DE1296456B

DE1296456B - Verfahren zur Gewinnung eines antiviralen Pflanzenschutzmittels

Info

Publication number: DE1296456B
Application number: DEY930A
Authority: DE
Inventors: Birk; Harzpaz; Sela Ilan; Dr Yehudith; Dr Yitzschak
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1964-04-06
Filing date: 1965-04-05
Publication date: 1969-05-29
Also published as: NL6504363A; GB1105474A; BE662146A

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Substanz mit Den Antivirusfaktor erhält man in einer bestimm-

antiviraler Aktivität. Diese Substanz wird erfindungs- ten Fraktion, was sich in einem scharfen Maximum gemäß aus mit Viren infizierten Pflanzen isoliert und der antiviralen Aktivität zeigt. Falls sich in dieser gereinigt. Die erfindungsgemäß gereinigten Stoffe aktiven Fraktion noch weitere Verunreinigungen bekönnen zur Kontrolle bzw. Einschränkung und Vor- 5 finden, können diese durch Dialyse oder durch beugung sowie zur Behandlung von Virusinfektionen Exklusionschromatographie mit Molekularsieben der Pflanzen verwendet werden. Diese Stoffe haben (J. Porath und D.Flodin, Nature, 183, S. 1657 einen hohen Wirkungsgrad. Sie können unter ge- [1959]) od. dgl. entfernt werden, wissen Bedingungen für längere Zeit gelagert und Der gereinigte Antivirusfaktor, wie man ihn z. B.

nach Belieben angewendet werden. io aus mit Tabakmosaikvirus infizierter Nicotiana

Die neuen Substanzen werden im folgenden als glutinosa erhält, ist auch wirksam gegen andere Antivirusfaktor, abgekürzt AVF, bezeichnet. Virustypen und auch bei anderen Pflanzen; selbst bei

Es wurde gefunden, daß mit Viren infizierte solchen, die anderen botanischen Familien ange-Pflanzen eine Substanz erzeugen, die aus solchen hören.

Pflanzen nach der Isolierung rein dargestellt werden 15 Es kann angenommen werden, daß das gereinigte können. Wenn man diesen gereinigten Antivirus- aktive Material Protein und RNA in einem Verhältfaktor in vitro einem Virusimpfstoff zufügt, so wird nis von etwa 1:1 enthält. Diese Annahme gründet dessen Infektionsfähigkeit wesentlich herabgesetzt sich auf eine proteinspezifische Reaktion (L ο wry), (vgl. Virology, 22 [1962], S. 446 bis 451, und Bei- UV-Absorptionsspektren, Purin-und Pyrimidinbasenspiele 3 und 4). Die Existenz eines solchen Faktors ao analysen und RNA-Absorption bei 260ΐημ. wurde bereits seit einigen Jahren vermutet; aber Die folgenden spezifischen Beispiele dienen ledig-

bisher war nichts bekannt über seine Isolierung und lieh zur weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne Reinigung und die Möglichkeit seiner Anwendung in daß diese auf die beschriebenen Ausführungsformen reiner Form zur Behandlung von Infektionen durch beschränkt ist. den gleichen Virus oder andere Viren. 25 Beisoiell

Der Antivirusfaktor wird erfindungsgemäß in . " . .

hochwirksamer gereinigter Form erhalten, wenn Gewinnung des Antivirusfaktors

zunächst der Saft aus virusinfizierten Pflanzen ge- aus Nicotiana glutinosa L.

wonnen und aus diesen der infektiöse Virus elimi- Blätter einer Pflanze von Nicotiana glutinöse L.

niert wird, worauf die Pigmente und Proteine, die 30 wurden mit Tabakmosaikvirus infiziert, nach 2 Tagen keine antivirale Aktivität haben, abgetrennt werden. abgeerntet und in einer angemessenen Menge Wasser Aus der verbleibenden Substanz wird der aktive zerkleinert. Der Saft wurde durch ein Seihtuch Faktor durch Fraktionierung gewonnen, wozu der pasiert und zur Entfernung des infektiösen Virus mit filtrierte Pflanzensaft mit Calciumphosphathydrat etwa der Hälfte seines Volumens an Calciumphosphatvermischt und zentrifugiert wird und dies wiederholt 35 hydrat vermischt. Das Gemisch wurde bei 2500 Upm wird, bis die überstehende Flüssigkeit keine Infek- während 15 Minuten zentrifugiert und die übertionsfähigkeit besitzt. Die aktive Fraktion mit anti- stehende Flüssigkeit gesammelt. Diese Behandlung viraler Spitzenwirkung ist chemisch rein und homo- wurde mehrmals wiederholt, bis die überstehende gen, entsprechend den anerkannten Kriterien der Flüssigkeit nicht mehr infektiös war. Diese Flüssigkeit Reinheit. Der gereinigte Antivirusfaktor ist selbst bei 40 wird als roher Antivirusfaktor bezeichnet. Sie kann einer Verdünnung von weniger als 1 ppm noch wirk- unter Bedingungen, die nicht zur Inaktivierung fühsam zur Herabsetzung der Infektionsfähigkeit eines ren, z. B. durch Gefriertrocknung, eingedampft und Virusimpfstoffs, wenn er diesem beigemischt wird. in dieser Form angewendet oder auch noch weiter geWenn man den Antivirusfaktor in ein virusinfiziertes reinigt werden.

Gewebe bringt, so wird die Virulenz des Virus be- 45 Die Lösung wurde zur Entfernung niedermoleträchtlich herabgesetzt, und praktisch kann man kularer Verbindungen mit Wasser dialysiert und der keine infektiösen Viren aus dem so behandelten Tiefkühltrocknung unterworfen. Man erhielt einen Gewebe bekommen. braunen Feststoff von hoher antiviraler Aktivität, der

Die erste Stufe der Reinigung besteht aus der als trockener roher Antivirusfaktor bezeichnet wird. Eliminierung des infektiösen Virus. Dies kann mittels 50 Diese Trockensubstanz kann ohne Aktivitätsverlust eines Adsorbens, wie z. B. Calciumphosphathydrat in mit Paraffin verschlossenen Röhrchen bei 0° C erfolgen (vgl. Fulton, Virology, 9, S. 522 bis 535 für 8 Monate gelagert werden. [1959], und Tiselius et al., veröffentlicht durch Die weitere Reinigung kann folgendermaßen

O. Levin in Methods in Enzymology, Vol. V, 27, durchgeführt werden: Der rohe Antivirusfaktor wird Academic Press, N. Y. [1962]). ₅₅ ins Gleichgewicht gebracht mit 0,01m Phosphat-

Die weitere Reinigung kann durch Fraktionierung puffer vom pH-Wert 7,6. Zur Chromatographie wird des Pflanzensaftes mittels Kolonnenchromatographie eine mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht geerfolgen, wobei die Pigmente und nichtaktiven brachte DEAE-Anionenaustauschkolonne verwendet. Proteine abgetrennt werden. Zur Chromatographie Der rohe Antivirusfaktor wird auf die Kolonne gekönnen Ionenaustauscher verwendet werden, z. B. 60 bracht und mit dem genannten Puffer gespült. Durch Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE) oder Carboxy- kontinuierliche Erhöhung der NaCl-Konzentration methylcellulose (CMC), wie sie von Petersen und wird der Antivirusfaktor eluiert, und es werden kleine Sober, Methods in Enzymology, Vol. V (1962), Fraktionen des Effluens aufgefangen. Der Antivirus S. 3 bis 27, beschrieben sind. Die Kolonnen werden faktor findet sich in den bei 0,40- bis 0,60molarem in bekannter Weise mit geeigneten Pufferlösungen 65 NaCl hervorgehenden Fraktionen. Die aktiven Frakkonditioniert, und die Elution erfolgt mit entweder tionen werden vereinigt, und das NaCl wird durch kontinuierlicher oder schrittweiser Erhöhung der Dialyse oder Entsalzung entfernt. Die entsalzten Natriumchloridkonzentration im Ausgangspuff er. Fraktionen werden wieder in einer DEAE-Kolonne

adsorbiert, und es werden NaCl-Lösungen mit steigenden Konzentrationen von 0,40- bis 0,65molar aufgegeben. Beim Eluieren werden die Fraktionen von 0,50- bis 0,64molar gesammelt. In einigen Fällen haben auch die Fraktionen von 0,42- bis 0,48molar antivirale Aktivität. Nach Vereinigung der Fraktionen wird das NaCl entfernt. Die salzfreie Lösung wird mit verdünnter Säure oder einem sauren Puffer angesäuert. Im voliegenden Fall wird mit 0,01molarem Acetatpuffer auf pH 4,0 abgeglichen. Die saure Lösung wird auf eine CMC-Kolonne gegeben, und die nicht adsorbierte Fraktion wird aufgefangen. Diese Lösung wird auf pH 7,6 eingestellt und auf eine DEAE-Kolonne gegeben. Zur Chromatographie werden wäßrige NaCl-Lösungen in stufenweisen Konzentrationen von 0,40- bis 0,65 normal verwendet und die entsprechenden Fraktionen aufgefangen. Der so gewonnene Antivirusfaktor hat etwa die 5000fache Wirksamkeit wie der rohe AVF, wie im Beispiel 3 noch ausgeführt wird.

ao

Beispiel 2

Reinigung des Rohen Antivirusfaktors
Der in der ersten Stufe gemäß Beispiel 1 gewonnene rohe AVF wurde, wie dort beschrieben, auf einen Anionenaustauscher gebracht. 25 mg trockener roher AVF wurden in 0,01molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,6 gelöst, auf eine DEAE-Kolonne gebracht und mit 100 ecm einer Lösung von NaCl im gleichen Puffer gewaschen. Die mit 0,55molarem NaCl eluierte Fraktion wurde aufgefangen. Nach Entfernung des NaCl wurde auf pH 4,0 eingestellt. Dann wurde diese Fraktion mit 0,01molarem Acetatpuffer vom pH-Wert 4,0 abgeglichen und auf eine CMC-Kolonne gebracht. Die nicht adsorbierte Fraktion wurde gesammelt. Nach Einstellung auf pH 7,6 wurde sie wieder in einer DECA-Kolonne adsorbiert. Für die Eluierung wurde wie im Beispiel 1 die Konzentration der NaCl-Lösung von 0,40- bis 0,65molar geändert. Die Fraktionen zwischen 0,50- und 0,64molar wurden gesammelt. Man erhielt 100 mg gereinigten AVF. Die höchste Aktivität wurde für 0,57- bis 0,58molar gefunden.

Die aktive Fraktion wurde weiter gereinigt durch Dialyse mit dem Standardpuffer, wobei Salze entfernt wurden. Dann wurde die Lösung wiederum an DEAE adsorbiert und mit 2molarem NaCl im Standardpuffer eluiert. Die gesammelten aktiven Fraktionen hatten ein Absorptionsmaximum bei 260 πΐμ. Das gereinigte Material schien Protein und RNA entweder als Nucleoprotein oder als Mischung von beiden zu enthalten.

Beispiel 3
Aktivität des Antivirusfaktors

SS

Die mit etwa 0,57molarem NaCl eluierte Fraktion, wie man sie in den Endstufen der Beispiele 1 und 2 erhält, wurde mit 0,01molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,6 dialysiert.

Ein Impfstoff des Tabakmosaikvirus wurde folgendermaßen hergestellt:

1 g virusinfizierte Tabakblätter wurden in 15 ecm Wasser mazeriert, und dann wurde mit dem oben beschriebenen Effluens auf 1:10 verdünnt, so daß sich für 1 g Blätter 150 ecm gepufferte Lösung ergaben. Blätter einer Versuchspflanze (Datura stramonium L.) wurden mit einem solchen Impfstoff mit und ohne Zugabe von AVF beimpft. Der reine Impfstoff verursachte lokale Schaden, während der Impfstoff mit AVF zu keinen Schäden führte.

Beispiel 4
Antivirusfaktor auf Gewebe in vivo

Der nach Beispiel 1 oder 2 gewonnene gereinigte AVF wurde durch Tiefkühltrocknung konzentriert. Ein Konzentrat mit einem Gehalt von mindestens 20μg/ccm wurde auf ein virusinfiziertes Gewebe in vivo aufgebracht. Bei diesem Versuch wurden mit Tabakmosaikvirus infizierte Tabakblätter mit AVF-Lösung begossen oder in diese eingetaucht. Die Viruskonzentration im Gewebe nahm rasch ab, und nach einiger Zeit war der Virus völlig verschwunden.

Weitere Versuche wurden gemacht mit einer AVF-Zubereitung, die in 0,01molarem Natriumphosphatpuffer bei pH 7,6 gelöst war. Die Konzentration wurde mit einem Beckmann-DU-Spektrophotometer auf ein Absorptionsvermögen von 0,090 bis 0,150 Einheiten bei 260 ηΐμ eingestellt. Die entsprechende Proteinkonzentration dieser Lösungen lag im Bereich von 6 bis 10 μg Protein pro Kubikzentimeter, gemessen mit dem Phenolreagens nach Lowry et al., (1951) J. Biol. Chem., 193, S. 265 bis 275.

Die AVF-Aktivität wurde geprüft an jungen Blättern verschiedener Pflanzen, die 10 Monate vor der AVF-Behandlung mit Tabakmosaikvirus (TMV) bzw. 2 Monate vorher mit einem der zwei Stämme des Cucumbermosaikvirus (CMV) beimpft worden waren. Einer dieser CMV-Stämme verursacht keine lokalen Schäden auf Zinnia elegans Jacq., während der andere nicht nur lokale Schäden hervorruft, sondern auch sich systematisch in der Pflanze ausbreitet. Dieser Stamm wird als CMC-LL bezeichnet. Die infizierten Blätter wurden geerntet, und ihre Mittelrippen wurden entfernt. Jeweils eines der beiden symmetrischen Halbblätter wurde in AVF-Lösung getaucht (behandeltes Halbblatt); das zweite Halbblatt wurde für die gleiche Dauer in den Standardpuffer getaucht (Vergleichsblatt). Nach 24 bis 28 Stunden wurden die Halbblätter aus ihren Lösungen herausgenommen und mit Standardpuffer gründlich gewaschen. Jedes Blatt wurde in einem bestimmten Volumen Standardpuffer homogenisiert, und der erhaltene Saft wurde als Impfstoff verwendet.

Die Virusinfektionsfähigkeit der Säfte aus den behandelten und den Vergleichshalbblättern wurde mittels des Halbblattests bestimmt (vgl. Samuel und Bald [1933], Ann. App. Biol., 20, S. 70 bis 99). TMV enthaltende Säfte wurden auf Halbblätter von Datura stramonium L. und CMV enthaltende Säfte auf Halbblätter von Chenopodium amaranticolor Coste & Reyn. aufgebracht.

Die Virusimpfstoffe wurden zu einer solchen Konzentration verdünnt, daß die Zahl der hervorgerufenen lokalen Schaden im linearen Teil der Schadenkonzentrationskurve lagen.

Für jeden Versuch wurden wenigstens sechs Blätter von D. stramonium und zwölf Blätter von C. amaranticolor verwendet. Der Rückgang der Infektionsfähigkeit wurde berechnet als Prozentsatz des Schutzes auf der Basis von 0% Schutz bei den Vergleichshalbblättern.

Bei der Behandlung der infizierten Blätter von Z. elegans oder Gomphrena globosa L. mit AVF wurden die gleichen Maßnahmen angewandt, jedoch mit den gegenüberliegenden Blättern an Stelle der Halbblätter.

Bei allen Versuchen (44 Versuche mit TMV und 13 Versuche mit CMV) wurden gegenüber den Vergleichsblättern eine erhebliche Abnahme der Infektionsfähigkeit der Viren an den behandelten HaIbblättern festgestellt

Spezielle Kontrollversuche wurden angestellt, um die Möglichkeit auszuschalten, daß etwa einiger wirksamer AVF nach der Waschung an oder in den behandelten Blättern zurückgeblieben sein könnte. Wenn nicht aller wirksamer AVF ausgewaschen ist, verursacht der zurückgebliebene AVF eine Abnahme der Infektionsfähigkeit, wenn im Prüfrohr unter Homogenisierung mit dem Virus gemischt wird. Bei diesen Kontrollversuchen wurden verdünnte Impfstoffe von infektiösen Viren zu Säften gegeben, die man aus nicht infizierten, mit AVF bzw. mit Puffer behandelten Blättern gewonnen hatte. Es wurde keine Abnahme der Infektionsfähigkeit festgestellt. Diese zeigt, daß nach dem Waschen kein wirksamer AVF an oder in den Blättern zurückgeblieben war.

Aus den Ergebnissen ist die antivirale Wirkung des AVF an Gewebe in vivo zu ersehen. Der Antivirusfaktor unterdrückt deutlich den infektiösen Virus von Blattgeweben, die lange Zeit vor der AVF-Behandlung infiziert worden waren. Die Ergebnisse zeigen auch die Wirkung im Innern der infizierten Gewebe.

Wirkung des Antivirusfaktors auf die Infektionsfähigkeit von Extrakten aus viruserkrankten Blättern a)

	Wirtspflanze	Viruskonzentration	Testpflanze	Gesamtzahl	der 10-kalen	behandelten	Schutz
				Schäden auf Halbblättern,	Halbblättern
Virus		(g/Blätter/		beimpft mit Säften von	208	(°/o)
	Tabak	ecm Standardpuffer)	D. stramonium	Vergleichs	200	0
	Tabak	1:150 ^b)	D. stramonium	halbblättern	215	0
Nicht infiziert	Tabak	1:150 ^b)	D. stramonium	253	847	0
Nicht infiziert	Tabak	1:150 ^b)	D. stramonium	179	33	45
Nicht infiziert	Tabak	1:40	D. stramonium	175	42	75
TMV	Tabak	1:120	D. stramonium	1548	52	97
TMV	Z. elegans	1:150	D. stramonium	131	394	97
TMV	G. globosa	1:4	D. stramonium	1685	285	34
TMV	Cucumber	1:8	D. stramonium	2043	406	0
TMV	Cucumber	1:150")	D. stramonium	595	168	0
Nicht infiziert	Cucumber	1:150 ^b)	C. amaranti color	278	108	0
Nicht infiziert	Cucumber	1:6«=)	C. amaranti color	432	125	0
Nicht infiziert	Cucumber	1:6^C)	C. amaranti color	171	79	48
Nicht infiziert	Cucumber	1:6	C. amaranti color	109	50	68
CMV	Cucumber	1:6	C. amaranti color	241	49	82
CMV	Cucumber	1:6	C. amaranti color	244	1	64
CMV	Cucumber	1:6	C. amaranti color	284	9	98
CMV-LL	Z. elegans	1:6	C. amaranti color	139		95
CMV-LL		1:3	49
CMV-LL		167

a) Alle Versuche wurden analysiert mit dem t-Test für entsprechende Proben (a = 0,01).

b) TMV-Impfstoff wurde bis zu einer Endkonzentration an TMV von 1:150 verdünnt mit nicht infiziertem Blätterextrakt. Letzterer war vorher auf die gleiche Verdünnung gebracht wie der. entsprechende Extrakt aus infizierten Blättern.

c) CMV-Impfstoff wurde in gleicher Weise wie der TMV-Impfstoff verdünnt, jedoch mit einer CMV-Konzentration von 1: 6.

Selbstverständlich kann der Antivirusfaktor in gereinigter Form aus verschiedenen Quellen gewonnen werden. Das Reinigungsverfahren wird jeweils dem speziellen Ausgangsstoff angepaßt. Das gereinigte Material kann zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Virusinfektionen bei Pflanzen angewendet werden. Die Anwendung kann je nach dem Zweck und den Umständen in Form von Lösungen, Sprühpulvern, Tabletten usw. oder in Form von pharmazeutischen Zubereitungen erfolgen.

Das als roher Antivirusfaktor bezeichnete Material kann bei O⁰C für viele Monate ohne Aktivitätsverlust aufbewahrt werden. Das gereinigte Material kann in Form einer Lösung bei kühler Lagerung (etwa 0° C) mindestens 1 Monat ohne merklichen Aktivitätsverlust aufbewahrt werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung eines antiviralen Pflanzenschutzmittels (Antivirusfaktor), dadurch gekennzeichnet, daß Gewebe von virusinfizierten Pflanzen mazeriert und der infektiöse Virus in an sich bekannter Weise durch Adsorption aus dem Mazerationssaft entfernt wird, wozu der filtrierte Pflanzensaft mit Calciumphosphathydrat vermischt und zentrifugiert wird und dies wiederholt wird, bis die überstehende Flüssigkeit keine Infektionsfähigkeit besitzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die rohe Antivirusfaktorlösung mit Phosphatpuffer auf pH 7,6 gebracht, über eine DEAE-Änionaustauschkolonne geführt und mit 0,4- bis 0,64molaren NaCl-Lösungen der gereinigte Antivirusfaktor eluiert und das Eluat entsalzt und diese Reinigungsstufe gegebenenfalls wiederholt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen zwei Reinigungsstufen mit Anionenaustauschern die entsalzte Antivirusfaktorlösung auf pH 4,0 gebracht, über eine CMC-Kationenaustauschersäule geführt und mit 0,4- bis 0,64molarer NaCI-Lösung der Tiefkühltrocknung unterworfen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die gereinigte Lösung der Tiefkühltrocknung unterworfen wird.