b) se acumula un número suficiente de cepas de bacteriófagos específicas para al menos una de las cepas bacterianas de la especie dada, c) se determina la actividad lítica de las cepas de bacteriófagos acumuladas en cada cepa bacteriana acumulada, se estima el valor de p, que es la proporción entre el número de cepas lisadas por un fago dado respecto el número de todas las cepas bacterianas acumuladas; d) a partir del valor de p resultante se determina si n cumple la condición: (Ver fórmula) donde: q = 1 - p d es una constante no mayor de 0, 1, óptimamente no mayor de 10% de p z1 - alfa es una variable aleatoria de la distribución normal dependiente del factor de confianza 1 -alfa, que no es menor de 0, 95 e) se selecciona la cepa de bacteriófagos que cumple el criterio de d) y tiene un valor de p no menor de 2/n, óptimamente no menor de 0, 5.
Description
Procedimientos de preparación de bacteriófagos
polivalentes para el tratamiento de infecciones bacterianas.
La presente invención se refiere a cepas
multivalentes de bacteriófagos, a procedimientos para obtenerlas y
a su aplicación en el tratamiento de infecciones bacterianas,
particularmente las producidas por cepas de bacterias resistentes a
fármacos.
Los bacteriófagos (fagos) son un grupo diverso
de virus cuyo ciclo de vida está relacionado exclusivamente con las
células bacterianas. Los bacteriófagos se caracterizan por un ciclo
de vida lisogénico o lítico. Como agentes antibacterianos son
especialmente útiles los bacteriófagos líticos que, después de una
infección por células bacterianas a las que son sensibles, se
replican dentro de ellas, conduciendo a su destrucción total (por
lisis) y a la liberación de nuevos fagos que atacan y destruyen
células bacterianas posteriores. Este proceso puede tener lugar
tanto in vitro como in vivo.
Una de las características esenciales de los
bacteriófagos es la alta especificidad bien conocida de su
actividad lítica. Esta característica se aprovecha, por ejemplo, en
la determinación de especies (tipificación de fagos) de diversas
bacterias (véanse, por ejemplo, las descripciones de patente GB
2285684, US 5824468 y SU 543260, así como las notificaciones de
patente internacional WO 0100786 y WO 0109370). Otras aplicaciones
conocidas de bacteriófagos incluyen su utilidad como herramientas en
biología molecular, por ejemplo en la expresión y selección de
proteínas específicas (por ejemplo, descripción de patente US
6027930) y en la esterilización y limpieza de medios (por ejemplo,
descripciones de patente EP 0414304, EP 0290295 y GB 2253859, así
como las notificaciones de patente internacional WO 9808944 y WO
9003122). En la producción de vacunas se usan fagos modificados
(por ejemplo, documento WO 9505454). También se usan ciertas
proteínas procedentes de bacteriófagos (por ejemplo, documentos EP
0510907, US 5470573, WO 9607329). Los procedimientos para aislar
bacteriófagos y obtener preparaciones de fagos son bien conocidos y
se están perfeccionando constantemente (por ejemplo, documentos GB
829266, CS 192212, RU 2109055).
La terapia con fagos se ha empleado en una
escala amplia desde la Segunda Guerra Mundial en el Instituto de
Microbiología y Virología de Tbilisi, Georgia. Allí se usa un banco
de diversas preparaciones de fagos en el tratamiento de infecciones
bacterianas y en profilaxis. Los datos disponibles indican una gran
eficacia de la terapia con fagos. Se ha realizado una investigación
similar en Polonia durante más de 25 años. En el Laboratorio de
Bacteriófagos del Instituto de Inmunología y Terapia Experimental de
la Academia Polaca de Ciencias en Wroclaw se usa la terapia con
fagos para el tratamiento de infecciones producidas por formas de
bacterias resistentes a fármacos y las no susceptibles a
antibióticos (véase: Stefan \acute{S}lopek et al.,
Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 1981, 31, 293;
Stefan \acute{S}lopek et al., Archivum Immunologiae et
Therapiae Experimentalis, 1983, 31, 267; Stefan \acute{S}lopek
et al., Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis,
1984, 32, 317; Stefan \acute{S}lopek et al., Archivum
Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 1985, 33, 219; Stefan
\acute{S}lopek et al., Archivum Immunologiae et Therapiae
Experimentalis, 1985, 33, 241; Stefan \acute{S}lopek et
al., Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 1987,
35, 569; Beata Weber-Dabrowska et al.,
Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 2000, 48,
31-37; Beata Weber-Dabrowska et
al., Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 2000,
48, 547-551). La terapia con fagos realizada en
dicho laboratorio durante los últimos 14 años, que ha incluido 1473
pacientes con infecciones purulentas de diferentes tejidos y
órganos, indica la alta eficacia de la terapia con fagos.
Se notificó una desaparición completa de los
síntomas de la enfermedad y la recuperación de la salud en 1289
casos. Debe subrayarse que al menos en una docena o un número
similar de casos la terapia con fagos presentó la única posibilidad
de eliminar la infección que ponía en peligro la vida. La terapia
se realizó en pacientes individuales afectados. Consistía en:
- a)
- el crecimiento e identificación de cepas bacterianas aisladas a partir de un material obtenido del paciente,
- b)
- determinación de la susceptibilidad de la cepa a fagos específicos y selección del fago que muestra la mayor actividad lítica hacia la cepa,
- c)
- preparación de un lisado del fago con un gran número de partículas de fago,
- d)
- producción de una preparación estéril del fago para el tratamiento.
Este procedimiento es bastante costoso,
laborioso y requiere tiempo. En algunas ocasiones, pasan de 7 a 10
días desde el momento de la 5 obtención del material de
investigación hasta que se dispone de la preparación de fago
esterilizada y terminada para el tratamiento. Este periodo de
retraso es demasiado largo en ciertas patologías.
Con el procedimiento empleado hasta ahora no
puede realizarse una terapia con fagos a escala amplia.
Las infecciones que acompañan a la
mucoviscidosis presentan un problema particular. Ésta es una
enfermedad sistémica hereditaria consistente en una disfunción de
las glándulas secretoras de moco, predisposición del paciente a
enfermedades bronquiales y pulmonares crónicas. El moco secretado
es espeso y pegajoso, lo cual dificulta su 5 eliminación por las
vías naturales (tosiendo). La acumulación y persistencia de moco en
los bronquios y la imposibilidad de eliminarlo crea condiciones
favorables para infecciones bacterianas, produciéndose bronquitis
crónica y neumonía. Los patógenos más amenazadores que producen
infecciones que acompañan a la mucoviscidosis son Staphylococcus
aureus y bacilos del género Pseudomonas. Las infecciones
recurrentes permanentemente por estos microorganismos producen
cambios patológicos graves en el sistema respiratorio y la muerte
prematura. Pocos pacientes sobreviven más de 25 años. El
tratamiento de estas infecciones con los antibióticos disponibles ha
creado un problema terapéutico serio a nivel mundial, especialmente
en los 5 últimos años. La terapia con antibióticos de estas
infecciones se ha ido haciendo cada vez menos eficaz debido a que
la inmensa mayoría de cepas bacterianas muestran resistencia a
todos los antibióticos, incluyendo el antibiótico de último recurso
- vancomicina. Por lo tanto, existe la necesidad urgente de
introducir un método terapéutico alternativo en la práctica médica
para el tratamiento de infecciones bacterianas refractarias y muy
peligrosas.
En los últimos años se ha visto una propagación
masiva de cepas bacterianas resistentes a todos los antibióticos,
incluyendo la vancomicina, el antibiótico de último recurso. Como
resultado, el tratamiento con antibióticos de infecciones
bacterianas inducidas por estas formas resistentes a fármacos es
ineficaz. Esta situación ha creado problemas terapéuticos drásticos.
De esta manera, existe la necesidad urgente de introducir métodos
terapéuticos alternativos en la práctica médica para el tratamiento
de infecciones bacterianas refractarias.
Teniendo en cuenta el objetivo anterior, esta
invención es una elaboración de un procedimiento para obtener cepas
de fagos multivalentes que pueden usarse en la producción de
preparaciones de eficacia garantizada en el tratamiento de
infecciones bacterianas sin la necesidad de seleccionar fagos
individuales en cada caso. En esta realización particular, el o
objetivo de la invención es la presentación de una forma que permite
obtener preparaciones de fagos de alta pureza, en particular sin
endotoxinas.
Un objetivo particular de la invención es
obtener preparaciones de fagos polivalentes que puedan emplearse
eficazmente en el tratamiento de infecciones bacterianas asociadas
con mucoviscidosis sin necesidad de realizar una selección de fagos
individuales en cada caso.
La presente invención proporciona un
procedimiento para obtener una cepa de bacteriófago multivalente,
mediante el cual:
- a)
- se acumula un número suficiente (n) de diferentes cepas de patógenos bacterianos de un género definido, que aparecen aleatoriamente en una región dada, con lo que las cepas bacterianas aisladas preferiblemente son resistentes a fármacos,
- b)
- se acumula un número suficiente de diferentes cepas de bacteriófagos, específicas para al menos una de las cepas bacterianas del género dado,
- c)
- se determina la actividad lítica de una cepa de bacteriófago acumulada en cada cepa bacteriana acumulada, y después se calcula el valor p, que es la proporción entre el número de cepas lisadas por un fago dado y el número de todas las cepas bacterianas acumuladas;
- d)
- para el valor resultante de p, se determina si n cumple la condición:
- donde:
- q = 1 - p
- d es una constante no mayor de 0,1, óptimamente no mayor del 10% de p
- z_{1-\alpha} es una variable aleatoria de la distribución normal dependiente del factor de confianza 1 - a, que no es menor de 0,95,
- e)
- se selecciona la cepa de bacteriófago que cumple el criterio definido en d) y tiene un valor de p no menor de 2/n, preferiblemente no menor de 0,5.
El intervalo de actividad lítica de cada
bacteriófago aislado se determina en relación con la población de
cepas bacterianas patógenas presentes en la región dada. Para este
fin, debe acumularse una colección suficientemente grande de cepas
bacterianas resistentes a fármaco elegidas aleatoriamente. En
relación con la gran muestra establecida de bacterias de un tamaño
de población de n cepas (en el ejemplo descrito, n era
845 y 880, respectivamente, para las cepas resistentes a fármacos
de Pseudomonas y Staphylococcus aisladas en Polonia),
se calcula la frecuencia de éxito o se estudia la proporción entre
el número de cepas lisadas por un fago dado y el número total de
cepas estudiadas. Esta frecuencia se considera la probabilidad de
éxito p. La probabilidad de fallo entonces es q = 1 -
p.
Es esencial elegir el tamaño n que debe tener
una muestra para que pueda considerarse representativa de la
población general de cepas del género dado (por ejemplo,
Pseudomonas o Staphylococcus). Para este fin, se
establece el siguiente criterio para que la muestra sea
representativa:
La probabilidad de que el valor absoluto de la
diferencia entre la frecuencia de la muestra v y la
probabilidad de éxito p sea menor que el valor preasignado
de d es 1 - \alpha, que corresponde a un nivel de confianza
de 1 - \alpha. Normalmente se establece un valor de 1 - \alpha
de 0,95 ó 0,98.
El número de muestras n debe cumplir la
condición:
donde z_{1-\alpha} es una
variable aleatoria de la distribución normal. Para 1 - \alpha =
0,95, z_{1-\alpha} = 1,96, y para 1 - \alpha = 0,98,
z_{1-\alpha} = 2,33. Basándose en este criterio y en el
valor de la frecuencia p obtenida para el fago caracterizado,
asignando valores razonables a d y al intervalo de confianza
1 - \alpha, es posible verificar la magnitud n usada para
determinar el intervalo de actividad lítica de un fago dado y
averiguar si la actividad lítica obtenida para esta magnitud
n, con los valores asignados de d y 1 - \alpha,
puede considerarse correcta con respecto a la población general de
las cepas bacterianas del género
dado.
La cepa de bacteriófagos preferiblemente se
aísla en la etapa b) a partir de una muestra procedente del medio
pasándola a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro
de 0,2 - 0,4 \mum, añadiendo medio de cultivo al filtrado y
mezclándolo con un caldo de cultivo de bacterias del género
definido, incubando esta mezcla a una temperatura de
aproximadamente 37°C durante aproximadamente una hora, retirando una
parte de la suspensión y extendiéndola sobre placas con medio de
cultivo sólido, incubando a aprox. 37°C durante un periodo de 2 a
24 horas, aislando una muestra del medio que rodea a la calva
individual, transfiriéndola al caldo de cultivo de bacterias del
género definido e incubando hasta que se aclara el cultivo, y
obteniendo la preparación de bacteriófagos pasando el lisado a
través de un filtro de membrana con un tamaño de poros de 0,2 - 0,4
\mum, prefiriéndose repetir la inoculación del medio de cultivo
sólido y el re-aislamiento de las calvas 5
veces.
Las cepas bacterianas de la etapa c)
preferiblemente se inoculan en un medio de cultivo sólido, sobre el
cual se deposita una parte de la preparación de bacteriófagos
obtenida en la etapa b), y se incuban a aproximadamente 37°C
durante aproximadamente 4 horas, después de lo cual la temperatura
se fija a aproximadamente 4°C durante un periodo de aproximadamente
2 a 24 horas, demostrándose la actividad lítica de la cepa del
bacteriófago por la aparición de, al menos, calvas
individuales.
Después, es posible realizar una purificación
adicional del lisado, particularmente con respecto a las
endotoxinas, poniendo en contacto la mezcla que contiene
bacteriófagos con un sustrato que contiene celulosa o un derivado
parcialmente esterificado de la misma, y después aclarando con una
solución que elimina las impurezas, especialmente las endotoxinas,
después de lo cual los bacteriófagos purificados se retiran por
lavado. La endotoxina puede eluirse eficazmente con agua, una
solución de una sustancia no disociadora, o una solución salina con
una concentración no mayor de 0,1 M, posiblemente tamponada. La
fracción de bacteriófago también puede eluirse eficazmente con una
solución de una sustancia no disociadora, o cualquier tampón, o una
solución salina de concentración mayor de 0,05 M, posiblemente
tamponada. Además, la elución de la endotoxina y los bacteriófagos
se realiza a temperaturas comprendidas entre -25°C y +100°C.
Preferiblemente, la elución de la endotoxina y el bacteriófago
puede realizarse usando una solución salina acuosa que contiene un
disolvente orgánico. El disolvente orgánico en el mejor de los casos
se selecciona entre un grupo que comprende dimetilsulfóxido,
dimetilformamida, isopropanol y acetona, y como sustrato puede
usarse celulosa parcialmente esterificada con un ácido orgánico o
inorgánico. Puede usarse un sustrato de celulosa parcialmente
esterificada con ácido acético, nítrico, sulfuroso o fosfórico, en
particular, como sustrato puede usarse celulosa de la que se han
esterificado de un 0,01 a un 5% de las moléculas de glucosa,
preferiblemente de un 0,25 a un 1%, más preferiblemente de un 0,5 a
un 1% de las moléculas de glucosa.
Preferiblemente, las cepas bacterianas patógenas
son de los géneros Staphylococcus o Pseudomonas.
Otro aspecto de la invención es una medicación
para el tratamiento o prevención de infecciones producidas por
patógenos bacterianos que contiene un agente activo y un posible
portador farmacéuticamente admisible, de tal forma que el agente
activo comprende una cepa de bacteriófago multivalente específica
para las bacterias del género indicado y obtenida usando el
procedimiento de esta invención.
De acuerdo con la invención, la medicación puede
tener la característica de que, como cepa de bacteriófago
multivalente específica para bacterias del género
Staphylococcus, contiene al menos una cepa de bacteriófagos
seleccionada entre S1 (PCM F/00001), S2 (PCM F/00002), S3 (PCM
F/00003), S4 (PCM F/00004), S5 (PCM F/00006), S6 (PCM F/00006) y S7
(PCM F/00007), preferiblemente los fagos S1, S2 y S4 o S5. Esta
medicación producida de acuerdo con un aspecto de la invención es de
utilidad en el tratamiento o prevención de infecciones que se
producen en personas que padecen mucoviscidosis y, como cepa de
bacteriófagos multivalentes específica para bacterias del género
Staphylococcus, contiene al menos una cepa de bacteriófagos
seleccionada entre F/00002, F/00004 y F/00007.
De acuerdo con la invención, la medicación
debería tener la característica de que, como cepa de bacteriófagos
multivalentes específica para bacterias del género
Pseudomonas, contiene al menos una cepa de bacteriófagos
seleccionada entre P1 (PCM F/00008), P2 (PCM F/00009), P3 (PCM
F/00010), P4 (PCM F/00011), P5 (PCM F/00012), P6 (PCM F/00013), P7
(PCM F/00014), P8 (PCM F/00015), P9 (PCM F/00016), P10 (PCM
F/00017), P11 (PCM F/00018), P12 (PCM F/00019), P13 (PCM F/00020),
P14 (PCM F/00021), P15 (PCM F/00022), P16 (PCM F/00023), P17 (PCM
F/00024), P18 (PCM F/00025), P19 (PCM F/00026) y P20 (PCM F/00027),
óptimamente los fagos P7, P20 y P6. La medicación producida de
acuerdo con cierto aspecto de la invención es de utilidad en el
tratamiento o prevención de infecciones que se producen en personas
que padecen mucoviscidosis y, como cepa de bacteriófagos
multivalentes específica para bacterias del género
Pseudomonas, contiene al menos una cepa de bacteriófagos
seleccionada entre F/00010, F/00013 y F/00018.
Otro objeto de esta invención es la aplicación
de una cepa de bacteriófagos multivalentes obtenida de acuerdo con
el procedimiento de la invención en el desarrollo de una medicación
para el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas
producidas por patógenos bacterianos.
Para la producción de una medicación para el
tratamiento o prevención de infecciones producidas por bacterias
del género Staphylococcus, es ventajoso el empleo de al
menos una cepa de bacteriófagos seleccionada entre S1 (PCM
F/00001), S2 (PCM F/00002), S3 (PCM F/00003), S4 (PCM F/00004), S5
(PCM F/00006), S6 (PCM F/00006) y S7 (PCM F/00007), óptimamente los
fagos S1, S2 y S4 o S5. Para la creación de una medicación para el
tratamiento o prevención de infecciones producidas por bacterias
del género Staphylococcus en personas que padecen
mucoviscidosis, es ventajoso el uso de al menos una cepa de
bacteriófagos elegida entre F/00002, F/00004 y F/00007.
También es ventajoso para la creación de una
medicación para el tratamiento o prevención de infecciones
producidas por bacterias del género Pseudomonas el uso de al
menos una cepa de bacteriófagos seleccionada entre P1 (PCM
F/00008), P2 (PCM F/00009), P3 (PCM F/00010), P4 (PCM F/00011), P5
(PCM F/00012), P6 (PCM F/00013), P7 (PCM F/00014), P8 (PCM
F/00015), P9 (PCM F/00016), P10 (PCM F/00017), P11 (PCM F/00018),
P12 (PCM F/00019), P13 (PCM F/00020), P14 (PCM F/00021), P15 (PCM
F/00022), P16 (PCM F/00023), P17 (PCM F/00024), P18 (PCM F/00025),
P19 (PCM F/00026) y P20 (PCM F/00027), óptimamente los fagos P7,
P20 y P6. Para la creación de una medicación para el tratamiento o
prevención de infecciones producidas por bacterias del género
Pseudomonas en personas que padecen mucoviscidosis es
ventajoso el uso de al menos una cepa de bacteriófagos seleccionada
entre F/00010, F/00013 y F/00018.
Otro objeto de la invención es una cepa de
bacteriófagos multivalentes específica para bacterias del género
Staphylococcus seleccionada entre S1 (PCM F/00001), S2 (PCM
F/00002), S3 (PCM F/00003), S4 (PCM F/00004), S5 (PCM F/00006), S6
(PCM F/00006) y S7 (PCM F/00007), óptimamente entre S1, S2, S4 y
S5.
Un objeto de la invención también es una cepa de
bacteriófagos multivalentes específica para bacterias del género
Pseudomonas, seleccionada entre P1 (PCM F/00008), P2 (PCM
F/00009), P3 (PCM F/00010), P4 (PCM F/00011), P5 (PCM F/00012), P6
(PCM F/00013), P7 (PCM F/00014), P8 (PCM F/00015), P9 (PCM
F/00016), P10 (PCM F/00017), P11 (PCM F/00018), P12 (PCM F/00019),
P13 (PCM F/00020), P14 (PCM F/00021), P15 (PCM F/00022), P16 (PCM
F/00023), P17 (PCM F/00024), P18 (PCM F/00025), P19 (PCM F/00026) y
P20 (PCM F/00027), óptimamente entre P7, P20 y P6.
En la investigación se usó la propia colección
de fagos de los presentes solicitantes activos contra especies de
bacterias que son los factores etiológicos más frecuentes de las
infecciones bacterianas de los seres humanos. Los ejemplos
prácticos descritos hacen referencia a bacteriófagos multivalentes
que actúan líticamente sobre cepas de estafilococos
(Staphylococcus aureus), incluyendo sus cepas resistentes a
meticilina, y el bacilo del pus azul (Pseudomonas
aeruginosa), que aparece en los pacientes de mucoviscidosis en
particular. Estas especies actualmente son la causa de infecciones
graves que producen una alta mortalidad.
La introducción en terapia de preparaciones de
fagos polivalentes que contienen fagos multivalentes obtenidos por
medio de esta invención es un avance importante para combatir
infecciones bacterianas que no son susceptibles de tratamiento con
antibióticos. Con esta nueva tecnología también se asocian ciertas
ventajas económicas. Permite una reducción significativa en los
costes de material y acorta el tiempo desde la recogida del
material para el examen hasta la obtención de la preparación de
fagos terapéutica. Gracias a esto, la preparación de fagos esperará
al paciente, y no el paciente a la producción de la preparación de
fagos individual.
La amplia serie de preparaciones de fagos
líticos compuestas de varios fagos multivalentes obtenidos por medio
del procedimiento de esta invención es una ventaja muy importante
desde el punto de vista de su aplicación en el tratamiento de
infecciones bacterianas. Es bien conocido que dentro de una
población bacteriana, pueden aparecer formas resistentes a
bacteriófagos con una frecuencia de aproximadamente 1 x 10^{-7}.
En presencia de dos fagos, la frecuencia de esta mutación es de
aproximadamente 1 x 10^{-4} y con tres fagos sólo de 1 x
1^{-21}. Con esta disposición, prácticamente no existe el
problema de resistencia de las cepas bacterianas a los fagos.
La gran aplicabilidad de las medicaciones
ejemplificadas compuestas de fagos multivalentes merece un énfasis
especial. Pueden emplearse en la práctica médica en general y
proporcionan un medio de copia eficaz con infecciones bacterianas
de riesgo. También es posible aprovechar fagos obtenidos de acuerdo
con esta invención en la preparación de medicaciones para uso
externo, empleándolos, por ejemplo, en el tratamiento y prevención
de infecciones dermatológicas. Se ha descubierto que la
administración oral de lisados de fagos obtenidos de acuerdo con
esta invención aumenta la resistencia a una posible infección
bacteriana futura.
En ciertos casos, la terapia con fagos puede
usarse junto con una terapia con antibióticos.
Se ha demostrado que las preparaciones de fagos
polivalentes usadas en el tratamiento de infecciones bacterianas
son muy eficaces. Se ha observado una eficacia particular en el
tratamiento de sepsis (con una proporción de cura del 88%) y en el
tratamiento de infecciones en pacientes con mucoviscidosis.
La Figura 1 presenta los resultados del análisis
de parámetros estadísticos adquiridos para los fagos S1 -S7.
La Figura 2 presenta los resultados del análisis
de parámetros estadísticos adquiridos para los fagos
P1-P20.
La Figura 3 presenta los resultados del análisis
estadístico de la eficacia de cepas de fagos seleccionadas con
respecto a cepas bacterianas que pertenecen al género
Staphylococcus aisladas a partir de pacientes con
mucovisci-
dosis.
dosis.
La Figura 4 presenta los resultados del análisis
estadístico de la eficacia de cepas de fagos seleccionadas con
respecto a cepas bacterianas que pertenecen al género
Pseudomonas aisladas a partir de pacientes con
mucovis-
cidosis.
cidosis.
Para comprender mejor la esencia de la
invención, se ilustra a continuación por medio de ejemplos.
Se aislaron bacteriófagos para Staphylococcus
y Pseudomonas a partir de aguas residuales municipales. Las
aguas residuales se pasaron a través de un filtro de membrana con
un tamaño de poro de 0,2 - 0,4 \mum, que captura las bacterias
pero permite que los bacteriófagos pasen a su través. A partir del
filtrado resultante, se añadió medio de cultivo líquido concentrado
y se mezclaron diferentes diluciones de filtrado con caldos de
cultivo jóvenes de bacterias (Staphylococcus aureus o
Pseudomonas aeruginosa). Las muestras se incubaron a 37°C
durante 1 hora, después de lo cual se extrajeron 0,2 ml de
suspensión de cada muestra con una pipeta y se extendieron en placas
que contenían medio de agar usando una varilla de vidrio, y las
placas se incubaron durante la noche a 37°C. En caso de que
estuviera presente el fago deseado en las placas inoculadas con la
dilución adecuada de filtrado que contenía el cultivo bacteriano
joven, se observaba un crecimiento uniforme (nebuloso) de
bacterias, campos pequeños transparentes separados, las denominadas
calvas, que normalmente contenían varios millones de partículas de
fagos. La calva individual junto con el agar que la rodeaba se
cortó con la ayuda de un asa de platino, después se transfirió a un
nuevo caldo de cultivo de bacterias y se incubó hasta que el
cultivo se aclaró. Después de pasarlo a través de un filtro de
membrana con un tamaño de poro de 0,2 - 0,4 \mum, que retiene
cualquier bacteria que quede en el lisado, el filtrado contenía
sólo bacteriófagos. La inoculación de diferentes diluciones de los
fagos obtenidos con las respectivas bacterias en medio de agar, y el
re-aislamiento de las calvas se realizaron cinco
veces, lo cual permitió obtener una línea pura
de fagos.
de fagos.
La susceptibilidad se determinó usando el medio
de cultivo descrito por Wahl. Se secaron placas con este medio a
una temperatura de 37°C durante 30 minutos, se cubrieron con un
caldo de cultivo joven de 4 horas de Staphylococcus aureus
que se mezcló por agitación, se retiró el exceso de la suspensión
con una pipeta y las placas se secaron de nuevo durante 30 minutos
a 37°C. En una placa, dividida en 6 segmentos, se determinaron las
susceptibilidades de la cepa que se estaba estudiando frente a 6
bacteriófagos diferentes pero específicos. Se puso una gota de una
dilución de bacteriófago 1/10 en la superficie de cada segmento.
Las placas se incubaron en una estufa a 37°C durante
aproximadamente 4 horas, después de lo cual se pusieron en un
refrigerador hasta el día siguiente. En caso de una alta
susceptibilidad de la cepa al fago definido, son visibles campos
transparentes en el sitio en el que se introdujo el fago en el medio
de cultivo que estaba cubierto uniformemente con el cultivo
bacteriano, siendo estos el resultado de la destrucción total de
las células bacterianas (lisis). Una menor susceptibilidad de la
cepa se manifiesta por la aparición de calvas individuales.
El procedimiento para determinar la sensibilidad
fue similar al descrito en el Ejemplo 2. En este caso, sin embargo,
el medio de reserva fue agar con un suplemento de tampón fosfato y
el tiempo de incubación del fago depositado en las placas fue de 5
horas.
Se aislaron bacteriófagos de acuerdo con el
procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Se determinaron las
susceptibilidades de 845 cepas clínicas resistentes a fármacos de
diversas especies de Staphylococcus aisladas en toda Polonia
a fagos de la colección de bacteriófagos específica para
Staphylococcus, y las susceptibilidades de 880 cepas clínicas
resistentes a fármacos de diferentes especies de Pseudomonas
a fagos de la colección de bacteriófagos específica para
Pseudomonas.
Un análisis de las susceptibilidades de los dos
grupos de cepas a los fagos respectivos permitió la selección de
fagos con una actividad inesperadamente elevada y un amplio
espectro de efecto lítico. Estos fagos se presentan en las tablas 1
y 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados para los fagos
S1-S7 y P1-P20 se sometieron a un
análisis estadístico para determinar si los valores de p
obtenidos para los fagos particulares pueden considerarse correctos
para las poblaciones generales de los géneros respectivos de
bacterias. Los resultados se presentan en las Figuras 1 y 2. Los
valores calculados de n para la mayoría de los bacteriófagos
fueron menores que el número de cepas bacterianas de las muestras
de investigación, lo que sugiere que los intervalos de los
espectros líticos son al menos correctos con respecto a las cepas
clínicas que aparecen en Polonia. Considerando estos resultados,
los fagos indicados en las Tablas 1 y 2 pueden considerarse fagos
multivalentes con respecto a esta invención.
Inesperadamente, en el caso de los fagos para
Staphylococcus, 3 de los 7 más activos, es, es decir S1, S2
y S4 o S5, presentaron actividad lítica en el 95% de las cepas de
Staphylococcus estudiadas. Además, 3 de los 21 fagos
seleccionados para Pseudomonas, es decir P7, P20 y P6,
presentaron actividad lítica en el 87% de las cepas de
Pseudomonas estudiadas.
También se pueden considerar los pacientes que
padecen mucoviscidosis como una "región dada de la aparición de
una infección bacteriana", como se define en la esencia de la
invención. En el estudio de los patógenos que aparecen en este
grupo de pacientes, se usaron 137 cepas bacterianas de las que se
identificaron 84 como Pseudomonas y 53 como S.
aureus. Todas las cepas se aislaron a partir de un material
procedente de pacientes con mucoviscidosis de toda Polonia. El
análisis de la susceptibilidad en las cepas de Pseudomonas y
S. aureus estudiadas a los fagos permitió la selección de
fagos con la mayor actividad lítica y el intervalo de acción más
amplio. Inesperadamente, en el caso de fagos para
Pseudomonas, 3 de los 21 fagos activos, es decir, F/00010,
F/0013 y F/00018, presentaron actividad lítica en el 75% de las
cepas de Pseudomonas (véase la probabilidad de éxito en la
fig. 3, en la que el fago 3 = F/00010, fago 6 = F/00013 y fago 11 =
F/00018). Entre los fagos seleccionados para Staphylococcus,
3, es decir F/00002, F/00004 y F/00007, presentaron actividad
lítica en el 98% de las cepas de Staphylococcus (véase la
probabilidad de éxito en la fig. 4, en la que fago 1 = F/00002, fago
3 = F/00004 y fago 4 = F/00007).
Se añadió un lisado de fagos de aproximadamente
un 5% a cultivos jóvenes de 4 horas de Staphylococcus aureus
(fase logarítmica) en medio de caldo suplementado con glucosa. Los
tubos de ensayo o frascos se mezclaron por agitación y se incubaron
durante 3 horas a 37°C. Después de la aparición de un cultivo
transparente (lisis), las muestras se mantuvieron en frío hasta el
día siguiente. El lisado se pasó a través de un filtro de membrana
con un tamaño de poro de 0,2-0,4 \mum para retirar
todas las células bacterianas no lisadas restantes. La
concentración de partículas de fagos vivas se determinó por el
procedimiento de dos capas de Gratia. Como control se utilizó un
cultivo incubado sin la adición de lisado de fago.
Replicación de fagos contra bacilos
Gram-negativos (Pseudomonas). Se usó agua de
peptona para replicar fagos contra Pseudomonas. Se añadió un
lisado de fagos al 5% a un cultivo joven de 4 horas de
Pseudomonas aeruginosa, los tubos de ensayo o los frascos se
mezclaron por agitación y las muestras se incubaron durante 5 horas
a 37°C. Después de aclararse el cultivo, las muestras se dejaron
hasta el día siguiente en un refrigerador, después de lo cual se
filtraron a través de un filtro de membrana con el tamaño de poro
indicado anteriormente. El número de partículas de fago vivas en el
lisado se determinó por el procedimiento de Gratia.
Los lisados de fagos en caldo estéril muestran
una actividad lítica de larga duración. Cuando se mantienen en
frío, conservan su vitalidad durante varios años, en algunos casos
durante más de 10 años.
El lisado de caldo estéril obtenido por el
procedimiento descrito en el Ejemplo 5, procedente de los fagos
seleccionados con un amplio espectro de actividad lítica en el
Ejemplo 4, o sus formas concentradas o purificadas adi-
cionalmente (véase el siguiente ejemplo) se utilizaron en la preparación de medicaciones con fagos poliva-
lentes.
cionalmente (véase el siguiente ejemplo) se utilizaron en la preparación de medicaciones con fagos poliva-
lentes.
La preparación de fagos polivalentes
ejemplificada contra Staphylococcus es una mezcla que
contiene diferentes cantidades de lisados de fagos S1, S2 y S4 o
S5, o derivados de estos lisados. Para infecciones producidas por
Staphylococcus en pacientes con mucoviscidosis, deberían
usarse preparaciones de fagos F/00002, F/00004 y
F/00007.
F/00007.
La preparación de fagos polivalentes
ejemplificada contra Pseudomonas es una mezcla que contiene
diferentes cantidades de los lisados de fagos P7, P20 y P6, o
derivados de estos lisados. Para infecciones producidas por
Pseudomonas en pacientes con mucoviscidosis, deberían usarse preparaciones de fagos F/00010, F/00013 y
F/00018.
Pseudomonas en pacientes con mucoviscidosis, deberían usarse preparaciones de fagos F/00010, F/00013 y
F/00018.
La medicación se administra por vía oral 3 veces
al día, en cantidades correspondientes a 10 ml de lisado, 30
minutos antes de las comidas, después de la neutralización previa
de los fluidos estomacales (por ejemplo, con Gel Alumini
Phosphorici, bicarbonato sódico purificado o agua Vichy). Cuando se
aplica la preparación directamente en heridas, esto debe hacerse 3
veces durante 24 horas. Por aplicación local, la herida no debe
limpiarse con desinfectante, ya que esto puede ocasionar la
inactivación de los fagos. Si es necesario, las heridas pueden
limpiarse con un medio de cultivo estéril o con solución
fisiológica de NaCl al 0,9%.
En ciertos casos, la terapia con fagos puede
emplearse junto con una terapia de antibióticos.
Las preparaciones de fagos polivalentes usadas
en el tratamiento de infecciones bacterianas han presentado una
alta eficacia. Se ha observado una eficacia particular en el
tratamiento de sepsis (con una proporción de cura del 88%) y en
infecciones que se producen en pacientes con mucoviscidosis.
En varias aplicaciones médicas, o también debido
a los procedimientos de administración (por ejemplo, por vía
intravenosa), se requieren preparaciones de bacteriófagos de alta
pureza, en particular que carezcan de endotoxinas bacterianas.
Siguiendo el procedimiento de esta invención, se usó la afinidad de
bacteriófagos por un sustrato que contenía celulosa u, óptimamente,
un derivado esterificado de ésta. En este ejemplo se usó un
derivado de celulosa sulfatado disponible en el mercado, que se
caracterizaba por un bajo nivel de esterificación (8 \mumol/ml de
gel). El sustrato se usó para retirar las endotoxinas de la mezcla
que contenía bacteriófagos. Después de aclarar el sustrato y de
retirar las endotoxinas, la siguiente etapa de purificación es la
elución de los bacteriófagos adsorbidos.
Se puso 1 ml de sustrato que contenía el
derivado de celulosa sulfatado en la columna estéril de un
cromatógrafo. La salida del sustrato de la columna se impidió
sellando la parte inferior de la columna con lana de vidrio
humedecida con etanol al 70%.
Se prepararon los siguientes tampones de
elución:
- Tampón I: tampón fosfato 0,01 M, pH 7,6;
- Tampón II: tampón fosfato 0,01 M, pH 7,6, que contiene cloruro sódico 1 M.
Las sales que entraron en la composición del
eluyente se endurecieron durante 1 hora a 145°C.
Las soluciones se prepararon usando agua
apirogénica destilada.
Antes de la cromatografía, se introdujo 1 ml de
sustrato en una columna de cromatografía enjuagada con 5 ml de
tampón I, y después con 5 ml de tampón II.
La columna se preparó para la cromatografía real
enjuagándola con 10 ml de tampón I.
La eliminación de la endotoxina se realizó
usando la fracción de molécula grande obtenida en el procedimiento
de tamiz molecular en Sepharose 4B del lisado del bacteriófago
concentrado Ps PCM F/00018.
Se transfirieron 0,2 ml de la mezcla de
bacteriófagos a una columna de cromatografía que contenía 1 ml de
sustrato que contenía el derivado sulfatado de celulosa. Se recogió
una fracción de 0,2 ml en volumen. La primera fracción se eluyó con
3 ml de tampón I. En estas condiciones, salió de la columna la
endotoxina no asociada. La segunda fracción se eluyó con el tampón
II. La fracción II contenía bacteriófagos purificados.
Los resultados de unidades de endotoxina en las
fracciones:
El material sometido a cromatografía en un
sustrato que contenía un derivado sulfatado de celulosa contenía
2500 unidades de endotoxina/ml. La fracción eluida con tampón I
contenía 600-1000 unidades de endotoxina/ml y la
eluida con tampón II contenía bacteriófagos que carecían de
endotoxinas (aproximadamente 1 unidad/ml).
Se determinó el contenido de endotoxinas en las
preparaciones de bacteriófagos usando el procedimiento de gel de la
compañía Charles River Endosafe, Charleston, USA.
Las cepas de bacteriófagos multivalentes de la
presente invención se han depositado según las disposiciones del
Tratado de Budapest y sus detalles se indican en la siguiente Tabla
3.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (29)
1. Procedimiento para obtener una cepa de
bacteriófago multivalente caracterizado porque:
a) se acumula un número suficiente (n) de cepas
bacterianas patógenas de una especie específica que aparece
aleatoriamente en una región dada, con lo que las cepas bacterianas
aisladas son posiblemente cepas resistentes a fármacos;
b) se acumula un número suficiente de cepas de
bacteriófagos específicas para al menos una de las cepas
bacterianas de la especie dada,
c) se determina la actividad lítica de las cepas
de bacteriófagos acumuladas en cada cepa bacteriana acumulada, se
estima el valor de p, que es la proporción entre el número de cepas
lisadas por un fago dado respecto el número de todas las cepas
bacterianas acumuladas;
d) a partir del valor de p resultante se
determina si n cumple la condición:
donde:
q = 1 - p
d es una constante no mayor de 0,1, óptimamente
no mayor de 10% de p
z_{1-\alpha} es una variable aleatoria de la
distribución normal dependiente del factor de confianza 1 -
\alpha, que no es menor de 0,95
e) se selecciona la cepa de bacteriófagos que
cumple el criterio de d) y tiene un valor de p no menor de 2/n,
óptimamente no menor de 0,5.
2. Procedimiento de la reivindicación 1, donde
en la etapa b) la cepa de bacteriófago se aísla a partir de una
muestra que procede del entorno, pasándola a través de un filtro de
membrana con un tamaño de poro de 0,2-0,4 \mum,
se añade medio de cultivo al filtrado obtenido y se mezcla con un
caldo de cultivo de bacterias de un género definido, la mezcla se
incuba a una temperatura de aproximadamente 37°C durante
aproximadamente 1 hora, se retira una parte de la suspensión y se
aplica a placas con medio de cultivo sólido, se incuba a
aproximadamente 37°C durante 2 a 24 horas, se aísla una muestra del
medio que rodea a una calva individual, se transfiere al caldo de
cultivo de bacterias del género definido y se incuba hasta que el
cultivo brilla, y el producto del bacteriófago se obtiene pasando el
lisado a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro de
0,2-0,4 \mum, repitiéndose preferiblemente la
inoculación del medio de cultivo sólido y el
re-aislamiento de las calvas 5 veces.
3. Procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en
el que en la etapa c) la cepa bacteriana en estudio se inocula en
el medio sólido respectivo, sobre el cual se transfiere una parte
de la preparación de bacteriófagos obtenida en la etapa b), se
incuba a una temperatura de aproximadamente 37°C durante
aproximadamente 4 horas, después de lo cual se deja a una
temperatura de aproximadamente 4°C durante aproximadamente 2 a 24
horas, después de lo cual se evidencia la actividad lítica de la
cepa de bacteriófago por la aparición de al menos calvas
individuales.
4. Procedimiento de la reivindicación 1, en el
que las cepas bacterianas patógenas son de los géneros
Staphylococcus o Pseudomonas.
5. Procedimiento de la reivindicación 1 ó 4, en
el que en la etapa c) la cepa de bacteriófago multivalente
seleccionada específica para cepas bacterias resistentes a fármacos
del género Staphylococcus que aparecen en Polonia es una
cepa de bacteriófagos seleccionada entre S1 (PCM F/00001), S2
(PCMF/00002), S3 (PCMF/00003), S4 (PCMF/00004), S5 (PCM F/00005),
S6 (PCMF/00006) y S7 (PCMF/00007).
6. Procedimiento de la reivindicación 5, en el
que en la etapa e) la cepa de bacteriófago multivalente
seleccionada específica para cepas bacterianas resistentes a
fármacos del género Staphylococcus que aparecen en pacientes
con mucoviscidosis es una cepa de bacteriófagos seleccionada entre
S2 (PCM F/00002), S4 (PCM F/00004) y S7 (PCMF/00007).
7. Procedimiento de la reivindicación 1 ó 4, en
el que en la etapa e) la cepa de bacteriófago multivalente
seleccionada específica para cepas bacterianas resistentes a
fármacos del género Pseudomonas que aparecen en Polonia es
una cepa de bacteriófagos seleccionada entre P1 (PCM F/00008), P2
(PCMF/00009), P3 (PCMF/00010), P4 (PCM F/00011), P5 (PCM F/00012),
P6 (PCM F/00013), P7 (PCM F/00014), P8 (PCM F/00015), P9 (PCM
F/00016), P10 (PCM F/00017), P11 (PCM F/00018), P12 (PCM F/00019),
P13 (PCM F/00020), P14 (PCM F/00021), P15 (PCM F/00022), P16 (PCM
F/00023), P17 (PCM F/00024), P18 (PCM F/00025), P19 (PCM F/00026) y
P20 (PCM F/00027).
8. Procedimiento de la reivindicación 7, en el
que en la etapa e) la cepa de bacteriófago multivalente
seleccionada específica para cepas bacterianas resistentes a
fármacos del género Pseudomonas que aparecen en pacientes
con mucoviscidosis es una cepa de bacteriófago seleccionada entre P3
(PCM F/00010), P6 (PCM F/00013) y P11 (PCM F/00018).
9. Procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, que
comprende además la purificación del lisado, especialmente de
endotoxinas, poniendo en contacto la mezcla que contiene
bacteriófagos con un sustrato que contiene celulosa o un derivado
al menos parcialmente esterificado de la misma, que después se lava
con una solución que elimina impurezas, especialmente endotoxinas,
después de lo cual se eluyen los bacteriófagos purificados.
10. Procedimiento de la reivindicación 9, en el
que la elución de endotoxinas se realiza por medio de agua, una
solución de una sustancia no disociante, o solución salina de una
concentración no mayor de 0,1 M, especialmente tamponada.
11. Procedimiento de la reivindicación 9, en el
que la elución de bacteriófagos se realiza por medio de una
solución de una sustancia no disociante, o cualquier tampón, o
solución salina de una concentración mayor de 0,05 M, especialmente
tamponada.
12. Procedimiento de la reivindicación 9, en el
que la elución de endotoxinas y bacteriófagos se realiza a
temperaturas de -25°C a 100°C.
13. Procedimiento de la reivindicación 9, en el
que la elución de endotoxinas y bacteriófagos se realiza usando una
solución acuosa de sal que contiene un disolvente orgánico.
14. Procedimiento de la reivindicación 13, en el
que el disolvente orgánico se elige entre el grupo que comprende
dimetilsulfóxido, dimetilformamida, isopropanol y acetona.
15. Procedimiento de la reivindicación 9, en el
que se usa como sustrato celulosa parcialmente esterificada con
ácido orgánico o inorgánico.
16. Procedimiento de la reivindicación 9, en el
que se usa celulosa parcialmente esterificada con ácido acético,
nítrico, sulfuroso o fosfórico.
17. Procedimiento de la reivindicación 9,
caracterizado porque: se usa celulosa en la que se han
esterificado del 0,01% al 5% de moléculas de glucosa, especialmente
del 0,25% al 1% de moléculas de glucosa.
18. Medicamento para el tratamiento o prevención
de infecciones debidas a un patógeno bacteriano, que comprende la
cepa de bacteriófago multivalente obtenible mediante el
procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1-17
específica para bacterias pertenecientes al género del patógeno
bacteriano.
19. Medicamento de la reivindicación 18, en el
que dicha cepa de bacteriófago multivalente específica para
bacterias del género Staphylococcus, posiblemente cepas
bacterianas resistentes a fármacos del género Staphylococcus
que aparece en Polonia, es una cepa de bacteriófago seleccionada
entre S1 (PCM F/00001), S2 (PCM F/00002), S3 (PCM F/00003), S4 (PCM
F/00004), S5 (PCMF/00005), S6 (PCMF/00006) y S7 (PCMF/00007),
especialmente, los fagos S1, S2 y S4 o S5.
20. Medicamento de la reivindicación 18,
caracterizado porque: sirve en el tratamiento o prevención
de infecciones que aparecen en pacientes con mucoviscidosis y, como
cepa de bacteriófago multivalente específica para bacterias del
género Staphylococcus, contiene al menos una cepa de
bacteriófagos seleccionada entre F/00002, F/00004 y F/00007.
21. Medicamento de la reivindicación 18, en el
que dicha cepa de bacteriófago multivalente específica para
bacterias del género Pseudomonas, posiblemente cepas
bacterianas resistentes a fármacos del género Pseudomonas
que aparecen en Polonia, es una cepa de bacteriófago seleccionada
entre P1 (PCM F/00008), P2 (PCM F/00009), P3 (PCM F/00010), P4 (PCM
F/00011), P5 (PCM F/00012), P6 (PCM F/00013), P7 (PCM F/00014), P8
(PCM F/00015), P9 (PCM F/00016), P10 (PCM F/00017), P11 (PCM
F/00018), P12 (PCM F/00019), P13 (PCM F/00020), P14 (PCM F/00021),
P15 (PCM F/00022), P16 (PCM F/00023), P17 (PCM F/00024), P18 (PCM
F/00025), P19 (PCM F/00026) y P20 (PCM F/00027), especialmente los
fagos P7, P20 y P6.
22. Medicamento de acuerdo con la reivindicación
18, caracterizado porque sirve en el tratamiento o
prevención de infecciones que aparecen en pacientes con
mucoviscidosis y, como cepa de bacteriófago multivalente específica
para bacterias del género Pseudomonas, contiene al menos una
cepa de bacteriófagos seleccionada entre F/00010, F/00013 y
F/00018.
\newpage
23. Uso de una cepa de bacteriófago multivalente
obtenida por el procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1-17 en la producción de una medicación para el
tratamiento o prevención de infecciones producidas por bacterias
patógenas.
24. Uso de la reivindicación 23, en el que para
la producción de una medicación para el tratamiento o prevención de
infecciones producidas por bacterias del género
Staphylococcus, posiblemente producidas por cepas
bacterianas resistentes a fármacos del género Staphylococcus
que aparecen en Polonia, se usa al menos una cepa de bacteriófagos
seleccionada entre S1 (PCM F/00001), S2 (PCM F/00002), S3 (PCM
F/00003), S4 (PCM F/00004), S5 (PCM F/00005), S6 (PCM F/00006) y S7
(PCM F/00007), especialmente los fagos S1, S2 y S4 o S5.
25. Uso de la reivindicación 23, en el que para
la producción de una medicación para el tratamiento o prevención de
infecciones que se producen en pacientes con mucoviscidosis
producidas por bacterias del género Staphylococcus, se usa
al menos una cepa de bacteriófago seleccionada entre F/00002,
F/00004 y F/00007.
26. Uso de la reivindicación 23, en el que para
la producción de una medicación para el tratamiento o prevención de
infecciones producidas por bacterias del género Pseudomonas,
posiblemente provocadas por cepas bacterianas resistentes a
fármacos del género Pseudomonas que aparecen en Polonia, se
usa al menos una cepa de bacteriófago seleccionada entre P1 (PCM
F/00008), P2 (PCM F/00009), P3 (PCM F/00010), P4 (PCM F/00011), P5
(PCM F/00012), P6 (PCM F/00013), P7 (PCM F/00014), P8 (PCM
F/00015), P9 (PCM F/00016), P10 (PCM F/00017), P11 (PCM F/00018),
P12 (PCM F/00019), P13 (PCM F/00020), P14 (PCM F/00021), P15 (PCM
F/00022), P16 (PCM F/00023), P17 (PCM F/00024), P18 (PCM F/00025),
P19 (PCM F/00026) y P20 (PCM F/00027), especialmente los fagos P7,
P20 y P6.
27. Uso de la reivindicación 23, en el que para
la producción de una medicación para el tratamiento o prevención de
infecciones que aparecen en pacientes con mucoviscidosis producidas
por bacteria del género Pseudomonas, se usa al menos una
cepa de bacteriófagos seleccionada entre F/00010, F/00013 y
F/00018.
28. Cepa de bacteriófago multivalente
seleccionada entre S1 (PCM F/00001), S2 (PCM F/00002), S3 (PCM
F/00003), S4 (PCM F/00004), S5 (PCM F/00005), S6 (PCM F/00006) y S7
(PCM F/00007), donde la cepa se caracteriza como específica
para bacterias del género Staphylococcus, posiblemente
específica para cepas bacterianas resistentes a fármacos del género
Staphylococcus que aparecen en Polonia.
29. Cepa de bacteriófago multivalente
seleccionada entre P1 (PCM F/00008), P2 (PCM F/00009), P3 (PCM
F/00010), P4 (PCM F/00011), P5 (PCMF/00012), P6 (PCMF/00013), P7
(PCM F/00014), P8 (PCM F/00015), P9 (PCM F/00016), P10 (PCM
F/00017), P1 (PCM F/00018), P12 (PCM F/00019), P13 (PCM F/00020),
P14 (PCM F/00021), P15 (PCM F/00022), P16 (PCM F/00023), P17 (PCM
F/00024), P18 (PCM F/00025), P19 (PCM F/00026) y P20 (PCM/00027),
donde la cepa se caracteriza como específica para bacterias
del género Pseudomonas, posiblemente específica para cepas
bacterianas resistentes a fármacos del género Pseudomonas que
aparecen en Polonia.
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| GB9220027D0 (en) | 1992-09-22 | 1992-11-04 | Mini Agriculture & Fisheries | Method and kits for detection of bacteria |
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| GB9500851D0 (en) | 1995-01-17 | 1995-03-08 | Bionvent International Ab | Method of selecting specific bacteriophages |
| DE19517940A1 (de) | 1995-05-18 | 1996-11-21 | Merck Patent Gmbh | Nachweis von Listerien mittels rekombinanter Bakteriophagen |
| JP2000508322A (ja) * | 1996-04-15 | 2000-07-04 | エヌワイエムオーエックス コーポレーション | バクテリオファージを含有する組成物および感染症を治療するためのバクテリオファージの使用方法 |
| WO1998008944A1 (fr) | 1996-08-26 | 1998-03-05 | Bio Venture Bank Co., Ltd. | Nouveau bacteriophage et procede de criblage associe, nouvelles matieres biobactericides preparees avec ledit bacteriophage et reactif utilise pour detecter celui-ci |
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| RU2109055C1 (ru) * | 1996-11-27 | 1998-04-20 | Дочернее предприятие "Биофаг" Научно-производственного объединения "Иммунопрепарат" | Способ выделения бактериофагов |
| DE19828596A1 (de) * | 1997-06-26 | 1999-02-11 | A Daniela Dr Nodar | Wirksames Arzneimittel gegen bakterielle Erkrankungen und Herstellung desselben |
| US6982153B1 (en) * | 1998-12-03 | 2006-01-03 | Targanta Therapeutics, Inc. | DNA sequences from staphylococcus aureus bacteriophage 77 that encode anti-microbial polypeptides |
| US6245504B1 (en) * | 1999-03-26 | 2001-06-12 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Transducing phages of Actinomycetales |
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