DE3418187C2

DE3418187C2 -

Info

Publication number: DE3418187C2
Application number: DE3418187A
Authority: DE
Inventors: Lajos Dr. Ferenczy; Antal Szeged Hu Mai; Istvan Dr. Ott; Gabor Dr. Ambrus; Tibor Dr. Budapest Hu Lang
Original assignee: Biogal Gyogyszergyar Rt
Current assignee: Teva Pharmaceutical Works PLC
Priority date: 1983-05-16
Filing date: 1984-05-16
Publication date: 1991-12-19
Also published as: HU194306B; GB8412364D0; GB2146015A; FI79551C; FI841951A0; GB2146015B; FI841951A; DE3418187A1; FR2546180A1; US4729951A; FI79551B; CH662582A5; FR2546180B1; BE899661A; HUT34235A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Aminoglykosid-Antibiotica enthaltenden Gärbrühen beziehungsweise Fermentationsbrühen durch genetische Rekombination in vivo zur qualitativen und quantitativen Erhöhung der Antibioticumerzeugung in Mikroorganismen.

Aminoglykosid-Antibiotica werden weitgehend in der Humantherapie eingesetzt und sind von großer wirtschaftlicher Bedeutung. Wegen ihres breiten Wirkungsspektrums werden sie nicht nur in der Humantherapie, sondern auch in der tierärztlichen Praxis angewandt.

Es ist bekannt, daß Streptomyces tenebrarius Nebramycin, ein Mehrkomponentengemisch von Antibiotica, erzeugt (Stark, Hoehn und Know, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1967, Seite 314, britische Patentschrift 11 78 489, US-Patentschrift 36 91 279 und ungarische Patentschrift 1 76 103). Von Umezawa und Mitarbeitern wurde die Herstellung von Kanamycin aus Streptomyces kanamyceticus ATCC 12 853 (J. Antibiotics 10A [1957], 181, und japanisches Patent Kokai 8695 [1961]) beschrieben. Die Kanamycin-Bestandteile A, B und C sind auch Aminoglykosid-Antibiotica.

Es ist auch bekannt, daß aus Mikroorganismenzellen der Streptomycetaceae-Familie (Streptomyces- und Micromonospora-Stämme) unter geeigneten Bedingungen Protoplasten (zellwandfreie Form) gebildet werden, die nachfolgend zu normalen Zellen regeneriert werden können (US-Patentschrift 42 94 927 und Okanishi, Suzuki und Umezawa, J. Gen. Microbiol. 80 [1973], 389). Die Fusion von Protoplasten unterschiedlicher Stämme induziert genetische Rekombinationen, wobei Zellen entstehen, die Träger von neuen genetischen Informationen sind (zum Beispiel Hopwood, Wright und Bibb, Nature 268 [1977], 171; Alföldi, Szvoboda und Mitarbeiter, US-Patentschrift 42 94 927; Godfrey, Ford und Huber, Can. J. Microbiol. 24 [1978], 994; Oichi, Hitchcock und Katz, J. Bact. 139 [1979], 984). Die Versuche wurden mit aminosäure-, nukleotidbase- und vitamindefizienten auxotrophen Stämmen durchgeführt. Die genetische Rekombination selbst wurde nachgewiesen, indem Protoplasten, die aus Zellen, die einerseits in Minimalnährmedium mit Uracilgehalt gezüchtet wurden und andererseits in Gegenwart von Cystein gebildet wurden, fusioniert und nach Regeneration die nicht aminosäuredefizienten Prototrophen isoliert wurden (Oichi, Hitchcock und Katz, J. Bact. 139 [1979], 984).

Von Baltz und Mitarbeitern wurde in den belgischen Patentschriften 8 68 472 und 8 68 473 ein Verfahren zur mit vorgeschalteter Vorzüchtung erfolgenden Herstellung von Streptomyces-Protoplasten sowie Protoplastfusion und Regeneration der fusionierten Protoplasten beschrieben, es wurde jedoch keine Isolierung von Stämmen mit modifiziertem genetischem Bestand und keine Ergebnisse über die Beeinflussung der Antibioticum-Biosynthese erwähnt. Die Versuche wurden immer mit auxotrophen Stämmen durchgeführt.

Die Beeinflussung der Antibioticum-Biosynthese durch genetische Rekombination in vivo mittels Protoplastenfusion wurde noch nicht beschrieben.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur Herstellung von Aminoglykosid-Antibiotica enthaltenden Gärbrühen mittels genetischer Rekombination in vivo zu antibioticumerzeugenden Stämmen mit modifiziertem genetischem Bestand beziehungsweise Material, durch welches eine qualitative und quantitative Beeinflussung der Antibioticum-Biosynthese in der Weise, daß die Qualität und Menge von biologisch aktiven Verbindungen, welche durch antibioticumerzeugende Mikroorganismen biosynthetisiert werden, vorteilhaft beeinflußt wird, zu schaffen.

Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht.

Es wurde nämlich überraschenderweise festgestellt, daß die antibioticumerzeugende Fähigkeit eines bestimmten Teiles von Rekombinantzellen, die durch Protoplastenfusion gemäß diesem Verfahren hergestellt wurden, im Vergleich zur Gesamtzahl der Rekombinantstämme in einem überraschend großen Anteil modifiziert wurden. Ein Teil der Rekombinanten erzeugte Antibioticumkomplexe mit veränderter Zusammensetzung, und weiterhin wurde im Vergleich zu den Fusionspartnern die Erzeugungsfähigkeit entweder beträchtlich erhöht oder vermindert.

Ferner wurde überraschenderweise festgestellt, daß die Wirksamkeit der Protoplastenfusion und noch mehr die der Rekombination durch das im folgenden festgelegte erfindungsgemäße Verfahren signifikant erhöht werden kann.

Außerdem wurde überraschenderweise festgestellt, daß die genetische Rekombination auch dann abläuft, wenn die Protoplasten eines der Fusionspartner durch chemische oder physikalische Behandlung inaktiviert worden sind. Daher ist es nicht nötig, beide Fusionspartner genetisch zu markieren.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Aminoglykosid-Antibiotica enthaltenden Gärbrühen mittels genetischer Rekombination in vivo zu antibioticumerzeugenden Stämmen mit modifiziertem genetischem Bestand beziehungsweise Material durch Vorzüchten in einem Nährmedium, Bilden von Protoplasten aus den Zellen von Streptomyces-Stämmen, Fusionieren beziehungsweise Verschmelzen der gebildeten Protoplasten und Regenerieren der kombinierten Protoplasten, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß zum Vorzüchten ein Rohrzucker (Saccharose) sowie Calcium- und Magnesiumionen enthaltendes Nährmedium verwendet wird, als Protoplasten entweder aus 2 oder mehr, vorzugsweise 2, genetisch markierten Stämmen oder aus 1 oder mehr, vorzugsweise 1, genetisch markierten Stamm beziehungsweise Stämmen und 1 oder mehreren, vorzugsweise 1, durch chemische oder physikalische Behandlung inaktivierten prototrophen oder unmarkierten Stamm beziehungsweise Stämmen gebildete fusioniert werden sowie nach dem Fusionieren und Regenerieren der fusionierten Protoplasten die Stämme mit modifiziertem genetischem Bestand (Prototrophen, Doppelauxotrophen beziehungsweise Segreganten) isoliert werden, in an sich bekannter Weise ihre Antibioticumerzeugungsfähigkeit geprüft wird und die Stämme mit geänderter Antibioticumerzeugungsfähigkeit selektiert werden sowie mit diesen neuen Stämmen belüftete Gärungen in Tauchkultur beziehungsweise Tiefkultur in einem organische Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Salze, Spurenelemente und/oder tierische oder pflanzliche Öle und/oder Fette enthaltenden Nährmedium durchgeführt werden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden also Aminoglykosid-Antibiotica enthaltende Gärbrühen durch Züchten von Streptomyces-Stämmen mit modifiziertem genetischem Material und geänderter Antibioticumerzeugungsfähigkeit hergestellt, welche durch die genetische Rekombination in vivo von antibioticumerzeugenden Streptomyces-Stämmen gewonnen werden.

Die Erfindung ist gegenüber den Verfahren des Standes der Technik einschließlich der belgischen Patentschriften 8 68 472 und 8 68 473 überraschend, da diese an der Erfindung vorbeigegangen sind, indem in ihnen keine Rede von der Isolierung von Stämmen mit modifiziertem genetischem Bestand oder gar der Untersuchung ihrer Antibioticumerzeugungsfähigkeit und Selektierung und Züchtung der Stämme mit besonders vorteilhaft modifiziertem genetischem Bestand durch Gärung ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden aminosäure- oder nukleotidbasedefiziente auxotrophe Stämme hergestellt. Die Auxotrophen können durch mutagene Behandlung mit N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin (Davis, J. Am. Chem. Soc., 70 [1948], 4267) gewonnen werden. Die Antibioticumerzeugungsfähigkeit sowie die genetische Stabilität der erhaltenen Auxotrophen werden in Reihenuntersuchungen geprüft. Die genetisch stabilen Isolate werden in einem organische Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Rohrzucker, Calcium- und Magnesiumionen und Glykokoll (Glykokoll hemmt das Zellwachstum) enthaltendem flüssigen Nährmedium gezüchtet. Diejenige Kultur, in welcher die wachstumshemmende Wirkung des Glykokolles die stärkste, aber noch nicht vollständig war, wird selektiert, und die Zellen werden zentrifugiert und gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in Rohrzucker und Lysozyme (siehe beispielsweise Römpp Chemie-Lexikon, 5. Auflage, 1962, Spalten 3041 bis 3042) enthaltender physiologischer Salzlösung suspendiert, wobei sich Protoplasten bilden. Die gewonnenen Protoplasten werden gewaschen, und ein Teil davon wird auf festen Regenerieragar übertragen. Der andere Teil der Protoplasten wird in einem Verhältnis von 1 : 1 mit für genetische Rekombination selektierten, aus Partnerzellen ähnlich dargestellten Protoplasten kombiniert. Dem Protoplastengemisch werden Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 20 000 Salze, die zu Magnesium- und Calciumionen dissoziieren, zugesetzt, um eine Protoplastenfusion zu induzieren. Nachfolgend werden die Zellen regeneriert. Wenn die Regeneration in einem Minimalnährmedium durchgeführt wird, können nur diejenigen Hybridzellen, bei welchen die genetische Rekombination in vivo tatsächlich zustande kam, Kolonien bilden. Die Regeneration kann aber auch in einem organischen Stickstoff enthaltenden Nährmedium durchgeführt werden. Dann kann die Zahl der Prototrophen in der Weise bestimmt werden, daß die in diesem Medium gezüchteten Kolonien auf ein Minimalnährmedium übertragen werden.

Nach der obigen Verfahrensweise werden die prototrophen Rekombinanten nach der Fusion von Protoplasten, die aus 1 oder mehreren auxotrophen Stämmen gebildet wurden, isoliert. Die Umwandlung der antibioticumerzeugenden Stämme in auxotrophe Stämme verminderte aber beträchtlich ihre Erzeugungsfähigkeit. Aus wirtschaftlichen Gründen ist es daher erwünscht, wenn mindestens einer der Fusionspartner große Mengen des Antibioticums biosynthetisieren kann. Daher wird nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens nur als einer der Partner ein Auxotroph, als anderer Partner dagegen ein Prototroph, dessen Protoplasten vor der Fusion entweder durch chemische oder physikalische Behandlung lebensunfähig gemacht worden sind, verwendet. Nach der Fusion werden von allen Auxotrophen oder abgetöteten Prototrophen, die zugegen sind, aber weder regenerieren noch wachsen können, allein die Hybridzellen regeneriert, da sie allein Kolonien bilden.

Am erfindungsgemäßen Verfahren wird vorteilhaft die Protoplastbildung und Protoplastfusion in einem 1 oder mehr Calciumsalz(e), vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 0,5 Gew.-%, 1 oder mehr Magnesiumsalz(e), vorzugsweise in Mengen von 0,3 bis 0,8 Gew.-%, und Rohrzucker, vorzugsweise in Mengen von 12 bis 14 Gew.-%, enthaltenden Nährmedium durchgeführt.

Zur Protoplasteninaktivierung kann jedes chemische Reagens, das zum Verlust der Regenerationsfähigkeit der Protoplasten bei gleichzeitigem Bewahren ihrer genetischen Integrität führt, verwendet werden. So können vorteilhaft als durch chemische Behandlung inaktivierte Stämme solche, welche mit 3-Methyl-6-isopropenyl-4′-n-pentyl-2′,6′-dihydroxy- 1,2,3,6-tetrahydro-diphenyl-3′-Carbonsäure {Kannabidiolsäure} oder ihren Salzen, N-Äthylmaleinimid, 3-Chlor-4-[3′- (chlor)-2′-(nitro)-phenyl]-pyrrol {Pyrrolnitrin}, N-4- {[4′-(diäthylamino)-phenyl]-phenylmethylen}-2,5-cyclohexa dien-1-yliden⟩-N-⟨äthyl⟩-äthanaminiumsulfat {Brillantgrün} oder 2-Mercaptoäthanol inaktiviert worden sind, eingesetzt werden. Nach beendetem chemischem Inaktivieren können die Protoplasten gewaschen und als Fusionspartner eingesetzt werden.

Vorteilhaft können als durch physikalische Behandlung inaktivierte Stämme solche, welche mit γ-Bestrahlung inaktiviert worden sind, eingesetzt werden. So wird vorzugsweise eine Bestrahlung mit dem ⁶⁰Co-Isotop mit einer Dosis von 30 bis 120 krad, insbesondere 80 krad, angewandt. Nach beendeter Bestrahlung können die Protoplasten zentrifugiert und als Fusionspartner angesetzt werden.

Das Prüfen der Antibioticumerzeugungsfähigkeit der gewonnenen prototrophen Isolate wird zweckmäßig in Reihenuntersuchungen durchgeführt. Nach der Fusion wird auch die Erzeugungsfähigkeit von Doppelauxotrophen und auch von Prototrophen, die aus ihnen durch Segregation erhalten wurden, bestimmt.

Die Erzeugungsfähigkeit der Stämme wird zweckmäßig wie folgt geprüft. Mit ihnen werden vorteilhaft organische Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Salze und Pflanzenöle enthaltende Nährmedien geimpft, und die Kulturen werden bebrütet. Nach 16 bis 24 Stunden werden diese Impfkulturen benützt, um mit ihnen das Hauptgärmedium der gleichen Zusammensetzung zu impfen. Die Gärung wird 140 bis 160 Stunden lang fortgesetzt. Proben werden erst in der 96sten Stunde und dann in jeder 24sten Stunde entnommen, um den Antibioticumgehalt und das Komponentenverhältnis der erzeugten Antibiotica zu bestimmen.

Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Mutanten mit hoher Antibioticumerzeugungsfähigkeit werden wie bereits erwähnt in belüfteten Tauchkulturen in einem organische Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Salze, Spurenelemente und/oder Öle und/oder Fette pflanzlichen und/oder tierischen Ursprungs enthaltenden Nährmedium gezüchtet. Zweckmäßig wird diese Züchtung bei 32 bis 40°C, vorzugsweise 37°C, so lange durchgeführt, bis sich geeignete Mengen des Antibioticums bildeten.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als antibioticumerzeugender Streptomyces-Stamm Streptomyces tenebrarius verwendet. So können Rekombinanten beispielsweise aus den in der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Országos Közeg´szs´gügyi Int´zet) unter den Bezeichnungen MNG 169 am 28. Dezember 1977 und MNG 204 am 2. September 1981 hinterlegten Mikroorganismenstämmen Streptomyces tenebrarius hergestellt werden. Der Stamm Streptomyces tenebrarius MNG 169 kann Nebramycin-2, Nebramycin-4 und Nebramycin-5′ und der Stamm Streptomyces tenebrarius MNG 204 kann Nebramycin-5′ neben Spuren von Nebramycin-4 biosynthetisieren. Aus diesen Stämmen können mittels üblicher mutagener Behandlung mit N-Methyl-N′- nitro-N-nitroso-guanidin auxotrophe Mutanten gebildet werden, und ihre genetische Stabilität kann durch mehrere Replikationen und ihre Antibioticumerzeugungsfähigkeit in Reihenuntersuchungen geprüft werden. Die genetisch stabilen Stämme werden selektiert, und aus ihnen können Protoplasten gemäß den in den Beispielen beschriebenen Verfahrensweisen gebildet werden. Die Protoplasten werden mit dem ausgewählten Fusionspartner kombiniert und nachfolgend regeneriert. Sowohl die Protoplastenbildung als auch die Regeneration sind quantitativ, wenn die Züchtung, die Protoplastenbildung und die Regeneration in Gegenwart von Rohrzucker und Salzen, welche zu Calcium- und Magnesiumionen dissoziieren, durchgeführt werden. Die regenerierten Hybride werden isoliert und zweckmäßig an einem Schrägagar gezüchtet. Die Häufigkeit der Prototrophenbildung aus auxotrophen Stämmen, die bei spontaner Mutation nur 10⁻⁸ beträgt, ergibt sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zu 1×10⁻³ bis 5×10⁻⁴.

Die Erzeugungsfähigkeit der isolierten prototrophen Rekombinanten analysierend wurde festgestellt, daß die einzelnen Antibiotica, die Komponenten des vom Elternstamm erzeugten Antibioticumkomplexes waren, auch von jedem Rekombinanten biosynthetisiert werden, aber in einem veränderten Komponentenverhältnis und veränderter Erzeugungskonzentration. Die Elternstämme erzeugen 2 (Stamm Streptomyces tenebrarius MNG 204) beziehungsweise 3 (Stamm Streptomyces tenebrarius MNG 169) Nebramycinkomponenten, bei der Autofusion der Protoplasten Streptomyces tenebrarius MNG 204 beziehungsweise MNG 169 und bei der Fusion der Protoplasten Streptomyces tenebrarius MNG 204 und MNG 169 entstehen dagegen genetische Rekombinanten, welche im Vergleich zu den Elternstämmen entweder

a) überhaupt kein Antibioticum oder sehr niedrige oder sehr hohe Antibioticumkonzentrationen biosynthetisieren oder
b) eine einzige Nebramycinkomponente, nämlich Nebramycin-2, Nebramycin-4 oder Nebramycin-5′, biosynthetisieren oder
c) 2 Nebramycinkomponenten, nämlich Nebramycin-2 und Nebramycin-4 oder Nebramycin-2 und Nebramycin-5′, biosynthetisieren oder
d) 3 Nebramycinkomponenten, nämlich Nebramycin-2, Nebramycin-4 und Nebramycin-5′, biosynthetisieren.

Von den gewonnenen Stämmen wurden in der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Országos Közeg´szs´gügyi Int´zet) der Nebramycin-2 erzeugende Stamm Streptomyces tenebrarius 35 TL unter der Bezeichnung MNG 00243 am 25. November 1982, der Nebramycin-4 erzeugende Stamm Streptomyces tenebrarius F104 unter der Bezeichnung MNG 00244 ebenfalls am 25. November 1982 und der Nebramycin-5′ erzeugende Stamm Streptomyces tenebrarius F77 unter der Bezeichnung MNG 00242 gleichfalls am 25. November 1982 hinterlegt.

Diese Stämme können Nebramycinkomponenten enthaltende Gärbrühen erzeugen. Die Gärung selbst wird vorzugsweise nach dem Verfahren der ungarischen Patentschrift 1 76 103 durchgeführt, während die Antibiotica vorzugsweise nach den Verfahren der ungarischen Patentschriften 1 74 315 und 1 76 103 isoliert werden.

Nach einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als antibioticumerzeugender Streptomyces-Stamm Streptomyces kanamyceticus für die Bildung von Rekombinanten verwendet. Die Züchtung der Mikroorganismen, die Protoplastenbildung, die Protoplastenfusion und die Regeneration und ferner die Reihenuntersuchung der Produktivität der selektierten Stämme kann entweder gemäß der obigen Verfahrensweise oder gemäß den in Beispielen 3 und 8 beschriebenen Verfahrensweisen durchgeführt werden.

Die so erhaltenen Stämme können Kanamycin (Nebramycin 5) enthaltende Gärbrühen erzeugen.

Von den vielen Vorteilen des erfindungsgemäßen Verfahrens sei darauf hingewiesen, daß die im Verfahren erfolgenden Rekombinationen und Diploidisationen die Biosynthese der Stämme entweder durch Veränderung des Komponentenverhältnisses oder durch Erhöhung der Antibioticumerzeugungsfähigkeit beeinflussen.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 Protoplastbildung, Protoplastfusion und Regeneration

Schrägagare werden mit einer Sporensuspension oder tiefgefrorenen Kultur von Streptomyces tenebrarius MNG 169 und Streptomyces tenebrarius MNG 204 oder aus ihnen gebildeten auxotrophen Stämmen beimpft. Der Schrägagar hat folgende Zusammensetzung:

Vor dem Sterilisieren wird der pH-Wert des Nährbodens mit einer wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf 7,2 eingestellt, nachfolgend wird bei 121°C 20 Minuten lang sterilisiert.

Die Schrägkulturen werden 4 Tage lang bei 37°C bebrütet, dann werden die Sporen von der Oberfläche des Agars mit sterilem destilliertem Wasser abgewaschen. Mit der erhaltenen Sporensuspension wird ein steriles Impfnährmedium beziehungsweise Inokulumnährmedium folgender Zusammensetzung beimpft:

Glukose
1,0 Gew.-%
Hefeextrakt	1,0 Gew.-%

Der pH-Wert des Mediums wird auf 7,2 eingestellt.

Die Kulturen werden 48 Stunden lang bei 37°C bebrütet, dann wird mit 0,2 ml Portionen dieses Impfmateriales ein steriles Nährmedium folgender Zusammensetzung geimpft:

Glukose
1,0 Gew.-%
Hefeextrakt	1,0 Gew.-%
Rohrzucker	20,5 Gew.-%
Calciumdichloriddihydrat	0,3 Gew.-%
Magnesiumdichloridhexahydrat	0,6 Gew.-%
Glykokoll	4, 5 oder 6 Gew.-%

Der pH-Wert der Medien wird auf 7,0-7,2 eingestellt.

Die Kulturen werden in einer Schüttelmaschine 48 Stunden lang bei 37°C bebrütet, dann werden diejenigen Kulturen, in welchen die wachstumshemmende Wirkung des Glykokolles die stärkste, aber noch nicht vollständig ist, selektiert. Mit diesen Kulturen werden obige Nährmedien mit erhöhtem Glykokollgehalt beimpft. Falls ursprünglich die selektierte Kultur 4 Gew.-% Glykokoll enthielt, so werden mit diesen Nährmedien geimpft, welche 5 bzw. 6 Gew.-% Glykokoll enthalten.

Dann wird das gebildete Myzel zentrifugiert (15 Minuten, 2300 g) und mit einer Lösung der folgenden Zusammensetzung gewaschen:

Rohrzucker
20,5 Gew.-%
Calciumdichloriddihydrat	0,3 Gew.-%
Magnesiumdichloridhexahydrat	0,6 Gew.-%
Kaliumchlorid	0,0075 Gew.-%
pH der Lösung: 7,2, Bezeichnung: M.

Nachfolgend wird wiederholt zentrifugiert.

Die Myzelmasse wird in der obigen Lösung erneut suspendiert und mit 0,5gew.-%igem Lysozym (Serva, Feinbiochemica, Heidelberg) versetzt. Das Myzel wird unter schwachem Schütteln bebrütet, und die Protoplastenbildung wird alle 10 Minuten mikroskopisch kontrolliert. Von der Stammart abhängend, dauert die quantitative Protoplastenbildung in myzelialen Streptomyces-Kulturen etwa 1-4 Stunden.

Die Kultur, die quantitativ zu Protoplasten umgewandelt war, wird zentrifugiert (25 Minuten, 2300 g), mit Lösung M gewaschen und wiederholt zentrifugiert.

Der Bodensatz wird vorsichtig in 0,05 ml Lösung M suspendiert, dann werden die Protoplasten regeneriert.

Zur Beseitigung der eventuell zurückgebliebenen Myzelstücke wird die Protoplastensuspension durch eine 2,5-cm-Schicht Watte gefiltert. Das Filtrat wird mit Lösung M verdünnt und auf sterilen Regenerieragar der folgenden Zusammensetzung geschichtet:

Glukose
1,0 Gew.-%
Hefeextrakt	1,0 Gew.-%
Rohrzucker	20,5 Gew.-%
Calciumdichloriddihydrat	0,3 Gew.-%
Magnesiumdichloridhexahydrat	0,6 Gew.-%
Agar	3,0 Gew.-%
pH der Lösung: 7,0-7,2.

0,1 ml der Protoplastensuspension wird auf die Oberfläche von 25 ml Regenerieragar in einer Petrischale geschichtet, dann wird sie mit 3 ml des Regenerieragars bedeckt. Der Agar, welcher zur Bedeckung benutzt wird, hat obige Zusammensetzung, doch wird 1,2 Gew.-% Agar anstatt 3 Gew.-% benützt.

Die Kulturen werden in einer feuchten Kammer bei 35-37°C bebrütet. Am dritten-vierten Tag können schon die regenerierten Kolonien frei beobachtet werden. In Anbetracht der Protoplastenzahl, die auf die Regenerierplatte aufgetragen wurde, kann die Regeneration als quantitativ betrachtet werden.

Die aus den beiden auxotrophen Stämmen gewonnenen Protoplasten werden fusioniert. Falls von den Hybriden nur die prototrophen Rekombinanten isoliert werden sollen, so werden sie auf einen Minimalnährboden folgender Zusammensetzung aufgetragen:

Diammoniumsulfat
0,5 Gew.-%
Kaliumdihydrogenphosphat	0,1 Gew.-%
Magnesiumsulfatheptahydrat	0,05 Gew.-%
Glukose	1,0 Gew.-%
Calciumchloriddihydrat	0,3 Gew.-%
Magnesiumchloridhexahydrat	0,6 Gew.-%
Rohrzucker	20,5 Gew.-%
Wickerham-Vitaminlösung	0,01 Gew.-%
Agar	3,0 Gew.-%
pH des Mediums: 7,2.

Zusammensetzung der Wickerham-Vitaminlösung
Folsäure
0,2 mg
Vitamin H (Biotin)	0,2 mg
Calciumpantothenat	40,0 mg
Inosit	200,0 mg
Nicotinsäure (Niacin)	40,0 mg
p-Aminobenzoesäure	20,0 mg
Pyridoxinhydrochlorid	40,0 mg
Vitamin-B₁-hydrochlorid (Aneurinhydrochlorid)	40,0 mg
Riboflavin	20,0 mg
Destilliertes Wasser	100,0 ml

Prototrophe können auch isoliert werden, indem die Kolonien, die auf komplettem Regeneriernährboden ausgewachsen waren, auf Minimalnährboden der obigen oder anderer Zusammensetzung repliziert werden.

Die Protoplasten werden in der Weise fusioniert, daß die Protoplasten, die aus zwei oder mehreren Stämmen gebildet wurden, in beliebigem Verhältnis, zweckmäßig 1 : 1, vermischt werden und 0,2 ml dieses Protoplastengemisches mit 2 ml Fusionslösung der folgenden Zusammensetzung versetzt wird:

Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 20 000
35,0 Gew.-%
Calciumdichloriddihydrat	0,3 Gew.-%
Magnesiumdichloridhexahydrat	0,6 Gew.-%

pH der Lösung wird mit wäßriger Natriumhydroxydlösung auf 7,2 eingestellt.

Das Vermischen mit der Fusionslösung induziert die Aggregation der Protoplasten, ihre Membrane verschmelzen, die Fusion kommt zustande. Die DNS von zwei oder mehreren Zellen, die Träger der genetischen Information sind, können näher zueinander, und so kann die genetische Rekombination vor sich gehen.

In Tabelle 1 wird das erfindungsgemäße Verfahren mit den Verfahren der belgischen Patentschriften 8 68 472 und 8 68 473 in bezug der Protoplastbildung und Regenerationshäufigkeit verglichen.

Tabelle 1

Bildung und Regeneration von Protoplasten von Streptomyces tenebrarius mit bekannten Verfahren und mit dem erfindungsgemäßen Verfahren

Aus der Tabelle 1 geht deutlich hervor, daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren mittels Vorzüchtung in der Gegenwart von Calciumchlorid, Magnesiumchlorid und Rohrzucker die Wirksamkeit der Protoplastbildung, noch mehr aber die der Regeneration wesentlich erhöht werden können.

In den nachfolgenden Beispielen werden einige genetische Rekombinationsversuche in vivo und ihre Ergebnisse erörtert.

Beispiel 2 Fusion von auxotrophen Stämmen und die Antibioticumbiosynthese von Rekombinantenstämmen a. Fusion der auxotrophen Stämme A222 his⁻ und 404 ura⁻

Durch bekannte übliche mutagene Behandlung (beispielsweise nach Davis, J. Am. Chem. Soc., 70 [1948], 4267) werden aus dem neben Spuren von Nebramycin-4, Nebramycin-5′ biosynthetisierenden Stamm Streptomyces tenebrarius MNG 204 der histidinabhängige Stamm A222 his⁻ und aus dem Nebramycin-2, Nebramycin-4 und Nebramycin-5′ produzierenden Stamm Streptomyces tenebrarius MNG 169 der uracilabhängige Stamm 404 ura⁻ hergestellt.

Aus den beiden Stämmen werden nach der Verfahrensweise des Beispieles 1 Protoplasten gebildet und diese fusioniert und regeneriert. Ein Teil der prototrophen Rekombinanten wird isoliert. Rekombinationshäufigkeit: 5×10⁻⁵.

Die Antibioticum-Produktionsfähigkeit der isolierten prototrophen Stämme wird gemäß der Verfahrensweise von Beispiel 8 bestimmt. In Tabelle 2 sind die Ergebnisse der Gärung von 147 isolierten Rekombinanten zusammengestellt.

Tabelle 2

Antibioticumproduktion von Prototrophen, die durch die DNS-Rekombination in vivo von Auxotrophen A222 his⁻ und 404 ura⁻ gewonnen wurden

Produktionsfähigkeit der Fusionspartner

Gleichzeitig übertrifft die Produktionsfähigkeit von einem Teil der Rekombinanten die der Fusionspartner ganz wesentlich. So biosynthetisiert zum Beispiel Streptomyces tenebrarius F 105 2140 µg/ml Nebramycin-2, 380 µg/ml Nebramycin-4 und 1510 µg/ml Nebramycin-5′, Streptomyces tenebrarius F 88 0 µg/ml Nebramycin-2, 140 µg/ml Nebramycin-4 und 1440 µg/ml Nebramycin-5′, Streptomyces tenebrarius MNG 00242 (Streptomyces tenebrarius F 77) 840 µg/ml Nebramycin-5′ und Streptomyces tenebrarius MNG 00244 (Streptomyces tenebrarius F 104) neben Spuren von Nebramycin-5′ (weniger als 1 Gew.-%) 1520 µg/ml Nebramycin-4.

Die Produktionsfähigkeit der Stämme, die nach der Autofusion von aus Elternstämmen hergestellten Protoplasten isoliert wurden, blieb unverändert.

Mit dem Stamm Streptomyces tenebrarius MNG 00244 werden gemäß der Verfahrensweise des Beispieles 8 10 l Gärbrühe hergestellt, und die biologisch aktiven Verbindungen werden gemäß der ungarischen Patentschrift 1 74 315 isoliert. Ausbeute: 13,8 g Nebramycin-5 (Kanamycin-B) und 9 mg Nebramycin-6 (Tobramycin).

b. Fusion der auxotrophen Stämme 7-34 trp⁻ und 73 lys⁻

Aus dem tryptophanabhängigen Stamm Streptomyces tenebrarius 7-34 trp⁻ und aus dem lysinabhängigen Streptomyces tenebrarius 73 lys⁻, die mit üblicher mutagener Behandlung (beispielsweise nach Davis, J. Am. Chem. Soc., 70 [1948], 4267) aus Streptomyces tenebrarius MNG 169 gewonnen wurden, werden gemäß der Verfahrensweise des Beispieles 1 Protoplasten gebildet und diese fusioniert und nachfolgend regeneriert. Ein Teil der Prototrophen wird isoliert, und ihre Produktionsfähigkeit wird gemäß der Verfahrensweise des Beispieles 8 geprüft. Rekombinationshäufigkeit: 1×10⁻⁵. In der Tabelle 3 sind die Ergebnisse der Gärung von 34 isolierten Rekombinanten zusammengestellt.

Tabelle 3

Antibioticumproduktion von Prototrophen, die durch DNS-Rekombination in vivo von Auxotrophen 7-34 trp⁻ und 73 lys⁻ gewonnen wurden

Die Fusionspartner selbst biosynthetisieren alle drei Nebramycin-Komponenten.

Nach der Fusion und Regeneration wurde beobachtet, daß es einige Stämme gibt, die im Minimalnährmedium in der Gegenwart von Lysin oder Tryptophan nicht wachsen konnten, in der gleichzeitigen Gegenwart von Tryptophan und Lysin aber schnell wuchsen. Die ursprünglich auxotrophen Stämme wurden durch die Rekombination zu Doppelauxotrophen (trp⁻lys⁻). Die Produktionsfähigkeit von 13 Doppelauxotrophen wurde gemäß der Verfahrensweise des Beispieles 8 geprüft, und die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengestellt. Nach der Segregation wurden aus den Doppelauxotrophen zwei Prototrophen (Streptomyces tenebrarius 35 W und 40 W) isoliert, ihre Produktionsfähigkeit wird ebenfalls angegeben.

Tabelle 4

Antibioticumproduktion von Doppelauxotrophen trp⁻lys⁻ und von Segreganten, die aus ihnen isoliert wurden

Die Tabelle 4 zeigt eindeutig, daß die Produktionsfähigkeit der Stämme, die nach genetischer Rekombination in vivo isoliert wurden, wesentlich geändert ist. Es ist besonders bemerkenswert, daß die aus Doppelauxotrophen isolierten Prototrophen ihre Fähigkeit, Nebramycin-2 (Apramycin) zu biosynthetisieren, verloren hatten, gleichzeitig aber ihre sonstige Antibioticum-Produktionsfähigkeit im Vergleich zu den Elternstämmen wesentlich höher wurde. So produzieren die Stämme Streptomyces tenebrarius 7-34 trp⁻ und 73 lys⁻ 1300 bis 1700 µg/ml Nebramycin-2, 200 µg/ml Nebramycin-4 und 1040 µg/ml Nebramycin-5′, während die Rekombinanten Streptomyces tenebrarius 35 W und 40 W 1040 µg/ml Nebramycin-4 und 1950 µg/ml Nebramycin-5′ biosynthetisieren.

c. Fusion der auxotrophen Stämme J1006-3ade⁻ und J211/2ura⁻

Streptomyces tenebrarius J1006-3ade⁻ und J211/2ura⁻ wurden mit mutagener Behandlung (beispielsweise nach Davis, J. Am. Chem. Soc., 70 [1948), 4267) aus Streptomyces tenebrarius MNG 204 gewonnen. Diese Stämme biosynthetisierten entweder überhaupt kein Antibioticum oder nur Spuren von Nebramycin-5′ (weniger als 5 µg/ml). Nach ihrer Fusion gemäß der Verfahrensweise des Beispieles 1 wurde die Produktionsfähigkeit der 150 prototrophen Rekombinanten gemäß der im Beispiel 8 beschriebenen Verfahrensweise geprüft.
Rekombinationshäufigkeit: 1×10⁻⁴.

60% (90) der untersuchten Stämme biosynthetisierten auch weiterhin überhaupt kein Antibioticum, 40% (60) produzierten dagegen entweder Nebramycin-4 und Nebramycin-5′ oder ausschließlich nur Nebramycin-5′. 13% der produktionsfähigen Stämme (8) biosynthetisierten Nebramycin-5′ in Mengen über 1500 µg/ml.

Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, daß die Antibioticum-Produktionsfähigkeit der Streptomyces-Stämme mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beträchtlich erhöht werden kann.

Beispiel 3 Fusion der auxotrophen Stämme Streptomyces kanamyceticus leu⁻ und arg⁻

Die im Beispiel 1 beschriebene Verfahrensweise der Vorzüchtung, der Protoplastbildung, der Protoplastfusion und der Regeneration der fusionierten Protoplasten wird mit dem Unterschied, daß die Züchtung der genetisch markierten Stämme bei 28°C so lange fortgesetzt wird, bis in 3 Gew.-% Glykokoll enthaltendem Nährboden schwaches Wachstum beobachtet werden kann, angewandt. Die auxotrophen Stämme werden nach der mutagenen Behandlung des in der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION hinterlegten und vor dem 16. Mai 1983 freigegebenen Stammes Streptomyces kanamyceticus ATCC 12 853 (ist im Katalog der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION enthalten) (bezüglich der Herstellung von Kanamycin durch diesen Stamm vergleiche Umezawa und Mitarb., J. Antibiotics, 10A, 181 bis 188 [1957], und Jpn. Kokai 8695 [1961]) isoliert. Der Elternstamm produziert Kanamycin. Die leucinabhängige Mutante biosynthetisiert überhaupt kein Antibioticum, die im Minimalnährmedium in Gegenwart von Arginin wachsende Mutante produziert dagegen 15 µg/ml Kanamycin.

Die Antibioticum-Produktionsfähigkeit von Streptomyces kanamyceticus wird gemäß der im Beispiel 8 beschriebenen Verfahrensweise ebenfalls unter Verwendung von in der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION hinterlegtem und vor dem 16. Mai 1983 freigegebenem Stamm Bacillus subtilis ATCC 6633 als Testorganismus für die biologische Aktivitätsprüfung geprüft, jedoch mit dem Unterschied, daß die Züchtung statt bei 37°C bei 28°C durchgeführt wird.

Nach der Fusion und Regeneration der fusionierten Protoplasten werden die Prototrophen isoliert und die Produktionsfähigkeit von 144 Stämmen geprüft. 12 Stämme können zehnmal mehr (im Durchschnitt 155 µg/ml Kanamycin) biosynthetisieren als die argininabhängige auxotrophe Mutante.
Rekombinationshäufigkeit: 3 bis 8×10⁻⁴.

Beispiel 4 Herstellung von intakten, aber lebensunfähigen Protoplasten und ihre Anwendung als Fusionspartner

Aus Streptomyces tenebrarius MNG 169 und aus seinem Auxotrophen 404 ura⁻ werden gemäß der Verfahrensweise des Beispieles 1 Protoplasten gebildet. Zwecks Inaktivierung des prototrophen Streptomyces tenebrarius MNG 169 wird der aus ihm gebildeten Protoplastsuspension (10⁸ Protoplasten/ml Lösung M) 50 bis 100 µg/ml Triäthylaminsalz von 3-Methyl-6-isopropenyl-4′-n-pentyl-2′,6′-dihydroxy- 1,2,3,6-tetrahydro-diphenyl-3′-carbonsäure {Kannabidiolsäure} in einer Lösung von Dimethylsulfoxyd bei 30°C zugesetzt. Nach vierstündiger Behandlung werden die Protoplasten zentrifugiert (2300 g, 25 Minuten), dann werden sie zwecks Beseitigung des überschüssigen Inaktivierungsmittels mit Lösung M gewaschen und wiederholt zentrifugiert. Die Fusion der chemisch inaktivierten, aus dem Prototrophen Streptomyces tenebrarius MNG 169 gebildeten Protoplasten und der aus dem Auxotrophen 404 ura⁻ gebildeten Protoplasten wird gemäß der Verfahrensweise des Beispieles 1 durchgeführt. Die Fusionsergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt.

Tabelle 5

Beispiel 5 Herstellung von intakten, aber lebensunfähigen Protoplasten und ihre Anwendung als Fusionspartner

Die im Beispiel 4 beschriebene Verfahrensweise wird durchgeführt, jedoch mit dem Unterschied, daß anstatt des Triäthylaminsalzes von Kannabidiolsäure 80 bis 240 µg/ml 3-Chlor-4-[3′-(chlor)-2′-(nitro)-phenyl]-pyrrol {Pyrrolnitrin} oder 100 bis 300 µg/ml N-⟨4-{[4′-(diäthylamino)- phenyl]-phenylmethylen}-2,5-cyclohexadien-1-yliden⟩-N- ⟨äthyl⟩-äthanaminiumsulfat {Brillantgrün} als chemisches Inaktivierungsmittel verwendet wird. In den Versuchen verlief die Inaktivierung der Protoplasten quantitativ. Die erhaltenen lebensunfähigen Protoplasten werden als Fusionspartner in einer gemäß dem Beispiel 4 (oder einem der ihm vorangehenden Beispiele) durchgeführten Fusion, beispielsweise mit aus dem Auxotrophen 404 ura⁻ gebildeten Protoplasten als anderem Fusionspartner, angewandt.

Beispiel 6 Herstellung von intakten, aber lebensunfähigen Protoplasten und ihre Anwendung als Fusionspartner

Protoplasten werden gemäß der Verfahrensweise des Beispieles 3 hergestellt, jedoch mit dem Unterschied, daß unmarkierter Streptomyces kanamyceticus ATCC 12 853 als Elternstamm verwendet wird. Die gewonnenen Protoplasten von Streptomyces kanamyceticus werden gemäß der im Beispiel 4 beschriebenen Verfahrensweise inaktiviert, jedoch mit dem Unterschied, daß anstatt Kannabidiolsäure 400 und 800 µg/ml N-Äthylmaleinimid (EM) als chemisches Inaktivierungsmittel verwendet wird. Die Fusion der erhaltenen inaktivierten Protoplasten wird nach der Verfahrensweise des Beispieles 4 (oder eines der ihm vorangehenden Beispiele) mit aus einem beliebigen markierten Stamm Streptomyces kanamyceticus, wie Streptomyces kanamyceticus ATCC 12 853, erhaltenen Protoplasten als anderem Fusionspartner durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengestellt:

Tabelle 6

Die mit 800 µg/ml N-Äthylmaleinimid behandelten und dadurch inaktivierten Protoplasten werden als Fusionspartner verwendet.

Beispiel 7 Herstellung von lebensunfähigen Protoplasten durch physikalische Inaktivierung

Eine gemäß Beispiel 1 hergestellte Protoplastsuspension (10⁸ Zellen/ml) von Streptomyces kanamyceticus ATCC 12 853 wird in einem Plastikrohr der γ-Bestrahlung (⁶⁰Co) unterworfen. Die mit einer Dosis von 80 krad inaktivierten Zellen werden als Fusionspartner in einer nach der Verfahrensweise des Beispieles 4 (oder eines der ihm vorangehenden Beispiele) durchgeführten Fusion mit aus einem beliebigen markierten Stamm Streptomyces kanamyceticus, wie Streptomyces kanamyceticus ATCC 12 853, erhaltenen Protoplasten als anderem Fusionspartner verwendet.

Beispiel 8 Prüfung der Anbitioticum-Produktionsfähigkeit von Stämmen, die Nebramycin-Komponenten biosynthetisieren, und Herstellung von Antibioticum-Gärbrühen

Mit den Sporen oder der vegetativen Kultur des zu prüfenden Stammes werden Schrägagare, die mit destilliertem Wasser bereitet wurden, geimpft. Zusammensetzung des Schrägagars:

Der pH-Wert des Nährmediums wird vor dem Sterilisieren mit einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf 7,2 eingestellt, dann wird 20 Minuten lang bei 121°C sterilisiert.

Die Kulturen werden 4 Tage lang bei 37°C bebrütet, dann werden die Sporen von der Oberfläche des Nährbodens mit sterilem destilliertem Wasser abgetrennt, und mit dieser Sporensuspension werden zwei mit Leitungswasser bereitete 100-ml-Impfmaterialnährmedien, die in 500-ml-Erlenmeyerkolben sterilisiert wurden, geimpft. Zusammensetzung der Impfmaterialnährmedien:

Der pH-Wert des Nährmediums wird mit einer wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf 7,2 eingestellt, dann wird bei 121°C 20 Minuten lang im Autoklaven sterilisiert.

Die beimpften Kulturen werden auf einem horizontalen Schütteltisch (Durchmesser 2,4 cm, 280 min⁻¹) bei 37°C bebrütet.

Mit diesem reifen Impfmaterial werden entweder 100 ml des im 500-ml-Erlenmeyerkolben sterilisierten Nährmediums oder 5 l desselben Nährmediums, welches jedoch 45 Minuten lang bei 121°C sterilisiert worden ist, in einer 10-l-Laboratoriumsgärvorrichtung geimpft. Die Zusammensetzung dieses mit Leitungswasser bereiteten Hauptgärmediums ist:

Der pH-Wert des Nährmediums wird vor dem Sterilisieren mit wäßriger Ammoniumhydroxydlösung auf 7,2 eingestellt.

Die Gärung wird bei 37°C durchgeführt. Die Zellen in den Erlenmeyerkolben werden an der horizontalen Schüttelmaschine gezüchtet. Die Drehzahl des Gärvorrichtungsrührers wird auf 360 min⁻¹ eingestellt, und 3 l/Minute sterile Luft wird durch das Nährmedium geführt.

Der Antibioticumgehalt der Kulturen wird nach bekannten Verfahrensweisen biologisch oder durch Dünnschichtchromatographie mit Bioautographie bestimmt. Als Prüforganismus der biologischen Bestimmung wird Staphylococcus epidermidis, für die spezifische Bestimmung von Nebramycin-5′ neben anderen Nebramycin-Komponenten wird nebramycin-2- und nebramycin-4-resistentes Rhizobium meliloti verwendet.

Bei der Bestimmung der Komponentenzusammensetzung durch Dünnschichtchromatographie werden Antibioticummengen von 0,1 bis 0,5 µg/ml auf Silicagel-Dünnschichtplatten (Merck, Darmstadt) getropft, und die Platten werden mit einem Gemisch von Äthylalkohol, Methyläthylketon und 25gew.-%igem Ammoniumhydroxyd im Volumverhältnis von 1 : 1 : 1 entwickelt. Nach vollständigem Trocknen des Gels wird auf die Plattenoberfläche in der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION hinterlegten und vor dem 16. Mai 1983 freigegebenen Stamm Bacillus subtilis ATCC 6633 (ist im Katalog der AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION enthalten) enthaltendes Nährmedium geschichtet, dann wird die Platte 16 Stunden lang bei 37°C bebrütet. Nachfolgend wird die Größe der Hemmungszonen im Vergleich zum Standard bestimmt. Diese Verfahrensweise ist sowohl für qualitative als auch für quantitative Bestimmungen geeignet.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Aminoglykosid-Antibiotica enthaltenden Gärbrühen mittels genetischer Rekombination in vivo zu antibioticumerzeugenden Stämmen mit modifiziertem genetischem Bestand durch Vorzüchten in einem Nährmedium, Bilden von Protoplasten aus den Zellen von Streptomyces-Stämmen, Fusionieren der gebildeten Protoplasten und Regenerieren der kombinierten Protoplasten, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Vorzüchten ein Rohrzucker sowie Calcium- und Magnesiumionen enthaltendes Nährmedium verwendet, als Protoplasten entweder aus 2 oder mehr genetisch markierten Stämmen oder aus 1 oder mehr genetisch markierten Stamm beziehungsweise Stämmen und 1 oder mehreren durch chemische oder physikalische Behandlung inaktivierten prototrophen oder unmarkierten Stamm beziehungsweise Stämmen gebildete fusioniert sowie nach dem Fusionieren und Regenerieren der fusionierten Protoplasten die Stämme mit modifiziertem genetischem Bestand (Prototrophen, Doppelauxotrophen oder Segreganten) isoliert, in an sich bekannter Weise ihre Antibioticumerzeugungsfähigkeit prüft und die Stämme mit geänderter Antibioticumerzeugungsfähigkeit selektiert sowie mit diesen neuen Stämmen belüftete Gärungen in Tauchkulturen in einem organische Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Salze, Spurenelemente und/oder tierische oder pflanzliche Öle und/oder Fette enthaltenden Nährmedium durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Protoplastbildung und Protoplastfusion in einem 1 oder mehr Calciumsalz(e), vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 0,5 Gew.-%, 1 oder mehr Magnesiumsalz(e), vorzugsweise in Mengen von 0,3 bis 0,8 Gew.-%, und Rohrzucker, vorzugsweise in Mengen von 12 bis 14 Gew.-%, enthaltenden Nährmedium durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als durch chemische Behandlung inaktivierte Stämme solche, welche mit 3-Methyl-6- isopropenyl-4′-n-pentyl-2′,6′-dihydroxy-1,2,3,6- tetrahydro-diphenyl-3′-carbonsäure {Kannabidiolsäure} oder ihren Salzen, N-Äthylmaleinimid, 3-Chlor-4- [3′-(chlor)-2′-(nitro)-phenyl]-pyrrol {Pyrrolnitrin}, N-⟨4-{[4′-(diäthylamino)-phenyl]-phenylme thylen}-2,5-cyclohexadien-1-yliden⟩-N-⟨äthyl⟩-äthanaminiumsulfat {Brillantgrün} oder 2-Mercaptoäthanol inaktiviert worden sind, einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als durch physikalische Behandlung inaktivierte Stämme solche, welche mit γ-Bestrahlung inaktiviert worden sind, einsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als antibioticumerzeugenden Streptomyces-Stamm Streptomyces tenebrarius verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als antibioticumerzeugenden Streptomyces-Stamm Streptomyces kanamyceticus verwendet.