DE1260080B

DE1260080B - Verfahren zur Reinigung von Interferon

Info

Publication number: DE1260080B
Application number: DEG42227A
Authority: DE
Inventors: Karl Heinz Pantes
Original assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Current assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Priority date: 1963-12-10
Filing date: 1964-12-09
Publication date: 1968-02-01
Also published as: BE656920A; GB1055896A; NL6414384A; SE341049B; GB1055895A; US3414651A; DK112269B; CH484202A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

A61k

Deutsche Kl.: 30 h-6

Nummer: 1260 080

Aktenzeichen: G 42227IV a/30 h

Anmeldetag: 9. Dezember 1964

Auslegetag: 1. Februar 1968

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Reinigung der nichtspezifischen antiviralen Substanz Interferon.

Der Name »Interferon« wurde einem nichtspezifischen antiviralen Stoff gegeben, der aus Zellen und extracellularen Flüssigkeiten gewonnen werden kann. Es wurde bereits eine erhebliche experimentelle Arbeit zur Erforschung dieses Stoffes geleistet: D. C. B u r k e, ßiochem. J., 78, (3), S. 556, 1961; V. M a y e r et al., Acta Vir., 5, S. 130,1961; J. Porterfiel d, Lancet, 12.9.1959, S. 326; R. Pollikoff, Bact. Proc. (61. Treffen), 56, S. 158, 1961; J. Z em la und J.Vlcek, Acta Vir., 5, S. 129, 1961; A.Isaacs Virus Growth & Variation; 9. Symposium der Ges. für Gen. Microbiol., Cambridge Univ. Press 1959, S. 102; R.Wagner, Bact. Rev., 24, (1), S. 151, 1960; A.Isaacs und Lind e nm.ann , J. Proc. Roy. Soc, B., 147, S. 258, 1957; E. D e M a y e r und J. F. E η d e r s , Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 107 (3), S. 573, 1961. Werden lebende Zellen mit einem lebenden, abgeschwächten oder teilweise inaktivierten Virus in Berührung gebracht, so werden sie dazu .angeregt, einen solchen antiviralen Stoff zu erzeugen, der in der extracellularen Flüssigkeit in Freiheit gesetzt wird und in verschiedenen Reinheitsgraden isoliert werden kann. Das auf diese Weise hergestellte Interferon scheint im allgemeinen nichtspezifisch hinsichtlich- seines Schutzvermögens gegen andere Viren zu sein, und zwar zusätzlich zu dem einen, das dazu verwendet wird, die Zellen anzuregen, obwohl Unterschiede in der Empfindlichkeit gegen Interferon bei verschiedenen Viren beobachtet werden. Es wurde jedoch - gefunden, daß Interferon gewöhnlich den Gewebe- und Zellarten, aus denen es hergestellt wurde, einen besseren Schutz verleiht als anderen Geweben und Zellen.

Das Interferon ist normalerweise mit einer Vielzahl anderer wasserlöslicher Stoffe assoziiert, vor allem mit Proteinen; bei einer beabsichtigten Verabreichung des Interferons als medizinisches Präparat, vor allem bei parenteraler Verabreichung, ist ein ausreichender Reinheitsgrad vorzuziehen.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in einem verbesserten Verfahren zur Reinigung eines Materials, das Interferon enthält.

Es wurde gefunden, daß bei der Behandlung einer wäßrigen Lösung, die Interferon sowie Protein-Verunreinigungen enthält, mit einem wasserlöslichen Thiocyanat oder Jodid bei einem pH-Wert unter 5,0 din erheblicher Teil des assoziierten Proteins ausgefällt wird, während das Interferon in Lösung bleibt öder nur in beträchtlich geringerem Ausmaß aus-Verfahren zur Reinigung von Interferon

Anmelder:

Glaxo Laboratories Limited,

Greenford, Middlesex (Großbritannien)

Vertreter:

Dr. F. Zumstein, Dr. E. Assmann

und Dr. R. Koenigsberger, Patentanwälte,

8000 München 2, Bräuhausstr. 4

Als Erfinder benannt:

Karl Heinz Pantes,

Bushey, Hertfordshire (Großbritannien)

Beanspruchte Priorität:

Großbritannien vom 10. Dezember 1963 (48 761)

gefällt wird, wobei die spezifische Aktivität des Interferonmaterials ansteigt.

Erfindungsgemäß wird deshalb ein Verfahren zur Reinigung eines Interferon enthaltenden Materials geschaffen, durch das unerwünschtes Protein aus einer wäßrigen Lösung dieses Materials bei einem pH-Wert unter 5,0, insbesondere 3,0 bis 4,0 mittels eines wasserlöslichen Salzes ausgefällt wird, das Jodid- oder Thiocyanationen liefert.
Das Salz, das Thiocyanat- oder Jodidionen liefert und in Wasser natürlich löslich sein muß, kann an Hand von Löslichkeitstabellen ausgesucht werden. Im allgemeinen werden jedoch die Alkali- und Ammoniumsalze und, sofern in Wasser löslich, die Erdalkalisalze bevorzugt.

Der pH-Wert der Interferon enthaltenden Lösung liegt vorzugsweise oberhalb 2,0, um jegliche Neigung zur Zersetzung des Produktes auf ein Mindestmaß zu reduzieren. In vorteilhafter Weise liegt der pH-Wert zwischen 3,0 und 4,0, am besten bei ungefähr 3,5. Die Molarität des Ausfällsalzes ist in der Lösung vorzugsweise wenigstens 0,lmolar und in vorteilhafter Weise 0,3molar oder darüber. Im Falle der Jodice ist die optimale Molarität ungefähr 0,7molar. Molaritäten oberhalb ungefähr l,0molar scheinen zur Erzielung

der gewünschten Ausfällung nicht notwendig zu sein, sind jedoch andererseits auch nicht in irgendwelcher Beziehung unvorteilhaft. .

709 747/508

Wie vorstehend bereits erwähnt, kann die Proteinausfällung durch Zugabe eines Thiocyanate oder Jodids zu einer wäßrigen Lösung des Interferonmaterials bei einem pH-Wert nicht größer als 5,0 durchgeführt werden, das Jodid oder Thiocyanat kann aber auch bei einem pH-Wert oberhalb 5,0 zugegeben werden, worauf Säure zur Einstellung des pH-Wertes auf einen Wert von 3,5 bis 4,0 zugesetzt wird, das unlösliche Protein entfernt wird und der pH-Wert auf einen Wert von 3,0,bis 3,5 eingestellt wird, worauf weiteres Protein entfernt wird. Es ist zweckmäßig, den pH-Wert in mehr als einer Stufe einzustellen, um jegliche Tendenz des Interferons zur Mitfällung auf ein Minimum herabzusetzen.

In dem Patent 1 201 511 wurde die Reinigung eines Interferon enthaltenden Materials durch Absorption an Aluminiumsilikat bei einem pH-Wert unter 6 und Eluierung mittels eines wäßrigen Elektrolyten bei einem pH-Wert größer als 5,5 vorgeschlagen. Das Aluminiumsilikat besitzt ein hohes molares Verhältnis von Siliciumdioxyd zu Aluminiumoxyd, vorzugsweise ist es größer als 5. Das Adsorbens ist vorzugsweise ein synthetisches amorphes Material mit kleiner Teilchengröße, und zwar werden als Materialien, die unter den geschützten Warenzeichen Doucil und Alusil erhältlich sind, bevorzugt. Dieses Prinzip kann auf die Verwendung von Siliciumdioxyd, vorzugsweise auf ausgefälltes oder sublimiertes Siliciumdioxyd als Adsorptionsmittel ausgedehnt werden, wobei die unter den geschützten Warenzeichen Neosyl und Aerosil erhältlichen Materialien bevorzugt wurden.

Das vorzugsweise verwendete Eluiermittel bei diesem vorstehenden Verfahren ist eine wäßrige Lösung eines Salzes, wie beispielsweise eines Alkaliphosphats, bei einem pH-Wert von ungefähr 7 bis 8 und einer Molarität von 0,1- bis 0,7molar. Es wurde nun gefunden, daß das als Fällmittel verwendete Thiocyanat oder Jodid als Elektrolyt in dem Eluiermittel verwendet werden kann und daß im wesentlichen während der Eluierung keine Proteinausfällung erfolgt, da der pH-Wert des Eluiermittels größer als 5,5, normalerweise 7,5, ist. Wird jedoch der pH-Wert des Eluats durch Zugabe von Säure auf 5,0 oder darunter, beispielsweise auf ungefähr 3,5, eingestellt, so fallen die Proteinverunreinigungen aus und können entfernt werden.

Das gesamte Verfahren, bestehend aus Adsorption, Eluierung mit Thiocyanat und Proteinfällung, ist sehr wirksam, dabei war es möglich, die spezifische Aktivität auf diese Weise auf das 19fache bei 5facher Konzentration zu steigern.

Nach der Ausfällung wird das unerwünschte Protein aus der Lösung entfernt, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Die erhaltene wäßrige Lösung kann dann gewünschtenfalls anderen Verfahrensstufen unterworfen werden, wie beispielsweise Ausfällung des Interferons und Entfernung weiterer Verunreinigungen.

Das Interferon kann aus wäßriger Lösung, beispielsweise durch Ausfällung, gewonnen werden. Mit Wasser mischbare Alkohole und Ketone, wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Aceton u. dgl., sind besonders nützliche Fällungsmittel, da sie leicht von dem Niederschlag abgetrennt werden können, beispielsweise durch Eindampfen, während feste Fällmittel, wie beispielsweise Ammoniumsulfat u. dgl., normalerweise eine anschließende Dialyse erforderlich machen. Die Ausfällung mit derartigen organischen Lösungsmitteln wird vorzugsweise in dem pH-Bereich zwischen 6 und 9, in vorteilhafter Weise bei ungefähr 7,5, durchgeführt. Beim Wiederauflösen eines derartigen Niederschlags in Wasser oder einer Pufferlösung, wie beispielsweise einer Earlschen Pufferlösung, stellt man fest, daß ein Teil des unerwünschten Proteins denaturiert und unlöslich ist, wodurch wiederum die spezifische Aktivität des Interferonmaterials erhöht wird.

Ein weiterer nützlicher Reinigungsschritt ist die Behandlung der Interferonendlösung mit einem Anionenaustauschharz, wie beispielsweise Diäthylaminoäthylcellulose, wobei weiteres inaktives Protein entfernt wird, während das Interferon im wesentlichen unbeeinflußt bleibt.

Die erfindungsgemäß bevorzugteste Folge von Verfahrensschritten ist nachstehend angegeben:

a) Adsorption des Interferonmaterials auf ein Adsorbens, wie beispielsweise das unter dem geschützten Warenzeichen erhältliche »Doucil« oder das unter dem geschützten Warenzeichen erhältliche »Alusil« bei saurem pH-Wert.

b) Eluierung des Interferona mit einer wäßrigen Lösung eines Thiocyanate oder Jodids bei höherem pH-Wert (oberhalb 5,5).

c) Ansäuerung, um den pHrWert des Eluats auf unter 5,0, vorzugsweise ungefähr 3,0, einzustellen, wobei die vorteilhafteste Methode darin besteht, auf einen pH-Wert von. 3,5 anzusäuern, den Niederschlag zu entfernen, weiterhin zur Einstellung auf einen pH-Wert von 3,0 anzusäuern und weiteren Niederschlag,zu entfernen.

d) Einstellung der erhaltenen Interferonlösung auf einen höheren pH-Wert, beispielsweise auf 6 bis 9, vorzugsweise ungefähr 7,5, und Ausfällung des Interferons mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie beispielsweise Methanol, Äthanol oder Aceton, worauf in einem kleineren Volumen Wasser oder verdünnter Pufferlösung eine Wiederauflösung erfolgt und denaturiertes Protein entfernt wird.

e) Chromatographie der Interferonlösung mit einem Anionenaustauscherharz, wie beispielsweise Diäthylaminoäthylcellulose, wobei weiteres Protein entfernt wird.

Es wurde gefunden, daß eine derartige Folge von Verfahrensstufen die spezifische Aktivität des Interferons um das öOOOfache steigern kann, wobei jede Stufe zur Durchführung in industriellem Maßstab geeignet ist und die Vermeidung der Dialyse ein besonders herausragendes Merkmal in diesem Zusammenhang darstellt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Herstellung von Interferon aus jeder beliebigen Zellenart, die durch ein Virus angeregt wird, angewendet werden, wiebeispielsweiseEichorioallantoismembranzellenoder ganze Kükenembryonen, die durch Influenza-, Newcastle-Kranheits-, Vogelpest-Virus u. dgl, angeregt wurden, oder Säugetierzellen, wie beispielsweise Affennieren-, menschliche Embryonalhüllenzellen oder sogar Zellreihen, die mit diesen oder anderen Viren infiziert wurden. Die Züchtung derartiger lebender Materialien und die dabei erforderlichen optimalen Bedingungen sind gut bekannt (M. H o. und J. F. E nd e r s , Proc. Nat. Acad. Sei., 45, S. 385,1959 [menschliche Nierenzellen]; A. I s a a c s und C. H i t c hcock, Lancet, 9. 7.1960, S. 9 [Lungen infizierter

Mäuse]; E. DeMayer und J. F. E η d e r s , Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 107, [3], S. 573, 1961 [menschliche Amnionzellen]).

Das Verfahren kann in jeder geeigneten Stufe bei der Reinigung des Interferons angewendet werden. So kann man das Medium einer Virus-Zell-Kultur dem erfindungsgemäßen Verfahren direkt zur Erzielung einer Reinigung des Interferons unterziehen, vorzugsweise nach der Entfernung von Gewebe- oder Zellbruchstücken.

Man kann auch das erfindungsgemäße Verfahren auf die Interferon enthaltende Lösung anwenden, die bereits teilweise durch andere Maßnahmen gereinigt wurde, beispielsweise durch selektive Ausfällung des Proteins, z. B. mit Ammoniumsulfat, Dialyse usw., wobei eine weitere Reinigung des Interferons erreicht wird.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken:

Interferonquelle

a) Kükeninterferon

9 bis 11 Tage alte Kükenembryonen wurde allantoisch mit geeigneten Verdünnungen eines Influenzavirus (z.B. B/England, A/Melbourne, A/Singapore oder Kunz; gewöhnlich 0,5 ml, die 100 bis 500 HA-Einheiten enthalten) geimpft. Die Eier wurden dann zur Inkubation 48 bis 72 Stunden lang auf 37°C gehalten und anschließend zur Abkühlung in einen kalten Raum gestellt. Die Allantoisflüssigkeit wird gesammelt und gegen einen Citratpuffer mit einem pH-Wert von 2,0 dialysiert oder auf einen pH-Wert von 2 angesäuert (beispielsweise mit Salzsäure) und ungefähr 16 bis 24 Stunden lang bei 4° C gehalten. (Dadurch wird das Virus getötet und auch seine hämagglutinierende Wirkung ohne Beeinflussung des Interferontiters zerstört.) Die Flüssigkeit wird dann durch Zugabe von n-NaOH oder durch Dialyse gegen einen geeigneten Puffer auf einen pH-Wert von 7,0 bis 7,4 neutralisiert und dann als Ausgangsmaterial zum experimentellen Arbeiten verwendet. Sie wird im folgenden als »rohes Interferon« bezeichnet. Die ionischen Konzentration der Lösung ist ungefähr isotonisch.

b) Affeninterferon

Die Kulturflüssigkeit einer 7 bis 10 Tage alten Monoschicht von Cyanomolgus-Affennierenzellen (in einer Roux-Flasche) wird gegen 100 ml Parker's 199 Medium ausgetauscht, das ein wenig zusätzliches NaNCO₃ (ungefähr 0,1 %) enthält. Dieses wird dann mit 1 ml Kunz-Virus (ungefähr 4000 HA-Einheiten) infiziert. Die Kulturen werden dann zur Inkubation 3 Tage lang bei 37°C gehalten. Die Kulturflüssigkeit, die das Interferon enthält, wird dann gesammelt, mit Salzsäure zur Tötung des Virus auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und nach 3 bis 16 Stunden wieder neutralisiert. Die ionische Konzentration der Lösung ist ungefähr isotonisch.

Interferonbestimmung

Eine Untersuchung hinsichtlich der Wirkungs- bzw. Befallsverminderung gemäß dem Verfahren von Isaacs et al., Lancet, 9. 7.1960, S. 69, wurde angewendet. Als Kükeninterferon wurden Kükenembryomonoschichten und Semliki Forest-Virus und als Affeninterferon AffennierenzeUen und M 6-Virus verwendet. Zur Affennieren- und Kükeninterferonuntersuchung wurde manchmal ein Reagenzglasversuch angewandt, wobei die Verdünnung einer Probe, die 50% der Zellen vor viralem Angriff schützte, ein Maß für den Interferongehalt darstellte.

Proteinbestimmung

Das Verfahren von L ο w r y et al. (J. Biol. Chem., 193, S. 265, 1951) wurde verwendet.

Beispiel 1

Zur Durchführung eines informatorischen Versuchs wurde festes KSCN einer rohen Kükeninterferonlösung, die, wie unter b) beschrieben, hergestellt worden war, zur Erzeugung von 0,4-, 1,0- und 2,0molaren Konzentrationen zugesetzt. Teile dieser Flüssigkeiten wurden mit HCl auf pH-Werte von 3,0, 3,5, 4,0 und 4,5 eingestellt und 16 Stunden lang bei 4° C stehengelassen. Das ausgefällte Protein wurde durch Zentrifugieren entfernt. Die Interferon- und Gesamtproteingehalte der Ausgangsflüssigkeit und des erhaltenen KSCN-Überstands (nach der Neutralisation und Dialyse gegen Earle'schen Puffer) wurden bestimmt; die Ergebnisse zeigt Tabelle I.

Tabelle I

Die Ergebnisse zeigen, daß die meiste oder die ganze

Aktivität in dem Überstand blieb, während das inaktive Protein durch Ausfällung entfernt wurde.

Bei niedrigeren pH-Werten und höheren KSCN-Konzentrationen wurde mehr Protein ausgefällt. Bei einem pH-Wert von 4 wurden nur 40 bis 50% ^unc* bei einem pH-Wert von 4,5 nur 25 bis 30% des inerten Proteins entfernt. Bei einem pH-Wert von 3 und bei hoher KSCN-Konzentration auch bei einem pH-Wert von 3,5 wurde wahrscheinlich etwas Aktivität durch Mitfällung verloren (doch besaßen die erneut suspendierten Niederschläge keinerlei Aktivität).

	1	pH	% Wirkungs- bzw.	Va	/la	Protein	43	0	1530	%
			Befallsverminderung,				52	29	470
		verursacht durch Verdünnung		μg/ml	49	40	210	100
	3,0	des Interferons		Ausgangsflüssigkeit	53	32	140	31
KSCN-Über-			71 ι 60	50	37	500	14
stanc		50	45	25	470	9
	3,5	62	62	39	210	33
Molarität		63	43	31	890	31
		72	48	28	770	14
0,4	4,0	61	73	31	780	58
1,0		53	69	43	1140	50
2,0		86	43	35	1100	51
0,4	4,5	62	25	1050	75
1,0		57		72
2,0	98	69
0,4	81
1,0	59
2,0
0,4
1,0
2,0

Beispiel 2

In einem zweiten Versuch wurde rohes Interferon mit 0,4molarem KSCN bei einem pH-Wert von 3,5 unter Bedingungen behandelt, die denen des Beispiels 1

ähnelten. Die Interferonaktivität wurde jedoch auf andere Weise gemessen, und zwar durch Auffinden der Verdünnung, die 50% des cytopathischen Effekts hemmt, der durch das Semliki Forest-Virus auf Küken-Fibroblastzellschichten verursacht wurde. Die Ergebnisse zeigt Tabelle II.

■ Tabelle!!

Ausgangsflüssigkeit
KSCN-Überstand .

Interferon

/120 /120

100 100

Protein

1060 230

	Tabelle	IV	7o	Protein	7o
	Volumen		100	μ§/ΐη1	100
	ml	Interferon	75	1310	34
5 Ausgangsfiussigkeiten	40	Titer	50	2230	36
0,4molare Eluate ...	8	80	75	2350	36
0,6molare Eluate ...	8	300		2340
0,8molare Eluate ...	8	200	50		2,7
ίο 0,4molar, pH		300		180
3,5 Überstand	8		50		2,6
0,6molar, pH		200		170
3,5-Überstand....	8		50		2,7
0,8molar, pH		200		180
15 3,5-Überstand	8
200

Der Überstand enthielt die ganze Aktivität, und nur 22 % des ursprünglichen Proteins, d. h. das Interferon, wurde fünfmal ohne Verlust gereinigt.

Beispiel 3

Die Wirkung verschiedener Konzentrationen von KI bei einem pH-Wert von 3,3 auf Interferon und das gesamte Protein wurde mit der von 0,5molarem KSCN bei dem gleichen pH-Wert verglichen. Die experimentellen Bedingungen ähnelten denen des Beispiels 2. Die Ergebnisse sind in Tabelle III aufgeführt.

^:-'^JiV Tabelle III

Ausgangsflüssigkeit

pH 3,3, Überstand aus
KI0,4molar

0,6molar

0,8molar

ijOmölar

KSCN 0,5molar

Interferon	7o	Pro
Titer	100	μg/πll
80	50	1400
40	50	430
40	50	360
40	50	300
40	50	280
40	280

Die Wirkung des KI glich der des KSCN, obwohl etwas höhere molare Konzentrationen an KI vielleicht notwendig wären.

KCl und KBr, 0,4- bis l,0molar, fällten bei einem pH-Wert von 3,3 nur wenig inertes Protein.

Beispiel 4

Im Patent 1201511 wurde vorgeschlagen, daß Interferon von bestimmten Aluminiumsilikaten adsorbiert und unter geeigneten Bedingungen unter Verwendung kleinerer Volumen Salzlösungen wieder eluiert wird, wobei eine Konzentration und Reinigung erzielt wird.

In diesem Beispiel wurde Interferon von 4 mg/ml des Aluminiumsilikats »Doucil« (geschütztes Warenzeichen) bei einem pH-Wert von 5 adsorbiert; es wurden Anteile mit 0,4-, 0,6- und 0,8molaren KSCN-Lösungen bei einem pH-Wert 7,5 eluiert, wobei in jedem Falle ein Volumen verwendet wurde, das ein Fünftel von dem der Ausgangsflüssigkeit betrug. Eluatproben wurden auf Interferon und Protein untersucht, die Rückstände auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und ihre Überstände erneut untersucht. Die Ergebnisse zeigt Tabelle IV.

Dieser Versuch zeigte, daß 0,4- bis 0,8molares KSCN-Interferon in 50- bis 75%iger Ausbeute von einem Doucil- (geschütztes Warenzeichen) Adsorbens

zo eluierte, wobei fünffache Konzentrate, bezogen auf das Volumen, bei gleichzeitiger Reinigung erhalten wurde. Ein Ansäuern der Eluate auf einen pH-Wert von 3,5 hatte eine weitere bemerkenswerte Reinigung zur Folge. Auf diese Weise wurden fünffache Konzenträte, bezogen auf das Volumen, erhalten, die 50% der gesamten Interferonaktivität und nur 2,6 bis 2,7% des Gesamtproteins enthielten, was einen 19fachen Anstieg der spezifischen Aktivität bedeutet.

Beispiel 5

Die Ansäuerung von KSCN-Doucil-Eluaten oder von anderen KSCN enthaltenden Flüssigkeiten kann in vorteilhafter Weise in zwei Stufen durchgeführt werden, wobei das Risiko des Verlustes von Interferon durch Mitfällung auf ein Mindestmaß herabgesetzt wird.

Ein Überstand mit einem pH-Wert von 3,5 eines 0,4molaren KSCN-Doucil-Eluates wurde auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt, dabei wurde weiteres Protein beim Stehen bei 4⁰C ausgefällt, welches erneut durch Zentrifugieren entfernt wurde. Die Ergebnisse zeigt Tabelle V.

45	3,5-Überstand 3,0-Überstand .	Tabelle V	feron 7o	Protein μ/ml j 7o	100 24
		100 100	530 130
5o pH pH

	Inter Titer
/200 /200

Eine weitere 4fache Reinigung ohne Aktivitätsverlust wurde auf diese Art erzielt.

Beispiel 6

Es wurde gefunden, daß Interferon aus KSCN-Doucil-Eluaten (nach einer Behandlung bei einem pH-Wert von 3,5, Entfernung des ausgefällten Proteins und Neutralisation des Überstandes) mit einigen mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln (beispielsweise niedrigen Alkoholen oder Ketonen, wie Methanol, Äthanol oder Aceton) ausgefällt werden konnte. Anders als bei anderen Eluaten, z. B. bei Phosphateluaten, verursacht die Zugabe derartiger Lösungsmittel nicht die gleichzeitige Ausfällung des anorganischen Salzes; die Niederschläge können

deshalb erneut aufgelöst und weiter direkt auf beispielsweise Ionenaustauschern fraktioniert werden, ohne daß dabei zur Verminderung der Ionenkonzentration eine vorherige Dialyse notwendig ist.

Die Ausfällung mit einem organischen Lösungsmittel unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen denaturiert weiteres inaktives Protein. Wird der Proteinniederschlag in Earleschem Puffer oder in einer anderen Salzlösung aufgenommen, so löst sich das denaturierte Protein nicht mehr auf und kann beispielsweise durch Abzentrifugieren entfernt werden, wobei eine weitere Reinigung eintritt. Da das mit dem Lösungsmittel ausgefällte Material erneut in einem Volumen aufgelöst werden kann, das wesentlich kleiner ist als das Volumen, das zur Vorfällung verwendet wurde, wird ebenfalls eine zusätzliche Konzentration erhalten. Diese Punkte zeigt Tabelle VL Bei diesem Experiment wurde das Doucil- (geschütztes Warenzeichen) Eluat nach der Behandlung bei einem pH-Wert von 3,5 und der Entfernung des ausgefällten Proteins durch Zentrifugieren mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. 5 Volumteile Methanol wurden zugegeben. Nach 16stündigem ίο Stehen bei 4⁰C wurde das ausgefällte Protein durch Zentrifugieren gesammelt. Der Niederschlag wurde in einem geringen Volumen Earleschen Puffer suspendiert und denaturiertes Protein nach kurzem Schütteln entfernt.

Tabelle VI

Volumen ml Konzentrationsfaktor

Interferon	7»	Protein	7o
Titer	100	^g/ml	100
40	100	1370	29
200	75	1960	7,5
150	80	. 510	0,63
3200	860

Reinigungsfaktor

Ausgangsflüssigkeit

0,4molares KSCN-Eluat von Doucil (geschütztes Warenzeichen)

Überstand nach der Behandlung bei einem pH von 3,5

Erneut aufgelöster und geklärter Methanolniederschlag

1000

200

10

Bei diesem Versuch wurde das Interferon lOOmal, bezogen auf das Volumen, konzentriert, die gesamte gewonnene Aktivität betrug 80 %> das Gesamtprotein 0,63 %> und die spezifische Aktivität war um das 128fache angestiegen.

Beispiel 7

Eine Probe eines teilweise gereinigten Kükeninterferons, das durch Doucil- (geschützes Warenzeichen) Adsorption, KSCN-Elution und Behandlung bei einem pH-Wert von 3,5 (Material A) erhalten worden war, wurde bei einem pH-Wert von 7,5 mit 5 Volumteilen Methanol ausgefällt. Der erhaltene Niederschlag wurde in einem kleinen Volumen 0,01molarem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 aufgenommen, worauf die Lösung geklärt wurde. Diese wurde an einer Diäthylaminoäthylcellulosekolonne beim selben pH-Wert und der gleichen Molarität fraktioniert. Die Aktivität wurde nicht von der Kolonne zurückgehalten, hingegen ein großer Teil des unwesentlichen Proteins. Die so erhaltenen Fraktionen besaßen sehr hohe spezifische Aktivitäten: Der größere Teil der aktiven Fraktionen enthielt ungefähr 40% der Gesamtaktivität des »Materials A«, jedoch nur 0,87% ihres gesamten Proteins. Diese Fraktionen waren bei ungefähr 0,004 μg Protein pro Milliliter aktiv, während die rohe Allantoisflüssigkeit, aus der sie erhalten worden waren, bei ungefähr 23 μ g/ml aktiv war; das Interferon war auf diese Weise ungefähr 6000fach gereinigt worden. Die meisten gereinigten Fraktionen enthielten einige 250 000 Interferon-Einheiten pro Milligramm Protein, einige der einzelnen Fraktionen enthielten wesentlich mehr (1 Interferon-Einheit wird als die Verdünnung definiert, die eine 50%ige Hemmung der cytopathischen Wirkung bewirkt, die durch das Semliki Forest-Virus auf Kükenembryofibroblastzellschichten verursacht wurde).

100

3,5
10,2
128

Bemerkung

Das vorstehend beschriebene Verfahren kann im wesentlichen reines Interferon in guter Ausbeute liefern, und zwar durch Verfahrensstufen, die leicht in fabrikationsmäßigem Maßstab durchgeführt werden können. Es ist keine besondere Ausrüstung erforderlich, das Material muß nicht bei jeder Stufe dialysiert werden.

Beispiel 8

KSCN kann ebenfalls zur Reinigung von anderen Interferonen als Kükeninterferon verwendet werden. Bei diesem Versuch wurde rohes Affeninterferon (hergestellt durch die Einwirkung des Kunzschen Züchtungsstammes eines Influenza Α-Virus auf Cyanomolgus-Affennierenzellen) mit 4 mg/ml Doucil (geschütztes Warenzeichen) bei einem pH-Wert von 5 zur Adsorbierung des Interferons behandelt. Die Elution wurde mit 0,5molarem KSCN bei einem pH-Wert von 7,5 unter Verwendung von einem Fünftel des Volumens des ursprünglichen Interferons durchgeführt. Der pH-Wert des Eluats wurde auf den Wert von 3,5 eingestellt, das ausgefällte Protein wurde durch Zentrifugieren entfernt. Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle VII.

Tabelle VII

Volumen
ml

Affeninterferon-Ausgangsflüssigkeit ..

0,5molares KSCN-Doucil-Eluat

pH 3,5-Überstand ..

110

22 22

Interferon
Titer I 7o

¹J,

40

/150
/S50

100

75
125

Protein

190

250
105

Das Affeninterferon wurde in guter Ausbeute 5mal, bezogen auf das Volumen, konzentriert und gleichzeitig ungefähr lOfacb gereinigt.

709 747/508

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Reinigung eines Interferon enthaltenden Materials, dadurch gekennzeichne t,· daß unerwünschtes Protein aus einer wäßrigen Lösung dieses Materials bei einem pH-Wert unter 5,0, insbesondere 3,0 bis 4,0, mittels eines wasserlöslichen Salzes ausgefällt wird, welches Jodid- oder Tbiocyanationen liefert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch.gekennzeichnet, daß als wasserlösliches Salz ein Alkalioder Ammoniumthiocyanat oder -jodid oder ein wasserlösliches Erdalkalithiocyanat oder -jodid verwendet wird.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Salz der wäßrigen Lösung, die Interferon enthält, bei einem pH-Wert oberhalb 5,0 zugegeben wird, daraufhin Säure zur Einstellung des pH-Wertes auf einen Wert von 3 5 bis 4,0 zugesetzt wird, so das unlösliche Protein entfernt wird und der pH-Wert auf einen Wert von 3,0 bis 3,5 eingestellt wird, worauf weiteres Protein entfernt wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch' gekennzeichnet, daß das

Interferon auf einem feinteiligen Aluminiumsilikat-Adsorbiermittel, das ein über dem Wert 5 liegendes Verhältnis von Siliciumdioxyd zu Aluminiumoxyd besitzt oder bei einem pH-Wert von weniger als 6,0 auf Siliciumdioxyd adsorbiert und mit einer wäßrigen Lösung eines Salzes, das Jodid- oder Thiocyanationen liefert, bei einem pH-Wert größer als 5,5 eluiert wird und der pH-Wert des Eluats anschließend zur Ausfällung unerwünschten Proteins auf einen Wert unterhalb 5,0 eingestellt wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Entfernung des ausgefällten Proteins das Interferon aus der wäßrigen Lösung bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9 durch Zugabe einer mit Wasser mischbaren organischen Flüssigkeit ausgefällt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das ausgefällte Interferon erneut in einem wäßrigen Medium aufgelöst, die Lösung von ungelöst gebliebenen Begleitproteinen abgetrennt und gegebenenfalls über eine Säule von Diäthylaminoäthylcellulose geschickt und der Durchlauf gesammelt wird.