HU194306B

HU194306B - Process for influencing biosynthesis of antibiotics with in vivo genetical recombination

Info

Publication number: HU194306B
Application number: HU831678A
Authority: HU
Inventors: Lajos Ferenczy; Antal Mai; Istvan Ott; Gabor Ambrus; Tibor Lang
Original assignee: Gyogyszerkutato Intezet
Priority date: 1983-05-16
Filing date: 1983-05-16
Publication date: 1988-01-28
Also published as: FI79551C; US4729951A; FI841951A0; FR2546180A1; DE3418187A1; FR2546180B1; CH662582A5; FI841951A; GB8412364D0; BE899661A; FI79551B; DE3418187C2; HUT34235A; GB2146015B; GB2146015A

Description

A találmány tárgya eljárás amjnoglükozid antibiotikumot bioszintetizáló mikroorganizmusok antibiotikum termelésének minőségi és mennyiség befolyásolására In vivő genetikai rekombinációval. Részletesebben, a találmány tárgya eljárás aminoglükozid antibiotikumokat tartalmazó fermentlevek előállítására antibiotikum termelésére képes Streptomyces törzsek in vivő genetikai rekonibinálása és az izolált megváltozott genetikai állományú és megváltozott antibiotikum termelőképességű törzsekkel végzett fermentálás útján.

Az aminoglükozid antibiotikumok csoportjába széleskörűen használt, gyógyászati és ipari szempontból értékes vegyületek tartoznak. Baktériumellenes hatásuk miatt mind a humán terápiában, mind pedig az állatgyógyászatban alkalmazhatók.

Ismeretes, hogy a Streptomyces tenebrarius több komponensből álló, nebramicinnek elnevezett antibiotikum-keveréket bioszintetizál (Stark, Hoehn és Knox, Antlmircobial Agents and Chemotherapy 1967, 314. oldal, 1 178 489 számú brit, 3 691 279 számú amerikai és 176 103 számú magyar szabadalmi leírások). Umezawa és munkatársai az ATCC 12853 jelű, Streptomyces kanamyceticus törzzsel kanamicint állítottak elő (3. Antlbiotics, 10A, 181 1957. és 8695/1961 számú japán szabadalmi közrebocsátás! irat (Kokai). A kanamicin A, B és C szintén aminoglükozid típusú antibiotikumok.

Ismeretes továbbá, hogy a Streptomycetaceae családba tartozó mikroorganizmusok (Streptomycesek és Micromonospora-k) sejtjei megfelelő körülmények között sejtfal nélküli alakká, protoplpsztokká alakíthatók, majd újra normális sejtekké regenerálhatok (Okanishi, Suzuki, és Umezawa, J. Gén. Microbiol., 80, 289, (1973), 4 294 927 sz. Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás). Különböző törzsekből készített protoplasztok fúziójakor genetikai rekombinációs események játszódnak le és új genetikai információkat hordozó sejteket kapunk (pl. Hopwood, Wright és Bibb, Natúré, 268, 171 (1977); Alföld, Szvoboda és munkatársaik 4 294 927 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, (1978); Godfrey, Ford és Huber, Can. J. Microbiol., 24, 994, (1978); Oichi, Hitchcock és Katz, J. Bact., 139, 984, (1979). Ezeket a kísérleteket növekedésükhöz amlnosavakat, nukleotid-bázísokat vagy vitaminokat igénylő auxotróf törzsekkel végezték. A genetikai rekombináció tényét úgy bizonyították, hogy például minimál táptalajon uracil jelenlétében növekvő sejtekből készített protoplasztokkal fuzionáltak, majd regenerálást követően aminosavát nem igénylő prototrófokat kerestek (Oichi és munkatársai 1. előbb).

A 868 472 és 868 473 számú belga szabadalmi leírásban Baltz és munkatársai Streptomyces protoplasztok előállításának és regenerálásának módszerét, valamint a protoplasztok fúzióját írják le, de nem közölnek antibiotikum bioszintézist befolyásoló eredményeket. Kísérleteiket minden esetben auxotróf partnerekkel végzik.

Antibiotikum bioszintézist befolyásoló, protoplasztok fúziójával elért in vivő genetikai rekombinációs eredményt Streptomyces sejtekkel mindeddig, tudomásunk szerint nem közölt senki az irodalomban.

A találmány célja olyan új, az antibiotikumok bioszintézisét minőségi és mennyiségi téren befolyásoló, in vivő genetikai rekombináción alapuló eljárás kidolgozása, amellyel az antibiotikumokat termelő mikroorganizmusok által bioszintetizált biológiailag aktív vegyületek mennyisége és minősége előnyösen változtatható.

Azt találtuk, hogy a találmány szerinti eljárással, protoplasztok fúziójával előállított rekombináns sejtek egy részének antibiotikum bioSzintetizáló képessége meglepő módon, és az összes vizsgált rekombínáns törzs számához viszonyítva váratlanul Igen nagy arányban, megváltozott. Egyes rekombinánsok más összetételű antibiotikum-komplexet termelnek, mások termelőképessége ugrásszerűen megnőtt vagy csökkent a fúziós partnerekéhez képest.

Továbbá azt találtuk, hogy ha a találmány szerint {'árunk el a protoplasztképzés és főként a regenerálás íatékonysága igen jelentős mértékben növelhető.

Kísérleteink során továbbá arra a meglepő felismerésre jutottunk, hogy a genetikai rekombináció akkor is létrejön, ha fúziós partnerek valamelyikének protoplasztjaít kémiai-szerekkel vagy fizikai behatás révén inaktiváljuk. így tehát nincs szükség a fúziós partnerek mindegyikének genetikai markerezésére.

A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás aminoglükozid antibiotikumokat tartalmazó fermentlevek előállítására antibiotikumok termelésére képes Streptomyces törzsek in vivő genetikai rekombinálása és az izolált, megváltozott genetikai állományú és megváltozott antibiotikum termelőképességű törzsekkel végzett fermentálás útján, amely abban áll, hogy genetikailag jelzett és prototróf vagy genetikailag jelzetlen Streptomyces törzsek sejtjeiből kalcium ionok, magnézium izonok és szacharóz jelenlétében végzett előtenyésztést követően, protoplasztokat készítünk, a genetikailag jelzett törzsekből kapott protoplasztokat, vagy a genetikailag jelzett törzs(ek)ből készített protoplasztokat és a prototróf törzsből vagy törzsekből kapott, de kémiai vagy fizikai módszerekkel inaktivált protoplasztokat fuzionáljuk, az egyesített protoplasztokat regeneráljuk, a megváltozott genetikai állományú törzseket (prototróf, kettős auxotróf vagy szegregáns) izoláljuk, vizsgáljuk antibiotikum termelésüket és a megváltozott antibiotikum termelőképességű törzseket kiválasztjuk, majd az így kapott új törzseket süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között, szerves szénás nitrogénforrást, szervetlen sókat, nyomelemeket és állati és/vagy növényi eredetű olajokat és/vagy zsírokat tartalmazó táptalajon tenyésztjük.

A találmány egy előnyös kivitelezési változata szerint növekedésükhöz amlnosavakat vagy nukleotidbázísokat igénylő auxotróf törzseket állítunk elő. Az auxotrófok előállítását például mutációkat okozó N-metfl-N -nitro-N-nitrozo-guanidines kezeléssel (Davis, J. Am. Chem. Soc., 70 4267, (1948) )végezzük. A kapott auxotrófok antibiotikum termelőképességét és genetikai stabilitását ellenőrizzük. A genetilaflag stabil izolátumokat folyékony halmazállapotú, szerves szén- és nitrogénforrást, szacharózt, kalcium- és magnéziumionokat és glicint tartalmazó táptalajon tenyésztjük (a gjlcin gátolja a sejtek növekedését). Kiválasztjuk azt a tenyészetet, ahol a glicin-gátlás erőteljes, de nem teljes, a sejteket centrifugálással elkülönítjük, majd mossuk. A mosott sejteket sza-21

194 306 charózt és lizozim enzimet tartalmazó izoozmotikus oldatban szuszpendáljuk és protoplasztokat képzőnk. A kapott protoplaszt-szuszpenziót mossuk és a protoplasztok egy részét szerves szénfonást, nitrogénforrást, szacharózt, kalcium- és magnézium-ionokat és agárt tartalmazó szilárd halmazállapotú regeneráló agarra szélesztjük. A protoplasztok másik részét 1 : 1 arányban keverjük olyan protoplasztokkal, amelyeket egy másik, a genetikai rekombinációhoz kiválasztott partner sejtjeiből készítettünk a fenti módon. A protoplasztok keveréséhez poli- etilén-gUkolt (Ms : 4000), valamint kalcium- és magnéziumionokra disszociáló sókat adunk, akkor a protoplasztok összeolvadnak (fúzió). Ezt követően regeneráljuk a sejteket. Ha a regenerálást minimál táptalajon végezzük, úgy csak a hibrid sejtekből képződnek telepek. Végezhetjük a regenerálást szerves nitrogénforrást tartalmazó táptalajon is. Ebben az esetben a kinőtt telepeket minimál táptalajra replikáivá állapítjuk meg a prototrófok számát.

A fenti eljárás során két vagy több auxotróf törzsből készített protoplasztok fúzióját követően izoláltunk prototróf rekombinánsokat. Egyes antibiotikum termelő törzsek termelőképessége azonban auxotróffá alakításukkor erősen csökken. Ipari szempontból előnyös, ha a fúziós partnerek közül legalább az egyik nagymennyiségű antibiotikumot bioszintetizál. Ezért olyan eljárást dolgoztunk ki, amelynek során csak egy auxotróf törzset használunk, a másik fúziós partner pedig prototróf törzs, azonban ennek protoplasztjait a fúzió előtt kémiai vagy fizikai kezeléssel életképtelenné tesszünk. így a fúziót követően az auxotróf és az elpusztult, regenerálódásra és növekedésre képtelen prototróf sejtek közül csak a hibrid sejtek regenerálódnak, illetve fejlesztenek telepet.

A protoplasztok inaktiválását kémiai vagy fizikai úton végezzük. Kémiai inaktiválószerként használhatunk bármilyen anyagot, amely a protoplasztokat integritásuk megsértése nélkül regenerálódásra képtelenné teszi, például - de nem limitáló jelleggel — kannabidiolsavat (3-metfl-6-izopropenü4 -n-pentfl-2 6 -dihidroxi-l,2,3,6-tetrahidro-difenil-3 -karbonsav) vagy sóit, N-etil-maleimidet, pirrolinitrint (3-klór-4-(3-klór-2-nitrofenfl)-pirrol), brillant-zöldet (N[4-[[4-(dletilamino)-fenil]-feni]metilén]-2,5-ciklohexadién-l-ilidénj-N-etiletánaminlum szulfát) és 2-merkapto-etanolt. A kémiai inaktiválás után a protoplasztokat mossuk, majd fúziós partnerként felhasználjuk.

A találmány értelmében inaktlválhatjuk a protoplasztokat γ-sugárzással is. A ⁶⁰Co izotóppad működő γ-sugárzóval 30-120 közötti, előnyösen 80 krad dózissal besugározzuk a protoplasztokat, majd centrifugálással összegyűjtjük és fúziós p rtnerként felhasználjuk.

A kapott prototróf izolátumok antibiotikum termelőképességét vizsgáljuk. Ugyancsak meghatározzuk a fúziót követően kapott kettős auxotrófok és az ezekből szegregációval kapott prototrófok termelőképességét Is.

A törzsek termelőképességének ellenőrzésére előnyösen szerves szén- és nitrogénforrást, szervetlen sókat és növényi olajokat tartalmazó táptalajokat oltunk és inkubáljuk a tenyészeteket. 16-24 órajnúlva ugyancsak a fenti táptalaj-összetevőket tartalmazó, főfermentációs táptalajokat oltunk a növekvő sejteket tartalmazó lnokulumokkal, majd 140—160 órán át folytatjuk a tenyésztést. A tenyészetekből a 96. órától kezdődően, 24 óránként mintákat veszünk, és meghatározzuk antibiotikum-tartalmukat és a termelt antibiotikumok egymáshoz viszonyított arányát.

A fenti módon előállított és antibiotikum termelés szempontjából előnyös egyedeket szerves szén- és nitrogénforrást, szervetlen sókat és növényi és/vagy állati olajokat és/vagy zsírokat tartalmazó táptalajon süllyesztett, levegőztetett körülmények között, 32°C és 40°C, előnyösen 37°C hőmérsékleten addig tenyésztjük, míg a táptalajban jelentős mennyiségű antibiotikum halmozódik fel.

Rekombinánsok előállítására például a Streptomyces tenebrarius MNG 169 és MNG 204 sorszámú, az Országos Közegészségügyi Intézet Nemzeti Törzsgyűjteményében letétbe helyezett törzseket használhatjuk. Az MNG 169 jelű törzs nembramlcin-2, nembramicin-4 és nebramicin-5 , az MNG 204 sorszámú pedig nyompyi mennyiségű nebramicin-4 mellett nebramicin-5 bioszintézisére képes. A törzsekből ismert módon, N-metíl-N -nitro-N-nitrozo-guanidines kezeléssel auxotróf mutánsokat állítunk elő. A mutánsok genetikai stabilitását több átoltást követően ellenőrizzük, ugyancsak ellenőrizzük antibiotikum termelőképességüket. A genetikailag stabil törzseket kiválasztjuk és a példákban megadott módon protoplasztokat állítunk elő. A protoplasztokat a megfelelő fúziós partnerekkel egyesítjük és regeneráljuk. Úgy találtuk, hogy mind a protoplasztképződés, mind a regenerálás közel 100%-os abban az esetben, ha a tenyésztést, a protoplasztokká alakítást és a regenerálást szacharóz valamint kalciumés magnézium-ionokra disszociáló sók jelenlétében végezzük. A regenerálódott prototróf rekombinánsokat izoláljuk és ferdeagaron tenyésztjük. Megjegyezzük, hogy az auxtróf törzsekből spontán mutációval kisebb mint 10'* frekvenciával kapunk prototrófokat, míg a találmány szerinti fúziós technikával lxlO’³ —5x20* frekvenciával.

Az izolált prototróf rekombinánsok termelőképességét vizsgálva úgy találtuk, hogy a szülőtörzsek által termelt antibiotikum-komplexben jelenlévő antibiotikumokat az egyes rekombinánsok az összes variációban termelik és a termelőképesség szintje is változott. A szülőtörzsek két (MNG 204), illetve három (MNG 169) nembramicin-komponenst termelnek. Ugyanakkor az MNG 204 és az MNG 169 protoplasztjalnak önfúziójával vagy az MNG 204 és MNG 169 fúziójával létrehozott genetikai rekombinációs eseményeket követően olyan törzseket kapunk, amelyek _______

á) antibiotikumot nem, csökkent vagy a szülőkhöz viszonyítva megnövekedett mértékben bioszintetizálnak;

b) egy nebramicin-komponenst: nebramicin-2t, nebramlcin-4-et vagy nebramicin-5 -t:

c) két nebramicin-komponenst: nebramicin-2-t és nebrqmicin-4-et, vagy nebramicin-2-t és nebraijtícin-5 -t vagy nebramicin-4-et és nebramicin-5 -t, és

d) három pebramicin-komponenst: nebramicin-2-t, -4-et és -5 -t bioszintetizálnak.

A kapott törzsek közül a nebramicin-2-t termelő

Streptomyce tenebrarius 35TL jelűt MNG 00243 sorszámon, a nebramicin-4-et bioszintetizáló Streptomyces tenebrarius FI04 jelűt MNG 00244 sorszámon, a nebramicin-5’-t termelő Streptomyces tenebrarius F77 jelűt pedig MNG 00242 sorszámon letétbe

194 306 helyeztük az Országos Közegészségügyi Intézet Nemzeti Töizsgyűjteményében.

A találmány szerinti törzsekkel nebramldn-komponenseket tartalmazó fermentlevek állíthatók elő. A fermentációt előnyösen a 176 103 sorszámú magyar szabadalmi leírás szerint végezzük, az antibiotikumok izolálása pedig célszerűen a 174 315 és 176 103 sorszámú magyar szabadalmi leírások szerint történhet.

A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös kivitelezési változata szerint egy Streptomyces kanamyceticus törzset használhatunk rekombinánsok előállítására. A mikroorganizmus tenyésztését, a protoplasztok előállítását, a fúziót és a regenerálást, illetve a kiválasztott törzsek termelőképességének ellenőrzését az előzőekben, Illetve a 3. és 8. példában megadottak szerint végezzük.

A találmány szerinti eljárás előnyei nyilvánvalóak. Alkalmazásakor olyan,-az antibiotíkum(ok) bioszintézisét érintő diploidizációs vagy rekombinációs események játszódnak le, amelyek eredményeként például több antibiotikumot vagy előnyösebb összetételű antibiotikum-keveréket termelő törzsekhez jutunk.

A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi kiviteli példákkal részletesen szemléltetjük.

1. példa

Protoplasztok előállítása, protoplasztok fúziója és regenerálása

A Streptomyces tenebrarius MNG 169 ‘és MNG 204 jelű vagy az ezekből készített auxotróf törzsek spóraszuszpenziójával vagy fagyasztott tenyészetével az alábbi összetételű ferdeagarokat oltjuk:

dextrin	1,0%
élesztőkivonat	0,1%
kazein-hidrolizátum (10%-os)*	2,0%
húskivonat	0,1%
kobalt-diklorid-hexahidrát	0,001%
agar	2,5%

*Enzimatikusan hidrolizált.

A táptalaj pH-ját sterilezés előtt vizes nátrium-hidroxid oldattal 7,2-re állítjuk be, majd 121°C hőmérsékleten 20 percen át sterűezzük.

Négy napon át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket, majd a táptalaj felületéről steril desztillált vízzel leválasztjuk a spórákat. Az így kapott spóraszuszpenzióval az alábbi összetételű steril táptalajt olljuk:

glükóz 1,0% élesztőkivonat 1,0%

A táptalaj pH-ját 7,2-re állítjuk be.

A tenyészeteket 48 órán át 37°C hőmérsékleten ink (báljuk, majd e tenyészetek 0,2 ml-ével az alábbi összetételű steril táptalajokat oltjuk:

glükóz 1,0% élesztőkivonat 1,0% szacharóz 203% kalcium-diklorid-dihldrát 03% magnézium-dlklorid-hexahldrát 0,6% glicin 4,5 vagy 6%.

A táptalajok pH-ját 7,0—7,2-re állítjuk be.

rázógépen inkubáljuk, majd kiválasztjuk azt a tenyészetet, ahol a glicin növekedésgátló hatása erős, de neip teljes. Ezzel a tenyészettel Ismét beoltjuk a fenti glicint tartalmazó táptalajokat, de a glicin koncentrációkat növeljük. Abban az esetben, ha példáid a 4% glicint tartalmazó tenyészetet választottuk ki, úgy a továbboltás 5 és 6% glicint tartalmazó táptalajokra történik.

Ezután 15 percen át 2300 g-n centrifugálva elkülönítjük a micéliumot, az alábbi összetételű oldattal mossuk és centrifugáljuk:

szacharóz 20,5% kalclum-dlklorid-díhidrát 03% magnézium-dlklorid-hexahldrát 0,6% kálium-klorid 0,0075%

Az oldat pH-ja 7,2. Jele: M.

A centrifugálást követően kapott micéliumtömeget a fenti oldatban szuszpendáljuk és a szuszpenzióhoz 0,5% Uzozím enzimet (Serva, Feinbíochemlca, Heidelberg) adunk. Ezután 37°C hőmérsékleten, enyhe rázás közben inkubáljuk a sejttömeget és 10 percenként mikroszkóp alatt ellenőrizzük a protoplasztok képződését. A mlcéliumos Streptomyces tenyészet teljes protoplasztolásához 1—4 órás Inkuhálásra van szükség, törzstől függően.

A 100%-osan protoplasztokká alakult tenyészetet ezután centrifugáljuk (2300 g, 25 perc), a fenti Mjelű mosóoldattal mossuk, majd Ismét centrifugáljuk.

Az üledéket 0,05 ml M oldatban óvatosan szuszpendáljuk, majd regeneráljuk a protoplasztokat.

A regenerálandó protoplaszt szuszpenziót 2,5 cm magasságú, gyapotvattából készült tömör szűrőrétegen engedjük át, az esetleg jelenlévő micéliumok eltávolítására. A szürletet megfelelő hígítás után, a hígításokat M oldattal végezve, steril regeneráló alapagarra szélesztjük. Az alapagar összetétele a következő:

glükóz	1,0%
élesztőkivonat	1,0%
szaczaróz	20,5%
kalcium-diklorid-dihidrát	0,3%
magnézium-dlklorid-hexahldrát	0,6%
agar	3,0%.

Az oldat pH-ja 7,0-7,2.

Petri-csészébe öntött 25 ml regeneráló alapagar felületére 0,1 ml protoplaszt szuszpenziót szélesztünk, majd 3 ml regeneráló fedőagarral rétegezzük. A fedőagar összetétele azonos az alapagaréval, de 3% helyett 1,2% agart tartalmaz.'

A tenyészeteket 35-37°C hőmérsékleten nedves kamrában inkubáljuk. A harmadik-negyedik napon szabad szemmel megfigyelhetők a regenerálódó telepek. A regeneráló lemezekre juttatott protoplasztok számához viszonyítva a regenerálás gyakorlatilag 100%-os.

Ha két auxotróf törzsből készült protoplasztokat fuzionálunk és a hibridek közül csak a prototróf rekomblnánsokat kívánjuk regenerálni, úgy az alábbi összetételű minimál táptalajra szélesztünk:

diammónium-szulfát 0,5% kálium-dihidrogén-foszfát 0,1% magnézium-szulfát-heptahidrát 0,05% glükóz 1,0% kaldum-klorid-dihidrát 0,3% magnézium-klorld-hexahldrát 0,6% szacharóz 20,5%

Wlckerham-vitamln oldat 0,01% agar 3,0%

A táptalaj pH-ja 7,2.

194 306

A WJckerham-vitamln oldat összetétele:

fólsav 0,2 mg biotin 0,2 mg

Ca-pantotenát 40,0 mg

Inozit 200,0 mg niacln 40,0 mg p-amlno-benzoesav 20,0 mg piridoxin-hidroklorid 40,0 mg aneurin-hidroklorld 40,0 mg riboflavin 20,0 mg deszt. víz 100,0 ml

Prototrófokat izolálhatunk úgy Is, hogy a komplett regeneráló táptalajon kinőtt telepeket, a fenti vagy más összetételű minimál táptalajra replikázzuk.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési változata szerint a protoplasztok fúzióját úgy végezzük, hogy a fentiek szerint, két vagy több törzsből készített protoplasztokat tetszőleges, előnyösen 1 :1 arányban összekeverjük, majd 0,2 ml protoplaszt keverékhez 2 ml fúziós oldatot adunk. Ennek összetétele a következő:

polietflén-glikol: molekulatömege: 4000, 35,0% kalcium-diklorid-dihidrát 0,3% magnézium-diklorid-hexahldrát 0,6%.

Az oldat pH-ját vizes nátrium-hidroxid oldattal

7,2-re állítjuk be.

A fúziós oldat adagolásakor a protoplasztok aggregálódnak, membránjaik összeolvadnak, azaz megtörténik a fúzió és a két vagy több sejt genetikai információkat hordozó DNS-e egymás közelében jut, így bekövetkezhetnek a genetikai rekombinációs események.

Az 1. táblázatban megadjuk a találmány szerinti eljárással és az Ismert, a 868 472 és 868 473 számú belga szabadalmi eljárás szerint előállított protoplasztok képződésének és regenerálódásának hatékonyságát.

1. táblázat

A Str. tenebrarius protoplasztok képződése és regenerálódásuk ismert és a jelen találmány szerinti eljárással

Módszer	Protoplasztképződés, % (90 perc)	Regenerá- lódás telep- szám	Protoplaszttá át nem alakult sejtekből fejlődő sejtekből fejlődő telep
telep- szám	%
Ismert	92,5	13	0,065 1500	7,5
Jelen le-
írás sze-
rinti	99,81	18000	90,0 38	0,19

A táblázatból* kitűnik, hogy a találmány szerinti eljárással, kalcium-klorid, magnézium-klorid és szacharóz jelenlétében történő előtenyésztéssel lényegesen növelhető a protoplasztképződés és főként a regenerálódás hatékonysága.

A következő példákban néhány in vivő genetikai rekombinációs kísérletet és azok eredményét Ismertetjük.

2. példa

Auxotróf törzsek fúziója és a rekombináns törzsek antibiotikum bioszintézise

a) Az A222 his' és 404 ura' auxotróf törzsek fúziója ki Ismert módon, mutagén kezeléssel kapott hisztídiri igényű A222 his és uracil igényű 44 ura’ törzset sorrendben a Streptomyces tenebrarius MNG 204 jelű, nyomnyl mennyiségű nembramicln4 mellett nebramlcin-5’-t termelő törzséből, Illetve az MNG 169 jelű, nebramlcin-2-t, nebramicld4-t és nebramicin-5’-t bioszlntetizáló törzséből állítottuk elő.

A két törzsből az 1. példában megadottak szerint eljárva protoplasztokat készítünk, a protoplasztokat fuzionáljuk és regeneráljuk. A prototróf rekomblnánsok egy részét izoláljuk. A rekombinációs frekvencia: 5x10⁵.

Az Izolált prototróf törzsek antibiotikum termelőképességét az 5. példában megadottak szerint meghatározzuk. A 2. táblázatban megadjuk az izolált 147 rekombináns fermentációja után kapott eredményeket.

2. táblázat

Az A222 his' és a 404 ura' auxotróf törzsek in vivő DNS rekombinációjával kapott prototrófok antibiotikum termelése

Termelőképesség	Törzsek száma (db)	%
Nem termel antibiotikumot	16	10,9
nebramicin-5’	24	163
nebramicin4	11	7,5
nebramlcin4 és -5’	57	38,8
nebramicin-2 és -5	7	4,7
nebramlcin-2,4 és -5	32	21,8

A fúziós partnerek termelőképessége a következő:

A222 his:	nebramicin-2: nebramicin4: nebramicin-5 :	0 pg/ml 30 pg/ml 675 pg/ml
404 ura’:	nebramlcin-2:	1120 pg/nrl
	nebramlcin4;	75 pg/ml
	nebramicin-5 :	145 pg/ml

A rekombinánsok egy részének termelőképessége ugyanakkor jelentősen meghaladja a fúziós partnerekét. így például a Streptomyces tenebrarius F 105 jelű törzs 2140 pg/ml nebramicln-2-, ^80 pg/ml nebramicin4- és 1510 pg/ml nebramicin-5 -t, az F 88 jelű 0 pg/ml nebramicin-2-t, 14Q pg/ml nebramlcln4et és 1440 pg/ml nebramicin-5 -t, az F 77 jelű 840 pg/ml nebramicin-5 -t, az F 104 jejű pedig Igen kis mennyiségű (<1%) nebramicin-5 mellett 1520 pg/ml nebramicin4-et bioszintetizál.

A szülőtörzsekből előállított protoplasztok ön fúziója után Izolált törzsek termelőképessége nem változott.

A Streptomyces tenebrarius F 104 jelű töressél az 5. példában megadottak szerint eljárva 10 liter fennentlét állítottunk elő, majd lényegében a 174 315 számú magyar szabadalmi leírásban megadottak szerint izoláltuk a biológiailag aktív vegyületeket. Végtermékként 13,8 g nebranücin-5-öt (kanamicin-B) és 9 mg nebramicln-6-ot (tobramicin) kaptunk.

Streptomyces tenebrarius F 77 és F 104 törzset MNG ÖÓ242, fii. MNG 00244 sorszámon letétbe helyeztük az Országos Közegészségügyi Intézet Nemzeti Törzsgyűjteményében.

bJA 7-34 trp' és 73 lys' auxotróf törzsek fúziója ki ismert módon, mutagén kezeléssel, a Streptomyces tenebrarius MNG 169 törzsből előállított Streptomyces tenebrarius 7-34 trp' triptofán Igényű és 73 lys Hzln Igényű törzsekből az 1, példában megadottakat megismételve protoplasztokat készítünk, a protoplasztokat fuzionáljuk és regeneráljuk.

194 306

A prototrófok egy részét izoláljuk és az 5. példában megadottak szerint vizsgáljuk termelőképességüket. A rekombinációs frekvencia: 1x10'*

3. táblázat

A 7-34 trp' ás a 73 lys~ auxotróf törzsek in vivő DNS rekombinációjával kapott prototrófok antibiotikum termelése:

Termelőképesség

Nem termel antibiotikumot nebramlcin-2 nebramldn-2 és-5’ , nebramlcin-2,4 és -5

Törzsek száma (db)	%
1	2,9
2	5,9
16	473
15	43,9

A fúziós partnerek mindhárom nebramldn-komponenst termelik.

A fúziót és regenerálást követően megfigyeltük, hogy néhány törzs minimál táptalajon, lizln vagy triptofán jelenlétében nem képes növekedni: ugyanakkor gyors növekedést figyeltünk meg Uzin és triptofán együttes jelenlétekor. Az eredetileg auxotróf törzsek a rekombinációs események következtében kettős auxotrófokká (trplys) váltak. Tizenhárom kettős auxotróf termelőképességét megvizsgáltuk az

5. példában megadottak szerint, az eredményeket a

4. táblázatban adjuk meg. A kettős auxotrófokból szegregációt követően két prototrófot Izoláltunk, ezek antibiotikum termelőképességét szintén megadjuk.

4. táblázat

A trp'tys' kettős auxotróf és az ezekből izolált szegregánsok antibiotikum termelése

Törzs A termelt nebramlcin komponens %

Str. tenebrarlus nebramlcln-2 23,1 trplys' nebramlcln-2 és -4,' 7,7 nebramlcin-2 és -5’ , 30,7 nebramlcln-2,-4 és-5’ 38,5

Str. tenebrarlus prototróf

W és 40 W nebramicin-4 és -5’ 100,0

A táblázatból kitűnik, hogy az In vivő genetikai rekombinációt követően izolált törzsek termelőképessége lényegesen megváltozott. Különösen érdekes, hogy a kettős auxotrófokból Izolált prototrófok elvesztették apramlclnt bioszintetizáló képességüket, ugyanakkor a termelt antibiotikumok mennyisége a Idindulásl törzsekéhez viszonyítva Igen nagy. A 7-34 trp' és 73 lys’ 1300-1700 pg/ml közötti mennyiségű nebramicin-2-t, 200, pg/ml nebramicln-4et és 1040 pg/ml nebramlcin-5 -t, ugyanakkor a 35 W és 40 W jelű rekombinánsok 1040,pg/ml nebramkin-4-et és 1950 pg/ml nebramlcin-5’-t termelnek.

A Streptomyces tenebrarlus 35 TL jelű, kizárólag nebramkin-2-t termelő törzset MNG 00243 sorszámon letétbe helyeztük az Országos Közegészségügyi Intézet Nemzeti Törzsgyűjteményében.

ej A J1006-3ade és a J211/2ura' auxotróf törzsek fúziója

K Streptomyces tenebrarlus J1006-3ade és J21 l/2ura' törzseket az MNG 204 sorszámú mikroorganizmusból állítottuk elő mutagén kezeléssel, a törzsek antibiotikumot nem vagy nyomnyl mennyi30 ségben (<5 pg/ml nebramlcin-5 ) termelnek. Az 1. példában megadottak szerint végzett fúziójukat követően 150 prototróf rekomblnáns termelőképességét vizsgáltuk az 5. példában megadottak szerint. A rekombinációs frekvencia: 1x10'*.

A vizsgált törzsek 60%-a (90 db) továbbra sem termelt antibiotikumot, 40%-ulj (60 db) azonban nebramjcin-4-et és nebramicin-5 -t vagy csak nebramicin-5 -t bioszintetizált. A termelők 13%-a (8 db) 1500, pg/nú feletti mennyiségben termelt nebramlcln-5 -t.

Az eredményekből kitűnik, hogy a találmány szerinti eljárással Streptomyces törzsek antibiotikum termelőképessége igen jelentősen fokozható.

3. példa

A Streptomyces kanamyceticus leu és arg auxotróf törzsek fúziója

Az 1. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a genetikailag jelzett törzsek tenyésztését addig folytatjuk, míg 3% glíclnt tartalmazó táptalajon gyenge növekedést tapasztalunk. Az auxotróf törzseket a Streptomyces kanamyceticus ATCC 12 853 jelű törzsből Umezawa és munkatársai, J. Antibiotics. 10A, 181—188, 1957 és a 8695/1961. számú japán szabadalmi közrebocsátás! Irat (Kokai) izoláltuk mutagén kezelést követően. A szülőtörzs kanamicint termel. A leucint igénylő mutáns antibiotikumot nem termel, a minimál táptalajon arginin jelenlétében növekvő mutáns Ά15 bg/ml kanamicin bioszintézisére képes.

A Streptomyces kanamyceticus antibiotikum termelését a 8. példában megadottak szerint ellenőrizzük, azzal a különbséggel, hogy a tenyésztést nem 37°C, hanem 28°C hőmérsékleten végezzük és biológiai értékméréshez Bacillus subtilis tesztorganizmust használunk.

A fúziót és a fuzionált protoplasztok regenerálását követően prototrófokat Izoláltunk és 144 törzs termelőképességét vizsgáltuk. 12 törzs az ariglnln Igényes auxotróf termelésénél tízszer több, átlagosan 155 jug/ml kanamicin bioszintézisére képes. A rekombinációs frekvencia: 3x8x10‘⁴

4. példa

Intakt, de életképtelen protoplasztok előállítása és felhasználása fúziós partnerként

A Streptomyces tenebrarlus MNG 169 törzsből és e törzs 404 ura’ auxotróf mutánsából protoplasztot készítünk az 1. példában leírt eljárás szerint. A Streptomyces tenebrarlus MNG 169 prototróf törzs inaktiválására a belőle képzett protoplaszt-szuszpenzlóhoz (10* protoplaszt/ml M jelű tápoldat) dimetflszulfoxldos oldatban, 30*C-on, kannabldiolsav-trietll-aminsót adunk 50-100 pg/ml koncentrációban. 4 órás kezelés után a protoplasztokat centrifugáink (2300 g, 25 perc), majd a nem reagált inaktiváószer eltávolítására a protoplasztokat M jelű táptalaj, al mossuk és ismét centrifugáljuk.

A prototróf Streptomyces tenebrarlus MNG 169-ből képzett, kémiai úton inaktivált protoplasztok és a 404 ura' auxotróf mutánsból készített protoplasztok fúzióját az 1. példa szerint végezzük. A fúzió eredményeit az 5. táblázatban szemléltetjük.

194 306

5. táblázat

Τύιιι	Regeneráló lemez (telepek szimajnú) Kanna bidiolsa vas	Minimál táptalaj (telepek száma/ml)	Rekombi- nációs frekvencia
kezelés előtt	kezelés után
MNG 169	2x10*	0	2,1x10*	_
404 ura' .	1,5x10*		0
MNG 169x
404 ura'	—	—	30	2x10’

5. példa

Mindenben a 4. példában leírt módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy kannabidlolsav-trietil-aminsó helyett 80-240 pg/ml pirrol-nitrint vagy 100-300 145/ml brillant-zöldet használunk kémiai inaktiválószerként. Kísérleteink során a protoplasztok 100%-osan inaktiválódtak. A kapott életképtelen protoplasztokat fúziós partnerként használjuk.

6. példa

Az 1. példában leírt módon készítünk protoplasztokat, azzal a különbséggel, hogy kiindulási törzsként Streptomyces kanamyceticust (ATCC 12 853) használunk. Az így nyert Streptomyces kanamycetius protoplasztokat a 4. példában leírt módon eljárva, de inaktiválószerként kannabidiolsav helyett 400 és 800 pg/ml N-etil-malein-imidet (EM) alkalmazva, Inaktiváljuk. Az eredményeket a 6. táblázatban mutatjuk be:

6. táblázat
Törzs	Regeneráló lemez (Telepek száma/ml) Nem 400 jug/rnl kezelt EM-del kezelve	800 pg/mj EM-del kezelve
Streptomyces	3,2x10* 4,2x10*	0

kanamyceticus (ATTCC 12853)

A 800 Atg/ml N-etfl-malein-imlddel kezelt és inaktlválódott protoplasztokat használjuk fúziós partnerként.

7. példa

Életképtelen protoplasztok előállítása fizikai inaktivitással

Az 1. példában megadottak szerint előállított Streptomyces tenebrarius protoplaszt szuszpenzióját (10* sejt/mll műanyag csőben g^mma-sugarakkal kezeljük (Co**). A 80 krad dózist kapott, s ezáltal inaktlválódott sejteket használjuk fúziós partnerként.

8. példa

Nebramicin antibiotikum-komponenseket bioszintetizáló törzsek termelőképességének vizsgálata és antibiotikumot tartalmazó fermentlevek előállítása

A vizsgálandó törzs spóráival vagy vegetatív tenyészetével az alábbi összetételű, desztillált vízzel készült ferdeagarokat oltjuk:

dextrin	1,0%
élesztőkivonat	0,1%
kazein-hidrolizátum (10%-os)*	2,0%
húskivonat	0,1%
kobalt-díklorid-hexahidrát	0,001%
agar	2,5%

•enzimatíkusan hidroHzált

A táptalaj pH-ját sterflezés előtt vizes nátrium-hidroxid oldattal 7,2-re állítjuk be, majd 121^eC hőmérsékleten 20 percen át sterilezzük.

Négy napon át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket, majd a táptalaj felületéről steril desztillált vízzel leválasztjuk a spórákat és az így kapott spóraszuszpenzióval kétszer 100 ml térfogatú Erienmeyer-lombikokban sterilezett alábbi összetételű, csapvízzel készült inokulum táptalajt oltunk:

szójaliszt 2,0% kazein-hidrolizátum (10%-os)* 2,0% ammónium-hidrát 0,1% ammónium-klorid 03% kalcium-karbonát 03% magnézium-szulfát-heptahidrát 0,5% pálmaolaj és lenolaj 1 :1 arányú elegye 3,0% glükóz (külön, 50%-os oldatként sterilezve) 2,0% *enzlmatikusan hidiolizált

A táptalaj pH-ját vizes nátrium-hidroxid oldattal

7,2-re állítjuk be, majd 121°C hőmérsékleten 20 percen át autoklávban sterilezzük.

A beoltott tenyészeteket 14-18 órán át, 2,4 cm átmérőjű kör mentén percenként 280-at forduló ..íkrázógépen 37°C hőmérsékleten tenyésztjük.

Az így előállított érett inokulummal 500 ml-es Erienmeyer-lombikokban sterilezett 100 ml, vagy 10 liter össztérfogatú laboratóriumi fermentorban 121°C hőmérsékleten 45 percen át sterilezett, 5 liter térfogatú, csapvízzel készült alábbi összetételű főfermentációs táptalajt oltunk:

szójaliszt	3,0%
kazein-hidrolizátum (10%-os)*	5,0%
ammónium-nltrát	0,1%
ammónium-klorid	0,5%
L-glutaminsav	0,8%g
kalcium-karbonát	0,5%
magnézium-szulfát-heptahidrát	0,5%
kobalt-dinitrát-hexahidrát	0,001%
pálmaolaj és lenolaj 1 :1 arányú elegye	3,0%
glükóz (külön, 50%-os oldatként
sterilezve)	4,2%

*enzlmatikusan hldrolizált

A táptalaj pH-ját sterflezés előtt vizes ammónjum-hidroxid oldattal 7,2-re állítjuk be.

A tenyésztést 37°C hőmérsékleten végezzük. A lombikokban lévő sejteket az előbbiekben jellemzett síkrázógépen tenyésztjük. A fermentor keverőjének fordulatszámát 360/percre állítjuk be. A táptalajon percenként 3 liter steril levegőt vezetünk át.

A tenyészetek antibiotikum tartalmát agardlffúbiológlai értékméréssel (I. S. Simpson: Analytical Mlcroblology, Acad. Press, New York, 1963, 87— 124. oldal) és vékonyrétegkromatográflát követően bioautográfiával határozzuk meg (Kádár Pauncz J. és Harsány! I.: J. Chromat, 195, 251 (1980).

Az agardlffúzlós biológiai értékméréshez az összantíbiotikum tartalom meghatározásakor Staphylococcus epldermidls, míg a nebramlcln-5 egyéb nebramicin-komponensek melletti szelektív mérésekor

194 306 nebramlcin-2-re és nebramlcin-4-re rezisztens Rhjzoblum melflottí tesztorganizmust használunk.

A vékonyrétegkromatográfiás módszerrel végzett antiblotíkumkomponens-összetétel meghatározásakor szllikagél (Merck, Darmstadt) vékonyrétegre a fermentléből hígítással készült 0,1-0,5 pglml közötti mennyiségű antibiotikumot tartalmazó oldatot cseppentünk, majd kifejlesztő elegyként etfl-alhohol, metfl-etfl-keton és 25%-os ammónlum-hidroxld 1:1 : 1 arányú elegyét használva kromatografáljuk az antibiotikum komponenseket. A kromatogramm kifejlesztése után szárítással eltávolítjuk a kifejlesztőszert és Bacfllus subtüls ATCC 6633 mikroorganizmust tartalmazó táptalajt rétegezünk a szflikagél lemez felületére, majd 3/C hőmérsékleten 16 órán át inkubáljuk a lemezt. A kromatogrammon elválasztott antibiotikum komponensek gátolják a tesztorganizmus növekedését. A gátlási zónák nagyságából állapítjuk meg a nebramicin antibiotikum komponensek mennyiségét standardokkal való összehasonlítás segítségével.

Claims

1. Eljárás amlnoglükózid típusú antibiotikumokat tartalmazó fermentlevek előállítására antibiotikum termelésére képes Streptomyces törzsek in vivő genetikai Tekombinálása és az izolált, megváltozott genetikai állományú és megváltozott antibiotikum termelőképességű törzsekkel végzett fermentálás útján, azzal jellemezve, hogy genetflaílag jelzett és prototróf vagy genetflaílag jelzetlen Streptomyces törzsek sejtjeiből kalcium Ionok, magnézium ionok és szacharóz jelenlétében végzett előtenyésztést követően, protoplasztokat készítünk, a genetflaílag jelzett törzsekből kapott protoplasztokat, vagy a genetikailag jelzett törzs(ek)bő] készített protoplasztokat és a prototróf törzsből vagy törzsekből kapott, de kémiai vagy fizikai módszerekkel inaktivált protoplasztokat fuzionáljuk, az egyesített protoplasztokat regeneráljuk, a megváltozott genetikai állományú törzseket (prototróf, kettős auxotróf vagy szegregáns) izoláljuk, vizsgáljuk antibiotikum termelésüket és a megváltozott antibiotikum termelőképességű törzseket kiválasztjuk, majd az így kapott új törzseket süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között, szerves szénás nitrogénforrást, szervetlen sókat, nyomelemeket és állati és/vagy növényi eredetű olajokat és/vagy zsírokat tartalmazó táptalajon tenyésztjük.

2, Az 1. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a protoplasztok képzését, fúzióját és regenerálását előnyösen 0,1-0,5% kalciumsót, 0,3-0,8% magnézium-sót és 12-34% szacharózt tartalmazó táptalajon végezzük.

3. Az 1. vagy 2. igénypont bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kémiai Inaktiválást kannabidiolsawal vagy valamely sójával N-etil-maleln-Imiddel, pirrol-nitrinnel, brflant-zölddel vagy 2-merkapto-etanoflal végezzük.

4. Az 1. vagy 2. Igénypont bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fizikai inaktiválást γ-sugárra] végezzük.

5. Az 1-4. Igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy antibiotikumot termelő Streptomyces törzsként Streptomyces tenebrariust használunk.

6. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy antibiotikumot termelő Stretpmyces törzsként Streptomyces kanamycetlcust használunk.