DE1296456B - Verfahren zur Gewinnung eines antiviralen Pflanzenschutzmittels - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung eines antiviralen PflanzenschutzmittelsInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine neue Substanz mit Den Antivirusfaktor erhält man in einer bestimm-
antiviraler Aktivität. Diese Substanz wird erfindungs- ten Fraktion, was sich in einem scharfen Maximum
gemäß aus mit Viren infizierten Pflanzen isoliert und der antiviralen Aktivität zeigt. Falls sich in dieser
gereinigt. Die erfindungsgemäß gereinigten Stoffe aktiven Fraktion noch weitere Verunreinigungen bekönnen
zur Kontrolle bzw. Einschränkung und Vor- 5 finden, können diese durch Dialyse oder durch
beugung sowie zur Behandlung von Virusinfektionen Exklusionschromatographie mit Molekularsieben
der Pflanzen verwendet werden. Diese Stoffe haben (J. Porath und D.Flodin, Nature, 183, S. 1657
einen hohen Wirkungsgrad. Sie können unter ge- [1959]) od. dgl. entfernt werden,
wissen Bedingungen für längere Zeit gelagert und Der gereinigte Antivirusfaktor, wie man ihn z. B.
nach Belieben angewendet werden. io aus mit Tabakmosaikvirus infizierter Nicotiana
Die neuen Substanzen werden im folgenden als glutinosa erhält, ist auch wirksam gegen andere
Antivirusfaktor, abgekürzt AVF, bezeichnet. Virustypen und auch bei anderen Pflanzen; selbst bei
Es wurde gefunden, daß mit Viren infizierte solchen, die anderen botanischen Familien ange-Pflanzen
eine Substanz erzeugen, die aus solchen hören.
Pflanzen nach der Isolierung rein dargestellt werden 15 Es kann angenommen werden, daß das gereinigte
können. Wenn man diesen gereinigten Antivirus- aktive Material Protein und RNA in einem Verhältfaktor
in vitro einem Virusimpfstoff zufügt, so wird nis von etwa 1:1 enthält. Diese Annahme gründet
dessen Infektionsfähigkeit wesentlich herabgesetzt sich auf eine proteinspezifische Reaktion (L ο wry),
(vgl. Virology, 22 [1962], S. 446 bis 451, und Bei- UV-Absorptionsspektren, Purin-und Pyrimidinbasenspiele
3 und 4). Die Existenz eines solchen Faktors ao analysen und RNA-Absorption bei 260ΐημ.
wurde bereits seit einigen Jahren vermutet; aber Die folgenden spezifischen Beispiele dienen ledig-
bisher war nichts bekannt über seine Isolierung und lieh zur weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne
Reinigung und die Möglichkeit seiner Anwendung in daß diese auf die beschriebenen Ausführungsformen
reiner Form zur Behandlung von Infektionen durch beschränkt ist. den gleichen Virus oder andere Viren. 25 Beisoiell
Der Antivirusfaktor wird erfindungsgemäß in . " . .
hochwirksamer gereinigter Form erhalten, wenn Gewinnung des Antivirusfaktors
zunächst der Saft aus virusinfizierten Pflanzen ge- aus Nicotiana glutinosa L.
wonnen und aus diesen der infektiöse Virus elimi- Blätter einer Pflanze von Nicotiana glutinöse L.
niert wird, worauf die Pigmente und Proteine, die 30 wurden mit Tabakmosaikvirus infiziert, nach 2 Tagen
keine antivirale Aktivität haben, abgetrennt werden. abgeerntet und in einer angemessenen Menge Wasser
Aus der verbleibenden Substanz wird der aktive zerkleinert. Der Saft wurde durch ein Seihtuch
Faktor durch Fraktionierung gewonnen, wozu der pasiert und zur Entfernung des infektiösen Virus mit
filtrierte Pflanzensaft mit Calciumphosphathydrat etwa der Hälfte seines Volumens an Calciumphosphatvermischt
und zentrifugiert wird und dies wiederholt 35 hydrat vermischt. Das Gemisch wurde bei 2500 Upm
wird, bis die überstehende Flüssigkeit keine Infek- während 15 Minuten zentrifugiert und die übertionsfähigkeit
besitzt. Die aktive Fraktion mit anti- stehende Flüssigkeit gesammelt. Diese Behandlung
viraler Spitzenwirkung ist chemisch rein und homo- wurde mehrmals wiederholt, bis die überstehende
gen, entsprechend den anerkannten Kriterien der Flüssigkeit nicht mehr infektiös war. Diese Flüssigkeit
Reinheit. Der gereinigte Antivirusfaktor ist selbst bei 40 wird als roher Antivirusfaktor bezeichnet. Sie kann
einer Verdünnung von weniger als 1 ppm noch wirk- unter Bedingungen, die nicht zur Inaktivierung fühsam
zur Herabsetzung der Infektionsfähigkeit eines ren, z. B. durch Gefriertrocknung, eingedampft und
Virusimpfstoffs, wenn er diesem beigemischt wird. in dieser Form angewendet oder auch noch weiter geWenn
man den Antivirusfaktor in ein virusinfiziertes reinigt werden.
Gewebe bringt, so wird die Virulenz des Virus be- 45 Die Lösung wurde zur Entfernung niedermoleträchtlich
herabgesetzt, und praktisch kann man kularer Verbindungen mit Wasser dialysiert und der
keine infektiösen Viren aus dem so behandelten Tiefkühltrocknung unterworfen. Man erhielt einen
Gewebe bekommen. braunen Feststoff von hoher antiviraler Aktivität, der
Die erste Stufe der Reinigung besteht aus der als trockener roher Antivirusfaktor bezeichnet wird.
Eliminierung des infektiösen Virus. Dies kann mittels 50 Diese Trockensubstanz kann ohne Aktivitätsverlust
eines Adsorbens, wie z. B. Calciumphosphathydrat in mit Paraffin verschlossenen Röhrchen bei 0° C
erfolgen (vgl. Fulton, Virology, 9, S. 522 bis 535 für 8 Monate gelagert werden.
[1959], und Tiselius et al., veröffentlicht durch Die weitere Reinigung kann folgendermaßen
O. Levin in Methods in Enzymology, Vol. V, 27, durchgeführt werden: Der rohe Antivirusfaktor wird
Academic Press, N. Y. [1962]). 55 ins Gleichgewicht gebracht mit 0,01m Phosphat-
Die weitere Reinigung kann durch Fraktionierung puffer vom pH-Wert 7,6. Zur Chromatographie wird
des Pflanzensaftes mittels Kolonnenchromatographie eine mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht geerfolgen,
wobei die Pigmente und nichtaktiven brachte DEAE-Anionenaustauschkolonne verwendet.
Proteine abgetrennt werden. Zur Chromatographie Der rohe Antivirusfaktor wird auf die Kolonne gekönnen
Ionenaustauscher verwendet werden, z. B. 60 bracht und mit dem genannten Puffer gespült. Durch
Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE) oder Carboxy- kontinuierliche Erhöhung der NaCl-Konzentration
methylcellulose (CMC), wie sie von Petersen und wird der Antivirusfaktor eluiert, und es werden kleine
Sober, Methods in Enzymology, Vol. V (1962), Fraktionen des Effluens aufgefangen. Der Antivirus S.
3 bis 27, beschrieben sind. Die Kolonnen werden faktor findet sich in den bei 0,40- bis 0,60molarem
in bekannter Weise mit geeigneten Pufferlösungen 65 NaCl hervorgehenden Fraktionen. Die aktiven Frakkonditioniert,
und die Elution erfolgt mit entweder tionen werden vereinigt, und das NaCl wird durch
kontinuierlicher oder schrittweiser Erhöhung der Dialyse oder Entsalzung entfernt. Die entsalzten
Natriumchloridkonzentration im Ausgangspuff er. Fraktionen werden wieder in einer DEAE-Kolonne
adsorbiert, und es werden NaCl-Lösungen mit steigenden
Konzentrationen von 0,40- bis 0,65molar aufgegeben. Beim Eluieren werden die Fraktionen von
0,50- bis 0,64molar gesammelt. In einigen Fällen haben auch die Fraktionen von 0,42- bis 0,48molar
antivirale Aktivität. Nach Vereinigung der Fraktionen wird das NaCl entfernt. Die salzfreie Lösung
wird mit verdünnter Säure oder einem sauren Puffer angesäuert. Im voliegenden Fall wird mit 0,01molarem
Acetatpuffer auf pH 4,0 abgeglichen. Die saure Lösung wird auf eine CMC-Kolonne gegeben, und
die nicht adsorbierte Fraktion wird aufgefangen. Diese Lösung wird auf pH 7,6 eingestellt und auf
eine DEAE-Kolonne gegeben. Zur Chromatographie werden wäßrige NaCl-Lösungen in stufenweisen
Konzentrationen von 0,40- bis 0,65 normal verwendet und die entsprechenden Fraktionen aufgefangen.
Der so gewonnene Antivirusfaktor hat etwa die 5000fache Wirksamkeit wie der rohe AVF, wie im
Beispiel 3 noch ausgeführt wird.
ao
Reinigung des Rohen Antivirusfaktors
Der in der ersten Stufe gemäß Beispiel 1 gewonnene rohe AVF wurde, wie dort beschrieben, auf einen Anionenaustauscher gebracht. 25 mg trockener roher AVF wurden in 0,01molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,6 gelöst, auf eine DEAE-Kolonne gebracht und mit 100 ecm einer Lösung von NaCl im gleichen Puffer gewaschen. Die mit 0,55molarem NaCl eluierte Fraktion wurde aufgefangen. Nach Entfernung des NaCl wurde auf pH 4,0 eingestellt. Dann wurde diese Fraktion mit 0,01molarem Acetatpuffer vom pH-Wert 4,0 abgeglichen und auf eine CMC-Kolonne gebracht. Die nicht adsorbierte Fraktion wurde gesammelt. Nach Einstellung auf pH 7,6 wurde sie wieder in einer DECA-Kolonne adsorbiert. Für die Eluierung wurde wie im Beispiel 1 die Konzentration der NaCl-Lösung von 0,40- bis 0,65molar geändert. Die Fraktionen zwischen 0,50- und 0,64molar wurden gesammelt. Man erhielt 100 mg gereinigten AVF. Die höchste Aktivität wurde für 0,57- bis 0,58molar gefunden.
Der in der ersten Stufe gemäß Beispiel 1 gewonnene rohe AVF wurde, wie dort beschrieben, auf einen Anionenaustauscher gebracht. 25 mg trockener roher AVF wurden in 0,01molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,6 gelöst, auf eine DEAE-Kolonne gebracht und mit 100 ecm einer Lösung von NaCl im gleichen Puffer gewaschen. Die mit 0,55molarem NaCl eluierte Fraktion wurde aufgefangen. Nach Entfernung des NaCl wurde auf pH 4,0 eingestellt. Dann wurde diese Fraktion mit 0,01molarem Acetatpuffer vom pH-Wert 4,0 abgeglichen und auf eine CMC-Kolonne gebracht. Die nicht adsorbierte Fraktion wurde gesammelt. Nach Einstellung auf pH 7,6 wurde sie wieder in einer DECA-Kolonne adsorbiert. Für die Eluierung wurde wie im Beispiel 1 die Konzentration der NaCl-Lösung von 0,40- bis 0,65molar geändert. Die Fraktionen zwischen 0,50- und 0,64molar wurden gesammelt. Man erhielt 100 mg gereinigten AVF. Die höchste Aktivität wurde für 0,57- bis 0,58molar gefunden.
Die aktive Fraktion wurde weiter gereinigt durch Dialyse mit dem Standardpuffer, wobei Salze entfernt
wurden. Dann wurde die Lösung wiederum an DEAE adsorbiert und mit 2molarem NaCl im Standardpuffer
eluiert. Die gesammelten aktiven Fraktionen hatten ein Absorptionsmaximum bei 260 πΐμ.
Das gereinigte Material schien Protein und RNA entweder als Nucleoprotein oder als Mischung von
beiden zu enthalten.
Beispiel 3
Aktivität des Antivirusfaktors
Aktivität des Antivirusfaktors
SS
Die mit etwa 0,57molarem NaCl eluierte Fraktion, wie man sie in den Endstufen der Beispiele 1 und 2
erhält, wurde mit 0,01molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,6 dialysiert.
Ein Impfstoff des Tabakmosaikvirus wurde folgendermaßen hergestellt:
1 g virusinfizierte Tabakblätter wurden in 15 ecm Wasser mazeriert, und dann wurde mit dem oben
beschriebenen Effluens auf 1:10 verdünnt, so daß sich für 1 g Blätter 150 ecm gepufferte Lösung ergaben.
Blätter einer Versuchspflanze (Datura stramonium L.) wurden mit einem solchen Impfstoff mit
und ohne Zugabe von AVF beimpft. Der reine Impfstoff verursachte lokale Schaden, während der Impfstoff
mit AVF zu keinen Schäden führte.
Beispiel 4
Antivirusfaktor auf Gewebe in vivo
Antivirusfaktor auf Gewebe in vivo
Der nach Beispiel 1 oder 2 gewonnene gereinigte AVF wurde durch Tiefkühltrocknung konzentriert.
Ein Konzentrat mit einem Gehalt von mindestens 20μg/ccm wurde auf ein virusinfiziertes Gewebe in
vivo aufgebracht. Bei diesem Versuch wurden mit Tabakmosaikvirus infizierte Tabakblätter mit AVF-Lösung
begossen oder in diese eingetaucht. Die Viruskonzentration im Gewebe nahm rasch ab, und nach
einiger Zeit war der Virus völlig verschwunden.
Weitere Versuche wurden gemacht mit einer AVF-Zubereitung, die in 0,01molarem Natriumphosphatpuffer
bei pH 7,6 gelöst war. Die Konzentration wurde mit einem Beckmann-DU-Spektrophotometer
auf ein Absorptionsvermögen von 0,090 bis 0,150 Einheiten bei 260 ηΐμ eingestellt. Die entsprechende
Proteinkonzentration dieser Lösungen lag im Bereich von 6 bis 10 μg Protein pro Kubikzentimeter, gemessen
mit dem Phenolreagens nach Lowry et al., (1951) J. Biol. Chem., 193, S. 265 bis 275.
Die AVF-Aktivität wurde geprüft an jungen Blättern verschiedener Pflanzen, die 10 Monate vor
der AVF-Behandlung mit Tabakmosaikvirus (TMV) bzw. 2 Monate vorher mit einem der zwei Stämme
des Cucumbermosaikvirus (CMV) beimpft worden waren. Einer dieser CMV-Stämme verursacht keine
lokalen Schäden auf Zinnia elegans Jacq., während der andere nicht nur lokale Schäden hervorruft, sondern
auch sich systematisch in der Pflanze ausbreitet. Dieser Stamm wird als CMC-LL bezeichnet. Die infizierten
Blätter wurden geerntet, und ihre Mittelrippen wurden entfernt. Jeweils eines der beiden symmetrischen
Halbblätter wurde in AVF-Lösung getaucht (behandeltes Halbblatt); das zweite Halbblatt
wurde für die gleiche Dauer in den Standardpuffer getaucht (Vergleichsblatt). Nach 24 bis 28 Stunden
wurden die Halbblätter aus ihren Lösungen herausgenommen und mit Standardpuffer gründlich gewaschen.
Jedes Blatt wurde in einem bestimmten Volumen Standardpuffer homogenisiert, und der erhaltene
Saft wurde als Impfstoff verwendet.
Die Virusinfektionsfähigkeit der Säfte aus den behandelten und den Vergleichshalbblättern wurde
mittels des Halbblattests bestimmt (vgl. Samuel und
Bald [1933], Ann. App. Biol., 20, S. 70 bis 99). TMV enthaltende Säfte wurden auf Halbblätter von
Datura stramonium L. und CMV enthaltende Säfte auf Halbblätter von Chenopodium amaranticolor
Coste & Reyn. aufgebracht.
Die Virusimpfstoffe wurden zu einer solchen Konzentration verdünnt, daß die Zahl der hervorgerufenen
lokalen Schaden im linearen Teil der Schadenkonzentrationskurve lagen.
Für jeden Versuch wurden wenigstens sechs Blätter von D. stramonium und zwölf Blätter von C. amaranticolor
verwendet. Der Rückgang der Infektionsfähigkeit wurde berechnet als Prozentsatz des Schutzes
auf der Basis von 0% Schutz bei den Vergleichshalbblättern.
Bei der Behandlung der infizierten Blätter von Z. elegans oder Gomphrena globosa L. mit AVF
wurden die gleichen Maßnahmen angewandt, jedoch mit den gegenüberliegenden Blättern an Stelle der
Halbblätter.
Bei allen Versuchen (44 Versuche mit TMV und 13 Versuche mit CMV) wurden gegenüber den Vergleichsblättern
eine erhebliche Abnahme der Infektionsfähigkeit der Viren an den behandelten HaIbblättern
festgestellt
Spezielle Kontrollversuche wurden angestellt, um die Möglichkeit auszuschalten, daß etwa einiger wirksamer
AVF nach der Waschung an oder in den behandelten Blättern zurückgeblieben sein könnte.
Wenn nicht aller wirksamer AVF ausgewaschen ist, verursacht der zurückgebliebene AVF eine Abnahme
der Infektionsfähigkeit, wenn im Prüfrohr unter Homogenisierung mit dem Virus gemischt wird. Bei
diesen Kontrollversuchen wurden verdünnte Impfstoffe von infektiösen Viren zu Säften gegeben, die
man aus nicht infizierten, mit AVF bzw. mit Puffer behandelten Blättern gewonnen hatte. Es wurde keine
Abnahme der Infektionsfähigkeit festgestellt. Diese zeigt, daß nach dem Waschen kein wirksamer AVF
an oder in den Blättern zurückgeblieben war.
Aus den Ergebnissen ist die antivirale Wirkung des AVF an Gewebe in vivo zu ersehen. Der Antivirusfaktor
unterdrückt deutlich den infektiösen Virus von Blattgeweben, die lange Zeit vor der AVF-Behandlung
infiziert worden waren. Die Ergebnisse zeigen auch die Wirkung im Innern der infizierten Gewebe.
Wirkung des Antivirusfaktors auf die Infektionsfähigkeit von Extrakten aus viruserkrankten Blättern a)
Wirtspflanze | Viruskonzentration | Testpflanze | Gesamtzahl | der 10-kalen | behandelten | Schutz | |
Schäden auf Halbblättern, | Halbblättern | ||||||
Virus | (g/Blätter/ | beimpft mit Säften von | 208 | (°/o) | |||
Tabak | ecm Standardpuffer) | D. stramonium | Vergleichs | 200 | 0 | ||
Tabak | 1:150 b) | D. stramonium | halbblättern | 215 | 0 | ||
Nicht infiziert | Tabak | 1:150 b) | D. stramonium | 253 | 847 | 0 | |
Nicht infiziert | Tabak | 1:150 b) | D. stramonium | 179 | 33 | 45 | |
Nicht infiziert | Tabak | 1:40 | D. stramonium | 175 | 42 | 75 | |
TMV | Tabak | 1:120 | D. stramonium | 1548 | 52 | 97 | |
TMV | Z. elegans | 1:150 | D. stramonium | 131 | 394 | 97 | |
TMV | G. globosa | 1:4 | D. stramonium | 1685 | 285 | 34 | |
TMV | Cucumber | 1:8 | D. stramonium | 2043 | 406 | 0 | |
TMV | Cucumber | 1:150") | D. stramonium | 595 | 168 | 0 | |
Nicht infiziert | Cucumber | 1:150 b) | C. amaranti color | 278 | 108 | 0 | |
Nicht infiziert | Cucumber | 1:6«=) | C. amaranti color | 432 | 125 | 0 | |
Nicht infiziert | Cucumber | 1:6C) | C. amaranti color | 171 | 79 | 48 | |
Nicht infiziert | Cucumber | 1:6 | C. amaranti color | 109 | 50 | 68 | |
CMV | Cucumber | 1:6 | C. amaranti color | 241 | 49 | 82 | |
CMV | Cucumber | 1:6 | C. amaranti color | 244 | 1 | 64 | |
CMV | Cucumber | 1:6 | C. amaranti color | 284 | 9 | 98 | |
CMV-LL | Z. elegans | 1:6 | C. amaranti color | 139 | 95 | ||
CMV-LL | 1:3 | 49 | |||||
CMV-LL | 167 | ||||||
a) Alle Versuche wurden analysiert mit dem t-Test für entsprechende Proben (a = 0,01).
b) TMV-Impfstoff wurde bis zu einer Endkonzentration an TMV von 1:150 verdünnt mit nicht infiziertem Blätterextrakt.
Letzterer war vorher auf die gleiche Verdünnung gebracht wie der. entsprechende Extrakt aus infizierten Blättern.
c) CMV-Impfstoff wurde in gleicher Weise wie der TMV-Impfstoff verdünnt, jedoch mit einer CMV-Konzentration von 1: 6.
Selbstverständlich kann der Antivirusfaktor in gereinigter Form aus verschiedenen Quellen gewonnen
werden. Das Reinigungsverfahren wird jeweils dem speziellen Ausgangsstoff angepaßt. Das gereinigte
Material kann zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Virusinfektionen bei Pflanzen angewendet werden.
Die Anwendung kann je nach dem Zweck und den Umständen in Form von Lösungen, Sprühpulvern,
Tabletten usw. oder in Form von pharmazeutischen Zubereitungen erfolgen.
Das als roher Antivirusfaktor bezeichnete Material kann bei O0C für viele Monate ohne Aktivitätsverlust aufbewahrt werden. Das gereinigte Material
kann in Form einer Lösung bei kühler Lagerung (etwa 0° C) mindestens 1 Monat ohne merklichen
Aktivitätsverlust aufbewahrt werden.
Claims (4)
1. Verfahren zur Gewinnung eines antiviralen Pflanzenschutzmittels (Antivirusfaktor),
dadurch gekennzeichnet, daß Gewebe von virusinfizierten Pflanzen mazeriert und der
infektiöse Virus in an sich bekannter Weise durch Adsorption aus dem Mazerationssaft entfernt
wird, wozu der filtrierte Pflanzensaft mit Calciumphosphathydrat vermischt und zentrifugiert
wird und dies wiederholt wird, bis die überstehende Flüssigkeit keine Infektionsfähigkeit
besitzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die rohe Antivirusfaktorlösung
mit Phosphatpuffer auf pH 7,6 gebracht, über eine DEAE-Änionaustauschkolonne geführt und
mit 0,4- bis 0,64molaren NaCl-Lösungen der gereinigte Antivirusfaktor eluiert und das Eluat entsalzt
und diese Reinigungsstufe gegebenenfalls wiederholt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen zwei Reinigungsstufen
mit Anionenaustauschern die entsalzte Antivirusfaktorlösung auf pH 4,0 gebracht, über
eine CMC-Kationenaustauschersäule geführt und mit 0,4- bis 0,64molarer NaCI-Lösung der Tiefkühltrocknung
unterworfen wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die gereinigte Lösung der
Tiefkühltrocknung unterworfen wird.
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- 1964-04-06 GB GB14184/64A patent/GB1105474A/en not_active Expired
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